CN1873010A - 利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用，其步骤是首先根据GenBank中的Ara h3的基因序列设计两对嵌套引物；其次是以P23和P1483为引物，花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR；第三是将第一轮PCR产物用无离子水稀释作模板，P81和P820为引物进行第二轮PCR；第四是将第二轮PCR的特异带从胶上切下，用回收试剂盒进行回收；第五是表达载体3PG6的构建；同时还涉及转基因载体3PG6在花生中的应用。本发明方法易行，操作方便。

Description

利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法及应用

                          技术领域

本发明涉及基因工程，更具体涉及一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法，另外还涉及该载体在花生子叶中的用途。

                          背景技术

Ara h3是花生种子中主要贮藏蛋白，也是致敏蛋白。花生贮藏蛋白主要由球蛋白和伴球蛋白组成，分别占花生蛋白的73％和21％，在一个400多个克隆的发育中种子转录本群体中球蛋白和伴球蛋白的转录量分别占总转录本的4.3％和1.7％，其中Ara h3有5种转录本，属于球蛋白，Ara h1有两种转录本，属于伴球蛋白[Peanuts：Allergic and other untoward reactions，Fries JH Ann，Allergy，1982，48：220-226，花生种子的贮藏蛋白。黄尚志，傅家瑞，花生科技，1992，1：1-6，Yong-Sheng Yan a，Xiao-Dong Lin a，Yi-Shun Zhang Lei Wang，KeqiangWu，Shang-Zhi Huang.Isolation of peanut genes encoding arachins andconglutins by expressed sequence tags.Plant Science 169(2005)439-445]，Ara h3的含量高于Ara h1。因此Ara h3的启动子对于外源蛋白的表达而言应是更理想的启动子。

现有的花生子叶特异表达转基因载体有我们刚构建好的pGA1，它是以Arah1启动子为调控启动子，代替传统植物转基因载体pBIN35S-mGFP4中的35S启动子。其中Ara h1启动子序列长1675bp[一种花生植物转基因载体的构建，王静，严海燕，康强胜，武汉植物学研究，2005(6)：514-518]。根据已知的Ara h1启动子序列[Peanuts：Allergic and other untoward reactions，Fries JH Ann，Allergy，1982，48：220-226]设计一对引物，PCR获得一条单一的带，将该条带切下纯化后与pMD182T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，并用同样的引物PCR筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆测序确认。由于Ara h1启动子的序列中靠5‘和3‘端分别有与植物转基因载体pBIN 35S-mGFP4中的35S启动子两端相同的酶切位点Hind III和Bam HI，且方向相同，直接用中间载体的Hind III和Bam HI酶切插入片段与pBIN 35S-mGFP4的Hind III和Bam HI酶切载体片段连接后转化大肠杆菌DH5α，然后在启动子序列的不同部位设计三对嵌合引物，PCR筛选和验证阳性克隆[一种花生植物转基因载体的构建，王静，严海燕，康强胜，武汉植物学研究，2005(6)：514-518]。这个植物转基因载体的启动子含有除了中间插入片段5’端两个调控元件外的所有元件共27个。是一个较为完全的贮藏蛋白启动子。

其他子叶特异表达启动子因为不是花生贮藏蛋白本身的启动子，不能比花生贮藏蛋白本身的启动子更好的适应发育中子叶中的表达调控。因此，Ara h3启动子对于花生生物反应器而言，应该是理想的外源蛋白表达调控启动子。

传统的植物转基因的方法是采用农杆菌介导，方法如下：

1、将花生种子进行无菌处理后，在培养瓶中无菌水中萌发，无菌水中浸有滤纸作为支架，避免花生种子完全淹没在水中窒息而死。

2、将萌发后的花生嫩叶片、茎段、或子叶切成小片或小块，置于1/2浓℃液体MS培养基和农杆菌菌液等量混合物中，28℃摇床培养2-3天。或者将农杆菌菌液滴在固体培养基上生长的花生嫩叶片小片、茎段、或子叶小块上，28℃共同培养3-5天。

