CN101067138A - 基因工程制备人毛乳头细胞hspc016蛋白质的方法、表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本法发明涉及一种基因工程人毛乳头细胞HSPC016基因的表达载体，该载体为含有人毛乳头细胞HSPC016基因功能序列的质粒pET－22b(+)，HSPC016编码序列位于pET－22b(+)载体上Nde I和Xho I酶切位点之间，载体是pET－22b(+)。本发明还涉及一种被上述载体所转化的基因工程菌，并提供制备人毛乳头细胞HSPC016目的蛋白的方法，通过IPTG诱导大肠杆菌pET－22b(+)/HSPC016/BL21表达目的蛋白HSPC016。本发明的优点在于：目的蛋白质表达量高，表达率在28％以上；加入6×His纯化标签，利于蛋白纯化；选择pET－22b(+)作为表达可溶性外源蛋白HSPC016的载体，既保证了目的蛋白的高表达，又维持了目的蛋白在合成过程中形成的正确构象，保持了生物学活性。

Description

基因工程制备人毛乳头细胞HSPC016蛋白质的方法、表达载体和工程菌

                            技术领域

本发明涉及利用DNA重组技术生产蛋白质或多肽药物的领域，具体地讲，本发明涉及基因工程制备人毛乳头细胞HSPC016(hematopoietic stem/progenitor cells，HSPC)蛋白质的方法，还涉及有关的表达载体和工程菌。

                            背景技术

毛囊是重要的皮肤附属器官，是毛发的主体。毛发具有调节体温、排泄代谢物、缓冲外界机械压力等重要生理功能，对人类而言同时还有美学、装扮、特征辨认等社会学意义。毛囊异常生长所致的多毛或少毛不仅会影响毛发生理功能的正常发挥，而且正在或可能将要给越来越多的患者造成心理压力，直接影响患者的生活质量和健康。因此，了解毛囊生长的确切机制、调控原理及探讨临床诊治毛囊疾病的方法与措施具有重要意义。多数学者认为毛乳头在毛囊的形态学发生和成年毛囊的周期性生长与调控中起主导作用，毛乳头细胞是毛囊研究的中心环节之一。HSPC016是我国复旦大学学者在人造血干细胞中发现的新基因，本申请人首次发现了HSPC016基因作为上调表达基因在凝集性生长状态人毛乳头细胞差异表达cDNA文库中的表达。对于一个新基因而言，获取其重组蛋白，是进一步对该基因功能进行深入研究所必需的。

毛囊的明显特性是自我更新和周期性生长。完整的毛囊生长周期包括生长期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)。毛囊的胚胎发育和周期性生长主要依靠来源于毛囊上皮与间质毛乳头(dermal papillae，DP)的相互作用。毛乳头是真皮成分突入毛球内形成的特殊结构，为含血管和神经的间充质成分。毛乳头细胞(dermalpapilla cells，DPC)是组成毛乳头的唯一细胞，在毛囊的胚胎发生和周期性生长过程中起着十分重要的作用，一方面提供毛囊生长和分化必需的信号因子和营养支持，另一方面还决定毛囊的分化方向。因此，毛乳头细胞是毛囊研究的中心环节之一。

毛乳头是一个可诱导的结构，它能发送或接受信号，从而影响毛囊的发育和周期性生长。通过对小鼠/大鼠模型的研究，一些与毛囊周期性生长有关的调节分子如成纤维细胞生长因子(fibobalast growth factors，FGFs)、骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)、刺猬蛋白(sonic hedgehog，Shh)、神经营养因子(neurotrophins)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等已相继被鉴定出来。组成毛囊的细胞如DPC、外根鞘细胞(out root sheath，ORS)、毛母质细胞等可分泌这些生长因子及其受体；而且就单一细胞因子而言，其产生和分泌都与毛囊周期的特定时相有关。但是，关于这些细胞因子调节毛囊胚胎发生和毛囊周期性生长的具体分子机制如通过什么信号转导途径、与什么分子作用等均不十分清楚。Inamatsu等在实验中发现凝集生长状态的DPC仍能保持诱导毛囊发生的能力。为了探索哪些基因在DPC凝集生长状态下表达，筛选与DPC凝集生长相关的基因，宋志强博士等应用抑制性消减杂交技术成功地建立了凝集性生长的人毛乳头细胞差异表达基因cDNA文库，并从凝集生长状态的人毛乳头细胞中筛选出一批上调表达和下调表达基因。HSPC016即是通过上述方法筛选得到的与DPC凝集生长相关的基因，它被首次从CD34⁺造血干细胞/祖细胞中分离鉴定，HSPC016基因位于第三对染色体p21.31位点上，包含4个外显子，全长mRNA为3943bp(GENEBANK NM_015933)，HSPC016共有65个氨基酸，成熟蛋白分子量约7.2kDa，但功能不清。鉴于DPC具有干细胞的特点，如自我更新、凝集性生长、处于受保护的隐蔽位置、血供丰富等，有学者将DPC转化为红系及髓系血细胞观察发现在动物体内可维持达1年之久，我们推测HSPC016对维持DPC凝集性生长及其功能可能发挥重要作用。

