CN1411510A - 植物的光周期敏感性基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明人从水稻中通过连锁分析成功地分离出一种光周期敏感性基因Hdl。本发明发现，植物的光周期敏感性可通过导入该基因或控制该基因的表达而得到改变。本发明还证实，植物的光周期敏感性可通过检测该功能性基因的存在或缺乏来评价。

Description

植物的光周期敏感性基因及其用途

                             技术领域

本发明涉及与植物的光周期敏感性有关的基因，以及用这些基因改变植物的光周期敏感性的方法。改变植物的光周期敏感性的方法对植物品种改良十分有用。

                             背景技术

一般情况下，水稻的抽穗(开花)在短昼(short-day)时提前而长昼(long-day)时延迟。在已知的栽培品种中，通常是那些来自九州岛和日本大陆南部的品种具有较强的光周期敏感性，而来自Tohoku区或Hokkaido的品种完全丧失了这种敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生长期后有特征性的开花，该植物的抽穗期不随光周期的改变而变化。水稻植物对栽培地点和时间的适应性根据该植物中光周期敏感性的存在而彻底不同。因此，改变水稻的光周期敏感性对于水稻品种改良十分重要。

在常规品种改良项目中，水稻抽穗期通过涉及以下方面的方法来改变：(1)通过杂交选择早熟品种或晚熟品种；和(2)通过辐射和化学试剂进行诱变；等。但是，这类品种改良项目的成功需要较长时间，并存在其它问题，如不能预计后代中突变的程度或方向。

“光周期敏感性基因”是在水稻遗传学领域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名称。已发现多个光周期敏感性基因的存在在突变体和栽培品种中是固有的，还提示光周期敏感性基因存在于，例如，Se1基因座(6号染色体；Yokoo和Fujimaki(1971)Japan.J.Breed.21：35-39)，E1基因座(7号染色体；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51：115-128；Okumoto，Y.et al.(1992)Jpn.J.Breed.42：415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3号染色体？；Okumotoet al.Japanese Society of Breeding，9lst lecture，Japanese Journal of Breeding47(Suppl.1)：31)；和其它类似基因座(Yamagata et al.(1986)In Rice genetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。

分离水稻的光周期敏感性基因使得能通过转化方法将这些基因导入任意品种，从而改变这些品种的光周期敏感性，并最终能调节水稻的抽穗期。因此，用这些基因进行品种改良是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法。

但至今未见关于水稻光周期敏感性基因的分离的报道。

                       发明内容

本领域的上述需要导致本发明，本发明的目的是提供新的植物光周期敏感性基因，尤其是来自水稻的基因。本发明另一目的是用这些基因改变植物的光周期敏感性，从而改变植物的开花时间。本发明的另一目的是提供评价植物的光周期敏感性的方法。

本发明人关注于需要通过简单方法改变其抽穗期的那些水稻，并进行了深入研究以分离与水稻光周期敏感性基因相关的基因。

从Nipponbare和Kasalath杂交的后代中鉴定出了一种定量特征基因座Hd1，它位于6号染色体上。此外，用近似纯合系对具有Nipponbare遗传背景的Hd1区(Kasalath的等位基因)进行了分析(Yamamoto et al.(1996)Abstract for Plant Genome IV.p124)，揭示Hd1基因座与光周期敏感性相关(Lin et al.(1999)Abstract for Plant Genome VII，p160；Yano et al.Breedingscience.Supplement，47(2)，p224)。此外，考虑到染色体上的位置，有观点认为Hd1可能与以前报道的光周期敏感性基因座Se1位于相同的基因座上；但迄今没有直接证据。

本发明人首先对Hd1基因区进行连锁分析并与酵母人工染色体(YAC)克隆进行对比排列，以便分离出光周期敏感性基因Hd1(尽管已证实它的存在，但从未被鉴定过)。

具体地，本发明人对一个大的、隔离的群体进行了连锁分析，这种分析是分离Hd1基因所必需的。连锁分析用集中取样法进行。还利用与在水稻基因组研究项目(Rice Genome Research Program，RGP)中构建的YAC克隆进行对比排列来确定Hd1基因座周围的YAC克隆。此外，还分离到所测定的YAC克隆Y4836的末端DNA片段，并作为RFLP标志进行分析。结果发现，YAC克隆Y4836包含Hd1基因区(图1)。

然后，本发明人利用P1衍生的人工染色体(PAC)克隆对Hd1基因区进行对比排列，以便限定Hd1基因的候选区。更具体地，使用通过上述分析发现的Hd1基因区周围的DNA标志从Nipponbare基因组文库中选出2个PAC克隆，据认为它们包含这些核苷酸序列。此外，通过PCR对选出的PAC克隆进行检查发现，其中一个克隆P0038C5包含对应于S20418和Y4836R的核苷酸序列，它完全覆盖了Hd1座位(图1)。

本发明人通过分析PAC克隆P0038C5的核苷酸序列，成功地将可能存在Hd1候选基因的区域定位在一个约12kb的区域。针对该候选区的核苷酸序列进行了基因预测分析和同源性搜索。发明人发现一个与过氧化物酶S25391以及拟南芥(Arabidopsis)CO高度相似的区域，其中所述S25391是作为水稻EST而获得的，所述拟南芥CO能促进在长昼条件下开花(其被认为是具有锌指结构域的转录调节基因)。

对预测的具有锌指结构域的基因是否就是Hd1基因的候选者进行进一步分析，发现在Kasalath的该候选基因区(ORF)内11个位点有突变(核苷酸插入、缺失和取代)(图2)。此外，还对se1突变系HS66和HS110及其亲本品种Ginbozu的候选基因区进行了分析。结果发现，Ginbozu的含有Se1基因的核苷酸序列与Nipponbare的相应序列相比，除了多一个额外的36-bp序列和一个核苷酸取代，其它完全相同。与Ginbozu的核苷酸序列相比，突变品种HS66和HS110中有突变(图2)。根据这些结果，可将具有锌指结构的候选基因判定为Hd1基因的潜在候选者。

而且，Hd1候选基因的表达分析表明，在一个Hd1基因区已经被Kasalath的染色体片段取代的近似纯合系(NIL(Hd1))中，表达水平显著低于在Nipponbare中的。在Ginbozu中检测到类似于在Nipponbare中的转录水平。另一方面，在突变株HS66和HS110中发现了大小不同于Ginbozu中的转录子。考虑到转录与稻田中到抽穗所需的天数之间的关系，本发明人发现，在出现正常转录的情况中(在Nipponbare和Ginbozu中)到抽穗所需的天数增加，而在检测到异常转录的情况中，到抽穗所需的天数减少(表1)。根据这些结果，本发明人得出结论：所述候选基因区确实是Hd1基因，而Se1基因座与Hd1基因座是相同的。

为了证实Hd1候选基因具有赋予水稻植物以光周期敏感性的功能，通过用Kasalath的光周期敏感性基因取代Nipponbare的相应区，而将一个携有该基因的基因组区导入缺乏光周期敏感性的品种中。结果在整合了所述候选基因的植株中，抽穗在短昼条件下提前。由于一般情况下，抽穗在短昼条件下提前是由于光周期敏感性高，因此认为Hd1候选基因具有提高光周期敏感性的功能。

换而言之，本发明人成功分离出一种与植物的光周期敏感性相关的基因。本发明人还发现，通过利用该基因可改变植物的光周期敏感性，和评价植物的光周期敏感性，因此完成本发明。

更具体地，本发明提供：

(1).一种编码植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA选自：

(a)编码含有SEQ ID NO：1或3所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)编码含有SEQ ID NO：1或3所示氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；

(c)能在严谨条件下与由SEQ ID NO：2或4所示核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

(2).如(1)所述的DNA，其中该DNA来自水稻。

(3).一种DNA，其编码与(1)或(2)所述DNA的转录产物互补的反义RNA。

(4).一种DNA，其编码具有特异性消化(1)或(2)所述DNA之转录产物的核酶活性的RNA。

(5).一种DNA，其编码能通过在植物细胞中表达而利用共抑制效应来抑制(1)或(2)所述DNA的表达的RNA。

(6).如(1)或(2)所述DNA，其中该DNA用于提高植物的光周期敏感性。

(7).如(3)-(5)中任一项所述的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。

(8).一种载体，其含有如(1)-(5)中任一项所述的DNA。

(9).一种植物细胞，其被如(8)所述的载体转化。

(10).一种植物转化体，其含有如(9)所述的植物细胞。

(11).如(10)所述的植物转化体，其中所述植物转化体为水稻。

(12).一种植物转化体，它是(10)或(11)所述植物转化体的后代或克隆。

(13).如(10)-(12)中任一项所述的植物转化体的繁殖材料。

(14).一种产生如(10)或(11)所述植物转化体的方法，它包括以下步骤：

(a)将(1)或(2)所述的DNA导入植物细胞，和(b)从该植物细胞再生植物。

(15).一种提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在该植物体中表达如(1)或(2)所述DNA的步骤。

