CN1137997C - 低温诱导性启动子序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低温诱导性启动子序列。该启动子在马铃薯块茎中，在低温下能诱导而在块茎之外的其它器官及常温下几乎不诱导表达、而且其诱导可长期持续进行5个月以上。本发明的启动子是具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，该DNA序列是由序列表的序列1所表示的碱基序列中1号～3546号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或添加；以及该DNA序列是由序列表的序列2所表示的碱基序列中、1号～4120号的碱基所组成的序列，或者其具有低温诱导性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或添加。

Description

低温诱导性启动子序列
本发明涉及具有在低温诱导基因表达性质的启动子序列。本发明的低温诱导性启动子序列适用于对低温储藏中的马铃薯块茎中的还原糖量的抑制、对马铃薯块茎发芽的抑制以及使植物具有低温耐性。
许多作物在收获后必须通过低温等处理以使其质量得以长期保持。然而，众所周知，马铃薯块茎在低温储藏中引起所谓低温甜化的还原糖积累，这时所生的还原糖引起在法式油炸马铃薯片、炸马铃薯片等的加工制作时的呈色反应(美拉德反应(maillard neaction))，从而使商品价值显著下降。又，已知果实等由于乙烯的生成而软化等。为解决这些问题的研究，也就是收获后生理研究(postharvest physiology)是现代世界中广泛进行的研究领域之一。
在马铃薯块茎中特异地表达外来基因时，在世界上一直广泛地使用蛋白质翅膜(Patagium)(パタチン)基因的启动子(EMBO J.8(1)：23～29，1989；植物分子生物学(plant Mol.Biol.)12：41～50，1989，生物学/工艺(Bio/Technology)12：1101～1105，1994等)。翅膜基因的表达随着块茎的发育、肥大而增加，但块茎的肥大同时也是其以从还原糖向淀粉转化为主的各种代谢系统活性化的时期。因此，按连接于翅膜启动子的基因的种类的不同，会涉及代谢系统的紊乱，进而涉及收获量减少等问题。为了回避这种问题，人们认为：为了有效地保持储藏时的质量，对在通常条件下的植物体中表达量少并仅在低温储藏中的块茎能有效地表达的启动子加以离析和利用是很有必要。
低温诱导性基因不管是原核或真核生物，已有许多种类被离析并报道(作为综述的有《组织培养》19(10)：357～361，1993等)。又，从马铃薯块茎也有离析例子(植物生理学(Plant Physiol.)104：445～452，1994)。同样，酶原(osmogen)类基因从茄属植物被离析出来，有人报道这种基因是在低温被诱导的(Plant Mol.Biol.21：729～735，1993)。关于从马铃薯块茎的离析例仅上述一个报道而已。
从马铃薯块茎已离析5种低温诱导性基因(cDNA)(植物生理学，104：445～452，1994)，其中两种已被发现它们和其它植物的小热体克蛋白质(smallheat-shock protein)或其它种类植物低温诱导蛋白质、ABA诱导蛋白质的基因有类似性。而其它三种尚未解析。这些cDNA的核基因(含有启动子)尚未有报道。认为它们都是对低温的反应快(1个星期内反应)的基因。
将上述已知基因的启动子应用于必须低温储藏的作物(马铃薯等)当然也是可能的，然而，这些启动子(植物生理学，104：445～452，1994等)是否仅在作为目的的器官上诱导高表达则尚不清楚(在低温时其它器官也可能诱导)。又，在常温下也可能有某种程度的表达。也就是，这些已知基因启动子是否在低温条件下仅在马铃薯块茎等以储藏为目的的器官中进行有效的基因表达尚不清楚，又因马铃薯块茎的储藏期达数个月的长时间，在其间，上述启动子是否还发挥其机能则也还不明了(植物生理学，104：445～452，1994，在此文献中只调查一个月左右)。
本发明的目的在于提供一种新型低温诱导性启动子，该启动子在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续。
本发明目的还在于提供作为探针有用的DNA片段，该探针用于发现在马铃薯或其它植物中存在的新型低温诱导性启动子。
本申请发明人等经过专心研究后成功地发现新型低温诱导性启动子序列，该启动子序列在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续；还成功地决定其碱基序列，从而完成本发明。
也就是，本发明提供具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，该DNA序列是由序列表的序列1所表示的碱基序列中、1号～3546号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或加入。
又，本发明提供具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，该DNA序列是由序列表内的序列2所表示的碱基序列中、1号～第4120号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或添加。
按照本发明，提供一种新型低温诱导性启动子，该启动子在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续。通过利用本发明启动子序列，可以对低温储藏中的马铃薯块茎中的还原糖量进行抑制；对马铃薯块茎的发芽进行抑制并且使植物具有低温耐性。
以下通过附图对实施本发明方法进行详细说明。
附图1是表示为导入LCIP2-10启动子的构型制备程序的说明图。
本发明的低温诱导性启动子序列包括，序列表的序列1所表示的碱基序列中、1号～3546号的碱基所组成的序列；或者序列2所表示的碱基序列中、1号～4120号的碱基所组成的序列。这些序列作为整体来说是能发挥其低温诱导性启动子活性，不过，即使是这些序列中的一部分仍然能发挥低温诱导性启动子活性，例如在序列表中的序列1所表示的碱基序列中、第2418号～3541号的碱基所组成的序列等也包含于本发明范围内。又，含有该序列1的序列的2418号～3541号的碱基所组成的序列并具有低温诱导性启动子的活性也包含于本发明范围内。
还有，序列表的序列1的3547号～3549号、或序列2的4121号～4123号的“ATG”是译码开始的密码子。又，序列1所表示的序列的第3503号以后的mRNA(cDNA)序列和其进行编码推定的氨基酸序列一起示于序列3。
在本说明书中，所谓“低温诱导性”是指：由启动子所致基因的表达在6℃以下的温度被诱导，而且如果温度保持在6℃以下，则其表达持续5个月以上。
通常，具有生理活性的DNA的碱基序列有微小改变的情况下，也就是，该碱基序列中的一个或多个核苷酸被置换或缺失；或者有一个或多个核苷酸添加或插入的情况下，有时该DNA的生理活性也能够保持。因此，上述本发明的低温诱导性启动子序列在进行这样的修饰、并同时具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。也就是，序列表的序列1所表示的碱基序列中、对1号～3546号碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分进行修饰、使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或在这些序列中插入或添加少数核苷酸并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。又，作为序列一部分的2417号～3541号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分进行修饰，使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或者在这些序列中插入或添加少数核苷酸、并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。