3、取出与农杆菌共同培养的材料，在超净工作台上用无菌水多洗几遍，然后置于含有卡那霉素的培养基上培养，筛选生存的组织块。连续筛选3次以上。

4、将存活的组织在分化培养基上使之分化出小苗，成长到一定大小后转入土中种植。

5、种植在土中的花生按常规方法养护，并收获种子。收获的种子再种植一代后分别萌发，用PCR和蛋白成分分析检验目的基因的表达。

近年来发展了一种直接将外源DNA导入花萼的方法[王传堂，赵双宜，苗华荣，李正超，徐建芝]，通过花萼管注射法获得转基因花生研究初报1999年增刊，花生科技261-263]也较为简单易行。

                            发明内容

本发明的目的在于提供一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法，方法易行，操作方便。

本发明的另一个目的在于转基因载体3PG6在花生中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

构建以Ara h3启动子控制目的基因表达的植物转基因载体，其步骤是：

A、PCR克隆Ara h3启动子

1、根据GenBank中已发表的Ara h3的基因序列(AF510854)设计两对嵌套引物，分别是：

P23：CTC TTT CTT TCT TTC TTG CAT TAT A

P1483：GCT GTT GGC TTT GGT CTT CTC CTT

P81：ATA AAC TTG TAT GCC AAA AAA AAC T

P820：CAA TGT AAC CGC CCT CC

2、以P23和P1483为引物，花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR：

94-95℃ 5min，94℃ 1min，49℃ 30sec，72℃ 1min，35 cycles，72℃ min

3、将第一轮PCR产物用无离子水稀释10倍作模板，P81和P820为引物进行第二轮PCR：

PCR程序：94-95℃ 5min，94℃ 1min，49℃ 30sec，72℃ 1min，35cycles，72℃ min

以引物为p81和p820的PCR产物很亮，是特异带；引物只有p81和引物只有p820的对照各有两条很暗的非特异带。

4、将第二轮PCR的唯一的特异带从胶上切下，用UNIQ-10试剂盒提供的试剂和方法洗脱、纯化后与pMD18T-载体(Takara公司)连接，连接方法按pMD18T-载体供应商提供的方法进行，用纯化的DNA片段和pMD18T-载体连接产物转化大肠杆菌DH5α，得到一些PCR检测阳性的克隆。

将其中PCR检测阳性的两个克隆3pu3和3pu6测序，均与已知AF510854.1启动子部分完全相同，附图4是中间载体3pu6插入片段与已知Arah3基因AF510854序列的比较，结果完全相同。

B、表达载体3pG6的构建：

1、XbaI、HindIII酶切pBin 35S GFP质粒，电泳后有两条带(附图5)，切下大片段，用UNIQ-10试剂盒提供的试剂和方法洗脱、纯化回收。

2、XbaI、HindIII同样酶切3pu6质粒，电泳后有两条带，切下小片段(附图6)，用UNIQ-10试剂盒提供的试剂和方法洗脱、纯化回收。

3、将回收的两个片段用T4连接酶连接。

4、转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。

3pG6花生子叶特异表达转基因载体在花生生物反应器中的应用

构建含有目的基因的植物转基因载体：

1、改造外源蛋白基因两端的序列，或将外源蛋白基因插入一个PUC19，使5‘端含有Xba I或Bam HI酶切位点，同时使3’端含有SacI酶切位点。使用这种方法时该目的基因内不能含有相同的酶切序列。如有，应采取T-A方法。

2、用Xba I/SacI或Bam HI/SacI分别双酶切Ara h3植物转基因载体和含有外源目的基因的载体，电泳分离和纯化植物转基因载体大片段和含有目的基因的片段。

3、将纯化的植物转基因载体3pG6大片段和目的基因片段用连接酶进行连接。

4、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆。

5、采用PCR方法和序列测定(测序公司操作)的方法进一步鉴定目的基因的插入。

6、大量提取阳性克隆的质粒，取痕量转化农杆菌LBA4404。

7、在卡那霉素培养基上筛选抗性菌株，并对筛选出来的可能含有目的基因质粒的抗性菌株进一步PCR验证。

8、繁殖50ml确证的阳性克隆，可以用于花生的遗传转化(把目的基因转入到花生基因组中)。

将目的基因转入花生中：

1、在一适当场地按传统方法种植花生。

2、在花生开花时采用含有目的基因质粒的农杆菌菌液浸染花的方法进行。将大量扩繁的含有目的基因载体的农杆菌菌液用滴管滴在正在或尚未开放的花内(尽可能滴在柱头上)。可以重复滴3-5次。标记处理的花的位置，和该花入土部位。

