CN1821395A - 一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与其在培育超高产水稻品种中的应用。该激酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与水稻颖果发育相关的蛋白质。应用转基因技术，可通过改造OsMAPK6对颖果形态建成的影响，调节水稻颖果对物质蓄积的活性，最终达到提高超高产潜力水稻产量的目的。本发明在培育超高产水稻新品种中将具有重要的实际应用价值。

Description

一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用，特别是涉及一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与其在培育超高产水稻品种中的应用。

背景技术

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是植物体内一种广泛存在的重要丝氨酸/苏氨酸信号家族。植物MAPK与一些其它的信号分子组成MAPK级联途径(MAPK cascade)，从而参与从细胞质运动到植物体的生长发育及抵御逆境胁迫反应等多种生理活动。当植物受到某种胁迫，如紫外辐射、渗透胁迫、冷胁迫和创伤等，或受到细胞因子和激素刺激时，植物MAPK会被不同的由各种细胞内、外的刺激因子所活化的上游信号分子激活，通过对下游分子的磷酸化作用，最终将刺激信号传递给细胞核，调节相关基因的表达，使细胞、组织、器官和整个植物体做出相应的生理反应。目前，MAPK信号系统在对植物的细胞周期与发育进程的调控以及逆境抵御的分子机制研究中受到广泛关注。

促分裂原活化蛋白激酶蛋白分子与其它蛋白激酶一样是由11个保守亚单位的催化区域组成。位于第VII和第VIII亚结构区域之间含有Thr、Tyr残基和高度保守的TXY序列(也称三肽模块)，它在MAPK催化功能中起着关键的作用。迄今，已从许多植物如烟草、苜蓿、玉米、拟南芥和水稻中分离出MAPK基因。根据植物MAPK的生理功能以及氨基酸结构方面的特点，植物MAPK被分为四个亚家族：参与环境胁迫和激素反应的A亚家族；与细胞周期调控相关的B亚家族；功能目前还不太清楚的C亚家族；以及在环境胁迫和伤害反应中扮演重要角色的D亚家族。A、B、C亚家族成员都具有TEY双重磷酸化模块，而D亚家族成员则具有TDY的双重磷酸化模块以及长的C末端。自1999年He首次从籼稻IR36中分离出第一个水稻功能性MAPK基因OsBWMK1(He C，Fong SH，Yang D，Wang GL.(1999).BWMK1，a novel MAP kinase induced by fungalinfection and mechanical wounding in rice.Mol Plant-Microbe Interact.12：1064-1073.)，随后水稻中又有5种不同的MAPK基因相继被克隆和鉴定。迄今为止已报道的水稻MAPK基因有11个，它们是OsMAP1，OsMAPK2，OsMSRMK2，OsBIMK1，OsMAPK5a，OsMAPK5b，OsMAPK4，OsMSRMK2，OsMAPK3，OsBWMK1和OsWJUMK1，但其中OsMAP1，OsMAPK2，OsMSRMK2，OsBIMK1和OsMAPK5a代表相同基因，OsMAPK4和OsMSRMK2也代表相同基因，OsMAPK5b为OsMAPK5a的剪切产物。如表1所示，水稻的MAPK基因分属A、C、D亚家族，这些MAPK在调控自我防御反应过程中的功能研究取得了相当的进展(Agrawal GK，Iwahashi H，Rakwal R.(2003)Rice MAPKs.Biochem BiophysRes Commun.302，171-180.)。但迄今为止，MAPK在水稻颖果发育中的确切生理作用及调控机制尚缺乏足够的认识。

水稻是重要的粮食作物，其颖果(主要是胚乳)的发育状态直接影响水稻的产量和品质。超高产水稻次级颖果充实性低下限制了水稻产量潜力的实现，根本原因可能是颖果胚乳发育相关基因表达失衡。

                 表1 已知的水稻MAPK性质及基本生理功能(横线表示没有实验数据)

