CN1249133A - 获得雄性不育植物的分子方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用位点特异性重组系统介导的获得具有雄性不育性状的转基因植物的方法。用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞,其中所说的第一个重组DNA序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列,所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列;其中所说的第二个重组DNA序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列,并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后;并由所说植物细胞再生得到完整的植株。

Description

获得雄性不育植物的分子方法

本发明涉及获得转基因植物的方法，特别是涉及获得具有雄性不育性状的转基因植物的分子遗传学方法。更具体地说，本明涉及以位点特异性重组系统介导的获得具有雄性不育性状的转基因植物的方法。

杂交优势的利用在植物育种中起着极为重要的作用。在植物育种中，传统的方法通常是利用不育系、恢复系和保持系三个系统获得杂交优势，以缩短育种周期，加速育种进程。然而，以常规育种方法获得的雄性不育系往往存在难以鉴定植物表型、育性不稳定和不育性容易丢失等缺点和限制因素。

随着重组DNA技术和植物转化技术的进展，人们已经有可能利用遗传工程手段获得雄性不育植物及其种子。例如Mariani，C.等人(Nature，347：737-741(1990))将烟草花药特异性基因TA29的启动子分别与芽孢杆菌RNA酶barnase和核糖核酸酶T₁融合，并以所得到的融合基因转化植物细胞后成功地获得了雄性不育烟草和油菜植株。

理论上，任何对植物雄性器官的细胞具有致死作用的蛋白质或多肽或核酸均可在特异性启动子的驱动下诱导植物的雄性不育表型。这些蛋白质或多肽或核酸包括β-1，3-葡聚糖酶(WO 97/38116)、限制性内切酶EcoR I(Barrens andRine，PNAS，82：1354-1358(1985))、α或β微管蛋白(PCT/GB 96/01675)、S座位特异性糖蛋白(EP-A 0825262)、哺乳动物非偶联蛋白(UCP)(WO 90/08831)、芽孢杆菌RNA酶barnase(WO 96/26283)、白喉毒素A(US 5,409,823)、链霉抗生物素(Sane and Cantor，PNAS，87：142-146(1990))，以及反式激活蛋白(US5,409,823)和反义DNA(EP-A 0329308、WO 90/08828、US 5,741,684、US 5,741,926)等。

上述现有技术中公开的方法基本都是用与器官、组织或细胞特异性启动子相连接的细胞毒性或致死性基因或反义核酸转化受体植物，以干扰植物雄性器官或花粉的正常发育，阻断花粉粒的形成和发育。

美国专利US 5,628,772描述了在植物细胞中产生DNA的位点特异性重组的方法。所说的方法包括向细胞中导入含有loxP位点的DNA序列，并使lox位点与其后导入的植物细胞活性启动子驱动的cre编码区共存于一个细胞中以产生位点特异性重组。如果两个lox位点方向相同，将导致两个lox位点间的DNA片段被删除；如果两个lox位点方向相反，则导致两个lox位点间的DNA片段倒位。另外，US5,723,765描述了利用噬菌体cre/lox系统控制植物基因表达的方法，虽然该专利比较笼统地描述了利用位点特异性重组技术控制植物基因表达的原理，但其中并没有具体地说明该技术在产生雄性不育植物中的应用。

目前研究得很清楚的位点特异性重组系统是噬菌体和酵母中的四种类型的位点特异性重组系统：噬菌体P₁的cre/lox系统、醇母2u质粒的FLP/FRT系统、酵母PSR1质粒的R/RS系统和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Odell，《Recombinationand Gene Silencing in Plants》ed.Paszkowsqi，219-270(1994))。其中对噬菌体P1的cre/lox系统的研究最为深入，并已广泛地应用于植物，例如用于介导植物基因组的位点特异性重组，造成DNA片段的定位剪切、倒位、外源DNA的整合及染色体的重排。位点特异性重组系统由重组酶和其特异性识别位点组成。其中以cre为代表的重组酶对lox位点具有特异性识别能力。对人工诱变的位点特异性重组缺陷型cre突变体的体外研究证实，cre的N末端结构域参与结合位点的识别，C末端则负责对DNA的剪切(Wierzbidi A，JBC，195：785-794(1987))。loxP代表噬菌体P₁中的交换座位，其中两个结合区域之间的8bp间隔区决定cre介导的重组的方向性(Hoess，R，In：UCLA Symposium on Molecularand Cellular Biology，Vol.147：745-756)。

1988年，Sauer，B.等人(PNAS 85：5166-5170)首先证实了cre/lox系统在酵母中介导位点特异性重组的可能性。之后，Sauer和Henderson(US 4,95,9,317)利用正选择系统显示cre可用于介导哺乳动物基因组中loxP位点间的剪切重组反应。在植物中，Dale和Ow(Gene，91：79-85(1990))用瞬时分析法证明烟草原生质体中的cre可介导染色体外DNA的剪切、倒位和整合反应。证明cre可介导整合到烟草基因组中的两个loxP位点间的重组反应，并且重组频率达到100％(Odell，MGG，369-378(1990))。

近年来，cre/loxP位点特异性重组系统已被广泛应用于控制植物外源基因的表达、失活或活化转基因、控制植物发育和表型特征，以及用于外源基因的位点特异性整合及染色体研究。然而，这些现有技术并没有具体地描述cre/loxP位点特异性重组系统在产生雄性不育植物方面的应用。

因此，本发明提供用于获得雄性不育植物的分子方法，该方法包括：

用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组DNA序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组DNA序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。

在本发明的一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是花药小孢子特异性启动子序列。

根据本发明的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的花药小孢子特异性启动子包括但不仅限于ntm19启动子序列。

在本发明的另一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是组成型启动子序列。

根据本发明的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的组成型启动子序列包括但不仅限于35S启动子序列。

在本发明的另一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子也是花药绒毡层细胞特异性启动子序列。

根据本发明的这一实施方案，其中所说的第一个和第二个花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列。

在本发明的再一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是诱导型启动子序列。

根据本发明的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的诱导型启动子序列包括但不仅限于MT启动子序列。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的第一个重组DNA序列中的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列是编码芽孢杆菌RNA酶barnase的核苷酸序列，并且编码第二个重组DNA序列中识别连接在第一个重组DNA序列中的所说的阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列是编码重组酶的核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的的阻断序列是可在植物特定细胞发育阶段被所说的细胞特异性启动子驱动表达的重组酶基因产物剪切，从而使所说的雄性器官细胞致死基因得以表达的核苷酸序列，并且所说的序列是非特定DNA序列编码区或非特定转录单位或编码polyA的核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的植物细胞或植株是F₀、F₁或F₂代植物细胞或植株。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由所说的植株直接得到的。

根据本发明的一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由所说的植株自交后再生得到的。

根据本发明的另一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由这一细胞或植株本身或自交后代被施加诱导物后得到的。