基于上述原因和条件，利用基因工程制备人毛乳头细胞HSPC016蛋白质成为必然。有研究证实非糖基化后修饰的HSPC016的蛋白质同样具有促进毛乳头细胞增殖的能力，这就为原核表达有活性的HSPC016提供了理论基础，为进一步对该基因功能进行深入研究奠定了基础。

                            发明内容

本发明的目的就是提供一种高效制备基因工程人毛乳头细胞HSPC016蛋白质的方法，及其有关的表达载体和工程菌。

本发明的第一方面，提供一种基因工程人毛乳头细胞HSPC016的表达载体。该载体为含有人毛乳头细胞HSPC016基因序列的质粒pET-22b(+)，且HSPC016基因编码序列位于pET-22b(+)载体Nde I和XhoI酶切位点之间，克隆HSPC016基因的引物为：

P1 5’-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3’(Nde I)

P2 5’-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3’(XhoI)。

该表达载体是pET-22b(+)/HSPC016，其构建过程如附图1所示。

本发明的第二方面，提供一种基因工程菌。它是大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(购置NOVEGA公司)，并被本发明所述的表达载体所转化。该基因工程菌是pET-22b(+)/HSPC016/BL21。(自申请之日起30年内向公众提供该工程菌)

本发明的第三方面，提供一种表达基因工程人毛乳头细胞HSPC016目的蛋白的方法。该方法包括：

a)基因重组工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21用发酵罐高密度发酵；

b)离心收集细菌；

c)超声破菌，分离上清和沉淀，鉴定表达形式；

d)亲和层析纯化；

e)目的蛋白HSPC016的鉴定；

f)目的蛋白HSPC016促进毛乳头细胞增殖的活性实验：流式细胞仪及³H-TdR检测毛乳头细胞增殖情况。

本发明首次将HSPC016基因克隆至质粒pET-22b(+)在大肠杆菌中表达。其优势在于：一是目的蛋白质表达量高，表达率在28％以上。大肠杆菌表达系统的高效表达质粒pET-22b(+)是一种基于大肠杆菌T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子间特异性识别而建立起来的高效偶联表达系统——T7表达系统。使用该系统的各种表达质粒如pET-11c(+)，pET-21a(+)，pET-28a(+)，pET-30a(+)等都含有一段lac I、lac UV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段，用噬菌体DE3的溶原菌，如BL21(DE3)等作为表达宿主，经IPTG诱导表达，其基因的表达水平在目前使用的各种表达系统中是很有优势的。尽管如此，同一基因在该系统不同的表达质粒之间，或者在同一表达质粒不同酶切位点之间，其基因的表达水平也有很大差别。本发明反复试用多种表达质粒，并且更换不同酶切位点，确定使用pET-22b(+)作为表达质粒、HSPC016编码序列插入Nde I和Xho I酶切位点之间构建的克隆表达效果最好，表达率在28％以上，这是本发明的创新点之一。