3、收获花生种子，种植并收获第二代种子。

4、萌发少量第二代种子，提取DNA，用PCR方法验证基因的转入。同时提取第二代种子的蛋白，根据目的蛋白的已知特性，用生化或抗体的方法检验目的蛋白是否表达以及确定表达量。

本发明的主要优点在于能在花生种子主要食用部位大量特异合成目的蛋白，而在其它部位如叶、茎不合成，既能经济地利用光合原料，又可以同花生自有的贮藏蛋白一样大量表达，使大量的目的蛋白丰集于少量的子叶中，如果是疫苗，就可以不必服食大量的材料同样达到引起免役反应的效果。同358控制的HbsAg蛋白在花生植株可溶性蛋白中占0.032％相比(陈红岩，张军，高毅，等.乙肝病毒表面抗原基因在花生中的遗传转化及免疫原性检测，生物技术通讯，2002，13(4)：245-250)，用Ara h3启动子控制的HbsAg蛋白在子叶蛋白中可达到14.6％，提高了约450倍，完全口服可以起到免疫作用，从而避免了注射引起的副作用，节省了费用，方便了广大贫困人群。

                        附图说明

图1为以P23和P1483为引物，花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR产物的电泳图，其中1-引物为p23和p1483，2-引物只有p23；3-引物只有p1483；

图2为以稀释10倍的第一轮PCR产物作模板，P81和P820为引物进行第二轮PCR产物的电泳图，其中，M是Hind III+EcoR I酶切Lambda DNA的分子量标记，1引物为p81和p820，产物很亮，是特异带；2，引物只有p81；3引物只有p820；

图3为含有Ara h3启动子中间载体3pU6的PCR和酶切检验电泳图，其中，M是Hind III+EcoR I酶切Lambda DNA的分子量标记，1是3pU6质粒，2是以p81、p820为引物，3pU6质粒为模板PCR产物，3是3pU6质粒用Xba I、HindIII双酶切产物；

图4为3pU6插入片段序列和已知Ara h3启动子序列比较图；

图5为XbaI、HindIII酶切pBin 35S GFP质粒的电泳图，示酶切产物为一条大片段和一条小片段；

图6为XbaI、HindIII酶切3pu6质粒产物电泳图，示有两条酶切片段；

图7为3pG6花生子叶特异表达转基因载体插入片段PCR产物电泳检测图，其中M是Hind III+EcoR I酶切Lambda DNA的分子量标记，1是pBIN-35SGFP质粒，2是3pG6质粒，3是以p81、p820为引物，3pG6质粒为模板PCR产物；

                       具体实施方式

利用花生Arah3启动子转基因载体的构建方法，其步骤是：

1、根据GenBank中已发表的Ara h3的基因序列(AF510854)设计两对嵌套引物，分别是：

P23：CTC TTT CTT TCT TTC TTG CAT TAT A

P1483：GCT GTT GGC TTT GGT CTT CTC CTT

P81：ATA AAC TTG TAT GCC AAA AAA AAC T

P820：CAA TGT AAC CGC CCT CC

2、以P23和P1483为引物，花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR：

PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5ul，dNTP(10mM each)0.5ul，P23、P1483引物(10uM)各1ul，花生基因组DNA(100ng)0.5ul，Taq DNA聚合酶(Biostar公司)0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul。同时做引物只有p23；和引物只有p1483的两个对照PCR反应。

PCR程序：94℃ 5min，94℃ 1min，49℃ 30sec，72℃ 1min，35 cycles，72℃5min。取10ul进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果：引物为p23和p1483，有一条很亮的特异带，引物只有p23的带很弱，引物只有p1483有两条亮带和一条暗带(附图1)。

3、将第一轮PCR产物用无离子水稀释10倍作模板，P81和P820为引物进行第二轮PCR：

PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5ul，dNTP(10mM each)0.5ul，P81、P820引物(10uM)各1ul，P23和P1483PCR产物稀释10倍后取1ul，Taq DNA聚合酶(Biostar公司)0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul。同时用引物只有p81和引物只有p820，其他条件相同的两个反应做对照