(16).如(15)所述的方法，其中依赖于光周期的植物开花时间通过提高该植物的光周期敏感性而延迟。

(17).一种降低植物的光周期敏感性的方法，该方法包括抑制该植物体的细胞中如(1)或(2)所述DNA表达的步骤，其中所述DNA为该植物细胞的内源性DNA。

(18).如(17)所述的方法，其中如(3)-(5)中任一项所述DNA是在该植物体的细胞内表达。

(19).如(17)或(18)所述的方法，其中依赖于光周期的该植物的开花时间通过降低该植物的光周期敏感性而提前。

(20).如(15)-(19)中任一项所述的方法，其中所述植物是水稻。

(21).一种评价植物的光周期敏感性的方法，它包括检测该植物中如(1)所述的DNA存在与否的步骤。

(22).如(21)所述的方法，其中所述植物是水稻。

(23).一种宿主细胞，其中已插入了携有(1)或(2)所述DNA的载体。

(24).由(1)或(2)所述的DNA编码的蛋白。

(25).一种产生(24)所述蛋白的方法，它包括以下步骤：培养(23)所述宿主细胞；使该宿主细胞表达该DNA所编码的重组蛋白；并从该宿主细胞或其培养上清中回收该重组蛋白。

(26)与(24)所述蛋白结合的抗体。

(27).一种DNA，其中至少15个核苷酸与由SEQ ID NO：2或4所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补。

本发明提供了编码来自水稻的Hd1蛋白的DNA。Nipponbare的Hd1基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2或4。由该DNA编码的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。此外，Ginbozu的Hd1基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：4，由该DNA编码的蛋白的氨基酸序列示于SEQ IDNO：3。

Hd1是用Nipponbare和Kasalath的杂交后代检测出的定量特征基因座(quantitative trait loci，QTL)之一，已知它位于6号染色体上。根据利用Hd1区有Nipponbare遗传背景的一个近似纯合系进行的试验还得知，Hd1基因座是光周期敏感性基因座。Hd1基因在短昼条件下能减少从播种到抽穗所需时间(到抽穗所需的天数)，而在长昼条件下能增加到达抽穗所需的天数。即，Nipponbare的Hd1基因能提高水稻的光周期敏感性，从而使该植物在自然田间(在近似于长昼的条件下)栽培时，推迟成熟期。已知Hd1基因是一种与植物的光周期敏感性有关的基因，它位于6号染色体上某一位置。但迄今仍未鉴定或分离到Hd1基因。本发明人通过复杂的实验，最终鉴定出了该基因所处的染色体区，并首次成功地将该基因作为单个基因而分离出。

目前在日本，水稻品种改良的一个重要目标是控制水稻的抽穗期。在寒冷地区逃避由于秋季低温的早早到来而引起的低温损害是十分重要的。另一方面，在西南部温暖地区的大规模水稻种植区，为了减少收获过于集中而带来的繁重劳动，也需要提前或延迟抽穗期。

植物的抽穗期(花期)可通过用编码Hd1蛋白(它能提高植物的光周期敏感性)的DNA转化植物而延迟。或者，用反义方法或核酶方法来控制所述DNA的表达，也能降低光周期敏感性和使植物的花期提前。具体地，植物的花期可通过将编码Hd1蛋白的DNA以重组方式导入缺乏该DNA的植物中，和通过用反义、核酶等控制该DNA在具有该DNA的品种中的表达而多样化。因此可培育新的品种。

本发明编码Hd1蛋白的DNA包括基因组DNA、cDNA和化学合成的DNA。基因组DNA和cDNA可根据本领域已知的常规方法来制备。更具体地，基因组DNA可以如下制备：(1)从具有光周期敏感性基因的水稻品种(如Nipponbare或Ginbozu)中提取基因组DNA；(2)构建基因组文库(利用载体，如质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)；(3)将该文库铺板；和(4)利用根据编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：2或4)制备的探针进行菌落杂交或空斑杂交。或者，可利用特异性针对编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：2或4)的引物经PCR来制备基因组DNA。另一方面，cDNA可如下制备：(1)根据从具有光周期敏感性基因的水稻品种(如Nipponbare或Ginbozu)提取的mRNA合成cDNA；(2)通过将该合成的cDNA插入载体，如λZAP来制备cDNA文库；(3)将该cDNA文库铺板；和(4)如上所述进行菌落杂交或空斑杂交。或者，cDNA也可通过PCR来制备。

本发明包括能编码与SEQ ID NO：1或3所示Hd1蛋白功能等价的蛋白(Nipponbare或Ginbozu)的DNA。本文中术语“与Hd1蛋白功能等价”指目标蛋白具有提高植物的光周期敏感性的功能。这类DNA优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Gramineae)，最优选来自水稻。

这类DNA的实例包括编码含有SEQ ID NO：1或3所示氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的突变体、衍生物、等位基因变体、变体或同系物的那些DNA。

制备能编码含本领域技术人员熟知氨基酸改变的蛋白的DNA的方法包括定点诱变(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directed constructionof mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154：350-367，1987)。蛋白的氨基酸序列也可由于核苷酸序列的突变而自然突变。编码具有天然Hd1蛋白的氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、和/或添加的蛋白的DNA也包括在本发明的DNA中，只要它们编码与天然Hd1蛋白(SEQ ID NO：1或3)功能等价的蛋白。此外，不引起蛋白质中氨基酸序列改变的那些核苷酸序列突变体(简并突变体)也包括在本发明的DNA中。

对一种DNA是否编码能提高植物光周期敏感性的蛋白可如下进行评估：最普通的方法包括用所述DNA转化植物和将该植物培养在能改变光照时间长短的培养箱中。更具体地，使植物在短昼(通常9-10小时)或长昼(14-16小时)的条件下培养，比较在这些不同条件下生长的植物从播种到开花(如果是水稻，从播种到抽穗)所需的天数。在长昼和短昼条件下达到抽穗所需天数没有不同的那些植物被确定为缺乏光周期敏感性。在所述两种条件下达到抽穗所需天数有差异的那些植物被确定为具有光周期敏感性，而这种差异被视为该植物的光周期敏感程度。如果不能提供培养箱，可通过将植物在田间和在温室中以自然光照时间栽培而评估。具体地，将植物每20天播种一次，恒温自然光照培养，测定每种植物开花所需天数。一般情况下，具有较强光周期敏感性的水稻品种如果是在8月份-2月份期间播种则抽穗提前，如果在4月份-7月份期间播种则抽穗会延迟。另一方面，光周期敏感性较弱的水稻品种达到抽穗期所需时间不受播种季节的影响，也不因光照时间的长短而发生大的改变。

编码与SEQ ID NO：1或3所示Hd1蛋白功能等价的蛋白的DNA可通过本领域已知方法产生，这些方法包括杂交技术(Southern，E.M.：Journal ofMolecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是说，用Hd1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2或4)或其部分作为探针，用能与Hd1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2或4)特异性杂交的寡核苷酸作为引物，分离出与水稻和其它植物的Hd1基因高度同源的DNA是本领域的常规技术。这类能编码Hd1蛋白的功能等价蛋白的DNA可通过杂交技术或PCR技术获得，它们都包括在本发明的DNA中。

用于分离这类DNA的杂交反应优选在严谨条件下进行。本发明的严谨条件包括如下条件：6M尿素，0.4％SDS，和0.5xSSC；和那些产生类似严谨度的条件。能在较高严谨条件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1xSSC下杂交的DNA具有更高的同源性。在这类条件下分离的DNA预计能编码与Hd1蛋白(SEQ ID NO：1或3)具有较高氨基酸水平同源性的蛋白。本文中高同源性是指同一性至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％(如至少95％)。一种氨基酸序列或核苷酸序列与另一种序列的同源性程度可按照Karlin和Altschl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)所述BLAST算法来确定。BLASTN和BLASTX等程序都是根据该算法开发的(Altschul etal.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。为了根据基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，将参数设置为，例如score＝100和word length＝12。另一方面，用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时，所用参数包括score＝50和word length＝3。当使用BLAST和空隙化BLAST程序时，使用每种程序的默认参数。这类分析的特定技术是本领域已知的( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。

