CN101056983B

CN101056983B - 用于植物的启动子分子

Info

Publication number: CN101056983B
Application number: CN2005800387189A
Authority: CN
Inventors: D·M·吕津斯基; D·J·豪金斯; S·S·纳瓦罗; L·D·帕内尔
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-12
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2025-09-12
Also published as: BRPI0515263A; AR050800A1; EP1789564A2; WO2006031780A2; AU2005285015B2; ATE540119T1; CN101056983A; AU2005285015A1; US20060064776A1; US7417177B2; US7982097B2; EP1789564B1; US20080241340A1; CA2580061A1; ZA200702270B; CA2580061C; USRE42415E1; WO2006031780A3

Abstract

本发明涉及调节植物中基因表达的多核苷酸分子。具体而言，本发明涉及可用于调节异源多核苷酸分子在植物中的基因表达的启动子。本发明也涉及含有该异源多核苷酸分子的表达构建体和转基因植物。

Description

用于植物的启动子分子

发明背景

本申请要求于2004年9月13日提交的美国临时申请号60/609535的优先权，所述临时申请的公开内容在此以其整体引用作为参考。

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，并且更具体地涉及可用于在植物中表达转基因的多核苷酸分子。本发明具体涉及分离自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、并可用于在农作物植物种子中表达具有农业重要性的转基因的P-Dgat1和P-Dgat2启动子。

发明背景

植物基因工程的目标之一是产生具有农业所需特征或性状的植物。基因工程的进展已提供了转化植物以含有并表达外来基因的必需工具。植物转化和再生中的技术进展已使研究人员能够获取外源多核苷酸分子(例如异源或天然来源的基因)、并将该多核苷酸分子整合到植物基因组中。该基因于是可以在植物细胞中得到表达以表现出添加的特征或性状。在一种方法中，基因在通常不表达这类基因的植物细胞或植物组织中的表达可能赋予所需的表型作用。在另一种方法中，基因或部分基因在反义方向的转录可以通过阻止或抑制内源基因的表达而产生所需的作用。

启动子是包含5’调节元件的多核苷酸分子，其对基因在活细胞中的全面表达起综合作用。分离的在植物中行使功能的启动子可用于通过基因工程方法修饰植物表型。产生转基因植物的方法的第一步包含将各种遗传因子组装到多核苷酸构建体中。该构建体包含可转录的多核苷酸分子(目的基因)，当在植物细胞中通过与目的基因可操作地连接的启动子得到表达(转录)时，所述可转录的多核苷酸分子赋予所需表型。构建体中的启动子可以与也包含于其中的目的基因同源或异源。然后通过各种植物转化方法将该构建体引入植物细胞以产生转化的植物细胞，并将转化的植物细胞再生为转基因植物。启动子控制与该启动子可操作地连接的目的基因的表达，并从而影响由该转基因在植物中表达而赋予的特征或性状。

为了产生具有各种所需特征的转基因植物，有利的是具有多种启动子以提供基因表达，从而以产生所需作用所必需的量将基因有效转录。遗传改良种质的商业开发也已进展到将多种性状引入农作物植物的阶段，常称为基因堆积方法(gene stacking approach)。在该方法中，可以将赋予不同目的特征的多个基因引入植物。将多个基因引入植物中时常常需要将各基因进行调节或控制以进行最佳表达，从而导致需要不同的调节元件。有鉴于此以及其他考虑，基因表达的最佳控制及调节元件多样性在植物生物技术当中显然是重要的。

多种不同类型或种类的启动子可用于植物基因工程。可以基于例如时间或发育范围、转基因表达水平或组织特异性这类特征将启动子分类。例如，被称为组成型启动子的启动子能够有效地转录可操作地连接的基因，并在多种组织中表达这些基因。可以通过分离以所需方式(例如组成型的、组织增强的或发育诱导的)得到转录或表达的基因的上游5’调节区而获得不同类型的启动子。

文献中已经描述了大量在植物细胞中起作用的启动子。这些启动子包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂氨酸(nos)启动子和章鱼氨酸合酶(ocs)启动子以及花椰菜花叶病毒(caulimovirus)启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S或35S启动子(美国专利5,352,605)、具有重复增强子的CaMV 35S启动子(美国专利5,164,316；5,196,525；5,322,938；5,359,142；和5,424,200)以及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(美国专利5,378,619)。这些启动子及众多其他启动子已经用于产生用于植物中转基因表达的构建体。在例如美国专利5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,614,399；5,633,441；6,232,526；和5,633,435中描述了其他有用的启动子，所有这些专利都在此引用作为参考。

为了产生植物油或其他性状，也需要基因在种子中表达的启动子。二酰甘油酰基转移酶(在下文中称为Dgat)是在植物、真菌和哺乳动物中催化三酰甘油产生的最终酶促步骤的整合膜蛋白(Harwood，Biochem.Biophysics.Acta，13017-13056(1996)；Daum等人，Yeast，16：1471-1510(1998)；以及Coleman等人，Annu.Rev.Nutr.，20：77-103(2000)。Dgat负责将酰基从酰基辅酶A转移至1，2-二酰甘油(Dag)以形成三酰甘油(TAG)。几乎所有商业上重要的植物来源的脂肪和油都由三酰甘油组成。此后将三酰甘油称为“油”或“植物油”。在植物中，特别是在油料种子中，Dgat与膜和脂质小体级分有关，且在油合成中起关键作用(Kennedy等人，J.Biol.Chem.，222：193(1956)；Finnlayson等人，Arch.Biochem.Biophys.，199：179-185(1980))。

