CN1394233A - 法尼焦磷酸合酶蛋白质、核酸及其启动子区域 - Google Patents
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Abstract
通过具有序列表中序列号2记载的碱基序列的酒花法尼焦磷酸合酶的基因组DNA、具有序列表中序列号3记载的碱基序列的酒花法尼焦磷酸合酶的cDNA以及基于上述基因组DNA与cDNA的碱基序列信息发现的在酒花蛇麻素腺毛中特异性表达的法尼焦磷酸合酶基因的启动子区域，明确了酒花中与二次代谢产物的生物合成有关的基因以及在酒花的蛇麻素腺毛中组织特异性地发挥功能的启动子基因的碱基序列，使利用基因工程学方法的酒花性状转化和酒花的二次代谢产物在试管内的合成成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及酒花的法尼焦磷酸(FPP)合酶基因以及上述基因的启动子区域。
背景技术
植物在其植物体内产生并蓄积萜类、生物碱、酚类、皂甙等种类繁多的低分子有机化合物。当初，认为这些化合物与维持生物的生命并没有直接关系，仅仅是次要的功能，因此曾被称为二次代谢产物。
但是，近年来，逐步明确该二次代谢产物作为与细胞分化或防御外界因子有关的物质发挥功能，随之在嗜好物、药品、染料等广泛领域发现了利用方法，其实用性不仅在农学领域，而且在广泛领域都得到了瞩目。
这种二次代谢产物由于在产业上利用价值高，植物细胞内的生成过程逐步明确，目前表明这些物质是经多种酶等参与的复杂级联而生物合成的。但是，为了得到这种物质，必须从植物中直接提取，在这种情况下一次能够分离的量非常少，结果成本增高，因此期望开发一种利用基因工程学技术和培养细胞等的试管内合成方法。
作为植物中与二次代谢产物的合成级联有关的酶，已知法尼焦磷酸合酶。法尼焦磷酸合酶是与植物中作为色素、香味、植物激素、防御素、对害虫等的防御物质等各种物质基干的类异戊二烯的代谢有关的酶(Plant Biochemistry & Molecular Biology，Hans-Walter Heldt，Oxford University Press，pp360-376，1997)，已知除了催化在异戊烯焦磷酸上加成二甲基烯丙基焦磷酸转变为焦磷酸香叶酯(geranylpyrophosphate)的反应以外，还催化在上述焦磷酸香叶酯上加成异戊烯焦磷酸转变为法尼焦磷酸的反应。
另一方面，酒花是赋予啤酒爽快的苦味和香味的主要原料，但是已知该酒花中也会在球果内含有的蛇麻素腺毛内大量分泌二次代谢产物，该二次代谢产物非常有助于啤酒的苦味和香味。而且，近年来表明这种酒花的二次代谢产物具有药理作用(例如，Biosci.Biotech.Biochem.，61(1)，158，1997)。基于这些原委，对酒花也进行了着眼于苦味质、精油成分这种蛇麻素腺毛中蓄积的二次代谢产物的各种品种改良。
但是，酒花是雌雄异株的植物，特别是雄株不带有作为啤酒原料的球果，在商业上得不到重视，因此进行的研究不太多，对于酿造上有用的遗传性状也几乎不明确。因此，目前的现状是按照以前利用交配的育种方法，依赖于经验和直觉的部分较多，特别是对于酿造质量实际上完全预想不到球果附生。因此，对于酒花也强烈希望分离上述法尼焦磷酸合酶基因，通过利用基因工程学方法的研究，确立一种酒花中二次代谢产物的控制方法或试管内合成方法。
另一方面，目前性状转化技术和分子筛选技术这些利用基因工程学的育种方法逐步在各种植物中成为可能。采用这些方法的情况下，与依赖于经验和直觉的部分多的传统育种方法相比，能够更客观有效地育种。也就是说，性状转化技术是将外来基因引入植物细胞内并使之表达，直接引入所要赋予的性状的技术，为了使外来基因进行表达，采取下述方法：将所需的结构基因以及在植物细胞内可以发挥功能的终止子连接在控制基因表达的在植物细胞内可以发挥功能的启动子上，将其引入植物细胞内。迄今为止，作为实验水平上常用的启动子，有在比较多的植物中不问组织均能使引入基因进行表达的CaMV 35S启动子和胭脂氨酸合成酶基因启动子(Sanders P.R.et al.Nucleic Acid Res，15(1987)1543-1558)等。但是，使用上述启动子使引入基因在所有组织中表达时，根据引入的基因有时会对植物的生长发育等带来不良影响，因此强烈需要分离出一种使外来基因在目的组织中进行表达的组织特异性启动子基因。
发明公开
本发明是鉴于上述现有技术中存在的课题而提出的，其目的在于明确酒花中与二次代谢产物的生物合成有关的基因以及在酒花的蛇麻素腺毛中组织特异性地发挥功能的启动子基因的碱基序列，使利用基因工程学方法的酒花性状转化和酒花的二次代谢产物在试管内的合成成为可能。
本发明人为了实现上述目的反复进行了悉心研究，结果发现了在酒花的蛇麻素腺毛中强烈表达，与二次代谢产物的生物合成有关的法尼焦磷酸合酶基因及其启动子基因，从而完成了本发明。
也就是说，按照本发明，可以提供以下1～2记载的蛋白质。
1、一种蛋白质，具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列。