同样，如果序列表的序列2所表示的碱基序列中、由1号～4120号的碱基所组成的序列或者其中具有低温诱导性启动子活性的一部分上进行修饰，并使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或者在这些序列中插入或添加少数核苷酸并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。
核苷酸的添加、插入、缺失或置换可通过例如众所周知的技术的诱发特异部位变异(例如核酸研究(Nucleic Acid Research)，Vol.10，NO.20，p6487～6500，1982)而进行实施，在本说明书中所谓“一个或多个核苷酸”是指：通过特异部位的变异诱发法能够添加、插入、缺失或置换的多个核苷酸。
特异部位的变异诱发是例如，除了和所要求变异的特定不相容外，在应受变异的单链噬菌体DNA中使用互补性的合成寡核苷酸引物，按下列方法进行。也就是，使用作为引物的上述合成寡核苷酸在噬菌体中合成互补性的链，用所得的双链DNA将噬菌体支持性宿主细菌转化形质。将形质转化的细菌的培养物在琼脂中平板培养，从含有噬菌体的单一细胞形成斑点。这样，在理论上，50％新的菌落含有作为单链并具有变异的噬菌体，其余的50％仍具有原来的序列。将所得斑点和与上述具有所要求变异的DNA完全相容的进行杂化，而与具有原来链的不相容的在不进行杂化的温度下，与经激酶处理合成的探针进行杂化。其次，收集和该探针杂化所形成的斑点，进行培养，回收DNA。
再者，在启动子序列中作为未丧失低温诱导性启动子活性的一个或多个核苷酸的置换、缺失、附加或插入的方法，除上述特异部位的变异诱发法之外，还有用变异源处理基因的方法；以及将基因选择性地进行开裂，其次，将所选择的核苷酸除去、添加或置换，随后再连接的方法。
如在下述实施例中所详述那样，以序列1和2所表示的碱基序列经过如下的过程而决定。
(1)制定由长期间在4℃下保存的块茎的cDNA程序库，不使与发育中的各种马铃薯组织(叶、茎、根、愈合组织、发育中的块茎)的mRNA杂化(不严密)，将和低温储藏中的块茎mRNA杂化的cDNA克隆离析，决定碱序列并解析。
(2)使用上述(1)中所用的RNA进行Northern分析，再度确认在通常条件下发育中的马铃薯植物体中几乎没有表达。
(3)将收获后的块茎在各种温度(3、6、9、12、15、20℃)下长期(5～6个月)储藏，使用从这些块茎中提取的RNA用Northern法检测，是否可在低温下诱导；在什么温度下能诱导；在多长的期间表达；是否因从低温回到常温而表达解除等。结果认为：在6℃以下的低温能诱导；表达长期(至少5～6个月)持续；由于从低温回到常温而表达解除等。
(4)用马铃薯试管植物体检测在低温下块茎以外的组织是否能诱导表达。结果认为，在块茎以外的组织能引起诱导的可能性是存在的(与低温处理块茎相比其明显的变化小)。
(5)通过Southern分析认为它是单复制基因。又，在稻、玉米、烟草等中未检出Southern带，作为其它植物的番茄中则检出了Southern带。
(6)将基因组克隆离析成二种，其中之一的开始ATG前后的序列与cDNA序列完全一致。另一种则完全不一致，认为它是将具有高相同性和相同机能的其它位置(locus)的基因进行编码。用反转录PCR作解析，结果认为两种基因的表达方式几乎相同。
(7)对基因组克隆的ATG上游区的碱基序列解析的结果，未发现在低温诱导性蛋白质中常见到的ABA诱导(反应)的基本特点，而在任一种克隆中也都看到了GA反应基本特点。离析的二种基因组克隆在达到ATG上游约500bp处彼此具有高的相同性(80.3％)，而在其更上游则未发现显示相同性的区域。
(8)将离析过的基因组克隆二种之一的启动子序列的一部分以荧光素酶基因(科学(Science)234：856～859，1986)作为信息基而导入马铃薯。由所得的形质转化体进行微管的低温储藏试验，确认了启动子的低温诱导性。又，在形质转化体的叶子上仅发现少量低温诱导性。
本发明启动子序列由(1)～(8)的过程构成，从下述实施例中所详述的方法可以得到。按照本发明，由该启动子序列的碱基序列已清楚，所以含有该启动子序列的DNA可从将马铃薯的基因进行造型的PCR法等而容易地得到。
在序列1和2所记载的序列和来自公知马铃薯块茎的低温诱导性基因没有相同性。因此，可认为本发明的启动子序列是与公知的不同的新型启动子序列。
又，本发明的低温诱导性启动子序列在常温(20℃)下，在发育中的叶、根、茎、块茎中其基因表达非常弱。当将收获的块茎置于低温(6℃以下)时，能诱导其表达。用低温处理，除块茎外的器官(叶、茎、根)也能诱导，但极少。但是，在从低温储藏过的块茎所生萌芽中，则可进行相当多的诱导。另一方面，在已发表的报告(植物生理学(Plant Physiol.)104：445～452，1994)中，没有谈及关于除块茎以外的器官的表达。本发明基因在严格的意义上还不能说是低温储藏块茎特异性基因，但可认为是与其相近的基因，可以说是有效地保持收获后的质量的基因(启动子)。
本发明的低温诱导性启动子序列在低温下能诱导基因表达，一旦回到常温，其表达即解除。按照文献(植物生理学，104：445～452，1994)的分类，可认为本发明基因属于对低温的反应慢的一类(在低温处理约一星期，表达达不到平稳状态，Van Berkel等(植物生理学，104：445～452，1994)对属于此类的基因的离析未获成功)。因此，通过温度进行表达的控制是可能的。
本发明的低温诱导性启动子序列在低温储藏时长时期地诱导表达(至少5个月)。另一方面，在已发表的报告(植物生理学，104：445～452，1994)的基因中则对这一点未确认。通过使用本发明启动子序列可以长时期地控制基因。
作为其它植物的稻、玉米、烟草中未看到与本发明基因有高相同性的基因。而在番茄中是存在的。因此使用本发明的启动子导入稻、玉米、烟草等基因，以使基因不活动(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1770～1774，1991)的少的基因表达。
从上述可知，本发明的低温诱导性启动子序列可以有以下用途。
(i)控制马铃薯低温储藏块茎中的还原糖量(还原糖量的抑制)
通过在本发明的启动子序列下游连结下列基因，能够抑制低温储藏的马铃薯块茎中的还原糖量：例如酸性转化酶抑制剂(Ovalle et al.，植物科学(PlantScience)108(1995)133-141)基因、液胞型酸性转化酶(EMBL数据库登记号(Data Library accession number)X76946)反义基因、PFK(EC 2.7.1.11.国际公开号：WO95/05457)基因、淀粉磷酸化酶(Brisson等人，植物细胞(PlantCell)1(1989)559～566；Mori等人，生物化学(J.Biochem.)266(1991)18446～18453，Sonnwald等人，植物分子生物(Plant Mol.Biol).27(1995)567～576)反义基因、β-或α-淀粉酶(Kreiberg and Gaushmg，12届欧洲土豆研究协会三周年会议摘要(12th Triennial Conference of the European Association forPotato Research.Abstracts)(1993)334～335)反意义基因、ADP葡萄糖焦磷酸酶(Stark et al.，科学(Science)258(1992)287～292)基因等。因此，能防止在加工法式油炸土豆和煎土豆片时的色反应。
(ii)马铃薯块茎发芽的抑制
本发明的启动子具有在低温诱导表达而当回到常温时停止表达的性质，因此，通过将例如酵母转化酶基因(Sonnewald等人，植物(PlantJ.)1(1991)95～100)，大肠菌无机焦磷酸酶基因(Sonnewald，植物，2(1992)571～581；Jelitto等人，植物(Planta)188(1992)234～244)、内贝壳杉烯合成酶(ent-kaurene synthetase)(赤霉素生物合成系基因、Sun等人，植物细胞(Plant Cell)4(1992)119～128)反义基因等连结起来并导入马铃薯、洋葱等植物中，则可在低温下进行基因表达(不发芽)、而在常温下解除表达(发芽)这样的发育控制。