已经鉴定了两个不同的Dgat蛋白质家族。第一个Dgat蛋白质家族(下文称为Dgat1)与酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)有关，并在文献中得到描述(见例如美国专利6,100,077和6,344,548)。与前面鉴定的Dgat1蛋白质家族无关的第二个Dgat蛋白质家族(下文称为Dgat2)在美国公开的申请US20030028923中得到描述。本发明描述了与这些Dgat家族关联的启动子。

尽管以前的工作已经提供了许多可用于在转基因植物中指导转录的启动子，但仍然需要具有有利的表达特征的新启动子。具体而言，对于油生产，需要能够指导外源基因在种子中表达的启动子。完全实现所选择的种子增强的油相关基因在转基因植物中表达的利益所需的表达模式或水平不能由许多以前鉴定的启动子提供。因此，在植物基因工程领域需要用于油料种子的新启动子。

发明概述

本发明提供了基因工具，所述基因工具符合改变植物所产生的油的组成及其相对于种子其他成分(包括例如其粗粉(meal)含量)的百分比含量的需求。本发明包括二酰甘油酰基转移酶(Dgat)启动子，该启动子可用于指导基因的转录，所述基因参与种子中农业性状(例如增加的油、淀粉和蛋白质)的产生。

在一个实施方案中，本发明提供启动子，所述启动子包含与选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4及其能够调节可操作地连接的多核苷酸分子转录的片段的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸序列。本发明也提供包含与任何这些序列至少约70％的序列同一性的多核苷酸序列，包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或其能够调节可操作地连接的多核苷酸分子转录(例如具有启动子活性)的片段的任一个或多个具有约75％、80％、83％、85％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在具体的实施方案中，将在此提供的序列片段定义为包含在此所述任何启动子序列(包括例如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4)的至少约30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、750、900、1000个或更多连续核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供植物表达构建体，该构建体包含在此所述的启动子序列，例如，包含与选自SEQ ID NO：1和4及其任何片段的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸序列，其中所述启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，并且也可以与3’转录终止多核苷酸分子可操作地连接。

在另一个实施方案中，本发明提供以本发明所提供的植物表达构建体稳定转化的转基因植物。在一个实施方案中，该构建体包含启动子，该启动子包含与选自SEQ ID NO：1和4及其任何片段或区域的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸序列，其中所述启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，并且任选地与3’转录终止多核苷酸分子可操作地连接。

在另一个实施方案中，本发明提供制备植物油的方法，其包括通过例如将本发明的启动子整合到油料种子植物基因组中获得由本发明提供的转基因植物，并从所述种子和/或其他植物的部分提取油和/或蛋白质，所述启动子与赋予改变的油和/或蛋白质含量的可转录的多核苷酸分子可操作地连接。在一方面，可以将该植物定义为油料种子植物。本方法可以包括栽培该植物以产生蛋白质和/或油。本发明也提供从这里所提供的植物产生食物和饲料的方法。在一方面，该方法包括获得本发明提供的植物或其部分，并由此制备食物或饲料。

在一方面，本发明提供制备植物油的方法，其包括将本发明的启动子整合到油料种子植物基因组中，所述启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，该多核苷酸分子编码油增强基因，其赋予改变的油含量，例如二酰甘油酰基转移酶(Dgat，EC 2.3.1.20，美国专利6,444,876)、磷脂酸磷酸酶(Pap，EC 3.1.3.4，美国专利6,495,739和6,476,294)和无色花色素双加氧酶(Dox，EC 1.14.11，WO04/046336)。本方法可以包括栽培该植物以产生油料种子、并从所述油料种子提取油和/或蛋白质。

在另一个实施方案中，通过本发明制备的食物或饲料是日用食物或饲料产品，例如植物淀粉。本发明提供了方法，其包括将本发明的启动子(SEQ ID NO：1和4)整合到油料种子植物基因组中，栽培该油料种子植物以产生富集淀粉的种子，并从所述油料种子提取淀粉和/或蛋白质，所述启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，该多核苷酸分子编码淀粉增强基因，其赋予增加的淀粉含量，包括蔗糖磷酸化酶(Sm.gtfA，EC 2.4.1.7，美国专利6,235,971)。

在另一个实施方案中，本发明提供改变细胞增殖的方法，其包括将本发明的启动子(SEQ ID NO：1和4)整合到油料种子植物基因组中的步骤，所述启动子与编码细胞增殖基因的可转录的多核苷酸分子可操作地连接。

通过下文的详细说明和附图，本发明的前述及其它方面将更加显而易见。

序列简述

SEQ ID NO：1列出P-Dgat1启动子的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：2列出P-Dgat1引物序列。

SEQ ID NO：3列出P-Dgat1引物序列。

SEQ ID NO：4列出P-Dgat2启动子的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：5列出P-Dgat2引物序列。

