CN1130375C - 抗虫融合蛋白,其编码基因以及用该基因生产转基因植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过对抗虫基因进行修饰，使其编码产物N端带有大豆SKTI的信号肽序列，C端加上内质网滞留信号KDEL序列，使抗虫基因转译产物最终特异性地定位到寄主植物细胞的内质网中，增加外源抗虫蛋白的稳定性，以提高外源抗虫物质在转基因植株体内的积累量，从而增强转基因植物的抗虫能力。

Description

抗虫融合蛋白，其编码基因以及用该基因生产转基因植株的方法

本发明涉及一种抗虫蛋白，其编码基因以及用该基因生产转基因植株的方法。具体地说，本发明涉及一种抗虫融合蛋白，其编码基因，含有该编码基因的表达载体，含有该表达载体转化的植物细胞，用该基因转化的植株，以及用该基因生产转基因植株的方法。

植物基因工程是近二十年来迅速发展的一门新兴生物技术。其目的是将特定的外源基因引人受体植物细胞的染色体中，使受体植物的遗传特性发生定向的永久性的变化。通过基因工程手段，可以突破种属的界限，按照人们的预想去创造更加优良的植物新品种，具有常规遗传育种所无法比拟的优越性。目前，植物基因工程已在植物的抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境方面取得了重要进展，在改良作物品质，提高作物固氮能力以及雄性不育、延熟保鲜、改变花色或花型等方面也获得较大突破。其中，抗虫植物基因工程是目前研究的热点之一。它在减少杀虫剂引起的环境污染，降低虫害对农作物生产造成的损失等方面具有巨大的应用前景。

近年来，抗虫植物基因工程研究取得了许多重要进展，已获得了大量有应用价值的抗虫基因及其转基因植株。在植物基因工程中使用的抗虫基因主要有两大类。一类是从微生物中分离出来的抗虫基因，如苏云杆菌毒蛋白基因，另一类是从植物本身分离出的抗虫基因，如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂-II基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。不同抗虫基因的抗虫能力、抗虫谱上是不一样的。如何提高抗虫蛋白在转基因植株体内的表达量，拓宽转基因植株的抗虫谱，降低害虫的耐受力对培育高抗虫性的转基因植物是至关重要的。

将两个或两个以上抗虫基因同时导入植物中，可以拓宽转基因植物的抗虫谱，使昆虫对抗虫蛋白产生耐受性的几率大为降低。一般来说，昆虫对一种抗虫蛋白产生耐受性的几率约为10^-6左右，如将两种不同抗虫机制的基因同时导入植物，则昆虫产生耐受性的几率降低到10^-12左右。不同抗虫机制的基因的抗虫谱往往有很大的互补性，象豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)基因与豌豆外源凝集素(P-lectin)基因、大豆胰蛋白酶抑制剂(SKTI)基因与水稻巯基蛋白酶抑制剂(OC)基因、Bt毒蛋白基因与CpTI基因，如能联合使用都将能产生很强的互补作用。如果采用分子设计的方式，在充分了解抗虫蛋白结构与功能的基础上，构建出融合蛋白基因，编码功能互补的两个抗虫蛋白的活性肽部分。由于这种融合蛋白同时保留有较强的两种抗虫蛋白的生物活性，又便于在转化植物中进行表达调控，在抗虫植物基因工程中将会有较大应用前景。

抗虫基因转译产物在转基因植物体内的定位可以提高抗虫蛋白的积累水平，增强转基因植株的抗虫能力。Higgin(1991，Plant Sci.，74：89-98).)等人的研究结果表明，外源基因产物在细胞内的定位过程与基因高水平表达或高水平积累密切相关。多肽在植物细胞内的定位是由其氨基酸序列中特殊的靶向信号(Targetting signal)决定的，不同类型的定位信号可引导新生多肽定位到不同的细胞器。通过体外对基因进行修饰，改变编码定位信号的核酸序列，可以人为地改变目的蛋白在细胞内的定位方式，使其运输并定位到特定的细胞器内。有目的地指导新生多肽向细胞核、叶绿体、线绿体、液泡以及内质网定位的研究已取得了重大进展，这些成果对于解决外源蛋白的定位问题提供了重要的基础(朱祯，1994，生物工程进展，14(2)：51-58)。

在植物细胞中，除了叶绿体和线粒体能编码并合成少数蛋白外，细胞内决大部分蛋白都是由核编码并在胞浆(Cytoplasm)或粗糙型内质网(rough EndoplasmicReticulum，rER)上合成的，然后新合成的蛋白或多肽被运送到靶细胞器位点，形成有功能的成熟蛋白。近来的研究表明，除一小部分胞浆内游离核糖体上合成的蛋白将直接输入到相应的靶细胞器或继续留在胞浆内外，很大一部分由粗糙内质网的核糖体合成的蛋白，将跨过ER膜进入ER腔内，通过细胞的分泌途径最终定位到细胞内的特定部位或分泌到细胞外。在这些分泌蛋白N-末端(少数在中部)含有一段由特殊氨基酸残基构成的信号肽。这段序列通常由13-30个氨基酸残基构成，可分为三个组成部分：(1)N-末端碱性区，至少含有一个带正电荷的氨基酸残基；(2)中部疏水区，含有一个由7-8个疏水氨基酸残基组成的疏水结构；(3)C-末端，为内肽酶加工裂解位点(Von Heijine，1986，Nucl.Acids.Res.，14：4683-4690)。这段氨基酸序列对于引导多肽进入ER腔内是必要的，同时也是充分的。不同来源的信号肽可以将作为乘客蛋白的胞浆蛋白导入到ER腔中并在那里进行相应的糖基化修饰(chrispeels，1991，Plant.Mol.Biol.，42：21-53)。使用马铃薯块茎蛋白(Patatin)的信号肽序列与GUS编码序列组成的嵌合基因(Iturriaga et al.，1989，The Plant Cell，1：381-390)以及由烟草PR蛋白(Pathogenesis-related Protein，PR)信号肽序列与GUS、Pat和Npt-II编码序列组成的嵌合基因(Denecke，1990，The Plant Cell，2：51-59)转化植物后，表达的融合蛋白产物均可有效的进入分泌途径。这些信号肽没有明显的种属特异性，实际上所有真核生物的分泌信号都是相似的。