二是加入6×His纯化标签，利于蛋白纯化。在构建克隆的引物设计中，下游引物已经去掉HSPC016基因ORF的终止密码子，使表达的蛋白带上载体pET-22b(+)的XhoI酶切位点之后序列翻译的6×His纯化标签。带有6×His纯化标签的目的蛋白可以被镍离子化的亲和层析柱高效特异地捕获，然后用一定浓度的咪唑溶液洗脱，从而实现目的蛋白与杂蛋白的分离纯化，而且改进了前期实验构建的重组子pcDNA3.1(+)/HSPC016几乎不表达、pPIC9K/HSPC016和pET-28a(+)/HSPC016表达率能达12％左右但纯化效果差的弱点，这是本发明的创新点之二。

三是选择pET-22b(+)作为表达可溶性外源蛋白HSPC016的载体，既保证了目的蛋白的高表达，又维持了目的蛋白在合成过程中形成的正确构象，保持了生物学活性。流式细胞仪检测和³H-TdR掺入实验均发现pET-22b(+)/HSPC016重组蛋白对第9代毛乳头细胞的增殖活性及其DNA合成具有促进作用，对第3代毛乳头细胞的增殖活性及其DNA合成与对照组相比无明显差异。这可能是由于低传代毛乳头细胞本身特异表达HSPC016蛋白，pET-22b(+)/HSPC016重组蛋白的介入不会对其增殖产生显著影响；而高传代毛乳头细胞一般不表达HSPC016蛋白，该蛋白的介入促进了毛乳头细胞的增殖。pPIC9K/HSPC016和pET-28a(+)/HSPC016重组蛋白对毛乳头细胞的增殖未见明显促进作用。这在国内外尚未报道，为本发明的创新点之三。

                            附图说明

图1：重组质粒pET-22b(+)/HSPC016的构建图

图2：目的基因HSPC016的ORF克隆

图3：pET-22b(+)/HSPC016重组表达质粒的酶切鉴定。

图4：pET-22b(+)/HSPC016基因重组菌诱导表达SDS-PAGE电泳图

图5：pET-22b(+)/HSPC016表达形式鉴定

图6：镍离子亲和层析法纯化重组洗脱图

图7：目的蛋白pET-22b(+)/HSPC016纯化后SDS-PAGE电泳

图8：流式细胞仪检测HSPC016重组蛋白对DPC增殖的影响；

图9：³H-TdR检测HSPC016重组蛋白对DPC增殖的影响。

                          具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1  人毛乳头细胞HSPC016的编码基因的克隆：

1.引物设计合成

由GenBank公布的HSPC016基因核苷酸序列确定其ORF序列195bp，根据酶切位点检索和引物设计原则，设计引物如下：

P1  5’-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3’(Nde I)

P2：5’-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3’(XhoI)

引物用Primer Premier 5.0软件设计和分析评价，由上海博亚生物技术有限公司合成，PAGE方式纯化。

2.目的基因的PCR扩增：

模板制备：pcDNA3.1(+)/HSPC016过夜培养菌液5ml 10000rpm离心5min去上清，加入0.5ml双蒸水混匀煮沸10min，同样离心后取上清作模板。

PCR扩增反应体系如下：

模板DNA                         1μl

P1(25pmol/μl)                  2μl

P2(25pmol/μl)                  2μl

dNTPs(2.5mmol/L each)           8μl

10×PCR buffer                  10μl

MgCl₂(25mmol/L)                 10μl

Ex-Taq DNA polymerase           1μl

ddH₂O                           66μl

total volume                    100μl

将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入40μl石蜡油。94℃预变性5min，94℃变性90s，60℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环，72℃完全延伸10min。

3.PCR产物的回收

(1)灌制可上样200μl的1.0％琼脂糖凝胶。

(2)将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳。

(3)在紫外线灯下切割分离含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP管。

(4)加入DNA binding buffer，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。

(5)加入500μl Washing buffer，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。

(6)重复步骤(5)。

(7)12000g离心1min，分离管移置另一干净1.5ml EP管，加入一定体积的TEbuffer，65℃孵育10min，12000g离心1min，取一定量电泳，UVP紫外光扫描检查回收效果。

PCR扩增效果如图2所示：

泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)

泳道2为目的基因HSPC016扩增产物(约195bp)。

表明目的基因HSPC016与预计(195bp)大小基本一致。

实施例2  重组质粒pET-22b(+)/HSPC016的构建及筛选

一.pMD18-T/HSPC016的构建

(一)连接反应

HSPC016的PCR产物经DNA胶回收后，通过紫外分光光度计检测其回收产物核酸含量为：200ng/μl，pMD18-T vector为：50ng/μl，control insert DNA：50ng/μl。根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的片段连接：

