CN1203182C - 生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体 - Google Patents

Abstract

生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，属生物高新技术领域产品。系采用人工合成单价或双价SS基因，分别插入pET32表达系统和pGEX-6P-1表达系统适当位点，转化感受态大肠杆菌。从而获得E.coli-SS 1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS 2c/GST3株基因工程体。该基因工程体经发酵，提取纯化表达产物，即可配制成激生3号苗a、b、c3个型的油乳苗。本疫苗生产成本低廉，适于工业化生产。本基因工程体表达产物免疫原性良好，用于家畜和家禽，免疫增重效果显著，且其安全性高，无残留。图为：SS 1a/pET32c重组质粒的构建

Description

生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体

本发明为生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，属生物高新技术领域产品，专用于生产能促进家畜、家禽生长的生长抑素(SS)基因工程亚单位苗(新型激生系列苗)。

生长抑素基因工程活载体苗及生长抑素(SS)基因工程亚单位苗(激生系列苗)促进动物生长的原理是通过激素的免疫调控促进动物生长。参与生长调节的激素有多种，其中由垂体分泌的生长激素(GH)和肝脏分泌的生长介素(SM)，亦称胰岛素样生长因子(IGFs)是调节核心，而GH和SM的合成和分泌又受下丘脑分泌的两种高位激素——生长激素释放激素(GRH)和生长抑素(SS)所调控。前者促进GH的合成和分泌，后者则抑制其合成和分泌。GH又作用于肝脏上的受体，促使SM的合成和分泌，SM则直接作用于多种组织，促进蛋白质的合成和细胞增殖，从而促使肌肉、内脏和骨骼的生长。SS系列苗免疫后，能诱导动物产生SS抗体，中和SS，解除生长抑制，使GH和SM等正向调节的激素水平提高，从而促进动物生长。见图1。

自1981年以来，国外有不少报道关于应用人工合成的生长抑素(SS)，连接各种载体蛋白，如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白等，制备合成肽苗。用于免疫牛、羊、猪等均能促进GH释放增加，从而促进家畜生长，可提高日增重10％左右。也有应用SS合成肽苗免疫动物，制备SS抗血清，被动免疫家畜以促进生长的报道。但由于合成肽成本太高，上述研究均停留在理论研究水平，未能形成商品在畜牧生产中应用。

现有技术中本课题组发明人之一——南京农业大学杜念兴教授，于七五期间主持农业部生物技术重点项目——生长抑素基因工程疫苗研究，先后构建了3个基因工程体。其中以痘苗病毒为载体，将SS基因与乙肝表面抗原(HBsAg)基因连接，构建成HBs/SS融合基因，将其插入痘苗病毒载体中，获得能表达HBsAg/SS融合蛋白的重组痘苗病毒(vv-HBs/SS)。用该基因工程体制成生长抑素基因工程活载体苗，简称激生1号苗。经实验室小试，增重效果显著，并已通过农业部鉴定，被认为是国内外第一个有望用于促进家畜生长的基因工程苗，处于国际领先水平，建议进行中试，尽快将本成果推广应用，转化为生产力，1997年经国家科委(科技部)列入863中试项目。经农业部生物基因工程安全管理委员会审批为安全等级I级，同意进行中间试制。经中间试制和田间试验结果表明，该疫苗生产工艺简单，不造成环境污染，免疫猪、牛、羊等家畜安全有效。该技术2000年通过科技部验收，经农业部生物基因工程安全管理委员会批准商品化生产。同年获得大北农科技成果奖和香港中华专利博览会金奖，发明专利申请号：00107295.1。

鉴于激生1号疫苗只能用于家畜，不能用于家禽，免疫期只有3个月，再次免疫时因产生抗痘苗病毒抗体，效果不理想。为弥补以上缺点，又设计研制了生长抑素基因工程亚单位苗(激生2号)，发明专利申请号：00105675.1。

