CN1680443A

CN1680443A - 含有白蛋白多聚体的重组蛋白

Info

Publication number: CN1680443A
Application number: CNA2005100517983A
Authority: CN
Inventors: 小田切优树; 木田善规; 片山直久; 甲斐俊哉
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2025-03-03
Also published as: EP1571212A1; US20050203020A1; JP2005245269A; CN1680443B

Abstract

本发明提供了一种含有血清白蛋白多聚体的重组蛋白，在这个重组蛋白中，至少有两个血清白蛋白编码基因通过基因重组技术连接在一起，并且使它们在宿主细胞中生产。本发明还提供了人血清白蛋白多聚体的编码基因和重组载体。这种蛋白能用作安全的给药载体，和常规的给药载体相比，这种载体能延长药物在血液中的半寿期，而不会有病毒污染等的危险。

Description

含有白蛋白多聚体的重组蛋白

发明背景

本发明涉及一种蛋白，这种蛋白含有一种血清白蛋白多聚体，是通过重组技术获得的。更具体而言，本发明涉及一种蛋白，这种蛋白含有一种血清白蛋白多聚体，是通过重组技术获得的，并且能当给药载体等使用，在预防病毒等感染风险的同时能增强药物的潴留属性。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是成年人血清中发现的主要蛋白，它产生于肝，并且在人体中起着转运不同血清分子的载体功能。此外，白蛋白在保持血浆胶体渗透压正常中起着重要的作用，这种渗透压由溶质(胶体)引起，这些胶体不能通过毛细血管上的小孔，从而能保持血液中的液体含量。因此，白蛋白已被施用于各种不同的外科治疗，精神损害，烧伤，以及引起浮肿的血液蛋白不足，还伴随着血管中液体的流失。

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白，它的平均水平能达到48mg/ml(0.67mmol/L)。白蛋白含量丰富的原因有两个。第一，白蛋白的富集使得肝细胞通过组织特异的机制加速白蛋白前体mRNA的转录。第二，白蛋白释放到血液循环中后，其排除和代谢相对较慢。白蛋白在人体中的代谢半寿期大约是19天，而在兔子中是4.6-6.2天。

根据上述的说法，就能知道血液中潴留了大量的血清白蛋白。把血清白蛋白用作一种给药载体能改善药物在血液中的潴留。

同时，含有来自血液的白蛋白的药用制剂会被未知病毒污染。因此，对人体等施用这种药用制剂会产生安全问题。然而，现已提出通过重组技术利用转化微生物来生产血清白蛋白的方法(参看JP S58-56684A和JP H05-292993A)，因此能获得安全的血清白蛋白制剂。

白蛋白是一种单链蛋白，由585个氨基酸组成，包括3个同源结构域。已知当天然白蛋白的三个结构域被切割成一或两个结构域时，白蛋白会加速从肾脏中分泌出来。相反，当给兔子施用含六个结构域的血清白蛋白二聚体时，能加速血浆中天然白蛋白的消失，这也是已知的(参看McCurdy TR等人，Journal of Clinical Medicine(临床医学杂志)，143(2)，115-124，2004年2月)。

发明概述

本发明的目的是提供一种安全的给药载体，它和常规的给药载体相比，不必担心病毒污染，而且能延长药物在血液中的半寿期。

为了解决上述问题，本发明的发明者通过重组技术建立了一种表达蛋白的系统，这种蛋白含有多聚血清白蛋白，而且发现，这种含有多聚血清白蛋白的蛋白在血液中潴留的时间比单体血清白蛋白要长，因此，完成了本发明。

换句话说，本发明涉及：

(1)一种含有多聚白蛋白的蛋白，其是通过重组技术产生的；

(2)根据上述(1)条所述的蛋白，其中血清白蛋白的氨基酸序列和人血清白蛋白的氨基酸序列一样；

(3)含有根据上述(1)条所述的蛋白的药用制剂；

(4)DNA片段，含有至少两段编码血清白蛋白的DNA序列；

(5)上述(4)条所述的DNA片段，在编码血清白蛋白的DNA序列之间进一步含有至少一个酶切位点；

(6)含有根据上述(4)条所述的DNA片段的重组载体；

(7)用根据上述(6)条所述的重组载体转化的宿主细胞；

(8)根据上述(1)条所述，产生蛋白的方法的特征包括：将包括至少两条血清白蛋白编码序列的DNA整合到载体中，将该载体转化宿主细胞，培养获得的转化子来生产蛋白，并收集产生的蛋白，而且，

