CN1205334C - 利用定位重组系统从特定器官中删除外源基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了位点特异性重组系统介导的可控的遗传操作，用于在转基因植物当代或后代的特定组织或器官中删除选定的无用或有害基因。在设定DNA顺序的上、下游，设置可为特定重组酶识别的位点。通过传粉或转化的程序，使重组酶基因进入受控的遗传工程体中。或通过诱导基因表达的方法，将原有受控于器官专一性启动子的重组酶基因激活。重组酶在特定时间和特定部位将选定的DNA顺序删除。此法在基因功能分析中也有重要应用价值。

Description

利用定位重组系统从特定器官中删除外源基因的方法

本发明涉及获得转基因植物的方法，特别是涉及获得转基因植物特定组织或器官中靶基因删除的分子方法。更具体地说，本发明涉及利用位点特异重组系统将特定的靶基因在转基因植物的特定组织或器官被删除的分子生物学方法。

随着生物技术的进步，人们利用基因工程手段来改造植物以提高其品质、产量、和抗性水平等已经成为现实。尤其近年来，转基因技术突飞猛进，转基因作物越来越多。基因修饰食品的安全性问题便成为公众关注的热点之一。由于某些原因，人们往往不希望在某种器官中含有外源的基因。特别是在一些可食用部分(果实，种子)若含有某种外来基因，该基因产物可能不利于食用器官的品质改良，或可能不利于产品在市场上销售。就有必要将这种基因在食用器官中删除。出于基因知识产权的保护，或其他目的也往往需要在局部器官中删除某种外源基因诸如蛋白酶抑制剂。因此，如何控制转基因植物中外源基因的行为对转基因作物的产业化和商业化具有非常重要的意义。

随着分子生物学的不断发展，人们已经开始利用基因工程手段来控制转基因的行为。例如Park & Willmizter等使用马铃薯块茎专一性启动子与uidA基因融合，所获转基因马铃薯只在块茎组织中检测到uidA基因的活性，而根、茎、叶中检测不到uidA基因的活性。在我们用uidA作为报告基因研究启动子2a12时也证实了该启动子具有果实专一性表达的特性(图2)。目前已经有越来越多的启动子如叶片、根、花粉、绒毡层、胚胎、内皮层、糊粉层、韧皮部、块茎、果实等器官和组织特异性启动子被分离和鉴定(Saito T，Biosci Biotechnol Biochem，63(4)：632-7(1999)；Guilfoyle TJ，Genetic Engineering 19：15-47(1997)；Zhou X，Transgenic Res，2(3)：141-6，(1993)；Klotz KL，PMB，36(4)：509-20，(1998)；CheungAy，PNAS，93(9)：3853-8，(1996)；Mett VL，Transgenic Res，5(2)：105-113，(1996))等。上述现有技术中基本都是采用组织、器官专一性启动子连接报告基因(如uidA或gfp)或其它编码基因表达的。但国内至今未见有关利用定位重组系统介导的方法控制外源基因的时空分布。本发明则提供了一套在转基因植物的当代或后代中将外源基因在特定的组织或器官中删除的分子生物学方法。

美国USDA和D&P公司于1998年共同申请的专利US 572 3765公开了一种控制植物基因表达的方法，即将三个DNA序列导入一种植物细胞，其中第一个重组DNA序列含有一个致死基因和一个在晚期胚胎发生中活化的启动子，致死基因和晚期胚胎发生中活化的启动子功能性相互连接，但由一个两端具有特异切除序列的阻断序列分隔开，阻断序列的存在阻止了致死基因的表达。第二个DNA序列含有位于一个阻抑型启动子调控下的重组酶基因，该重组酶特异于第一个重组DNA序列中阻断序列两端的特异切除序列。第三个重组DNA序列含有编码特异于第二个重组DNA序列的阻抑型启动子的阻遏物的基因。对外源基因的控制既可以通过施加外部刺激物而获得，也可以通过杂交获得。该专利描述了利用一种位点特异性重组系统控制植物基因表达的分子生物学方法，但其中并没有涉及到对转基因作物后代中的外源基因进行直接的删除和控制。

