CN1268974A - 通过核糖体蛋白质l3基因的修饰植物和动物对单端孢菌毒素的耐受 - Google Patents

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Abstract

禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)是一种植物致病原,侵染了许多种类的植物,包括玉米(穗和主茎腐烂),大麦,和小麦(头枯萎)。镰孢霉流行造成上百万美元的损失。谷类作物感染禾谷镰孢霉会降低产量和谷物品质。真菌毒素是由许多种类的真菌产生的,因而谷物被这些真菌毒素,例如单端孢菌毒素污染。主要由禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)以及大刀镰孢(F.Culmorum)产生的单端孢菌毒素是一种脱氧瓜蒌镰菌醇(DON,也被称为呕吐毒素)。单端孢菌毒素是强力的蛋白质合成抑制剂,对人类和动物具有毒性。乙鉴定出一种抵抗单端孢菌毒素,木霉素的酵母基因。已制备出相应的植物基因,它被用于转化植物并适用于转化动物。这些转化的植物具有提高的对单端孢菌毒素的耐受性,更能抵抗镰孢霉的侵染。转化的动物对单端孢菌毒素的耐受性提高。这种修饰的基因也可用作转化实验中的可选择性标记。

Description

通过核糖体蛋白质L3基因的修饰植物和 动物对单端孢菌毒素的耐受
本发明涉及一种修饰的基因，其中，用所说的基因转化的宿主对单端孢菌毒素具有抗性，其中所说的基因的野生形式编码一种核糖体蛋白质L3。本发明也涉及一种用所说的基因转化植物提高对单端孢菌毒素抗性的方法。本发明也涉及一种用所说的基因转化动物提高对单端孢菌毒素耐受性的方法。本发明还涉及在转化中将所说的基因用作选择性标记的方法。
发明背景
在全球范围内，禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)是一种重要的植物致病原，侵染了许多种类的植物，包括许多重要的粮食作物，例如玉米(穗和主茎腐烂)，大麦，和小麦(头枯萎)。适宜的环境条件(适宜的温度和高的湿度)可导致镰孢霉流行并造成上百万美元的损失。谷类作物感染禾谷镰孢霉会降低产量和谷物品质。品质的降低是由于这种真菌产生的真菌毒素作用的结果；这些真菌毒素在收获后保留在被污染的谷物中，对可能消费这些谷物的动物和人类的健康造成威胁。
在不流行的年份低水平的污染仍对安大略的玉米农场造成5％的损失，这一数字意味着使用这些玉米作饲料的养猪工业约$27,000,000的损失。在流行的年份，损失将是这一数字的两倍或三倍。这些对饲养业主种植业主的直接损失包括作物损失和与饲料减少和饲料质量下降相关的动物的损失。总之，联合国FOA估计世界上每年约25％的粮食作物被真菌毒素侵袭(Mannon和Johnson，1985，Fungi down on the Farm，New Scientist 105：12-16)。镰孢霉真菌毒素发现于所有的主要的谷类作物，包括玉米，小麦，大麦，燕麦，黑麦和其它的一些作物。这种病在温和的气候下最为流行。
真菌毒素是由许多种类的真菌产生的。禾谷镰孢霉以及结谷木镰孢霉(F.Sambucinum)，早熟禾镰孢霉(F.Poae)，拟分枝孢镰孢霉(F.Sporotrichioides)，大刀镰孢(F.Culmorum)和F.Crookwellense可产生一类被称为单端孢菌毒素的化合物。这一大的倍半萜环氧化物家族的化合物密切地相互关联，而在基本的化学结构上羟基化和取代基的位置和数目有所变化。由禾谷镰孢霉产生的主要的单端孢菌毒素是脱氧瓜萎镰菌醇(DON)，由于它能引起呕吐因而也被称为呕吐毒素。这些化合物是强力的真核细胞蛋白质合成抑制剂，对人类和动物以及其它有机体例如植物均具有毒性。
由于它们的毒性，有人已建议了用于人类食品和动物饲料的DON真菌毒素污染的安全阈值(Van Egmond，1989，Food Addit.Contam.6：139-188；Underhill，CFIA Fact Sheet，Mycotoxins，1996)。如果将家养动物用污染的谷类饲喂，则对家畜饲养者的威胁是对动物的健康会产生几个方面的危害，包括饲料摄入量降低，生长速率降低，生育能力降低，免疫抑制，出血，呕吐和可能造成死亡。这些效应中的一些可直接观察，因而可进行测定，例如体重降低，而其它一些效应是比较细微的变化，例如免疫抑制，因而难于对其进行定量。总之，猪的怀胎率降低10-20％，生长率降低10-20％，可使饲养业主的利润降低17-44％。真菌毒素对家禽和牛的影响没有量化，因为这两种动物对其饲料中的DON污染不太敏感，并且还没有对其经济性进行评估。
在镰孢霉流行的年份，用于人类消费品的高于2ppm DON安全阈值的加拿大谷物必降低等级使其成为动物饲料。如果谷物含有高于10ppm DON则不适于用作动物饲料并必须进行处理。由于许多农场主将自己生产的谷物用作农场动物的饲料，它们可能无法评估谷物中真菌毒素污染的水平，因而可能大量使用了DON污染的饲料。因而降低食品中单端孢菌毒素的水平非常重要，这可通过控制种植的谷类作物中镰孢霉的爆发来实现。
过去曾使用化学处理来控制单端菌毒素的生物合成。一种抑制剂是描述于美国专利4816406中的ancymidol。但在现在的环境下人们期望避免使用化学品进行控制，特别是对于食品。因而需要一种通过使用非化学品的方法控制镰孢霉，特别是禾谷镰孢霉的方法。
单端孢菌毒素已经显示是小麦头部斑点病的致病因子。这是通过使用不产生单端孢菌毒素的禾谷镰孢霉的突变体接种小麦头部来证明的，其中通过遗传工程技术将特异于单端孢菌毒素生物合成途径的第一个基因破坏掉(Desjardins等，1996，Mol.Plant-Micr.Int.9：775-781)。在两年时间的田间试验中，不产生单端孢菌毒素的品系与产生单端孢菌毒素的后代或回复变异体相比具有较低的致病性，这是通过几种疾病参数测定的。用产生和不产生这些单端孢菌毒素的镰孢霉品系接种田间生长的玉米得到了相似的结果。因而，提高小麦或玉米对单端孢菌毒素的效应的耐受性可降低疾病的发生。
发明概述
动物研究的结果表明，对单端孢菌毒素的生物响应是快速的而无论是通过口服、局部或非胃肠道途径施用的。在它们从身体被排泄之前(通常发生在注射后24至72小时内)，发现在胆汁，胆囊，肾脏，肝脏和小肠中具有最高的浓度。