根据本发明的再一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是分别被第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲本植物细胞或植株，并且所说具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交后再生得到的。

根据本发明的再一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞是分别被第二个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲代植侏或植物细胞，并且所说的具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交产生的F₁代植株自交后的F₂植株得到的。

根据本发明的再一个实施方案，其中所说的被转化的植物细胞或植株是分别被第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲本植物细胞或植株，并且所说的具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交后直接施加诱导物或自交后代再经施加诱导物后得到的。

图1图解显示含有osg6B/cre和ntm19/cre结构的双元重组载体的构建。

图2图解显示含有ntm19/nls-cre结构的双元重组载体的构建。

图3图解显示含有osg6B/lox-barstar-lox/barnase结构的双元重组载体

   的构建。

图4图解显示将35S/cre结构和osg6B/lox-barstar-lox/barnase结构共

   转化到同一植物细胞后，有所说的细胞再生的植株中的位点特异性重

   组过程。

图5图解显示检测图4中位点特异性重组发生的PCR分析结果。

此附图的详细说明见实施例部分。

本发明提供了获得具有雄性不育性状的转基因植物的方法。根据本发明的一个实施方案，植物雄性不育性状的表达是用第一个和第二个重组DNA序列通过再转化或共转化或串接后转化植株直接实现的，或者再转化或共转化或串接后转化植株的自交后代实现的；另外，还可以通过转化植株之间的杂交实现或杂交后代再经过自交产生的后代实现雄性不育。在另一个实施方案中，雄性不育性状的表达是通过施加外界刺激实现的。

所说的第一个重组DNA序列按5′→3′顺序包括：在植物花药发育的特定阶段有活性的启动子序列；两侧翼连接有可被位点特异性重组酶识别并剪切位点的阻遏序列；编码对宿主细胞有致死性的特异性蛋白质的核苷酸序列。所说的第二个重组DNA序列按5′→3′顺序包括组成型或花药特异性启动子序列或在特定外界刺激下有特异活性的诱导型启动子序列或植物花药小孢子特异性的启动子序列，以及编码特异性识别所说的第一个重组DNA序列中阻遏序列两侧识别和剪切位点的重组酶的核苷酸序列。

首先，如果第二个重组DNA序列中与重组酶基因相连接的启动子是组成型启动子或花药特异性启动子，当用第一个和第二个重组DNA表达序列再转化或共转化或串接后转化同一种植物的同一个细胞后，则所说的启动子将在植物的任何发育阶段或在花药绒毡层细胞中有活性。这样，例如在植物发育的特定阶段，在花药绒毡层细胞中，瞬时活性启动子例如花药绒毡层特异性启动子将驱动与之相连接的重组酶基因的表达，然后作为表达产物的位点特异性重组酶将在特定剪切位点处切掉第一个重组DNA序列中花药特异性启动子和致死基因之间的阻断序列，使位点特异性重组过程发生前本来未被表达的细胞致死性基因得以表达。致死基因的表达产物将特异地作用于与花粉发育直接相关的细胞例如花药绒毡层细胞，使花药特定细胞死亡或丧失功能，导致花粉发育不正常，从而产生雄性不育植物。

在一个优选实施方案中，也可以通过两个转基因植株间的杂交实现位点特异性重组，得到雄性不育或具有雄不育性状的植物。根据本发明，用如前所述的包括处于花药特异性启动子控制下的，但当没有重组酶存在时不能被表达的细胞致死基因的第一个重组DNA序列转化第一个植株，并用包括处于花药特异性启动子控制下的重组酶基因的第二个重组DNA序列转化第二个植株。两株植物杂交后，由于在植物特定发育时期，例如绒毡层细胞中的重组酶基因得以表达，进而由表达产物重组酶切掉已整合到绒毡层细胞基因组中的阻断序列，使处于花药特异性启动子例如花药绒毡层细胞特异性启动子控制下的，但在未经位点特异性重组之前被阻断序列封闭的细胞致死基因在花药发育的特定阶段得以表达，从而得到因花粉不能正常发育或发挥功能而产生雄性不育植物。

由此可见，在使用组成型启动子或花药特异性启动子的情况下，无论用第一和第二个重组DNA序列共转化或再转化或串接后转化同一植株，或分别用第一和第二个重组DNA序列转化两个分立的植株。重组酶表达的启动和相继发生在同一亲本细胞或子代(包括F₁和F₂代)植株的细胞内的位点特异性重组过程取决于所使用的启动子的时间和空间特异性，而不必外加特定的刺激因子。也就是说，在植物发育的任何时期或特定阶段，所说的组成型启动子或花药特异性启动子驱动与之相连的下游重组酶基因的表达。当在被两个重组DNA序列再转化或共转化或串接后转化的同一个细胞再生的完整植株，或处于转录抑制下的致死基因转化的第一个转基因植株和组成型启动子或花药特异性启动子连接的重组酶基因转化的第二个转基因植株杂交后，所产生的原代植株或F₁杂交植株即同时含有被阻断的致死基因和重组酶基因。在植株发育的任何阶段或特定阶段，例如花药发育的绒毡层细胞中，重组酶得以表达并切除所说的阻断序列，使致死基因直接连接到花药特异性启动子后，导致致死性基因例如芽孢杆菌RNA酶barnase基因的表达，使再生的植株或F₁杂交子代植株表现出雄性不育的性状。

本发明更优选的第二个重组DNA序列中与重组酶基因相连的一类启动子是花药小孢子细胞特异性启动子。花药小孢子细胞特异性启动子是特异性地调控花粉生成和/或功能所必需的蛋白质的核苷酸序列。小孢子特异性启动子的例子是NTM19、BCP4、BCP10基因的启动子。为本发明的目的，本发明特别优选的小孢子特异性启动子是只在花药小孢子细胞中驱动重组酶基因表达的特异性启动子，例如NTM19基因的启动子。

当将从一种植物中分离的特异启动子用于不同种的植物时，可使用连接到该启动子上的报告基因(如GUS基因)来确定含有该启动子在特定植物的确切发育阶段的活性。据信可使用这些启动子将给定的基因如重组酶基因的表达限制于花药小孢子细胞中。

可以对花药特异性启动子进行必要的修饰，例如插入适当的激活物、增强子、内含子或外显子序列或连接到不同启动子的相关区域上，以提高启动子的调节活性和/或时空特异性，使之成为在植物发育的适当时期能在特定细胞内产生足够高水平转录的RNA的高效启动子。

如果第二个重组DNA序列中与重组酶基因相连接的启动子是花药小孢子特异性启动子，当用第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化或串接后转化同