来源於噬菌体P1的Cre-loxP系统，(Sternberg N，J.Mol.Biol，150：467-486，1981)，酵母2μ质粒的FLP-FRT系统，酵母PSR1质粒的R-RS系统(Kilbv N J，Trends Genet，9：413-421，1993)和噬菌体Mu的Gin/Gix系统(Plasterk RHA，Virotogy，127：24-36，1983)是目前研究较清楚的四种定位重组系统。这些重组系统都是由重组酶及其特异识别的位点(一段核苷酸序列)组成。其中Cre，FLP，R编码重组酶。Gin编码转化酶，这些酶的特点均由单个多肽组成，且作用于核酸序列时，除Gin外，其它三个重组酶均不需辅助因子。各酶之间蛋白质序列差异较大，但C端均有一个40个氨基酸的同源区域，其中有三个保守的氨基酸序列His-Arg-Tyr，可能是这些酶的活性位点。四种酶所识别的特异苷酸序列分别称为LoxP，FRT，RS和Gix位点。这些重组位点均含有12-13bp的反向重复序列，中间是非对称的2-8bp的间隔区，间隔区的方向决定了重组酶介导重组的结果。如果重组酶识别的两个位点方向相同，则两个位点间的DNA序列被删除，如果两个识别位点的方向相反，则两位点间的DNA序列发生倒位，如果两个重组位点位于不同的DNA分子上，则会发生DNA分子的易位。目前只有Cre-loxP重组系统的研究最为深入，它已广泛应用于包括植物(Dale E C $ OW，DW，Gene，91：79-85，1990)(Albert H et al，plant J，7(4)：649-659，1995)，动物细胞(Saver B，Mol.Cell，Biol，7：2087-2096，1987)等的基因表达调控研究中。他们的实验均证实了Cre可成功介导生物基因组中两个loxP两个位点间的重组反应，并且重且频率达到近100％，尤其所年来，Cre-loxP定位重组系统被广泛用于控制外源基因的表达，可以通过失活或活化外源基因，进而影响植物的表型特征，然而，现有这些技术中，没有具体描述Cre-loxP位点特异性重组系统在特定组织或器官中删除不期望的外源基因，而其它器官或组织保留该外源基因方面的应用。

因此，本发明提供了用于在特定组织或器官中删除外源基因的方法。该方法包括：用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化植物细胞，其中所述的第一个重组DNA序列包含连接到组成型启动子的编码序列，如35S启动子驱动下的编码蛋白酶抑制剂的基因序列。所述的第二个重组DNA序列含有编码一种重组酶的核苷酸序列，且处于器官或组织特异性启动子调控之下，所述的重组酶可特异性地识别第一个重组DNA序列两侧翼的核苷酸序列并将识别位点之间的DNA序列删除掉。从所述的植物细胞再生得到一个完整植株，当由第一和第二个重组DNA序列得到的转基因植株杂交后，或它们相互二次转化的植物细胞得到转基因植株。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的第一个重组DNA序列中的组成型启动子是CaMV35S启动子，其中所述的器官或组织特异性启动子是番茄果实特异性启动子。

根据本发明的这一实施方案，其中所述组成型启动子包括但不仅限于CaMV35S启动子，并且所述器官或组织特异性启动子包括但不仅限于番茄果实专一性启动子2a12。

在本发明的实施方案中，其中所述的第一个重组DNA序列中的能改变植物表型的外源靶核苷酸序列编码一种杀虫蛋白，马铃薯胰蛋白酶抑制剂(PinII)，其中所述的第二个重组DNA序列中的能识别的剪切第1个重组DNA序列的特异苷酸序列的是重组酶Cre基因，且该酶识别的特异核苷酸序列称为loxP位点。

根据本发明的这一实施方案，其中所述的外源靶核苷酸序列包括但不仅限于马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因(PinII)，所述的重组酶基因包括但不限于Cre重组酶基因，其中所述的被重组酶识别和剪切的核苷酸序列包括但不仅限于loxP位点。

根据本发明的这一实施方案，其中所述的Cre重组酶在番茄果实发育阶段表达并特异性切除果实中第一个重组DNA序列中两个loxP位点间外源靶核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的由第一个重组DNA序列，及第二个重组DNA序列转化植物细胞得到再生植株为To代，To代也可是由第一个和第二个重组DNA序列共转化植物细胞得到再生植株或二次转化后得到的再生株。由杂交得到的植株为T2代。

