CN1872876A

CN1872876A - 棉花的一个dreb类转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1872876A
Application number: CN 200610012084
Authority: CN
Inventors: 刘进元; 黄波; 金龙国
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2006-06-01
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2006-12-06
Anticipated expiration: 2026-06-01
Also published as: CN100402550C

Abstract

本发明公开了一个棉花的DREB类转录因子及其编码基因与应用。其目的是提供一个来源于棉花的DREB类转录因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。该DREB类转录因子是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。本发明可应用于植物抗性的基因工程改良中，具有较高的实际应用价值。

Description

棉花的一个DREB类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的DREB类转录因子及其编码基因，以及其在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

背景技术

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

DREB类转录因子是植物中可与DRE元件结合进而调控植物抗逆胁迫反应的转录因子。DREB类转录因子属于AP2/ERF转录因子家族中一个亚族(DREB亚族)，该亚族又可进一步被分为6个组(A-1到A-6)，目前对DREB亚族成员的研究主要集中在A-1和A-2组，而对其它组成员则研究得较少。但是，其它组成员在整个DREB亚族中占据着75％的数量(拟南芥中数据)(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290：998-1009)，因此对这些组成员的结构与功能的研究有助于对整个DREB亚族转录因子的进一步认识。

2002年，Pagès研究小组通过酵母单杂交技术从玉米中分离得到两个DREB类转录因子，命名为ZmDBF1和ZmDBF2(Kizis D，Pages M.Maize DRE-binding proteinsDBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsiveelement in an ABA-dependent pathway.Plant J.2002，30：679-689)。通过序列比对和进化树分析，将ZmDBF1归类到A-6组，ZmDBF2归类到A-4组。研究表明，ZmDBF1受到干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导，并且在植株的各个部分均有表达，但基本上不受低温和热刺激的诱导。体外凝胶滞留实验证明ZmDBF1能特异地和“ACCGAC”序列相结合。瞬时表达实验表明ZmDBF1蛋白能够激活由rab17启动子驱动的报告基因的表达，而且这种激活作用在外源ABA的存在下更明显(Kizis D，Pages M.MaizeDRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation throughthe drought-responsive element in an ABA-dependent pathway.Plant J.2002，30：679-689)。Pagès研究小组的实验首次展示了除了典型A-1和A-2组成员外，A-6组的成员也能够与DRE元件相结合，并且能够激活DRE元件介导的报告基因的转录。此外，上述研究结果还表明了ABA参与了ZmDBF1基因的表达调控，这是关于ABA参与DREB类转录因子表达调控的首次报道。ABA在植物响应外界非生物胁迫信号中起到非常重要的作用，因此该实验不仅对认识整个DREB亚族转录因子提供了一条新的线索，而且为通过过量表达DREB类转录因子来提高植物的抗逆性提供了新的材料和新的思路。但是，迄今为止，除了ZmDBF1以外，还没有其它A-6组成员的功能被解析，也还没有实验证据表明在其它植物中也有类似于ZmDBF1基因的存在。

在鉴定一个转录因子时，常常采用DNA迁移率变动试验(DNA mobility shiftassay，EMSA)来分子转录因子与目标DNA序列的结合特性。DNA迁移率变动试验，又叫凝胶阻滞(gel retardation)试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的凝胶电泳分析技术。基本原理为：在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可证实特异性DNA与相应蛋白的结合。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于棉花的DREB类转录因子。

本发明所提供的DREB类转录因子，名称为Gossypium hirsutum DRE bidingprotein-2(简称GhDBP2)，来源于棉属陆地棉(Gossypium hirsutum)，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由350个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第257位-273位氨基酸残基为核定位序列(NLS)，自氨基端第160位-217位氨基酸残基序列为保守的AP2/ERF结构域，自氨基端第31位-60位氨基酸残基序列为丝氨酸富含区，自氨基端第278位-350位氨基酸残基序列为酸性区域。

编码上述棉花DREB类转录因子的基因(GhDBP2)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID №：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在调控植物抗逆性中起重要作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由1493个碱基组成，其编码序列为自5’端第110位-1162位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第878位-928位碱基为核定位序列的编码序列，AP2/ERF保守结构域的编码序列，自5’端第587位-760位碱基为AP2/ERF保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸，自5’端第200位-289位碱基为丝氨酸富含区的编码序列，自5’端第941位-1159位碱基为酸性区域的编码序列。

含有本发明基因GhDBP2的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增GhDBP2中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种调控植物抗逆性的方法。

本发明所提供的调控植物抗逆性的方法，是将所述编码棉花DREB类转录因子的基因GhDBP2导入植物组织或细胞，植物抗逆性获得调控。

所述编码棉花DREB类转录因子的基因GhDBP2可通过含有GhDBP2的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。

使用GhDBP2构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有GhDBP2的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

上述调控植物抗逆性的方法对所有植物都适用，既适用于玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也适用于棉花、拟南芥、烟草等双子叶植物。

本发明提供了一个来源于棉花的DREB类转录因子及其编码基因(GhDBP2)。RT-PCR检测结果表明GhDBP2在棉花幼苗的真叶、茎和根中优势表达，并受到NaCl、干旱、低温和ABA的强烈诱导。GhDBP2可应用于植物(包括单子叶和双子叶植物，尤其是棉花)的品质及抗性的基因工程改良中，具有较高的实际应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为GhDBP2 AP2/ERF结构域的进化树分析结果

图2为GhDBP2与部分DREB亚族A-6组成员的全序列多重比对结果

图3为Ni-NTA亲和层析柱纯化的N-末端带有His-tag的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白的SDS-PAGE检测结果