基因工程亚单位苗和基因工程生产多肽类药物，表达产物的提取费用往往占生产成本的70％，第一个SS亚单位苗(激生2号苗)采用pET32c质粒中的硫氧还蛋白(TRX)为载体。构建时，将主基因SS插入载体蛋白TRX的长臂中间，在SS之后，还留有一个长长的尾巴。这样就使得作为主要免疫原的SS不能充分暴露，影响免疫原性的充分发挥，并且其表达产物主要以包涵体形式存在，不利于提取纯化。见图2。

本发明的目的是针对现有技术中激生2号苗的基因工程体的缺陷，构建新型SS基因工程亚单位苗(激生3号苗)的基因工程体。该基因工程体表达产物呈水溶性，易于提取，而作为免疫原的SS又充分暴露，达到充分发挥SS基因的免疫原性目的。设置不同类型达到互测SS抗体的目的。

本发明所提供的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体(商品名为“激生3号”)，采用人工合成SS基因，将其插入载体蛋白表达系统，转化感受态大肠杆菌，提取重组质粒并经酶切鉴定、序列测定验证而成。生长抑素基因SS的氨基酸序列如下：

其特征在于，SS基因设计中含终止子。其设计通式为：

5’-保护性碱基-内切酶-框架保证碱基-单价SS基因或双价SS基因-终止子-内切酶-保护性碱基-3’

其中人工合成SS基因为单价SS基因或双价SS基因，在其3’端设有终止子。选用硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统时，SS基因插入位点以后的密码子不能表达，其长长的尾巴被截去，作为免疫原的SS得以充分暴露。见图3、4。选用载体蛋白为谷胱甘肽转移酶(GST)pGEX-6P-1系统时，因其本身没有尾巴，SS亦能充分暴露。共构建包括用单价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 1a/TRX、用双价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 2b/TRX和用双价SS基因与本身没有尾巴的pGEX-6P-1表达系统重组获得的基因工程体E.coli-SS 2c/GST 3株基因工程体。

用单价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统获得的基因工程体，分类：大肠埃希氏杆菌，命名：E.coli-SS 1a/TRX，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：中国.北京.中关村.2714信箱  邮政编码：100080

保藏号：0705

用双价SS基因与截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)pET32表达系统获得的基因工程体，分类：大肠埃希氏杆菌，命名：E.coli-SS 2b/TRX，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：中国.北京.中关村.2714信箱  邮政编码：100080

保藏号：0707

用双价SS基因与本身没有尾巴的pGEX-6P-1表达系统获得的基因工程体，分类：大肠埃希氏杆菌，命名：E.coli-SS 2c/GST，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：中国.北京.中关村.2714信箱  邮政编码：100080

保藏号：0708

本发明所提供的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：

1)本发明所提供的新型SS基因工程亚单位苗(激生3号苗)的基因工程体，构建过程中采取切去TRX的部分长尾的办法，不仅不影响表达水平，而且表达水平高、表达量在20％以上，表达产物是水溶性，易于提取，提取纯度在85％以上；而作为免疫原的SS又充分暴露，可以充分发挥SS基因的免疫原性。克服了激生2号苗的基因工程体主要以包涵体形式存在、表达产物难以提取的困难，并且其主基因SS之后留有一个长长的尾巴，影响免疫原性充分发挥的缺陷。

2)用本发明新构建的基因工程体E.coli-SS 1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS2c/GST(3株)分别用于生产3种生长抑素基因工程亚单位苗，——激生3号a型、b型和c型。其基因工程体表达产物为水溶性，提取和纯化方便，生产工艺简单，成本低廉，适合于大规模工业化生产。用于免疫动物，增重20％以上，效果显著，安全性高，无激素和药物残留，可用以替代促进动物生长的化学添加剂，无任何潜在危险。