(iii)使植物具有低温耐性
在低温下通过例如甘油-3-磷酸酰基转移酶(Murata等人，自然，(Nature)356(1992)710～718)基因、来自黄花菊属(Flaveria brownii)的丙酮酸盐、正磷酸二激酶(PPDK，Usami等人，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)27(1995)969～980)基因的表达对植物增加低温耐性是可能的。
以下，就作为本发明另一方面的低温诱导性启动子检测用的探针进行说明。
本发明探针：是由序列表的序列3所记载的序列内、在45号～839号碱基序列中、或它们间互补的碱基序列中至少连续15个碱基的序列所组成的DNA片段。上述序列3中的45号～839号的序列或者与此序列有高相同性的序列，存在于低温诱导性启动子序列的下游可能性大。因此，通过用该序列或其中一部分序列作为探针来检测植物基因组DNA，就可能发现在马铃薯或其它植物中存在的新低温诱导性启动子。
探针是基于上述序列而设计的，其长度较好至少连续15个碱基以上，在15个碱基以上直到上述序列的全长、任一长度都行。探针是单链或双链都可以，但至少在使用时成为单链。而且，为了不损失从上述序列所选定的DNA片段探针对上述序列或与此相同性高的序列作特异性杂交的性质而将碱基的添加、缺失、插入或置换的序列也包含在本发明中。还有，这碱基序列的添加、缺失、插入或置换的方法可以使用与上述本发明的低温诱导性启动子所用的方法相同进行。
本发明的探针是从后面所述实施例中的方法所得序列表的序列3中所记载的DNA片段，用适当的限制酶切断而调制成，又，通过用含该序列的试料进行PCR反应也可能调制。或者，用市售DNA合成机(例如Perkinermer公司制)以惯用方法合成可以作为探针的单链DNA。
本发明的探针可用惯用的方法例如用放射线同位素、可检出的酶等进行标记。例如使用32P时，一般使用序列表3所记载的DNA片段时，用随机起动标识标记，又，使用合成引物时，用磷酸化酶作5’末端标记也可以。
用本发明探针时的杂化可用惯用方法进行。一般，用中等程序的杂化强度(42℃～50℃进行杂化，以0.1×SSC洗净)而进行。
对于目的植物的基因组程序库使用本发明探针并检出杂化时，通过这基因特定的上游，可得到新的低温诱导性启动子。
以下，基于实施例对本发明作进一步的具体说明。不过，本发明不受下列实施例的限制。
实施例1差示筛选[上述(1)的过程]
将在4℃下储藏7个月的马铃薯块茎(品种是东洋西洛(トョシロ))的全RNA用SDS/苯酚法提取，用Dynabeads(Dynal公司)精制poly A+RNA。以此作材料合成cDNA，连结于λgt 10载体上，制成程序库(Amershamλgt 10克隆合(cloning Kit)，Amershan日本)。将在制作程序库所使用的poly A+RNA和从长大中的块茎所提取的poly A+RNA用32P作标记，进行差示筛选。
使用文献(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1991～1995，1984)的方法进行杂化、洗净等，比较由上述二种探针所得的射线自显影。将在储藏中被认为是其信号增大的cDNA克隆用牙签平板接种后立即再度进行杂化。将所得射线自显影的信号用密度计测定，选择其信号增大显著的，再与除块茎以外的器官(叶、茎、根、愈伤组织)的mRNA不进行强杂化的克隆(CIP353)离析。
实施例2 Northern斑迹分析[上述(2)和(3)的过程]
将从各种马铃薯组织(品种是东洋西洛的块茎、叶、茎、根和品种为肯纳贝克的培养细胞)来的总RNA用SDS-苯酚法提取，用乙二醛凝胶电泳(分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)分离后，(3μg/lane)、转录在Gene-screen Plus膜(Du Pon+公司)上。作为探针，使用多引物标记(マルチプラィム)(分子克隆：实施室手册，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)过的cDNA(CIP353)的EcoRI片段(全长)。按照在Gene-screen膜所附指南进行对膜的转录、杂化、洗净等。结果示于表1到表3。
表1  在马铃薯各器官或悬浮细胞中的mRNA表达状况
             器官                  mRNA表达水平
             叶*1                      ±
             茎*1                      ±
             根*1                      ±
           悬浮细胞*2                  ±
         增大中的块茎                   ±
     经7个月低温储藏的块茎           + + + + +
        *1由培养苗而来的器官
        *2肯纳贝克品种，其它使用东洋西洛品种
表2  储藏(短期)块茎的mRNA表达状况
    储藏期间        2周       4周      2个月       3个月
      20℃          ±        ±        ±          ±
      15℃          ±        ±        ±          ±
      12℃          ±        ±        ±          ±
      9℃           ±        ±        ±          ±
      6℃          + +       + +       +(+)        +(+)
      3℃          +(+)     + + +     + + +(+)   + + + + +
    6℃2个月储藏后       20℃ 1周储藏   ±
    6℃2个月储藏后       20℃ 2周储藏   ±
    6℃2个月储藏后       20℃ 4周储藏   ±
表3  储藏(长期)块茎的mRNA表达状况
   储藏期间         3个月        5个月            6个月
     20℃             -            -               ±
     6℃             +(+)        + + +            +(+)
     3℃            + + + +    + + + + +         + + + +
   3℃ 5个月储藏后 20℃ 1个月储藏                  ±
   6℃ 5个月储藏后 20℃ 1个月储藏                  ±
   20℃ 5个月储藏后 3℃ 1个月储藏                 + + +
   20℃ 5个月储藏后 6℃ 1个月储藏                  +(+)
 由经20℃5个月储藏的块茎所生的萌芽                 ±
 由经6℃ 5个月储藏的块茎所生的萌芽                 +(+)
如表所示，通常在发育中的马铃薯块茎、叶、茎、根和培养细胞中，上述探针几乎不杂化，又，在各种温度下经5～6个月储藏的马铃薯块茎中，该为在6℃以下储藏的有明显的杂交；而在9℃以上储藏的则几乎没有杂化。
实施例3  组织特异性的确定[上述(4)的过程]
在Linsmaier and Skoog(Physiol，Plant，18：100～127，1965)的琼脂培养基中，在20℃、3000lux、昼长16小时下，使用无菌条作为材料进行3-4周培养。将它们在3℃或20℃下放置，昼长16小时，3000lux下培养四周，培养后0、24周后取样(分叶、茎、根)，提取RNA。进行与上述相同的Northern分析。结果示于表4和表5。
表4  经储藏处理(20℃)的各器官的mRNA表达状况