一种植物的同一个细胞后，则所说的启动子将在植物花药的小孢子细胞中才有活性的。这样，在花药小孢子细胞中，小孢子特异性启动子将特异性地驱动与之相连接的重组酶基因的表达，然后作为表达产物的位点特异性重组酶将在整合到烟草小孢子基因组中的特定剪切位点处切掉第一个重组DNA序列中花药特异性启动子和致死基因之间的阻断序列。虽然花药特异性启动子已经和致死基因直接相连，但所选择的花药特异性启动子在花药小孢子细胞中没有活性，所以此时致死基因仍然不能表达。只有在该转基因植株经自交后产生的F₁植株的花药细胞中，未被表达的细胞致死基因得以表达。致死基因的表达产物将特异地作用于与花粉发育直接相关的细胞例如花药绒毡层细胞，使花药细胞死亡或丧失功能，导致花粉发育不正常，而产生雄性不育植物。

在一个优选实施方案中，也可以通过两个亲本植物间的杂交实现位点特异性重组，得到雄性不育或具有雄不育性状的植物。根据该实施方案，用如前所述的包括处于花药特异性启动子控制下的，但当没有重组酶存在时不能表达的细胞致死基因转化第一个植株，并用包括处于花药小孢子细胞特异性启动子控制下的重组酶基因的第二个重组DNA序列转化第二个植株。使两株植物杂交产生F₁后代，F₁代的花药小孢子细胞内整合到烟草基因组中的重组DNA序列即发生位点特异重组，使致死基因直接和花药特异性启动子相连，但此时花药特异性启动子没有活性。只有在这些F₁代植株自交后获得F₂代种子，它们所再生的F₂代植株中，在花药发育的特定时期细胞致死性基因才得以表达，从而得到F₂代雄性不育植物。

由此可见，在使用小孢子特异性启动子的情况下，无论用第一和第二个重组DNA序列共转化或再转化或串接后转化同一植株或细胞，或分别用第一和第二个重组DNA序列转化两个分立的植株，由于第一个和第二个重组DNA序列中致死基因或编码重组酶的核苷酸序列是特异性表达的，控制致死基因或重组酶基因表达的启动子是具有严格的时空特异性的，所以重组酶表达的启动和相继发生在同一亲本细胞或子代(包括F₁和F₂代)植株的细胞内的位点特异性重组过程将取决于所使用的启动子的时间和空间特异性，而不必外加特定的刺激因子。也就是说，在植物特定发育时期的花药小孢子细胞中，所说的小孢子特异性启动子驱动与之相连的下游重组酶基因的表达。当由两个重组DNA序列再转化或共转化或串接后转化同一个植株，或将由第一个重组DNA序列转化的第一个转基因植株和将由第二个重组DNA序列转化的第二个转基因植株杂交后，所产生的原代植株或F₁杂交植株即同时含有被阻断的致死基因和重组酶基因。在植株发育的花药小孢子细胞中重组酶得以表达并切除所说的阻断序列，使致死基因直接连接到花药特异性启动子后。然而，此时花药特异性启动子是没有活性的，所以致死基因仍不能表达。只有当该植株经自交产生F₁或F₂后代，在该子代植株花药发育的特定时期，致死性基因例如芽孢杆菌RNA酶基因才得以表达，使再生的F₁或F₂植株表现出雄性不育性状。

根据本发明的另一个实施方案，如果第二个重组DNA序列中与重组酶基因相连接的启动子是诱导型启动子，当将第一和第二个重组DNA序列再转化或共转化或串接后转化到同一种植物的同一植株或细胞内后，所说的诱导型启动子将在特定的诱导物的诱导或刺激下，在特定细胞的特定发育时期启动与之连接的重组酶基因的表达，从而剪切所说第一个重组DNA表达序列中的阻断序列，使其两端的花药特异性启动子得以启动致死基因的表达。致死基因的表达产物将特异地作用于与花粉的发育直接相关的细胞，使花药细胞死亡或丧失功能，不能形成有正常功能的花粉，从而产生植物雄性不育性状。

在一个优选实施方案中，在使用诱导型启动子的情况下，可以使用中间插入了两端连接有重组酶特异性识别和剪切位点的阻断序列的花药特异性启动子和植物细胞致死性基因的第一个重组DNA序列转化第一个植物细胞或植株，并用含有与诱导型启动子连接的能够特异性地识别第一个重组DNA序列中阻断序列两端的剪切位点的重组酶基因的第二个重组DNA表达序列转化第二个植物细胞或植株，然后使分别被转化的第一和第二个细胞或植株杂交，以得到雄性不育子代植株。

由此可见，在使用诱导型启动子的情况下，无论是用第一和第二个重组DNA序列共转化同一个植株，或分别用第一和第二个重组DNA序列转化两个分立的植株，转基因植物都必须在用外界刺激物处理之后才能产生雄性不育。例如在使用金属硫蛋白(MT)启动子时，在转化植物后必须用Cu²⁺处理转基因植物，导致重组酶基因的表达，产生雄性不育植株。在最初被转化的植株中，细胞致死基因不能表达，不仅是因为阻断序列将细胞致死性基因与其5上游连接的启动子分隔开，而且还因为其5上游连接的启动子是花药特异性启动子，只有在花药特定发育阶段的特定细胞中才有活性。也就是说，所说的被转化的同一个植株或分立的两个植株杂交后可以产生种子。只有在用刺激物或诱导物处理这些种子产生的植株，激活直接与重组酶基因连接的诱导型启动子后，启动子才驱动重组酶表达并发生继后的位点特异性重组，即除去阻断序列，导致后代植株中花粉粒不能正常发育，以产生雄性不育植物。

包含于本发明的第一个重组DNA序列中的细胞致死基因是当其表达时将导致花粉形成相关细胞不正常死亡的任何核苷酸编码序列。这样的序列包括但不只限于编码芽孢杆菌RNA酶barnase的基因、核糖体抑制蛋白(RIP)基因、白喉毒素A链(DTA)基因、gin重组酶基因、T-urfB、吲哚乙酸—赖氨酸合成酶基因，以及与细胞凋亡有关基因的核苷酸序列。其中优选的是芽孢杆菌RNA酶基因和RIP基因，特别是芽孢杆菌RNA酶barnase基因。芽孢杆菌RNA酶barnase是从淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus Amyloliquetaciens)中分离的由110个氨基酸组成的对植物宿主细胞，例如被转化的花药绒毡层细胞有显著杀伤活性的多肽，序列的C端连有26个氨基酸的信号肽和另外13个将被胞外酶从N端切掉的氨基酸。上述这些基因在特定组织或细胞特异性启动子的调控下得以表达后，相应的表达产物将导致特定发育阶段的特定细胞或组织不能存活。

根据本发明，被插入到第一个重组DNA序列中组成型启动子和细胞致死基因之间的阻断序列可以是阻止与雄蕊特异性组成型启动子连接的细胞致死基因表达的任何一个无特定编码意义的核苷酸序列，例如可以是poly(A)序列，或编码另一个其表达并不影响位点特异性重组系统工作的无关基因或其结构区域的核苷酸序列，例如编码抗生素抗性(NPT II、bar等)、抗除草剂或葡萄糖醛酸酶(如GUS)等的核苷酸序列。这些序列可能表达或不表达某种特定活性，但可以基于它们的位置效应而有效地阻止与之相连接的下游细胞致死基因的表达。