图4为DRE元件的DNA序列及GhDBP2的AP2/ERF结构域与DRE元件结合的体外凝胶滞留实验结果实验结果

图5为载体pCK-GFP的结构示意图

图6为GhDBP2的核定位分析结果

图7为GhDBP2 mRNA的时空分布模式RT-PCR分析结果

图8为外界胁迫对GhDBP2表达影响的RT-PCR检测结果

图9为检测GhDBP2与LEA D113基因启动子区结合的EMSA实验用探针序列及

实验结果

图10为载体5×GAL4-LUC的框架图

图11为效应质粒与报告质粒的部分结构示意图与GhDBP2在烟草细胞中对LEAD113基因启动子活性的转录激活作用的检测结果

图12为载体pBE2113的框架图

图13为载体pUE2113的框架图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。

实施例1、棉花DREB类转录因子编码基因GhDBP2的克隆

利用生物信息学和常规PCR相结合的方法克隆棉花DREB类转录因子编码基因GhDBP2的cDNA序列，具体方法为：对玉米ZmDBF1(GenBank登陆号：AF493800)(KizisD，Pages M.Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17regulation through the drought-responsive element in an ABA-dependent pathway.Plant J.2002，30：679-689)编码的氨基酸序列用tblastn程序搜索棉花EST数据库(http：//www.tigr.org/)，结果得到一个序列(TC18189)，该序列由来自陆地棉和海岛棉的几个EST序列拼接而成，具有具有翻译起始密码子和终止密码子，说明该序列包含了全长开放阅读框(ORF)，序列比对结果表明，该序列所编码的氨基酸残基序列与ZmDBF1的氨基酸残基序列具有较高的相似性。为验证在陆地棉(Gossypiumhirsutum)中也存在该cDNA序列，根据该序列的5’和3’端序列设计一对引物P1：5’-ACCTCTTTTAATCCGTTCTGG-3’和P2：5’-CTCTGGTATCGTGTTTTCTTC-3’，然后以棉花的cDNA文库为模板，在引物P1和P2的引导下进行常规PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1500bp的目的片断，将其克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，对含有回收片断的重组载体进行测序，结果扩增片断具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由1493个碱基组成，其编码序列为自5’端第110位-1162位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。测序结果表明该序列就是目的序列，与TC18189只有少量几个碱基的变化。将该基因命名为Gossypium hirsutum DREbiding protein-2，(简称GhDBP2)，其编码蛋白命名为GhDBP2，该蛋白质理论分子量(MW)为38.5kDa，理论等电点(pI)为6.94。

实施例2、GhDBP2蛋白的序列分析和DNA结合域的同源性进化分析

一、GhDBP2蛋白的序列分析

对GhDBP2的氨基酸残基序列进行序列分析，结果发现GhDBP2蛋白含有一个在DREB亚族转录因子中很保守的AP2/ERF结构域，即自氨基端(N端)第160位-217位氨基酸残基(SEQ ID №：2中自5’端第587位-760位碱基为其编码序列)，共58个氨基酸；在其C-末端具有一个酸性区域，即自氨基端第278位-350位氨基酸残基(SEQ ID №：2中自5’端第941位-1159位碱基为其编码序列)，该酸性区域可能作为转录激活区起作用；在DNA结合区的后面为双亲性核定位信号序列(NLS)，即自氨基端第257位-273位氨基酸残基(SEQ ID №：2中自5’端第878位-928位碱基为其编码序列)；在N-末端还具有一个丝氨酸富含区，即自氨基端第31位-60位氨基酸残基(SEQ ID №：2中自5’端第200位-289位碱基为其编码序列)，富含丝氨酸的区域常常是蛋白修饰位点，在调节蛋白活性上起作用，因此，推测该区域对GhDBP2的促进转录活性具有调节作用。

二、GhDBP2蛋白的DNA结合域的同源性进化分析

序列的同源性比对分析可以为基因功能的研究提供一些有用信息。2002年，Sakuma等对拟南芥全基因组145个AP2/ERF族转录因子的DNA结合域进行了进化树分析，将DREB转录因子分为了6个组(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290：998-1009)。实验证明这种分类方法具有合理性，如在同源性分析中被划分为DREB1类的基因几乎都受到低温胁迫的诱导(Stockinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F.Arabidopsis thalianaCBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that bindsto the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulatestranscription in response to low temperature and water deficit.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94：1035-1040；Gao M J，Allard G，Byass L，et al.Regulationand characterization of four CBF transcription factors from Brassica napus.Plant Mol.Biol.2002，49：459-471)；而被划分到A-2组(DREB2类)的成员，如拟南芥DREB2A/B、水稻OsDREB2A和大麦HvDRF1则都受到干旱或高盐的诱导(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transductionpathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell 1998，10：1391-1406；Xue G P，LoveridgeC W.HvDRF1 is involved in abscisic acid-mediated gene regulation in barleyand produces two forms of AP2 transcriptional activators，interactingpreferably with a CT-rich element.Plant J.2004，37：326-339)。

为进一步明确GhDBP2与ZmDBF1及其它已报道的DREB类转录因子的同源关系和GhDBP2在整个AP2/ERF家族中的分类地位，现将GhDBP2 AP2/ERF DNA结合域的氨基酸序列与该家族中的其它成员进行进化树比对分析，具体方法为：根据上述Sakuma的分类方法，从拟南芥AP2/ERF家族每个小组中分别选取有代表性的基因作为分类的基本框架，然后将在GenBank中登陆并且有文献报道的来自其它植物的DREB类转录因子的DNA结合域的氨基酸序列用ClustalW软件进行序列比对分析，并用Tree view1.1软件绘制进化树。GhDBP2 AP2/ERF结构域的进化树分析结果如图1所示(标尺表示分枝的长度，A-1～A-6是按Sakuma等提出的DREB亚族的6个组。所增加的序列在GenBank中的登录号分别为：CBF4/DREB1D(AB015478)；DDF1/DREB1F(AC025417)；BnCBF1(AF370733)；LeCBF1(AY034473)；TaCBF1(AF303376)；ScCBF1(AF370730)；HvCBF3(AF239616)；ZmDREB1A(AF045481)；HvDRF1(AY223807)；OsDREB1A(AF300970)；OsDREB2A(AF300971)；ZmDBF1(AF493800)；ZmDBF2(AF493799)；ZmABI4(AY125490)；GhDBP1(AY174160)；GhDBP2(AY619718)；OsDBF1(AP004727))，新添加的序列并未打乱以前的分类框架，来自其它植物的DREB1类转录因子被划分到A-1组，而水稻OsDREB2A和大麦HvDRF1被划分到A-2组中，GhDBP2和玉米ZmDBF1一样同属于A-6组，同组的成员还包括来自拟南芥的RAP2.4(NM_106457)和水稻中推定的AP2/ERF转录因子OsDBF1(AP004727)，进化树分析表明GhDBP2的功能可能与同组的ZmDBF1和RAP2.4具有相似性。