  储藏期间      未储藏      2周           4周
    叶*1         -          -           (±)
    茎*1         -          -           (±)
    根*1        (±)        ±                        ±
        *1从培养苗来的
表5  经储藏处理(3℃)的各器官的mRNA表达状况
  储藏期间       未储藏      2周   4周
    叶*1          -         ±          ±
    茎*1          -         ±          +
    根*1         (±)       ±          ±
       *1从培养苗来的
从表可知，经3℃保存的叶、茎和根仅看到稍微有点杂交，但与相同温度下保存的块茎相比，则差得多。
实施例4  Southern斑迹分析[上述(5)的过程]
从马铃薯东洋西洛品种、蕃茄家芝麻品种(ハゥスオトリコ)、烟草F104品种、玉蜀黍A188品种、稻朝光品种等的嫩叶的DNA用热苯酚法调制。将从各品种提取的DNA(10μg)用限制酶EcoRI或Hind III消化(在检定马铃薯基因组中的拷贝数时另外使用BamHI、Bgl II、EcoR V、Xba l。限制酶全部使用Takara公司产品)。进行琼脂凝胶电泳复制到Hybond N+膜(Amerham日本)上(分子克隆：实验手册/第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。以多引物标记(分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)的cDNA(CIP 353)的EcoRI片段(全长)作为探针，与实施例1同样地进行了杂化。
结果，确定该基因就是单复制基因。又，在稻、玉蜀黍、烟草中未检出带，而在蕃茄中却检出带。
实施例5  基因组克隆的离析[上述(6)的过程]
将东洋西洛品种马铃薯的嫩叶的DNA以热苯酚法提取，将100μg的DNA用0.0078或0.0156单位的限制酶Sau3AI(Takara公司)部分消化1小时(反应缓冲剂使用Takara公司所附的)。反应在终浓度为40mM的EDTA中停止，在苯酯/氯仿中提取、乙醇沉淀后，使在150μ1的TE中消化的DNA溶解。将DNA经65℃处理10分钟后，在10～40％蔗糖密度梯度在20mA Tris、pH8.0，1mM EDTA，200mM NaCl所组成的缓冲剂中，制备溶解有终浓度为40、32.5、25、17.5、10％蔗糖系列上复层。使用日立SRP28SA转子，经20,000rpm、20℃下离心17小时以上分离后，每0.5ml为一份，用0.5％琼脂糖凝胶分析。将含有15Kb以上片段的各份合并后，用乙醇沉淀法浓缩，其中，使0.4μg与1μg的λDASHII/BamHI(Stratagene公司)连接，用Gigapack II Gold(Stratagene公司)包装。所述连接、包装反应是按照Stratagene公司所附指南进行的。将约80万克隆以多引物标记(分子克隆：实验手册/第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)的cDNA(CIP 353)EcoR 1片段作为探针进行与实施例1同样的筛选，得到2个阳性克隆(LCIP2-10和LCIP1-2)。从噬菌体提取DNA和向质粒载体的亚克隆都按文献(分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)所述进行。
实施例6  反转录PCR分析[上述(6)的过程]
对二种基因组克隆的DNA序列解析结果发现在ATG上游、非译码领域中多个碱基不同。因此，制备含有该领域的序列的合成寡核苷酸12S(5′-GAAAAAGGAAATAAAAA-3′。在来自LCIP2-10的mRNA上是特异的，Tm＝43℃)以及210S(5′-GAAAAAATTAAGAGTAAC-3′，在来自LCIP2-10的mRNA上是特异的，Tm＝45℃)，与来自cRNA内部序列的3′端的反义链引物、325aR(共同使用于两种mRNA，5′-TACACTAGCAACGGGCAT-3′，Tm＝54℃)一起进行反转录PCR。
使用东洋西洛品种马铃薯的各组织的总RNA10μg作为反转录PCR的材料，和寡-dT 500ng混合后(加水，使总量为55μl)，在70℃下处理10分钟。在其中混入反应液(5×1st，单链缓冲剂(BRL公司)20μl，10mMdNTPs5μl，100mM DTT10μl，RNase抑止剂(Pharmacia公司)5μl，过录(Superscript)RTase(BRL公司)5μl)(总量为100μl)，在37℃下反应1小时后，在95℃热处理5分钟，作为反转录PCR造型单链cDNA(该溶液中的cDNA浓度假定是100ng/μl)。
将合成的cDNA1～100ng作为造型进行PCR反应(cDNA1-100ng，引物10pmol×2、2.5mM dNTPs1.6μl、10×PCR缓冲剂(Takara公司)2μl、rTaq(Takara公司)0.2μl，总量为20μl)。使用上述12S和325aR引物时的反应条件是94℃30秒、45℃30秒、72℃60秒、进行30个循环；在使用210S和325aR引物时是94℃30秒、47℃30秒、72℃60秒、进行30个循环。用琼脂凝胶电泳分析PCR产物，结果示于表6。在表6中的LCIP2-10与后述的序列表的序列1所记载的序列相对应；而LCIP1-2则与序列2相对应。从表可知，在任一个来自基因组克隆的mRNA中，都可被认定仅有低温长期间储藏的块茎有明显的表达，由此可见，序列1和2两个序列都有低温诱导性启动子活性。
表6  按PT-PCR的二种基因组克隆来的mRNA表达状况
                                 LCIP2-10   LCIP1-2
                                   mRNA       mRNA
     经20℃4周储藏的叶*1         (±)         -
     经20℃4周储藏的茎*1         (±)         -
     经20℃4周储藏的根*1         (±)        (±)
     经3℃4周储藏的叶*1            ±                  (±)
     经3℃4周储藏的茎*1            +         (±)
     经3℃4周储藏的根*1          (±)         ±
从经20℃5个月储藏的块茎所生的萌芽   +           +
从经6℃5个月储藏的块茎所生的萌芽   +(+)         +
     增大中的块茎                  (±)         ±
   刚收获后的成熟块茎               -           -
经20℃5个月储藏的(成熟)块茎         -           -
   经3℃5个月储藏的块茎            ++(+)        +++
*1由培养苗来的
实施例7  DNA碱基序列的决定、解析[上述(1)、(7)的过程]
程序反应、序列的决定是通过以质粒DNA作为造型的二脱氧法(ABI公司、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)和DNA定序器(ABI公司，373A)进行的，序列的解析是通过GENETYX(软件开发株式会社)软件进行的。
结果，从上述二个基因组克隆中之一得到以序列号1所表示的序列；而从另一克隆得到以序列号2所表示的序列。另外，从上述的cDNA克隆(CIP353)得到以序列号3所表示的序列。
实施例8  形质转化用的载体的制备和通过形质转化法确认启动子的低温诱导性[上述(8)的过程]