(9)根据上述第(4)条的DNA片段的生产方法，包括将DNA片段导入具有高增殖能力的宿主细胞中，在该DNA片段中，限制性酶切位点插入编码血清白蛋白的多个DNA序列之间；培养获得的转化子，从增殖的细胞中提取DNA；并用特异的限制性酶切割DNA。

本发明的蛋白在体内的半寿期延长，这归因于其在血液中的消除速率降低，因此，当这种蛋白被用作给药载体时，能延长药物在血液中的潴留时间。此外，由于利用重组技术产生蛋白，不存在诸如未知病毒污染等风险，这是血液制剂的固有问题。因此，这种蛋白能安全的用于人体等。除此之外，该蛋白由人体内在的成份组成。即便这种蛋白施用给人体，它对人体的影响，如副作用也是很小的。

附图简述

图1是解释图，列举的是实施例1中人血清白蛋白二聚体产生的一般过程。

图2是pKF18K-HSA的示意图。

图3是实施例1中的DNA片段W-1的示意图。

图4是实施例2中的DNA片段W-2的示意图。

图5是测试实施例1中施用本发明蛋白所用的时间，以及给定剂量的残余率。

图6是实施例2中pPIC9K-HSA二聚体的示意图。

图7的分解图表示实施例2中毕赤酵母基因组的重组过程，其中含有HSA二聚体cDNA。

图8示出有义和反义引物，用于扩增实施例2中的部分pPIC9K，HSA cDNA-1和HSA cDNA-2。

在本发明中，多聚血清白蛋白是一种蛋白，在这种蛋白中，多个血清白蛋白直接或间接偶联在一起。多聚血清白蛋白偶尔也叫做血清白蛋白多聚体或融合蛋白。血清白蛋白一般是人血清白蛋白。血清白蛋白包括的单链蛋白，由585个氨基酸组成，包括三个同源结构域，该蛋白的片段和修饰蛋白或其片段。可以利用重组技术来生产血清白蛋白多聚体。多聚体包括二聚体或三聚体。

在本发明中，编码血清白蛋白的DNA序列能在一种系统中生成血清白蛋白，该系统能使含有该DNA序列的基因表达。该DNA序列不仅限于生成完全血清白蛋白的DNA序列，也包括能生成血清白蛋白部分多肽的DNA序列。然而，优选的DNA是编码完全血清白蛋白的DNA序列。此外，优选的编码血清白蛋白多聚体的DNA序列不含任何内含子，所述内含子介于编码血清白蛋白的cDNA序列之间，和编码全部或部分血清白蛋白的mRNA同源。

在含有至少两个编码血清白蛋白的DNA序列的DNA片段中，上述DNA序列在整个DNA片段中是重复出现的。DNA片段中的多个DNA序列可以是相同的，或彼此互不相同。DNA片段指的是分离的片段。

此外，在两段编码血清白蛋白的DNA序列之间优选插入的是含有至少一个限制性酶切位点的DNA片段。含有至少一个限制性酶切位点的DNA片段和编码血清白蛋白多聚体的DNA序列与载体连接，并将该重组载体整合到具有很好增殖能力的宿主细胞，如大肠杆菌中，从而转化该宿主细胞，然后培养转化子。随后，从增殖的转化子中提取DNA(质粒)，然后用限制性内切酶^*1切割，紧接着纯化DNA片段。结果，能有效地获得大量拷贝的编码白蛋白多聚体的DNA序列。此外，这些拷贝的DNA事实上用于制备重组载体，并整合到宿主细胞中，用来有效生产含有血清白蛋白多聚体的蛋白。

^*1：该限制性酶和用来连接白蛋白单体的限制性酶不同。

可以用任何一种已知的方法将上述DNA片段整合到载体中。例如，有这么一种方法，它包括在多种多样的限制性酶处理的DNA片段和载体的混合溶液中加入连接酶，从而将DNA片段和载体连接起来。这种载体可以是重组技术中使用的任何载体，但通常使用的是质粒载体。

随后，将上述重组载体导入宿主细胞获得重组子。将重组载体导入宿主细胞的方法可以是本领域使用的任何常规方法，包括感受态细胞方法，原生质体方法，磷酸钙共沉淀方法，电穿孔方法，微注射方法，脂质体融合方法，以及基因枪方法。使用哪种方法取决于使用的宿主。