PCR程序：94℃ 5min，94℃ 1min，49℃ 30sec，72℃ 1min，35 cycles，72℃ 5min。

取10ul进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果以引物为p81和p820的PCR产物很亮，是特异带；引物只有p81和引物只有p820的对照各有两条很暗的非特异带(附图2)。其中，M是Hind III+EcoR I酶切Lambda DNA的分子量标记，1引物为p81和p820，产物很亮，是特异带；2，引物只有p81；3引物只有p820。

4、将第二轮PCR的唯一的特异带从胶上切下，用上海生工公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收如下：

(1)、将凝胶放在在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过400mg。

(2)、按照400ul/100mg胶的比例加入Binding Buffer，置于50℃的水浴中10min，使胶彻底融化。50℃加热熔胶时，每2分钟混匀一次。

(3)、将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温(20-25℃)放置2min。8000rpm离心1min。

(4)、取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500ul Washing Solution，8000rpm室温(20-25℃)离心1min。重复此步骤一次。

(5)、取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNI1-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温(20-25℃)离心15sec。

(6)、将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ulElution Buffer，室温(20-25℃)放置2min。

(7)12000rpm室温(20-25℃)离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

5、将纯化后PCR特异带与pMDT18T-载体连接：

反应组分如下：

a、回收的DNA片段        5ul

b、pMD18T-载体          0.5ul(Takara公司)

c、Ligation Mix         5ul(Takara公司)

将上述a、b、c反应物混匀，在16℃连接4h，用于转化大肠杆菌DH5α。

6、PCR特异带与pMDT18T-载体连接产物的转化

(1)、大肠杆菌感受态细胞的制备

①从保存有DH5α的LB平板上挑取一个单菌落接种到约5ml的LB液体培养基中，于37℃，250r/min震荡培养过夜。

②次日将此5ml菌液转移到50ml的LB液体培养基中，继续培养至OD600＝0.4左右。

③将菌液在无菌条件下转移到预先冰冷的10ml离心管中，共分装5管，于冰上放置30min，中间轻轻晃动4-6次，使所有的菌液都得到预冷。

④4℃，4000rpm离心10min。

⑤倒掉上清液，每管中加入1ml预先冰冷的0.1M CaCl₂，轻拍管壁直至沉淀重新悬浮，将5管中的细胞集中至1管，加CaCl至10ml，冰上放置。

⑥4℃，4000rpm离心10min。

⑦弃去上清，加入冰上预冷的1.6ml CaCl₂和0.4ml灭菌甘油，轻拍管壁使沉淀重新悬浮。

⑧分装成100ul/管，共20管，-70℃保存备用。

(2)、大肠杆菌感受态细胞的转化

①从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上10min。

②将连接好的产物加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

③42℃热激90sec，在此过程中不要晃动离心管。

④热激完毕后立即拿出放于冰上2min。

⑤加入200ul的LB液体培养基，37℃，200r/min孵育1h。

⑥将菌液涂布在Amp抗性且含有IPTG和X-gal的LB固体平板上，37℃培养12h。

⑦将平板放入4℃冰箱保存。

7、阳性克隆的检测

(1)、菌液PCR检测

从转化的平板上挑取白色菌斑接种到LB液体培养基中，37℃，250r/min培养过夜。

PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5ul，dNTP(10mM each)0.5ul，P81和P820引物(10uM)各1ul，菌液1ul，Taq DNA聚合酶(Biostar公司)0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul。

PCR程序：94℃ 5min，94℃ 1min，48℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环，72℃ 5min。

取10ul用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，有一条与700-800bp左右的亮带。

(2)、提取质粒进行检测

①将菌液PCR阳性的菌液取100ul接种到50ml的Amp抗性的LB液体培养基中，37℃，250r/min震荡培养过夜。

②将菌液转移到7ml的离心管中，室温(20-25℃)10000rpm离心30sec，收集菌体。

③倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的上清液流出。

④加入300ul的预冷溶液I，在旋涡震荡器上剧烈震荡重悬菌体。

⑤加入600ul新鲜配置的溶液II，盖紧管口，快速颠倒6次，以混合内容物，将离心管置于冰上5min。

⑥加入450ul预冷的溶液III，盖紧管口，温和的颠倒3-5次，使溶液III在细菌裂解物中分散均匀，之后将离心管置于冰上5min，室温(20-25℃)10000rpm离心15min。

⑦将上清转移到一个新离心管中，加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，反复混匀，10000rpm室温(20-25℃)离心5min。