HSPC016(200ng/μl)              1μl

pMD18-T(50ng/μl)               1μl

ddH₂O                           3μl

ligation solution               5μl

Total volume                    10μl

Control insert DNA连接：

Contral insert DNA(50ng/μl)    1μl

pMD18-T(50ng/μl)               1μl

ddH₂O                           3μl

ligation solution               5μl

total volume                    10μl

16℃连接16h。

(二)连接产物转化及重组子的筛选、鉴定

1.E.coli DH5α感受态菌的制备(CaCl2法)

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的DH5a保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16h。

(2)挑取单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。

(3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD600为0.2～0.4时，8000g离心5min收集细菌。

(4)加入1ml预冷的0.1MCaCl2重悬沉淀，冰水浴3h。4℃8000g离心5min，弃上清。加入100μl预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。

2.含有X-Gal、IPTG的Amp⁺LB平板的制备

LB固体培养基用前熔化，待温度降至50℃左右加入Amp至终浓度为100mg/L，混匀后倾到平板，自然凝固。使用前2～3h取Amp⁺LB平板，加入40μl X-Gal、5μl IPTG，用L棒涂布均匀，置于37℃孵箱备用。

3.连接产物转化

(1)同时取三管感受态菌液各100μl，第一管加入连接反应产物；第二管加入control insert DNA连接产物，作为阳性对照；第三管不加外源DNA，作为阴性对照，冰水浴60min。42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。

(2)每管各加100μl LB培养液，37℃摇床培养1h。

(3)各管以8000g离心10min，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布平板，37℃孵箱培养过夜。

4.重组子pMD18-T/HSPC016的筛选与鉴定

(1)LB阴性对照平板布满细菌，Amp⁺LB阴性对照平板无菌落出现；阳性对照平板有蓝、白斑菌落生长，说明感受态菌的制备和连接反应两步操作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的蓝、白斑菌落分别接种Amp⁺LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

(2)质粒DNA抽提

[1]取菌液分装于1.5ml离心管中，12000g离心3min，留取沉淀。

[2]每管加100μl Solution I悬浮，充分振荡混匀。

[3]加入100μl Solution II，轻柔混匀，冰水浴5min。

[4]加入250μl Solution III，轻振混匀，室温放置10min。

[5]4℃、12000g离心10min，将上清移至分离管中。

[6]12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。

[7]加入500μl washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。

[8]重复步骤[7]。

[9]12000g离心1min，使乙醇完全挥发。

[10]将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g离心1min。

[11]取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

(3)酶切鉴定

质粒DNA进行Nde I+Xho I双酶切。

Recombinant plasmid DNA       5μl

Nde I                         0.5μl

Xho I                         0.5μl

10×buffer(H)                 1μl

ddH₂O                         3μl

total volume                  10μl

混匀，37℃水浴4h。电泳表明HSPC016基因已被克隆至pMD18-T中。

二.重组质粒pET-22b(+)/HSPC016的构建

pMD18-T/HSPC016质粒经Nde I+Xho I双酶切回收目的片段后与同样经Nde I+Xho I双酶切回收的pET-22b(+)载体相连接，构建重组质粒pET-22b(+)/HSPC016。

1.质粒抽提

大量抽提质粒pET-22b(+)以及pMD18-T/HSPC016，操作方法同前。

2.酶切反应

载体pET-22b(+)以及pMD18-T/HSPC016均用Nde I+Xho I双酶切，反应体系如下：

                           pET-22b(+)    pMD18-T/HSPC016

plasmid DNA                80μl         120μl

Nde I                      5μl          5μl

Xho I                      5μl          5μl

10×buffer(H)              20μl         20μl

ddH₂O                      90μl         50μl

total volume               200μl        200μl

混匀，37℃水浴4h。

3.酶切后目的片段的回收

灌制1.0％琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中各加入20μl 10×Loadingbuffer，80V电泳待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳，分别切割含pMD18-T/HSPC016的小片段(约195bp)以及pET-22b(+)的大片段(约5493bp)的琼脂糖凝胶，Omega胶回收试剂盒回收所需片段，操作同前。