宿主细胞优选真核细胞。真核细胞的例子包括巴斯德毕赤酵母(Phichia pastoris)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Shizo Saccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母。

培养这样获得的转化子，然后，在培养物中生产含有血清白蛋白多聚体的融合蛋白。用一种已知的方法分离蛋白，并任选纯化以获得本发明的蛋白。

培养转化子的培养基是一种已知的培养基，包括诸如YPD培养基的营养培养基，诸如MB培养基的基本培养基，BMMY培养基和BMGY培养基。转化子一般在16-46℃，优选的是25-37℃，培养8-168小时，优选的是24-120小时。转化子可以振荡或静止培养，或者，如果需要的话，可以搅动和通风培养。

分离和纯化培养物中生产的融合蛋白的已知方法的例子包括：利用溶解性差异的方法，如盐析或溶剂沉淀法；利用分子量差异的方法，如透析，超滤，或凝胶电泳；利用电荷差异的方法，如离子交换层析，利用特异亲和性的方法，如亲和层析；利用疏水性差异的方法，如反相高效液相色谱；以及利用等电点差异的方法，如等电点聚焦。

对分离和纯化的融合蛋白进行鉴定的已知方法的例子包括Western印迹方法和活性检测方法。此外，纯化的融合蛋白可以进行氨基酸分析，氨基末端分析，一级结构分析等来阐明它的结构。

实施例1

图1表示的是实施例1的大致过程(人血清白蛋白基因的扩增)

把人血清白蛋白基因整合到质粒pKF18K(下文称作pKF18K-HSA，购自TonenGeneral Sekiyu K.K)(参看图2)中，获得的质粒作为模板。以SEQ.ID.NO.1的W-1有义引物，SEQ.ID.NO.2的W-1反义引物，SEQ.ID.NO.3的W-2有义引物，SEQ.ID.NO.4的W-2反义引物(如图8所示)为合成引物，和DNA聚合酶(KOD+DNA聚合酶，购自Toyobo公司)进行PCR。PCR的反应条件是：在94℃处理DNA(质粒)2分钟，进行连续的变性(94℃，15秒)，退火(63℃，30秒)以及延伸(68℃，2分钟)反应，30个循环，然后在68℃处理5分钟。通过PCR扩增加上了DNA序列的DNA片段，而这些编码人血清白蛋白的DNA序列的3’和5’端具有限制性酶切位点。因此，通过SEQ.ID.NO.1的有义引物和SEQ.ID.NO.2的反义引物(下文称W-1，参看SEQ ID NO.5和图3)扩增的DNA片段和通过SEQ.ID.NO.3的有义引物和SEQ.ID.NO.4的反义引物(下文称W-2，参看SEQ ID NO.6和图4)扩增的DNA片段就获得了。

人血清白蛋白基因的连接

PCR扩增的DNA片段W-1通过酚抽提和乙醇沉淀而纯化后，用限制性酶AvaI(购自Takara Shuzo公司)进行切割。另一方面，用酚抽提和乙醇沉淀纯化后，用限制性酶AvaI(购自Takara Shuzo公司)对DNA片段W-2进行切割。随后，再次对W-2进行酚抽提和乙醇沉淀而纯化，接着用限制性酶EcoRI(购自Takara Shuzo公司)进行切割。DNA片段W-1和W-2，以及质粒pPIC9被限制酶处理后进行琼脂糖凝胶电泳。然后，将对应各个DNA片段的条带切割下来，并用凝胶抽提试剂盒(QIAquick凝胶抽提试剂盒，由QIAGEN制造)进行凝胶抽提。凝胶抽提后，将DNA片段W-1，W-2和质粒pPIC9混合在一起，利用DNA连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.1，由Takara Shuzo公司制造)在16℃连接4小时，制备重组质粒(下文称pBIC9-W²)，在这个重组质粒中，编码血清白蛋白二聚体的DNA(下文称W²)和质粒pPIC9连接在一起。

这样获得的pBIC9-W²被导入大肠杆菌JM109中进行转化。在补充了氨苄青霉素的培养基上筛选导入了目的质粒pBIC9-W²的转化子，然后利用质粒纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，由QIAGEN制造)纯化质粒。用限制性酶XhoI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)对质粒进行双酶切，然后用限制性酶XhoI，AvaI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)对质粒进行三酶切，以制备限制性酶切图谱，证明该质粒是目的质粒载体。