重组酶/识别和剪切序列系统可以是任何一个能够选择地切除在特定时间和环境条件下需要切除的外源或内源DNA序列的系统。所说的识别和剪切序列最好是被转化的植物中天然不存在的，从而可确保植物基因组中的固有序列不被切断。本发明优选的重组酶/识别和剪切序列系统是噬菌体P1的cre/lox系统，其中cre蛋白在lox P位点处完成核苷酸序列的位点特异性重组。

为本发明的目的，可以使用本领域技术人员熟知的各种不同的转化技术将本发明的重组DNA序列导入到待转化的靶植物细胞中。例如，这些方法包括但不只限于农杆菌侵染法、微粒轰击法、显微注射法、共沉淀法和电穿孔法等。最好使被导入的序列稳定地整合到靶植物细胞的基因组中，从而使被导入的序列在完成位点特异性重组后所赋予靶植物或其子代的遗传性状如雄性不育性状能够连续传代而不被丢失。另外，本领域技术人员可以理解到，用于转化靶植物细胞的核苷酸序列可以是线性的、环形质粒或其他重组载体形式的，或人工染色体形式的。

可以使用本领域技术人员已知的Southern杂交技术或PCR分析法确定再生的被转化亲代植物中是否存在已被稳定整合的上述重组DNA序列，并可使用Northern印迹技术来确定重组酶的表达。

根据本发明的一个实施方案，使用包括处于花药特异性启动子控制下的，并间隔一个两端带有重组酶特异性识别和剪切位点的阻断序列的细胞致死基因的重组DNA序列转化一个植物细胞或植株，并使用包括处于特异性启动子控制下并与之连接的重组酶基因的重组DNA序列转化另一个植物细胞或植株，然后使两亲本细胞或植株杂交，并由杂交种子或杂交种子的自交后代直接或经诱导物处理后产生具有雄性不育性状的植物。

根据本发明的再一个实施方案，使用包括处于花药特异性启动子控制的，并通过一个两端带有重组酶特异性识别和功割位点的阻断序列的细胞致死基因的重组DNA序列，和包括处于特异性启动子控制下的重组酶基因的重组DNA序列共转化或再转化植物细胞或植株，由这些植株或其自交后代直接或经诱导物处理后产生具有雄性不育性状的植物。

另外，也有可能在植物发育的特定阶段将单独的重组酶基因或重组酶本身直接导入到已携带有其他重组对象的转基因植物中，或者按照Horn，M.A.等人(Plant Physiol.93：1492-1496)所述的方法，在生物素介导下将重组酶本身直接导入已用重组序列元件转化的植物中。从而由这些植株或其自交后代产生雄性不育植物。

可以使用本领域已知的任何一种适当的方法，例如体细胞胚胎发生方法从被转化的植物细胞再生整株植物。

以下实施例旨在参照附图进一步举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

如无特别说明，所有实施例中的细菌培养、DNA制备和操作均参见《分子克隆：实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学实验指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。DNA操作中所用的限制性内切酶等工具酶购自New England Biolabs公司(Beverly Mass，美国)、Boehringer Mannheim公司(Indianapolis Ind.，美国)或Promega公司(Madison MI，美国)。

实施例1芽孢杆菌RNA酶barnase基因的克隆

考虑到按本发明方法产生的雄性不育植物和其种子的商品化应用目的，我们从已知的核糖核酸酶类基因中选择衍生于淀粉液化芽孢杆菌(BacillusAmyloliquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶基因barnase作为产生雄性不育植物的细胞致死基因。

为此，首先根据已发表的编码成熟芽孢杆菌RNA酶的核苷酸序列设计并合成下列一对寡核苷酸引物，引物1：TAGGGCAG GTTATCAACA CG(SEQ ID NO：1)和引物2：GTTATCTGAT CTTTGTAAAG G(SEQ ID NO：2)。

将淀粉液化芽孢杆菌的储存菌株接种到50ml细胞培养液中，并使之生长至对数生长期。取1.5ml细胞培养物移入小离心管中，10,000g离心两分钟。将细胞沉淀重新悬浮于567ul TE缓冲液中，向所得细胞悬液内加入30ul 10％SDS和3ul蛋白酶K溶液(20mg/ml)，并于37℃保温1小时。然后再依次向反应混合物内加入100ul 5M NaCl和80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃保温10分钟。向反应混合物中加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀并放置10分钟后，以12,000g离心5分钟。然后将上清液移入另一离心管内，按上述步骤重复抽提。收集上清液，加入0.5倍体积的异丙醇沉淀DNA，12,000g离心5分钟后，将沉淀重新悬浮于100ul TE缓冲液中。

取1μl总DNA作为模板，在含有Taq聚合酶的50μl反应混合物中，利用上述引物1和2进行PCR反应(94℃预变性7分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，25个循环之后，72℃再延伸10分钟)。电泳(1.5％琼脂糖凝胶)回收340bp片段的特异条带。在T4 DNA连接酶存在下，以3∶1比例使上述片段与pGEM-T载体(Promega公司)连接过夜。然后用该连接反应混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于37℃下培养过夜。挑取白色菌落提取质粒，进行酶切及PCR鉴定，将所得重组质粒命名为pGbn。核苷酸序列分析显示，按上述方法克隆的核苷酸序列与已发表的编码芽孢杆菌RNA酶的核苷酸序列具有99.4％同源性，两者编码的氨基酸序列完全相同。实施例2 ntm19基因启动子的分离

ntm19基因编码PI 0.92的10.8kD蛋白质，在烟草基因组中以一个小的基因家族形成存在。定位研究发现，ntm19基因只在花粉的单核小孢子期表现有转录活性(Oldenhof，PMB，31：213-225(1996))。GUS分析结果表明，ntm19启动子在单核小孢子阶段具有很强的特异性活性(Custers，PMB，35：689-699(1997))。