2、一种蛋白质，其特征在于，具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，而且具有法尼焦磷酸合酶活性。
另外，按照本发明，可以提供3～10记载的核酸。
3、一种核酸，其特征在于，编码具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列的蛋白质。
4、一种核酸，具有序列表中序列号3记载的碱基序列。
5、一种核酸，其特征在于，由序列表中序列号3记载的碱基序列的一部分构成。
6、一种核酸，其特征在于，与具有序列表中序列号3记载的碱基序列的核酸，或者互补的核酸在严格条件下进行杂交，而且编码具有法尼焦磷酸合酶活性的蛋白质。
7、一种核酸，具有序列表中序列号2记载的碱基序列。
8、一种核酸，其特征在于，由序列表中序列号2记载的碱基序列的一部分构成。
9、一种核酸，其特征在于，具有序列表中序列号2记载的碱基序列中碱基序号1～1886表示的碱基序列。
10、一种核酸，其特征在于，与具有上述7～8记载的碱基序列的核酸，或者互补的核酸在严格条件下进行杂交，而且具有启动子活性。
而且，通过采用这种蛋白质或核酸，使利用基因工程学方法的酒花性状转化和酒花的二次代谢产物在试管内的合成成为可能。
附图的简单说明
图1是表示分离本发明的法尼焦磷酸合酶基因的过程中得到的核酸片断的图。
图2是表示本发明中采用的反向PCR法原理的示意图。
图3是表示本发明中采用的Casett-ligation mediated PCR法原理的示意图。
图4是表示测定本发明的法尼焦磷酸合酶活性的薄层色谱展开图象的图。
图5是确认本发明的法尼焦磷酸合酶基因表达的Northern解析照片。
发明的最佳实施方式
以下，根据情况参照附图，对本发明的优选实施方式进行详细说明。
本发明中“核酸”是指可以为例如DNA、RNA或者诱导的活性DNA或RNA的多核苷酸，优选DNA和/或RNA。这时，作为上述核酸的形态，例如基因组DNA(genomic DNA)、cDNA、mRNA。
另外，本发明中“严格条件下进行杂交”是指2个核酸片断在Sambrook，J.等的“大肠杆菌的克隆化基因表达(Expression of cloned genes inE.coli)”(Molecular Cloning：A laboratory manual(1989))ColdSpring harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47-9.62以及11.45-11.61记载的杂交条件下进行相互杂交。
更具体地说，“严格条件”是指例如在约45℃下采用6.0×SSC进行杂交后，在50℃下采用2.0×SSC进行洗涤。为了选择严格性，可以在例如作为低严格性的约2.0×SSC、50℃至作为高严格性的约0.1×SSC、50℃的范围内选择洗涤工序中的盐浓度。而且，可以使洗涤工序的温度从低严格条件的室温(约22℃)增大至高严格条件的约65℃。
另外，本发明中“启动子”是指DNA上存在的碱基序列中，支配使RNA合成(复制)开始或结束的指令、或者调节其频率的指令的信号序列。
另外，本发明中“启动子活性”是指上述启动子发挥如上所述进行复制开始、结束及其调节的功能。
首先，对本发明的酒花法尼焦磷酸合酶进行说明。
本发明的蛋白质是具有下述氨基酸序列的酒花法尼焦磷酸合酶蛋白质，所述氨基酸序列具有序列表中序列号1记载的342个氨基酸残基。
另外，本发明的蛋白质只要是具有法尼焦磷酸合酶活性的蛋白质，也可以是具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列的蛋白质。
而且，多数蛋白质上可以添加糖链，通过转变1个或多个氨基酸能够调节糖链的添加。因此，在序列表中序列号1记载的氨基酸序列中，调节上述糖链的添加得到的蛋白质只要具有上述法尼焦磷酸合酶活性也包括在本发明的蛋白质中。
另外，具有编码上述法尼焦磷酸合酶蛋白质的碱基序列的核酸也包括在本发明中。也就是说，由于编码一个氨基酸的碱基序列(密码子)存在多种，因而编码序列表中序列号1所示的氨基酸序列的核酸也存在多种。因此，这种核酸也包括在本发明的核酸中。这里，“编码蛋白质”是指DNA为双链时，互补的双链中任意一条链包括具有编码蛋白质的碱基序列的部分，因此本发明的核酸中也包括直接编码序列表中序列号1记载的氨基酸序列的碱基序列构成的核酸或者其互补的碱基序列构成的核酸。
其次，对本发明的法尼焦磷酸合酶基因进行说明。
本发明的核酸具有序列表中序列号3记载的碱基序列，是编码酒花法尼焦磷酸合酶的核酸(cDNA)。
另外，本发明的核酸也可以是由上述序列号3记载的碱基序列的一部分构成的核酸。
而且，本发明的核酸也可以是与具有上述序列号3记载的1029个碱基的碱基序列的核酸在严格条件下进行杂交，且编码具有法尼焦磷酸合酶活性的蛋白质的核酸，只要满足这种条件，其碱基序列并没有特别的限定。而且，本发明的核酸中也包括具有与上述在严格条件下进行杂交的核酸互补的碱基序列的核酸，具体而言，例如具有上述序列号3记载的碱基序列的核酸缺失、取代、插入、添加若干个碱基，且编码具有法尼焦磷酸合酶活性的蛋白质的核酸。这里，缺失、取代、插入、添加不仅包括1～10个碱基的短的缺失、取代、插入、添加，也包括10～100个碱基的长的缺失、取代、插入、添加。另外，法尼焦磷酸合酶活性是指通过法尼焦磷酸合酶的催化作用进行法尼焦磷酸合成反应的活性。这时，作为法尼焦磷酸合酶底物的物质只要是最终能合成法尼焦磷酸的物质即可，并没有特别的限定，例如异戊烯焦磷酸或焦磷酸香叶酯。