多肽的糖基化修饰和高级结构的形成部分是在ER内完成的，进入ER的多肽在修饰后除少数滞留在ER内，绝大部分通过运载体运输到了高尔基体和反式高尔基网，之后或通过正常的分泌途径分泌到细胞外，或定位到细胞的其它亚细胞结构中。一些滞留在ER内的蛋白具有一个共同的特征，即在多肽的C-末端含有由四个氨基酸残基KDEL或HDEL序列组成均ER滞留信号。有报道表明，ER滞留信号对于新生多肽滞留在ER内是必要的条件之一(Palham，1988，EMBO J.，7：1757-1762)。Wandelt(1992，The Plant J.，2：181)等人将定位于液泡的豌豆储藏蛋白(Vicilin)的C末端外加KDEL序列，在转基因植物的叶肉细胞内，重组蛋白Vicilin-KDEL大量积累在ER腔内及其衍生的蛋白体中。通过外加KDEL序列同样成功地将另一个液泡蛋白PHA定位到ER腔内(Herman et al，1990，Planta，182：305-312)。 已有的数据表明，绝大多数ER定位蛋白在C末端附近20个氨基酸残基中至少含有6个酸性氨基酸残基。推测这个靠近C末端的带负电荷的区域同KDEL序列一起，保证了这些蛋白有效地定位于ER腔中(Murro et al.，1987，Cell，48：899-907)。

本发明首次把信号肽序列、抗虫基因和KDEL序列联合使用，生产了可以定位在植物细胞内质网中的外源抗虫蛋白，与以往的抗虫蛋白比较，此新式抗虫蛋白的稳定性增强了，从而提高了抗虫蛋白在转基因植物体内的积累量。

研究表明，抗虫蛋白在转基因植株中的表达量必须达到某一特定的阈值才能表现出明显的抗虫效果。例如CpTI在转基因烟草内的表达量占可溶总蛋白的0.4％以上时，才表现出一定的抗虫性，高于0.8％以上才有显著的抗虫效果。因此，提高抗虫基因的表达水平一直是抗虫植物基因研究的一个重要方面。使用强启动子、增强子和转译增强序列虽可有效提高外源基因的转录水平，但高效转录并不一定意味着转译产物的高水平积累。并且，近年来的研究表明，外源基因的高水平转录，往往容易导致基因失活(李旭刚等人，1998，生物技术通报，3：1-8)。在转基因烟草细胞内，玉米醇溶蛋白mRNA的转录量高达1-2.5％，而相应蛋白的含量仅占总蛋白的0.00001-0.003％(Ohtani etal.，1991，Plant Mol.Biol.，16：117-128)。显然，在进行植物遗传操作时，仅仅考虑使用强启动子并不总是有效，且通过类似方法提高外源基因表达水平的潜力已十分有限，因此有必要开辟一条新的途径来解决上述问题。多肽在细胞内定位的研究进展为提高转译产物的积累水平提供了一条新的思路。大多数抗虫基因的转译产物是在细胞质中合成的，而胞质中存在大量的蛋白酶，直接影响到蛋白的稳定性。如能通过体外对基因进行修饰的方式，人为地改变蛋白在细胞内的定位方式，将其定位到具有惰性环境的细胞器中(如内质网、蛋白体等)，将能显著提高抗虫蛋白在细胞内的积累水平，进而可培育出具有高抗虫能力的转基因植株。

本发明的目的是提供一种抗虫融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种编码抗虫融合蛋白的基因。

本发明的又一个目的是提供一种含有该编码基因的表达载体。

本发明的再一个目的是提供一种含有该表达载体的转化的植物细胞

本发明的还一个目的是提供一种用该基因转化的植株。

本发明的另一个目的是提供一种用该基因生产转基因植株的方法。

本发明提供了一种新式的抗虫融合蛋白，它从N-末端到C-末端依次含有信号肽、抗虫蛋白及内质网定位信号。其中信号肽是指所有使分泌蛋白定位到内质网的氨基酸序列，包括但不限于上文提到的马铃薯块茎蛋白(Patatin)的信号肽序列，PR蛋白信号肽序列及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)的信号肽；抗虫蛋白包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI等抗虫蛋白，还可以包括由两个或多个抗虫基因融合的多价抗虫蛋白；内质网滞留信号可以使抗虫蛋白定位在植物细胞的内质网中，它包括但不限于KDEL、HDEL等使分泌蛋白滞留在内质网中的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码抗虫融合蛋白的核苷酸序列。本发明涉及的核苷酸序列是在抗虫基因编码区的5’端带有信号肽的编码列，3’端带有内质网滞留信号的编码序列。其中信号肽的编码序列是指所有使分泌蛋白定位到内质网的多肽的编码序列，包括但不限于上文提到的马铃薯块茎蛋白(Patatin)的信号肽，PR蛋白信号肽及大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)的信号肽的编码序列；抗虫基因包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI等抗虫基因，还可以包括由两个或多个抗虫基因构成的融合抗虫基因；内质网滞留信号的编码序列包括但不限于KDEL、HDEL等使分泌蛋白滞留在内质网中的多肽的编码序列。

本发明还提供了一种包含抗虫融合蛋白基因序列的表达载体。本发明涉及的载体指包含此融合抗虫基因的载体。载体可以是细菌质粒载体，植物转化载体及其它不同形式的载体。本领域普通技术人员应该知道，外源基因在植物体内的表达可以由不同的启动子来驱动，且单子叶、双子叶中表达外源基因一般采用不同的启动子。本发明涉及的植物转化载体可用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、棉化曲叶病毒CLCuV)复制酶基因启动子(PRP)、水稻actin启子，T-DNA mas启动子、玉米ubiquin启动子及不同启动子之间或启动子和调控序列构成的复合启动子(包括但不限于)来控制外源基因的表达。