所有的单端孢菌毒素的作用方式与它们和60S核糖体亚单位的结合能力并基本上抑制肽转移酶活性相关。这是通过抑制蛋白质合成的起始、合成中的肽的延伸或肽的终止来完成(Freinberg和McLaughlin，1989，单端孢菌毒素p27作用的生物化学机制，In：单端孢菌毒素的毒性：致病效应，Vol 1 CRC Press，Boca Raton Fl.)。这些毒素对蛋白质合成的效应是在不同的真核细胞例如酵母和哺乳动物细胞系中进行观察的。每一个核糖体明显地仅具有一个毒素的结合位点，并且研究工作表明所有的单端孢菌毒素竞争核糖体蛋白质L3上的同一个核糖体结合位点。
由Schindler等分离出的啤酒酵母(酵母)突变体(1974，自然(Nature)，248：548-536)显示出可在单端孢菌毒素药物木霉素上生长。这种酵母品系显示出具有改变的60S核糖体亚单位功能，并且当所涉及的基因被克隆后发现它编码核糖体蛋白质L3(RPL3)(Schultz和Friesen，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)155：8-14)。
在本发明的一个方面中，通过比较野生型的酵母基因和突变的酵母基因得到的信息被用于修饰来自水稻Oryza sativa(一种谷类作物)的相应的基因。然后使用修饰的水稻基因创建出转基因烟草，这些植物与野生型的烟草或用野生型的水稻基因转化的植株相比对单端孢菌毒素具有较高的耐受性。含有修饰的水稻Rpl3基因的转基因玉米胚胎培养物与含有野生型的水稻Rpl3基因的培养物相比对单端孢菌毒素DON也显示出较高的耐受性。因而，这种修饰的水稻基因可提供对单端孢菌毒素的保护，因而在另一种植物中提供对镰孢霉侵袭的抗性。
因而本发明提供了一种修饰的基因，其中，用所说的基因转化的宿主对单端孢菌毒素的抗性提高，其中所述的基因的野生型形式编码核糖体蛋白质L3。
在本发明的一个实施方案中，编码核糖体蛋白质L3的基因来自水稻。
本发明还提供了一种含有所说的修饰的核糖体蛋白质L3基因的适当的克隆载体。
本发明由一方面提供了一种用修饰的Rpl3基因转化的植物，其中所说的转化的植物对镰孢霉侵袭的抗性提高。
本发明也包括来自上述转化的植物的种子。
本发明再一方面提供了一种用修饰的Rpl3基因转化的动物，其中所说的转化的动物对单端孢菌毒素的耐受性提高。
本发明又一方面提供了一种通过用一种修饰的基因转化一种适当的植物提高对镰孢霉侵袭的抗性的方法，其中，用所说的基因转化的植物具有提高的对单端孢菌毒素的抗性，并且其中所说的基因的野生形式编码核糖体蛋白质L3。
本发明也提供了一种通过用一种修饰的基因转化一种适当的动物提高对单端孢菌毒素的耐受性的方法，其中，用所说的基因转化的动物具有提高的对单端孢菌毒素的耐受性，并且其中所说的基因的野生形式编码核糖体蛋白质L3。
本发明再一个方面提供了一种使用本发明的修饰的基因作为转化实验中的可选择性标记的方法。
附图简要说明
从下文的叙述参照附图本发明的这些和其它的特征将显而易见。
图1显示野生型酵母RPL3氨基酸序列(RPL13PWT；SEQ ID NO：1)，上面的一行，和木霉素抗性酵母序列(SCRP 13 PRO；SEQ ID NO：2)，下面的一行，之间的比较。显示了W-255至C-255的氨基酸变化。突变酵母基因在GenBank中的登记号是J01351。
图2显示水稻RPL3序列(SEQ ID NO：3)，上面一行，和木霉素抗性酵母序列(SEQ ID NO：2)，下面的一行，之间的比较。这一比较可以看出为创建真菌毒素耐受性水稻基因Rpl3：c258推测的残基W258(水稻基因编号)至C258的变化。该水稻基因在GenBank的登记号为D12630。
图3显示用于植物转化的Agrobacterium tumefaciens双重载体(binaryvector)pBin 19的质粒图谱(Bevan，M.1984，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，12：8711-8721)。
图4显示质粒pCAMterX，它被用于将Rpl3克隆进多克隆位点(MCS)。Rpl3基因在前后排列的(70S启动子)花椰菜花叶病毒(CAMV35S启动子)引导下表达。
图5显示含有野生型的水稻Rpl3基因(C3细胞；图5A)或修饰的Rpl3(C4；图5B)的转基因烟草的生长率。细胞被生长在不含有毒素或含有25ppm DON的培养基中。
本发明详细描述
本发明提供了一种修饰的核糖体蛋白质L3基因，其基因产物提供对单端孢菌毒素的抗性。以前的研究工作显示，单端孢菌毒素结合在真核细胞60S核糖体的单一位点上。鉴定出了一个对单端孢菌毒素药物，木霉菌素，具有抗性的酵母啤酒酵母的自发突变体。对相应的野生型基因进行鉴定的结果发现该突变基因产生于推测的RPL3蛋白质的255位的单个氨基酸变化(图1)。
这一突变体只是可产生对药物单端孢菌毒素木霉素抗性的同一个基因的很多突变体的一个例子。因而，本发明涉及一种修饰的核糖体蛋白质L3基因，其中，所说的修饰的基因提供对单端孢菌毒素的抗性。
本发明的发明人没有局限于任何一种特定的理论，认为该真菌毒素与野生型的蛋白质结合，但不与突变型基因的产物结合。因而，本发明的修饰的Rpl3基因仍允许核糖体复合物中的肽基转移酶行使功能，但对其修饰的程度应降低真菌毒素的结合能力。如果真菌毒素的影响降低，植物可更好地保护自身抵抗真菌，并降低发病率。
在本发明的这一方面的一个实施方案中，编码RPL3的基因来自植物。再这一实施方案的一个实施例中，将相应的水稻Rpl3基因进行鉴定和修饰，以反映酵母突变基因中的修饰。这样得到的Rpl3基因也显示出对单端孢菌毒素的抗性。选择一种植物来源的Rpl3基因代替酵母基因，预期植物基因在植物宿主中与酵母基因相比表达较好。选择水稻是因为它最接近小麦和玉米，这是两种植物宿主的例子。
作为例子虽然使用的是水稻Rpl3基因，也可使用其它的植物基因。适当的例子包括：来自Arabidopsis thaliana和单子叶植物的相应的基因，例如小麦和玉米。对于动物转化来说，相应的牛的基因将是适当的修饰对象。