本发明的DNA可用于制备重组蛋白，产生已改变其光周期敏感性的植物转化体等等。

重组蛋白常如下制备：将编码本发明蛋白的DNA插入适当的表达载体，将该载体导入适当的细胞，培养转化的细胞，使这些细胞表达所述重组蛋白，和纯化所表达的蛋白。重组蛋白可表达为与便于纯化的其它蛋白融合的蛋白，如与大肠杆菌(Escherichia coli)麦芽糖结合蛋白(New England Biolabs，USA，载体pMAL系列)融合的蛋白，与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(AmershamPharmacia Biotech，vector pGEX series)融合的蛋白，或带有组氨酸标记(Novagen，pET系列)的融合蛋白。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达所述重组蛋白。除了上述大肠杆菌以外，可以使用酵母或各种动物、植物、或昆虫细胞。可通过本领域已知的各种方法将载体导入宿主细胞。例如，可用利用了钙离子的转化方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.53：158-162，(1970)；Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166：557-580，(1983))将载体导入大肠杆菌。表达在宿主细胞中的重组蛋白可用已知方法从所述宿主细胞或其培养上清中纯化和回收。当重组蛋白表达为与麦芽糖结合蛋白或其它配对物融合的蛋白时，该重组蛋白可通过亲和层析方便地纯化。

所得蛋白可用于制备能结合该蛋白的抗体。例如，可用本发明的纯化蛋白或其一部分免疫动物，如兔等，一段时间后收集血液并去除血凝块，从而制备多克隆抗体。将骨髓瘤细胞与用上述蛋白或其一部分免疫的动物的抗体生成细胞融合，分离能表达所需抗体的单克隆细胞(杂交瘤)，从所述细胞回收抗体，可获得单克隆抗体。所得抗体可用于纯化或检测本发明的蛋白。相应地，本发明包括能结合本发明蛋白的抗体。

提高了光周期敏感性的植物转化体可用本发明的DNA来产生。更具体地，可将编码本发明蛋白的DNA插入适当载体；将该载体导入植物细胞；然后使所得已经被转化的植物细胞再生。由本发明人分离的光周期敏感性基因Hd1能提高水稻的光周期敏感性并延迟水稻的抽穗期。因此，可通过用该基因转化各种品种并使它们表达来控制各种品种的抽穗期。转化所需时间相对于常规通过杂交进行的基因转移而言大大缩短。此外，转化不伴有其它特征改变，这一事实也是有利的。本文中新鉴定并分离了控制水稻抽穗期的基因，而对水稻抽穗期的控制由于本发明而首次变为可能。

另一方面，降低了光周期敏感性的植物转化体可利用能抑制编码本发明蛋白的DNA表达的DNA来产生：将该DNA插入适当载体，将载体导入植物细胞，然后使所得已转化的植物细胞再生。术语“抑制编码本发明蛋白的DNA表达”包括抑制基因转录以及抑制蛋白的翻译。它不仅包括彻底使DNA表达能力丧失，还包括降低表达水平。

植物中特定内源基因的表达可通过领域内常用的、利用了反义技术的方法来抑制。Ecker等人首次通过瞬时基因表达法证实了经电穿孔导入植物细胞的反义RNA的反义效应(J.R.Ecker和R.W.Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5372(1986))。此后，有报道在烟草和矮牵牛中通过表达反义RNA减少了靶基因的表达(A.R.van der Krol et al.，(1988)Nature 333：866)。如今反义技术已作为抑制植物中靶基因表达的一种成熟手段。

反义核酸抑制靶基因表达需要多种因素，包括：通过形成三链而抑制转录起始；通过在RNA酶形成局部开环结构的位点处形成杂合体而抑制转录；通过与被合成的RNA形成杂合体而抑制转录；通过在内含子与外显子连接处形成杂合体而抑制剪接；通过在剪接体形成位点形成杂合体而抑制剪接；通过与mRNA形成杂合体而抑制mRNA从核到细胞浆的转位；通过在加帽位点或poly A添加位点形成杂合体而抑制剪接；通过在翻译起始因子结合位点形成杂合体而抑制翻译的起始；通过在起始密码子附近的核糖体结合位点形成杂合体而抑制翻译；通过在已翻译区或在mRNA的多体结合位点形成杂合体而抑制肽链延伸；通过在核酸与蛋白相互作用的位点形成杂合体而抑制基因表达。这些因素通过抑制转录、剪接或翻译而抑制靶基因的表达(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(New BiochemistryExperimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei ToHatsugen(Replication and Expression of genes)”，Nihon Seikagakukai Hen(TheJapanese Biochemical Society)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。

本发明的反义序列可通过上述任何机制抑制靶基因的表达。在一个实施方案中，如果将反义序列设计成与所述基因的mRNA5’端附近的非翻译区互补，它就能有效抑制基因翻译。也有可能使用与编码区或非翻译区在3’侧互补的序列。因此，本发明中使用的反义DNA包括具有针对所述基因非翻译区和翻译区的反义序列的DNA。将所用的反义DNA连接在适当启动子下游，并优选将含有转录终止信号的序列连接在3’侧。将如此制备的DNA通过已知方法转染至目标植物中。优选反义DNA的序列是互补于转化植物的内源基因的序列或其一部分，但它不需要完全互补，只要它能有效抑制基因表达。所转录的RNA优选至少90％，最优选至少95％互补于靶基因的转录产物。为了用反义序列有效抑制靶基因的表达，该反义DNA应至少含有15个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，还更优选至少500个核苷酸。所用反义DNA通常短于5kb，优选短于2.5kb。

编码核酶的DNA也可用于抑制内源基因的表达。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶有很多种，它们具有不同的活性。对核酶作为RNA裂解酶的研究使得能设计出以位点特异性方式裂解RNA的核酶。一部分I组内含子型核酶或包含在RNA酶P中的M1RNA由至少400个核苷酸组成，而其它属于锤头型或发卡型的核酶具有约40个核苷酸的活性结构域(MakotoKoizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，和Enzyme)，35：2191(1990))。

锤头型核酶的自我裂解区在序列G13U14C15中C15的3’侧裂解。U14与第9位的A之间形成核苷酸对被认为对核酶活性是十分重要的。此外，已知当第15位的核苷酸是A或U而不是C时也发生裂解(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.228：225(1988))。如果将核酶的底物结合位点设计成与靶位点的邻近RNA序列互补，则能产生限制酶样RNA裂解性核酶，它识别靶RNA中的序列UC、UU、或UA(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.239：285(1988)；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，和Enzyme)，35：2191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.17：7059(1989))。例如，在Hd1基因(SEQ ID NO：2或4)的编码区中有多个可作为核酶作用目标的位点。

发卡型核酶也可用于本发明。发卡型核酶可在烟草环斑病毒的卫星RNA负链中找到(J.M.Buzayan，Nature 323：349(1986))。该核酶也能以靶特异性方式裂解RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751(1992)；Yo Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemisty和Biology)30：112(1992))。

设计用于裂解目标的核酶可与启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子融合，并与转录终止序列融合，使它能在植物细胞中转录。但如果在所转录的RNA的5’或3’端添加了额外的序列，核酶的活性可能丢失。在这种情况下，可另外安排一个能清理接缝(trimming)的核酶，它能在核酶部分的5’或3’侧顺式清理接缝，从而从含有该核酶的转录RNA上准确切出核酶部分(K.Tairaet al.，Protein Eng.3：733(1990)；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4823(1989)；C.A.Grosshands和R.T.Cech，Nucleic AcidsRes.19：3875(1991)；K.Taira et al.Nucleic Acid Res.19：5125(1991))。通过随机排列靶基因内的多个位点可以裂解这些结构单位并获得更大效应(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271(1992))。通过利用这类核酶，有可能特异性裂解本发明靶基因的转录产物，从而抑制该基因的表达。

内源基因的表达也可通过用具有与该靶基因序列相同或相似序列的DNA进行转化而进行共抑制。“共抑制”是指将具有与内源靶基因序列相同或相似序列的基因通过转化而导入植物后，该导入基因和内源靶基因的表达都受到抑制的现象。共抑制的详细机制目前尚不明了，但它常见于植物(Curr.Biol.7：R793(1997)，Curr.Biol.6：810(1996))。例如，如果想获得Hd1基因已被共抑制的植物体，可以用设计成能表达Hd1基因或具有相似序列的DNA的载体DNA来转化该植物，在所得植物群体中选出具有Hd1突变体特性的植物，即光周期敏感性已降低的植物。用于共抑制的基因不必与靶基因完全相同，但应有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％(如至少95％)的序列同一性。序列同一性可通过上述方法确定。

此外，本发明内源基因的表达也可通过用具有该靶基因的显性阴性表型(dominant negative phenotype)的基因转化该植物来抑制。具有该靶基因的显性阴性表型的基因是指，表达后能消除或降低该植物固有的野生型内源基因活性的那些基因。

对用于植物细胞转化的载体没有限制，只要该载体能在植物细胞中表达所插入的基因。例如，可以使用含有用于植物细胞中组成型基因表达的启动子(如花椰菜花叶病毒35S启动子)和受外源刺激诱导的启动子的载体。术语“植物细胞”在本文中包括各种形式的植物细胞，如培养细胞悬液，原生质体，叶切片，和愈伤组织。