根据ntm19启动子的序列，设计并合成一对具有下示核苷酸序列的引物，引物3：GATCCAGATT TATAGGGTCC T(SEQ ID NO：3)和引物4：GGGTTGGTAC TCTAAGATGAAT(SEQ ID NO：4)。按照Saghai-Maroof等人(PNAS，81：8014-8018(1986))的方法，小量提取烟草Samsan品种总DNA。简单地说，取0.5g植物材料于液氮中研磨成粉末，转至预热的加有0.3％β-ME的500μl 2×CTAB缓冲液中，将内容物小心混匀，于60℃保温30-60分钟。加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)并混匀，以5,000g离心5分钟。收集上清液并向其中加入2/3体积的异丙醇，于-20℃沉淀30分钟后，以10,000g离心5分钟。将沉淀物重新悬浮于1250μl 5×TE缓冲液中，加入125μl 5×CTAB溶液，并在冰上放置20分钟后，4℃以11,000g离心5分钟，将DNA沉淀物重新悬浮于TE缓冲液中。以如此制备的烟草总DNA作为模板，用上述引物3和引物4以50μl的总反应体积进行PCR反应(94℃预变性7分钟，94℃变性45秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，25个循环之后，72℃延伸10分钟)。经1.0％琼脂糖凝胶电泳回收1.0kb的扩增产物，在T4 DNA连接酶存在下，与pGEM-T载体(Promega公司)连接过夜。用所得连接反应混合物转化大肠杆菌DN5α感受态细胞，并于37℃下培养过夜。挑取白色菌落提取质粒，进行酶切及PCR鉴定，将所得重组质粒命名为pGTntm。对其进行核苷酸序列分析表明，其核苷酸序列与已发表的序列相比，同源性为99.7％。实施例3 osg6B基因启动子的分离

osg6B基因是第一个从单子叶植物中分离的在花药绒毡层细胞中特异表达的基因(Tsuchiya T，PMB，26：1737-1746(1994))。GUS分析表明，osg6B基因的启动子在烟草花药绒毡层中也具有特异活性。5′缺失分析表明，5′上游的1095bp区域是osg6B启动子在烟草中特异表达所必需的。转基因水稻的GUS分析表明，osg6B基因启动子在从单核小孢子期到三核花粉期的花药绒毡层中具有很高的特异活性。

根据osg6B基因启动子的核苷酸序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，引物5：TTGGTTAATT GGAGTGATGG CAG(SEQ ID NO：5)  和引物6：CCCTCAGGTTGTATTTGGAT AATG(SEQ ID NO：6)。基本按照实施例2中所述的方法从水稻叶片中小量制备总DNA。以如此制备的水稻总DNA作为模板，用上述引物5和引物6进行50μl总反应体积的PCR反应(94℃预变性7分钟后，94℃变性45秒，56℃延伸1分30秒，72℃延伸2分钟，25个循环之后，72℃延伸10分钟)。经0.8％琼脂糖凝胶电泳回收1.6kb扩增产物，用T4 DNA聚合酶削成平端后与已用EcoRV酶剪切的pBluescript II ks+载体在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，用所得连接反应混合物转化大肠杆菌DN5α感受态细胞，于37℃下培养过夜。挑选白色菌落摇菌，提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，将以正确方向连接有1.6kbosg6B启动子片段的重组载体命名为pBsosg。核苷酸序列分析表明该重组质粒携带有所需的启动子序列。实施例4携带osg6B/cre的重组载体的构建

用Pst I和Sac I消化pMM23质粒(美国农业部农业研究中心David Ow教授惠赠)，以从中切出含有cre基因及nos基因的终止序列的1.0kb片段，并将该片段连接到已用Pst I和Sac I消化的pBsosg质粒osg6B启动子的下游，经酶切及PCR鉴定后得到pBsoc。根据已公开的cre基因的核苷酸序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，引物7：AAATGTCCAA TTTACTGACC GTACAC(SEQ ID NO：7)和引物8：GGCTAATCGC CATCTTCCAG(SEQ ID NO：8)。以质粒pBsoc为模板，用引物7和引物8以30μl总体积进行PCR反应(94℃预变性5分钟后，94℃变性30秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟)。鉴定出携带cre基因的重组载体pBsoc。经酶切及PCR鉴定后用Hind III和Sac I双酶切pBsoc，得到oag6B启动子驱动cre基因的3.2kb的构建物(osg6B/cre)。将该构建物连接到与已用Hind III和Sac I双酶切的双元载体pGPTV-KAN中，形成pGkoc(参见图1)。

经酶切及PCR法进一步鉴定后，以冻融法用pGkoc转化土壤农杆菌LBA4404(pAL4404)。将LAB4404土壤农杆菌菌株接种于含100μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基(表1)中，28℃振荡培养至对数期；以6,000g 4℃离心2分钟沉淀细菌培养物；用400μl冰预冷的20mM CaCl₂重新悬浮细菌培养物；并以6,000g 4℃离心2分钟，然后向细胞沉淀中加入 50μl冰预冷的20mM CaCl₂。重新悬浮后，向其中加入约1μl质粒DNA，轻轻混合并将该混合物在液氮中速冻5分钟，37℃温育5分钟；向其中加入500μl YEB液体培养基，并于28℃旋

                表1    农杆菌YEB培养基

          成分                             每升含量

          牛肉膏提取物                     5.0克

          酵母提取物                       1.0克

          蛋白胨                           5.0克

          蔗糖                             5.0克

          七水合硫酸镁                     0.5克

          琼脂(固体培养基用)               10.0克

          pH7.2转培养4小时；从该培养物中取50-200μl菌液均匀涂布于YEB选择平板(含100ug/L链霉素，50ug/L利福平和相应其他抗生素)上，28℃倒置培养两天。培养后，挑取单菌落并提取质粒，经PCR鉴定正确后，保存菌种备用。申请人已按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，于1998年12月21日将包含本发明的重组质粒pGkoc的土壤农杆菌LBA4404菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(中国北京)，保藏登记号为CGMCCNo.0379.实施例5携带ntm 19/cre的重组载体的构建

用Pst I和Sac I消化pMM23质粒(美国农业部农业研究中心David Ow教授惠赠)，以从中切出含有cre基因及nos基因的终止序列的1.0kb片段，并将该片段连接到已用Pst I和Sac I消化的pBsosg质粒osg6B启动子的下游，经酶切及PCR鉴定后得到pBsoc。根据已公开的cre基因的核苷酸序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，引物7：AAATGTCCAA TTTACTGACC GTACAC(SEQ ID NO：7)和引物8：GGCTAATCGC CATCTTCCAG(SEQ ID NO：8)。以质粒pBsoc为模板，用引物7和引物8以30μl总体积进行PCR反应(94℃预变性5分钟后，94℃变性30秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟)。鉴定出携带cre基因的重组载体pBsoc。

用Apa I和Pst I从pBsoc上切除1.6kb的osg6B启动子片段后，将其与已用Apa I和Pst I酶切pGTntm所得的1.0kb的ntm19启动子片段连接，得到pBsnc。经酶切及PCR鉴定后用Hind III和Sac I双酶切pBsnc，得到ntm19启动子驱动cre基因的2.6kb的构建物(ntm19-cre)。将该构建物连接到与已用HindIII和Sac I双酶切的双元载体pGPTV-KAN中，形成pGknc(参见图1)。经酶切及PCR法进一步鉴定后，以冻融法用pGknc转化土壤农杆菌LBA4404(pAL4404)。培养后，挑取单菌落并提取质粒，经PCR鉴定正确后，保存菌种备用。实施例6携带ntm 19/nls-cre结构的重组载体的构建