现进一步分析A-6组成员结构上的特点，将已知的玉米ZmDBF1、拟南芥RAP2.4和其它推定的序列AtRAP2、OsDBF1和OspDREB3进行了全序列的多重比对分析，分析结果如图2所示(方框内序列为AP2/ERF结构域，下划线表示两个推定的保守区，星号(*)表示在AP2/ERF结构域中保守的14位缬氨酸残基和19位亮氨酸残基。GhDBP2(棉花，AY619718)，AtRAP2(拟南芥，BT000907)，RAP2.4(拟南芥，NM_106457)，ZmDBF1(玉米，AF493800)，OspDREB3(水稻，XM_467836)，OsDBF1(水稻，AP004727))，这些蛋白的氨基酸残基序列都含有一个保守的AP2/ERF结构域，而且在这个结构域中的第14位和第19位的氨基酸分别为缬氨酸和亮氨酸。研究表明这两个位置的氨基酸对于DREB亚族和ERF亚族成员与DNA结合的特异性起到关键性的作用。在拟南芥中，第14位的缬氨酸在所有的DREB亚族成员都是保守的，而第19位氨基酸的可变性要大一些，主要是谷氨酸，此外，还发现有亮氨酸或缬氨酸等。同氨基酸的保守性相一致，Sakuma等通过定点突变的方法进行研究发现第19位的氨基酸单点突变几乎不影响DREB转录因子与DRE元件的亲和力，而第14位缬氨酸的单点突变则显著降低了该亲和力，表明第14位的氨基酸决定了DREB亚族转录因子与DRE元件结合的特异性(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290：998-1009)。由于GhDBP2的AP2/ERF结构域中第14位氨基酸是缬氨酸，跟它同属于A-6组且与其在氨基酸水平上同源性非常高的ZmDBF1已被证实可以与DRE元件相结合，因此，推测GhDBP2也能够与DRE元件特异的相结合。

实施例3、GhDBP2与DRE元件的结合特性分析

一、制备带有His-tag(6×His)的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白

1、GhDBP2 AP2/ERF结构域表达载体的构建

以GhDBP2 cDNA为模板，在引物P1(上游引物)：5’-CG GGATCCATGGTTAGCTTTCTTTGC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)和P2(下游引物)：5’-CG GAATTCTCAAGCGTCAACAGAGGA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)的引导下，PCR扩增5’端添加BamH I识别位点、3’端加EcoR I识别位点的GhDBP2 AP2/ERF结构域编码序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约300bp的目的片断，将其用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET32a(+)(购自Novagen公司，具有His-tag编码序列)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含100μg/mL氨苄霉素的LB平板上进行抗性筛选，挑选长出的单菌落，将其接种于LB液体培养基中摇菌，提质粒，对其进行核酸序列测定，测序结果表明获得了序列及插入位置正确的含有GhDBP2 AP2/ERF结构域编码序列的重组载体，命名为pET32-GhDBP2-AP2/ERF。

2、重组蛋白的表达

将经鉴定的重组质粒pET32-GhDBP2-AP2/ERF转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于含100μg/mL氨苄霉素的LB平板上进行抗性筛选，得到转化有重组质粒pET32-GhDBP2-AP2/ERF的重组菌，作为表达GhDBP2 AP2/ERF结构域重组蛋白的宿主菌。挑取单菌落，将其接种于3mL含100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基中在37℃下培养12-24小时，然后取1mL培养物接种于新鲜且预热的1L液体LB培养基中扩大培养，200rmp振荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.7时，然后向培养物中加入终浓度为0.8mM的IPTG诱导重组蛋白的表达，在相同条件下继续培养3-5小时即可。

3、表达蛋白的纯化及SDS-PAGE检测

N-末端带有His-tag的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白的在一定条件下可与Ni-NTA树脂特异结合，在较高的咪唑浓度下又能被洗脱下来，因此可用亲和层析方法进行纯化，具体方法包括以下步骤：

1)取步骤2的培养液，5000g离心25分钟收集菌体，将菌体重悬于50mL超声裂解液(50mM NaH₂PO₄(pH 8.0)，300mM NaCl，20mM咪唑)中；

2)加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，冰上放置30分钟；

3)冰浴超声裂解细胞(功率300W，超声3秒，停3秒，共100次)，4℃、12000g离心20分钟，收集上清液；

4)通过恒流泵将上清液缓慢泵入用裂解液平衡好的Ni-NTA层析柱中，用5～10倍体积洗涤液(50mM NaH₂PO₄(pH 8.0)，1M NaCl，40mM咪唑，5mMβ-巯基乙醇，0.2％Tween-20，5％乙醇)洗柱，直至流出液的OD₂₈₀接近于0；

5)用10mL洗脱液(50mM NaH₂PO₄(pH 8.0)，300mM NaCl，150mM咪唑)洗脱，每管收集1mL左右；

6)所得洗脱液用考马斯亮蓝试剂(考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95％乙醇，再加入120mL 85％磷酸，用水稀释至1升)染色，并进行SDS-PAGE检测，合并蛋白含量较高的几管，测定浓度后，加入甘油至终浓度为10％，-70℃保存备用。

经纯化的N-末端带有His-tag的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白的SDS-PAGE检测结果如图3所示(M：低分子量蛋白标准，单位KDa；CL：细胞裂解液的上清；FT：Ni-NTA亲合层析纯化时的流出液；W：Ni-NTA亲合层析纯化时的洗涤液；E1：Ni-NTA亲合层析纯化的融合蛋白)，纯化蛋白的分子量约为30kDa，与预期结果相符，表明获得了电泳纯的N-末端带有His-tag的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白。

二、GhDBP2与DRE元件的结合分析

实施例2的GhDBP2的氨基酸结构分析表明该蛋白是DREB亚族成员，现用非同位素体外凝胶滞留实验(EMSA)检测它与DRE元件的结合能力，具体方法包括以下步骤：

1)以拟南芥的基因组DNA为模板，在引物DREs：5’-CATCAGTTTTGAAAGAAAAGGGA-3’和DREa：5’-TTTGCTTTTTGGAACTCATGTCG-3’的引导下，PCR扩增DRE元件的DNA序列(见图4中的图A，方框内碱基为DRE元件的核心序列)，该序列长度为75bp，来自于拟南芥rd29A基因启动子区域，回收并纯化该片段；