验证和培养其中导入了目的质粒的大肠杆菌。然后，利用质粒纯化试剂盒(QIAGEN质粒Maxi试剂盒，由QIAGEN制造)从增殖的细菌细胞中提取和纯化质粒(pPIC9-W²)。用限制性酶BamHI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)对质粒进行双酶切。酚抽提和乙醇沉淀进行纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将对应W2的条带(3.5kb)切下来，接着用凝胶抽提试剂盒(QIAquick凝胶抽提试剂盒，由QIAGEN制造)进行凝胶抽提。

人血清白蛋白基因的扩增

随后，用同样的的方式将DNA片段W²整合到质粒pPIC9K中。用两种限制性酶BamHI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)切割pPIC9K，然后通过酚抽提和乙醇沉淀进行纯化，接着进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶抽提试剂盒(QIAquick凝胶抽提试剂盒，由QIAGEN制造)进行抽提。DNA片段W²和质粒pPIC9K混合在一起，利用DNA连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.1，由Takara Shuzo公司制造)在16℃连接4小时，制备重组质粒(下文称pBIC9k-W²)，在这个重组质粒中，DNA片段W²和质粒pPIC9K连接在一起。

质粒pPIC9K-W²被导入大肠杆菌JM109中进行转化。在补充了卡那霉素的培养基上筛选转化子，然后利用质粒纯化试剂盒(QIAprepSpin Miniprep试剂盒，由QIAGEN制造)抽提和纯化质粒，接着证实质粒pBIC9k-W²的导入。验证导入了质粒pPIC9K-W²的转化子，并进一步培养。用同样的方法从增殖的细菌细胞中抽提和纯化质粒。然后用限制性酶XhoI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)对质粒进行双酶切，然后用限制性酶XhoI，AvaI和EcoRI(购自Takara Shuzo公司)对质粒进行三酶切，制备限制性酶切图谱。同时，用DNA测序仪(ABIPrism 310 Genetic Analyzer，由Perkin-Elmer Applied Biosystems制造)鉴定DNA序列，来验证目的DNA片段W²的扩增。

人血清白蛋白二聚体的表达

用限制性酶SalI切割质粒pPIC9K-W²，并通过酚抽提和乙醇沉淀进行纯化，接着利用电穿孔系统(Gene Pulser II电穿孔系统，由Bio-Rad实验室公司制造)，以电穿孔的方法将质粒pPIC9K-W²导入巴斯德毕赤酵母GS115中，而实现转化。筛选产生的转化子，只有阳性克隆表示出G418抗性，并被培养在BMMY液体培养基中。然后，验证血清白蛋白的表达，并把转化子保存在甘油中。

人血清白蛋白二聚体的纯化

转化的巴斯德毕赤酵母GS115在BMGY液体培养基中培养48小时，然后在BMMY培养基中培养96小时，其间每隔12小时加入1％的甲醇。离心(6000g×10分钟)分离酵母细胞，通过0.22μm滤膜过滤培养上清液，然后用Blie亲和CL-6B柱纯化。

测试实施例1

以和实施例1同样的方式制备人血清白蛋白二聚体，用放射性铟同位素(¹¹¹In)标记，制备¹¹¹In重组人血清白蛋白二聚体。通过尾静脉，将¹¹¹In重组人血清白蛋白二聚体静脉施用给三只实验小鼠。给药后，每隔恒定的时间取血样，并利用辐射剂量仪检测血液中白蛋白的水平。作为对照，用¹¹¹In标记人血清白蛋白(单体)，制备¹¹¹In人血清白蛋白，将其施用给小鼠，然后用同样的方法检测。图5表示的是给药后的时间以及给定剂量的残余率。

图5所示的结果很明显，人血清白蛋白二聚体在血液中停留的时间比单体要长。前者的半寿期大约是后者的5倍。

本发明的白蛋白是通过基因工程制造的蛋白，它衍生自天然蛋白，并不可能被病毒等所污染，因此，它可用作一种无毒的药物载体。本发明的白蛋白分子中结合了大量的药物，因此它可用作给药载体，这种载体能结合高分子量的药物等。