SEQ ID NO：6列出P-Dgat2引物序列。

附图简述

图1描述pMON65429。

图2描述pMON65430。

发明详述

提供下列定义和方法以更好地定义本发明并在本发明的实践中给本领域普通技术人员以指导。除非另外指出，相关领域普通技术人员将根据常规用法理解术语。

此处所用的短语“多核苷酸分子”指基因组或合成来源的单链或双链DNA或RNA，即分别为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基，从5’(上游)末端读向3’(下游)末端。

此处所用的短语“多核苷酸序列”指多核苷酸分子序列。使用如37 CFR§1.822中所述的DNA碱基命名法。

启动子

此处所用的术语“启动子”指多核苷酸分子，所述多核苷酸分子在其天然状态位于可读框(或蛋白质编码区)的翻译起始密码子上游或5’，并参与RNA聚合酶II及其他蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动转录。“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或非天然启动子。组成型植物启动子在植物发育始终的大部分或所有组织中发挥功能。可以将任何植物启动子用作5’调节元件以用于调节与其可操作地连接的一种或多种特定基因的表达。当与可转录的多核苷酸分子可操作地连接时，启动子一般引起该可转录的多核苷酸分子的转录，其转录方式与该启动子通常连接的可转录的多核苷酸分子的转录方式类似。植物启动子可以包括通过操作已知启动子以产生人工、嵌合或杂合启动子而产生的启动子。这类启动子也可以通过例如向具有其自身部分或全部调节元件的活性启动子加入异源调节元件而组合了来自一个或多个启动子的顺式元件。因此，本发明包括嵌合或杂合启动子的设计、构建和用途，所述嵌合或杂合启动子包含SEQID NOs：1和4的至少一个顺式元件以用于调节可操作地连接的多核苷酸序列的表达。

此处所用的术语“顺式元件”指赋予基因表达全面控制的一方面的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以起到结合调节转录的转录因子，反式作用蛋白质因子的作用。一些顺式元件结合超过一种转录因子，而且转录因子可以与超过一种顺式元件以不同的亲和力相互作用。本发明的启动子合意地含有可以赋予或调节基因表达的顺式元件。可以通过许多技术鉴定顺式元件，所述技术包括缺失分析，即从启动子5’末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰分析、电泳迁移率变动分析、通过连接介导PCR的体内基因组足迹法以及其他常规测定法；或通过常规DNA序列比较方法与已知顺式元件基序的DNA序列相似性分析。可以通过诱变(或替代)一个或多个核苷酸或通过其他常规方法进一步研究顺式元件的精细结构。可以通过化学合成或从包含这类元件的启动子分离来获得顺式元件，而且将它们与额外的侧翼核苷酸一起合成，所述侧翼核苷酸含有有用的限制酶位点以促进后续操作。

在一个实施方案中，本发明的启动子包含多个顺式元件，每个顺式元件为基因表达的全面控制赋予不同的方面。在优选的实施方案中，使用专为鉴定序列内顺式元件、结构域或基序而设计的计算机程序鉴定来自SEQ ID NOs：1和4的多核苷酸分子的顺式元件。取决于条件，顺式元件可能正或负调节基因表达。本发明因此包含公开的启动子的顺式元件。

此处所用的短语“基本同源的”指通常表现出与在此提供的启动子具有相当大百分比序列同一性的多核苷酸分子。尤其感兴趣的是这样的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在植物中发挥功能以指导转录，并且与在此所述启动子的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约75％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、和至少约90％或更高的序列同一性，包括至少约92％、95％、96％、98％或99％序列同一性。能够调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子转录、并且与在此提供的启动子的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸分子包括在本发明的范围内。

在此所用的短语“百分比序列同一性”指当两个序列得到最佳比对时(具有适当的核苷酸插入、缺失或在比较窗口中总计低于参照序列20％的缺口)，与测试多核苷酸分子(或其互补链)相比，参照多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分数。比对比较窗口的最佳序列比对为本领域技术人员所熟知，并且可以通过工具(例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法)实施，并优选通过计算机化执行这类算法(例如作为GCG

WisconsinPackage

(Accelrys Inc.，San Diego，CA)的部分提供的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)而实施。测试序列和参照序列比对片段的“同一性分数”是两个比对序列共有的相同组分的数目除以参照序列片段(即整个参照序列或参照序列中详细说明的较小部分)中的组分总数目。将百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分、或与更长的多核苷酸序列比较。