多价基因在转基因植物中可以表达出多个外源蛋白产物。为提高转基因植株的抗虫能力，拓宽抗虫谱，减缓昆虫产生耐受性的目的，本发明用此抗虫融合基因可以与其它抗虫基因，包括但不限于Bt毒蛋白、CpTI、GNA及P-lectin(包括但不限于)等基因构建一系列多价抗虫基因载体。

本发明还提供了一种含有该表达载体的转化的植物细胞以及一种用所述的抗虫融合蛋白基因转化的植株。

本发明涉及的细胞包括但不限于细菌，根癌农杆菌，植物细胞。植物细胞可以是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞，包括但不限于烟草、棉花、杨树、大豆、马铃薯、甘薯、水稻、玉米、小麦、白菜、青椒、甘蓝等植物细胞及含有此类细胞的完整的转基因植株。转基因植株可由许多对本领域普通技术人员来说非常熟知的转化技术，包括但不限于基因枪转化、农杆菌介导转化等获得。

本发明还提供了一种用抗虫融合蛋白基因生产转基因植株的方法。该方法包括：

a.将抗虫基因编码区的5’端与信号肽的编码序列相连，3’端与内质网滞留信号的编码序列相边，构建成融合基因；

b.将得到的融合基因转化到植物细胞中；

c.将得到的转化的植物细胞培养成植株。

本发明可以通过提高外源抗虫蛋白在转基因植株体内的积累水平来增强转基因植株的抗虫能力。ELISA检测结果表明含有修饰融合基因的转基因烟草CpTI含量较对照有明显提高，并表现出良好的抗虫效果。修饰后I型Bt毒蛋白基因CryIA(c)基因的表达量与未修饰的CryIA(c)基因相比有显著提高，其转译产物占可溶性总蛋白的百分含量平均是未修饰CryIA(c)基因的2.4倍，最高可达0.3％。

附图简要说明：

附图1：三引物PCR(TP-PCR)原理图。根据两个基因的序列，设计三条引物，利用中间引物的桥梁作用，把两个基因的编码序列融合在一起，形成融合基因。

附图2：TP-PCR扩增产物电泳图谱其中A：λDNA/HindIIIMarker；B：PCR扩增产物(三引物)；C：PCR扩增产物(未加P1引物)；D：PCR扩增产物(未加P3引物)E：PCR扩增产物(未加F：PCR引物)FCR扩增产物(未加模板质粒)。

附图3：质粒pSBK构建过程。克隆载体质粒是pUC19，DNA片段为TP-PCR产物。Signal指信号肽编码序列，KDEL内质网滞留信号编码序列。

附图4：修饰后CryIA(c)基因的序列及其氨基酸序列。划线部分分别是5’端引物，中间引物和3’端引物。

附图5：质粒pΩSBK构建过程图。修饰的抗虫基因CryIA(C)带上了CaMV35S启动子和nos终止子。

附图6：pBinΩSBK构建过程图。pBinΩSBK可以用来转化植物。启动子是CaMV35S，终止子是nos。植物选择标记基因是新霉素磷酸转译酶基因。细菌选择标记是卡那霉素。

附图7：ELISA法检测Bt毒蛋白标准曲线

附图8：Bradford法检测样品总蛋白的标准曲线。

附图9：转基因烟草的Bt毒蛋白含量比较。

附图10：转基因烟草的Bt毒蛋白平均含量比较。

附图11：修饰的CpTI基因扩增电泳图谱。A：Φ×174/HaeIII Marker引物)；B：PCR扩增产物(未加3端’引物)；D：PCR扩增产物(三引物)，最亮的带(箭头所指)为目的带SCK片段。

附图12：质粒pBSCK构建过程图。克隆载体质粒是pBluescriptKS(+)，DNA片段为SCK。

附图13：修饰的CpTI基因SCK序列及对应的氨基酸序列。划线部分是引物序列。

附图14：质粒pBinΩSCK图谱。抗虫基因是修饰的CpTI，启动子是CaMV35S启动子，终止子是nos。植物选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因，细菌选择标记是卡那霉素。

附图15：ELISA检测转基因烟草植株CpFI含量柱型图。

附图16：修饰的CpTI基因转化植株的抗虫情况(接虫8天后)。

附图17：棉铃虫取食转化烟草后受抑制状况，放在转化烟草(左)及非转化烟草(右)上8天后的棉铃虫。

附图18：ELISA方法测定转基因烟草中Bt毒蛋白、CpTI含量。前面一排是Bt毒蛋白含量柱型图，后面一排是CpTI含量柱型图。

附图19：质粒pUSCK-Hyg图谱。抗虫基因是修饰的CpTI，启动子是玉米ubiquitin基因启动子，终止子是nos。植物选择标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因。细菌选择标记是卡那霉素。

附图20：转SCK基因水稻CpTI活性柱型图。

附图21：转基因水稻T₀在自然状态下经受大螟(Sesamia inferens)和水稻二化螟(Chilo suppressalis)的攻击(未防治)，表现了显著的抗性(左)，而对照(右)受到严重损害。

附图22：转基因水稻后代对大螟(Sesamia inferens)的抗性。生长初期，转基因水稻对自然发生的大螟有显著抗性(上图)，而对照非转基因水稻受到严重损害(下图)。