由于认为在酒花中上述焦磷酸香叶酯或法尼焦磷酸是香叶烯、律草烯、丁香烯和法尼烯等精油成分的前体，因此通过检测出具有上述序列表中序列号3记载的碱基序列的核酸，能够控制酒花的精油成分代谢系统，或者用作与精油成分有关的性状的基因标记。上述核酸的检测并不需要序列表中序列号3记载的全部碱基序列，例如可以采用PCR法将其一部分扩增确定碱基序列或者采用RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)等基因解析方法进行检测。因此，本发明的核酸中也包括序列表中序列号3记载的碱基序列的一部分构成的核酸。
其次，对本发明的法尼焦磷酸合酶基因的启动子区域进行说明。
本发明的核酸是具有序列表中序列号2记载的碱基序列的核酸。另外，本发明的核酸可以是具有上述序列号2记载的4699个碱基的碱基序列的核酸的一部分，也可以是碱基序列1～1886表示的碱基序列。
具有上述序列号2记载的碱基序列的核酸是法尼焦磷酸合酶的基因组DNA，编码法尼焦磷酸合酶的起始蛋氨酸的碱基序列是其中的碱基序号1887～1889。因此，上述序列号2记载的碱基序列中的碱基序号1～1886为5’非翻译区，该区域包含法尼焦磷酸合酶基因的启动子区域。严格确定上述碱基序号1～1886中启动子区域的两个末端的边界较为困难，只要具有启动子活性，上述碱基序号1～1886中的一部分构成的序列也包括在本发明的核酸内。
另外，本发明的核酸也可以是与具有上述序列号2记载的碱基序列的核酸或具有该核酸中碱基序号1～1886表示的碱基序列的核酸在严格条件下杂交，且具有启动子活性的核酸，只要满足这种条件，其碱基序列并没有特别的限定。而且，本发明的核酸中也包括具有与上述在严格条件下进行杂交且具有启动子活性的核酸互补的碱基序列的核酸，具体而言，例如具有上述序列号2记载的碱基序列的核酸中缺失、取代、插入、添加1个或多个，且具有启动子活性的核酸。这里，缺失、取代、插入、添加不仅包括1～10个碱基的短的缺失、取代、插入、添加，也包括10～100个碱基的长的缺失、取代、插入、添加。
其次，说明分离本发明的核酸，解析其基因产物功能的优选方法。
本发明的核酸可以经以下(1)～(5)的步骤进行分离，在(6)～(7)的步骤中，能够确认分离出的基因显示法尼焦磷酸合酶活性，或者具有启动子活性。1、酒花的法尼焦磷酸合酶基因及其启动子的分离(1)酒花基因组DNA的制备
酒花基因组DNA的制备可以采用公知方法进行，例如可以采用Wagner，D.B.等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，2097-2100(1987))进行。(2)法尼焦磷酸合酶基因及其启动子的分离
法尼焦磷酸合酶基因的部分片断可以通过以白葶苈、玉米等已知的其它植物的法尼焦磷酸合酶的碱基序列为基础设计引物，采用反向PCR法(Inverse PCR)或Cassett-ligation mediated PCR这些公知的方法进行分离。反向PCR法如图2的示意图所示，是用限制酶消化作为试样的DNA，以扩增前将上述限制酶消化产物环化得到的试样作为模板，使用与通常PCR法中使用的引物反向合成的引物，进行PCR法的方法，能够使特定碱基序列邻接的上游或下游区域扩增。作为反向PCR法的具体实例，例如Liu，Y.G.等的方法(Genomics 25，674-681(1995))。另外，Cassett-ligation mediated PCR如图3的示意图所示，是在想要获知与已知碱基序列相邻接的未知碱基序列时所采用的方法(例如“TaKaRa LAPCR in vitro Cloning Kit”(宝酒造社制)附带的使用说明中记载的方法)。具体而言，可以首先用限制酶将包含这种核酸区域的核酸消化，通过将具有上述限制酶识别部位且具有能够设定引物的已知碱基序列的衔接子核酸连接在上述核酸上，采用PCR法使碱基序列已知的区域中夹杂的未知碱基序列区域扩增，确定扩增产物的碱基序列。通过反复进行这种反向PCR法和/或Cassett-ligation mediated PCR，可以分离酒花的法尼焦磷酸合酶基因的全部区域及其启动子。(3)碱基序列的确定
分离出的基因的碱基序列可以按照公知方法进行确定。例如可以按照PE Biosystems社制的“ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing ReadyReaction Kit”附带的使用说明等进行。另外，利用数据库(例如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)对采用上述方法确定的碱基序列进行同源检索，能够获知是否与由其它植物种得到的已知基因具有同源性及其程度，能够判断得到的基因是否为新型基因。(4)各组织级分的完全RNA的制备