如上文所述，本发明不限于使用修饰的植物Rpl3基因来获得对单端孢菌毒素的抗性。按照本发明，可使用任何一种可赋予对单端孢菌毒素抗性的修饰的动物或植物Rpl3基因，以此转化植物或动物，获得对单端孢菌毒素的抗性。
在酵母基因中修饰的区域是高度保守的区域。表1显示了在该蛋白质的这一关键部分的周围在植物、大鼠、小鼠、人类、酵母、雅致弯梗霉(C.Elegans)和大肠杆菌中存在的氨基酸同源性。它们中的任何一种均可被用作Rpl3基因的原材料。在每一种情况下，将氨基酸序列与突变的酵母基因和在相应的Rpl3基因中产生的相应的突变进行线性排列。由于在氨基酸残基240和263(基于酵母的氨基酸编号)之间的整个区域是高度保守的，在这一区域中对任何一个氨基酸进行修饰来得到修饰的基因序列都被认为是本发明的一部分。这种修饰可包括替换或短的长度的缺失，增加或颠换。如上文所述，该修饰的基因产物必需也能够允许肽基转移酶发挥功能，但对真菌毒素的结合能力降低。
                     表1在残基240和263之间各种核糖体蛋白质L3的序列比较
                   氨基酸序列
Figure A9880874500121
线条表示与野生型的酵母RPL3序列相同的氨基酸
本发明还提供了一种含有所说的修饰的Rpl3基因的适当的克隆载体。可使用任何一种克隆载体。对克隆载体的选择当然应反映最终进行转化的宿主。本发明包括转化的动物和植物。
适当的植物克隆载体包括：双重农杆菌载体，例如Bin 19(Bevan，M.，1984，核酸研究12：8711-8721)以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。
对于植物转化来说，克隆载体可还包括3’非翻译区域。3’非翻译区域是指一种基因的部分，它含有一种包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。通常聚腺苷酸信号的特征是引导聚腺苷酸味加入到mRNA前体的3’端。通常聚腺苷酸信号是通过与规范形式的5’AATAAA-3’的同源性的存在识别的，虽然其变异形式是不常见的。
适当的3’区域的例子是含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大豆贮存蛋白质基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚单位基因)的3’转录的非翻译区域。来自本发明的构建体的修饰的Rpl3基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达，不需要加入额外的区域。
本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明的植物转化的例子中可使用任何一种强启动子。适当的例子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV35S)。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的克隆载体在需要时也可包括增强子，不论是翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域对于本领域普通技术人员来说是公知的，可包括ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框同相，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是多种不同的来源，可以是天然的或合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域，或来自结构基因。该序列也可衍生于被选用来表达该基因的启动子，并可对其进行特异性修饰，以提高mRNA的翻译。
为了便于转化的植物细胞的鉴定，可对本发明的载体进行进一步的基因工程操作以包括植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括庆大霉素，潮霉素，卡那霉素等。同样，可使用可产生通过颜色变化(例如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶))或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶。
含有本发明的修饰的Rpl3基因的转基因植物也被认为是本发明的一部分。从植物细胞产生完整植株的方法是本领域已知的，而得到转化的和重生的植株的方法不是本发明的关键。总之，转化的植物细胞被培养在适当的培养基中，该培养基中可含有选择试剂，例如抗生素，其中选择性标记被用于转化的植物细胞的识别。在愈伤组织形成之后，可按照已知的方法使用适当的植物激素刺激苗的形成，并将苗转移至生根培养基中生成植株。然后将该植株用于重复繁殖，或者使用种子或者使用无性繁殖技术来进行。
本发明的载体构建体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，电穿孔等导入植物细胞。对这些技术的综述参见例如Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法(Method forPlant molecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)，第二版(1988)。
适当的植物宿主包括但不限于玉米，大麦，小麦，水稻，黑麦，燕麦，和谷子。
产生转基因动物的技术已经建立起来，并使用小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎的基因操作：实验室手册。冷泉港实验室出版社：纽约)，羊(Wright等，1991，生物技术，纽约9：831-834)，山羊(Ebert和Schindler，1993，Teriogenology，39：121-135)和猪(Rexroad和Purcel，1988，Proc.11th int.Congress of Animal Reproduction and Artificial Insem.5：29-35)进行了进一步的完善。总之，这种方法基于对取自过度排卵雌性动物的受精卵的前核进行微注射。使用几百个拷贝的这种新的基因构建体对卵子的前核进行微注射，然后转移至受体雌性动物中完成妊娠。对转基因整合的证实是通过对取自子代的体细胞组织的Southern杂交，以及对基因产物或基因功能的分析进行的。基因替换实验可使修饰的Rpl3插入，代替动物的内源性野生型(易感性)基因，从而使动物获得高水平的对真菌毒素的抗性(Stacey等，1994，分子细胞生物学14：1009-1016)。