附图23：转基因棉花PCR-Southern结果。A：pBinΩSCK质粒DNA作为阳性对照；B：未转化植株作为阴性对照；C～G：转化植株样品。

附图24：在1/2MS(Km 50mg/l)对照(左)四周后变黄变白直至死亡；转化芽(右)生根形成完整植株。

附图25：转SCK基因的转基因植株PCR检测。A：pGEM-Tzf/HaeIII Marker；B：阳性对照质粒；C：阴性对照植株；D-F转植株。

实施例1：

首先利用本实验室发明的TP-PCR技术，其原理是设计三条引物，使两个基因形成一个融合基因，编码序列在同一个读码框下，原理大致见附图1。利用此方去，对CryIA(c)基因进行了改造，使其编码产物具有SKTI信号肽-CryIA(c)-KDEL(SBK)的结构。

通过体外DNA重组，获得了含有CaMV35S启动子-SBK-Nos终止子表达盒的中间质粒。将此表达盒插入mini-Ti质粒pBin19中，由此得到了植物表达载体pBinΩSBK，并以含有未经修饰的CryIA(c)基因的植物表达载体pBinΩBC作为对照，通过根农杆菌介导法分别转化烟草。ELISA检测表明：在转基因烟草中，修饰CryIA(c)基因的表达量显著高于未修饰的CryIA(c)基因的表达量，其转译产物占可溶性总蛋白的百分含量平均是未修饰CryIA(c)基因的2.4倍，最高可达0.28％。下文将说明基因修饰，载体构建，植物转化及转基因植株的检测过程。

CryIA(c)基因的修饰与克隆

参照CryIA(c)基因编码序列、SKTI基因编码序列以及KDEL信号序列设计了三条引物，利用TP-PCR方法进行扩增，扩增出的片段具有编码SKTI信号肽-CryI(c)一KDEL序列的结构。设计引物：

P1：GCGAATTCATGAAGAGCACCATCTTCTT；

P2：GTTGATGTTTGGGTTGTTGTCCATGAAATCAGCGATGGCTGAAGGTAGGT；

P3：GTTACAGTTCATCCTTCCATGGTTCATCTTCAGCCTCGAGTGTTGCAGT，

5’端引物P1长28mer，其中20个碱基与SKTI信号号肽序列互补；中间引物P2长50mer，其中26个碱基与SKTI信号肽序列互补，另24个碱基与CryIA(c)5’端编码序列互补；3’端引物P3长49mer，其中21个碱基与CryIA(c)3’端编码序列互补，另有两个酸性氨基酸编码序、一个Ncol酶切位点及KDEL编码序列。鉴于待扩增基因片段较长(1962bp)，故采用Boehringer Mannheim公司的Expand^TMHigh Fidelity PCR System扩增基因。该系统的特点是其酶系由Tap和Pwo DNA聚合酶混合而成，无论以游离型或是以基因组DNA为模板，这种有效的酶系都能保证扩增产物的高产量，高保真度和高特异性，而且特别适合于扩增长片段。与单独的Tap酶系相比较，Expand系统的错配低30倍(见附图2)。

修饰后的CryIA(c)基因的克隆

PCR反应结束后，加入Klenow酶，37℃保温30分钟，用Wizard^TMPCR回收试剂盒回收PCR产物，平端插入克隆载体pUC19的Smal位点。电激转化E.coliDH5α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上培养过夜，挑选白色菌落在LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，质粒的提取采用煮沸法(Berghammer，1993，Biotechniques，527：11-16)和碱裂解去(Sambrook et al.，1989，MoleGular Cloning)。限制性内切酶分析(Sambrook et al，1989，MoleGularCloning)鉴定出方向，得到反向插入的pSBK(见附图3)。

修饰后CryIA(c)基因的部分序列分析

含质粒pSBK的E.coli DH5α单菌落接种于25mlLB液体培养其中，37℃振荡培养过夜，用Wizard^TM质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，交由上海皓嘉公司进行测序。测序结果显示，基因5’端的500bp和基因3’端的400bp完全与预期序列相一致，编码27个氨基酸的SKTI信号肽序列成功地融合在CryIA(c)基因的5’端，两个酸性氨基酸及KDEL的编码序列成功地添加在CryIA(c)基因的3’端。

修饰后CryIA(c)基因的片段替换

为了保证修后CryIA(c)基因编码序列的正确性，避免在PCR过程中可能产生的突变，我们选择了用原CryIA(c)基因编码序列的中间区段酶切替换PCR产物的相同区段的方法。这一中间区段长达1675bp，其两端均已在测序范围之内，从而保证了修饰后基因的编码序列与预期序列完全一致。修饰和替换后的CryIA(c)基因被命名为SBTK，核苷酸序列见附图4。

植物表达载体的构建

选择pBPFΩ7作为修饰后CryIA(c)基因的植物表达中间载体，其上带有CaMV35S启动子和nos终止子；选择pBin19(David et al.，1995，PlantMolecular Biology，27：405-409)作为修饰后CryIA(c)基因的植物表达载体，其上带有来源于Ti质粒的T-DNA边界序列RB和LB，在边界序列之间带有植物选择标记NptII及MCS序列。pΩSBK为植物表达中间质粒，pBinΩSBK为植物表达质粒(见附图5、6)。

根农杆菌LBA4404的转化使用BIO-RAD公司的电激仪，感受态的制备和电激方法参照产品说明书进行，在YEB(Rif25，Km50)平板上28℃暗培养2天后即有转化菌落长出，进一步从转化菌中提取质粒予以鉴定。

烟草转化苗的获得

将含植物表达载体的根农杆菌LBA4404接种20ml YEB培养基(Km50，Ref50)28℃增养过夜，按2％转接至无抗生素的YEB培养基(乙酰丁香酮0.2％)中继续培养3小时，菌液用MS培养基适当稀释用于植物转化。