4.连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，HSPC016的ORF片段为150ng/μl，载体片段pET-22b(+)为：200ng/μl。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

ORF fragment(150ng/μl)       2.5μl

pET-22b(+)(200ng/μl)         2μl

ddH₂O                         0.5μl

ligation solution             5μl

total volume                  10μl

16℃连接3h。

5.连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

(1)E.coli DH5α感受态菌的制备(CaCl2法)：同前。

(2)Amp⁺LB平板的制备：同前。

(3)连接产物转化：

[1]同时取5管感受态菌液各100μl，一管加入pET-22b(+)质粒作为阳性对照；一管不加外源DNA，作为阴性对照；其余三管分别加入上述连接反应产物，冰水浴60min。置42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。

[2]每管各加100μl LB培养液，37℃摇床培养1h。

[3]各管以5000g离心10min，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布Amp⁺LB平板，37℃孵箱培养过夜。

(4)阳性重组子的筛选与鉴定

[1]不含抗生素的LB平板布满细菌，Amp⁺LB阴性对照平板无菌落出现；阳性对照平板有菌落生长，说明感受态菌制备操作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落接种Amp⁺LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

[2]质粒抽提。

[3]质粒DNA进行Nde I+Xho I双酶切鉴定。

同上以Nde I+Xho I进行双酶切鉴定重组质粒pET-22b(+)/HSPC016，阳性重组质粒经双酶切后出现约195bp左右的插入片段，大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功。酶切鉴定结果如图3所示：

泳道1为重组质粒pET-22b(+)/HSPC016双酶切Nde I/Xho I产物(约195bp)；

泳道2为重组质粒pET-22b(+)/HSPC016双酶切Nde I/Xho I产物(约195bp)；

泳道3为核酸(DNA)分子量标准(Marker)。

6.基因碱基序列测定

采用T7启动子和终止子通用引物测定重组质粒pET-22b(+)/HSPC016的碱基序列，由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明所扩增的HSPC016基因ORF序列与GenBank公布的序列完全一致。

实施例3  pET-22b(+)/HSPC016在E.coli BL21(DE3)中的表达

一.HSPC016的表达

1.pET-22b(+)/HSPC016/BL21(DE3)工程菌株的构建

(1)制备感受态BL21(DE3)，操作同DH5α感受态的制备。

(2)将阳性重组子pET-22b(+)/HSPC016转化至感受态BL21(DE3)中，操作同前。

通过Amp⁺抗性筛选和Nde I/Xho I双酶切鉴定，确认重组质粒已成功转入BL21(DE3)中。

2.SDS-PAGE检测目的蛋白HSPC016的表达

(1)重组工程菌的诱导

将重组工程菌接种于3ml Amp⁺LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20ml Amp⁺LB培养液中，37℃摇床培养(200rp/min)待OD₆₀₀≈0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L开始诱导，于诱导0、1、2、3、4、5、6小时取样并分别测定其OD₆₀₀值，同时作空载体菌诱导对照。

(2)HSPC016的表达

按公式：菌液量(ml)＝1/OD₆₀₀取样离心，100μl双蒸水重悬沉淀，加入100μl 2×上样缓冲液，混匀，煮沸15min备用。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，待凝胶完全聚合后，拔出上样梳，用阴级缓冲液清洗上样孔并用滤纸吸干孔内水分。待测样本与蛋白分子量标准同时上样，当考马斯亮蓝到达凝胶底部时停止电泳。凝胶于固定液中固定30～60min，考马斯亮蓝加热至60℃染色20min，脱色液脱色至背景无色。UVP扫描分析电泳结果，计算目的蛋白条带的相对含量。

Nde I/Xho I双酶切鉴定确认重组质粒成功转入，并且诱导表达良好的重组工程菌命名为pET-22b(+)/HSPC016，按照实验室常规方法进行菌种保存。

重组工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21(DE3)经IPTG诱导后，SDS-PAGE观察摇瓶条件下目的蛋白表达情况。与对照菌相比重组菌在7.2kDa附近均出现新的蛋白表达条带(箭头所示)，与推定目的蛋白Mr为7255Da基本相符，且表达量随诱导时间的延长而增加，摇瓶条件下于6h时达到高峰，UVP扫描分析目的蛋白约占菌体总蛋白的28％。诱导表达结果如图4所示：