适用的动物宿主包括任何一种其食谱的至少一部分来自上述植物的动物。这些动物包括但不限于牛，绵羊，山羊，猪，马，家禽以及人。如上所述，猪对真菌毒素特别敏感。在本发明中提及特定序列时，应当理解这些序列包括与所说的特定序列“基本上同源”的序列。当一定长度内至少约70％，优选至少约80％，最优选至少约90-95％的核苷酸相匹配时，则这种序列为“基本上同源的”。“基本上同源”的序列在其序列内包括替换，缺失，和增加中的任何一种。基本上同源的DNA序列可通过Southern杂交实验进行鉴定，例如在严谨杂交条件下进行实验(参见Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)第387至389页)。
本发明中提及的特定的序列也包括与所说的特定的序列“功能等同”的序列。在本发明中，功能等同的序列是指一种虽然它与特定的序列不相同但具有相同或基本上相同的功能的序列。功能等同的DNA序列包括在序列中具有替换，缺失和增加中的任何一种。在本发明中功能等同的序列将提供对单端孢菌毒素的抗性。如上文所述，本发明的修饰的基因必须仍然使肽转移酶具有活性但具有低的与真菌毒素结合的能力。
因而，本发明的另一个方面是一种用修饰的Rpl3基因转化的植物，其中该转化植物对镰孢霉感染的抗性提高。
本发明又一方面提供了一种用修饰的Rpl3基因转化的动物，其中该转化的动物对单端孢菌毒素的耐受性提高。
本发明再一方面提供了一种赋予对镰孢霉感染的抗性的方法，包括以下步骤：提供一种修饰的基因，其中所说的基因的野生形式编码一种核糖体蛋白质L3；并用所说的修饰的基因转化一种适当的植物。
本发明再一方面提供了一种提高动物对单端孢菌毒素耐受性的方法，包括以下步骤：提供一种修饰的基因，其中所说的基因的野生形式编码一种核糖体蛋白质L3；并用所说的修饰的基因转化一种适当的动物。
本发明的又一方面是该修饰的基因在转化实验中作为选择性标记的应用。诸如来自细菌转座子的新霉素磷酸转移酶npt II，或潮霉素磷酸转移酶hpt，或者哺乳动物二氢叶酸还原酶基因dhfr的选择性标记基因已被成功地应用于许多植物系统中(Sproule等，1991，理论应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)82：450-456；Dijak等，1991，植物细胞组织和器官培养25：189-197)。这些基因在转基因植物筛选中和在原生质体水平筛选体细胞杂种的情况下，分别允许使用抗生素卡那霉素，潮霉素和氨甲蝶呤。或者选择策略在进行多重转化的科学研究中具有实用性，也就是说用几种不同的基因对一个植物进行重复转化。为达到这一目的，需要新的和有效的选择试剂。在转基因生物体中使用抗生素降解或解毒基因是不允许或不期望的情况下，基于解毒化合物而不是抗生素的基因的新的筛选策略也是有用的。在这种情况下，需要一种基因，它赋予一种作为选择性标记的有用的表型(疾病抗性)。
根据本发明，暴露于DON的植物或动物细胞在这种毒素的存在下不能增值。用本发明的修饰的基因转化的细胞系对DON具有较大的抗性，并可在含有0.1ppm至50ppm的DON中生长。在本发明的一个实施例中，在选择培养基中可使用0.5至10ppm的DON。这样该修饰的基因可在转化实验中被用作选择性标记，其中，只有被含有该修饰的基因的载体转化的细胞系可在含有DON的选择培养基中生长。因而，例如，本发明的修饰的基因可与现在使用的提供对潮霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗性的基因相同的方式被用作植物或动物转化实验中的选择性标记。
虽然参照优选的实施方案对本发明进行详细描述，但所说的实施方案只是为了说明的目的，不限定本发明的范围。实施例实施例1水稻Rpl3基因的修饰
酵母Tcm1基因的野生型DNA序列得自酵母基因组测序项目的M.Bolotin-Fukuhara。将该Tcm1 DNA序列与突变型的tcm1序列比较后发现一个单一的碱基对的变化。这一变化在推定的PRL3蛋白质(图1)的残基255发生一个色氨酸(Tcm1)至一个半胱氨酸的变化(tcm1)。
在本发明的这一实施例中，相应的水稻Rpl3基因发生了一种类似于酵母木霉素抗性基因(tcm1)的形式的转化。
水稻Rpl3 cDNA含有一个21bp的5’非编码区域，一个1170bp的编码区域，和一个177bp的3’非编码区域(包括部分聚A尾)，它是由Dr.A.Kato(Hokkaido University，Japan)惠赠的。该cDNA(原名为T82，现名为pOSRPL3)是以在pIBI31的SmaI/EcoRI位点的1368bp的插入物接收的。该水稻cDNA是从水稻悬浮培养细胞(Uchimaya等，1992，植物杂志(Plant J.)2：1005-1009)中随机克隆的。数据库检索的结果显示与许多的核糖体蛋白质L3基因序列同源(Nishi等，1993，Biochimicaet Biophysica Acta 1216：110-112)。
由水稻Rpl3和酵母Tcm1基因编码的蛋白质具有65％的氨基酸相同性。在酵母等位基因之间观察到的色氨酸-至-半胱氨酸的变化位于一个水稻基因中高度保守的区域；在水稻和酵母之间，5’端的第17个氨基酸，该色氨酸本身，和该色氨酸的3’方向的3个氨基酸完全保守(图2和表1)。
因而，使用定点诱变来修饰水稻Rpl3 cDNA，使其在关键的位点类似于酵母tcm1基因。