完全RNA的制备可以在制备任意的组织级分后，采用公知方法进行，例如按照Chang，S.等的方法(Plant Molecular Biology Report 11，113-116(1993))进行。(5)法尼焦磷酸合酶基因cDNA的分离
法尼焦磷酸合酶基因的cDNA可以采用公知方法进行分离，例如能够以(2)中分离出的法尼焦磷酸合酶基因的基因组DNA的碱基序列为基础设定引物，以由完全RNA合成的cDNA作为模板采用RT-PCR法进行分离。这时的具体方法可以采用例如Loches Diagnostics社制的“Titan OneTube RT-PCR System”附带的使用说明等记载的方法。(6)分离出的法尼焦磷酸合酶基因编码的蛋白质的功能解析
(5)中分离出的法尼焦磷酸合酶基因编码的蛋白质可以通过将法尼焦磷酸合酶基因的cDNA整合到表达载体中，并将该载体引入大肠杆菌中，使之在大肠杆菌中进行表达。上述法尼焦磷酸合酶编码的蛋白质的表达以及上述蛋白质的纯化可以采用例如“QIAexpress Expression System”(Quiagen社制)附带的使用说明中记载的方法进行纯化。另外，用该大肠杆菌表达、纯化后的法尼焦磷酸合酶蛋白质的功能可以采用公知方法进行确认，例如可以采用Sylvie A.等的方法(Arch.Biochem.Biophys.321，493-500，(1995))进行确认。(7)Northern杂交解析(以下称为Northern解析)
分离的法尼焦磷酸合酶基因在何种组织中进行表达，或者分离的法尼焦磷酸合酶基因的启动子在何种组织中发挥功能，能够以分离的法尼焦磷酸合酶基因作为探针利用Northern解析进行解析，例如能够以“TheDIG System User′s Guide for Filter Hybridization”Berlin Garman Haim社，p.53-55(1995)记载的方法为基础进行。
其次，说明利用本发明的核酸可能的实施方式的一个实例。
(1)杂交用探针
通过将本发明中公开的碱基序列的一部分或全部用作杂交的探针，能够检测出至少在酒花中进行表达的法尼焦磷酸合酶基因。另外，通过将本发明中公开的碱基序列的一部分或全部用作杂交的探针，考察酒花组织中的基因表达，也能够鉴定基因表达的分布。
将本发明中公开的碱基序列的一部分或全部用作杂交的探针时，对于杂交方法自身没有特别的限定，具体而言，例如Northern杂交、Southern杂交、克隆杂交、斑点杂交、荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization，FISH)、原位杂交(in situ hybridization，ISH)、DNA芯片法、微阵列(microarray)法等。
将本发明的碱基序列用作杂交用探针时，必须有至少20个碱基的长度，本发明的基因序列中，优选使用具有20个以上连续的碱基长度的基因。更优选使用具有40个以上碱基长度的基因，特别优选具有60个以上碱基长度的基因。
对于本领域技术人员来说，核酸探针技术是众所周知的，各种长度的利用本发明得到的探针以及作为目的的多核苷酸的适当杂交条件能够容易地确定。用于获得对于包括各种长度的探针最为合适的杂交条件的这种操作对本领域技术人员来说是众所周知的，例如可以参照Sanbluck等，“分子克隆：实验方法(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor(1989)”。
这里，上述探针优选进行了标记以便容易检测的探针。能够检测的标记可以是通过目测或使用仪器任意一种方法能够检测的任何种类、部分。通常使用的能够检测的标记例如是32P、14C、125I、3H、35S等放射性标记。生物素标记核苷酸可以通过缺口翻译、化学和酶方法等整合到核酸中。生物素标记的探针在使用抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白、荧光标识剂、酶、金胶体复合体等标记方法的杂交后进行检测。核酸也可以通过使之与蛋白质结合进行标记。另外，也可以使用放射性或荧光组蛋白单链结合蛋白质上交联的核酸。
(2)PCR法中使用的引物
法尼焦磷酸合酶基因的检测也可以通过以公开的碱基序列的任意序列作为引物，采用聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction，PCR)进行。例如，能够从欲检定的试样中提取出RNA，采用RT-PCR法半定量地测定基因表达。这种方法可以采用对当事人来说众所周知的方法进行。
使用本发明的核酸作为PCR用引物时，必须具有10个至60个碱基的长度，本发明的核酸中，优选使用具有10个至60个连续碱基的核酸，更优选使用具有15个至30个碱基的核酸。另外，一般情况下，上述引物序列中的GC含量优选为40％至60％。而且，优选扩增所使用的2个引物间的Tm值没有差异。另外，优选在引物的3’末端不进行退火，在引物内不形成2维结构。