项目		OsMAP1OsMAPK2OsMSRMK2OsBIMK1OsMAPK5a	OsMAPK3	OsMSRMK3OsMAPK4	OsBWMK1	OsWJUMK1
							亚家族		A	C	C	D	D
信号分子	机械伤害	促进	-	弱的促进	促进	不变
							茉莉酮酸	促进	-	弱的促进	促进	不变
	甲基化茉莉酮酸	促进	-	-	促进	-
							水杨酸	促进	-	促进	促进	不变
	脱落酸	促进	-	促进	促进	弱的促进
							乙烯	促进	-	促进	促进	不变
	H2O2	促进	-	促进	促进	弱的促进
							蛋白磷酸酶抑制剂	芫菁素	促进	-	促进	促进	弱的促进
Endothall	促进	-	促进	促进	不变
						冈田酸		促进	-	-	促进	-
渗透压	NaCl	促进	-	促进	促进								不变
						蔗糖	促进	糖饥饿促进	促进	促进	不变
	环境胁迫因子	干旱	促进	-	抑制							促进	弱的促进
42℃						抑制	-	-	-	-
		37℃	促进	-	抑制						促进	促进
12℃						促进	-	抑制	不变	抑制
		4℃	促进	-	促进						-	-
O3						促进	-	-	促进	-
		SO2	促进	-	-						促进	-
UV-C						促进	-	抑制	不变	抑制

重金属	铜	促进	-	促进	促进	促进
							镉	促进	-	促进	促进	促进
	汞	促进	-	促进	促进	促进
							诱导物	脱乙酰壳多糖	促进	-	促进	促进	-
benzothiadiazole	促进	-	-	-	-
						probenazole		促进	-	-	-	-
2，6-氯烟异酰胺	促进	-	-	-	-
						病源体		M.grisea	促进	-	-	促进	-
P.syringae	促进	-	-	-	-
							蛋白合成抑制剂	环己酰亚胺	-	-	-	促进	-
	发育调节	相关	相关	相关	-	相关

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因。

本发明所提供的水稻促分裂原活化蛋白激酶，名称为OsMAPK6，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与水稻颖果发育相关的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由569个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第13-304位氨基酸残基为蛋白激酶结构域，自氨基端第48-151位氨基酸残基序列为MAPK特征结构域，自氨基端第175-177位氨基酸残基序列为双重磷酸化模块。

上述水稻促分裂原活化蛋白激酶的编码基因(OsMAPK6)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由2265个碱基组成，其编码序列为自5’端第78-1787位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第114-989位碱基为蛋白激酶结构域的编码序列，编码292个氨基酸；自5’端第219-530位碱基为MAPK特征结构域的编码序列，编码104个氨基酸；自5’端第600-608位碱基为双重磷酸化模块，编码3个氨基酸。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsMAPK6中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

使用OsMAPK6构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明OsMAPK6的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是水稻、玉米、拟南芥、烟草和马铃薯等。

本发明提供了一个与水稻颖果发育相关的MAPK家族新成员-水稻促分裂原活化蛋白激酶OsMAPK6，它可促进幼叶及发育早期颖果的形态建成，且其在幼嫩器官发育调控中的作用可受到2，4-D和6-BA诱导。应用转基因技术，可通过改造OsMAPK6对颖果形态建成的影响，调节水稻颖果对物质蓄积的活性，提高超高产潜力水稻籽粒的充实性，最终达到提高超高产潜力水稻的产量的目的。本发明在创制超高产水稻新品种中将具有重要的实际应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为诱导表达的OsMAPK6的SDS-PAGE检测结果

图2为诱导表达的OsMAPK6的激酶活性检测结果

图3为GFP和OsMAPK6-GFP融合蛋白在BY-2悬浮细胞中的稳定表达定位

图4为OsMAPK6及其蛋白在6周龄水稻植株的根、叶鞘、成叶、幼叶和不同发育阶段颖果中的表达分析结果

图5A为外源激素处理不同时间对OsMAPK6表达影响的RT-PCR分析结果

图5B为外源激素处理不同时间对OsMAPK6表达影响的Western Blotting分析结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述引物合成和序列测定工作均由上海博亚完成。

实施例1、水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMAPK6的克隆

根据已知的促分裂原活化蛋白激酶基因的保守区，在“华大水稻基因组数据库”(http：//btn.genomics.org.cn：8080/rice/)中进行序列比对，获得预测的水稻促分裂原活化蛋白激酶的全基因序列。根据预测的全基因序列设计三对引物进行全基因的克隆，引物序列如下：

引物1：(上游引物)5’-TTGTTCTTGGATGCCATTGTG-3’

引物1：(下游引物)5’-GTTGATAATTTCCGGAGG-3’；

引物2：(上游引物)5’-TTTGAGCGAAGAAAGGTTAC-3’

引物2：(下游引物)5’-GAATTGGTCGCATCTGGTCA-3’；

引物3：(上游引物)5’-CCGGACATACGGTCTTCAC-3’