⑧上清液转移到另一离心管中，加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温(20-25℃)沉淀1h，10000rpm室温(20-25℃)离心15min。

⑨倒掉上清，加入500ul冷的70％乙醇淋洗沉淀两次，空气中干燥。

⑩加入适当体积的无菌水重新溶解沉淀，并加入1/50体积的RNAase A于37℃消化4h以上。

纯化质粒

①加入等体积的平衡酚，反复混匀，10000rpm，室温(20-25℃)离心5min。

②转移上层水相到一新离心管中，加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，反复混匀，10000rpm，室温(20-25℃)离心5min。

③转移上层水相到一新离心管中，加入等体积的氯仿，反复混匀，10000rpm，室温(20-25℃)离心5min。

④取上层水相，加入1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀1h，10000rpm室温(20-25℃)离心15min。

⑤倒掉上清，加入500ul冷的70％乙醇淋洗沉淀两次，空气中干燥。

⑥加入适当体积的无菌水重新溶解沉淀。

(3)、质粒PCR和酶切检测

PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5ul，dNTP(10mM each)0.5ul，P81和P820引物(10uM)各1ul，质粒1ul，Taq DNA聚合酶(Biostar公司)0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul。

PCR程序：94℃ 5min，94℃ 1min，48℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环，72℃ 5min。

XbaI和HindIII酶切体系：

10*Buffer M       2ul

质粒DNA           1ug

HindIII(takara)   1ul

H₂O              加至20ul

37℃酶切4h后，用3倍体积的乙醇沉淀，重溶在10ul的无菌水中，依次加入以下试剂：

10*buffer D       2ul

乙酰化BSA         2ul

XbaI(SABC)        1ul

H₂O              加至20ul

37℃反应4h。

质粒为模板的PCR产物电泳有一条700-800bp左右的亮带，质粒酶切后电泳有一条2kb左右和一条700-800bp左右的亮带，与最初克隆纯化的700-800bp的相似。请见附图3。

(4)序列测定

将上述检测阳性的3pu6克隆由北京三博远志生物公司进行序列的测定，测定的结果发现与已发表的Ara h3基因AF510854.1启动子部分的序列完全一致，除了基本的TATA box，AGGA box以外，还有一个RY box和四个DOF结合框。附图4是PCR获得的特异带克隆到pMD18T载体后测序的结果与已知Arah3基因AF510854序列的比较，结果完全相同。

表达载体3PG6的构建：

1、提取pBIN-35S mGFP(Haseloff，J，Siemering，KR，Prasher，DC.andHodge，S.Removal of a cryptic intron and subcellular localization of greenfluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plantsbrightly.PNAS.1997，94(6)，2122-2127)质粒和前面A步骤第4步所构建的3pU6质粒。

2、XbaI和HindIII酶切pBIN-35S mGFP质粒(酶切体系同上)，酶切产物电泳后有一条13kb左右和一条700-800bp左右的带，回收其中的13kb左右的大片段。附图5是XbaI和HindIII酶切pBIN-35S mGFP质粒产物电泳图。

3、XbaI和HindIII同样酶切3pu6质粒，酶切产物电泳后有一条2kb左右和一条700-800bp左右的带，回收其中的700-800bp的小片段。附图6是XbaI和HindIII同样酶切3pU6质粒产物电泳图。

4、将GFP质粒的13kb大片段和3pu6质粒的700-800bp小片段进行连接，连接体系：

35S质粒大片段       4ul

3pU6质粒小片段      4ul

T4连接酶Buffer      1ul

T4连接酶(SABC)      1ul

22℃反应3h

5、连接产物转化至DH5α感受态细胞中

6、提取质粒进行PCR鉴定，有一条700-800bp的亮带，质粒命名为3pG6。附图7是3pG6的PCR鉴定电泳图。其中M是Lambda DNA/Hind III+EcoRI Markers作为分子量标记，1和2分别是pBIN35SGFP和3pG6质粒，3是3pG6质粒PCR产物电泳。

载体在花生生物反应器中的应用

构建含有目的基因的植物转基因载体：

1、改造乙肝疫苗基因两端的序列，或将乙肝疫苗基因插入pUC19(购自武汉生命科学公司)，构建中间载体并命名为pMN，使目的基因5‘端含有Xba I或Bam HI酶切位点，同时使3’端含有SacI酶切位点。使用这种方法时该目的基因内不能含有相同的酶切序列。如有，应采取T-A方法。