根据本发明的一个实施方案，其中所述的二次转化是由第一或第二个重组DNA序列转化植物得到的T0。再被第二或第一个重组DNA序列转化，最终保证两个DNA序列共存于一个植物细胞，由此植物细胞再生得到的转基因植物具有组织或器官特异性删除外源基因的能力。

根据本发明的再一个实施方案，其中所述的共转化的是由第一和第二个重组DNA序列同时转入一个植物细胞，并且所说的具有组织和器官特异性删除外源基因的植株，由所说的植物细胞再生后得到。

根据本发明的再一个实施方案，所述的第一个重组DNA序列经转化得到转基因植株To代，第二个重组DNA序列经转化也得到转基因植株To代，并且所说的具有组织和器官特异性删除外源基因的植株，由两个To代植株杂交产生的T2代植株中得到。

所说的第一个重组DNA序列包括：在植物各个发育阶段有活性的组成型启动子及其下游端的外源靶核苷酸序列所组成的嵌合基因。同时该嵌合基因两侧翼含有可被位点特异性重组酶识别并剪切的特异核苷酸序列，所说的第二个重组DNA序列包括组织或器官特异性启动子连接一个能特性识别并剪切第一个重组DNA序列中嵌合基因两侧翼特异核苷酸序列的重组酶基因。

本发明涉及一种制备转基因植物的方法，其中所期望获得的植物表型在上述实施方案中均可以控制，在一个实施方案中。所述控制通过共转化和二次转化等转基因技术实现，在另一个实施方案中，所述控制是通过杂交实现。再一个实施方案中是通过将两端连有特异识别和剪切序列的外源靶核苷酸序列与重组酶基因直接导入植物细胞获得。本发明是通过将一些功能DNA序列引入植物细胞实现。所述DNA序列含有以下基本元件：组成型表达的启动子序列，组织或器官特性表达的启动子序列，可以改变植物表型的外源核苷酸序列，一个编码位点特异性重组酶的基因和该重组酶可以识别和剪切的特核苷酸序列。这些因子的排列顺序可以改变，只要达到删除外源靶基因的目的即可。

通过上述多种实施方案可以得到一种同时含有两个DNA序列元件的植物，其中第一个重组DNA序列中的改变植物表型的外源核苷酸序列是在组成型启动子驱动下表达，可保证植物各部分均表现外源基因的性状，此时，虽然两种DNA序列共存于一个植物细胞中，但由于第二个重组DNA序列中识别和剪切第一个重组DNA序列中两侧翼核苷核序列的重组酶基因是在器官或组织特异性启动子驱动下表达，因此，只有在植物的特异器官或组织中该重组酶才能表达，并在表达的器官或组织中切除识别位点间的外源核苷酸序列，而其它器官或组织中不能删除外源靶核苷酸序列并保证了该外源基因的性状，从而达到本发明的目的，在本发明的实施方案中，可以根据所需作用的目标植物选用不同的实施方案。

在本发明中有关重组酶及其识别和剪切序列的重组系统可以是任何一个在植物基因组织中起删除靶DNA序列的一种，有关几个系统的描述可参考Sadowski(1993)The FASEB Journal 7：760-767。本发明中优先选择的系统是来源于细菌噬菌体P1的Cre/loxP系统，其中Cre重组酶在loxP位点进行DNA的位点特异性重组，其它的重组系统还包括FLP/FRT，R/RS，Gin/Gix等系统。

在本发明中所描述的将重组DNA序列，经转化进入目标植物的技术不是问题的关键所在。关键在于选择引入的靶基因在植物基因组中能稳定存在并且也在其后代中延续在并稳定表达的植株。现在可以使用本领域技术人员熟悉的各种植物遗传转化手段(技术)或不断改进的新技术来完成转化。例如，农杆菌介导的侵染法，基因枪法，显微注射法，磷酸钙DNA共沉淀法，花粉管通道法，电击法等，用于转化的靶DNA可以各种形式进入植物靶细胞，可以是质粒中的环状DNA或酶切后的线状靶DNA片段。或是以人工染色体的形式等。

可以使用本领域技术人员常用的分子方法，诸如：PCR技术，Southern印迹技术来确定重组DNA序列是否稳定整合进再生的被转化植物基因组中，并可用Northern杂交以及Western印迹技术来确定重组酶表达的水平。