可通过已知方法将载体导入植物细胞，如聚乙二醇法，电穿孔，农杆菌(Agrobacterium)介导的转移，和粒子轰击。可根据植物细胞的类型用已知方法从已转化的植物细胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.100：1503-1507)。例如，水稻植物的转化和再生方法包括：(1)用聚乙二醇将基因导入原生质体并再生植物体(适于indica水稻品种)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用电脉冲将基因导入原生质体并再生植物体(适于japonica水稻品种)(Toki et al(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通过粒子轰击将基因直接导入细胞并再生植物体(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9：957-962)；(4)利用农杆菌导入基因并再生植物体(Hiei et al.(1994)Plant J.6：271-282)；等等。这些都是领域内现有方法，都广泛用于本发明所属技术领域。这些方法适用于本发明。

一旦获得了一种转化植物，其中已将本发明的DNA导入了基因组，就有可能通过有性或无性繁殖从该植物体获得后代。或者，可从该植物及其后代或克隆获得繁殖材料(如种子、果实、穗、块茎、块根、株、愈伤组织、原生质体等)来大规模生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物的后代和克隆，以及从该植物获得的繁殖材料、其后代或克隆，它们都包括在本发明中。

如上述制备的改变了光周期敏感性的植物的花期不同于野生型植物。例如，用编码Hd1蛋白的DNA转化的植物提高了光周期敏感性，而且在田间生长调节下该植物的花期延迟了。另一方面，由于导入反义DNA使得编码Hd1蛋白的DNA的表达受到抑制的那些植物降低了光周期敏感性，且该植物的花期提前。因此，植物开花所需时间可通过控制Hd1基因的表达来调节。根据本发明，可以严密控制水稻，这种极具价值的作物的抽穗期，这对于培育能适应特定环境的水稻品种非常有利。

此外，本发明提供了评估植物的光周期敏感性的方法。本发明人研究了Hd1基因的转录与田间栽培时到达抽穗所需的天数之间的关系，发现当检测到正常转录时(在Nipponbare和Ginbozu中)，到达抽穗所需的天数增多，而在观察到异常转录子的情况下天数减少(实施例5)。这些结果表明，功能性Hd1蛋白的表达是决定植物对光周期的敏感程度的一个因素。本发明评估植物的光周期敏感性的方法是基于这一发现，其特征在于检测植物是否携有编码功能性Hd1蛋白的DNA的步骤。

植物是否携有编码功能性Hd1蛋白的DNA，可通过检测多态性，即与基因组DNA中的Hd1相对应的区域的结构差异来评价。

用本发明的方法评估植物的光周期敏感性对于，如通过杂交来改良植物品种十分有效。即，当不希望导入光周期敏感性特征时，可通过本发明避免与具有光周期敏感性的植物杂交。相反，当希望导入光周期敏感性特征时，通过本发明就能与具有光周期敏感性的植物进行杂交。此外，本发明的方法还可用于从杂交的后代植物群体中筛选植物。在基因序列中确定植物的光周期敏感性比根据植物的表型来进行确定更简单可靠。因此，本发明评估光周期敏感性的方法对植物品种改良方法的进步作出了很大贡献。

而且，本发明提供了一种DNA，它有至少15个核苷酸与本发明中由核苷酸序列SEQ ID NO：2或4或其互补链组成的DNA互补。本文中将“互补链”定义为由A∶T和G∶C碱基对构成的双链DNA中相对于一条链的另一条链。“互补”不仅指在至少15个连续核苷酸的区域内互补配对的那些，还指在所述区域内具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％同源性的那些。所述DNA可作为有效检测或分离本发明DNA的探针，或作为扩增本发明DNA的探针。

                         附图简述

图1显示Hd1基因区的详细连锁图谱，以及YAC和基因组克隆的排列。

A显示用1,505个植株产生的连锁图谱。

B显示酵母人工染色体(YAC)克隆的排列。

C显示P1衍生的人工染色体(PAC)克隆的的排列。

D显示Hd1基因的候选区，预测的Hd1基因，及其同源性搜索结果。

图2显示Hd1候选基因区的核苷酸序列对比。Nipponbare和Ginbozu都具有功能性Hd1基因，而Kasalath的Hd1基因功能减弱或缺失。HS66和HS110是在γ射线辐射下诱导Se1基因座的光周期敏感性丧失的突变系。被直角线包围的区域是通过基因预测假定为外显子的区域。所测定的突变位点上方的数字表示插入或缺失的核苷酸的数目。

图3显示了用于通过转化进行互补分析的载体。

图4显示，在一群已导入了含有Hd1候选基因区的7.1-kb基因组DNA片段的转化植株中，抽穗所需时间的改变。

图5显示，在一群已导入了含Hd1候选基因区的7.1-kb基因组DNA片段的转化植株的自花授粉后代(T1)中，抽穗所需时间的改变。

                    实施本发明的最佳模式

本发明参照以下实施例举例说明，但不应理解为本发明仅限于此。

[实施例1] 通过高精度连锁分析以及酵母人工染色体(YAC)克隆对 Hd1基因进行的排列

用大规模分离群体对Hd1区进行高精度连锁分析，这是根据该分析的图谱进行克隆所必需的。连锁分析所用的群体为Nipponbare和Kasalath的回交后代BC₃F₃代，其中的Hd1区已分离。连锁分析用集中取样法进行。即，使约8,000个Hd1区分离的BC₃F₃植株在稻田中生长，研究它们的抽穗期，选出1,505个早熟植株，推定它们在Hd1基因座上是Kasalath等位基因纯合子。从其中5个植株收集叶片，提取DNA，选出携有在Hd1区发生了重组的染色体的植株。在筛选重组个体时使用的RFLP标志是R1679和P130。结果在R1679和Hd1之间以及Hd1和P130之间分别选出9个和2个重组植株(图1)。

用被认为位于Hd1周围的DNA标志进行的另一项高精度连锁分析显示，Hd1基因座位于RFLP标志S20481和P130之间，但在S2539和Hd1之间位发现重组(图1)。分别在S20481和Hd1之间以及Hd1和P130之间发现1个和2个可用于限定Hd1基因的基因组候选区的重组植株。

根据在水稻基因组研究中制备的YAC克隆的排列图谱，鉴定出在邻近Hd1基因座含有DNA标志C235，S20481，和S2539的核苷酸序列的YAC克隆。此外，当用盒(cassette)法分离上述鉴定的YAC克隆Y4836的末端DNA片段，并经分析确定为RFLP标志时，该末端DNA克隆Y4836R与RELP标志P130共分离，说明YAC克隆Y4836R包含Hd1基因座(图1)。

[实施例2] 用P1-衍生的人工染色体(PAC)克隆排列Hd1基因区

使用衍生自邻近Hd1基因座的RFLP标志S20481(0.74-kb扩增基因组片段)和S2539(1.9-kb扩增基因组片段)的一组STS(序列标记位点)引物，筛选在水稻基因组研究项目(RGP)中制备的Nipponbare基因组的PAC克隆文库(插入子长度平均为112kb，18432个克隆；对应于水稻基因组大小的约4.5倍)。用“5’-GGA CTG GGT GAA GAA GAT-3’(SEQ ID NO：5)”和“5’-CCTTGT CCT CTC CTC TTG-3’(SEQ ID NO：6)”产生S20481的STS引物，用“5’-GTA GAG TGA TGA CAA AAT GAC AA-3’(SEQ ID NO：7)”和“5’-GGACTG AGA TGG AAT GTG CT-3’(SEQ ID NO：8)”产生S2539的STS引物。结果选出两个克隆P0676F10和P0038C5。此外，经PCR检查这些PAC克隆是否带有对应于RFLP标志Y4836R和P130的核苷酸序列。结果发现，PAC克隆P0038C5具有对应于Y4836R的核苷酸序列，完全覆盖Hd1基因座(图1)。