(3)核酸的筛选
通过使用本发明中公开的碱基序列的一部分或全部，可以检测在酒花内进行表达的法尼焦磷酸合酶基因的表达分布。例如，通过将本发明中公开的碱基序列的一部分或全部用作杂交的探针或PCR的引物，能够检测基因表达的分布。
另外，使用DNA芯片、微阵列等也能够检测该基因表达的分布。也就是说，能够将本发明公开的碱基序列的一部分或全部直接安装在芯片、阵列上。用荧光物质等标记由细胞提取出的RNA，使之杂交，能够解析其基因在何种细胞中高度表达。另外，安装在芯片、阵列上的DNA也可以是使用本发明公开的碱基序列的一部分或全部得到的PCR反应产物。
(4)DNA克隆
通过使用本发明中公开的碱基序列的一部分或全部，能够克隆至少在酒花中进行表达的基因。例如，将本发明中公开的碱基序列的一部分或全部用作Northern杂交的探针、克隆杂交的探针或PCR的引物，能够克隆包括本发明中公开的碱基序列的一部分或全部的基因。
除以上说明的实施方式以外，使用本发明的蛋白质或核酸，能够得到有关酒花法尼焦磷酸合酶的信息，或者进行酒花的性状转化、二次代谢产物的生产等。
也就是说，上述法尼焦磷酸合酶是与植物中作为色素、香味、植物激素、防御素、对害虫等的防御物质等各种物质基础的类异戊二烯的代谢有关的酶。因此，例如通过利用如上所述分离出的法尼焦磷酸合酶基因，能够控制植物中色素、香味、植物激素、防御素、对害虫等的防御物质等的代谢系统或检测支配这些性状的基因。
另外，使用本发明中分离出的法尼焦磷酸合酶基因，利用基因工程学方法制备得到法尼焦磷酸合酶，通过使用该法尼焦磷酸合酶，能够在试管内生产植物的二次代谢产物。
而且，由于认为在酒花中，即使在其树脂成分以及具有抗癌作用的所谓Xanthofumol(Brauwelt，36，1998)的代谢系统中，法尼焦磷酸合酶也可能有关，因此通过使用本发明的核酸，不仅能够控制酒花的树脂成分或Xanthofumol的代谢系统，而且能够用作与上述树脂成分和Xanthofumol有关的性状的基因标记。
因此，以前不得不依赖于经验和直觉的酒花育种方法能够通过基因工程学方法进行，例如通过利用植物的性状转化技术，将本发明的法尼焦磷酸合酶基因引入酒花中，能够控制蛇麻素腺毛中二次代谢产物的组成等。因此，能够使利用酒花得到的食品(例如啤酒或发泡酒)质量提高或维持，或者使利用二次代谢产物得到的药品质量提高或有效化。
而且，通过利用含有本发明的法尼焦磷酸合酶基因的启动子区域的核酸，在上述启动子的下游连接作为对象的欲引入酒花的基因以及在酒花中发挥功能的终止子，引入上述酒花中，从而能够使上述基因在蛇麻素腺毛中特异性地表达。
实施例
以下，结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1
(酒花基因组DNA的制备)
酒花基因组DNA的制备如下所述进行。也就是说，将酒花的叶在液氮中冷冻粉碎，悬浊于2％CTAB溶液(2％溴化十六烷基三甲基铵、0.1M Tris(pH9.5)、20mM EDTA、l.4M NaCl、5％β巯基乙醇)中，在65℃下保温30分钟。将上述悬浊液用氯仿/异戊醇(24∶1)萃取2次后，加入3/4倍量的异丙醇，使DNA和RNA析出。将析出的DNA和RNA溶解于High SaltTE缓冲液(1M氯化钠、10mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA)中，加入RNase，在60℃下保温，仅分解RNA。向其中加入2倍量的异丙醇，使DNA析出，再用70％乙醇洗涤析出的DNA后，溶解于水，得到基因组DNA试样。
实施例2
(法尼焦磷酸合酶基因及其启动子的分离)
在碱基序列已知的白葶苈、玉米、银胶菊、橡胶树、白羽扇豆和胡椒的法尼焦磷酸合酶的氨基酸序列中，以各植物间共同的序列为基础，合成引物1(序列号4)以及引物2(序列号5)。使用这些引物，以酒花基因组DNA为模板进行PCR，得到图1的片断1。
其次，确定得到的扩增片断的碱基序列。根据这里得到的碱基序列，设计表1所示的引物3(序列号6)、引物4(序列号7)、引物5(序列号8)以及引物6(序列号9)，采用反向PCR法，得到图1的片断2和片断3。
表1
| 引物 | 序列号 | 碱基序列 |
| 1 | 4 | 5’-GGYTGGTGYATTGAATGG-3’ |
| 2 | 5 | 5’-TAAAAYGARTARTARGCHGTYTT-3’ |
| 3 | 6 | 5’-CCTTTGGTACTCTAAACCAGCAGGG-3’ |
| 4 | 7 | 5’-TTAGAAAGTGTTAAAAGGGTATCCG-3’ |
| 5 | 8 | 5’-AGGTGGAATTCCAAACAGCCTCGGG-3’ |
| 6 | 9 | 5’-TTTGATCACCACAATTGAAGGAGAG-3’ |
| 7 | 10 | 5’-GACATTGTAATCCAGCATCTGC-3’ |
| 8 | 11 | 5’-CACAGAGAAATTGAACTTGGTC-3’ |
| 9 | 12 | 5’-CACTTCCTTTGACCTGTTTG-3’ |