将基因组克隆LCIP2-10用限制酶Asp718(贝林格尔公司)消化，将含有开始ATG上游约200bp的Asp 718片段导入pUC19质粒中，得到重组质粒p210A8。其次，将该质粒(p210A8)制成造型，使用M13引物-RV(Takara公司)和210A引物(5′-GTTACTCTTAATTTTTTC-3′)进行PCR(94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒、25个循环)。将放大产物在TA克隆载体(Invifrogen公司)中进行亚克隆，制成仅含开始ATG上游约200bp区的载体p210Pro(200)。将通过该质粒制备的由限制酶Hind III、Xhol(Takara公司)所消化的含有开始ATG上游区约200bp的片段离析，在pHSG399(Takara公司)的Hind III、Sall位点插入，得到质粒pHSG210(200)。将该质粒用Hind III，BamHI(Takara公司)消化，被离析的ATG上游200pb片段利用Hind III、BamHI位点向载体(pLUC101)的5′上游区域插入，得到pLUC210(200)，该载体(pLUC101)的5′上游利用BamHI、SacI位点将pBI101载体(clontech公司)的β-葡萄糖醛酸酶基因取代了荧光素酶基因(Science 234：856-859，1986)。另一方面，制备导入Xbal(Takara公司)消化片段的pUC18载体(p210Xl)，该Xbal消化片段含有从基因组克隆LCIP2-10的开始ATG上游约1000bp；从pUC18载体通过限制酶Asp 718消化而离析的800bp片段(ATG上游约-200～1000bp的区)插入于pLUC210(200)的Asp 718位点中，并将荧光素酶基因与约1Kb的启动子区相连结而制备形质转化用载体pLUC210(1000)。形质转化用载体(pLUC101和pLUC210(1000))通过三系杂化法(植物基因操作手册，讲谈社1990)导入细菌根瘤土壤杆菌LBA4404中，使用于植物的形质转化。
马铃薯的形质转化根据文献(特开平6-133783)进行。以Linsmaier和Skoog(Physiol.Plant.18：100-127，1965)的琼脂培养基和无菌繁殖的东洋齐洛品种的叶和茎作为原料进行试验。将这些组织切成适当大小，在土壤杆菌属菌液中共培养2天后，在含有吲哚乙酸0.1mg/l、玉米素核苷1.0mg/l、卡那霉素100mg/l、头孢素250mg/l的Linsmaier和Skoog(Physiol.Plant.18：100-127，1965)的琼脂培养基中进行培养。在20℃昼长16小时下培养后，将细分化的植物体在含有卡那霉素100mg/的Linsmaier和Skoog(Physiol.Plant.18：100-127，1965)的琼脂培养基上继代繁殖。
将繁殖的形质转化体，切出各单节，在Linsmaier和Skoog(Physiol.Plant.18：100-127，1965)的液体培养基上培养3～4周(20℃昼长16小时)，随后，换成含蔗糖80g/1的Linsmaier和Skoog(Physiol.Plantl.18：100-127，1965)液体培养基，在20℃、黑暗下培养4～5周以上。将形成的微管经水洗、除去水分后放入培养皿，在黑暗下、20℃或40℃下储藏。在Linsmaier和Skoog(Physiol.Plant.18：100-127，1965)的琼脂培养基中生长的植物体也用于黑暗下20℃或40℃的储藏试验。
荧光素酶活性测定是根据文献(Science 234：856～859，1986)进行。加入相当于其粗重3～10倍量的提取缓冲液(100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、1mM二硫苏糖醇)，磨碎后，离心分离(15000rpm、5分钟)将其上清液作为粗提取液。该粗提取液50μl与活性测定用缓冲液(36mM甘氨酰基甘氨酸缓冲液(pH7.8)、1mg/ml牛血清清蛋白、20mM氯化镁、12mMATP)100μl混合后，加入0.4mM荧光素100μl，用荧光计(6100型，帕加特公司)测定荧光素酶活性，结果示于表7和表8。
表7   在马铃著形质转化体的叶上的荧光素酶活性
    系统      形质转化所用的构型    储藏条件   荧光素酶活性
                                               (cps/mg蛋白质)
 LUC1000-1-1     pLUC210(1000)        未储藏      25900
 LUC1000-1-1     pLUC210(1000)       4℃、4周     36000
表8  马铃薯形质转化体的微管中的荧光素酶活性
   系统      形质转换所用的构型     储藏条件   荧光素酶活性
                                              (cps/mg蛋白质)
 LUC101-2-1       pLUC101*         未储藏         217
 LUC101-2-1       pLUC101*         20℃、4周      166
 LUC101-2-1       pLUC101*         4℃、4周       245
 LUC1000-1-1    pLUC210(1000)       未储藏        78200
 LUC1000-1-1    pLUC210(1000)       20℃、4周     23800
 LUC1000-1-1    pLUC210(1000)       4℃、4周      149000
*缺失启动子的构型，作对照用。
从表可知，在低温(4℃)下储藏4周的微管中观察到活性显著上升。又，尽管其活性低于微管，但在叶中也看到低温下的活性稍有上升。因此，序列1所记载的序列内由2418号～3541号的碱基所组成的DNA序列(启动子片段)明显地具有在低温下诱导基因表达的作用。
                         序列表序列号：1序列的长度：3600序列类型：核酸链数：双链拓朴结构：直链状序列种类：基因组DNA起源：
生物名：马铃薯(Solanum tuberosum L.)
品种：东洋齐洛直接的起源：
程序库名：由绿叶基因组DNA来的λDASH11基因组DNA程序
    库序列的特征：序列GATCTATGAT ATTCCTTTAT CAAATTTTAG ACTAAGGAAG GATTAATGAT AAGTTTTGAA   60TATTTGTTTC CAAGATAAAT TAAAGTTAAC AAGTCTTATC ATTGGATTCT TAAAGAAGAT  120TTTTATAATG TTGCATCACT TGTTACGATT GACCTAAAAA TTGTTGTGTA CTATTTTGAT  180TTATTGAGAA AACGAATCAT TGTTGTATAG GGTAAAAATG GGTTGGACAT CACTACTAAA  240AATAATGGAA AAATCGACGA ATAAGGTGAG TCTAAAAATT GACAATGTTC ATCGATTTTT  300TTTCATGCAA AAATTATAAT TTCTTAATTT TTTTTTTTTT AAATGATACA GTTCCTTGGT  360TTCAATTAAT TCCATACAAA ATTGACGAAC ATGATCAGTT CCCGGAGTGT AAACCTACAG  420TTGAATATTA TAAATAAAAA CGATGAAATA TTTTATGAGA ACATGTATGG ATCGAGTGGT  480AGAATTTTCC AAATTCCTAA AAAATACTTG GATTCACTTC CAAATAGGTA CATTCTATAG  540GTATATTTTT TGAAAAAACG ATGACACTAT CAATAGCTAA GTGAATATTA ATGTTGTTTT  600AACAAAGCAC GATATTGCTA TAACAATTTT TTTTTTTTGG TCAAAATAAA TTCAAATGTA  660CCATTTTCAT