在本发明中，用于将转化细胞再生为一个完整植株的方法并不是关键的，可以使用任何适用于靶植物的转化方法。有关植物转化的许多技术在文献中有详尽的描述，并且许多技术也在不断涌现或成熟，因此在利用本发明中涉及到的转化技术，使用者可以根据转化物种并参考相关文献，同时选择合适的且不需复杂和过多的实验以达目的的技术方案。

本发明可适用于生产各种转基因植物，这些方法即适用于有性繁殖的一年生植物，它们包括但不仅限于番茄，黄瓜，西瓜，香蕉，甜瓜等，也适用于有性或无性繁殖的多年生植物，包括但不限于桃，李，葡萄，苹果等，还适用于包括但不限于水稻，小麦和玉米等单子叶植物。

以下实例是对本发明的进一步阐明，并不是限制本发明待批权利要求的范围。

如无特别说明，所有实施例中的细菌培养DNA制备和分子克隆均参考Sambrook et al，的《Molecular Cloning》和《精编分子生物学实验指南》(颜子颖等，科学出版社，北京(1998)DNA操作中所用的限制性内切酶等工具酶购自Promega(美国)，基因有限公司(美国)和华美生物工程公司(中国)

图1：番茄果实专一性启动子驱动Gus基因的植物表达载体pPRGUS

图2：番茄果实专一性启动子驱动下Gus活性分析

图3：果实专一性启动子驱动Cre基因的植物表达载体pCRE2A

图4：侧翼含同向loxP位点的植物表达载体pBINPU

实例1：番茄果实专一性启动子2a12的克隆

考虑到本发明所述器官或组织特异性删除靶基因的目的，我们在研究已证实具有果实专一性表达基因的启动子区内，根据启动子特性，选择性地克隆了一个851bp的启动子片段，作为我们研究果实专一性删除外源基因的基础。根据已发表的果实专一性基因启动子4kb的核苷酸序列区，设计并合成一对引物，即引物1，引物2。番茄基因组DNA的提取：选取饱满种子，用70％乙醇处理1分钟，再用20％次氯酸钠溶液灭菌处理20分钟，用无菌水清洗3-5遍，播种于1/2MS固体培养基，10-15天后取幼叶约0.5g，置于研钵中，在液氮作用下迅速研成细粉，移入小离心管中，迅速加入550μl提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris·ClpH8.0，50mM EDTA pH8.0，1.5％(v/v)β-疏基乙醇)中加入SDS至终浓度2％，置65℃水浴中10分钟，加入1/10体积的5M KAC溶液，置冰上20分钟，14000g离心10分钟取上清，加入0.6V异丙醇，冰上放置10分钟，12500g离心5分钟，将沉淀用600μl TE溶解，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提1-2次，收集上清，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，用无菌双蒸水溶解备用。

取1ug总DNA为模板，在含有引物1，引物2，dNTP，缓冲液的50μl反应体系中进行PCR(94℃预变性10分钟，94℃变性50秒，53℃退火50秒，72℃延伸1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟)，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，用玻璃奶回收850bp的特异条带，Klenow大片段作用下补平。在T4DNA连接酶的作用下，以3∶1摩尔比与经HinCII酶切的pUC119载体片段连接过夜，用连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，于37℃培养过夜，挑取白色菌落，进行酶切和PCR鉴定，得到阳性克隆命名为pTM，经核苷酸序列分析，扩增的850bp核苷酸序列与原发表序列有99.6％的同源性。

实例2.携带果实专一性启动子2a12/UidA植物表达载体pPRGUS的构建

用HindIII和XbaI酶切pTM质粒，从中切出850bp大小的果实专一性启动子2a12，同时用HindIII和XbaI酶切专门用于研究启动子特性的双元载体pPR97，该载体含有报告基因UidA，将850bp片段与其连接经转化后，挑取菌落并酶切鉴定，得到重组双元载体pPRGUS(见图1)，根据UidA基因核苷酸序列设计并合成一对引物，引物3引物4作为转化后PCR鉴定用。