采用叶盘法(Horsch，1985，Methods in Enzymology，118：627-641)转化烟草，将含有质粒pBinΩSBK和pBinΩBC的根农杆菌LBA4404分别转化烟草，其中pBinΩBC为未修饰的CryIA(c)基因的植物表达载体，以作为对照。转化两周后，未转化对照逐渐变黄、变白，而转化的叶片周缘则长出了小芽。再过一个月，未转化对照变白，转化的叶片上的小芽长大。切下小芽，转入生根培养基中，待小苗根系发达，植株较壮后，便可进行ELISA检测。本实验得到转pBinΩSBK植株22株、转pBinΩBC植株20株和未转化对照5株。

转基因植株的ELISA检测

样品制备

取烟草叶片0.2-0.4g，于1.5ml Eppendorf管中用小玻棒充分研磨并加入400μl包被底，14,000rpm离心2min，取上清液转移到一个新的1.5ml Eppendorf管中，即为待测样品。2.溶液配制(1)包被液CBS)：

     Na₂CO₃        1.59g

     NaHCO₃         2.93g

     NaN₃           0.2g

     (加蒸馏水至1000ml)(2)磷酸钠缓冲液(PB)：

     Na₂HPO₄·12H₂   0.44g

     O

     NaH₂PO₄·2H₂O   1.345g

     (加蒸馏水至100ml)(3)磷酸洗涤液(PBST)：

     KCl                0.2g

     NaCl               8g

     KH₂PO₄          0.2g

     Na₂HPO₄·12H₂  2.9g

     O

     (加蒸馏水至1000ml后，加入1ml Tween20)(4)封闭液:    0.3g BSA溶于30ml CBS溶液(5)一抗溶液:  用PBST按1∶2000稀释一抗，37℃保温1小时(6)二搞溶液： 将所购二抗稀释10倍后，再用PBST按1∶500稀

          释，然后37℃保温1小时(7)底物溶液： 按TMB原液∶PB∶30％H₂O₂为20∶1000∶3

          的比例配制，TMB原液为60mg TMB溶于10ml

         DMSO后所得3.检测步骤(1)包被：(2)标准曲线：选取一排检测孔用于做标准曲线，第一个孔和最后一个检测孔加10uldH₂O，中间的检测孔加10ul不同浓度的标准蛋白，加样量依次为5ng，10ng，20ng，40ng，60ng，80ng，100ng，然后每个检测孔补加190μl包被液(见附图7)。样品：在样品检测孔中加入20μl样品，补加180μl包被液。将包被好的酶标板置于4℃冰箱过夜。(3)洗涤：将检测孔中液体迅速用力甩下。在滤纸上控干，每孔加入320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重复3次。(4)封闭：每孔加封闭液250μl，置入37℃温箱，保温1小时。(5)洗涤：将检则孔中液体迅速用力甩下。在滤纸上控干，每孔加入320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重复3次。(6)加一抗：每孔加入一抗溶液150μl，置于37℃温箱，保温1小时。(7)洗涤：将检测孔中液体迅速用力甩下。在滤纸上控干，每孔加320μl PBST溶液放置3min后，甩干，重复3次。(8)加二抗：每孔加入二抗溶液150μl，置于37℃温箱，保温1小时。(9)洗涤：将检测孔中液体迅速用力甩下。在滤纸上控干，每孔加320μl PBST溶液，放置3min后，甩干，重复5次；然后换用蒸馏水，再洗涤2次。(10)显色：每个检测孔加入100μl底物溶液，暗反应25min。(11)终止：每个检测孔加入50μl 2M H₂SO₄以终止反应。(12)比色：将酶标板放置5min，于450nm比色。(13)根据标准曲线计算出待测样品的Bt毒蛋白含量

Bradford法检测总蛋白含量：(1)标准曲线：在1.5ml Eppendorf管中加入0.5mg/ml BSA，加入量依次为0，

5，10，15，20，25μl，再分别补加0.15M NaCl溶液使总体积为100μl，

加1ml考马斯亮蓝溶液，混合均匀，室温下反应2min。使用1ml的比色皿，   在595nm下测光吸收，做光吸收值对浓度的标准曲线(见附图8)。(2)样品检则：取10μl样品溶液在1.5ml Eppendorf管中，加入90ul 0.15MNaCl溶液，使总体积为100ul，其余操作同上，得到的吸光值在标准曲线上读出样品溶液中可溶性蛋白的含量。(3)计算结果：根据测得的可溶性总蛋白的含量计算出每个样品中Bt毒蛋白的相对含量，其计算公式为：相对含量＝(Bt毒蛋白含量(ng)×20/总蛋白含量(μg)×1000)×1％。(4)根据所得结果作成柱型图(见附图9，10)。实施例2：

同实施1操作步骤基本相似，修饰的抗虫基因为CpTI。

参照CpTI编码序列、SKTI信号肽编码序列及KDEL信号周边序列设计了三条引物

5’端引物(SKTI-PA)：5′AAAATGAAGAGCACCATCTTC 3′

3’端引物(CpTI-PC)：5′TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATCTTCATCCCT 3′

中间引物(SCK-Pin)：

5′CCTACCTTCAGCCATCGCTGATTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTACTTTTC 3′利用TP-PCR方法法进行扩增，扩增出的片断为SKTI信号肽-CpTI-KDEL的结构。选用Biolabs公司的Vent DNA聚合酶。扩增36个循环后，得到SCK片段(见附图11)所际，经Klenow酶补平，用Wizard^TM PCR回收试剂盒回收PCR产物，平端插入克隆载体pBluescript KS(+)的EcoRV位点，得到反向插入的pBSCK(见附图12)，从pBSCK克隆的SCK片断两端进行序列分析，克隆片断完全符合预期的序列(见附图13)。

载体的构建与实施例1相同，以pBPFΩ-7为中间载体，以pBin19为植物表达载体mimi-Ti质粒(见附图14)