真核生物中大分子物质进出细胞核是细胞维持活性的一个基本过程，这一过程是通过核孔复合体完成的。已证明，某些小分子量蛋白质(小于40-60kD)可以通过自由扩散的方式进出细胞核(Paine，Nature，254：109-114(1975)，Brecuwer，Cell，60：999-1008(1990))，但大分子量蛋白质进入细胞核则需要核定位信号(NLS)与核膜上的受体相互作用才能完成。

目前已对SV40大T抗原为代表的核定位信号进行了非常透彻的研究和广泛的应用。虽然cre蛋白分子量较小(约38.5kD)，但我们推测在cre基因5′端加上SV40大T抗原的核定位信号应该可以增加cre蛋白在核内的含量，从而有利于cre蛋白对特异剪切序列的有效识别。因此，根据已知的编码SV40大T抗原的核定位信号的核苷酸序列设计并合成一个寡核苷酸引物9：TCCTGCAGAACCATGGCTCC CAAGAAGAAG AGAAAGGTAA TGTCCAATTT ACTGACCG(SEQ ID NO：9)。以按照实施例4中所述方法制备的pBsnc为模板，用引物9及T7引物进行50μl总反应体积的PCR反应(94℃预变性5分钟后，94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，25个循环之后，72℃延伸10分钟)。经1.0％琼脂糖凝胶电泳回收1.6kb的扩增产物，并将其与pGEM-T Easy载体(Promega公司)连接过夜。用所得连接反应混合物转化大肠杆菌DN5α感受态细胞，并于37℃下培养过夜。培养后，挑选白色菌落并提取质粒，经酶切和PCR鉴定后命名为pGTEnlsc。经核苷酸序列分析表明，SV40大T抗原的核定位信号确实已经连接到CRE蛋白的N端。用Pst I和Sac I将pGTEnlsc上的nls-cre基因切下，取代pBsnc中的cre基因，并在T4 DNA连接酶存在下连接过夜。用所得连接反应混合物转化大肠杆菌DN5α感受态细胞，于37℃下培养过夜。培养后，挑选单菌落，提取质粒，经酶切和PCR鉴定后将其命名为pBsnlsc。再用Hind III和Sac I双酶切将所得pBsnlsc中的ntm19/nls-cre构建物切出，将其与已经用Hind III和Sac I酶剪切的双元载体pGPTV-KAN在T4 DNA连接酶存在下连接过夜。然后用所得连接反应混合物转化大肠杆菌DN5α感受态细胞，并于37℃下培养过夜。挑选单菌落，提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，鉴定正确后将其命名为pGknlsc(参见图2)。以冻融法将pGknlsc转入土壤农杆菌LBA4404(pAL4404)中，用PCR法鉴定正确后，保存菌种备用。实施例7携带osg6B/barnase结构的重组质粒的构建

用pDM307中35S/bar结构替换pGPTV-BAR中的nos/bar结构得到重组质粒pGsbar，从而使bar基因处于35S强启动子控制之下。然后用sac II和Sac I将实施例1中提到的pGbn中的芽孢杆菌RNA酶(barnase)基因连接于pBsosg中的osg6B启动子的下游，得到重组质粒pBsobn。经酶切分析和PCR鉴定正确后，再用Hind III和Sac I将pBsobn中的osg6B/barnase结构连接到双元载体pGsbar中，得到新的重组质粒pGsbobn。实施例8携带ntm19/barnase结构的重组质粒的构建

用BamHI酶消化实施例6中所述的pBsobn，末端补平后再经Apa I酶切去除osg6B启动子：用SalI酶消化实施例2中所述的pGTntm，末端补平后再经ApaI酶切，将切出的ntm19启动子与上述载体连接得到重组质粒pBsnbn。上述pBsnbn经酶切和PCR鉴定后，用Apa I酶切，末端补平后再用Sac I酶切，将切出的ntm19/barnase结构连接入经Hind III酶切补平再经Sac I酶切的pGsbar载体中，得到pGsbnbn。鉴定正确后，通过冻融法转入土壤农杆菌LBA4404中。经PCR鉴定正确后保存菌种备用。实施例9携带Posg6B/loxp-barstar-loxp/barnase的表达质粒的构建

用Not I和Spe I从pMS102中将80bp的同向loxp位点切出，连接到已经用NotI和SpeI消化的pGEM-5Z f(+)(Promega公司)中，得到重组质粒pGlox。对所得的重组质粒进行核苷酸序列分析，证明连接到该载体中的两个loxP位点的核苷酸序列无一改变。

将pGPTV-BAR中GUS基因下游的Sac I位点酶切补平后，自身环化得到重组质粒pGPTV-BAR′。用Hind III和EcoR I酶从中切出2.1kb的GUS基因片段，并连接到用同种酶消化的pGEM-7Z f(+)(Promega公司)中，得到重组质粒pG7GUS。

上述pG7GUS经酶切和PCR鉴定正确后，再用Xba I将2.1kb的GUS基因片段切出，并将该片段与用同种酶消化的上述质粒pGlox连接，得到重组质粒pGlGUS。经酶切、PCR及序列分析鉴定正确后，得到携带两个loxP位点间插入GUS基因片段的重组质粒。用Pst I和Sal I切下上述pGlGUS中loxp位点间含有GUS基因的结构，并连接到用Pst I和 Xho I消化的PZeRO2.1中，得到重组载体pZlGUS。

用BamH I和EcoR I切出pBbsr中0.7kb的barstar基因和nos终止序列片段，末端补平后，与用sma I和xho I切除pZIGUS中GUS基因并末端补平后的载体连接得到重组质粒pZlbsr。先用酶切鉴定插入方向正确的克隆，再用PCR法进一步鉴定之：根据已知的芽孢杆菌RNA酶抑制剂barstar的核苷酸序列设计并合成了一对寡核苷酸引物，引物10：GGATGAAGAA GGCAGTCATT A(SEQ ID NO：10)和引物11：GGTTAGGAGA GTATGATGGT GAT(SEQ ID NO：11)。以pZlbsr为模板，用引物10和引物11进行30ul总体积的PCR反应(94℃预变性7分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，25个循环之后，72℃再延伸10分钟)。

用EcoR I和BamH I将pZlsr中loxp位点间含有barstar基因的结构切出，连接到用同种酶消化的实施例6的pBsobn 中的osg6B启动子和barnase基因之间，得到重组质粒pBsolbsrbn。用酶切分析和PCR法进行鉴定。

用Hind III和Sac I从上述质粒pBsolbsrbn中切出osg6B-loxp/barstar/loxp-barnase完整结构，连接到用同种酶消化的pGsbar中，得到重组质粒pGsbolbsrbn(参见图3)，酶切及PCR鉴定后以冻融法转入LBA4404(pAL4404)中，用PCR鉴定正确后保存菌种备用。