对pPRGUS进一步酶切和PCR鉴定后，以冻融法将pPRGUS转入农杆菌LBA4404，将LBA4404农杆菌菌株接种于含100mg/L链霉素和50mg/L利福平的YEB(见表1)液体培养基中，28℃振荡培养至对数期，分至1.5ml小离心管中，5℃，5000g离心1分钟沉淀细菌培养物，用400μl预冷的50mM CaCl₂重新悬浮细菌，在5℃，5000g离心1分钟，然后用100μl预冷的CaCl₂(50mM)溶液重新悬浮，4℃冰箱放置12小时。向其中加入1μg的质粒pPRGUS，轻轻混匀后，放在液氮中冻2-5分钟，取出后在37℃温育3分钟，向其中加入600μl YEB液体培养基，于28℃，150rpm摇床振荡4-5小时，从该培养物中取100μl菌液均匀涂余于YEB平板上(Rif^r 25mg/L，Str^r 100mg/L，Kan^r 50mg/L)，28℃，倒置培养2天，挑取单菌落直接作PCR鉴定，鉴定后的pPRGUS保存备用。

表2  农杆菌YEB培养基(PH7.2)

成分                                 (克/每升)

牛肉膏提取物                         5.0

酵母提取物                           1.0

蛋白胨                               5.0

蔗糖                                 5.0

七水合硫酸镁                         0.5

琼脂(固体培养基用)                   10.0

实例3  携带2a12/Cre以卡那霉素为选择标记的表达质粒pCRE2A的构建

用XbaI和SacI消化pMM23质粒(美国农业部植物基因表达研究中心DavidO.W教授惠赠)，从中切出含有Cre基因及Nos终止子序列的片段(约1.8kb)并将该片段连接到经同样酶切的双元载体pBINPLUS上，经酶切和PCR鉴定筛选后，得到中间重组载体pCREH2。鉴定Cre基因的PCR引物是根据已公开的Cre基因的核苷酸序列设计合成的，引物5，引物6，以质粒pCREH2为模板在加有引物5、引物6、dNTP和Taq酶的50μl反应体系中进行PCR，条件为(94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟)鉴定得到携带Cre基因的重组载体pCREH2。

用HindIII和XbaI消化质粒pTM，得到含有2a12果实专一性启动子850bp大小的片段，半其与径同样酶消化的pCREH2重组载体进行连接，经酶切和PCR鉴定后，得到重组植物表达载体pCRE2A(见图3)以冻融法将pCRE2A转入土壤农杆菌LBA4404(Rif^r，Str^r)中，培养后挑取单菌落进行PCR鉴定，经PCR鉴定无误后，保存菌种备用。

实例4：携带loxP/P35S/PinII/loxP的中间载体pGLOXPIN的构建

用HindII酶消化含有35S/pinII结构的质粒35SPin，用Klenow大片段补平末端，再用EcoRI消化，得到约2.0kb大小的一平一粘的核苷酸片段，同时用SmaI和EcoRI两种酶消化含有同向loxP位点序列的质粒pGGUS，得到一平一粘的载体片段，将回收的含有35S/PinII结构的片段用T₄DNA连接酶与含有同向loxP位点的pGGUS载体片段连接，将连接产物进行酶切和PCR鉴定，得到含35S/PinII结构并在其侧翼含有loxP位点的重组载体pGLOXPIN。鉴定PinII基因的引物7，引物8是根据已公开的PinII基因核苷酸序列设计合成。以质粒pGLOXPIN为模板，在混合dNTP，Taq酶缓冲液的50μl的反应体系中进行PCR，扩增条件(94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，54℃退火50秒，72℃延伸50秒，30个循环后72℃延伸10分钟)鉴定得到含有PinII基因约中间重组载体pGLOXPIN。

实例5，携带loxP/P35s/PinII/loxP的表达载体pBINPU的构建

用BstXI酶在56℃消化由实例4中得到的中间载体pGLOXPIN，末端补平后，再以BamHI酶消化，玻璃珠法回收含有35S/PinII侧翼有loxP位点结构的片段，同时用SmaI和BamHI双酶消化双元表达载体pBINPLUS，将回收的片段与双酶消化得到的载体片段进行连接，经酶切和PCR鉴定正确无误后命名为pBINPU(见图4)。用冻融法将pBINPU转入土壤农杆菌LBA4404中，28℃培养36-48小时，挑取单菌落径PCR鉴定，得到阳性克隆，保存菌种备用。