用XbaI和NaeI消化pOSRPL3，产生一个1722bp的包括Rpl3 cDNA的片断。将该片断亚克隆进pALTER-EX1载体(Promega)的XbaI/HpaI位点并将其命名为pALTRPL3。使用一个18bp的寡核苷酸(5’-GGCTGGATGGCAGGCACC；SEQ ID NO：4)借助于Altered Sites kit(Promega)产生所需的突变。DNA测序证实了该诱变是成功的，并将得到的克隆命名为pALTRPLC4。实施例2载体构建和转化
在水稻Rpl3 TAG终止密码子8bp上游的XbaI位点和EcoRI位点被用于将没有修饰或修饰形式的基因亚克隆进pCAMterX。PCAMterX衍生于pBIN19(Bevan，M，1984，核酸研究，12：8711-8721；图3)并具有一个70SCaMV启动子，多克隆位点，并增加了nos 3’终止子。含有亚克隆进pCAMterX的没有修饰的和修饰的Rpl3基因的质粒(图4)分别被命名为pCARPL3和pCARPLC4。这两个克隆被转化进农杆菌菌株GV3101/pmp90，随后被用于转化Nicotiana tabacum培育种Delgold和N.debneyi。转化的N.tabacum和N.debneyi的品系在含有150mg/L卡那霉素的再生培养基(Sproule等，1991，理论应用遗传学，82：450-456)上进行选择。实施例3烟草转化
将含有没有修饰的和修饰的Rpl3基因(分别为pCARPL3和pCARPLC4)的载体用于转化野生型烟草(Nicotiana tobacum)和一种野生的双倍体品种N.debneyi。两种基因以相同的频率被转移进这些烟草品种中，这表明它们中没有一种对生长，再生，或种子生成具有负面效应。例如，分别有70和63个独立的N.debneyi转基因品系发现有pCARPL3和pCARPLC4基因。对这些转基因植物的种子进行的Southern杂交结果和子代检测被用于证实这些选出的用于进行详细分析的植物具有单拷贝的插入物。实施例4原生质体分离和培养
将从转基因的N.tabacum和N.debneyi收获的种子在70％Javex溶液中处理2-3分钟，然后在无菌蒸馏水中浸洗5次进行表面消毒。将它们种植在(每个60×20mm培养皿上20个种子)琼脂糖固化的含有150mg/L卡那霉素的B5培养基(Gibco)表面上，并保持在25℃和16小时日长的100uE m sec的光照下。选择后的两周之后将发芽并保持绿色的小苗转移至新的缺乏卡那霉素的半强度MS培养基(Gibco)的培养皿中。这些植物在25℃温室中和16小时日长的100uE m sec的光照下被保持在无菌Magenta容器内。
从叶肉细胞进行的原生质体分离是按照Sproule等(1991，理论应用遗传学，82：450-456)的方法进行的。将1％(w/v)纤维素酶R-10和解析酶R-10在0.45M甘露醇盐溶液的酶溶液进行无菌过滤，并将20ml的等份试样加入无菌的100×15mm培养皿中。剪取每种供体植物的五片叶子，并将背轴面向下飘浮在酶溶液中。用封口膜将培养皿封闭，在一个28℃的暗培养箱中在一个潮湿的盒子中温浴17小时，并轻微摇动。通过一个无菌的88微米网眼的尼龙漏斗过滤将解离的原生质体与组织碎片分开。将原生质体-酶溶液的等份试样装入圆底的无菌玻璃试管中，并在900转/分离心10分钟。将分离的原生质体通过在4ml具有0.5ml的SCM(0.45M山梨糖，10mg/L CaCl2.2H2O，5mg/L MES吗啉代乙烷磺酸；pH5.8)覆盖膜的无菌0.6M蔗糖溶液表面上悬浮与细胞碎片分开。从SCM界面中用无菌的吸管收集纯化的原生质体。将原生质体用血细胞计数器将浓度在含有0.4M葡萄糖作为渗压剂的液体NT培养基中(Nagata和Takebe，1991，Planta 99：12-20)调整至5×104细胞/ml。
DON的贮存溶液是按照Greenhalgh等的方法制备的(1986，J.Agric.Food Chem.34：98-102)，将其用于调整一些原生质体培养物中的DON毒素的浓度，使其浓度为0，0.1，1.0，5.0，或10.0ppm。所有的原生质体培养物为2ml液体，在无菌的60×15mm培养皿中在28℃在黑暗中进行温浴。在培养一周之后，通过加入0.5ml的含有0.3M葡萄糖的NT培养基调整培养基中的渗压剂的浓度，并将原生质体培养物转移至25℃低光照下(10uE m sec)。
野生型植物显示出对培养基中的0.5至10ppm的DON敏感。DON对这些原生质体的效应是与不存在DON的培养相比降低原生质体重新形成细胞壁的能力，降低分裂频率(细胞的有丝分裂指数)，和降低铺板效率(微小集落形成的数目)。
基因型Rpl3：c258(C4品系)的原生质体的存活性在添加了0.5至25ppm DON的培养基中培养20天后没有受到显著影响。而含有Rpl3：c258的原生质体的存活率在不存在DON的情况下为约65％，当这些原生质体被培养在含有25ppm的DON时存活率为56％。来自野生型烟草的原生质体当被培养在添加了25ppm的DON的NT培养基中时的存活率为18％，而来自具有水稻Rpl3基因(C3品系)的转基因植物的原生质体的存活率低于10％。这种对叶肉原生质体的效应的原因不是每种基因型的总效应，因为在不存在DON时，每种品系在NT培养基中的存活率为58％至66％范围内。当这些原生质体在真菌毒素DON存在下被培养时基因型之间的显著差异就变得更为明显。
也将原生质体培养在60×15mm培养皿内的2ml琼脂糖底铺层(0.4％w/v)上。该琼脂糖底铺层含有0，0.1，1.0，10，或25ppm DON。在这些培养中的原生质体以1×105/ml的浓度被悬浮在液体NT培养基中，并以Sproule等(1991，理论应用遗传学82：450-456)的方法进行培养。
当原生质体被培养在添加了DON的培养基中时，可观察到微小集落形成(从分离的原生质体形成的细胞集落)的显著变化。从含有Rpl3的原生质体形成的集落并不经常发展成愈伤组织，因而不将其转移至再生培养基，而含有Rpl3：c258的微小集落可被转移至再生培养基。实施例5细胞悬浮培养
来自初级转基因或野生型烟草植物的细胞悬浮培养物是从叶愈伤组织培养物起始的。将两克的愈伤组织在无菌的研磨器中进行研磨，将匀浆化的组织在无菌的125mlErlenmeyer烧瓶中用于接种33ml的含有2mg/L 2，4-D液体MS培养基。将细胞悬浮液在25℃在16小时日长的条件下保持在一个150转/分的轨道振荡器上，每周将5-10ml的细胞在33ml新鲜的培养基中进行亚培养。