2、用Xba I/SacI或Bam HI/SacI分别双酶切3pG6植物转基因载体和含有外源目的基因的载体，电泳分离和纯化3pG6植物转基因载体大片段和pMN中含有目的基因的片段。

3、将纯化的植物转基因载体3pG6大片段和乙肝疫苗基因片段用连接酶进行连接。

4、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆。

5、采用PCR方法和序列测定的方法进一步鉴定乙肝疫苗基因的插入，命名插入目的基因的质粒为3pG6N。

6、摇菌50毫升提取阳性克隆的3pG6N质粒，取11ul转化农杆菌LBA4404。农杆菌的转化(冻融法)：

①将两管农杆菌感受态细胞置于冰上融化，然后分别加入1ug的3pG6N质粒DNA，充分混匀，冰上放置30min。

②置液氮中快速冷却1min后迅速转入37℃水浴中5min。

③加200ul无抗生素的YM液体培养基于28℃，230r/min培养2-4h。

④将菌液涂布到含有适当卡那霉素的YM平板上，28℃培养48h。

7、挑取单菌落接种到含卡那霉素的YM液体培养基中，28℃，250r/min培养，培养好的菌液用于转化或保存。

8、从农杆菌中提取3pG6N质粒进行鉴定

(1)分别挑取一个单克隆接种到含Kan抗生素的LB液体培养基中，28℃培养过夜。

(2)4000rpm离心10min以收集菌体。

(3)用STE溶液洗涤沉淀2次。

(4)加入400ul溶液I，旋涡震荡悬浮菌体，然后室温(20-25℃)放置10min。

(5)加入800ul新配制的溶液II，轻轻颠倒离心管10次，室温(20-25℃)放置10min。

(6)加入400ul溶液III，轻柔颠倒离心管数次，使酚与内容物混合均匀。

(7)加入200ul 3M NaAc(pH 4.8)，轻柔颠倒几次混匀，冰浴5min。

(8)10,000rpm离心10min，将上清液转移到一新离心管中，加入2倍体积冰冷的95％乙醇，-20℃沉淀1h。

(9)10,000rpm，离心10min，弃去上清液。

(10)加入0.5ml 0.3M NaAc(pH 7.0)溶解沉淀，加1ml无水遗传，-20℃沉淀1h。

(11)10,000rpm离心10min，弃去上清液。

(12)70％的乙醇洗涤沉淀3次。

用TE或无菌水溶解沉淀，1/100体积的RNAase消化3h以上。

9、对含有3pG6N质粒的菌株进一步PCR验证后。可以用于花生的遗传转化(乙肝疫苗基因转入到花生基因组中)。

将目的基因转入花生中：

1、在一适当场地按传统方法种植花生。

2、在花生开花时采用含有乙肝疫苗基因质粒的农杆菌菌液浸染花的方法进行。

将大量扩繁的含有乙肝疫苗基因载体的农杆菌LBA4404菌液用滴管滴在正在或尚未开放的花内(尽可能滴在柱头上)。可以重复滴3或4或5次。标记处理的花的位置，和该花入土部位。也可以将质粒酶切后纯化要转化的DNA片段，直接将DNA溶液滴在花内。

3、收获花生种子，种植并收获第二代种子。

萌发少量第二代种子，提取DNA，用PCR方法验证基因的转入。同时提取第二代种子的蛋白，根据目的蛋白的已知特性，用生化或抗体的方法检验目的蛋白是否表达以及确定表达量。

使用本方法获得的花生种子，乙肝疫苗含量至少应当与Ara h3贮藏蛋白单拷贝的量相同。农杆菌转化通常将一个拷贝整合到基因组中，而DNA直接导入有可能有多个拷贝整合到基因组中，多拷贝整合的植株有可能大量表达外源基因，也有可能由于表达抑制作用表达量很低。成功转化和表达外源基因的植株中的外源基因拷贝数需要经过筛选和验证。如果按单个拷贝表达量算，表达的外源蛋白在1/5*73％，即占子叶蛋白的14.6％。如果是多个拷贝，量应该更高。

Claims (2)