烟草的转化与实施例1相同，转化质粒为pBinΩSCK，对照是pBinΩCpTI。

CpTI的检则

取烟草转化植株新叶0.5g，装入1.5ml Eppendoff管，冰浴条件下用小玻棒迅速研磨，将叶片磨成匀浆状，加入提取液(50mM Tris-HCl，0.2g/L NaN₃，pH9.5)1ml，混匀后4℃14000rpm离心8分钟，取上清。检测步骤及所用试剂参照本实验室手册进行，一抗稀释到4∶1，二抗稀释到1∶1，终止反应后在492nm波下，用酶联免疫检测仪测定光吸收值。所得结果见附图15。

生物检则

移栽到温室的转化苗长至株高20-25cm，7-8片叶龄时，从每株烟草上各选取生长位置一致、生长健康的烟草叶片，置于平皿中，每皿接二龄棉龄虫10头，在室温28℃、湿度85％条件下进行抗虫测试(见附图16，17)实施例3：

利用实施例1，实施2的部分结果，本发明构建了Bt-CpTI的融合基因，具体操作步骤如下：

中间载体pSBCK的构建

利用设计于SBTK基因末端KDEL序列之前的Ncol位点，将带有信号肽的CryIA(c)序列插在3’末端带有KDEL序列的CpTI编码序列之前，构成编码SKTI信号肽-CryIA(c)-CpTI-KDEL序列的结构，产生出中间质粒pSBCK。

融合蛋白读码框的修正

在融合蛋白的编码序列中，后面的CpTI基因序列应与CryIA(c)基因序列处于同一个读码框之下，但上述融合基因的CpTI编码序列部分并未处于正确的读码框下。为了能正确地表达融台蛋白，我们选择了用PCR突变加小片段替换的方法修正基因序列。参照Bt与CpTI接合处的序列及载体上多克隆位点的序列，设计了两条引物。

5’-ACA CTC GAG GCT GAA ACC ATG GAT CTG AAC C-3’

  …ACA CTC GAG GCT GAA GAT GAA CCA TGG ATC TGA ACC…5’端引物长31mer，与原序列相比缺失了5个碱基，恰好使CpTI基因的起始密码子ATG处于正确的读码框下，3’端引物为载体上的T3引物。PCR产物包括CryIA(c)末端部分序列及完整均CpTI序列，通过DNA体外重组，用PCR产物替换原序列，以保证读码框的正确。DNA测序证明，原序列成功缺失了5个碱基，CpTI编码序列已置于正确的读码框下。修正后的质粒为pSBCKM。1)5’-ACA CTC GAG GCT GAA ACC ATG GAT CTG AAC C-3’2)  …ACA CTC GAG GCT GAA GAT GAA CCA TGG ATC TGA ACC…注1)为5’引物序列，2)为原编码序列，加黑部分为CpTI起始密码子，下划线分为须缺失的5个碱基。

植物表达载体的构建

构建过程与实施例1、实施例2相同。pΩSBCKM为植物表达中间质粒，pBinΩSBCKM为植物表达质粒。

烟草转化同实施例1、2相同。

对转化植株检则，表明转基因植株同时具有Bt和CpTI活性。说明本发明可以同时把多个抗虫蛋白定位到植物细胞内质网中(见附图18)实施例4

转修饰CpTI基因(SCK)的转基因水稻的获得。

转化受体的制备

取开花后12-15天的幼胚(灭菌处理)或幼胚来源的胚性愈伤组织(1mm)作为基因枪转化的受体。待幼胚在诱导培养基培养2-3天后，仔细挑选将其转移到盛有高渗培养基(NMBi+0.5M甘露醇)的平皿(直径9cm)上，并摆放在平皿中央2-3cm的枪击范围内(盾片端朝上)，高渗预培养4小时后进行枪击，胚性愈伤组织进行同上处理后再进行枪击。

微弹DNA的制备

称取60mg的金粉(直径1.0μm)置于1.5ml的Eppendorf管中，加入1ml无水乙醇，在漩涡振荡器上振荡1-2分钟后静置，重复振荡三次，10,000rpm离心1分钟，去上清清液；再加入1ml的无菌水，重悬，可储存于4℃冰箱或室温保存。

充分振荡起金粉悬液，取50μl，置灭菌的Eppendorf管中，依次加入5μl供体质粒DNA pUSCK-Hyg(见附图19)(1.0μg/μl)溶液，50μl 2.5M氯化钙溶液，以及20μl 0.1M亚精胺溶液(抽滤灭菌)，充分振荡约3分钟，静置10分钟后，10,000rpm离心10秒钟，尽可能去除上清液。加250μl无水乙醇，短暂振荡后，10,000rpm离心10秒钟，去上清后加60μl无水乙醇，并重新重悬，可供5枪之用(5-10μl一枪)。

基因枪的轰击

使用Dupond公司生产的PDS-1000/He型气动式基因枪进行转化，按产品说明书提供的方法操作。真空度为26-30英寸汞柱，气压为1,500或1,750psi，每皿轰击二枪。

水稻抗性愈伤组织的筛选

枪击后的材料于高渗培养基上过夜后，转移到不含hpt B的非选择培养基上培养(即NMBi)5-7天后。将材料转入含有hpt B的NMBs上选择培养三次，暗培养，每次3-4周，hygB浓度依次为30mg/l、40mg/l和50mg/l。

抗性植株的再生

将抗性愈伤组织转至含hpt B 50mg/l的NMBr上，光照条件同前。待分化出的抗性小芽长至2-3cm时，将其转至含hpt B 20mg/l的MMBg再生苗继代培养基上，当长至完整的植株后，将其从固体培养基转至营养液中开放式培养。待生成新根后，将苗转入温室。