在培养物在生长条件下平衡12周后对细胞悬浮物的生长进行测定。对增重的程度是通过将1ml的细胞悬浮物铺板在无菌的Whatman滤纸上进行测定的，该滤纸放置在10ml琼脂糖固化的含有0或25ppmDON的MS培养基上。以4天的间隔对每一个滤纸新鲜重量在无菌条件下进行测定，然后将细胞在相同的培养基中进行重新培养。两种基因型的细胞当转移至琼脂糖固化的添加了卡那霉素的培养基中是具有相同的生长能力，表明了这些培养物中转基因的稳定性和存在。
细胞体积的增长是通过将5ml的细胞接种至35ml添加了0或25ppm的液体MS培养基中进行测定的。以3天的间隔将每个烧瓶的整个内含物转移至无菌的锥形刻度管中，并记录群集的细胞的体积(表2)。将细胞放回相同的培养基中进行培养。
                          表2
在DON存在和不存在下转基因烟草细胞生长12天后的平均体积增长
      细胞系     DON的浓度(ppm)        体积增长的平均％
        C4            0                     45
        C3            0                     40
        C4            25                    41
        C3            25                    13
DON在25ppm时足以抑制群集细胞体积，以及pCARPL3植物的细胞悬浮物的鲜重增加。这些DON水平对pCARPLC4植物的培养物的群集细胞体积，或细胞鲜重增加的影响较小(表3和图5a和图5b)。
                          表3
在DON存在和不存在下转基因烟草细胞生长16天后的平均生长速率
      细胞系     DON的浓度(ppm)     重量增长的平均％
        C4            0                   22.5
        C3            0                   24.5
        C4            25                  21.5
        C3            25                  8.5
DON也可抑制从野生型和pCAPRL3植物的叶体外培养的叶外植体上形成愈伤组织，而来自pCARPLC4植物的外植体可在DON的存在下再生。实施例6单子叶植物转化
将没有修饰的Rpl3和修饰的Rpl3：c258基因在水稻肌动蛋白启动子和内含子元件(由纽约康奈尔大学的吴瑞教授提供的pCORl3)的控制下克隆进单子叶植物表达载体，分别提供pActRPL3和pActRPLC4，以在单子叶植物中进行组成型表达。这些构建体通过粒子轰击被导入玉米胚发生组织培养物的细胞，这种胚发生组织培养物衍生于玉米A188×B73的不成熟F1胚胎。为了得到转基因细胞系，每个构建体与含有Bar基因的选择性除草剂抗性基因pAHC25(由Dr.Peter Quail，UCBerkeley Ca提供)共同轰击，并建立phosphinothricin抗性培养。对这些培养物进行的Southern印迹分析鉴别出了具有整合进高分子量玉米DNA的RPL3和RPLC4的细胞系。实施例7转基因单子叶植物培养物
许多研究工作表明各种单子叶植物组织的生长被DON抑制。Bruins等(1993，植物科学(Plant Sci.)94：195-206)证实DON降低小麦花药衍生的愈伤组织的生长。10mg/L浓度的DON足以显著抑制成熟的玉米胚胎的生长(McLean，1996，Mycopathologia 132：173-183)。100mg/L剂量的DON对大多数小麦愈伤组织来说是致死性的(Menke-Milczarek和Jimny，1991，Mycotox.Res.7：146-149)。
通过Southern分析选择出具有低拷贝数目转基因的RPL3和RPLC4的每种中一个细胞系。来自这两个细胞系的愈伤组织经历了相同的选择过程并具有相同的日龄。对这两个细胞系检测其在含有0至25mg/L DON的培养基上生长的能力。在含有DON的培养基上生长的愈伤组织显示出RPLC4细胞系对真菌毒素具有明显强的耐受性。在5mg/L DON时RPL3的生长降低至对照的15％，而在相同水平的DON时RPLC4降低至对照的63％。为将RPLC4细胞系的生长降低至对照值的15％需要50mg/L DON。这表示RPLC4愈伤组织对DON的耐受性提高了10倍。
                       表4
DON对用pActRPL3和pActRPLC4转化的玉米胚胎发生培养物
                (A188×B73)的生长的效应起始干重-RPL3＝1.4mg，RPLC4＝1.5mg。在25℃在黑暗中培养3周之后的最终干重。12外植体/处理
                       DON mg/L
            0        5        10       25      50PActRPL3      31.1     4.9      3.3      3.2     2.2PActRPLC4     29.8     18.7     13.1     7.0     4.4将这些植物进行自交，建立纯合子品系，并在野外种植进行镰孢霉抗性研究。
所有的学术出版物和专利文献引入本文作为参考。
对本发明的优选实施方案进行了描述。但是，对于本领域普通技术人员来说可以进行多种变化和修改而不脱离本发明权利要求限定的范围。
                          序列表(1)总信息：
(i)申请人：
   (A)名称：加拿大农业和农业食品部
   (B)街道：Central Experimental Farm
   (C)城市：Ottawa
   (D)州：Ontario
   (E)国家：Canada
   (F)邮编：K1A 0C6
   (A)姓名：Linda J.Harris
   (B)街道：6495 Wheatfield Cres.