实施例2

pPIC9K中限制性位点BamHI和XhoI之间DNA序列的扩增

以和实施例1相同的方式，利用图8所示的有义和反义引物(SEQID.7和8)，质粒pPIC9K为模板进行PCR。通过乙醇沉淀纯化扩增的pPIC9K，用BamHI和XhoI(Takara Shuzo)对其进行双酶切，将酶切的片段进行电泳，然后将对应BamHI和XhoI之间的DNA序列的凝胶条带切下来。利用凝胶抽提试剂盒(QIAquick凝胶抽提试剂盒，QIAGEN)从凝胶条带中获得抽提的DNA片段(2)。

人白蛋白基因的连接和扩增

以和实施例1相同的方式，将DNA片段W-1(HSA cDNA-1，(3)，图6)和W-2(HSA cDNA-2，(4)，图6)从pKF18K-HSA中凝胶抽提出来。DNA片段W-1和W-2的有义和反义引物(对应SEQ.ID.No.1-4)如图8所示。利用DNA连接试剂盒(DNA连接试剂盒Ver.1，TakaraShuzo)，在16℃反应4小时，将DNA片段(2)，W-1(3)和W-2(4)，以及质粒，pPIK9连接成质粒pPIC9K-HSA二聚体(图6)，在这个质粒中，DNA片段W-1(3)和W-2(4)与质粒pPIC9K结合在一起。

将质粒pPIC9K-HSA二聚体转化到宿主细胞大肠杆菌JM109中。在含有卡那霉素的培养基上筛选转化子，然后用质粒纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep试剂盒，QIAGEN)提取和纯化质粒，接着验证这些质粒中包含了质粒pPIC9K-HSA二聚体。进一步培养含有质粒pPIC9K-HSA二聚体的转化子，从增殖的细菌中提取和纯化质粒，并用限制性酶XhoI和EcoRI(Takara Shuzo)对其进行双酶切，随后用XhoI，AvaI和EcoRI(Takara Shuzo)进行三酶切。做成限制性图谱，同时用DNA测序仪(ABI Prism 310 Genetic Analyzer，Perkin-ElmerApplied Biosystem)验证其中的目的DNA片段是否扩增。

随后通过重组的方法将质粒pPIC9K-HSA二聚体导入毕赤酵母GS115基因组中(his 4)(参看图7)。在毕赤酵母GS115中表达人血清白蛋白二聚体，并以和实施例1相同的方式从中分离和纯化。

序列表

<110>尼普洛株式会社(NIPRO CORPORATION)

<120>含有白蛋白多聚体的重组蛋白

(RECOMBINANT PROTEIN CONTAINING ALBUMIN MULTIMER)

<130>SPI050800-47

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

ggtaccctcg agaaaagaga tgcacacaag agtgaggttg c 41

<210>2

<211>47

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

cagctgcccg agccaccacc acctaagcct aaggcagctt gacttgc 47

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gttaacctcg ggcggtggcg gaagtgatgc acacaagagt gaggttgc 48

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

cacgtggaat tcttataagc ctaaggcagc ttgacttgc 39

<210>5

<211>1796

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

ggtaccctcg agaaaagaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg 60

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt 120

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgta 180

gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta 240

tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa 300

gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga 360

ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt 420

ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc 480

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa 540

gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggc ttcgtctgcc 600

aaacagagac tcaaatgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg 660

gcagtggctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta 720

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct 780

gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aggattcgat ctccagtaaa 840

ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa 900

aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 960

gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat 1020

gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa 1080

accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc 1140

gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ctgtgagctt 1200

tttaagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa 1260

gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc 1320

agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc 1380

gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcaca 1440

aaatgctgca cagagtcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat 1500

gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc 1560

acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gcttgtgaaa 1620

cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt 1680

gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa 1740

cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttaggtggtg gtggctcggg cagctg 1796

<210>6

<211>1795

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

gttaacctcg ggcggtggcg gaagtgatgc acacaagagt gaggttgctc atcggtttaa 60

agatttggga gaagaaaatt tcaaagcctt ggtgttgatt gcctttgctc agtatcttca 120

gcagtgtcca tttgaagatc atgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaac 180