实例6  携带2a12/Cre结构以Bar为选择标记的植物

将pMM23(同实例3)质粒用表达载体的构建HindIII和SacI双酶切，回收3.4kb大小的片段。该片段含有35S启动子和Cre基因，同时将含有bar基因的双元载体pGPTVBAR也用HindIII/SacI双酶切，回收11.5kb大小载体片段，将两片段连接，连接产物转化大肠杆菌提取质粒，通过酶切和PCR鉴定得到pBARCRE双元载体，其中PCR鉴定的引物9，引物10是根据已公开的Bar基因核酸序列设计而成，PCR扩增Bar基因的条件(94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，56℃退火50秒，72℃延伸50秒，30个循环后，72℃延伸10分钟)。

用HindII和XbaI酶切质粒pTM，从中切出850bp大小的果实专一性启动子2a12，同时用HindIII和XbaI消化双元载体pBARCRE，得到切除35S启动子的双元载体片段，将果实专一性启动子2a12与该片段用T₄DNA连接酶连接，经转化后，挑取单菌落进行酶切和PCR鉴定，将连接有850bp果实专一性启动子2a12并含有Cre基因，以Bar为选择标记的植物表达载体命名为p2a12CRE。

实例7：携带2a12/Cre和loxP/P35S/PinII/loxP两种结构的双元表达载体pCRELOXPIN的构建

用BamHI单酶消化PBINPU质粒(见实例5)用Klenow大片段补平末端后，再用HindIII消化该载体得到一平一粘的约14.3kb的载体片段，同时用SacI单酶消化实例3中构建的质粒pCRE2A，末端补平后，再用HindIII消化得到一平一粘的约2.5kb大小的插入片段，将插入片段与载体片段用T₄DNA连接酶以3∶1摩尔比进行连接，转化后，挑取单菌落提取质粒进行酶切鉴定和PCR检测后得到pCRELOXPIN。

约酶切和PCR进一步鉴定之后，用冻融法将pCRELOXPIN质粒转入土壤农杆菌LBA4404中，挑取单菌落并提取质粒，经PCR鉴定正确后，保存菌种于-70℃备用。

实例8.含pPRGUS的土壤农杆菌转化番茄

挑取实例2中构建的含pPRGUS并转化土壤农杆菌菌株的LBA4404单菌落，接种到含100mg/L链霉素，30mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的20ml液体YEB培养基中，放在28℃恒温摇床上振荡培养30个小时至对数生长期，取适量农杆菌菌液用液体MS培养基稀释20-30倍。

番茄转化外殖体的准备：选取饱满种子，用70％乙醇处理1分钟，再用20％次氯酸钠溶液灭菌处理20分钟，以无菌水清洗3-5遍，播种于1/2MS固体培养基中，10-14天后取完全展开的子叶为外殖体。

剪取靠近叶柄1/3处的叶片作为外殖体浸入上述制备的土壤农杆菌稀释液中侵染，期间轻轻摇动，20分钟后，取出叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液。转移这些叶片于含有2.0mg/L玉米素，0.1mg/L吲哚乙酸的培养基上共培养两天后，再转移这些叶片于含有2.0mg/L玉米素，0.1mg/L吲哚乙酸，80mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的固体MS培养基上(表2)，放置于25℃左右，16/8小时昼夜光周期的培养室中培养。4-8周后，将生长至1厘米以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素和80mg/L卡那霉素的固体1/2MS培养基中诱导生根，约2-3周后，可见根的形成，从而得到再生的完整植株，待这些植株生长至4-5厘米大小时，从培养中取出，去掉根部的MS培养基，移栽于灭菌的土壤在温室中继续生长。

取上述温室中生长的再生番茄植株叶片按实例1中所述的方法微量制备总DNA，取1ug总DNA用引物3和引物4进行50μl体系的PCR反应，并以未经转化的番茄作负对照，结果特异性地扩增得到预期1.85kb大小的uidA基因片段。将初步鉴定为阳性的植株培养至结果期，取开花后4周的青熟果实，作徒手超薄组织切片，同时取根，茎，叶等组织也做切片，于X-Gluc染色液(0.5mg X-Gluc/ml，Triton X-100 0.1％，PH7.0的磷酸缓冲液，1mM铁氰化钾，1mM亚铁氰化钾)在37℃温育15小时，结果见如图2，表明了2a12果实专一性启动子是特异于果实组织的启动子。

表3  番茄组织培养用MS培养基

成分                                 每升含量

(分化培养基)

10X      MS大量元素母液              100ml

100X     MS微量元素母液              10ml

100X     铁盐母液                    10ml

100X     维生素母液                  10ml

2.0mg/ml 玉米素                      2.0ml

1.0mg/ml 吲哚乙酸                      0.1ml

琼脂                                   7克

PH5.6

(生根培养基)