   (C)城市：Greely
   (D)州：Ontario
   (E)国家：Canada
   (F)邮编：K4P 1E8
   (A)姓名：Stephen C.Gleddie
   (B)街道：33 Leonard Ave.
   (C)城市：Ottawa
   (D)州：Ontario
   (E)国家：Canada
   (F)邮编：K1S 4T8
   (A)姓名：John A.Simmonds
   (B)街道：130 Amberwood Cres.
   (C)城市：Nepean
   (D)州：Ontario
   (E)国家：Canada
   (F)邮编：K2E 7H8
(ii)发明名称：通过核糖体蛋白质L3基因的修饰植物和动物对单端孢菌毒素的耐受
(iii)序列数目：4
(iV)计算机可读形式
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机IBM PC兼容
   (C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征
   (A)长度：387氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(Xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe1               5                   10                  15Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala ser Ile Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe
         20                  25                  30Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly
     35                  40                  45Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr Ile Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly
 50                  55                  60Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp65                  70                  75                  80Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro
            85                  90                  95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp
        100                 105                 110Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys
    115                 120                 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gln Asp Gly Ala Gly Ile
130                 135                 140Glu Arg Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val145                 150                 155                 160Leu Val His Thr Gln Ile Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gln Lys Lys Ala
            165                 170                 175His Leu Ala Glu Ile Gln Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ser Glu Lys Val
        180                 185                 190Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val
    195                 200                 205Phe Glu Gln Asn Glu Met Ile Asp Ala Ile Ala Val Thr Lys Gly His
210                 215                 220Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg225                 230                 235                 240Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Trp His
            245                 250                 255Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gln Arg Gly Tyr
        260                 265                 270His Ser Arg Thr Ser Ile Asn His Lys Ile Tyr Arg Val Gly Lys Gly
    275                 280                 285Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr
290                 295                 300Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu Ile Lys Asn Asp305                 310                 315                 320Phe Ile Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg Ile Val
            325                 330                 335Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu
        340                 345                 350Glu Val Ser Leu Lys Trp Ile Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly
    355                 360                 365Arg Phe Gln Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys
370                 375                 380Lys Asp Leu385(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征
   (A)长度：387氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(Xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe1               5                   10                  15Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe
        20                  25                  30Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly
    35                  40                  45Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr Ile Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly
50                  55                  60Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp65                  70                  75                  80Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro
            85                  90                  95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp
        100                 105                 110Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys
    115                 120                 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gln Asp Gly Ala Gly Ile
130                 135                 140Glu Arg Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val145                 150                 155                 160Leu Val His Thr Gln Ile Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gln Lys Lys Ala
            165                 170                 175His Leu Ala Glu Ile Gln Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ser Glu Lys Val
        180                 185                 190Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val
    195                 200                 205Phe Glu Gln Asn Glu Met Ile Asp Ala Ile Ala Val Thr Lys Gly His
210                 215                 220Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg225                 230                 235                 240Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Cys His
            245                 250                 255Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gln Arg Gly Tyr
        260                 265                 270His Ser Arg Thr Ser Ile Asn His Lys Ile Tyr Arg Val Gly Lys Gly
    275                 280                 285Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr
290                 295                 300Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu Ile Lys Asn Asp305                 310                 315                 320Phe Ile Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg Ile Val