3)用本发明新构建的基因工程体(3株)分别用于生产3种生长抑素基因工程亚单位苗，——激生3号a型、b型和c型。它们都是以SS为主基因，其基本设计相似而又功能互补。激生3号苗a型和b型是将单价SS基因或双价SS基因分别插入除去长尾的TRX基因，构建成表达水平高、表达产物是水溶性、易于提取，而作为免疫原的SS又充分暴露的新型基因工程体。通常，疫苗在做动物试验时，检测抗体是一项关键技术。常规的检测SS抗体方法是用纯品SS交联BSA、OVA等载体蛋白作为包板抗原，用ELISA测定SS抗体。但SS价格十分昂贵，为此本发明设计了激生3号苗c型，将双价SS基因插入谷胱甘肽转移酶(GST)为载体蛋白的pGEX-6p-1质粒中，该系统表达水平也较高。这样可用c型苗的表达产物包板，检测a型和b型的SS抗体，反之亦可用a型、b型的表达产物检测c型苗的SS抗体。

4)本疫苗既能用于家畜，也能用于家禽；并可多次接种，加强免疫；可以单独应用，也可与激生1号苗联合应用；既能提高畜产品产量，还能提高饲料转化率，降低饲养成本，其应用前景十分广阔。

图1 生长抑素免疫调控原理图

    SSV-1  激生1号疫苗      SSV-3  激生3号疫苗

    SSAb   SS抗体           SS     生长抑素

    GH     生长激素         GHRH   生长激素释放激素

    SM     生长介素         DA     神经递质

图2 SS-N/X(激生2号苗)融合蛋白的三维结构

    1 TRX硫氧还蛋白    2 SS生长抑素    3 TRX长尾

图3 SS 1a/TRX融合蛋白的三维结构

    1 TRX硫氧还蛋白    2 SS生长抑素

图4 SS 2b/TRX融合蛋白的三维结构

    1 TRX硫氧还蛋白    2 SS生长抑素    2′SS生长抑素

图5 SS的三维结构

图6 SS 1a/pET32c重组质粒的构建

图7 SS 1a/pET32c重组质粒的酶切鉴定

    1 Marker    2 重组质粒+NcoI    3 重组质粒+XhoI    4 重组质粒+EcoRI    5 重组质粒对照

图8 SS 1a/TRX融合蛋白的表达水平

    1 蛋白质分子量标准

    2-5  诱导后的菌体裂解液，加样量分别为：200μl、100μl、80μl和50μl

图9 SS 2b/pET32c重组质粒的构建

图10 SS 2c/pGEX-6P-1重组质粒的构建

实施例：

总体设计和技术路线

SS是由14个氨基酸组成的短肽，共遗传保守性很强，各种鸟类和哺乳动物之间无种属差异。因其分子量较小，必需与载体蛋白连接形成SS-载体融合蛋白才有免疫原性。因此只须构建能高效表达SS融合蛋白的基因工程体，即可用其表达产物制备SS亚单位苗，用于各种家畜和家禽的免疫。

SS的氨基酸序列如下：其三维结构见图5

选择表达系统和最佳插入位点是技术关键。为保障本研究目标的顺利完成我们选用了pET32系统，载体蛋白为硫氧还蛋白(TRX)和pGEX-6P-1系统，其载体蛋白为谷胱甘肽转移酶(GST)。

为使SS基因在大肠杆菌中高产表达，以天然SS氨基酸序列为标准，将大肠杆菌使用频率低的4个密码子(AAG、ACT、ACA和TGT)分别更换成使用频率较高的密码子(AAA、ACC、ACC、和TGC)，设计SS基因如下：

 1   2   3   4   5   6   7   8   9  10  11  12  13  14

Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys

GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC

本发明SS基因工程亚单位疫苗(激生3号系列疫苗)的基因工程体构建的技术路线为：人工合成单价SS基因或双价SS基因→插入pET32c或pGEX-6P-1→转化感受大肠杆菌→重组质粒的酶切鉴定→重组质粒的序列测定→完成基因工程体构建。