[实施例3] 通过分析核苷酸序列来确定候选基因

对推测携有Hd1基因的PAC克隆P0038C5进行核苷酸序列分析。为了分析核苷酸序列，对P0038C5的DNA插入子(包括载体)进行超声处理，来制备含有平均2.5kb和5kb的片段的插入子亚克隆。从该亚文库随机选取2,000个克隆进行核苷酸序列分析，用Phred/Phrap软件进行装配。根据由连锁分析显示的候选基因组区中核苷酸序列的信息，产生新的CAPS(裂解扩增多态性序列)标志，以此来限定该候选区。用以下CAPS标志作为引物共分离Hd1基因：1b(限制酶SspI)“5’-AAG CAA GCA GAA AGT AAA GAG-3’(SEQ ID NO：9)”和“5’-GAA ACA ATA GTA GAC CGA GCA-3’(SEQ ID NO：10)”；1c(限制酶HindIII)“5’-GAC CCA TCC GCC GCC TAC TCT-3’(SEQ IDNO：11)”和“5’-GCA GGT CGT GAA ACA ATC GGT-3’(SEQ ID NO：12)”；1d(限制酶HaeIII)“5’-ATT GAG ATG GTA TTG CGG AAG A-3’(SEQ ID NO：13)”和“5’-CAC ATC GTG CCT TCA AGC TG-3’(SEQ ID NO：14)”；和1e(限制酶Sau3AI)“5’-ACA AGG ACG AGG AGG TGG AC-3’(SEQ ID NO：15)”和“5’-GCT GCT GCT CTT GCT GTT CA-3’(SEQ ID NO：16)”。此外，在1a(限制酶Sau3AI)“SEQ ID NO：7”和“SEQ ID NO：8”之间以及1f(限制酶NcoI)“5’-CCA GGA AGT TTG AGA AGA CA-3’(SEQ ID NO：17)”和“5’-TGC ATTCTG ATG CTT GAT TA-3’(SEQ ID NO：18)”之间都检测到一个重组基因(图1)。因此，Hd1基因的候选基因区可限定为约12kb。对该候选区的基因预测以及序列同源性搜索检测出一个与过氧化物酶S2539(鉴定为水稻的EST)以及拟南芥(Arabidopsis)CONSTANS(CO)基因(它具有在长昼条件下促进开花的功能，并被认为是具有锌指结构域的转录调节基因)的核苷酸序列高度同源的区域。

[实施例4] 分析Hd1候选基因的核苷酸序列

对Nipponbare和它的Hd1近似纯合系进行RT-CR，发现S2539(水稻植物的EST)在转录水平上未发生变化。因此，用预测具有锌指结构域的基因作为Hd1候选基因继续进行分析。为确定Kasalath的Hd1候选基因的核苷酸序列，从根据Kasalath的基因组DNA构建的粘粒文库选出携带所述候选基因的第47号克隆。利用如此选出的粘粒克隆确定Kasalath的12-kb Hd1候选基因区的核苷酸序列。在Kasalath的候选基因区的ORF(SEQ ID NO：19)中的11个位点发现突变(源于核苷酸的插入、缺失和取代)。最大的突变是在预测的外显子中36-bp的插入和33-bp的缺失(图2)。

另一方面，分析se1突变株HS66和HS110，以及它们的亲本株Ginbozu中上述候选基因区的核苷酸序列。推测Se1位于与Hd1相同的基因座上。根据Nipponbare的核苷酸序列制备能扩增Hd1候选基因区的引物，用这些引物克隆相应区，从而分析核苷酸序列。结果发现，携有Se1基因的Ginbozu的核苷酸序列除了一段36-bp的插入序列与Kasalath中的序列一样，并含有一个核苷酸取代以外，与Nipponbare的序列相同。突变株HS66(SEQ ID NO：20)相对于Ginbozu，在预测的外显子中观察到一段43-bp的缺失，而在HS110(SEQ ID NO：21)内含子中检测到一段433-bp的插入子(图2)。

根据以上结果，确定带有锌指结构域的基因是Hd1基因更可能的候选者，而且也表明Se1基因座很可能就是Hd1基因座。

[实施例5] 对Hd1候选基因的表达模式的分析

对Nipponbar及其近似纯合系(NIL(Hd1))的候选基因进行RT-PCR分析，在该近似纯合系中，Hd1基因区已被Kasalath的染色体片段取代。即，从收集的叶片提取总RNA，逆转录为cDNAs，然后用含有在Hd1基因中指定的内含子的引物对进行PCR：5’-TTC TCC TCT CCA AAG ATT CC-3’(SEQ IDNO：22)(有义链)和5’-CAT ACG CCT TTC TTG TTT CA-3’(SEQ ID NO：23)(反义链)。用作模板的RNA的量用以下引物对经PCR来估测：5’-TCC ATCTTG GCA TCT CTC AG-3’(SEQ ID NO：24)(有义链)和5’-GTA CCC GCATCA GGC ATC TG-3’(SEQ ID NO：25)(反义链)，所述引物能扩增肌动蛋白基因中的片段。结果，Nipponbare的在Hd1基因座带有Kasalath基因的近似纯合系中，候选基因的转录水平比Nipponbare中的大大降低，其大小也显著变小(表1)。表1植株            抽穗期²       表达水平³      转录子大小²Nipponbare      111.4±0.55    +++             具有预计大小者(Nipponbare)NIL(Hd1)¹      96.2±0.84     +               略小者Ginbozu         118.8±0.84    +++             具有预计大小者HS66            95.2±0.84     +++             略小者HS110           99.0±1.00     +               具有预计大小者和略大者的混合

¹：是那些包含Hd1基因区的染色体片段已经被具有Nipponbare遗传背景的Kasalath染色体片段取代了的植株。

²：在田间栽培所得数据(于4月22日播种)。

³：Hd1候选基因的转录子的表达水平和大小通过RT-PCR来评价。

转录子的大小与那些可作为标准在Nipponbare中扩增的转录子相当。

发现这种大小的差异与基因组核苷酸序列中检测出的缺失相对应。接着，用RT-PCR对se1突变株HS66和HS110以及它们的亲本株“Ginbozu”进行类似的基因表达模式分析。在Ginbozu中检测到与Nipponbare中类似的转录子。相比之下，在HS66中，尽管转录子的量与Ginbozu中的没有不同，但扩增出一种略小的转录子。大小的减小程度与基因组核苷酸序列分析所示的43-bp的缺失相对应。而在HS110中，单一大小的转录子不能经RT-PCR扩增，使得与Ginbozu的转录子大小相同的转录子以及大得多的转录子被扩增(表1)。对这些扩增产物进行克隆，并测定它们的核苷酸序列，除了与Nipponbare中相同的扩增产物以外，还检测出一种产物，它含有433-bp插入序列的一部分。这些结果表明，在HS110中，由于该433-bp的片段插入内含子中，使得有可能不发生正常剪接。

对候选基因的转录子与到达抽穗所需的天数之间的关系进行分析发现，当检测到正常转录子(在Nipponbare和Ginbozu中)时，到达抽穗所需的天数增加，而当发现异常转录子时，天数减少。而且，在HS110中，尽管检测到少量正常转录，到达抽穗所需的天数比Ginbozu的少，但比HS66的略多(表1)。这些结果说明，HS110可能没有完全丧失Se1的功能。

将核苷酸序列分析和表达模式分析的结果综合，强烈提示了对应于Hd1基因的候选基因，而且Se1基因座与Hd1候选基因座相同。

[实施例6] 通过转化鉴定候选基因的功能

将指定为Hdl候选区的基因组区(图1)中7.1-kb的ApaI片段或3.5-kb的HindIII片段分别插入质粒载体pPZP2H-lac，该载体可通过农杆菌(Agrobacterium)介导进行转化(图3)。转化用含或不含这些片段的载体，按照Doi，et al.((1997)Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21)所述方法进行。将被转化的品系是NIL(Hd1/Hd2)，它具有Nipponbare的遗传背景，并且由于Nipponbare的光周期敏感性基因Hd1和Hd2被Kasalath的相应基因取代而缺乏光周期敏感性。转化获得潮霉素抗性植株，其中52个带有含7.1-kb片段的载体，44个带有含3.5-kb片段的载体，19个仅带有载体。

需要导入的区域是否已经导入，可用该候选基因的特异性引物对SEQID NO：14(有义链)和SEQ ID NO：15(反义链)经PCR确定。结果表明，候选基因已整合至所有希望导入7.1-kb或3.5-kb片段的重组体中。

将这些植株转移至自然长昼条件下的隔离温室中(已于7月中旬从栽培室转移至隔离温室中，Tsukuba city)，以及短昼条件下的培养室中(每日光照10hr)，评价达到抽穗所需的天数。在自然长昼条件下，抽穗显著提前的植株出现在转移了7.1-kb片段的植株组中(图4)。在短昼条件下，含有7.1-kb片段的植株和不含转基因的植株之间抽穗期明显不同，前者的抽穗期比后者提早7-14天。另一方面，含有3.5-kb基因组片段的植株的抽穗期与仅含有载体的植株相同。

这些结果证实，候选基因区(7.1kb)具有在短昼条件下使抽穗提前的功能。考虑到当植物对光周期高度敏感时，可在短昼条件下提前抽穗，因此证实所导入的基因组片段具有提高光周期敏感性的功能。

而且，从那些在短昼条件下提前抽穗的植株中选出一个推测携有所述转基因的单个拷贝的植株，将其自花授粉后代在短昼条件下进行类似栽培(每天光照10hr和避光14hr)。结果在自花授粉后代中观察到到达抽穗期的天数有很大差异：3个晚熟植株不带有所述转移基因，而其它早熟植株携有该转基因(图5)。根据PCR分析结果，4个最早熟的植株为该转基因的纯合子。经证实，所导入的候选基因具有Hd1基因在短昼条件下使抽穗提前的功能。