| 10 | 13 | 5’-AAGCTCGTGGAGTAACCCTC-3’ |
| 11 | 14 | 5’-GCGTGTTTGCGGATTACGAG-3’ |
| 12 | 15 | 5’-TGAGAAGGATTTTGGCAGCC-3’ |
| 13 | 16 | 5’-GAATTCTTATGATTAACCAAAAAC-3’ |
| 14 | 17 | 5’-CGGGATCCATGAGTGGTTTAAGGTCAAAAT-3’ |
| 15 | 18 | 5’-CGGGATCCTTACTTCTGCCTCTTGTAGATC-3’ |
具体而言，将酒花基因组DNA用限制酶BglII或HindIII消化，使用“DNA Ligation Kit Ver.1”(宝酒造社制)，按照附带的使用说明，进行分子内连接(自身连接，Self ligation)，以分子内连接结束后的反应液的一部分作为模板，使用引物3和引物5进行PCR。接着，以上述PCR结束后的反应液的一部分作为模板，使用表1所示的引物4和引物6进行PCR，得到图1的片断2和片断3。
同样，根据图1的片断2的碱基序列，设计引物7(序列号10)、引物8(序列号11)、引物9(序列号12)。对于用限制酶EcoRI消化后的酒花基因组DNA，进行分子内连接，以其为模板，使用上述引物7和引物9再次进行PCR，得到图1的片断4，确定碱基序列。
另外，图1的片断5是采用Casett-ligation mediated PCR法，利用“TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit”(宝酒造社制)，按照附带的使用说明进行分离的。也就是说，将酒花基因组DNA用限制酶EcoRI消化，并将试剂盒附带的EcoRI衔接子结合在其上。接着，使用以片断3的碱基序列为基础设计的引物10(序列号13)以及上述试剂盒附带的弹夹引物(Cassette primer)C1，进行PCR。然后，以该PCR反应液为模板，使用以片断3的碱基序列为基础设计的引物11(序列号14)以及试剂盒附带的弹夹引物C2，进行PCR，得到片断5，确定其碱基序列。
最后，以酒花基因组DNA为模板，使用以图1的片断4和片断5的碱基序列为基础设计的引物12(序列号15)以及引物13(序列号16)，进行PCR，得到包含酒花法尼焦磷酸合酶基因及其启动子的片断6。上述任何PCR均使用“Expand High-Fidelity PCR System”(Berlin GarmanHaim社制)，按照附带的使用说明进行。
实施例3
(酒花法尼焦磷酸合酶基因及启动子的碱基序列的确定)
使用“TaKaRa BKL Kit”(宝酒造社制)，使实施例2中得到的包含酒花法尼焦磷酸合酶基因及其启动子的片断6的两个末端平滑化，亚克隆到pUC载体上。片断6的两个末端的平滑化以及向pUC载体的亚克隆按照上述试剂盒附带的使用说明进行。
碱基序列的确定使用“ABI PRISM Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit”(PE Biosystems社制，ABI373S型)，按照附带的使用说明进行。片断6的碱基序列如序列表中序列号2所示。
实施例4
(各组织级分和完全RNA的制备)
作为提取完全RNA的组织，制备酒花的叶、茎、蛇麻素(-)级分以及蛇麻素(+)级分。这里，蛇麻素(-)级分是指以几乎不存在蛇麻素腺毛的球芽的外苞为主进行回收得到的级分，蛇麻素(+)级分是指尽量由球芽除去蛇麻素腺毛以外的组织得到的主要由蛇麻素腺毛构成的级分。将这些组织级分在液氮中冷冻粉碎，悬浊于2％CTAB溶液(2％溴化十六烷基三甲基铵、0.1M Tris(pH9.5)、20mM EDTA、1.4M NaCl、5％β巯基乙醇)中，在65℃下保温10分钟。用氯仿/异戊醇(24∶1)萃取2次后，加入1/3倍量的10M氯化锂，放置过夜，以15000rpm离心分离10分钟后，将沉淀溶解于水中。其中，在实施例5中使用完全RNA时，代替上述水，溶解于DNase反应缓冲液(100mM醋酸钠(pH5.2)、5mM氯化镁)中，加入DNase，在37℃下保温，分解DNA。向上述溶液中再加入1/3倍量的10M氯化锂，放置过夜，以15000rpm离心分离10分钟。将沉淀用70％乙醇洗涤后，干燥，再次溶解于水中，得到完全RNA试样。
实施例5
(法尼焦磷酸合酶基因的cDNA的分离及其碱基序列的确定)
法尼焦磷酸合酶基因的cDNA是通过由碱基序列已知的白葶苈等的法尼焦磷酸合酶基因信息，推测实施例3中确定的序列号2记载的酒花法尼焦磷酸合酶基因的编码区两末端，设计具有其序列上添加了BamHI标识序列的序列的引物，以实施例4得到的完全RNA作为模板，采用RT-PCR法进行分离的。也就是说，引物采用引物14(序列号17)以及引物15(序列号18)，RT-PCR使用“Titan One Tube RT-PCR System”(LochesDiagnostics社制)，按照附带的使用说明进行。这样得到的法尼焦磷酸合酶基因的cDNA亚克隆到pCR2.1(Invitrogen社制)载体上，得到pFPPS101R。上述亚克隆得到的法尼焦磷酸合酶基因cDNA使用“ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”(PE Biosystems社制)以及DNA测序仪ABI373S型(PE Biosystems社制)，按照附带的使用说明，确定碱基序列。得到的法尼焦磷酸合酶基因cDNA的碱基序列如序列表中序列号3所示。另外，该cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列号1所示。