引物3：(下游引物)5’-TTTTACCAAATAATCCGCCGTCT-3’；

提取抽穗后3天的水稻颖果的总RNA，逆转录合成其cDNA，然后以该cDNA为模板，分别在上述三对引物的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×pfx缓冲液(试剂盒自带)5μl，50mM MgSO₄ 1.5μl，10mM dNTPs 1μl，10μM上游引物和下游引物各1.5μl，Platinum pfx DNA聚合酶(Invitrogen公司)0.2μl和模板1μl，用无菌水补充至总体积为20μl。PCR反应条件为：先94℃3分钟；然后94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明获得了与预测分子量相符的三个PCR片段，片段长度分别为1.2kb，0.85kb和0.65kb。用DNA回收试剂盒(原平造公司)对PCR扩增产物进行分离纯化并用Taq酶对经纯化的PCR产物催化加尾，反应体系和反应条件为：10×Taq缓冲液1μl，2.5mM dATP 1μl，25mM MgCl₂ 0.6μl，PCR产物6.4μl，1U Taq酶1μl，样品混匀后72℃保温30分钟，并迅速置于冰上。然后将三个片段分别与载体pGEMT-Easy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，经筛选后选取阳性克隆进行核苷酸序列测定，将获得的序列进行拼接，获得了水稻促分裂原活化蛋白激酶的全长cDNA序列，该cDNA序列由2265个碱基组成，具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，其编码序列为自5’端第78-1787位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID №：1由569个氨基酸残基组成，该蛋白的理论分子量为64.67kD。使用ScanProsite软件对其氨基酸残基序列进行分析，分析结果表明自氨基端(N端)第13-304位氨基酸残基为蛋白激酶结构域，自氨基端第48-151位氨基酸残基序列为MAPK特征结构域，自氨基端第175-177位氨基酸残基序列为双重磷酸化模块。将该蛋白的氨基酸残基序列与水稻及其它植物的相似序列进行同源性比较和相似性分析，结果表明在氨基酸水平上，该蛋白与MAPK D亚家族的同源性最高，与水稻OsWJUMK1(AJ512643)，OsBWMK1(AF177392)，苜蓿MsTDY1(AF129087)，拟南芥AtMPK9(NM_112686)和AtMPK8(NM_179354)的相似性分别为82.1％，63.8％，61.8％，65.3％和56.1％，证明所克隆的基因是MAPK D亚家族在水稻中的一个新成员，命名为OsMAPK6。

实施例2、OsMAPK6的诱导表达及其激酶活性检测

一、OsMAPK6的诱导表达

根据实施例1获得的OsMAPK6的全长cDNA序列以及原核表达载体pET30c(Novegen公司)的多克隆位点设计用于扩增OsMAPK6基因的开放阅读框序列的引物，引物序列如下：

引物4：(上游引物)5’-GGT GAATTCATGGATTTCTTCAGTGAATATG-3’(带下划线碱基表示EcoRI识别位点)；

引物5：(下游引物)5’-ACA AAGCTTCTAGTACATCCTTGAAACACCA-3’(带下划线碱基表示HindIII识别位点)。

提取抽穗后3天的水稻颖果的总RNA，逆转录合成其cDNA，然后以该cDNA为模板，在引物4和引物5的引导下，PCR扩增OsMAPK6基因的开放阅读框序列，除引物不同外，PCR反应体系和PCR循环条件与实施例1相同。然后将经电泳分离纯化后的PCR扩增产物经Taq酶加尾并与载体pGEMT-Easy连接后转化大肠杆菌JM109，经筛选后选取阳性克隆进行核苷酸序列测定，将测序正确的含有OsMAPK6基因开放阅读框序列的重组质粒命名为pGEMT-Easy/OsMAPK6。用限制性内切酶EcoRI和HindIII对pGEMT-Easy/OsMAPK6进行双酶切，将酶切产物与经相同酶酶切的原核表达载体pET30c连接得到含有OsMAPK6基因开放阅读框序列的重组表达载体，命名为pET30c/OsMAPK6，然后将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Promega公司)。经筛选后挑取阳性单克隆在37℃、1mM IPTG诱导剂下进行表达(以未添加IPTG诱导剂的为空白对照)，反应结束后提取未经IPTG诱导和经IPTG诱导5小时后的菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，泳道M为蛋白分子量Marker，泳道1为未经IPTG诱导的细菌总蛋白，泳道2为经IPTG诱导5小时后的细菌总蛋白，与未加IPTG的空白对照相比，在约65kD处有一条明显的诱导条带(图中箭头所指)，与预测的OsMAPK6重组蛋白的分子量一致，表明经IPTG诱导获得了正确表达的OsMAPK6。