                           工业实用性

本发明提供了水稻品种中的光周期敏感性基因。本发明的基因赋予植物以光周期敏感性并可用于控制水稻的抽穗期。因此，这些基因对于培育能适应特定区域和季节的水稻品种从而进行品种改良十分有效。此外，用本发明的基因改良水稻品种的方法与传统方法相比具有优势，其优势在于可在短期内获得非常可靠的目标植物。

本发明还提供了评估植物的光周期敏感性的方法。传统评估方法需要2-3年的繁重劳动来确定一个品种的光周期敏感性，它包括：将目标品种与待检植物品系杂交，鉴定特定基因的存在；然后通过分离植物后代的抽穗期来确定所述基因的存在。根据本发明的方法，植物的光周期敏感性可如下测定：仅需(1)播种约2周后收获秧苗的一部分；(2)从中提取DNA；(3)以所述DNA为模板进行PCR并进行限制酶处理来确定。植物后代的光周期敏感程度可在杂交前，根据所述基因的存在与否来确定，这种基因是对选择并筛选将要杂交的亲本植物而言有价值的信息。而且，光周期敏感性基因在选出的每种植物中的存在与否可利用上述方法轻易测定。因此，所述基因还可以作为选择标志。

                             序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所所长代表的日本国(JAPAN as represented byDirector General of Ministry of Agriculture，Forestry and Fisheries，NationalInstitute of Agrobiological Resources)

生物系特定产业技术研究推进机构(Bio-oriented Technology Research AdvancementInstitution)

社团法人农林水产先端技术产业振兴中心(Society for Techno-innovation ofAgriculture，Forestry and Fisheries)<120>植物的光周期敏感性基因及其用途<130>MOA-105PCT<140><141><150>JP 1999-313846<151>1999-11-04<160>25<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>456<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>1Met Ala Gly Arg Phe Gly Thr Phe Leu Met Tyr Leu His Trp Leu Pro1               5                  10                  15His Thr Gly Ala Pro Ser Lys Lys His Ser Gln Asn Ser Thr Arg Ala

         20                  25                  30Met Arg Ala Lys Ala Thr Thr Thr Thr Ser Lys Ala Thr Ser Phe Met

     35                  40                  45Asn Tyr Asn Phe Gly Gly Asn Val Phe Asp Gln Glu Val Gly Val Gly

 50                  55                  60Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Gly Cys Pro Trp Ala Arg65                  70                  75                  80Pro Cys Asp Gly Cys Arg Ala Ala Pro Ser Val Val Tyr Cys Arg Ala

             85                  90                  95Asp Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Ser Cys Asp Ala Arg Val His Ala Ala

        100                 105                 110Asn Arg Val Ala Ser Arg His Glu Arg Val Arg Val Cys Glu Ala Cys

    115                 120                 125Glu Arg Ala Pro Ala Ala Leu Ala Cys Arg Ala Asp Ala Ala Ala Leu

130                 135                 140Cys Val Ala Cys Asp Val Gln Val His Ser Ala Asn Pro Leu Pro Ala145                 150                 155                 160Ile Thr Ile Pro Ala Thr Ser Val Leu Ala Glu Ala Val Val Ala Thr

            165                 170                 175Ala Thr Val Leu Gly Asp Lys Asp Glu Glu Val Asp Ser Trp Leu Leu

        180                 185                 190Leu Ser Lys Asp Ser Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asp

    195                 200                 205Asn Asp Asn Asn Asp Asn Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asn Asn Gly Met

210                 215                 220Tyr Phe Gly Glu Val Asp Glu Tyr Phe Asp Leu Val Gly Tyr Asn Ser225                 230                 235                 240Tyr Tyr Asp Asn Arg Ile Glu Asn Asn Gln Asp Arg Gln Tyr Gly Met

            245                 250                 255His Glu Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Met Gln Lys Glu

        260                 265                 270Phe Ala Glu Lys Glu Gly Ser Glu Cys Val Val Pro Ser Gln Ile Thr

    275                 280                 285Met Leu Ser Glu Gln Gln His Ser Gly Tyr Gly Val Val Gly Ala Asp

290                 295                 300Gln Ala Ala Ser Met Thr Ala Gly Val Ser Ala Tyr Thr Asp Ser Ile305                 310                 315                 320Ser Asn Ser Ile Ser Phe Ser Ser Met Glu Ala Gly Ile Val Pro Asp

            325                 330                 335Ser Thr Val Ile Asp Met Pro Asn Ser Arg Ile Leu Thr Pro Ala Gly

        340                 345                 350Ala Ile Asn Leu Phe Ser Gly Pro Ser Leu Gln Met Ser Leu His Phe

    355                 360                 365Ser Ser Met Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr Arg Glu Lys Lys

370                 375                 380Lys Ala Arg Lys Phe Glu Lys Thr Ile Arg Tyr Glu Thr Arg Lys Ala385                 390                 395                 400Tyr Ala Glu Ala Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe Ala Lys Arg Ser

            405                 410                 415Asp Val Gln Ile Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr Ala Ala Leu Ser

        420                 425                 430Asp Gly Ser Tyr Ala Thr Ser Gly Met Asp Leu Ile Ala Phe Cys Phe