基因设计的通式为：5’-保护性碱基-内切酶-框架保证碱基-单价SS基因或双价SS基因-终止子-内切酶-保护性碱基-3’

实施方法

1.E.coli-SS 1a/TRX基因工程体构建

1.1 单价SS基因的人工合成

合成两端有NcoI和XhoI酶切位点的正负2条核苷酸链：

正链5’ CATGGGA GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC

         NcoI

            AAC TCC TGC  TAA TGA AC 3’

                         终止子

负链3’CCT CGA CCG ACG TTT TTG AAG AAG ACC TTT TGG AAG TTG AGG

      ACG  ATT ACT T GA GCT 5’

          终止子   XhoI

退火后即可直接插入Nco1和XhoI酶解的pET32c质粒，构建激生3号苗a型的基因工程体-Ecoli-SS 1a/TRX。见图6。

1.2 SS基因克隆和重组质粒构建

1.2.1 单价SS基因的重组和重组质粒的构建

1.2.1.1 SS基因片段的退火

合成的单价SS基因的正链和负链，分别用灭菌超纯水溶解成浓度为100pmol/μl的溶液，各取2μl，加入72μl的灭菌超纯水中混匀，置沸水浴中2min后，缓缓冷却至室温。

1.2.1.2 pET32c质粒的提取，酶切及回收

pET32c质粒的提取参照[美]J萨姆布鲁克等著，《分子克隆实验指南(第二版)》上介绍的方法进行。

用NcoI及XhoI对pET32c质粒进行双酶切，具体方法参照TakaRa公司限制酶使用方法说明书进行，反应体系如下：

NcoI                 1μl

XhoI                 1μl

10×buffer k         2μl

0.1％BSA             10μl

pET32c               10μl(约10μg)

灭菌超纯水定容量     20μl

上述混合物于37℃水溶中，反应1h。取10μl酶切产物进行琼脂糖(含EB)凝胶电泳，在紫外灯下切下酶切大片段，置液氮中5min，然后置37℃水浴中溶化，10000r/min离心10min，吸上清，-20℃保存备用。

1.2.1.3 连接

DNA连接反应参照TaKaRa公司连接试剂盒使用说明书进行，反应体系如下：

PET32c双酶回收产物   2.5μl

人工合成的SS基因     6.5μl

10DNA连接缓冲溶液1   10μl

上述混合物16℃反应5h后，所获得的重组质粒(SS/pET32c)，即可用于转化大肠杆菌。

1.2.1.4 转化

取上述连接后的重组质粒(SS/pET32c)5μl转化100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体操作参照《分子克隆实验指南》方法进行。取200μl转化物涂布含Amp50ug/μl的LB琼脂平板。同时设未转化的感受态细胞(阳性对照)和pET32c质粒转化的感受态细胞对照(阳性对照)，接种后平板置37℃培养18h。

1.2.1.5 重组质粒的酶切鉴定

NcoI和XhoI在pET32c质粒多酶切位点的最外侧，其间尚有EcoRI、HandIII等位点。当pET32c质粒插入SS基因后，EcoRI和HindIII 2个位点应该消失，而NcoI和XhoI酶切位仍然存在。据此原理，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤培养基扩大培养后，取质粒分别用HindIII、EcoRI、NcoI和XhoI进行单酶切。HindIII和EcoRI酶切位点消失，而NcoI和XhoI仍存在表明克隆成功。见图7。

1.2.1.6 重组质粒的序列分析

挑选经酶切鉴定后的重组质粒，由上海博采生物技术公司进行序列测定，其中第514～580bp即SS基因，与原设计完全符合，证明克隆正确。SS/pET32c重组质粒构建成功，所转化的重组大肠杆菌(Ecoli-SS1a/TRX)即可用于生产激生3号疫苗a型。其表达产物为SS1/TRX融合蛋白。