此处所用的术语“同源性”指多核苷酸序列之间在百分比核苷酸位置同一性(即序列相似性或同一性)方面的相似性或百分同一性的水平。此处所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似的功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可能具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严格性条件)，一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。短语“严格条件”是关于核酸探针与靶核酸(即与特定的目的核酸序列)通过特定杂交程序杂交而功能性定义的，所述杂交程序在MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，第1、2、3卷.J.F.Sambrook，D.W.Russell，和N.Irwin，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000(在此称为Sambrook等人)进行讨论。因此，本发明的核苷酸序列可以因其与多核苷酸分子片段的一段互补序列选择性地形成双链体分子的能力而得到利用。根据设想的应用，人们需要采用不同的杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于要求高选择性的应用，人们一般需要采用相对的高严格条件以形成杂交体，例如，人们将选择相对低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃温度、约0.02M至约0.15M NaCl所提供的条件。例如，高严格条件是以高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)将杂交过滤器(filter)洗涤至少两次。促进DNA杂交的合适的中等严格性条件为本领域技术人员所公知，例如约45℃、6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后为50℃的2.0×SSC洗涤。另外，可以从50℃、约2.0×SSC的低严格性至50℃、约0.2×SSC的高严格性选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，可以从室温(约22℃)的低严格性条件至约65℃的高严格性条件增加洗涤步骤中的温度。温度和盐均可以变化，或者可以保持温度或盐浓度恒定而改变另一个变量。这样的选择性条件允许探针和模板或靶链之间的很少的错配。通过杂交检测多核苷酸分子为本领域技术人员所熟知，且美国专利4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的示例。

也可以通过计算机程序确定同源性，所述计算机程序比对多核苷酸序列并评价多核苷酸分子在确定的严格性条件下形成双链体分子的能力。将共有高同源性程度的不同来源的多核苷酸分子称为“同源的”。

可以使用本领域技术人员熟知的方法鉴定具有与在此所述的启动子相似的活性的目的启动子。例如，可以使用目的细胞或组织构建cDNA文库，并筛选所述文库以鉴定具有与在此所述的启动子相似的表达模式的基因。然后可以使用鉴定的基因的cDNA序列分离基因的启动子以进行进一步表征。见例如美国专利6,096,950；5,589,583；和5,898,096，在此引用作为参考。另外，也可以使用转录特征分析(profiling)或电子RNA印迹(northern)技术鉴定具有与在此所述的启动子相似的表达模式的基因。一旦这些基因得到鉴定，就可以分离其启动子以进行进一步表征。见例如美国专利6,506,565和6,448,387，在此引用作为参考。电子RNA印迹技术指以计算机为基础的序列分析，所述序列分析使得能够将来自多个cDNA文库的序列基于研究人员确定的参数(包括在多个cDNA文库中EST群体的丰度)、或是专门与来自一个文库或文库组合的EST组电子地进行比较。转录特征分析技术是用于对数千基因系统监控基因表达谱的高通量方法。基于DNA芯片的技术将数千cDNA序列排列于支持物表面上。将这些阵列同时与一群标记的cDNA探针杂交，所述cDNA探针从不同细胞或组织类型的RNA样品制备，从而允许表达的直接比较分析。该方法可以用于分离调节序列，例如与这些基因相关的启动子。

在另一个实施方案中，可以修饰在此公开的启动子。本领域技术人员可以生成在多核苷酸序列中有变化的启动子。可以修饰或改变如SEQ ID NOs：1和4中所示的本发明的启动子多核苷酸序列，以增强其控制特征。改变多核苷酸序列的一个优选方法是使用PCR以修饰序列中所选核苷酸或区域。这些方法为本领域技术人员所熟知。可以在基于PCR的DNA修饰方法中通过例如模板序列的插入、缺失或置换而修饰序列。“变体”是合有变化的启动子，在所述启动子中，优选在基本保持启动子功能的同时缺失、添加和/或替代原始启动子的一个或多个核苷酸。例如，可以从启动子5’或3’末端缺失一个或多个碱基对以产生“截短的”启动子。可以在启动子内部插入、缺失或替代一个或多个碱基对。在启动子片段的情况下，变体启动子可以包含影响与其可操作地连接的最小启动子转录的改变。最小或基本启动子是能够招募并结合基本转录机器的多核苷酸分子。真核细胞中基本转录机器的一个实例是RNA聚合酶II复合物及其附属蛋白质。可以通过例如标准DNA诱变技术或通过化学合成变体启动子或其部分而产生变体启动子。

可以通过多种方法设计或工程改造新的嵌合启动子。许多启动子含有激活、增强或限定启动子强度和/或特异性的顺式元件。例如，启动子可能含有定义了转录起始位点的“TATA”框以及位于转录起始位点上游调节转录水平的其它顺式元件。例如，可以通过将第一个启动子片段与第二个启动子片段融合而产生嵌合启动子，所述第一个启动子片段含有来自一个启动子的激活剂顺式元件，而所述第二个启动子片段含有来自另一个启动子的激活剂顺式元件；产生的嵌合启动子可以引起可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达增加。可以构建启动子，从而通过将这类片段置于最小启动子上游而把启动子片段或元件可操作地连接。本发明的顺式元件和片段可以用于构建这类嵌合启动子。构建本发明的嵌合和变体启动子的方法包括但是不限于组合不同启动子的控制元件、或将启动子的部分或区域重复(见例如美国专利4,990,607、5,110,732和5,097,025，所有专利都在此引用作为参考)。本领域技术人员熟知标准资源材料，所述资源材料描述了构建、操作和分离大分子(例如多核苷酸分子、质粒等)、以及产生重组生物并筛选和分离多核苷酸分子的具体条件和程序。