    435                 440                 445Glu Met Glu His Ser Pro Asn Ile

450                 455<210>2<211>4814<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2aaagcaaaga tgaacagagg tggactgttc tccttacaaa tttattgcaa aaaaaaaagt 60agattctcta tggagaggca tatttaacgt tatagcaggg ctataataag aaacagatgg 120ctcaaagaaa atgataagca acaaataacc cataaaggac ccatgtcata tatagatagg 180ccttgcaaac aaacaaaaaa aaggtatgca aggaaataat agttccttca gcagttgaga 240aatcatataa cagaagaaaa aaaacacatt ggtaataatt tgacttctcc actagaatag 300atatttttgg atgagggagg ccggcaaaga aactatttag tgacatggca ggccgctttg 360gaacttttct catgtatctg cactggctac ctcacaccgg aggttcgtaa aggcggaacg 420gctaaggggg agtgccaatg actggcacaa aaccgcatgc tttggaatcc cagagaaccc 480aaccctccct ttctcttttg caaaagaatg tgcataaaga gagagaggca gcatctttcc 540tctgctcttt tttgtttttc cctttatttg tacatcatca cagtggcttc caattctccc 600cctttgggct tagttccatc taagagatgt ccattgaatt gtttagggac aatcctagga 660atgcatatgg gaggattcta ttgatccctg taaaatctct ttagggacag tcctaagtta 720aaatggaaca tgattacgac aaaagagaat cagtgtactc atcactaaaa tgcaaagctt 780ttttgcgcaa aagcgcgatt gctttggctt aaaaggtatt gacatcagtt caggttagat 840acttagattt agctcaaggg cgccaattct ccataggacc cgccaaagtg cacaaaatct 900ttatctgaaa acgacccctc cattgaggat tggcatcagg gggtgagaag agaaacgctg 960aagcagcaaa catccaaagg caaccacaag acaggcattg cagccgccgc tcgccccccc 1020cccccccccc cccggggatc gcgccaagtg tcaatcgctg gattcgactt gacaccccct 1080tactattagt atactctaca ctcaaactcc ccaggacaaa aacaccgtga ctttcccctc 1140cctagctcct tccaaaaaac actcacaaaa ttccacaaga gccatgcgag gtagaggaac 1200aggagaagac gcatacacac acgacacata gagagagagg acaaacacaa tagcttggat 1260cgatagactt gtccatgtgg tgcaagctaa agctactact accacaagca aggctacttc 1320gttcatgaat tataattttg gtggcaacgt gttcgaccag gaggttggag ttggaggcga 1380aggaggagga ggaggagagg ggagcggctg cccatgggcg cggccgtgcg acgggtgccg 1440cgcggcgccg agcgtggtgt actgccgcgc ggacgcggcg tacctgtgcg cgtcgtgcga 1500cgcgcgggtg cacgcggcca accgcgtggc gtcccgccac gagcgcgtgc gggtgtgcga 1560ggcctgcgag cgcgccccgg ccgcgctcgc gtgccgcgcc gacgccgccg cgctgtgcgt 1620ggcgtgcgac gtgcaggtgc actccgcgaa cccgctcccg gccatcacca tcccggccac 1680ctccgtcctc gctgaggcgg tggtggccac cgccaccgtc ctcggcgaca aggacgagga 1740ggtggactct tggcttctcc tctccaaaga ttccgacaac aacaacaaca ataacaacaa 1800caacgacaac gacaataacg acaacaacaa cagcaacagc agcaacaacg gcatgtattt 1860tggtgaagtc gatgagtact ttgatcttgt cgggtacaat tcgtactacg acaaccgcat 1920cgaaaacaac caagatcggc agtatgggat gcatgaacag caagagcagc agcagcagca 1980gcaggagatg caaaaggagt ttgcagagaa ggaagggagc gagtgtgtgg taccttcaca 2040gatcacaatg ctgagtgagc agcagcatag tggttatgga gttgtgggag cagaccaggc 2100cgcctccatg accgccggcg tcagtgctta cacagattcc atcagcaaca gcgtgagttc 2160atctattact agctgcaact attttttttt cagagaatga acatctatta ctgttgttag 2220ttagttgtta ctacatgcca cgttgtcaat gttttagagt tcatactagt acttttgagt 2280ggaaaaacat tctccaaaca aaagctactg tctaacaaaa tgaagggata aataaacaga 2340tctcaacaag aaaacaaaga tacttttcta cttccaagct gcgatcttta ggctgattaa 2400atggaaccga taaaaaaaat actttaaaga aaagtacaca attgatcttt aggcagacca 2460gttgactact tcctgtattt ctaagcatat acgatccatg ctaactcact aattgaaaag 2520aagtgagttt gttaaccttt tatgtacaca gcaatcacca cacgaaagac ctcatgaaaa 2580gtaggataag tgtaagtgta attcatattt tatcccagtg cataaattta aaatatctta 2640cttttgcgac agtaaaaaag atattggaag tttttcttat gtatgtaaaa ttaaattaag 2700cccatctata tatcattgca gggtctctga cacctgcaat ctccttatga ttcgcatatt 2760tcagtgacca tttgccgatt ccatctcaga tatctttctc atcaatggag gcgggtatag 2820taccagacag cacggtgata gatatgccaa attccagaat cctgacacct gctggagcaa 2880tcaatctctt ctcaggtccc tcgcttcaga tgtcccttca cttcagctcc atggacaggg 2940aggccagggt gctcaggtac agggagaaga agaaggccag gaagtttgag aagacaatac 3000gttatgaaac aagaaaggcg tatgcagagg cacgaccccg gatcaagggc cgtttcgcca 3060agagatcaga tgtgcagatc gaagtggacc agatgttctc cactgcagct ctatctgacg 3120gtagctatgg tactgttcca tggttctgat gggactcatg agacgctatc ttataggcat 3180atatatgggg acttactgag tagcaataac atcgatccag tgggagtagt tctagacaat 3240ctgtgttatg aataatagtg tgttgtttgc gacttaaaat tgatcaagta ccttagcttt 3300ttaaagtttt gctttgtaat ttccggatag cagatatata ttgttggtac ttgctcagta 3360gctttaagtt tttgaagtaa gcaaagagca gtgatgagat gaaatgagta tgtgtataac 3420tgtatataga taattctagg gtaccttggc caacaatcac agtagcaaca atgctttagg 3480ggtttaggtg acgaattggg ggtttagttg tttactatga agtagcacca aaatggtgga 3540acatatatat tcctattttc gttccatcat gacatataac tgctgtctaa ccagcctatg 3600ttgactgaaa acaaagctcg tttcattaca aaataaaaga tggaaccctg attaagtgtg 3660tccactggcc agatagtatc atagtagtat aataatgaac tggagttcaa gtcttttata 3720ttccacttgg atctcggtgc cattttctta atgatgtatc ttagtgatgg gctatcattg 3780tatccggttg gaatttcagc agaggtgaag gtgatggtgt tcactcagct tttaaatatc 3840cattattctt acagccctcc agatcattct ggatgaaaag aaaagcagtg acaaagaatt 3900tactgttgct ttaaccatga gaatcatatc tttccagcac ggcctatctt ctcactaaac 3960catgagctat cggtgatcag taactcgaat gatagttgta gggaatatag gaacattgcc 4020tgatactgat aggtacacca ttgtggttgg gtgatataag tacaacaaac tcacagaaaa 4080gtttccctat tattttgtga atcaagagag cataaataag gaagctcttt ctcattctca 4140gtgcattcct cttccctttc actagcaact agtggcatgg atcttattgc cttttgtttt 4200gagatggagc attcaccaaa tatctaaggc atctcagggc a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         20                  25                  30Met Arg Ala Lys Ala Thr Thr Thr Thr Ser Lys Ala Thr Ser Phe Met

     35                  40                  45Asn Tyr Asn Phe Gly Gly Asn Val Phe Asp Gln Glu Val Gly Val Gly

 50                  55                  60Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Gly Cys Pro Trp Ala Arg65                  70                  75                  80Pro Cys Asp Gly Cys Arg Ala Ala Pro Ser Val Val Tyr Cys Arg Ala

             85                  90                  95Asp Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Ser Cys Asp Ala Arg Val His Ala Ala

        100                 105                 110Asn Arg Val Ala Ser Arg His Glu Arg Val Arg Val Cys Glu Ala Cys

    115                 120                 125Glu Arg Ala Pro Ala Ala Leu Ala Cys Arg Ala Asp Ala Ala Ala Leu

130                 135                 140Cys Val Ala Cys Asp Val Gln Val Tyr Ser Ala Asn Pro Leu Ala Arg145                 150                 155                 160Arg His Gln Arg Val Pro Val Ala Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ile Pro

            165                 170                 175Ala Thr Ser Val Leu Ala Glu Ala Val Val Ala Thr Ala Thr Val Leu

        180                 185                 190Gly Asp Lys Asp Glu Glu Val Asp Ser Trp Leu Leu Leu Ser Lys Asp

    195                 200                 205Ser Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asp Asn Asn

210                 215                 220Asp Asn Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asn Asn Gly Met Tyr Phe Gly Glu225                 230                 235                 240Val Asp Glu Tyr Phe Asp Leu Val Gly Tyr Asn Ser Tyr Tyr Asp Asn

            245                 250                 255Arg Ile Glu Asn Asn Gln Asp Arg Gln Tyr Gly Met His Glu Gln Gln

        260                 265                 270Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Met Gln Lys Glu Phe Ala Glu Lys

    275                 280                 285Glu Gly Ser Glu Cys Val Val Pro Ser Gln Ile Thr Met Leu Ser Glu

290                 295                 300Gln Gln His Ser Gly Tyr Gly Val Val Gly Ala Asp Gln Ala Ala Ser305                 310                 315                 320Met Thr Ala Gly Val Ser Ala Tyr Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ser Ile

            325                 330                 335Ser Phe Ser Ser Met Glu Ala Gly Ile Val Pro Asp Ser Thr Val Ile

        340                 345                 350Asp Met Pro Asn Ser Arg Ile Leu Thr Pro Ala Gly Ala Ile Asn Leu

    355                 360                 365Phe Ser Gly Pro Ser Leu Gln Met Ser Leu His Phe Ser Ser Met Asp

370                 375                 380Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr Arg Glu Lys Lys Lys Ala Arg Lys385                 390                 395                 400Phe Glu Lys Thr Ile Arg Tyr Glu Thr Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Ala

            405                 410                 415Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe Ala Lys Arg Ser Asp Val Gln Ile

        420                 425                 430Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr Ala Ala Leu Ser Asp Gly Ser Tyr

    435                 440                 445Ala Thr Ser Gly Met Asp Leu Ile Ala Phe Cys Phe Glu Met Glu His