1.3 重组大肠杆菌(基因工程体)的表达

1.3.1 摇瓶培养表达

挑取重组大肠杆菌(Ecoli-SS 1a/TRX)单菌落，接种3ml含Amp(70μg/ml)的LB培养基，37℃震摇过夜。次日按5％比例接种30ml的LB培养基中，于37℃震摇培养3.5～4h，取样测OD₆₀₀至0.5左右，取出1ml至Eppendorf管中，10000r/min离心1min，弃上清，沉淀菌体置-20℃保存备用，作为诱导前对照。其余培养物加入浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达3～4h，同上法取1ml诱导后菌液离心收集菌体，供表达水平的检测。

用250L发酵罐，加200LLB培养基，按2％的量接种种子液，37℃发酵2h，OD₆₀₀达0.9时，加入IPTG诱导表达5h，OD₆₀₀达1.2时，离心收获菌体，经SDS-PAGE和灰度扫描，SS/TRX融合蛋白表达量达25％。用渗透休克法提取SS/TRX融合蛋白，一次性地获得SS/TRX融合蛋白150g，纯度在85％以上。

1.3.2 表达水平的测定

取诱导前和诱导后的菌体，用少量无菌PBS重悬，再加等体积的2×载样缓冲液，置沸水中煮沸5min，各取10μl进行SDS-PAGE电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝(R250)染色，脱色后用凝胶灰度扫描仪测定表达产物的相对含量。在分子量18.5KD左右出现一条SS/TRX融合蛋白主带，表达量达20％以上。见图8。

1.4 疫苗制备和免疫小试

收获的SS/TRX融合蛋白按常规方法配成油乳苗，使融合蛋白的含量为0.4mg/ml，即激生3号苗a型。用于免疫架子猪90头，肌肉注射1ml/头；40d后加强免疫一次，观察3个月，平均提高日增重12％。免疫1kg左右体重幼兔20只，肌注0.1ml/只，间隔40d，加强免疫一次，共加强免疫2次，观察至140d时，试验兔提高日增重20％，效果显著，并且比激生1号苗更为安全。

2.E.coli-SS 2b/TRX基因工程体构建

2.1 双价SS基因的人工合成

为保证2个SS的立体构型不互相干扰，在二者之间插入一个6个氨基酸的连接肽。

2.1.1 用于插入pET32c质粒的双价SS(b型)基因

按上述通式设计双价SS基因如下：

5’-CATG CCATGGCT ATG GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC

          NcoI

TTC ACC TCC TGC  GCC CTG CTG ATC GCC GTTGCT GCC TGC AAA AAC

                        连  接  肽

TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC  TAA TGA C TC GAG CGG-3，

                                     终止子   XhoI

合成正链、负链2条中间互补的基因片段如下：

正链：5’-CATG CCATGGCT ATG GCT GGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC

                NcoI

       TTC ACC TTC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC AAA-3’

负链：5’-CCG CTCGAG TCATTA GCA GGA GGT GAA GGT TTT CCA GAA GAA

              XhoI  终止子

GTT TTT GCA GCC AGC AAC GGC GAT CAG CAG GGC GCA GGA GGT GAA-3’

退火、延伸、补齐后、获得上述设计的双价SS基因，经Nco1+XhoI双酶切后插入经相同酶切的pET32c质粒后转感受态大肠杆菌即获得可用于生产激生3号苗b型的基因工程体Ecoli-SS 2b/TRX。见图9。

2.2 双价SS2b型基因克隆和重组质粒的构建

2.2.1 双价SS2b型基因片段的退火、延伸、补齐

人工合成双价SS2b型基因的2条核甘酸链按2.1.1所述方法退火。先按《分子克隆实验指南上介绍的方法》配制10×dsDNA合成反应缓冲液，然后按下法配制反应液：

退火后的DNA片段              50μl

10×dsDNA合成反应缓冲液      10μl

10mmol/L dNTP                10μl

灭菌超纯水                   8.5μl

DNA聚合酶1 Klenew片段        1.5μl

混匀后，置37℃水浴1.5h，将该DNA片段延伸、补齐。然后再加入5mmol/L NaCl6μl，无水乙醇300μl，置冰浴中过夜，12000g离心15min，取沉淀，再加入预冷的70％乙醇200μl，混匀，同上法离心，取沉淀悬浮于20μl pH8.0的TME缓冲液中。即获得按设计要求的双价SS2b型基因。-20℃冻存备用。