1、一种利用花生Ara h3启动子转基因载体的制备方法，它包括下列步骤：

A、根据GenBank中的Ara h3的基因序列设计两对嵌套引物，分别是：

P23：CTC TTT CTT TCT TTC TTG CAT TAT A；

P1483：GCT GTT GGC TTT GGT CTT CTC CTT；

P81：ATA AAC TTG TAT GCC AAA AAA AAC T；

P820：CAA TGT AAC CGC CCT CC；

B、以P23和P1483为引物，花生基因组DNA为模板进行第一轮PCR:PCR反应体系：Taq酶缓冲液/含有Mg²⁺2.5ul，dNTP/10mM each 0.5ul，P23、P1483引物/10uM各1ul，花生基因组DNA/100ng 0.5ul，Taq DNA聚合酶0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul；

C、将第一轮PCR产物用无离子水稀释10倍作模板，P81和P820为引物进行第二轮PCR:PCR反应体系：Taq酶缓冲液/含有Mg²⁺2.5ul，dNTP/10mM each0.5ul，P81、P820引物/10uM各1ul，P23和P1483PCR产物稀释10倍后取1ul，Taq DNA聚合酶0.5ul，加灭菌双蒸水至25ul；

D、将第二轮PCR的特异带从胶上切下，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收：首先是将凝胶放在在紫外灯下用刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过400mg；其次是按照400ul/100mg胶的比例加入Binding Buffer，置于50℃的水浴中10min，使胶底融化，50℃加热熔胶时，每2分钟混匀一次；第三是将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm离心1min；第四是取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500ul Washing Solution，8000rpm室温离心1min，然后重复本步骤一次；第五是取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNI1-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心15sec；第六是将UNIQ-10柱放入一个1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer，室温放置2min；第七是12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，保存于-20℃备用；

E、将纯化后PCR特异带与pMDT18T-载体连接：

a、回收的DNA片段    5ul；

b、pMD18T-载体      0.5ul；

c、Ligation Mix     5ul；

将上述a、b、c混匀，在16℃连接4h，用于转化大肠杆菌DH5α；

F、PCR特异带与pMDT18T-载体连接产物的转化：

a、大肠杆菌感受态细胞的制备：首先是从保存有DH5α的LB平板上挑取一个单菌落接种到5ml的LB液体培养基中，于37℃，250r/min震荡培养过夜；其次是次日将此5ml菌液转移到50ml的LB液体培养基中，继续培养至OD600＝0.4；第三是将菌液在无菌条件下转移到预先冰冷的10ml离心管中，于冰上放置30min，中间晃动4-6次，使菌液得到预冷；第四是4℃，4000rpm离心10min；第五是倒掉上清液，每管中加入1ml预先冰冷的0.1M CaCl₂，拍管壁直至沉淀悬浮，将5管中的细胞集中至1管，加CaCl至10ml，冰上放置；第六是4℃，4000rpm离心10min；第七是弃去上清，加入冰上预冷的1.6ml CaCl₂和0.4ml灭菌甘油，拍管壁使沉淀悬浮；第八是分装成100ul/管，-70℃保存备用；

b、大肠杆菌感受态细胞的转化：首先是从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上10min；其次是将连接好的产物加至感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；第三是42℃热激90sec，在此过程中不要晃动离心管；第四是热激完毕后拿出放于冰上2min；第五是加入200ul的LB液体培养基，37℃，200r/min孵育1h；第六是将菌液涂布在Amp抗性且含有IPTG和X-gal的LB固体平板上，37℃培养12h；第七是将平板放入4℃冰箱保存；

G、表达载体3PG6的构建：首先是提取pBIN-35S mGFP质粒和D步骤所构建的3pU6质粒；其次是XbaI和HindIII酶切pBIN-35S mGFP质粒，酶切产物电泳后有一条13kb和一条700-800bp的带，回收其中的13kb的片段；第三是XbaI和HindIII同样酶切3pu6质粒，酶切产物电泳后有一条2kb和一条700-800bp的带，回收其中的700-800bp的片段；第四是将GFP质粒的13kb片段和3pu6质粒的700-800bp片段进行连接，连接体系：

35S质粒片段     4ul

3pU6质粒片段    4ul

T4连接酶Buffer  1ul

T4连接酶        1ul22℃反应3h；第五是连接产物转化至DH5α感受态细胞中；第六是提取质粒进行PCR鉴定，有一条700-800bp的亮带，质粒为3pG6。

2、一种转基因载体3PG6在花生中的应用。

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