GGTAAACACA ATATTGCCAT AACAATTTGT TTTTAATAAA CGAGATTGTT  720ATCAAGAAAT TTTAGTTAGC GATATAAACG TGACCATGCT ACATTTTTTT TTTAACCTTT  780GAACTTTAAT TTATCAACTT CAAGTTAAAA GTGAGTGAAT TCTTTTGAGT TCTAGAGTTT  840GTGCAGTGTT TGGATTTTTG AAAACATTTC ATTTGCTACC ACGATGATCT CACCCTCCAA   900TTAGGTGGCC CTTTCTTTAC CGTCCGATCA TTTGGTACTC TACATTTTTG TCATAAACTT   960TCAATTTGAT CATTGAACAG TCAAATATAT TTAATCTTTA GGCCAAATAC ATATAGACAA  1020CACATTTTAG AGATGGTTTG ACTTTTGACT TTTGGATTTA TAAGCCAAAA GTAATAAATT  1080AAAACATTTT AGCTTACTTT TACTATTTTA CTTTAAAATC AAATGGTTAT AAGCACTTTT  1140TTTAAAAAAT TTATTCAAAC ACACTAAAAT GCTTTAAAAC ACTCAAGAGA AATTAATTCA  1200CATAGACTTT GGTTTCAATT TTTATTTTGG GCACTCATCA ACCTTATTTC ATTTTTATTT  1260TAATCTTTCA ATTTTATTTT TCATCTATCA TCTAAGCACG AAAAATATTA TTAAATGTAA  1320ATTGTTCAGT AAATAACGTC ATGTATTTCA TTTTTTTTTT TGTATGTCAT CTTGGTCTTC  1380TGCATTTAAC CCAAATATCC AAAAAGAAAT TTATATTAAC TTAGCTCACA ATTGATAAAA  1440ACAACCTATC TTCAATACAG GTAAAAAGAA AAACAAACTT CGGTTCACTA TTAATAAAAA  1500TACTAAAATG CGACGAGCTC CGTGGGGTTA TGAACATTTA AAAAATAAAT AAAAAAATTC  1560GTACTTTCAT CCATTGCTTT TTTCATAAAA ATATACAGAA ACTATAAATA ATTATTTTTA  1620AAACTCTTTC TTGAATCAAC AAACAAATTG ATTGAGAAAT CCAAATTGAT CGATGTGCAT  1680CGATTTTTTT ATTAAAATAT TAACAGATTT CTGTCACATG TATAAATAAT ACATAA AAAT 1740AGAATAAGGT TAACATTTAG TGCCAATATT TAAAATGTGG ATAAATTAAA GGGGTGGGTT  1800TGTATATTTG GTCTTATCTC TAAGTTTTTA TTTTGTCATA CATTTTAAAA TTGAAACTTG  1860AGAAATAATT TTAAAATATA TATACTTAGA TATATATTTG AAAAAAATTT AAGTATTGTG  1920AATGAAAGTC CCAAAATTCA AAAACTGATC AAGACAATTT TTTAAAACTT GAAAAATATT  1980TAAAACAATT TTTCAAAATC TATAGTCAAA TAAGTATTTT TTTTTAAAAA AAAATTCAAA  2040AATCTAATTC TAAATATATA ACCAAAACTA GCCTCAATTC ATGAACTTGA TTGGTTACTA  2100CCACTACCAG CATATATATT GTTTTATGAG CTATATAGTT CAAAATTGGT GCATACTTAT  2160CAAGACCGGT ATGAGCCTAG ATTGAGATGC TTTGATTATT ATTCCTCGTT TTAAAATAAG  2220TGAATTATTG TGATAATATA TTTTTATTAA AAAATTAGAT ATAAATTAAA TATTATTTTT  2280TATTTTTACT CTTTTAGTTA TTTTCAAACT ACTCTTAAAA TAATATAATT AATTTCAAAT  2340AAACTCATAA ATATAAATAA TTAAATCTCT TTAATCACCT AGCAAATGTA AATAAAAGAC  2400AAAAAAAAAA GAAATTTTCT AGAACTCTCT TGGAACTTCG AACAATTCAC ATTTAAAAAA  2460AAAATGAAAA AAATTCAACA ATTCACTTTT TTTAAATGGA AAAAGTATTT CAATTCGATA  2520AGTAAATATA ATACGTGCAA TCGATTTGTG AAATGTAAAT ATCAATTGGT TAATAAATTA  2580ATTAATCATT ATTATTGGAA TTCAGTTCCT AGCAATCTTC TCAATATGTG CTCCCTAGGT 2640CCTTTTTTCT TGTTATTTTT GATAAATTAA GAAAAAGATA ATTTTTTATG GAAAAATGAT 2700CTGAAAAAAA TACTAACTTT GGCTGAATTT GATGTTACGA TACCAAACTT TCATGAGGAC 2760CTATTACCCC CTAAAATATT TAATACCGTA TTTTTTACCC CCTGAACTAT TTAATAGTGT 2820ATTTTGAAGG TATATATGTG CCCACGTGAA CACATTACTA TTTATAATTA TGCAATATTT 2880TTTATGTCCA CGTGGGCACA TATATATGTT AAAAATATGG TATTAAATAG TCTAGGGGGT 2940AATAAGTCCT CATGAAAGTG TGGTATCGTA ACAACAAATT TGGCCAAAGT TGAGTATTTT 3000TCAGACCCCC TTATTCCTAT TTTATCTACT ATATCCTCAA TTTATTTAGA AAGTTGATAT 3060TTTTGAAAAA AATGAAACCT CTTTTAATGA GTAAATTAAT TTAAATTTTT TAACAATTAA 3120TAGAAATAAA ATAATAAATT TACTATATCA ATTATTTTTT TAACAAATAT ATTAAGTCAA 3180AGATGAATAA GTAAATACTA AATAGTGACA GAGCGTATAT GAATAAGTAA ATAGTAAGAG 3240AGGGAGTATA TAACTACATA TTCGTAACGG AAGCACTAAT TCCAATGTGC TTTTAACAGA 3300CAACAATTGT CGAAATTGCG TGAATTTTAT GTAAAGGTAC CATAAGTGAA CAATTCAAGA 3360AGTTTTAGGT TGTATATGCT AGATGAATTA TCTAAGAGGT ACAAGATTAA AAGTAATGAA 3420TTACTAAGGG ACTACACTGC AAATATCCTT TCCTATAAAT TAACACTCAC CCCAAGCACA 3480ATTTTATCGT CTCTTTCAAT TACTTTCACT CAAAAAAAAA AAGGAAAAAA TTAAGAGTAA 3540CAAAAGATGT GTGGAGGTGC CATAATCTCC GATTATGAGC CCGCCGGAAA CTTCTACCGG 3600序列号：2序列长度：4140序列类型：核酸链数：双链拓朴结构：直链状序列的种类：基因组DNA起源：
生物种：马铃薯(Solanum tuberosum L.)