            325                 330                 335Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu
        340                 345                 350Glu Val Ser Leu Lys Trp Ile Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly
    355                 360                 365Arg Phe Gln Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys
370                 375                 380Lys Asp Leu385(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征
   (A)长度：389氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(Xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ser His Arg Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly Ser Leu Gly Phe1               5                   10                  15Leu Pro Arg Lys Arg Ser Ser Arg His Arg Gly Lys Val Lys Ser Phe
        20                  25                  30Pro Lys Asp Asp Val Ser Lys Pro Cys His Leu Thr Ser Phe Val Gly
    35                  40                  45Tyr Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Glu Val Glu Lys Pro Gly
50                  55                  60Ser Lys Leu His Lys Lys Glu Thr Cys Glu Ala Val Thr Ile Ile Glu65                  70                  75                  80Thr Pro Pro Leu Val Ile Val Gly Leu Val Ala Tyr Val Lys Thr Pro
             85                 90                  95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser Val Trp Ala Gln His Leu Ser Glu
        100                 105                 110Glu Val Arg Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Cys Lys Ser Lys Lys Lys
    115                 120                 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ala Leu Lys Tyr Asp Ser Asp Ala Gly Lys Lys
130                 135                 140Glu Ile Gln Met Gln Leu Glu Lys Met Lys Lys Tyr Ala Ser Ile Val145                 150                 155                 160Arg Val Ile Ala His Thr Gln Ile Arg Lys Met Lys Gly Leu Lys Gln
            165                 170                 175Lys Lys Ala His Leu Met Glu Ile Gln Ile Asn Gly Gly Thr Ile Ala
        180                 185                 190Asp Lys Val Asp Tyr Gly Tyr Lys Phe Phe Glu Lys Glu Ile Pro Val
    195                 200                 205Asp Ala Val Phe Gln Lys Asp Glu Met Ile Asp Ile Ile Gly Val Thr
210                 215                 220Lys Gly Lys Gly Tyr Glu Gly Val Val Thr Arg Trp Gly Val Thr Arg225                 230                 235                 240Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly
            245                 250                 255Ala Trp His Pro Ala Arg Val Ser Tyr Thr Val Ala Arg Ala Gly Gln
        260                 265                 270Asn Gly Tyr His His Arg Thr Glu Met Asn Lys Lys Val Tyr Lys Ile
    275                 280                 285Gly Lys Ser Gly Gln Glu Ser His Ala Ala Cys Thr Glu Phe Asp Arg
290                 295                 300Thr Glu Lys Asp Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Pro His Tyr Gly Val305                 310                 315                 320Val Lys Gly Asp Tyr Leu Met Ile Lys Gly Cys Cys Val Gly Pro Lys
            325                 330                 335Lys Arg Val Val Thr Leu Arg Gln Ser Leu Leu Lys Gln Thr Ser Arg
        340                 345                 350Leu Ala Leu Glu Glu Ile Lys Leu Lys Phe Ile Asp Thr Ser Ser Lys
    355                 360                 365Phe Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Thr Asp Glu Lys Gln Arg Phe Phe
370                 375                 380Gly Lys Leu Lys Ala385(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征
   (A)长度：18碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝”寡聚体”
(Xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
GGCTGGATGG CAGGCACC
18

Claims (26)

1.一种修饰的基因，其中所述的基因的野生型形式编码核糖体蛋白质L3，并且其中用所说的修饰的基因转化的宿主对单端孢菌毒素的抗性提高，先决条件是所说的基因不是来自啤酒酵母。
2.按照权利要求1所述的修饰的基因，其中该基因是通过碱基对的替换，缺失，增加或颠换进行修饰的，其中该修饰足以降低真菌毒素的结合能力，但不足以破坏肽基转移酶的活性。
3.按照权利要求2所述的修饰的基因，其中基于酵母基因的氨基酸编号该修饰发生在氨基酸240和263之间。
4.按照权利要求3所述的修饰的基因，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因来源于水稻，Arabidopsis thaliana，单子叶植物，大鼠，小鼠，人类，酵母，雅致弯梗霉(C.Elegans)或大肠杆菌。
5.按照权利要求4所述的修饰的基因，其中该编码Rpl3基因的基因是一种水稻基因。
6.按照权利要求5所述的修饰的基因，其中该基因具有编码示于SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其功能等同体的序列。
7.一种含有权利要求1所述的修饰的Rpl3基因的克隆载体。
8.按照权利要求7所述的克隆载体，其中该基因是通过碱基对的替换，缺失，增加或颠换进行修饰的，其中该修饰足以降低真菌毒素的结合能力，但不足以破坏该基因的核糖体蛋白质的功能。
9.按照权利要求8所述的克隆载体，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因来源于水稻，Arabidopsis thaliana，单子叶植物，大鼠，小鼠，人类，酵母，雅致弯梗霉或大肠杆菌。
10.按照权利要求9所述的克隆载体，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因是一种水稻基因。
11.按照权利要求10所述的克隆载体，其中该基因具有编码示于SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其功能等同体的序列。
12.一种用权利要求1的修饰的Rpl3基因转化的转化植物，其中所说的转化植物对镰孢霉侵袭的抗性提高。
13.按照权利要求12所述的植物，其中该基因是通过碱基对的替换，缺失，增加或颠换进行修饰的，其中该修饰足以降低真菌毒素的结合能力，但不足以破坏该基因的核糖体蛋白质L3的功能。
14.按照权利要求13所述的植物，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因来源于水稻，Arabidopsis thaliana，单子叶植物，大鼠，小鼠，人类，酵母，雅致弯梗霉或大肠杆菌。
15.按照权利要求14所述的植物，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因是一种水稻基因。
16.按照权利要求15所述的植物，其中该基因具有编码示于SEQ IDNO：3的氨基酸序列或其功能等同体的序列。
17.按照权利要求12所述的植物，其中该植物选自下组：玉米，大麦，小麦，水稻，黑麦，燕麦和谷子。
18.由权利要求12至17中任意一项所述的转化植物产生的种子。
19.一种用权利要求1的修饰的Rpl3基因转化的转化动物，其中所说的转化动物对单端孢菌毒素的耐受性提高。
20.按照权利要求19所述的动物，其中该基因是通过碱基对的替换，缺失，增加或颠换进行修饰的，其中该修饰足以降低真菌毒素的结合能力，但不足以破坏该基因的核糖体蛋白质L3的功能。
21.按照权利要求20所述的动物，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因来源于水稻，Arabidopsis thaliana，单子叶植物，大鼠，小鼠，人类，酵母，雅致弯梗霉或大肠杆菌。
22.按照权利要求21所述的动物，其中该编码核糖体蛋白质L3的基因是一种水稻基因。
23.按照权利要求22所述的动物，其中该基因具有编码示于SEQ IDNO：3的氨基酸序列或其功能等同体的序列。
24.一种通过用权利要求1所述的修饰的基因转化一种适当的植物提高对镰孢霉侵袭的抗性的方法，其中，用所说的基因转化的植物具有提高的对单端孢菌毒素的抗性，并且其中所说的方法包括以下步骤：
提供一种修饰的基因，和
用所说的基因转化一种适当的植物。
25.一种通过用权利要求1所述的修饰的基因转化一种适当的动物提高对单端孢菌毒素的耐受性的方法，其中，用所说的基因转化的动物具有提高的对单端孢菌毒素的耐受性，并且其中所说的方法包括以下步骤：
提供一种修饰的基因，和
用所说的基因转化一种适当的动物。
26.一种使用权利要求1所述的修饰的基因作为动物或植物转化实验中的选择性标记的方法。
CN98808745A 1997-08-12 1998-07-29 通过核糖体蛋白质l3基因的修饰植物和动物对单端孢菌毒素的耐受 Pending CN1268974A (zh)

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