实施例10含pGsbolbsrbn的土壤农杆菌转化烟草

取实施例8中提到的pGsbolbsrbn转化的土壤农杆菌菌株LBA4404的菌种，接种到含100mg/L链霉素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的10ml液体YEB培养基中，放在28℃摇床上振荡培养17-20个小时。用此培养物按Horsch的方法(Science，227：1229-1231)进行烟草的叶盘法转化。取上述土壤农杆菌培养物1ml按1∶20的比例稀释到20ml液体MS培养基(表2)中。把在25℃下生长4-6周的烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成8平方厘米并浸在该稀释液中。5分钟后，取出叶片在无菌滤纸上吸去多余菌液。把这些叶片按每瓶10片放置到含有1.0mg/L、500mg/L羧苄青霉素和10mg/LPPT的同体MS培养基(表2)上，在14小时白天、14小时黑夜的光周期和25℃条件下培养。

约3周后，将生长至长1厘米以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素和5mg/L PPT的固体MS培养基(表2)上诱导生根，约2-3周后可见根的形成，从而得到再生的完整植株。待这些完整植株生长到大约5厘米时，从培养瓶中取出，用自来水冲去残存于根部的MS培养基，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长。

取上述温室中生长的再生烟草叶片按实施例2中提到的方法微量制备总DNA。取1ul总DNA，分别用引物7和引物2、引物7和引物10以及引物9和引物2进行30ul体积的PCR反应。结果特异性地扩增得到所预期的2.5kb、1.9kb和1.0kb的片段。

取上述总DNA 10ug，用barnase基因片段做探针，用Boehringer Mannheim公司的非放射性标记和检测试剂盒，完全按照该公司提供的操作手册进行Southern印迹检测，证明已经得到所需的转基因植株。实施例11含pGknlsc的土壤农杆菌转化烟草

将实施例8中提到的pGknlsc转化的土壤农杆菌菌株LBA4404的菌种接种到含100mg/L链霉素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的10ml液体YEB培养基中，放在28℃摇床上振荡培养17-20个小时。用此培养物按Horsch等人的方法(Science，227：1229-1231)进行烟草的叶盘法转化。取上述土壤农杆菌培养物1ml按1∶20的比例稀释到20ml液体MS培养基(表2)中。把在25℃下生长4-6周的烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成8平方厘米并浸在该稀释液中。5分钟后，取出叶片在无菌滤纸上吸去多余菌液。把这些叶片按每瓶10片放置到含有1.0mg/L、500mg/L羧苄青霉素和40mg/L卡那霉素的固体MS培养基(表2)上，在14小时白天、14小时黑夜的光周期和25℃条件下培养。约3周后，将生长至长1厘米以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素和30mg/L卡那霉素的固体MS培养基(表2)上诱导生根，约2-3周后可见根的形成，从而得到再生完整植株。待这些完整植株生长到大约5厘米时，从培养瓶中取出，用自来水冲去残存于根部的MS培养基，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长。

                表2 烟草组织培养用培养基

      成分                                   每升含量

      分化培养基

      10X MS大量元素母液                     100ml

      100X MS微量元素母液                    10ml

      100X铁盐母液                           10ml

      100X维生素母液                         10ml

      1mg/ml 6-苄基腺嘌呤                    1.0ml

      1mg/ml萘乙酸                           0.1ml

      琼脂                                   7.5克

      pH5.8

      生根培养基

      10X MS大量元素母液                     100ml

      100X MS微量元素母液                    10ml

      100X铁盐母液                           10ml

      100X维生素母液                         10ml

      琼脂                                   7.5克

      pH5.8

取上述温室中生长的再生烟草叶片按实施例2中提到的方法微量制备总DNA。取上述1ul总DNA，用引物7和引物8进行30ul体积的PCR反应。结果特异性地扩增得到所预期大小的1.0kb片段。

取上述总DNA 10ug，用cre基因片段做探针，用Boehringer Mannheim公司的非放射性标记和检测试剂盒，完全按照该公司提供的操作手册进行Southern印迹检测，证明已经得到所需的转基因植株。实施例12含p35Scre和pGsbolbsrbn的土壤农杆菌共转化烟草

将实施例8中提到的pGsbolbsrbn转化的土壤农杆菌菌株LBA4404的菌种和p35Scre转化的土壤农杆菌菌株LBA4404的菌种接种到含100mg/L链霉素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的10ml液体YEB培养基中，放在28℃摇床上振荡培养17-20个小时。用此培养物按Horsch的方法(Science，227：1229-1231)进行烟草的叶盘法转化。取上述土壤农杆菌培养物1ml按1∶20的比例稀释到20ml液体MS培养基(表2)中。把在25℃下生长4-6周的烟草无菌苗的幼嫩叶片剪成8平方厘米并浸在该稀释液中。5分钟后，取出叶片在无菌滤纸上吸去多余菌液。把这些叶片按每瓶10片放置到含有1.0mg/L、500mg/L羧苄青霉素、40mg/L卡那霉素和10mg/L PPT的固体MS培养基(表2)上，在14小时白天、14小时黑夜的光周期和25℃条件下培养。

约3周后，将生长至长1厘米以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素、30mg/L卡那霉素和5mg/L PPT的固体MS培养基(表2)上诱导生根，约2-3周后可见根的形成，从而得到再生完整植株。待这些完整植株生长到大约5厘米时，从培养瓶中取出，用自来水冲去残存于根部的MS培养基，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长。

取上述温室中生长的再生烟草叶片按实施例2中提到的方法微量制备总DNA。取1ul总DNA，分别用引物5(A)、引物2(B)、引物11(C)、引物10(D)、引物7(E)、引物8(F)的不同组合以30ul体积进行PCR反应(有关位点特异性重组过程参见图4)。反应后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图5所示，其中泳道1为p35Scre扩增产物，泳道2、5、7、9分别为p35Scre和pGsbolbsrbn共转化的转基因烟草总DNA扩增产物，泳道3、4、6、8分别为pGsbolbsrbn转化的转基因烟草总DNA扩增产物，泳道10为pBsobn扩增产物。在p35Scre和pGsbolbsrbn共转化的转基因烟草总DNA中，E和F引物组合扩增得到1.0kb片段(泳道2)，A和D引物组合扩增得到1.9kb片段(泳道9)，同时A和C以及B和D引物组合没有扩增到任何片段(泳道7和5)。由此说明，cre基因以及osgB/lox-barstar-lox/barnase结构已经一起转化到烟草中，并且证明cre/lox系统确实已经在烟草中发挥作用，将lox位点间的阻遏片段特异性地切除掉，使芽孢杆菌RNA酶barnase基因直接位于花药绒毡层特异性基因osg6B启动子下游。