品种：东洋西洛直接的起源：
程序库名：由绿叶基因组DNA来的λDASH11基因组DNA程序
    库序列特征：序列GATCAAATAA GGTTTTTCTA AAAGAGAATT CAAAATCTAA TTTTAAATAT ATAGTCAAAA    60CTAGCTTCAA TTCATGAACT TGATTGGTTA CTAGTTACTA CCAGTACTAG CATATATATT   120GTTTTATGAG CTATAGAGTT TAAAATTGGT GCATACTTAT TTATGAAGAC TGGTATGTGC   180CTAGATTGAG ATGCTTTGAT TATATTACAC CTCATTTTAG TGAATTGCTG AAACAATATA   240TATTTATTAA AAAAAATTAG CTATAAATTA GATATTATTT TTATTTTTAC CTTTTTAGTT   300ATTTTCAAAT TATTTTTAAA AATATAATTA ATTCAAAATA AACTCATCAA TATAGATAAT   360TAAATCTCTT GAAATTATTA CCTAGAAAAA TATAAATGAA AGACCCAAAT AGAAAAATTA   420ATAATTCAAT AACTCTCTTG AACTGTGAAT AACTCACTTT TTTTTTTAAA TATGAAAAAA   480AAACACTACA ATTCACTTAT TTTGAGATGA TAAAAGTATT TCAGTTTCAA TAAGTGAATA   540TAATATGTGA AGTGTGATAC GTGAAATGTA AATATCAAGG CCAGAAAACT TAAGTATACA   600ACTTAATAAC TTTAATTACG CGAATATAGC AATACTTTTT TTTTCAATTG AATAGCAATA   660TTTTTTTTTC CAAACTGGAA TTCTTATTAA GAAAAAAAAC GTTTTCAGCC ACAATTATCC   720ATATCCCTTA GATTTCTCCA ATTATTTTAC CTTTCCTGAG TTACTTCAAT TTGTTATATA   780TCATATCCCA TAAAGGAAGG TTTCCTACCA AAATAAAACT TCTCTTTCAA ACAAAGATCG   840ACGATCAAAT ATTCAAACCC AATAATTTTT CAATTTTAAT TCATCACAGC GGGCATTGGG   900ACTCATCAGG TAATCTTTTT GGTAGTAATT CCTTTGATTT TGTCGAATTT GGTGGAATAT   960ACATTCATAA GATTTTGGTT AATGTTCTGG TGCAACTGTA AAAGGGTTAA TTATTAAATA  1020GATATTAAGA TTTAGCAATT GTTTGTGGAA TATTATTAGG ATTTTCACAT AATCTGCGTT  1080TTAATTCTTT TTGGTATTTA TTCGTTGTTT TATATTAACG TTTTTGGTGT AATACAACAA  1140CATCATATGA TTTTGGTTGT AATATGATGC GTCGAATAAG TTTTTTTATA ATTTTTTTTA  1200GGTTAATTGG TATGTTGCAT GTCGAATGTT GACAAATTTT ATCAATAGTT TCTTTTGGTA  1260TGTGATGTGG TGTACACATA CAACTTGAAG TTAAATTTCA GGTATATATT TTTGTGTATT  1320TAGTTATATT ATTTGGTATA TAAAATATAA CTTTAAAATA ATGGTTAGTT TTTTGGTGTA  1380TTTTATTTAT CCGAATTGGT TGAAGATAAT AATTTGAAAA TTGGTCATAT GTGATTTGGT  1440ACTTAATTTG ATATATTTGT TTCTATAAAT TGATGGTAAA TTAAACTTTA GCAATGTGTT  1500GGTGTATTTT TGGGTTAAAT GTCAGATTAC TTTTGGTACG TCGATTGGTG TAATACATTG  1560TATGGTTTAA CTGATTGTGT GAATTACCAC AGATTGGTTT AAGTATGTGA TGTGGTAAAT  1620GACACCAAAA TAATACTCTG ATGTATGAGT TGGTATATTT ATTGGTCTAA TATATAATAC  1680CATAATTTTA AAATAGGTTG TTGTTGTGTA AATAGATATG TTAACTATGA AAAATATTGC  1740GTGAATGAAT GCTTCGTATG TTGTGTGACA CACCAATTTT AATTAATTTG ATTAGATAAA  1800ATGATTGAAG AATTTTGGGT TAAATTATGG TGTATATCTT GGTCTAGTTT ATGTATTTCG  1860TATAATAGTG CACTATACAC CACCAGTTAA TCATGATGTA CAATACTGTT CAAGATAGCA  1920ATGATAAAGT ATCATGTGCA CATGTTTTTT TAATTAAAGT TGAAAATGGT AATTTGCTTG  1980GTTAGTTTGT GGTGTATATG ATTGGTGTAT GTCATATATT AATATATTAG ATTGACCTGT  2040ACACCAAAAC ATCACCATAT TATGCACCAA AGCGTCACCA TACTGTACAC CAAAGTGTCA  2100CCATATTATA TACCATTTCT AATTAATTTG TAATTTAAAA AATTATAAAT AAGTGGTTGT  2160AATATGATGT TATACATTGC TTGTAGGTTA GTATGTGTCT AACTATTTAT CGAAATGTAT  2220CGCAGGAATT TATGTGGATT TCAAGATTGA AGGAGTGATA CATGACACAA ACACCCAAAA  2280GACGTTTACC AAATAGATAC AATACTTTGT AATTAATTTT ATTTTTTTAT GAATGAAATT  2340TTTACTAATA CTAGTGATTT TTTCATATAT ATTGGTATAA TTATTTATTA ATTCAATGAT  2400AAATATTGAT AGATAGTTGA TAATATTATG GTGTAAGGCA ACATATAGTT ATAATATATA  2460ACAAAAATTA ATGTTATAAT CATGAATTTT TACTTCATGT GCAATTTAAT TATTTGTTGG  2520TGTAAGTTAT TCATTGTGAT TAAAAATAAT TGTACACCAA ACTTAATTTA CAATGTACAT  2580TATTTAATAT ACTTTTTTAA AAAAAGTTAA AACTATTGAA TGGTGCTATG GTTTATAATA  2640GGAATAAAAT TTGATTATAT TTTGGTATAA GTTATATATT GTGGTTACAA AAAAAATGGT  2700CAACAATATA ATACAAATTC TATACCATTT AATATACTCA CCCCCCACCC CACCCCTTTT  2760TAACTGACAT ATATAAAATT GAAGAGAGAA GTAAAAAAAG ATCTTCCCAT AATAATTGAA  2820ATGAAATACC AGAGAGAAAA AATAAATTCA ATAGTAATTG TATGAAATTA ATGAGAAACG  2880TGCTTAACTA TAGAAATCAT ATTAATTAGA TGATACATTT TTACTCCCTA AAAATTAGGA  2940CATCCAAATC TAAAAAGATA ATAAGAACAC ACGTAATTGA AGAGAGAGAG AAAATTAGCA  3000TCAAATTCTA AAAAGATAAT TAAAAAACAC GTAATTGAAG AGAGAGAAAA AAATTAGCAT  3060CCAAATCTAA AAAGGATAAT TTTAAAAAAA CGTAATTGAA GAGAGAGAAA AATATTTTTT  3120ACCATAGTAA TTGTATTAAG TAAAAAAGAG AAAAAAAATC TTTAAGTAAA AGAAATGTAT  3180GCAATTATAA TTGTGATTGA TAATCTAAAT GGTAAAAATA ATAAATAATG AGTTCCATAA  3240AATAAGTCAC TAAGCCACAA AAATAGGTAT AAAAACGTGT GAGTGTGAAG ATATATATAT  3300TTAATAAGTT GTCATATTTC TAATTAAAAT GTTATTGTTA TAAATAAAAA GAGTTTGAAA 3360CTGTTTAGGA GAGAGAATAT TTGATAATTA TTAATATCCT AATTATACTC CATATAAAAG 3420GCATGAAATA CTAATAGTAT GAGAGAGAAA AATCTATAAA ACCAAAATTA AATTAAATGT 3480TTGTTATTAT GTAATTTAAA AACTTAGTTT GTAATTAAAT ATAAATATAT TGATATTTTT 3540GTTAAATAAA AGTCTTAAGT AGTATATTTT TGTAATTTTC ACTAATAATA TAATATCAAT 3600CGATTGATGA ATAAGTGACT ATATTTTTAT TTATTATACC CTCAATTTAT TTAGAAAATT 3660AATGTTTTTG AAAAAGATGG AACCTATTTT AATTAGTAAT TAATTTTGAA TTTTTATCAA 3720TTAATAAGAG CCAAATAATA AATTCATTAT ATCAAATTTT TTTTATTAAT ATATGTGTTG 3780AATCAAAGAT GAATAAGTAA ATAGTAACAG AGGAAGTATA TGACTACATA TTCGTAACGG 3840AAGCACTAGT TCCAATGTAC TTTTAACGGA CAACAATTGT CGAAATTGCG TGAATTTTAT 3900GTAAAGGTAC CAAAAGTGAA CATTTCAAGA AGCTTCAGGT CGTATGTGCC AGACTAATTA 3960TCTTGGAGGA ACAAGATTAA AATTAATAAA CAACTAAAGG ACTAATCTGC AAATATCCTT 4020TCCTATAAAT TAACACTCAC CCCAAGCACA ATTTTATCGT CTCTTTCAAT TACTTTCACT 4080CAAAAAAAGA AAAAGGAAAT AAAAAAAAGA GTAAAAAAAG ATGTGTGGAG GTGCCATAAT 4140序列号：3序列长度：1132序列类型：双链拓朴结构：直链状序列的种类：cDNA起源：
生物名：马铃薯(Solanum tuberosum L.)