10X     MS大量元素母液                100ml

100X    MS微量元素母液                10ml

100X    铁盐母液                      10ml

100X    维生素母液                    10ml

琼脂                                   7克

PH5.6

实例9  含pBINPU的土壤农杆菌转化番茄

挑取实例5中提到的pBINPU转化的土壤农杆菌菌株LBA4404的单菌落，接种于含100mg/L链霉素，30mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的20ml液体YEB培养基中，放在28℃摇床上振荡培养20个小时左右至对数生长期，用此培养物参考Horsch等人的方法(Science，227：1229-1231)进行番茄的叶盘法转化，取适宜土壤农杆菌用液体MS培养基稀释20倍，取无菌番茄子叶作为外殖体(制备方法见实例8)，剪取子叶浸入上述制备的农杆菌稀释液中，20分钟后，取出并无菌滤纸吸去多余菌液，将这些叶片放在含2.0mg/玉米素和0.1mg/吲哚乙酸的固体MS培养基上共培养2天后，转至含2.0mg/玉米素0.1mg/L吲哚乙酸，500mg/羧苄青霉素和100mg/L卡那霉素的固体MS培养基上。在25℃左右，16/8小时的光周期的培养室中培养，每隔20天继代一次，约4-6周后，将生长至1厘米以上的小苗转移至含300mg/L羧苄青霉素和100mg/卡那霉素的固体1/2MS培养基中诱导生根，3周左右可见根的形成，从而得到再生的完整植株。待这些植株长至5厘米时，从培养瓶中取出，去除残存于根部的MS培养基，移栽于灭过菌的土壤中，置于温室中生长。

取上述温室中生长的再生番茄叶片按实例1中提到的方法，微量制备总DNA取上述1μl总DNA用引物7，引物8进行50μl体系的PCR反应。结果特异性地扩增得到预期大小的750bp的片段。

取上述总DNA 10μg，用PinII基因片段做探针，用Roche公司DIG-labeledPCR试剂盒和检测试剂盒，完全按照该公司提供的操作手册进行Southern印迹，证明已得到含PinII基因的转基因植株。

实例10  含pCRE2A的土壤农杆菌转化番茄

pCRE2A土壤农杆菌转化番茄的方法；完全同实例9中所述的，将再生的植株转移至灭菌的土壤中，移至温室中生长。

取上述温室中生长的再生番茄叶片按实例1中提到的方法，微量制备基因组DNA，取上述1μl总DNA，用引物5，引物6进行50μl体系的PCR反应，结果特异性地扩增到1.0kb大小的片段。

用DIG Detection Kit的方法做Southern杂交，证明已得到含Cre基因的转基因植株。

实例11.含pCRE2A和pBINPU的转基因番茄植株的杂交及F₁代的获得

选择实例9和实例10中经Southern杂交为阳性的植株，用Trizol试剂盒提取两个转基因番茄植株的总RNA，取10μg经0.8％甲醛变性凝胶电泳后，转移至带正电荷的尼龙膜上，按DIG检测试剂盒说明进行Northern杂交，根据杂交信号强弱选择信号强的转基因株系作杂交的父母本，开花期，将母本去雄，用相应父本花粉、授粉、套袋、收获成熟果实的种子。

实例12，果实中PinII基因的特异性删除

将实例11中得到的种子，经表面灭菌处理后(见实例1)播种到含100mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，筛选能在含有抗生素中生根的转基因株系，长至5厘米大小，转移温室土壤中生长，按实例1中所述方法提取总DNA，用引物5，引物6进行50μl体系的PCR反应，用引物7、引物8也进行50μl体系的PCR反应。选取既能扩增出Cre基因又能扩增出PinII基因的转基因株系，生长至果实青熟期时提取果实组织中的总DNA，以PinII基因标记探针，对同一株系的根、茎、叶片、果实总DNA进行Dot Blot证明果实中检测不到PinII信号，根、茎、叶中均有PinII信号。用PCR方法检测，用引物7，引物8进行50μl体系的PCR扩增检测不到PinII基因，用引物11，引物12进行PCR扩增，得到预期大小的900bp的片段，回收该片段进行测序，证明两个loxP位点间的PinII基因删除，并留下一个单个loxP位点，Dot Blot和PCR检测证明运用Cre/loxP系统，并在2a12果实专一性启动子的作用下，可以特异性地删除番茄果实中的外源基因。