二、OsMAPK6的激酶活性检测

透析试剂的组成：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA，10％甘油，3mM还原型谷胱苷肽，1mM氧化型谷胱苷肽，0.5M L-Arg。

先对步骤1获得的OsMAPK6蛋白进行纯化后，再在4℃透析12-18h使其复性后进行活性鉴定。30μl自我磷酸化反应体系为：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl₂，10mM MnCl₂，1μCi[γ-³²P]ATP，0.5μg复性OsMAPK6蛋白。30μl底物磷酸化反应体系为：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl₂，10mM MnCl₂，1μCi[γ-³²P]ATP，0.5μg MBP，0.5μg复性OsMAPK6蛋白。将上述两个反应体系分别于30℃温育30min后加入SDS-PAGE上样缓冲液终止反应，然后沸水煮样4min后进行15％SDS-PAGE电泳。电泳结束后干胶压片，用放射自显影法观察结果，具体方法可参见Huang Y.F.，LiH.，Gupta R.，Morris P.C.，Luan S.，Kieber J.(2000)ATMPK4，an Arabidopsishomolog of mitogen-activated protein kinase，is activated in vitro by AtMEK1through threonine phosphorylation.Plant Physiology，122，1301-1310。结果如图2所示，泳道1为OsMAPK6的自磷酸化活性检测结果，泳道2为OsMAPK6的底物MBP磷酸化活性检测结果，实心箭头所指为OsMAPK6，空心箭头所指为底物MBP。表明OsMAPK6具有自磷酸化和催化底物MBP磷酸化的能力，证明获得的OsMAPK6为功能性MAPK。

实施例3、OsMAPK6的亚细胞定位

根据OsMAPK6基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因序列以及载体pCAMBIA super 1300(将pCAMBIA 1300用EcoRI和HindIII酶切后引入1.3kb的pBIB super promoter)的多克隆位点设计引物，引物序列如下：

引物6：(上游引物)5’-CG CCCGGGATTTCTTCAGTGAATATGG-3’(带下划线碱基为Xma I识别位点)；

引物6：(下游引物)5’- TCCTCGCCCTTGCTCACCATGTACATCCTTGA AA CACCATAT-3’(带下划线碱基为GFP序列)；

引物7：(上游引物)5’- ATATGGTGT TTCAAGGATGTACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(带下划线碱基为OsMAPK6序列)

引物7：(下游引物)5’-GGC GGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)；

引物8：(上游引物)5’-TCA CCCGGGTGAGCAAGGGCGAG-3’(带下划线碱基为XmaI识别位点)；

引物8：(下游引物)5’-GGC GGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)。

1)以pEGFP(Clontech公司)质粒为模板，分别在引物对7和引物对8的引导下，PCR扩增待与OsMAPK6的编码区融合的GFP序列和对照GFP序列。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μl，25mM MgCl₂ 1.2μl，2.5mM dNTPs 1.6μl，10μM上、下游引物各0.8μl，Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.2μl，pEGFP质粒1μl，用无菌水补充总体积至20μl。PCR反应条件为：先94℃3分钟；然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。

2)以实施例2扩增的OsMAPK6编码序列为模板，在引物对6的引导下，PCR扩增待与GFP的编码区融合的OsMAPK6序列，除模板和引物不同外，反应体系与步骤1)相同，PCR反应条件为：先94℃3分钟；然后94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。

3)PCR扩增OsMAPK6-GFP融合序列，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μl，25mMMgCl₂ 1.2μl，2.5mM dNTPs 1.6μl，10μM OsMAPK6上游引物(引物对6中的上游引物)0.8μl，10μM GFP下游引物(引物对7或引物对8中的下游引物)0.8μl，Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.2μl，步骤1)和步骤2)获得的待融合的GFP和OsMAPK6回收片段各1μl。PCR反应条件为：先94℃1分钟，60-45℃梯度退火1分钟，72℃2分30秒，共30个循环；再72℃10分钟。