2)按以下体系将步骤1扩增的DRE元件的DNA序列与不同浓度(10ng、50ng、100ng)的步骤一表达的N-末端带有His-tag的GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白进行混合(20μl)：100ng DNA片段，不同浓度的蛋白质，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，150mM KCl，1mM DTT。

3)将上述混合体系在室温下放置30分钟，然后进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，用EB染色，观察DNA条带的移动情况。

凝胶滞留实验结果如图4中的图B所示(条带FP：游离的探针；条带B：GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白与DRE元件结合引起滞后的条带。泳道1：没有加GhDBP2 AP2/ERF结构域融合蛋白；泳道2-4：蛋白的上样量分别为10ng、50ng和100ng)，在凝胶上有明显滞后的条带，而且这个条带的亮度随着蛋白量的加大而成正比例增加，说明这个滞后条带不是由于非特异性结合造成的，而是GhDBP2在体外条件下与DRE元件形成复合体所致，该实验证明本发明的GhDBP2就是一个DRE元件结合蛋白。

实施例4、GhDBP2的细胞核定位分析

转录因子通过与基因的启动子区相结合来调节基因的表达，因此转录因子若发挥其转录调节功能则必须进入到细胞核内与基因组DNA相结合。实施例2的序列分析结果表明GhDBP2具有一个类似的核定位信号(NLS，KKSSKVTADTKSRNNKK，序列表中SEQ ID №：1中自氨基端第257位-273位氨基酸残基)，通过瞬时表达GhDBP2与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白来验证GhDBP2的细胞核定位(GFP产生荧光的生色团是由Ser₆₅、脱氢Tyr₆₆、Gly₆₇自身环化及氧化形成，形成时依赖于氧，无需酶催化，且发生在肽链合成之后。该发色团在395nm处有最大吸收，发射509nm绿色荧光)，具体方法如下：

一、GhDBP2核定位信号的编码序列与GFP融合基因瞬时表达载体的构建

以GhDBP2 cDNA为模板，在引物LCSF(上游引物)：5’-CATG CCATGGCTTTTGCCTTCCTCTGTTGACG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nco I识别位点)和LCSR(下游引物)：5’-CGC GGATCCGATACAGCCGAACCCTCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)的引导下，PCR扩增5’端添加Nco I识别位点、3’端加BamH I识别位点的GhDBP2核定位信号的编码序列(GhDBP2(NLS))。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约230bp的目的片断，将其用限制性内切酶Nco I和BamH I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pCK-GFP(该载体的结构示意图见图5，具有加倍的CaMV 35S启动子)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含100μg/mL氨苄霉素的LB平板上进行抗性筛选，挑选长出的单菌落，将其接种于LB液体培养基中摇菌，提质粒，对其进行核酸序列测定，测序结果表明GhDBP2(NLS)与GFP在同一个阅读框架内，获得了序列及插入位置正确的含有GhDBP2与GFP融合基因的重组载体，命名为pCK-GhDBP2(NLS)：GFP。

二、转化洋葱

将步骤一构建的GhDBP2与GFP融合基因的瞬时表达载体pCK-GhDBP2(NLS)：GFP用基因枪瞬时法转化洋葱，具体方法包括以下步骤：

1)DNA的金粉包埋

按照Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System的方法(Sanford J C，Smith F D，Russell J A.Optimizing the biolistic process for differentbiological applications.Methods Enzymol.1993，217：483-509)对pCK-GhDBP2(NLS)：GFP质粒用金粉进行包埋，即将保存在50％甘油中的金粉振荡5分钟以悬浮凝聚的金粉颗粒，从中取出金粉悬液50μl(60mg/mL，六枪的用量)到一个新的离心管中，继续振荡取出的金粉悬液，并在振荡过程中依次加入5μg的质粒、50μl的CaCl₂(2.5M)、20μl亚精胺(0.1M)，充分混匀，点离心，弃上清，用无水乙醇洗涤沉淀2次，将沉淀重新悬浮于48μl无水乙醇中，待用。

2)洋葱表皮的准备

将洋葱撕成瓣，取中间鲜嫩的洋葱瓣，用解剖刀切成约1.5cm×1.5cm的小块，然后用平头镊子将洋葱的内表皮慢慢撕下，将撕下的内表皮放在MS固体培养基上，在22℃下培养。

3)基因枪轰击

采用Bio-Rad PDS-1000/He基因枪对包埋有质粒DNA的金粉进行轰击，可裂膜压力为1.1kPa，洋葱表皮至可裂膜距离为6cm，轰击后将洋葱表皮继续在22℃下培养12小时。

三、激光共聚焦显微镜观察

将轰击后在22℃下培养12小时的洋葱表皮细胞直接放在载玻片上用激光共聚焦显微镜(Olympus，FV500)进行观察，以转化有pCK-GFP空质粒的洋葱表皮为对照。选用标准的GFP(激发波长488nm，发射波长525nm，并加强)和可见光明场下对同一视野进行序列扫描，两次扫描结果保存成单独的图像，最后由显微镜操作系统(Fluoview，版本4.3)对两次扫描形成的图像进行叠加，所有得到的扫描图像都通过Adobe Photoshop^CS进行编辑整理，形成最终的图片。结果如图6所示(A-C为转化pCK-GFP空质粒的洋葱表皮；D-F为转化pCK-GhDBP2(NLS)：GFP的洋葱表皮：A和D是暗场下对GFP荧光进行扫描的照片；B和E是在明场下对细胞的形态进行照片；C和F是暗场和明场的合并)，当包含有GhDBP2核定位信号的一段氨基酸序列与GFP在洋葱表皮细胞中融合表达时，该融合蛋白特异的定位于洋葱表皮细胞的细胞核中(见图6中的图D-图F)；而当GFP单独表达时，GFP荧光则充满整个洋葱表皮细胞(见图6中的图A-图C)。该实验结果证明GhDBP2蛋白定位于细胞核。