在另一个实施方案中，包含SEQ ID NOs：1和4所示多核苷酸序列的启动子包括该多核苷酸序列的任何长度，所述多核苷酸序列能够调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子。例如，SEQ ID NOs：1和4中公开的启动子可以是截短的，或者可以缺失部分而仍然保留调节可操作地连接的多核苷酸分子转录的能力。在有关实施方案中，公开的启动子的顺式元件可以赋予特定的特异性，例如赋予可操作地连接的多核苷酸分子在确定组织内表达的增强，并由此能够调节可操作地连接的多核苷酸分子的转录。因此，包含SEQ ID NOs：1和4中所示多核苷酸序列的启动子的任何片段、部分或区域可以用作调节多核苷酸分子，包括但是不限于公开的多核苷酸分子的顺式元件或基序。可以组合替代、缺失、插入或其任何组合以产生最终构建体。

多核苷酸构建体

此处所用的术语“构建体”指来自任何来源的任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环形单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个多核苷酸分子已以功能上可操作的方式连接的多核苷酸分子。

此处所用的短语“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选地，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。

此处所用的短语“可转录的多核苷酸分子”指能够被转录为RNA分子的任何多核苷酸分子。已知以使可转录的多核苷酸分子被转录为功能mRNA分子的方式将构建体引入细胞的方法，所述功能mRNA分子得到翻译并从而表达为蛋白质产物。为了抑制特定的目的RNA分子的翻译，也可以构建能够表达反义RNA分子的构建体。为了实施本发明，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知(见例如Sambrook等人)。

本发明的构建体可以含有与可转录的多核苷酸分子可操作地连接的启动子，该可转录的多核苷酸分子与3’转录终止多核苷酸分子可操作地连接。另外，构建体可以包括但不限于来自植物基因3’-非翻译区(3’UTR)的额外的调节多核苷酸分子(例如，增加mRNA的mRNA稳定性的3’UTR，比如马铃薯PI-II终止区、或章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶3’终止区)。构建体可以包含但不限于mRNA多核苷酸分子的5’非翻译区(5’UTR)，所述5’非翻译区在翻译起始中具有重要作用，并且也可以是植物表达构建体中的基因组分。例如，已经在植物中证明来自热激蛋白基因的非翻译的5’前导多核苷酸分子增强基因表达(见，例如美国专利5,659,122和5,362,865，以及美国公开申请号2002/0192812，在此引用作为参考)。这些额外的上游和下游调节多核苷酸分子可以来自天然来源、或来自与启动子构建体上存在的其他元件异源的来源。

因此，本发明的构建体包括例如SEQ ID NOs：1和4提供的、或如上所述修饰的那些启动子，该启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，从而在把该构建体引入植物细胞中后，启动子指导所述可转录的多核苷酸分子以所需水平或在所需组织或以所需的发育模式表达。在有些情况下，可转录的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，且启动子提供功能mRMA分子的转录，该功能mRNA分子经过翻译并表达为蛋白质产物。为了在靶宿主细胞中抑制特定目的RNA分子的表达，也可以为转录反义RNA分子或其他相似的抑制性RNA而构建构建体。

整合到本发明的构建体中的示范性可转录的多核苷酸分子包括例如来自种类不同于靶基因种类的DNA分子或基因，或者是甚至起源于或存在于相同物种中、但通过不同于经典生殖或育种技术的基因工程方法整合到受体细胞中的基因。外源基因或遗传因子意指引入受体细胞内的任何基因或DNA分子。外源DNA中包含的DNA类型可以包括已经存在于植物细胞中的DNA，来自另一种植物的DNA，来自不同生物的DNA，或外部产生的DNA，例如含有基因反义信息的DNA分子，或编码基因的人造或修饰形式的DNA分子。

可以按照说明将本发明的启动子整合到使用标记基因的构建体中，并在瞬时分析中测试，所述瞬时分析在稳定植物体系中为基因表达提供指示。如此处所用的短语“标记基因”指可以通过某种方法筛选或评定其表达的任何可转录的多核苷酸分子。在瞬时测定中测试标记基因表达的方法为本领域技术人员所公知。已经使用多种植物、组织和DNA送递体系报导了标记基因的瞬时表达。例如，瞬时分析的类型可包括但不限于在任何瞬时植物测定中使用任何目的植物物种通过组织电穿孔或粒子轰击的直接基因送递。这类瞬时体系可包括但不限于多种组织来源的原生质体电穿孔或特定的目的组织的粒子轰击。本发明包括使用任何瞬时表达体系来评价与任何可转录的多核苷酸分子可操作地连接的启动子或启动子片段，所述可转录的多核苷酸分子包括但不限于经过选择的报告基因、标记基因或具有农业重要性的基因。预想在瞬时中通过合适的送递体系测试的植物组织的实例包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。

在瞬时测定中可使用任何可评价或筛选标记基因。本发明的启动子或启动子片段瞬时分析的优选标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670，在此引用作为参考)或GFP基因(美国专利5,491,084，在此引用作为参考)。将含有启动子或启动子片段的构建体送递至组织，所述启动子或启动子片段与标记基因可操作地连接，并依赖于标记通过合适的机制分析该组织。当与稳定植物中具有农业重要性的基因可操作地连接时，使用定量或定性分析作为工具来评价该启动子或启动子片段可能的表达谱。