2.2.2 双价SS2b型基因的酶切。

回收的双价SS2b型基因用NcoI和XhoI双酶切，酶切产物回收后，即可直接用于连接反应。

2.2.3 pET32c质粒的提取，酶切和回收

质粒的提取按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行，用NcoI和XhoI双酶切。取10μl酶切产物进行1％琼脂糖电泳，回收酶切大片段，置液氮中冷冻10min，然后置37℃水浴中融化，10000r/min离心10min，吸取上清，置-20℃冻存备用。

2.2.4 连接

按DNA连接试剂盒说明书进行，其反应体系如下：

pET32c双酶切回收产物       2.5μl

双价SS基因双酶切回收产物   6μl

DNA连接溶液1               1.5μl

混匀后，置16℃反应5小时后，立即用于转化。

2.2.5 感受态细胞的制备

参照《分子克隆实验指南》介绍的方法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

2.2.6 转化

取10μl连接产物转化100μl BL21(DE3)感受态细胞，具体操作参照《分子克隆实验指南》介绍的方法进行。

取200μl转化大肠杆菌，涂布含Amp 50μg/ml的LB琼脂平板，同时设未转化的感受态大肠杆菌作对照(阴性对照)，接种后置37℃温箱，培养18h。

2.2.7 重组质粒的酶切鉴定

同2.1.5挑选转化后的单个菌落接种含Amp的LB肉肠培养基扩大培养后，提取质粒。图示HindIII和EcoRI酶切位点消失，而NcoI和XhoI仍存在表明克隆成功。用HindIII、EcoRI、NcoI和XhoI单酶切。

2.2.8 重组质粒的序列分析

经筛选获得的阳性重组质粒，由上海博采生物技术公司进行序列测定。表明双价SS2b型基因已正确插入pET32c质粒的相应位点，新转化的重组大肠杆菌(Ecoli-SS 2b/TRX)即可用于生产激生3号苗b型。其表达产物为SS2b/TRX，三维结构见图4。

3 E.coli-SS 2c/GST基因工程体构建

3.1 用于插入pGEX-6P-1质粒的双价SS(C型)基因的人工合成

同上法设计双价SS基因如下：

5’-AAT GGATCC GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC ACC

        BamHI

TCC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC

TGG AAA ACC TTC ACC TCC TGC TAATGA CTC GAG ATC

                            终止子 XhoI

同上法合成正链、负链2条中间互补的基因如下：

正链：5’-AAT GGATCC GCT GGC TGC AAA AAC TTC TTC TGG AAA ACC TTC

             BamHI

ACC TCC TGC GCC CTG CTG ATC GCC GTT GCT GGC TGC-3’

负链：5’-GAT CTCGAG  TCATTA GCA GGA GGT GAA GGT TTT CCA GAA GAA

             XhoI   终止子

          GTT TTT GCA GCC AGC AAC GGC GAT CAG CAG GGC GCA GGA

          GGT GAA-3’

退火延伸、补齐后，获得上述设计的双价SS基因，经BamHI+XhoI双酶切后，插入经相同酶切的pGEX-6P-1质粒，转化感受态大肠杆菌即构建成用于生产激生3号c型苗的基因工程体-Ecoli-SS 2c/GST。见图10。

3.2 双价SS2c型基因克隆和重组质粒构建

3.2.1 双价SS2c型基因的退火、延伸、补齐

双价SS2c型基因的2条核苷酸链，按2.2.1方法退火、延伸、补齐、回收，制备成符合设计要求的双价SS2c型基因，-20℃冻存备用。

3.2.2 双价SS2c型基因的酶切

回收的双价SS2c型基因用BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物回收后，即可直接用于连接反应。