实施例5、GhDBP2转录本的时空分布

用RT-PCR的方法检测GhDBP2在棉花植株中的组织分布情况，并采取以下措施保证检测结果的可靠性：首先用扩增级别DNase I来消化提取的总RNA中可能存在的少量的基因组DNA的污染，为了检测基因组DNA消除得是否干净，取出一部分用DNase I消化的总RNA样品进行常规的PCR反应，当发现没有扩增的条带时，再进行下面的反转录步骤；另一方面，在引物设计上尽量将两对引物放在两个外显子上，使从基因组DNA和cDNA上扩增产物大小不一样，这样就可以排除扩增产物可能存在基因组DNA的痕量污染；最后，由于GhDBP2的家族成员的保守性较强，将其扩增引物尽量不放在cDNA的编码区，特别是编码很保守的AP2/ERF结构域的区域，为了进一步验证RT-PCR扩增的条带就是GhDBP2基因本身，还将PCR产物切胶回收进行测序。具体方法为：分别以2周幼苗的真叶、子叶、茎、根，和90天植株的完全开放的花、幼胚(5DPA，day post anthesis)、成熟胚(55DPA)、纤维细胞(5DPA)为材料提取总RNA为模板，在引物GhDBP2-RTs(上游引物)：5’-CAATTCCACCTCCACAAC-3’和GhDBP2-RTa(下游引物)：5’-TGCCGTAACCTTGGATGA-3’的引导下进行RT-PCR扩增：先取1μg总RNA加入扩增级别DNase I(Sigma，USA)室温放置30分钟以去除基因组DNA的污染，然后加入停止缓冲液(50mM EDTA)，70℃加热10分钟以变性DNase I和RNA；然后采用Promega公司的Reverse Transcription System并按照试剂盒说明书进行反转录，在42℃下反应45分钟，取出，沸水煮5分钟后，置于冰上，以使反转录酶失活；最后取1μl反转录产物进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃40s，55℃30s，72℃1min，共30个循环。以胚胎发育晚期丰富(late-embryogenesis abundant，LEA)蛋白基因LEA D113(GenBank登陆号：X13202)为对照(RT-PCR扩增引物为：D113s(上游引物)：5’-ATGCTGCTGCCTCTGCTA-3’和D113a(下游引物)：5’-TCCCAGCATTGTTAGAC-3’)，以棉花染色体18S rRNA(Small Subunit rRNA，SSUrRNA)cDNA为量参(RT-PCR扩增引物为：SSU1(上游引物)：5’-AACTTAAAGGAATTGACG-3’和SSU2(下游引物)：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCC-3’)，反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％的琼脂糖凝胶检测，检测结果如图7所示(LV：真叶：CL：子叶；ST：茎；RT：根；FL：完全开放的花；YE：幼胚；OE：成熟胚；FB：纤维细胞(5DPA))，GhDBP2基因在棉花幼苗的真叶、茎和根中优势表达；在幼苗的子叶中的表达量稍弱；而在90天的植株中的棉胚中GhDBP2的mRNA有大量的积累，其中在成熟胚的表达量要高于幼胚；而在开放的花和5DPA的纤维细胞中，GhDBP2的表达量较弱。LEA D113基因在棉花的成熟胚优势表达，在棉花幼苗的子叶和根中有痕量的表达。此结果与以前报道的LEA D113基因主要在棉花的胚发育晚期大量表达(Galau G A，Hughes D W，Dure L.Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesis-abundant(Lea)mRNAs.Plant Mol.Biol.1986，7：155-170)相一致。上述检测结果表明GhDBP2在所检测的所有组织中呈现出一种组成型表达的模式，与DREB亚族A-6组中另外两个已报道的成员(RAP2.4和ZmDBF1)的表达模式相似。PAP2.4基因在所检测的野生型拟南芥的叶、茎、根和花中都有表达(Okamuro J K，Caster B，Villarroel R，etal.The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA bindingproteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94：7076-7081)，而ZmDBF1基因在所检测的野生型玉米的根、茎、叶和不同发育时期的胚中都有表达(Kizis D，Pages M.Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved inrab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA-dependentpathway.Plant J.2002，30：679-689)。上述结果暗示GhDBP2可能与ZmDBF1和RAP2.4具有某些功能上的相似性。

实施例6、检测逆境胁迫条件对GhDBP2基因表达的影响

研究表明A-6组中的玉米ZmDBF1表达主要受到干旱、高盐和植物激素ABA的诱导，而低温对ZmDBF1的表达几乎没有影响(Kizis D，Pages M.Maize DRE-bindingproteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through thedrought-responsive element in an ABA-dependent pathway.Plant J.2002，30：679-689)。为了研究GhDBP2基因对外界环境胁迫的响应和与ZmDBF1基因之间的差异，现用RT-PCR的方法检测GhDBP2基因在各种环境胁迫处理条件下的表达模式。首先对14天的棉花幼苗分别进行下述胁迫处理：NaCl(将幼苗从土中取出浸泡在400mMNaCl溶液中)、干旱(将幼苗从土中取出放在滤纸上)、低温(4℃)、ABA(将幼苗从土中取出浸泡在100μM ABA溶液中)和水渍(用蒸馏水处理)，以未作任何处理的棉苗为对照(Con)，然后用与实施5相同的方法检测GhDBP2的表达情况，以胚胎发育晚期丰富(late-embryogenesis abundant，LEA)蛋白基因LEA D113(GenBank登陆号：X13202)为对照，以棉花染色体18S rRNA(Small Subunit rRNA，SSU rRNA)cDNA为量参。检测结果如图8所示(泳道Con：对照组；泳道1、3、6、12、24分别表示经胁迫处理1、3、6、12、24小时的结果)，表明GhDBP2受到NaCl、干旱、低温和ABA的强烈诱导。其中受到NaCl、干旱和ABA的诱导非常快速，经胁迫处理1小时就达到峰值了，而对低温的响应要明显落后于上面的三种处理，经胁迫处理1小时时出现表达，而在3-6小时达到峰值。但在前三种处理情况下，GhDBP2基因的表达量从6小时左右都开始降低，而在冷处理条件下，从3小时到24小时，GhDBP2基因的表达水平一直都很高。另外，在用蒸馏水作为NaCl和ABA溶液处理对照时，GhDBP2基因受到水渍的轻微诱导。这可能是因为水渍引起了植物细胞内渗透压的变化，进一步引起GhDBP2基因表达水平的变化。上述检测结果显示了GhDBP2基因对响应各种环境胁迫的复杂性。