因此，在一个优选实施方案中，将SEQ ID NOs：1和4所示的本发明的多核苷酸分子或其片段、变体或衍生物整合到构建体中，从而将本发明的启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，所述可转录的多核苷酸分子提供选择标记、筛选标记或评价标记。用于实施本发明的标记包括但不限于编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUC)、赋予抗生素抗性的蛋白质或赋予除草剂耐受的蛋白质的可转录的多核苷酸分子。有用的抗生素抗性标记为本领域所公知，包括编码赋予对卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的蛋白质的那些标记。已经证明了转基因植物耐受、并且可以应用本发明方法的除草剂，包括但不限于草甘膦、草铵膦、磺酰脲、咪唑啉酮类、溴苯腈、茅草枯(delapon)、cyclohezanedione、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制剂和isoxasflutole除草剂。编码参与除草剂耐受的蛋白质的多核苷酸分子为本领域所公知，包括但不限于美国专利5627061、5633435和6040497中所述编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子；以及美国专利5094945中关于草甘膦耐受所述的aroA；美国专利4810648中关于溴苯腈耐受所述的编码溴苯腈腈水解酶的多核苷酸分子(Bxn)；Misawa等人，Plant J.，4：833-840(1993)和Misawa等人，Plant J.，6：481-489(1994)关于达草灭耐受所述的编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸分子(crtI)；Sathasiivan等人，Nucl.Acids Res.，18：2188-2193(1990)关于对磺酰脲除草剂耐受所述的编码乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase)(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；以及DeBlock等人，EMBO J.，6：2513-2519(1987)关于草铵膦和双丙氨酰膦耐受所述的bar基因。

在一个优选的实施方案中，将SEQ ID NOs：1和4所示本发明的多核苷酸分子或其片段、变体或衍生物整合到构建体中，从而将本发明的启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，所述可转录的多核苷酸分子是具有农业重要性的基因。如此处所用的短语“具有农业重要性的基因”指可转录的多核苷酸分子，其包括但不限于提供与植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受有关的所需特征的基因。为了赋予农业重要的性状，需要表达具有农业重要性的基因。为农作物植物提供有利农业性状的具有农业重要性的基因可以是例如，包括但不限于遗传因子，包括除草剂抗性(美国专利5633435和5463175)、增加的产量(美国专利5716837)、昆虫控制(美国专利6063597、6063756、6093695、5942664和6110464)、真菌疾病抗性(美国专利5516671、5773696、6121436、6316407和6506962)、病毒抗性(美国专利5304730和6013864)、线虫抗性(美国专利6228992)、细菌疾病抗性(美国专利5516671)、淀粉生产(美国专利5750876和6476295)、修饰的油生产(美国专利6444876)、高油生产(美国专利5608149和6476295)、修饰的脂肪酸含量(美国专利6537750)、高蛋白生产(美国专利6380466)、水果成熟(美国专利5512466)、增强的动物和人类营养(5985605和6171640)、生物聚合物(美国专利5958745和美国公开申请号2003/0028917)、环境应激抗性(美国专利6072103)、药物肽(美国专利6080560)、改善的加工性状(美国专利6476295)、改善的可消化性(美国专利6531648)、低棉子糖(美国专利6166292)、工业酶生产(美国专利5543576)、改善的风味(美国专利6011199)、固氮作用(美国专利5229114)、杂种种子生产(美国专利5689041)以及生物燃料生产(美国专利5998700)，上面所列专利中描述的遗传因子和转基因在此引用作为参考。

另外，可转录的多核苷酸分子可以通过编码不可翻译的RNA分子而影响上述表型，所述不可翻译的RNA分子通过例如反义、RNAi或共抑制介导的机制引起内源性基因表达的靶向抑制。RNA也可以是经过工程改造的催化性RNA分子(即核酶)以切割所需内源性mRNA产物。因此，可以在本发明的实践中使用编码表达目的表型或形态学改变的蛋白质或mRNA的任何多核苷酸分子。

本发明的构建体可以包含双Ti质粒边界DNA构建体，所述双Ti质粒边界DNA构建体具有从根癌土壤杆菌分离的包含T-DNA的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，所述Ti质粒与由土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞提供的转移分子一起，允许T-DNA向植物细胞基因组中的整合。该构建体也可以含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒主链DNA片段，例如，大肠杆菌(E.coli)的复制起点例如ori322、宽宿主范围的复制起点例如oriV或oriRi、以及选择标记编码区，例如Spec/Strp，其编码赋予壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酸转移酶(aadA)，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株常常为根癌土壤杆菌ABI、C58或LBA4404，然而，植物转化领域技术人员已知的其它菌株也可以在本发明中发挥功能。