序列表中序列号3记载的碱基序列中，第660号碱基与相应的基因组DNA序列(序列号2的第3737号碱基)(碱基序列的确认进行多次)不同，这被认为是在分离cDNA时进行的RT-PCR中产生的碱基整合错误。但是，由于该错误在氨基酸水平上与原来编码的氨基酸相同，因此对实施例6所述的蛋白质的功能解析不会产生影响。
实施例6
(分离出的法尼焦磷酸合酶基因编码的蛋白质的功能解析)
为了确认分离出的法尼焦磷酸合酶基因编码的蛋白质实际上是否具有法尼焦磷酸合酶活性，用限制酶BamHI处理实施例5中分离出的法尼焦磷酸合酶基因的cDNA，将得到的DNA整合到“QIA express ExpressionSystem”(Quiagen社制)附带的表达载体pQE30的BamHI部位，然后引入大肠杆菌中，使法尼焦磷酸合酶基因在上述大肠杆菌中表达，并将其表达产物纯化。上述大肠杆菌内的法尼焦磷酸合酶基因的表达以及表达产物的纯化按照“QIAexpress Expression System”(Quiagen社制)附带的使用说明进行。
接着，按照Sylvie A.等的方法(Arch.Biochem.Biophys.321，493-500，(1995))确认得到的表达产物是否具有法尼焦磷酸合酶活性。也就是说，向酶反应液100μl(50mM Tris-HCl、2mM二硫赤藓糖醇、1mM氯化镁、100μm二甲基烯丙基焦磷酸)中加入纯化的法尼焦磷酸合酶基因的表达产物2μl(28μg)以及14C-异戊烯焦磷酸2.5μl(0.05μCi)，在30℃下使之反应30分钟。接着，加入碱性磷酸酶(和光纯药社制)附带的10倍浓度反应缓冲液30μl，加入碱性磷酸酶1μl(10units)，在37℃下反应3小时后，再在25℃下反应一夜。向上述反应液中加入法尼醇1μl(4.5nmol)作为载体，再加入己烷200μl，混合，以10000rpm离心分离1分钟后，回收己烷层，向残留的水层中再加入己烷100μl，混合，离心分离，回收己烷层，并与在先回收的己烷层混合。向该己烷提取液中通入氮气，浓缩至1μl，加入甲醇10μl混合后，在薄层色谱板(HPTLC-aluminium sheets silica gel 60 F254 pre-coated，Meruk社制)上点样1μl，用苯∶乙酸乙酯＝9∶1的展开溶剂展开。另外，作为标准，同时将法尼醇和香叶醇点样。将展开结束后的薄层色谱板干燥，然后用碘喷雾，确认法尼醇和香叶醇的位置后，通过X射线薄膜在-80℃下暴露7天。得到的结果如图4所示。
如图4所示，在法尼醇和香叶醇的位置检测出了反应产物产生的信号。也就是说，确认分离出的法尼焦磷酸合酶基因编码的蛋白质具有法尼焦磷酸合酶活性。
实施例7
(Northern杂交解析)
为了确认分离出的法尼焦磷酸合酶基因在酒花的何种组织中进行表达且以何种程度的量进行表达，进行Northern杂交解析。
首先，以用限制酶KpnI消化实施例5制备的质粒pFPPSl01R形成直链状得到的物质作为模板，使用“DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)”(LochesDiagnostics社制)，制备法尼焦磷酸合酶基因的RNA探针。制作方法按照上述试剂盒附带的使用说明进行。
接着，对于实施例4制备的叶、茎、蛇麻素(-)级分以及蛇麻素(+)级分的完全RNA各15μl，使用改性琼脂糖凝胶(1.2％琼脂糖、6.7％甲醛、20mM MOPS、5mM醋酸钠、1mM EDTA，pH7.0)进行电泳。将电泳结束后的凝胶在蒸馏水中振荡3次，每次40分钟，除去上述琼脂糖凝胶中的甲醛后，以20×SSC(0.3M枸橼酸钠、3M氯化钠，pH7.0)作为缓冲液，将上述琼脂糖凝胶中的RNA复制到尼龙薄膜上。使用RNA复制后的尼龙薄膜以及上述探针，在68℃下杂交1夜。另外，杂交所使用的杂交缓冲液的组成为5×SSC、0.02％SDS、0.1％N-月桂酰基肌氨酸、50％甲酰胺、2％Blocking Reagent(Loches Diagnostics社制)。杂交结束后，用洗涤液(0.1％SDS、2×SSC)在68℃下进行2次30分钟的洗涤处理，再用洗涤液(0.1％SDS、0.1×SSC)在68℃下进行2次30分钟的洗涤处理。洗涤后，检测探针杂交后的RNA片断。上述检测按照“采用DIG系统进行杂交的用户指南”(Loches Diagnostics社制)记载的流程进行。得到的结果如图5所示。