对LEA D113基因表达模式的也进行了分析。如图8所示，同以前的报道LEA D113基因可以在幼胚中被ABA诱导表达的结果相似，在上述实验条件下检测到在棉苗的子叶中LEA D113基因也受到ABA的诱导表达；另外，它还受到NaCl和干旱引起植物细胞脱水的外界环境胁迫的诱导，而对于低温则只有很微弱的响应，在蒸馏水作对照的棉花幼苗子叶中则很难检测到表达，表明LEA D113不仅能在棉胚的成熟过程中起作用(Galau G A，Hughes D W，Dure L.Abscisic acid induction of cloned cottonlate embryogenesis-abundant(Lea)mRNAs.Plant Mol.Biol.1986，7：155-170)，而且同其它的LEA和类LEA基因相似，LEA D113基因也可以在棉花的营养组织中受到外界胁迫信号(尤其是NaCl和干旱等引起细胞脱水的信号)的诱导而表达，从而参与棉花对这些外界胁迫的响应，增强棉株的抗逆性。

GhDBP2基因在棉花幼苗的真叶、茎和根中优势表达与其受到干旱、高盐、低温和ABA处理的诱导说明：GhDBP2参与了棉花营养组织对外界胁迫的应答反应。而在棉胚中的有很高的表达，特别是在成熟胚中的表达量更高，又暗示GhDBP2基因可能也参与了棉花胚的发育过程。进一步对两个调节途径之间的关联进行分析，发现它们之间其实是相通的。植物胚成熟的过程伴随着细胞的大量失水，这种失水过程同植物受到干旱、高盐和低温胁迫诱导所引起的细胞脱水(dehydration)在某种程度上有一致的。比如在植物胚成熟过程中一类称之为胚胎发育晚期丰富(LEA)蛋白大量积累(Galau G A，Hughes D W，Dure L.Abscisic acid induction of cloned cotton lateembryogenesis-abundant(Lea)mRNAs.Plant Mol.Biol.1986，7：155-170)，它们的积累以利于细胞抵御由于胚成熟过程中的大量失水对细胞造成的伤害。而在植物受到干旱、低温和盐渍等环境胁迫后造成脱水的营养组织中LEA基因也有强烈的表达。与LEA基因相类似，可以说GhDBP2基因在棉花幼苗组织中受到外界能引起细胞渗透压升高的环境胁迫信号的诱导和在棉花胚成熟过程中大量表达是一致的，都是GhDBP2基因对细胞失水信号的响应。

对DREB类转录因子的研究发现，在植物营养组织中受某些DREB类转录因子所调控的基因中有一部分是LEA和类LEA基因(Jaglo-Ottosen K R，Gilmour S J，ZarkaD G，et al.Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhancesfreezing tolerance.Science 1998，280：104-106；Maruyama K，Sakuma Y，KasugaM，et al.Identification of cold-inducible downstream genes of the ArabidopsisDREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems.Plant J.2004，38：982-993；Gilmour S J，Zarka D G，Stockinger E J，et al.Low temperatureregulation of the Arabidopsis CBF family of AP2transcriptional activatorsas an early step in cold-induced COR gene expression.Plant J.1998，16：433-442)。但是这些DREB类转录因子在胚胎发育过程中的表达情况以及它们在胚胎发育过程中对LEA和类LEA基因的调节情况未有报道。从这些DREB类转录因子参与LEA基因的调控以及LEA蛋白在植物胚胎发育过程中和在植物营养组织中的功能的一致性来讲，这些DREB类转录因子除了像文献中所报道的那样在营养组织中大量表达来调控LEA类功能基因在植株受到外界胁迫情况下的表达外(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，inArabidopsis.Plant Cell 1998，10：1391-1406；Seki M，Narusaka M，Abe H，et al.Monitoring the expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought andcold stresses by using a full-length cDNA microarray.Plant Cell 2001，13：61-72)，还应该会在植株胚成熟过程中表达，以调节相同的LEA类功能基因在植物胚胎发育晚期大量表达。

事实上，一些研究小组已经就此问题展开了研究：比如与GhDBP2同属于A-6组中另一个成员ZmDBF1的研究。ZmDBF1基因在玉米的幼胚和成熟胚中大量表达，并在玉米幼苗中受到干旱和ABA处理的强烈诱导，此外，玉米ZmDBF1能够以DRE元件依赖的方式激活玉米LEA类基因rab17启动子的转录(Kizis D，Pages M.MaizeDRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation throughthe drought-responsive element in an ABA-dependent pathway.Plant J.2002，30：679-689)。大麦中DREB类转录因子A-2组成员HvDRF1蛋白也被证实同时参与了胚发育过程和大麦幼苗营养组织对干旱、高盐和外源ABA处理的响应(Xue G P，Loveridge C W.HvDRF1 is involved in abscisic acid-mediated gene regulationin barley and produces two forms of AP2 transcriptional activators，interacting preferably with a CT-rich element.Plant J.2004，37：326-339)。与ZmDBF1以及HvDRF1相类似，推测GhDBP2可能参与了棉胚成熟过程和响应外界胁迫信号传导通路中对棉花LEA类基因LEA D113的表达调控。

实施例7、检测GhDBP2对LEA D113基因启动子区的识别

实施例6的实验结果表明GhDBP2可能参与了对LEA D113基因的直接调节。分析LEA D113基因的启动子序列，发现其中存在一个与已知DRE元件非常相似的序列(核心区：CCGAC，命名为DRE1：DRE-like，见图9中的图A)，以及一个类似LTRE元件的序列(核心区：CCGAAA，命名为LTRE1：LTRE-like，见图9中的图A)，核心区序列与DRE元件只差一个碱基。据报道DRE元件核心区“CCGAC”中第2和第5位的碱基C和第3位的碱基G是被DREB1A和DREB2A识别所必需的(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-binding specificity of theERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved indehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290：998-1009)，现用EMSA实验检测这些碱基对于GhDBP2的识别是否也是必需的，具体方法为：首先以棉花的基因组DNA为模板，在引物D113-Ps：5’-TATCTAATTAACCCGAAAGTTAAGTG-3’和D113-Pa：5’-AGCTGCTGTCGGCTATGGATTGTTCG-3’的引导下，PCR扩增包含有DRE-like(DRE1)和LTRE-like(LTRE1)的探针P的DNA序列(序列见图9中的图A)，该序列长度为112bp，来自于棉花LEA D113基因的启动子区，并在引物D113-Ps和D113-mPa：5’-AGCTGCTAAAAGCTATGGATTGTTCG-3’的引导下，PCR扩增在探针P的DRE1核心区进行了突变(从CCGAC到CTTTT)的探针mP的DNA序列，回收并纯化上述片段；然后用与实施例3相同的方法进行EMSA实验，以不含有任何类似于DRE元件的非相关DNA序列(NRP)为对照，结果见图9中的图B(泳道1、5和9：没有加GhDBP2融合蛋白；泳道2-4和6-8蛋白的上样量分别为：10ng、50ng和100ng；泳道10：蛋白上样量为100ng)，GhDBP2蛋白在体外能够结合含有这两个元件的PCR扩增片段P。当DRE1元件发生突变(从CCGAC到CTTTT)，GhDBP2蛋白就不能与发生突变的片段相结合mP，表明GhDBP2蛋白对这个片段的识别是与DRE1元件相互结合，而LTRE1元件对于这种结合不起作用；虽然LTRE1元件在核心区上与DRE元件只差一个碱基，但GhDBP2还是不能结合到LTRE1元件上，说明这个碱基的差别对于GhDBP2蛋白的识别起到非常重要的作用，与文献中报道的相似(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al.DNA-bindingspecificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcriptionfactors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290：998-1009)。该实验表明GhDBP2能够结合到LEA D113基因的启动子区，这种结合预示着GhDBP2可能以与DRE1元件相结合的方式来调节LEA D113基因的表达。