4)将步骤3)获得的OsMAPK6-GFP融合序列亚克隆到真核稳定表达载体pCAMBIAsuper 1300(将pCAMBIA 1300用EcoRI和HindIII酶切后引入1.3kb的pBIB superpromoter)中得到含有OsMAPK6-GFP融合序列的真核表达载体，命名为pCAMBIA super1300/OsMAPK6-GFP，再将该重组表达载体转化根癌农杆菌GV3101(Koncz C，SchellJ.1986.The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expressionof chimaeric genes carried by a novel types of Agrobacterium binary vector.Mol Gen Genet，204：383-396.)，经筛选选取阳性克隆摇菌，用其菌液转化烟草BY-2愈伤组织(同时将步骤1)的GFP克隆至pCAMBIA super 1300中，用同样方法将其转化BY-2愈伤组织作为对照)。将上述愈伤组织置于含有500μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml hygromycin(Promega公司)双抗的MS培养基上进行筛选，直至有新的愈伤长出(约需2-3周)。将新的愈伤组织转移到新的MS抗性培养基上继续培养，并将其转入MS液体培养基中悬浮培养。利用Fluoview 300共聚焦显微镜图像系统(Olympus)进行图像采集，结果如图3所示(箭头指示细胞核，Bar＝10μm)，图中A-C代表GFP的亚细胞定位，D-F代表OsMAPK6-GFP的亚细胞定位；其中，A和D为GFP荧光图，B和E为明场图，C为A和B的叠加图，F为D和E的叠加图。可以看出OsMAPK6-GFP融合蛋白既定位于细胞质中，也定位于细胞核中，且在细胞核中的分布更多，表明OsMAPK6可能具有活化转录因子的功能。

实施例4、OsMAPK6在水稻器官发育过程中的表达

一、用RT-PCR法检测OsMAPK6在水稻器官发育过程中的表达情况

分别以6周龄水稻植株的根、叶鞘、幼叶及成叶和不同发育阶段的颖果总RNA的逆转录cDNA为模板，用RT-PCR的方法检测OsMAPK6的表达情况(以Actin作为阳性对照，扩增Actin的引物序列为上游引物：5’-CCTCGTC TCGACCTTGCTGGG-3’，下游引物：5’-GAGAACAAGCAGGAGGACGGC-3’；rRNA为溴化乙锭染色结果)，引物序列如下：

引物9：(上游引物)5’-TTTGAGCGAAGAAAGGTTAC-3’；

引物10：(下游引物)5’-ATTGTGAAGACCGTATGTCC-3’。

RT-PCR反应体系为：模板适量，10×Taq缓冲液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，25mMMgCl₂ 1.2μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加无菌水补至总体积为20μl。PCR反应条件为：先94℃3分钟；然后94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，共25个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4中A和C所示，A中泳道1为OsMAPK6在根中表达情况，泳道2为OsMAPK6在叶鞘中表达情况，泳道3为OsMAPK6在成叶中表达情况，泳道4为OsMAPK6在幼叶中表达情况；C中泳道1-7分别表示在颖果抽穗后第0、3、6、9、12、15和20DAH颖果中OsMAPK6的表达情况。结果表明该基因的mRNA水平在根和成熟叶片中较低，而在叶鞘和幼叶中较高，约为根和成叶中mRNA表达量的2-5倍，推测该基因为非器官特异性表达基因，根据其在幼叶中表达明显高于成叶的特性，推测其可能与幼叶的形态建成关系密切。在颖果中OsMAPK6在抽穗当日表达极低，3天起大量累积，9天达到最大表达量，以后逐渐下降，表明该基因也参与了颖果发育早期的形态建成过程。

二、用Western Blotting法检测OsMAPK6在水稻器官发育过程中的表达情况

根据OsMAPK6序列和原核表达载体pQE-40的多克隆位点设计引物扩增OsMAPK6C的末端特异性核苷酸序列，引物序列为：

引物11：(上游引物)5’- GGTACCGTGCAGTACAGGCCTGCAC-3’(带下划线碱基为KpnI识别位点)

引物12：(下游引物)5’- AAGCTTCGTAAAGTAGTATTGTGAAGAC-3’(带下划线碱基为HindIII识别位点)

分别以6周龄水稻植株的根、叶鞘、幼叶及成叶和不同发育阶段的颖果总RNA的逆转录样品(cDNA)为模板，在引物11和引物12的引导下，PCR扩增OsMAPK6的C末端特异性核苷酸序列，经回收纯化后与载体pGEMT-Easy连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，经筛选后挑取阳性单克隆进行核苷酸序列测定。将测序正确的含有OsMAPK6的C末端特异性核苷酸序列的重组质粒用KpnI和HindIII进行双酶切，并将酶切产物与用相同酶酶切的原核表达载体pQE-40连接，将连接产物转化转化大肠杆菌DH5α，在37℃1mM IPTG诱导剂下进行OsMAPK6特异肽段的表达，反应结束后进行SDS-PAGE检测，将表达蛋白经切胶纯化后用于制备下述Western Blot检测中的抗体。