450                 455                 460Ser Pro Asn Ile465<210>4<211>4850<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>4aaagcaaaga tgaacagagg tggactgttc tccttacaaa tttattgcaa aaaaaaaagt 60agattctcta tggagaggca tatttaacgt tatagcaggg ctataataag aaacagatgg 120ctcaaagaaa atgataagca acaaataacc cataaaggac ccatgtcata tatagatagg 180ccttgcaaac aaacaaaaaa aaggtatgca aggaaataat agttccttca gcagttgaga 240aatcatataa cagaagaaaa aaaacacatt ggtaataatt tgacttctcc actagaatag 300atatttttgg atgagggagg ccggcaaaga aactatttag tgacatggca ggccgctttg 360gaacttttct catgtatctg cactggctac ctcacaccgg aggttcgtaa aggcggaacg 420gctaaggggg agtgccaatg actggcacaa aaccgcatgc tttggaatcc cagagaaccc 480aaccctccct ttctcttttg caaaagaatg tgcataaaga gagagaggca gcatctttcc 540tctgctcttt tttgtttttc cctttatttg tacatcatca cagtggcttc caattctccc 600cctttgggct tagttccatc taagagatgt ccattgaatt gtttagggac aatcctagga 660atgcatatgg gaggattcta ttgatccctg taaaatctct ttagggacag tcctaagtta 720aaatggaaca tgattacgac aaaagagaat cagtgtactc atcactaaaa tgcaaagctt 780ttttgcgcaa aagcgcgatt gctttggctt aaaaggtatt gacatcagtt caggttagat 840acttagattt agctcaaggg cgccaattct ccataggacc cgccaaagtg cacaaaatct 900ttatctgaaa acgacccctc cattgaggat tggcatcagg gggtgagaag agaaacgctg 960aagcagcaaa catccaaagg caaccacaag acaggcattg cagccgccgc tcgccccccc 1020cccccccccc cccggggatc gcgccaagtg tcaatcgctg gattcgactt gacaccccct 1080tactattagt atactctaca ctcaaactcc ccaggacaaa aacaccgtga ctttcccctc 1140cctagctcct tccaaaaaac actcacaaaa ttccacaaga gccatgcgag gtagaggaac 1200aggagaagac gcatacacac acgacacata gagagagagg acaaacacaa tagcttggat 1260cgatagactt gtccatgtgg tgcaagctaa agctactact accacaagca aggctacttc 1320gttcatgaat tataattttg gtggcaacgt gttcgaccag gaggttggag ttggaggcga 1380aggaggagga ggaggagagg ggagcggctg cccatgggcg cggccgtgcg acgggtgccg 1440cgcggcgccg agcgtggtgt actgccgcgc ggacgcggcg tacctgtgcg cgtcgtgcga 1500cgcgcgggtg cacgcggcca accgcgtggc gtcccgccac gagcgcgtgc gggtgtgcga 1560ggcctgcgag cgcgccccgg ccgcgctcgc gtgccgcgcc gacgccgccg cgctgtgcgt 1620ggcgtgcgac gtgcaggtgt actccgcgaa cccgctcgcc aggcgccacc agcgcgtccc 1680cgtcgcgccg ctcccggcca tcaccatccc ggccacctcc gtcctcgctg aggcggtggt 1740ggccaccgcc accgtcctcg gcgacaagga cgaggaggtg gactcttggc ttctcctctc 1800caaagattcc gacaacaaca acaacaataa caacaacaac gacaacgaca ataacgacaa 1860caacaacagc aacagcagca acaacggcat gtattttggt gaagtcgatg agtactttga 1920tcttgtcggg tacaattcgt actacgacaa ccgcatcgaa aacaaccaag atcggcagta 1980tgggatgcat gaacagcaag agcagcagca gcagcagcag gagatgcaaa aggagtttgc 2040agagaaggaa gggagcgagt gtgtggtacc ttcacagatc acaatgctga gtgagcagca 2100gcatagtggt tatggagttg tgggagcaga ccaggccgcc tccatgaccg ccggcgtcag 2160tgcttacaca gattccatca gcaacagcgt gagttcatct attactagct gcaactattt 2220ttttttcaga gaatgaacat ctattactgt tgttagttag ttgttactac atgccacgtt 2280gtcaatgttt tagagttcat actagtactt ttgagtggaa aaacattctc caaacaaaag 2340ctactgtcta acaaaatgaa gggataaata aacagatctc aacaagaaaa caaagatact 2400tttctacttc caagctgcga tctttaggct gattaaatgg aaccgataaa aaaaatactt 2460taaagaaaag tacacaattg atctttaggc agaccagttg actacttcct gtatttctaa 2520gcatatacga tccatgctaa ctcactaatt gaaaagaagt gagtttgtta accttttatg 2580tacacagcaa tcaccacacg aaagacctca tgaaaagtag gataagtgta agtgtaattc 2640atattttatc ccagtgcata aatttaaaat atcttacttt tgcgacagta aaaaagatat 2700tggaagtttt tcttatgtat gtaaaattaa attaagccca tctatatatc attgcagggt 2760ctctgacacc tgcaatctcc ttatgattcg catatttcag tgaccatttg ccgattccat 2820ctcagatatc tttctcatca atggaggcgg gtatagtacc agacagcacg gtgatagata 2880tgccaaattc cagaatcctg acacctgctg gagcaatcaa tctcttctca ggtccctcgc 2940ttcagatgtc ccttcacttc agctccatgg acagggaggc cagggtgctc aggtacaggg 3000agaagaagaa ggccaggaag tttgagaaga caatacgtta tgaaacaaga aaggcgtatg 3060cagaggcacg accccggatc aagggccgtt tcgccaagag atcagatgtg cagatcgaag 3120tggaccagat gttctccact gcagctctat ctgacggtag ctatggtact gttccatggt 3180tctgatggga ctcatgagac gctatcttat aggcatatat atggggactt actgagtagc 3240aataacatcg atccagtggg agtagttcta gacaatctgt gttatgaata atagtgtgtt 3300gtttgcgact taaaattgat caagtacctt agctttttaa agttttgctt tgtaatttcc 3360ggatagcaga tatatattgt tggtacttgc tcagtagctt taagtttttg aagtaagcaa 3420agagcagtga tgagatgaaa tgagtatgtg tataactgta tatagataat tctagggtac 3480cttggccaac aatcacagta gcaacaatgc tttaggggtt taggtgacga attgggggtt 3540tagttgttta ctatgaagta gcaccaaaat ggtggaacat atatattcct attttcgttc 3600catcatgaca tataactgct gtctaaccag cctatgttga ctgaaaacaa agctcgtttc 3660attacaaaat aaaagatgga accctgatta agtgtgtcca ctggccagat agtatcatag 3720tagtataata atgaactgga gttcaagtct tttatattcc acttggatct cggtgccatt 3780ttcttaatga tgtatcttag tgatgggcta tcattgtatc cggttggaat ttcagcagag 3840gtgaaggtga tggtgttcac tcagctttta aatatccatt attcttacag ccctccagat 3900cattctggat gaaaagaaaa gcagtgacaa agaatttact gttgctttaa ccatgagaat 3960catatctttc cagcacggcc tatcttctca ctaaaccatg agctatcggt gatcagtaac 4020tcgaatgata gttgtaggga atataggaac attgcctgat actgataggt acaccattgt 4080ggttgggtga tataagtaca acaaactcac agaaaagttt ccctattatt ttgtgaatca 4140agagagcata aataaggaag ctctttctca ttctcagtgc attcctcttc cctttcacta 4200gcaacta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Claims (27)

1.一种编码植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA选自：

(a)编码含有SEQ ID NO：1或3所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)编码含有SEQ ID NO：1或3所示氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；

(c)能在严谨条件下与由SEQ ID NO：2或4所示核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

2.权利要求1的DNA，其中该DNA来自水稻。

3.一种DNA，其编码与权利要求1或2的DNA的转录产物互补的反义RNA。

4.一种DNA，其编码具有特异性消化权利要求1或2所述DNA之转录产物的核酶活性的RNA。

5.一种DNA，其编码能通过在植物细胞中表达而利用共抑制效应来抑制权利要求1或2所述DNA的表达的RNA。

6.权利要求1或2的DNA，其中所述DNA用于提高植物的光周期敏感性。

7.权利要求3-5中任一项的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。

8.一种载体，其含有权利要求1-5中任一项的DNA。

9.一种植物细胞，其被权利要求8的载体转化。

10.一种植物转化体，其含有权利要求9的植物细胞。

11.权利要求10的植物转化体，其中所述植物转化体为水稻。

12.一种植物转化体，它是权利要求10或11的植物转化体的后代或克隆。

13.权利要求10-12中任一项的植物转化体的繁殖材料。

14.一种产生权利要求10或11所述植物转化体的方法，它包括以下步骤：

(a)将权利要求1或2的DNA导入植物细胞，和

(b)从该植物细胞再生植物。

15.一种提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在该植物体中表达权利要求1或2的DNA的步骤。

16.权利要求15的方法，其中依赖于光周期的植物开花时间通过提高该植物的光周期敏感性而延迟。

17.一种降低植物的光周期敏感性的方法，该方法包括抑制该植物体的细胞中权利要求1或2的DNA表达的步骤，其中所述DNA为该植物细胞的内源性DNA。

18.权利要求17的方法，其中权利要求3-5中任一项所述DNA是在该植物体的细胞内表达。

19.权利要求17或18的方法，其中依赖于光周期的该植物的开花时间通过降低该植物的光周期敏感性而提前。

20.权利要求15-19中任一项的方法，其中所述植物是水稻。

21.一种评价植物的光周期敏感性的方法，它包括检测该植物中权利要求1的DNA存在与否的步骤。

22.权利要求21的方法，其中所述植物是水稻。

23.一种宿主细胞，其中已插入了携有权利要求1或2所述DNA的载体。

24.由权利要求1或2的DNA编码的蛋白。

25.一种产生权利要求24所述蛋白的方法，它包括以下步骤：培养权利要求23所述宿主细胞；使所述宿主细胞表达所述DNA所编码的重组蛋白；并从所述宿主细胞或其培养上清中回收所述重组蛋白。

26与权利要求24所述蛋白结合的抗体。

27.一种DNA，其中至少15个核苷酸与由SEQ ID NO：2或4所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补。

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