转化的植物和植物细胞

如此处所用的术语“转化的”指已引入了外来多核苷酸分子例如构建体的细胞、组织、器官或生物。优选将引入的多核苷酸分子整合到受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA中，从而使引入的多核苷酸分子由后来的后代遗传。“转基因的”或“转化的”细胞或生物也包括细胞或生物的后代，以及在杂交中采用这样的转基因植物作为亲本、并表现出由于存在外来多核苷酸分子而产生的改变的表型的育种程序产生的后代。可以通过任何植物转化方法将含有本发明启动子的植物转化构建体引入植物。在本发明的实践中通过将植物表达构建体引入植物基因组而转化植物的方法和材料可以包含任何公知的和经过证明的方法，包括美国专利5384253中说明的电穿孔；美国专利5015580、5550318、5538880、6160208、6399861和6403865中说明的微粒轰击；美国专利5635055、5824877、5591616、5981840和6384301中说明的土壤杆菌介导的转化；以及美国专利5508184中说明的原生质体转化，所有这些专利都在此引用作为参考。

转化双子叶植物(dicot)的特定方法为本领域技术人员所熟知。使用这些方法的转化和植物再生已经关于许多农作物进行了说明，所述农作物包括但不限于棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、大豆(Glycine max)、花生(落花生(Arachis hypogaea))、芸苔属(Brassica)成员以及苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))。

转化单子叶植物(monocot)的特定方法为本领域技术人员所熟知。使用这些方法的转化和植物再生已经关于许多农作物进行了说明，所述农作物包括但不限于大麦(Hordeum vulgarae)、玉蜀黍(Zeamays)、燕麦(Avena sativa)、果园草(鸭茅(Dactylis glomerata))、稻(Oryza sativa，包括籼型和粳型变种)、高梁(两色蜀黍(Sorghumbicolor))、甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum sp))、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、草坪草(剪股颖属(Agrostis))、小麦(普通小麦(Triticumaestivum))、黍和黑麦。

对本领域技术人员显而易见的是，为了产生来自任何数目的目的靶农作物的稳定转基因植物，可以使用并修饰许多转化方法。

许多种子、坚果和核含有油，这些油能够得到提取并用于烹饪，作为其它食物中的成分，作为营养补充剂，作为制造肥皂、身体和毛发油、去污剂、颜料的原材料，以及某些基于石油的润滑剂和燃料的替代品。如此处所用的，将这些种子、坚果和核统称为“油料种子”(National Sustainable Agriculture Information Service(ATTRA)，Fayetteville，AR)。表1列出通常分类为油料种子的种子、坚果和核的实例。

表1.含油种子、坚果、核

杏仁(Apricot stones)	红醋栗	辣椒
			鳄梨(Avocado)	加州希蒙得木	巴西坚果
棉籽	咖啡	西番莲果
			欧洲越桔	可可豆	美洲山核桃
玻璃苣	胡荽	阿月浑子果
			刺荨麻(stinging nettle)	葛缕子籽	油菜籽
山毛榉坚果	南瓜籽	蓖麻子
			金盏草	亚麻子	海鼠李
腰果	肉豆蔻	芥菜籽
			干椰子肉(干燥的椰子)	玉米籽	芝麻籽
红花	澳洲坚果	大豆
			落花生	杏仁	葵花籽
大戟	瓜子仁	Tropho plant
			橡胶籽	罂粟	西红柿籽
野玫瑰果	肉豆蔻核仁	葡萄籽
			大麻	夜来香	胡桃
榛实	印度楝树籽	柑桔籽
			悬钩子	Niger seed	低芥酸芥子
接骨木	棕榈仁

在另一个实施方案中，本发明提供制备植物油的方法，其包括将本发明启动子整合到油料种子植物基因组中、栽培该油料种子植物以产生油料种子、并从油料种子中提取油和/或蛋白质的步骤，所述启动子与赋予改变的油和/或蛋白质含量的可转录的多核苷酸分子可操作地连接。

对转化的植物分析目的基因的存在以及由本发明启动子赋予的表达水平和/或特征。本领域技术人员知道大量可利用的分析转化植物的方法。例如，植物分析的方法包括但不限于DNA印迹或RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价(fieldevaluations)和免疫诊断测定。

本发明的种子可以从可育的转基因植物收获，并且可以用于栽培本发明的转化植物的后代世代，所述后代世代包括含有本发明构建体、并表达具有农业重要性的基因的杂种植物系。将术语“种子”和“核”理解为含义相同。术语核常用于描述玉米或稻植物的种子。在所有植物中，种子是由种皮、胚、糊粉和胚乳组成的成熟胚珠。

本发明的启动子提供在植物组织、优选在至少一种植物种子组织中的差异表达，所述植物种子组织包含种皮、胚、糊粉和胚乳。在此将该启动子称为“种子增强的启动子”。

本发明涉及通过操纵细胞增殖基因在种子中的表达而改变细胞数目和种子特异性器官(例如胚和/或糊粉)的大小，在植物中改变细胞周期。较大的种子特异性器官引起每个种子产生更多的油、微量营养物、蛋白质或淀粉。本发明包括修饰细胞周期的各种策略。

短语“细胞增殖”指如在快速生长的组织中进行细胞有丝分裂的细胞。可以通过表达参与细胞增殖过程的基因来增强细胞增殖，所述基因包括但不限于CYCD2；1(CYCD2)和CYCD3；1(CYCD3)(GenBank编号X83370和X83371，Soni等人，Plant Cell，7：85-103(1995))、E2Fb(GenBank编号AJ294533，Richard等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，69：167-176(2002))、AINTEGUMENTA(GenBank编号U41339，Elliott等人，Plant Cell，8(2)：155-168(1996))。