获得的抗血清经特异性鉴定后对水稻根、叶鞘、幼叶、成叶和不同发育阶段颖果中OsMAPK6的表达情况进行Western Blotting分析，具体方法为：分别取100μg/每样品的上述器官的总蛋白按照顺序上样电泳；将电泳后的凝胶和硝酸纤维素膜在转膜缓冲液中漂洗10min，利用蛋白电转仪在90V电压下转移60min使蛋白印迹到硝酸纤维素膜(NC膜)上，NC膜经立春红染色检测转移情况后，用蒸馏水洗膜脱去颜色；用封闭液37℃封闭膜1h，封闭后的NC膜用1∶500稀释(用PBS稀释)的抗体37℃孵育1h，然后用PBST洗膜3次，每次15min，再用PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG，中山公司)孵育1h，然后用PBST洗膜3次，用DAB试剂盒(中山公司)并按说明书操作流程进行DAB显色，至显色清晰时，用蒸馏水洗去显色液终止反应。

如图4中B和D所示，B中泳道1为OsMAPK6在根中表达情况，泳道2为OsMAPK6在叶鞘中表达情况，泳道3为OsMAPK6在成叶中表达情况，泳道4为OsMAPK6在幼叶中表达情况；D中泳道1-7分别表示在颖果抽穗后第0、3、6、9、12、15和20天(DAH)颖果中OsMAPK6的表达情况。OsMAPK6在根和成熟叶片中表达量较低，而在叶鞘和幼叶中较高，约为根和成叶中蛋白表达量的2-5倍，推测该基因为非器官特异性表达基因，根据其在幼叶中表达明显高于成叶的特性，推测其可能与幼叶的形态建成关系密切。在颖果中OsMAPK6在抽穗当日表达极低，3天起大量累积，9天达到最大表达量，以后逐渐下降，其蛋白的表达趋势与之相似，表明该基因也参与了颖果发育早期的形态建成过程。

实施例5、OsMAPK6的表达调控机制

鉴于OsMAPK6在幼叶形态建成及颖果早期发育中起重要作用，植物激素如细胞分裂素、生长素在这些过程中的重要调节作用已有报道，为揭示OsMAPK6的调控机制，现分析植物激素2，4-D和6-BA对水稻幼苗OsMAPK6表达的影响，具体方法为：用10μM2，4-D或6-BA浸泡3周龄水稻幼苗根部进行不同时间(15-180min)的处理，然后提取幼苗地上组织总RNA进行RT-PCR分析，以Actin作为阳性对照，rRNA为溴化乙锭染色结果，所用引物序列与实施例4中步骤一相同，以Col为阴性对照(未经处理的材料)，结果如图5A所示，表明OsMAPK6的转录可被2，4-D和6-BA诱导，经2，4-D处理后OsMAPK6mRNA水平增高，并在处理60min时达到最大值。6-BA处理后OsMAPK6转录物也快速累积，处理30min时达到累积高峰。然后提取上述不同组织的总蛋白(每样品100μg)进行Western Blotting分析表明，结果如图5B所示，表明OsMAPK6的表达也可被2，4-D和6-BA快速诱导，经2，4-D处理30min时该蛋白即有少量增加，从60min到180min一直保持较高水平。而6-BA仅在处理后30min时，诱导一个短暂的OsMAPK6蛋白表达，蛋白水平随后到未处理前的状态。由上述结果推断OsMAPK6在颖果形态建成中的作用是受到植物激素信号调控的。

                           序列表

<160>2

<210>1

<211>569

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 15)

<400>1

Met Asp Phe Phe Ser Glu Tyr Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Lys Ile Gln

1               5                   10                  15

Glu Ile Val Gly Lys Gly Ser Tyr Gly Val Val Cys Ser Ala Ile Asp

            20                  25                  30

Gln His Thr Gly Asp Lys Val Ala Ile Lys Lys Ile His Asn Ile Phe

        35                  40                  45

Glu His Leu Ser Asp Ala Ala Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Leu Arg His Pro Asp Ile Val Glu Ile Lys His Ile Met Leu