实施例8、检测GhDBP2蛋白对LEA D113基因启动子活性的调节作用

通过瞬时表达的方法检测GhDBP2蛋白对LEA D113基因启动子活性的调节作用，首先构建瞬时表达载体，具体方法如下：

一、瞬时表达载体的构建

1、报告载体的构建

以棉花中棉12核DNA为模板，在引物113Ps：5’-CCC AAGCTTTGCGGTGAACAATCCATAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)和113Pa：5’-AGAC GTCGACCTTCAATATT TAGTGAAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)的引导下，PCR扩增5’端添加Hind III识别位点、3’端加Sal I识别位点的LEA D113基因启动子区311bp长的片段。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约311bp的目的片断，将其用限制性内切酶Hind III和Sal I酶切后，与经相同酶双酶切的载体5×GAL4-LUC(该载体的框架图见图10，含有萤火虫荧光素酶(Firefly LUC)基因表达盒)进行连接，将LEA D113基因启动子区311bp长的片段替换掉载体5×GAL4-LUC中LUC基因前面的启动子框，得到报告质粒(Reporter plasmid)，命名为p113LUC，该载体的部分结构示意图见图11的图A。

2、效应载体的构建

将载体pBE2113(该载体的框架图见图12，Mitsuhara I，Ugaki M，Hirochika H，et al.Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genesin dicotyledonous and monocotyledonous plants.Plant Cell Physiol.1996，37：49-59)上GUS基因的表达盒用限制性内切酶Hind III和EcoR I切下，回收该片断，将其克隆到载体pUC19(TaKaRa公司)中，得到一中间质粒，命名为pUE2113(该载体的框架图见图13)；然后以GhDBP2的全长cDNA序列为模板，在引物TCs：5’-CG GGATCCATGGCAGCTGCAATGGATTTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)和TCa：5’-GC GAGCTCTCAGGCTTTTAGAATGGAATC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sal I识别位点)的引导下，PCR扩增5’端添加BamH I识别位点、3’端加Sal I识别位点的GhDBP2的全长cDNA序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1100bp的目的片断，将其用限制性内切酶BamH I和Sal I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pUE2113进行连接，将pUE2113中的GUS基因替换掉，得到效应质粒，命名为pUE2113-GhDBP2，该载体的部分结构示意图见图11的图A；另外，将GUS基因从pUE2113上切除后将载体末端补平后连接，得到一重组质粒，命名为pUE2113ΔGUS，作为瞬时表达实验中的阴性对照质粒。

二、转化烟草

将步骤一构建的效应质粒、报告质粒(或阴性对照质粒)及内参质粒pRTL-NLUC[为了控制在每次转化实验中因转化效率差异造成的误差，以CaMV 35S启动子接上海参LUC(Renilla LUC)基因形成的质粒(CaMV35S-Renilla LUC-NOS)为内参对照质粒(Gu Y Q，Wildermuth M C，Chakravarthy S，et al.Tomato transcription factorsPti4，Pti5，and Pti6 activate defense responses when expressed in Arabidopsis.Plant Cell 2002，14：817-831)，用基因枪轰击方法同时转化烟草品种“山西烟”(Nicotiana tabacum cv.Shanxiyan)的叶片细胞(将新鲜的烟草叶片从植株上剪下，用灭菌水冲洗干净，直接放到MS固体培养基上培养的叶片)中。

三、转基因烟草叶片细胞的相对荧光素酶活性测定

将步骤二轰击过的烟草叶片放在用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)润湿的滤纸上22℃下暗培养18小时。取出叶片用液氮研磨成粉状，然后利用Promega公司的双荧光素酶报告基因测试系统(Dual-Luciferase^Reporter Assay System，DLR)试剂盒来测样品的LUC活性，具体方法包括以下步骤：

1)将磨好的样品加入到2.0mL的离心管中，加入400μl新配制冷的1×PLB(试剂盒自带)溶液，振荡混匀，用预冷的电动匀浆器匀浆2分钟；

2)4℃放置30分钟，4℃、12,000g离心10分钟，将上清移到一个新的离心管中；

3)将LUC检测仪TD-20/20照度计(TD-20/20 Luminometer，Turner Designs)连接到计算机，开机预热，并将程序设计成3秒延迟，15秒测量；

4)取10μl LAR II溶液(试剂盒自带)到离心管中，加入10μl步骤2)提取的上清，吹吸混匀2～3次，放入TD-20/20照度计中，按enter开始测量Firefly LUC活性；

5)Firefly LUC测量完毕后，取出离心管加入10μl Stop & Glo^溶液(试剂盒自带)，吹吸混匀2～3次，放入TD-20/20照度计中，按enter开始测量Renilla LUC活性；

6)由于LUC检测仪连接到计算机上，所以荧光虫LUC和海参LUC的活力数值都在计算机上显示，并且它们之间的比值(荧光虫LUC比上海参LUC，FLUC/RLUC，相对荧光素酶活性)也自动计算出来，记录这个比值，以空白对照质粒的FLUC/RLUC活性为1.0。