上述过程中所使用的培养基见下表。

转基因水稻植株的检测

水稻叶片胰蛋白抑制剂活性测定，结果见附图20。

样品制备

采取0.3g水稻新鲜叶片，液氮研磨后加入600ul提取液充分混匀，以11,000rpm，4℃离心10min，将上清液作为待测样品，及时测定。

样品测定样品测定依下表进行

                         空白管        标准管         样品管

缓冲液(ul)               200           200            200

蒸馏水(ul)               800           750            720

牛胰蛋白酶(0.1ug/ul，ul) 0             50             50

样品(ul)                  /             /             30充分混匀后，置于27℃温箱保温60min。保温后上述反应管各取100ul分别与1mlBAEE底物反应液混匀，置于27℃保温15min。保温完成后，立即于λ＝254nm处测定各反应管吸光值(OD₂₅₄)。同时做标准曲线

以大豆来源的胰蛋白酶抑制剂为标准品(TRYPSIN INHIBITOR fromSOYBEAN TYPE 1-S)。以下简称标准品。

                      标准0 标准5 标准10 标准20 标准30 标准40

缓冲液(ul)             200  200   200    200    200    200

蒸馏水(ul)             720  715   710    700    690    680

牛胰蛋白酶(0.1ug/ul)(ul)50  50    50     50     50     50

非转化植株提取液(ul)    30  30    30     30     30     30

标准品(0.1ug/ul)(ul)    0   5     10     20     30     40

试剂配制

蛋白提取液：50mmol/L Tris-Cl缓冲液(DTT 1mmol/L)pH9.5。

缓冲液：50mM Tris-Cl缓冲注色(含10mmol/L Ca²⁺)PH8.0。

牛胰蛋白酶溶液：牛胰蛋白酶结晶以0.001M HCl溶解(1mg/ml)，分装-20℃保存使用时用0.001M HCl稀释为0.1mg/ml。

BAEE底物溶液(0.2mg/ml以缓冲液溶解)转化水稻所用培养基一览表

成分       NMB_i    NMB_s-1 NMB_s-2 NMB_r-1 NMB_r-2  MMB_g-1  MMB_g-2

大量元素    N6      N6      N6      N6      N6      1/2MS   1/2MS

微量元素    MS      MS      MS      MS      MS      1/2MS   1/2MS

有机成分    B5      B5      B5      B5      B5      1/2B5   1/2B5

谷氨酰胺    250     250     250     250     250     250     250

脯氨酸      -       500     500     500     500     -       -

水解酪蛋白  300     300     300     300     300     300     300

PVP         3，000  3,000   3,000   -       -       -       -

2，4-D      2       2       1       -       -       -       -

NAA         -       -       1       -       -       -       0.2

KT          -       -       0.5     2.5     -       -       -

6-BA        -       -       -       0.5     -       -       1

TDZ         -       -       -       -       0.5     -       -

MET         -       -       -       -       -       -       1.25

蔗糖        60,000  60,000  60,000  30,000  30,000  20,000  20,000

Gelrite     2，200  2，200  2,200   2,400   2,400   -       -

琼脂粉      -       -       -       -       -       6,500   6,500

MgCl₂      500    500      500     500     500     -       -注N6：N6培养养基，MS：MS培养基，B5：B5培养基。i：愈伤诱导培养基，s：愈伤继代培养基，r：水稻植株再生培养基，g：水稻植株继代培养基。蔗糖、氨基酸、抗生素、激素及磷酸盐抽滤灭菌，其它成分为高压灭菌。

转基因水稻植株的PCR、Southern检测。

水稻基因组DNA的提取参照Zolan(Zolan ME.et al.，Molecular AndCellular Biology，1986，6：195-200.)等的方法进行。植物DNA的酶切、电泳及向硝酸纤维素膜转移均按常规方法进行。Southen检测证实了外源DNA的存在(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning)。 PCR分子检测5′-端引物为：5′AAAATGAAGAGCACCATCTTC3′，3′-端引物为：5′TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATCTTCATCCCT3′。

生物学检则

自然条件下，转基因水稻植株在害虫大螟，二化螟攻击下，表现出明显的抗虫性(见附图21、22)实施例5

本发明使用根农杆菌介导转化法转化棉花，其操作程序如下：

转化受体材料的制备：棉籽经硫酸脱绒后用自来水冲洗，经10％H₂O₂浸泡2-4小时后置于无菌水中12-14小时，剥去种皮，放置于1/2MS的发芽培养基上。在28℃暗培养下发芽3-5天后，将无菌苗下胚轴切成0.5-1cm切段。

根农杆菌的制备：取20ml经高压灭菌的液体YEB培养基加入相应的抗生素(卡那霉素50mg/L、利福霉素25mg/L)，挑取在平板上的单菌落(含有质粒pBinΩSCK)，接种于20ml含有上述抗菌素的液体YEB培养基中，28℃的恒温摇床上过夜(150-180rpm)。取400μl此菌液转接于不含抗生素的液体YEB培养基中(20ml)，并添加2.5ml 100mmol/L的乙酰丁香酮，继续振荡培养3-5小时。

转化程序：将下胚轴用稀释至5×10⁸个/ml的根农杆菌菌液浸泡10分钟左右，于覆盖有滤纸的共培养培养基(MS无机盐、B5有机成分，30g/L葡萄糖和2，4-D及KT各0.1mg/L，pH5.8)上培养。

筛选转化体：转化后的下胚轴经三天暗培养后，转入添加了80mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的选择培养基上，经2-3个月培养(20-30天继代一次)诱导出转化愈伤，在MS培养基(MS无机盐、B5有机成分，30g/L葡萄糖，pH5.8)上继代4-5次以诱导胚状体的形成。5-6个月后将发育好的胚状体转移到分化培养基(MS无机盐、B5有机成分，去除激素及NH₄NO₃、KNO₃加倍并添加谷氨酰胺1g/L、天门冬酰胺0.5g/L，pH5.8)进行胚状体的分化。每月继代一次，当小植株长出完整和健壮的根系并具有3-4片真叶之后，将其移栽或嫁接。