实施例1～12中所涉及到的引物1～12在序列表中列了出来，具体对应关系如下：

引物1对应SEQ ID NO：1，

引物2对应SEQ ID NO：2，

引物3对应SEQ ID NO：3，

引物4对应SEQ ID NO：4，

引物5对应SEQ ID NO：5，

引物6对应SEQ ID NO：6，

引物7对应SEQ ID NO：7，

引物8对应SEQ ID NO：8，

引物9对应SEQ ID NO：9，

引物10对应SEQ ID NO：10，

引物11对应SEQ ID NO：11，

引物12对应SEQ ID NO：12。

序列表

(1)一般信息

  (I)申请人：北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室

  (II)发明名称：特异性删除转基因植物组织或器官中外源基因的方法

  (III)序列数：12

  (IV)通讯地址：

      (1)联系人：林忠平

      (2)街道：海淀区颐和园路5号

      (3)城市：北京

      (4)国家：中华人民共和国

      (5)邮政编码：100871

  (V)计算机可读形式：

      (1)介体类型：3.5英寸软盘

      (2)计算机：IBM Pentium II

      (3)操作系统：Windows 98

      (4)软件：Word 97

  (VI)电讯信息：

      (1)电话：86-10-62753062

      (2)传真：86-10-62754427

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(3)序列特征：

      (1)长度：29个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (I)分子类型：DNA

  (II)序列：TTG GAT CCA GCA CTT GTT AGA CTC ATC TG

(4)SEQ ID NO：2的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：28个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：TTG AAT TCA ATG GTT TTG GAT TAA TTG C

(5)SEQ ID NO：3的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：24个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：TTA TGT TAC GTC CTG TAG AAA CCC

(6)SEQ ID NO：4的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：22个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：TCA TTG TTT GCC TCC CTG CTG C

(7)SEQ ID NO：5的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：22个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA C

(8)SEQ ID NO：6的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：20个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：GGC TAA TCG CCA TCT TCC AG

(9)SEQ ID NO：7的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：20个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：CAT CAT GGA TGT TCA CAA GG

(10)SEQ ID NO：8的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：23个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：GAA ATA TGG ATG ATC TCT TTC TC

(11)SEQ ID NO：9的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：24个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA

(12)SEQ ID NO：10的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：22个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：CTG AAG TCC AGC TGC CAG AAA C

(13)SEQ ID NO：11的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：23个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：CGA CAA TCT GAT CAT GAG CGG AG

(14)SEQ ID NO：12的信息：

  (I)序列特征：

      (1)长度：23个碱基

      (2)类型：核酸

      (3)链型：单链

      (4)拓扑结构：线性

  (II)分子类型：DNA

  (III)序列：TAT CGC GCG CGG TGT CAT CTA TG

Claims (5)

1、利用定位重组系统删除特定组织或器官中外源目的基因的方法，其特征在于：分别构建含重组酶基因的植物表达载体与含外源目的基因的载体，重组酶基因受器官或组织特异性启动子驱动，外源目的基因受组成型启动子驱动，外源目的基因两侧为同向的可被重组酶识别的DNA位点，将这两种载体通过转基因的方法分别导入两个植株，这两个转基因植株杂交后，重组酶识别外源目的基因两侧的DNA位点，将外源目的基因从植物基因组中删除。

2、根据权利要求1所述的利用定位重组系统删除特定组织或器官中外源目的基因的方法，重组酶基因为Cre重组酶的编码基因，对应的DNA识别位点为loxP。

3、根据权利要求1所述的利用定位重组系统删除特定组织或器官中外源目的基因的方法，驱动重组酶的器官或组织特异性启动子包括选自于叶片、根、果实组织或器官中特异表达的启动子，这些启动子来自于番茄、黄瓜、香蕉、西瓜、甜瓜、梨、苹果、稻、麦。

4、根据权利要求1所述的利用定位重组系统删除特定组织或器官中外源目的基因的方法，外源目的基因为杀虫蛋白基因。

5、根据权利要求1所述的利用定位重组系统删除特定组织或器官中外源目的基因的方法，驱动外源目的基因的组成型启动子为CaMV35S启动子。

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