65                  70                  75                  80

Pro Pro Ser Arg Arg Asp Phe Lys Asp Ile Tyr Val Val Phe Glu Leu

                85                  90                  95

Met Asp Thr Asp Leu His Gln Val Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr

            100                 105                 110

Lys Glu His His Gln Phe Phe Leu Tyr Gln Met Leu Arg Ala Leu Lys

        115                 120                 125

Tyr Ile His Thr Ala Asn Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn

    130                 135                 140

Ile Leu Ala Asn Ala Asn Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu

145                 150                 155                 160

Ala Arg Val Ala Phe Asn Asp Thr Pro Thr Thr Val Phe Trp Thr Asp

                165                 170                 175

Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Cys Gly Ser Phe

            180                 185                 190

Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Ala Ile Asp Thr Trp Ser Ile Gly Cys Ile

        195                 200                 205

Phe Ala Glu Ile Leu Thr Gly Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val

    210                 215                 220

Val His Gln Leu Asp Leu Met Thr Asp Leu Leu Gly Thr Pro Ser Met

225                 230                 235                 240

Asp Ala Ile Ser Arg Ile Arg Asn Asp Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Ser

                245                 250                 255

Ser Met Arg Arg Lys Gln Pro Val Pro Phe Ser Glu Lys Phe Pro Asn

            260                 265                 270

Val Asp Pro Leu Ala Leu Lys Leu Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Asp

        275                 280                 285

Pro Lys Asp Arg Pro Thr Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe

    290                 295                 300

Lys Gly Leu Ala Lys Val Glu Arg Glu Pro Ser Cys Gln Pro Ile Ser

305                 310                 315                 320

Lys Met Glu Phe Glu Phe Glu Arg Arg Lys Val Thr Lys Asp Asp Ile

                325                 330                 335

Lys Glu Leu Ile Phe Arg Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Gln Leu Leu

            340                 345                 350

Lys Asp Tyr Met Asn Gly Ser Glu Asn Thr Ser Phe Leu Tyr Pro Ser

        355                 360                 365

Ala Val Asp Asn Phe Arg Arg Gln Phe Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly

    370                 375                 380

Gly Lys Ser Gly Ala Leu Asp Arg Lys His Val Ser Leu Pro Arg Ala

385                 390                 395                 400

Thr Thr Val His Ser Thr Ser Ile Pro Pro Asn Glu Gly Leu Asp Ala

                405                 4l0                 415

Thr Ser Gln Val Thr Gln Arg Ile Pro Thr Ala Arg Pro Gly Arg Thr

            420                 425                 430

Val Gly Pro Val Leu Pro Phe Glu Asn Pro Gly Ala Ala Asp Pro His

        435                 440                 445

Ser Ala Arg Arg Val Val Arg Asn Pro Met Val Pro Pro Ala Ala Ala

    450                 45                  460

Asn Lys Ser Gly Tyr Ser Tyr Asn Leu Lys Ser Asp Tyr Ser Asp Arg

465                 470                 475                 480

Gln His Gln Glu Glu Leu Glu Lys Asp Arg Val Gln Tyr Arg Pro Ala

                485                 490                 495

Gln His Leu Met Asp Ala Lys Val Ala Pro Asp Thr Ala Pro Asp Ile

            500                 505                 510

Arg Ser Ser Gln Tyr Tyr Phe Thr Arg Ser Ala Pro Arg Thr Asp Leu

        515                 520                 525

Thr Asp Arg Ala Ala Leu Gln Gly Ser Met Leu Tyr Gly Ile Ala Pro

    530                 535                 540

Phe Asn Gly Ile Ala Ala Val Ala Gly Gly Tyr Ser Lys Val Gly Ala

545                 550                 555                 560

Val Gln Tyr Gly Val Ser Arg Met Tyr

                565

<210>2

<211>2265

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.cv.Zhonghua 15)