泳道1：空质粒菌pET-22b(+)诱导前(0hr)；

泳道2：空质粒菌pET-22b(+)诱导后(4hr)；

泳道3～9：工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21分别诱导0，1，2，3，4，5，6hr；

泳道10：蛋白质分子量标准(Marker)。

基因重组菌经过诱导后在分子量7.2kDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

二.HSPC016表达形式的鉴定

1.常规方法培养细菌，培养结束后离心收集细菌并留取培养液浓缩10倍(PEG10000透析)待测。

2.超声破菌

(1)超声波裂解菌体，功率300W超声30s，间歇30s，工作30次。取样染色后于显微镜下观察破菌效果，未破细菌＜2个/油镜视野为裂菌完全。750g×30min差速离心去掉未破细菌，差速上清经12000g×30min高速离心后，分离上清和沉淀。

(2)将分离所得上清和沉淀，与诱导前后的全菌以及浓缩后的培养液一起作SDS-PAGE电泳。

利用超声波裂解或高压均质破菌诱导后的工程菌HSPC016进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式。结果显示：目的蛋白主要存在于破菌上清液中，在破菌沉淀和培养液泳道中无明显的目的蛋白条带，说明目的蛋白HSPC016为可溶性表达。表达方式鉴定结果如图5所示：

泳道1：诱导前全菌；

泳道2：诱导后全菌；

泳道3：破菌上清；

泳道4：破菌沉淀；

泳道5：培养液(浓缩)；

泳道6：蛋白质分子量标准(Marker)。

三.目的蛋白N-端氨基酸测序鉴定

将诱导表达的样品SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，考马斯亮兰染色，脱色后切下目的蛋白条带用塑料袋密封后送至中国医学科学院基础医学研究所用全自动测序仪进行N-端氨基酸序列分析。所测N-端5个氨基酸依次为甘氨酸-蛋氨酸-丝氨酸-甘氨酸-精氨酸(GMSGR)，与实验设计序列完全吻合。

实施例4  基因重组菌的发酵

发酵工艺如下：

采用德国B.Bron 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每0.5h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌。

发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/L CoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/LMnCl₂·4H₂O、4mg/L CuSO₄而成。

发酵结束后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。

结果：10L发酵菌液可以收获细菌湿重800克。

实施例5  目的蛋白HSPC016的纯化

1.Chelating Sepharose HP或Chelating Sepharose FF亲和柱纯化

1)用相应缓冲液以0.5mL/min流速平衡Chelating Sepharose HP或ChelatingSepharose FF亲和柱(柱体积10ml)，调校A280nm基线。

2)将经过超滤的上清以0.5mL/min流速上柱。

3)待上样20mL后，用平衡缓冲液冲洗杂蛋白至A280nm回复至基线。

4)用洗脱缓冲液梯度洗脱结合于柱上的目的蛋白(0-100％B，20min)，收集洗脱峰，如图6所示：

目的蛋白峰(fraction 5)获得95％以上的纯度，目标蛋白的回收率在71％左右。1为流穿峰；2为杂蛋白洗脱峰；3为目的蛋白峰。

5)合并目的蛋白峰，测定蛋白浓度。超滤浓缩至适当浓度以备凝胶过滤层析纯化。

2.Superdex200凝胶过滤层析纯化：

1)先以凝胶过滤平衡缓冲液平衡层析柱，0.5mL/min，100min。

2)将HSPC016蛋白注入Superdex200凝胶过滤柱，收集目的蛋白峰。

纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE(如图7)，检测其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。

泳道1：纯化前工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21；

泳道2：空质粒菌pET-22b(+)诱导后(4hr)；

泳道3～9：工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21纯化后各上样15μl；

泳道10：蛋白质分子量标准(Marker)。

实施例6  目的蛋白HSPC016促进毛乳头细胞增殖的活性实验

DMEM培养基和小牛血清购自Hyclone公司；第3代毛乳头细胞和第9代毛乳头细胞由申请人用“二步酶法”制备并常规保存[方法见文献：钟白玉，杨卫兵，杨希川，等.二步酶消化法分离人头皮毛乳头细胞[J].中华皮肤科杂志，2003，36(7)：406.]。