经分子水平检测表明外源基因SCK已整合进棉花基因组中(见附图23)。对转基因棉花进进抗虫实验，转基因棉花表现出明显的抗虫性(见17页表)。实施例6

农杆菌介导的转基因毛白杨的获得

菌液制备

从甘油管中挑取少量菌液(pBinΩSCK)，划于含相应抗生素的YEB平板上，置于28℃恒温培养箱培养2天。从平板上挑取单菌落，重新于同样平板上划线，置于28℃恒温培养箱中培养2天。从平板上挑取单菌落，加入含相应抗生素的液体培养基中，28℃180-200rpm振荡培养过夜。次日早晨取0.8-1ml菌液加至20ml新鲜YEB培养基中，不加抗生素，加入20ul乙酰丁香酮，使其终浓度为500μM/L继续振荡培养3-5hr。调节菌液OD₆₀₀约0.3-0.6左右，可用于转化。

叶盘法转化杨树

取生长健壮的无菌苗叶片，切成0.5-1cm大小，放在预培养培养基上预培养1-2天。然后在稀释的菌液中浸染10-20分钟左右。取出叶块，用无菌滤纸吸干后，转入覆有一层无菌滤纸的共培养培养基中于25℃暗培养2-3天后，将叶片转入筛选培养基中。

转化植株的获得

感染叶片在暗处筛选培养10天左右，然后移至光下，一个月以后陆续有抗性小芽长出，将抗性小芽连同外植体转至新鲜培养基上继续筛选，抗性芽长到2-3cm时，切下，转入含有km50mg/L的生根培养基上生根，获得km^r植株。

转化植株的移栽。

移栽前先在自然光下锻炼几天，移植容器为15cm的花盆，基质为蛭石和营养土各一份。移栽时，先在三角瓶或GA7盒子中放少许水，使培养基和培养容器分离。然后，用镊子轻轻夹出小植株，用清水洗去培养基，在1/10MS营养液中培养一周，栽在花盆内，在其上罩一烧杯防止植株萎蔫，一周后去除罩子。

本发明所用的植物组织培养基见下表。

对转基因植株进行分子水平检测表明SCK整合进寄主植物基因组见附图24，25)。转化杨树所用培养基一览表

  成分   继代培养基  共培养培养基  筛选培养基  生根培养基

大量元素     MS          MS          MS         1/2MS

微量元素     MS          MS          MS         1/2MS

有机成分     B5          B5          B5         B5

蔗煻(g/L)    30          30          30         30

6-BA(mg/L)   0.5         0.25        0.25       /

IAA(mg/L)    /           0.25        0.25       /

ZT(mg/L)     /           0.25        0.25       /

IBA(mg/L)    0.1         /           /          0.2

Km(mg/L)     /           /           30-50      50

Cef(mg/L)    /           /           200-500    50-100

琼脂         5.8         5.8         5.8        6.0

pH           5.8         4.8-5.0     5.8        5.8

注：MS：MS培养基B5：B5培养基。抗菌素抽滤灭菌，其它成分高压灭菌。棉花抗虫实验结果

    死亡率    蜕皮     平均      生物     食叶编号

     ％       指数    重量mg    总量mg    级别CK-1     50       2.6     160.2      801       4CK-2     40       3.2     169.0      1014      4CK-3     40       3.1     150.6      904       4CK-4     50       2.7     176.4      882       4平均     45       2.9     163.9      900.3     4XLZ1-8   50       2.6     42.2       211       2XLZ1-9   90       1.5     28.0       28        1XLZ1-11  50       3.6     121.4      607       3XLZ1-12  90       1.3     24.0       24        1XLZ1-13  80       2.3     95.0       19        3XLZ1-15  50       2.7     62.0       31        3XLZ1-16  100      1.9     0          0         0XLZ1-17  80       2.0     40.5       81        2XLZ1-19  70       2.1     10.7       32        2XLZ1-20  70       1.9     44.3       133       3平均     73       2.1     46.8       161.6     2.0J7-3     80       2.1     24.5       49        3J7-4     90       1.9     4.0        4         2J7-6     90       2.0     27         27        1J7-7     100      1.9     0          0         0J7-8     90       2.1     42.0       42        1J7-10    100      1.9     0          0         0J7-11    100      1.4     0          0         0J7-12    60       2.8     22.3       89        1J7-18    60       2.7     74.8       299       4J7-21    50       3.6     133.8      669       4平均     82       2.2     32.8       117.9     1.6注：使用棉花鲜叶进行试验，使用二龄初棉铃虫作为攻击虫。每试验接虫5条，六天后统计结果。食叶级别划定方式如下：0级为不食或轻微咬食，1级咬食面积小于5％，2级咬食面积介于5-10％之间，3级为15-40％之间。

Claims (9)

1.一种抗虫融合蛋白，它从N-末端到C-末端依次含有信号肽、抗虫蛋白及内质网滞留信号。

2.按照权利要求1所述的抗虫融合蛋白，其特征在于，所述的抗虫蛋白是由两个抗虫蛋白融合的二价抗虫蛋白。

3.一种编码权利要求1或2所述的抗虫融合蛋白的核苷酸序列。

4.一种包含权利要求3所述的抗虫融合蛋白基因序列的表达载体。

5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于，它是一种植物转化载体。

6.按照权利要求5所述的表达载体，其特征在于，表达盒中的外源基因是在植物表达启动子控制下。

7.一种含有权利要求3所述的表达载体的转化的植物细胞。

8.按照权利要求7所述的植物细胞，其特征在于，该植物细胞是水稻、玉米、小麦、烟草、棉花、杨树、大豆、甘薯、马铃薯、白菜、甘蓝、或青椒细胞。

9.一种用权利要求3所述的编码抗虫融合蛋白的核苷酸序列生产转基因植株的方法，包括：

a.将抗虫基因编码区的5’端与信号肽的编码序列相连，3’端与内质网滞留信号的编码序列相连，构建成融合基因；

b.  将得到的融合基因转化到植物细胞中；

c.将得到的转化的植物细胞培养成植株。

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