<400>2

ttgttcttgg atgccattgt gttttgagac agagtgctga attttcaatc ttgaattttg      60

tccagaacac aacagagatg gatttcttca gtgaatatgg tgactccagc cggtacaaaa     120

ttcaagaaat cgttggtaaa ggaagttatg gagttgtttg ttcagctatt gaccaacata     180

ccggtgacaa agtagcaatc aagaaaatac acaatatctt tgagcatcta tctgatgctg     240

ctaggatcct ccgtgagatc aaacttctcc ggcttttacg gcatcctgat attgtcgaga     300

tcaaacatat aatgttacct ccatctagaa gggacttcaa agatatttat gttgtcttcg     360

aactgatgga tacagacctc caccaggtta ttaaggctaa tgatgactta acgaaggaac     420

atcatcagtt ctttctgtat caaatgcttc gagcattgaa atatatccat actgctaatg     480

tttatcatcg tgatttaaag cccaaaaata tattagcaaa tgctaactgt aagctcaaga     540

tatgtgattt tggactagca agagttgcat ttaatgacac tcctacaaca gttttctgga     600

cggactacgt tgcaactaga tggtacaggg ctcctgagct gtgtgggtct ttcttttcta     660

agtattcacc agctatagat acatggagta ttggttgcat ttttgcggag attttgactg     720

gaaaaccttt gttccctggt aaaaatgtgg ttcatcaatt ggacttgatg actgatctct     780

tgggtacacc atcaatggat gctatttcac ggattcggaa tgacaaggca aggaggtatc     840

tgagcagcat gaggaggaag cagccagtac ctttttcaga aaagttccca aatgtagatc     900

ctttggcact caagctctta caaaggcttc tagcatttga tccgaaggat cgacctactg     960

cagaagaggc gttggctgat ccatatttta aaggccttgc aaaagtggag agagaaccat    1020

catgccaacc aatttcaaaa atggagtttg agtttgagcg aagaaaggtt accaaagatg    1080

atatcaagga acttatattc cgtgagatat tagagtatca tcctcagctt ctgaaggatt    1140

acatgaatgg ctccgaaaac acgagctttc tatatccaag tgctgttgat aatttccgga    1200

ggcaatttgc catcttagag gaaaacggag gaaagagtgg tgcactagat aggaagcatg    1260

tttctcttcc aagggctaca acagttcact ctacatcaat tcctccaaat gaaggcctag    1320

atgcaacatc ccaagttact caaaggatcc caacagctag accaggaaga acggttggtc    1380

cggtattacc atttgagaat ccaggcgccg cagatccgca cagcgcacgg agggtggtga    1440

ggaatccgat ggttcctcca gcagctgcca acaagtcagg atacagctac aacctaaagt    1500

cagactactc tgataggcaa catcaggaag agcttgagaa agatcgtgtg cagtacaggc    1560

ctgcacaaca cttgatggat gctaaagttg ctccagatac agccccggac atacggtctt    1620

cacaatacta ctttacgagg agtgctccca gaactgatct aacagacagg gctgcactcc    1680

aggggagcat gctatacggc attgctccgt tcaacggcat cgcagcagtt gctggtggat    1740

acagcaaggt tggtgccgtt caatatggtg tttcaaggat gtactagagt tttagtcagg    1800

cagttgtgga attgctccat agatgagcaa gatgggaatg ccggagcatg gctttgtgtt    1860

gtgcccatcc acccagatat aaggctggca agggaattgg tcgcatctgg tcatggatgc    1920

aggcgaaggt tgaagaaagg agaagggaaa ctcctattcc atctcaggcg gccattgtcc    1980

atttgaaatg gcagtgagct cgcgatggtg aaagaggaaa agagggagag aaagttcatg    2040

gtggaatttc tcgcacttta tttgttgtgg agaaaaggag aaaatgtgaa taacagcact    2100

aggctgggct tgtgtacata cctgcaaccc ttgatttttt ttttcttgtt ttcgttgcta    2160

gaagctgttg cttcttgtgt aaacctgcaa aagcatactc cgaaaatgaa tcattcgcca    2220

aaaaattgag acggcggatt atttggtaaa aaaaaaaaaa aaaaa                    2265

Claims (10)

1、一个水稻促分裂原活化蛋白激酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与水稻颖果发育相关的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶，其特征在于：所述序列表中SEQ ID №：1自氨基端第13-304位氨基酸残基为蛋白激酶结构域；自氨基端第48-151位氨基酸残基序列为MAPK特征结构域；自氨基端第175-177位氨基酸残基序列为双重磷酸化模块。

3、编码权利要求1或2所述水稻促分裂原活化蛋白激酶的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求3或4所述水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的植物表达载体。

6、含有权利要求3或4所述水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求3或4所述水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的宿主菌。

8、扩增权利要求3或4所述基因中任一片段的引物。

9、权利要求1或2所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在培育超高产水稻品种中的应用。

10、权利要求3或4所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因在培育超高产水稻品种中的应用。

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