促进毛乳头细胞增殖活性实验包括二个方面：

1.流式细胞仪检测  细胞在培养瓶内生长至70％～80％汇合时，加入HSPC016蛋白质至终浓度为0.1mg/ml；37℃、5％CO2培养箱培养48h，用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，离心弃上清，PBS洗涤3次；用70％乙醇固定；离心弃乙醇，PBS洗涤2次，去除固定液；加RNA酶(1g/L)，37℃孵育30min，然后用溴化乙锭(EB)作细胞DNA染色，4℃避光作用30min。结果显示：第3代DPC对照组的细胞处于S期的细胞和增殖常数(PI)分别为80.73和90.01，而HSPC016重组蛋白处理组处于S期的细胞和PI值分别为33.81和97.03，二者比较无显著差异，说明HSPC016重组蛋白对第3代DPC的增殖没有作用；第9代DPC对照组的PI值为0，HSPC016重组蛋白处理组的PI值为42.60，说明该重组蛋白促进第9代DPC的增殖(见图8)。

2.³H-TdR检测  取对数期生长细胞，制成3×10⁵/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板，1ml/孔；当细胞处于对数生长期时，每孔加入终浓度为0.1mg/ml的HSPC016蛋白质，培养24h后加入终浓度为3.7×10⁷Bq/ml的³H-TdR，继续培养6h；终止培养，弃培养液；用0.01mol/L的PBS洗涤2次，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化；用10％TCA重复洗2次；加入0.5ml 0.3Eq NaOH，在60℃处理30min，然后冷至室温；收集裂解液，移入闪烁瓶中，加5ml闪烁液，用液体闪烁记数仪测定每分脉冲数(cpm)。结果表明：与对照组相比，HSPC016重组蛋白对第3代DPC的增殖及DNA合成没有显著促进作用(P＝0.271138)；而HSPC016重组蛋白对第9代DPC的增殖及DNA合成具有显著的促进作用(P＝0.008647)(见图9)。

Claims (7)

1.一种基因工程人毛乳头细胞HSPC016基因的表达载体，其特征在于：该载体为含有人毛乳头细胞HSPC016基因功能序列的质粒pET-22b(+)，HSPC016编码序列位于pET-22b(+)载体上Nde I和Xho I酶切位点之间，载体是pET-22b(+)；克隆HSPC016基因的引物为：

P1 5’-CATATGTCCGGCCGCGAAGGT-3’(Nde I)

P2 5’-CTCGAGCTTTTTGCCAGATTTCT-3’(XhoI)。

在引物P2的设计中，已经去掉HSPC016基因ORF的终止密码子，使表达的蛋白带上载体pET-22b(+)的Xho I酶切位点之后序列翻译的6×His纯化标签。

2.一种基因工程菌，其特征在于：它是大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，它被权利要求1所述的载体所转化。

3.一种制备人毛乳头细胞HSPC016目的蛋白的方法，其特征在于：IPTG诱导大肠杆菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21表达目的蛋白HSPC016，经对重组工程菌发酵、离心收集细菌、超声破菌、分离上清和沉淀、鉴定表达形式和纯化得到可溶性目的蛋白HSPC016。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：重组工程菌pET-22b(+)/HSPC016/BL21的发酵方法如下：采用德国B.Braun 5L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每0.5h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％；在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导6h收菌；发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，是在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/LCoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/L MnCl₂·4H₂O、4mg/LCuSO₄而成。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于离心收集细菌、超声破菌、分离上清和沉淀步骤如下：

(1)将离心收集的485g湿菌按80g/份分成6份分别用10倍体的不同缓冲液重悬；

(2)高压均质机70MPa破菌3次，油镜检查破菌效果；

(3)细胞破碎液16000g×30min 4℃离心收集上清液；

(4)上清液16000g×30min 4℃离心弃沉淀；

(5)上清过0.22μm滤膜，收集滤液。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：载体pET-22b(+)上Xho I酶切位点之后的6×His纯化标签可以与镍离子特异结合，因此，选用镍离子亲和纯化填料选自Chelating Sepharose HP或Chelating Sepharose FF纯化。

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