atgtgtagct gatgagtcag ctgaaaattg tgacaaatca cttcataccc tttttggaga 240

caaattatgc acagttgcaa ctcttcgtga aacctatggt gaaatggctg actgctgtgc 300

aaaacaagaa cctgagagaa atgaatgctt cttgcaacac aaagatgaca acccaaacct 360

cccccgattg gtgagaccag aggttgatgt gatgtgcact gcttttcatg acaatgaaga 420

gacatttttg aaaaaatact tatatgaaat tgccagaaga catccttact tttatgcccc 480

ggaactcctt ttctttgcta aaaggtataa agctgctttt acagaatgtt gccaagctgc 540

tgataaagct gcctgcctgt tgccaaagct cgatgaactt cgggatgaag ggaaggcttc 600

gtctgccaaa cagagactca aatgtgccag tctccaaaaa tttggagaaa gagctttcaa 660

agcatgggca gtggctcgcc tgagccagag atttcccaaa gctgagtttg cagaagtttc 720

caagttagtg acagatctta ccaaagtcca cacggaatgc tgccatggag atctgcttga 780

atgtgctgat gacagggcgg accttgccaa gtatatctgt gaaaatcagg attcgatctc 840

cagtaaactg aaggaatgct gtgaaaaacc tctgttggaa aaatcccact gcattgccga 900

agtggaaaat gatgagatgc ctgctgactt gccttcatta gctgctgatt ttgttgaaag 960

taaggatgtt tgcaaaaact atgctgaggc aaaggatgtc ttcctgggca tgtttttgta 1020

tgaatatgca agaaggcatc ctgattactc tgtcgtgctg ctgctgagac ttgccaagac 1080

atatgaaacc actctagaga agtgctgtgc cgctgcagat cctcatgaat gctatgccaa 1140

agtgttcgat gaatttaaac ctcttgtgga agagcctcag aatttaatca aacaaaactg 1200

tgagcttttt aagcagcttg gagagtacaa attccagaat gcgctattag ttcgttacac 1260

caagaaagta ccccaagtgt caactccaac tcttgtagag gtctcaagaa acctaggaaa 1320

agtgggcagc aaatgttgta aacatcctga agcaaaaaga atgccctgtg cagaagacta 1380

tctatccgtg gtcctgaacc agttatgtgt gttgcatgag aaaacgccag taagtgacag 1440

agtcacaaaa tgctgcacag agtccttggt gaacaggcga ccatgctttt cagctctgga 1500

agtcgatgaa acatacgttc ccaaagagtt taatgctgaa acattcacct tccatgcaga 1560

tatatgcaca ctttctgaga aggagagaca aatcaagaaa caaactgcac ttgttgagct 1620

tgtgaaacac aagcccaagg caacaaaaga gcaactgaaa gctgttatgg atgatttcgc 1680

agcttttgta gagaagtgct gcaaggctga cgataaggag acctgctttg ccgaggaggg 1740

taaaaaactt gttgctgcaa gtcaagctgc cttaggctta taagaattcc acgtg 1795

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

cgaaggatcc aaacgatgag 20

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

cttttctcga gagatacccc ttcttc 26

Claims

1.一种包含人血清白蛋白多聚体的蛋白，其是通过重组技术制备的。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其中多个血清白蛋白直接或间接偶联在一起。

3.根据权利要求1所述的蛋白，其中血清白蛋白包含具有由585个氨基酸组成的单链结构和三个同源结构域的蛋白，蛋白的片段和修饰蛋白或其片段。

4.根据权利要求1所述的蛋白，其中血清白蛋白包括具有由585个氨基酸组成的单链结构和三个同源结构域的蛋白。

5.根据权利要求1所述的蛋白，其中的多聚体包括二聚体或三聚体。

6.一种药用制剂，包括根据权利要求1所述的包含血清白蛋白多聚体的蛋白。

7.DNA片段，包括至少两段编码血清白蛋白的DNA序列。

8.权利要求7所述的DNA片段，在编码血清白蛋白的DNA序列之间进一步包括至少一个限制性酶切位点。

9.重组载体，包括根据权利要求7所述的DNA片段。

10.宿主细胞，转化有根据权利要求9所述的重组载体。

11.根据权利要求1所述的蛋白的生产方法，其包括将含有至少两个编码血清白蛋白的DNA序列的DNA片段插入载体；用该载体转化宿主细胞；培养获得的转化子，以生产蛋白；并收集生产的蛋白。

12.根据权利要求7所述的DNA片段的生产方法，其包括将DNA片段导入增殖能力强的宿主细胞，在该DNA片段中，限制性酶切位点插在两段编码血清白蛋白的DNA序列之间；培养获得的转化子；从增殖的细胞中抽提DNA；用具有不同限制性位点的限制性酶切割DNA，该限制性位点介于两段编码血清白蛋白的DNA序列之间。