取上述总DNA 10ug，用特定限制性内切酶酶切过夜后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后将上述凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜上。用barnase基因片段和cre基因片段做探针，用Boehringer Mannheim公司的非放射性标记和检测试剂盒，完全按照该公司提供的操作手册进行Southern印迹检测，证明确实已经得到共转化的转基因植株。

取上述温室中生长的再生烟草叶片用Clontech公司Trizol试剂盒按其操作手册提取总RNA。取总RNA10ug，在无RNA酶的条件下进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后将上述凝胶中的RNA转移到硝酸纤维素膜上。用cre基因片段做探针，使用Boehringer Mannheim公司的非放射性标记和检测试剂盒进行Northern印迹分析，证明重组酶基因在共转化的转基因植株中具有组成型转录活性。实施例13转基因雄性不育性状的获得

以实施例9中所提到的含有ntm19/cre结构的转基因植株作母本，并以实施例10所提到的带有osg6B/lox-barstar-lox/barnase结构的转基因植株作父本进行杂交。杂交种子在含有10mg/L PPT培养基中萌发或萌发后喷施PPT，再生得到的植株再进行自交。同样如所述，自交后代的种子在含有10mg/L PPT培养基中萌发或萌发后喷施PPT后，再生得到的植株待开花后进行花粉检测发现，花粉空瘪，不能被碘染色，自交不能得到能够萌发的种子，从而证明得到了雄性不育性状。

实施例11中的带有35S/cre和osg6B/lox-barstar-lox/barnase结构的转基因植株待开花后同样进行花粉检测，同样检测到花粉空瘪、不能被碘染色、自交不能得到能够萌发的种子，从而也证明获得了雄性不育性状。

当MT/cre和osg6B/lox-barstar-lox/barnase结构被转化到同一植物细胞或植株后，对所得植株或它们的自交后代植株喷施20mM CuSO₄。待该植株开花后，对其进行花粉检测发现花粉空瘪，不能被碘染色，且自交后不能得到能够萌发的种子，证明已获得了雄性不育性状。

                            序列表

(1)一般信息

  (i)申请人：北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室

  (ii)发明名称：获得雄性不育植物的分子方法

  (iii)序列数：13

  (iv)通讯地址：

    (A)联系人：林忠平

    (B)街道：海淀区颐和园路5号

    (C)城市：北京

    (D)国家：中华人民共和国

    (E)邮政编码：100871

  (v)计算机可读形式：

    (A)介体类型：3.5英寸软盘

    (B)计算机：IBM Pentium II

    (C)操作系统：WINDOWS97

    (D)软件：WORD97

  (vi)电讯信息：

    (A)电话：86-10-62753062

    (B)传真：86-10-62751843

(2)SEQ ID NO：1的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：22个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：TATGGCACAG GTTATCAACA CG

(3)SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GTTATCTGAT CTTTGTAAAG G

(4)SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GATCCAGATT TATAGGGTTC T

(5)SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：22个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GGGTTGGTAC TCTAAGATGA AT

(6)SEQ ID NO：5的信息

  (i)序列特征：

   (A)长度：23个碱基

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：TTGGTTAATT GGAGTGATGG CAG

(7)SEQ ID NO：6的信息

  (i)序列特征：

   (A)长度：24个碱基

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：CCCTCAGGTT GTATTTGGAT AATG

(8)SEQ ID NO：7的信息

  (i)序列特征：

   (A)长度：26个碱基

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA

(iii)序列：AAATGTCCAA TTTACTGACC GTACAC

(9)SEQ ID NO：8的信息

  (i)序列特征：

   (A)长度：20个碱基

   (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GGCTAATCGC CATCTTCCAG

(10)SEQ ID NO：9的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：58个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：TCCTGCAGAA  CCATGGCTCC  CAAGAAGAAG  AGAAAGGTAA

TGTCCAATTT  ACTGACCG

(11)SEQ ID NO：10的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GGATGAAGAA GGCAGTCATT A

(12)SEQ ID NO：11的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：23个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：GGTTAGGAGA GTATGATGGT GAT

(13)SEQ ID NO：12的信息

  (i)序列特征：

  (A)长度：20个碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：ATGAGCCCAG AACGACGCCC

(14)SEQ ID NO：13的信息

  (i)序列特征：

  (A)长度：20个碱基

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (iii)序列：AGATCTCGGT GACGGGCAGG

Claims (21)

1.获得雄性不育植物的分子方法，该方法包括：

用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组DNA序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组DNA序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是花药小孢子特异性启动子序列。

3.根据权利要求2的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的花药小孢子特异性启动子包括但不仅限于ntm19启动子序列。

4.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是组成型启动子序列。

5.根据权利要求4的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的组成型启动子序列包括但不仅限于35S启动子序列。

6.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子也是花药绒毡层细胞特异性启动子序列。

7.根据权利要求6的方法，其中所说的第一个和第二个花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列。

8.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是诱导型启动子序列。

9.根据权利要求8的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的诱导型启动子序列包括但不仅限于MT启动子序列。

10.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个重组DNA序列中的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列是编码芽孢杆菌RNA酶barnase的核苷酸序列，并且编码第二个重组DNA序列中识别连接在第一个重组DNA序列中的所说的阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列是编码重组酶的核苷酸序列。

11.根据权利要求1的方法，其中所说的的阻断序列是可在植物特定细胞发育阶段被所说的细胞特异性启动子驱动表达的重组酶基因产物剪切，从而使所说的雄性器官细胞致死基因得以表达的核苷酸序列，并且所说的序列是非特定DNA序列编码区或非特定转录单位或编码polyA的核苷酸序列。

12.根据权利要求1的方法，其中所说的植物细胞或植株是F₀、F₁或F₂代植物细胞或植株。

13.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由所说的植株直接得到的。

14.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由所说的植株自交后再生得到的。

15.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞或植株是某个植物种的被第一个和第二个重组DNA序列再转化或共转化的同一个植物细胞或植株。并且所说的具有雄性不育性状的植物是由这一细胞或植株本身或自交后代被施加诱导物后得到的。

16.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞或植株是分别被第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲本植物细胞或植株，并且所说具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交后再生得到的。

17.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞是分别被第二个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲代植侏或植物细胞，并且所说的具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交产生的F₁代植株自交后的F₂植株得到的。

18.根据权利要求1的方法，其中所说的被转化的植物细胞或植株是分别被第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列转化的两个亲本植物细胞或植株，并且所说的具有雄性不育性状的植物是由两个F₀代植株杂交后直接施加诱导物或自交后代再经施加诱导物后得到的。

19.按权利要求1到18中任何一项所述方法得到的，含有第一个和/或第二个重组DNA序列的重组载体。

20.携带权利要求19所限定的重组载体的宿主细胞。

21.按权利要求1到18中任何一项所述方法得到的，含有第一个和/或第二个重组DNA序列的植物细胞和由之再生的植株。

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