相对荧光素酶活性检测结果见图11中的图B，相对荧光素酶活性越高表明该效应基因在细胞中的转录激活能力越强。在转基因烟草叶片细胞中，GhDBP2能够转录激活由LEA D113基因启动子驱动的FLUC基因的表达，相对于只加入空白对照质粒，GhDBP2激活报告基因的表达水平高达11倍。联系GhDBP2蛋白的DNA结合区在体外能够以DRE1元件依赖的方式结合到LEA D113基因的启动子区，暗示GhDBP2在棉花细胞内参与了LEA D113基因的转录调控。

序列表

<160>2

<210>1

<211>350

<212>PRT

<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>1

Met Ala Ala Ala Met Asp Phe Ile Ser Ile Gly Val Asp Gln Ser Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Gly Gly Glu Leu Met Glu Ala Leu Glu Pro Phe Met Lys Ser

20 25 30

Val Ser Ser Ser Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ser

35 40 45

Leu Pro Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Phe Ser Ser Ser Glu Thr Gln Pro

50 55 60

Asn Phe Tyr Pro Asp Ser Cys Cys Tyr Pro Tyr Pro Thr Pro Met Asp

65 70 75 80

Ser Val Ser Cys Pro Gln Gln Pro Gln Thr Gly Ser Thr Ile Gly Leu

85 90 95

Asn Ser Leu Thr Gln Ala Gln Ile His Gln Ile Gln Leu Gln Phe His

100 105 110

Leu His Asn Asn Gln Pro Ser Tyr Leu Cys Gln Ser Pro Gln Pro Asn

115 120 125

Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asn Pro Met Val Ser Phe Leu Cys Pro Lys

130 135 140

Pro Val Pro Met Lys His Val Gly Ala Pro Ser Lys Pro Thr Lys Leu

145 150 155 160

Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg His Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile

165 170 175

Arg Leu Pro Arg Asn Arg Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr

180 185 190

Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Leu Arg

195 200 205

Gly Asp Phe Ala Arg Leu Asn Phe Pro Asn Leu Arg His His Gly Ser

210 215 220

His Val Gly Asp Tyr Lys Pro Leu Pro Ser Ser Val Asp Ala Lys Leu

225 230 235 240

Gln Ala Ile Cys Glu Ser Leu Val Gln Asn Pro Lys Gln Gly Ser Lys

245 250 255

Lys Lys Ser Ser Lys Val Thr Ala Asp Thr Lys Ser Arg Asn Asn Lys

260 265 270

Lys Ser Asp Met Ala Glu Pro Lys Pro Glu Glu Asn Thr Ala Lys Val

275 280 285

Glu Asn Ser Ser Ser Leu Ser Thr Val Gln Ser Glu Ser Glu Gly Ser

290 295 300

Ala Val Ser Ser Pro Leu Ser Asp Leu Thr Phe Ser Asp Phe Asp Glu

305 310 315 320

Gln Pro Trp Pro Glu Val Val Ser Ser Ser Glu Thr Phe Met Leu Ser

325 330 335

Lys Tyr Pro Ser Glu Ile Asp Trp Asp Ser Ile Leu Lys Ala

340 345 350

<210>2

<211>1493

<212>DNA

<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>2

acctctttta atccgttctg gatttaggac ctgttcttca agttttggta agaaacaggt 60

taatttttta ttaaaatttg gtcctcatct tatttctagt tttagtgtaa tggcagctgc 120

aatggatttc attagtattg gagtagatca atcagatcta tatgggggag aattgatgga 180

agctctcgaa ccttttatga aaagtgtttc ctcctcttcc ccttcccctt ccccttcccc 240

ttccccttct tctcttcctt ctacttctta cctttctttc tcttcttccg aaacacaacc 300

taatttttac ccagatagct gttgttaccc ttaccctaca ccaatggact cagtatcatg 360

tccccaacag cctcaaactg gttcaacaat tgggctaaat agcttgacac aagctcagat 420

ccatcagatc cagcttcaat tccacctcca caacaaccaa ccaagctacc tttgccaaag 480

tccccaaccc aacaccatca gcgccaatag taacccgatg gttagctttc tttgccctaa 540

acctgtccca atgaaacacg tgggtgcgcc atccaaaccc accaaacttt acagaggagt 600

taggcaacgc cactggggaa aatgggtcgc tgagatccgg ttacctagaa accggacacg 660

tctttggtta ggcacttttg acactgctga ggaagcagcc ttggcttatg acaaagcagc 720

ttataaacta agaggtgact ttgcgagact caacttccct aaccttcgtc accacggttc 780

ccacgtaggt gactacaagc ctttgccttc ctctgttgac gctaagcttc aagccatttg 840

tgagagcttg gtacaaaacc ctaagcaagg gagcaagaag aaatcatcca aggttacggc 900

agacaccaaa agcaggaaca acaaaaaatc cgacatggca gagccaaagc ccgaggagaa 960

tacagcgaaa gtggagaact cctcatcttt gtctacggtt caatccgaga gtgagggttc 1020

ggctgtatct tcacctttat cagatcttac attctcggat ttcgacgaac aaccatggcc 1080

ggaagtcgtt tcttcttcgg aaacttttat gttgtccaag tacccttcag agatcgattg 1140

ggattccatt ctaaaagcct gaagggaaaa acccaagttt cgttttctgt gtaacagtct 1200

tttgttgttt aggagtttcc tttcgtgtat ttttttttgt aaagctagct gcaatggagt 1260

ttttggcagt tgcagtggca tgtattttag gttattaaga gtctgttaat gagtgtaagt 1320

gcttgtgttc ataagaattt gtgattttct ccatgctggt cagctcgttt ttttacttgc 1380

tgaaccaaaa ggtgaaattt gttagtgtct ataaaaaaag tttatagctt ttgtattttg 1440

tacgaattaa atgttattta tgttgttgta ttctctggta tcgtgttttc ttc 1493

Claims

1、棉花的一个DREB类转录因子，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于：所述蛋白具有序列表中的SEQID №：1的氨基酸残基序列。

3、编码权利要求1所述棉花DREB类转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的DNA；

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体。

6、含有权利要求3所述基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求3所述基因的宿主菌。

8、一种调控植物抗逆性的方法，是将权利要求3所述的编码棉花DREB类转录因子的基因导入植物组织或细胞，植物抗逆性获得调控。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。