3.2.3 pGEX-6p-1质粒的提取，酶切和回收

同2.2.3方法进行。

3.2.4 连接

同2.2.4方法进行。

3.2.5 感受态细胞的制备

同2.2.5方法进行。

3.2.6 转化

同2.2.6方法进行。

3.2.7 重组质粒的酶切鉴定

在pGEX-6P-1质粒的多酶切位点中，在BamHI和XhoI位点中尚有1个SmalI位点。据此，如将双价SS2c型基因片段插入该质粒后，则SmalI位点消失，仍保留BamHI和XhoI位点。同2.1.5挑选转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤培养基扩大培养后，提取质粒，分别用BamHI、XhoI和SmalI单酶切。结果SmalI位点消失，而BamHI和XhoI位点仍保留表明克隆成功。

3.2.8 重组质粒的序列分析

经筛选获得的阳性质粒，由上海博采生物技术公司进行序列测定，表明双价SS2c型基因已正确插入pGEX-6P-1质粒，新转化的重组杆菌(Ecoli-SS 2c/GST)，即可用于生产激生3号菌c型。其表达产物为SS-SS/GST融合蛋白。

上述3株E.coli-1a/TRX、E.coli-SS 2b/TRX和E.coli-SS 2c/GST基因工程体，经酶切筛选，嵌合基因的序列测定和表达产物的SDS-PAGE电泳分析，证明其正确无误。三者均应用发酵工艺生产。a、b二型可用简易的渗透休克法，c型可用底物亲和层析法提纯表达产物，大大降低了生产成本。纯化的表达产物加白油佐剂，即可分别配制成激生3号苗a、b、c 3个型的油乳苗。生产成本低廉，适于大规模工业化生产。其中激生3号苗a型经用猪和兔作免疫增重试验，效果显著，且其安全性高，无激素和药物残留，可替代用于促进家畜生长的化学添加剂。本疫苗既能用于家畜，也能用于家禽；并可多次接种，加强免疫；可以单独应用，也可与激生1号苗联合应用；既可提高肉、乳、蛋、毛、绒(鸭绒、我绒、羊绒)等畜产品产量，还能提高饲料转化率，降低饲养成本，提高经济效益。其应用面很广，几乎覆盖了整个畜牧业生产领域；并随着畜牧业的发展，疫苗覆盖率的递增产生的效益将会越来越大。

Claims (4)

1、生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，系采用人工合成SS基因，分别插入不同载体蛋白表达系统，转化感受态大肠杆菌而成，重组质粒经酶切鉴定，序列测定，证实完全符合设计要求，生长抑素基因SS的氨基酸序列如下：

其特征在于，基因设计中含终止子，使SS多肽充分暴露，其设计通式为：

5’-保护性碱基-内切酶-框架保证碱基-单价SS基因或双价SS基因-终止子-内切酶-保护性碱基-3’

其中人工合成SS基因为单价SS基因或双价SS基因，上式中5’端的保护性碱基为为 CATG和3’端的保护性碱基为 CGG，框架保证碱基为 CT，保证SS基因框架正确，选用表达系统为可使SS多肽暴露的载体蛋白表达系统。

2、根据权利要求1所述的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，其特征在于，构建中使用的SS多肽充分暴露的表达系统是以截去尾巴的硫氧还蛋白(TRX)为载体蛋白的pET32表达系统或其本身没有尾巴的谷胱甘肽转移酶(GST)为载体蛋白的pGEX-6P-1表达系统。

3、根据权利要求1或2所述的生长抑素基因工程亚单位苗的基因工程体，包括：

保藏号为CGMCC0705的大肠杆菌E.coli-SS1a/TRX

保藏号为CGMCC0707的大肠杆菌E.coli-SS2b/TRX

保藏号为CGMCC0708的大肠杆菌E.coli-SS2c/TRX。

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