根据图5的结果，由于在叶、茎、蛇麻素(-)级分以及蛇麻素(+)级分的任意一种组织级分中，在与具有编码法尼焦磷酸合酶基因的序列表中序列号2记载的碱基序列的核酸大小相近的1.1kb的位置见到信号，确认酒花的法尼焦磷酸合酶基因在任意一种组织级分中均表达。但是，由于信号强度的顺序为蛇麻素(+)级分＞蛇麻素(-)级分＞茎＞叶，确认来源于法尼焦磷酸合酶基因的mRNA在各组织中所占的比例是蛇麻素腺毛中最多，其次为茎和外苞，所占比例最少的为叶。也就是说，法尼焦磷酸合酶基因在蛇麻素腺毛中表达最强，而且法尼焦磷酸合酶基因的启动子在蛇麻素腺毛中启动子活性最高。
工业实用性
如以上说明，按照本发明能够鉴定法尼焦磷酸合酶蛋白质和基因，因此明确了酒花中与二次代谢产物的生物合成有关的基因以及在酒花的蛇麻素腺毛中组织特异性地发挥功能的启动子基因的碱基序列，使利用基因工程学方法的酒花性状转化和酒花的二次代谢产物在试管内的合成成为可能。
序列表<110>SAPPORO BREWERIES LTD.<120>法尼焦磷酸合酶蛋白质、核酸及其启动子区域<130>FP01-4014-00<140><141><150>JP2000-308054<151>2000-10-06<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>342<212>PRT<213>Humulus lupulus L.<400>1Met Ser Gly Leu Arg Ser Lys Phe Met Glu Val Tyr Ser Ile Leu Lys1 5 10 15Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe Glu Phe Thr Asp Asp Ser Arg
20 25 30Gln Trp Val Glu Arg Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly Lys Leu
35 40 45Asn Arg Gly Leu Ser Val Ile Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Lys Gly Gly
50 55 60Lys Glu Leu Thr Glu Glu Glu Ile Phe Leu Thr Ser Ala Leu Gly Trp65 70 75 80Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met
85 90 95Asp Asn Ser Val Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Val Pro
100 105 110Lys Val Gly Leu Ile Ala Ala Asn Asp Gly Ile Leu Leu Arg Asn His
115 120 125Ile Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe Lys Gly Lys Ser Tyr Tyr Val
130 135 140Asp Leu Leu Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly145 150 155 160Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Ile Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ser
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340
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Claims (10)
1、一种蛋白质，具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列。
2、一种蛋白质，其特征在于，具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，而且具有法尼焦磷酸合酶活性。
3、一种核酸，其特征在于，编码具有序列表中序列号1记载的氨基酸序列的蛋白质。
4、一种核酸，具有序列表中序列号3记载的碱基序列。
5、一种核酸，其特征在于，由序列表中序列号3记载的碱基序列的一部分构成。
6、一种核酸，其特征在于，与权利要求4或5记载的核酸，或者互补的核酸在严格条件下进行杂交，而且编码具有法尼焦磷酸合酶活性的蛋白质。
7、一种核酸，具有序列表中序列号2记载的碱基序列。
8、一种核酸，其特征在于，由序列表中序列号2记载的碱基序列的一部分构成。
9、一种核酸，其特征在于，具有序列表中序列号2记载的碱基序列中碱基序号1～1886表示的碱基序列。
10、一种核酸，其特征在于，与权利要求7～9中任意一项记载的核酸，或者互补的核酸在严格条件下进行杂交，而且具有启动子活性。
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