品种：东洋西洛直接的起源：
程序库名：由低温储藏块茎mRNA来的λgt10cDNA程序库序列的特征：
特征表示的记号：CDS
存在位置：45-836
决定特征的方法：序列CTTTCACTCA AAAAAAAAAA GGAAAAAATT AAGAGTAACA AAAG ATG TGT GGA GGT     56
                                             Met Cys Gly Gly
                                               1GCC ATA ATC TCC GAT TAT GAG CCC GCC GGA AAC TTC TAC CGG AAA CTC     104Ala Ile Ile Ser Asp Tyr Glu Pro Ala Gly Asn Phe Tyr Arg Lys Leu5                  10                  15                  20TCT GCT CGT GAC CTG TGG GCT GAG CTG GAC CCT ATC TCC GAC TAC TGG     152Ser Ala Arg Asp Leu Trp Ala Glu Leu Asp Pro Ile Ser Asp Tyr Trp
             25                  30                  35TCC TCT TCC TCC TCA TCC TCA ACT GTC GAA AAC CCT TAT TCC GCT CAG     200Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Val Glu Asn Pro Tyr Ser Ala Gln
         40                  45                 50TCG CCG GTG ACT CAC TCC GTC GAT AAG CCT AAG AAA TCA GAT TCC GGC     248Ser Pro Val Thr His Ser Val Asp Lys Pro Lys Lys Ser Asp Ser Gly
     55                  60                  65AAA TCT AAT CAA CTC AAA AAA GGT AAT AAG ACT GTG AAG GTT GAG AAG     296Lys Ser Asn Gln Leu Lys Lys Gly Asn Lys Thr Val Lys Val Glu Lys
 70                  75                  80GAG AAG AGT ACT GGA CCA AGG CAG AGA AAG AAC AAG TAC AGA GGA ATA     344Glu Lys Ser Thr Gly Pro Arg Gln Arg Lys Asn Lys Tyr Arg Gly Ile85                  90                  95                 100AGG CAG AGA CCA TGG GGA AAA TGG GCT GCT GAG ATT CGC GAT CCT CAG     392Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gln
            105                 110                 115AAG GGT GTC CGT GTT TGG CTT GGT ACA TTC AAC ACA GCA GAG GAT GCT     440Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Asp Ala
        120                 125                 130GCC AGA GCC TAT GAT GAG GCT GCT AAG CGC ATT CGT GGT AAC AAG GCC    488Ala Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Arg Ile Arg Gly Ash Lys Ala
    135                 140                 145AAA CTC AAC TTC CCT GCC CCA TCA CCA CCT GCT AAG CGA CAG TGC ACT    536Lys Leu Asn Phe Pro Ala Pro Ser Pro Pro Ala Lys Arg Gln Cys Thr
150                 155                 160AGC ACT GTC GCT GCT GAT CCT CCA CCA GCA CTA CTC CTT GAG AGT TCT    584Ser Thr Val Ala Ala Asp Pro Pro Pro Ala Leu Leu Leu Glu Ser Ser165                 170                 175                 180AAC ATA ATA TCT TAT AAC AAT TCT CCT TTA ATG AAC TTC GGA TAT GAT    632Asn Ile Ile Ser Tyr Asn Asn Ser Pro Leu Met Asn Phe Gly Tyr Asp
            185                 190                 195GTT CAG AGC CAA ACT CCC TAC TAC CCA ATG GAA ATG CCC GTT GCT AGT    680Val Gln Ser Gln Thr Pro Tyr Tyr Pro Met Glu Met Pro Val Ala Ser
        200                 205                 210GAT GAT TAT GAA CTC AAG GAA CAG ATT TCC AAC TTG GAA TCG TTC CTG    728Asp Asp Tyr Glu Leu Lys Glu Gln Ile Ser Asn Leu Glu Ser Phe Leu
    215                 220                 225GAA TTG GAG CCA GCA GAT TCA TCT GAT CAG TTT TCA GGG ATC GTC GAT    776Glu Leu Glu Pro Ala Asp Ser Ser Asp Gln Phe Ser Gly Ile Val Asp
230                 235                 240CCT GAT CCT CTT AAT GTT TTT CTG ATG GAG GAT TTT GCT TCA ACT CAG    824Pro Asp Pro Leu Asn Val Phe Leu Met Glu Asp Phe Ala Ser Thr Gln245                 250                 255                 260CAT CAG TTC TAT TGATCCTGAG TTGTTTGGTG AGTGATGAGT GACTAGTTTA        876His Gln Phe TyrTTAGCTTTTG GCTGTAGTAG TAGTAATAGA GAAAAAAGTA CATATGATAT GATAATAATA  936AGTTGCGTGC CTTAGCCTGC AATTGTAATA GTATCAATGT TTGTTGTCTT GTGTTGTTTA  996TGCTTTCTAA ATCTTGGATT TACCTTATAA TGTTTGGTCA TTTGGTGTAT GTATTGTAAC 1056TATATATGGA GTACTTTATT ACTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATAAAAAAAA 1116AAAAAAAAAA AAAAAA                                                 1132

Claims (3)

1.具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是由序列表的序列1所表示的碱基序列中1号～3546号的碱基所组成的序列；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失，置换，插入或添加。
2.具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是由序列表的序列1所表示的碱基序列中2418号～3541号的碱基所组成的序列；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失，置换，插入或添加。
3.具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，其特征在于，该DNA序列是由序列表的序列2所表示的碱基序列中1号～4120号的碱基所组成的序列，或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失，置换，插入或添加。
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