以类似的方式，可以通过表达参与细胞增殖过程的基因中断或抑制细胞增殖，所述基因包括但不限于KRP1和KRP2(GenBank编号U94772和AJ251851，De Veylder等人，The Plant Cell，13：1653-1667(2001))和AtWEE1(GenBank编号CAD28679，Sorrell等人，Planta，215(3)：518-522(2002))。

短语“微量营养物含量”指在种子中按照重量基础表示的微量营养物的量，所述微量营养物即维生素A、E、K、生育酚、生育三烯酚(tocotrienol)或类胡萝卜素。

短语“油含量”指可以通过例如低分辨率¹H核磁共振(NMR)(Tiwari等人，JAOCS，51：104-109(1974)或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))或近红外透射(NIT)光谱学(Orman等人，JAOCS，69(10)：1036-1038(1992)；Patrick等人，JAOCS，74(3)：273-276(1997))确定的油水平。

此处所用的短语“油组成”指样品中不同脂肪酸或油组分的比率。这类样品可以是植物或植物部分，例如种子。这类样品也可以是植物部分的集合。

此处所用的短语“百分比含量”，在优选的实施方案中指特定组分的总重量相对于其它类似相关组分的百分比。

此处所用的短语“增强的油”或“油增强”包括增加的油产量或改变的油组成。

此处所用的短语“蔗糖磷酸化酶”指一种酶，该酶催化蔗糖和无机磷酸盐向α-D-葡萄糖-1-磷酸和D-果糖的可逆转化。该酶可以分离自许多微生物来源，包括变异链球菌(Streptococcus mutans)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrifaciens)、出芽茁霉(Pullularia pullulans)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、土壤杆菌属物种(Agrobacterium sp.)和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)(美国专利6235971)。

此处所用的短语“淀粉增强”指导致多糖(例如淀粉)水平增加的基因或基因组合。

此处所用的术语“淀粉”指以颗粒形式存在于某些植物物种、特别是谷类、块茎和豆类(例如玉米、小麦、稻、马铃薯和大豆)中的碳水化合物聚合物。该聚合物由连接的脱水α-D-葡萄糖结构单位组成。该聚合物可以主要为线性结构(淀粉酶)或分支结构(支链淀粉)。

短语“蛋白质质量”指无论是游离的还是整合到蛋白质中的一种或多种必需氨基酸的水平，所述必需氨基酸即组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。

包含下列实施例在内以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下面实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地发挥功能的技术。然而，根据本发明公开内容的指导，本领域技术人员应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中进行许多改变并仍然获得相似或类似结果，因此将所述或附图中所示所有内容解释为说明性的，并且没有限制性意义。

实施例

实施例1：P-Dgat1和P-Dgat2启动子的分离。

使用下述修改的基因组DNA分离规程(Dellaporta等人，(1983)Plant Molecular Biology Reporter，1：19-21)使用从鼠耳芥分离的基因组DNA构建基因组DNA文库。收获在土壤或培养皿中栽培的鼠耳芥幼苗，并于液氮中保持冷冻直至提取。使用研钵和研杵将组织研磨为细粉末，同时保持用液氮冷冻组织。将粉末状组织转移到含有200mL冷(0℃)的DNA提取缓冲液(350mM山梨糖醇，100mM Tris，5mMEDTA，用HCl调pH至7.5，临用前加入亚硫酸氢钠(3.8mg/mL))的韦林氏搅切器中，并高速匀浆30-60秒。将匀浆物经干酪包布(cheesecloth)层过滤并收集在离心瓶中。将样品于2500xg离心20分钟。弃去上清液和任何疏松的绿色材料。然后将沉淀重悬在1.25mLDNA提取缓冲液中，并转移到50mL聚丙烯管中。

然后加入细胞核裂解缓冲液(1.75mL，含有200mM Tris、50mMEDTA、2M NaCl、2.0％(w/v)CTAB、用HCl调pH至7.5)，随后加入0.6mL 5％(w/v)肌氨酰。将管轻轻混合，并将样品于65℃温育20分钟。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)并将管轻轻混合。然后将管于2500xg离心15分钟，并将得到的上清液转移到清洁的管中。将等体积冰冷的异丙醇注入样品，并将样品颠倒几次直至形成沉淀。使用玻璃移液管将沉淀从溶液中取出，并通过使沉淀空气干燥2-5分钟而取出残留的醇。将沉淀重悬在400μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调节pH至8.0)中。

P-Dgat1启动子

使用PCR(聚合酶链反应)分离P-Dgat1启动子(SEQ ID NO：1)。PCR反应的反应条件遵照制造商规程(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)。使用各30nmol正向引物(SEQ ID NO：2)和反向引物(SEQ ID NO：3)，和各10微摩尔dATP、dCTP、dGTP和TTP，2.5个单位的TaKaRaLA Taq在1X LA PCR缓冲液II(Takara Bio INC，Shiga，日本)中扩增大约100ng如上所述制备的鼠耳芥基因组DNA。最初于94℃温育1分钟后，进行于94℃45秒，随后于60℃退火45秒，于72℃1分钟15秒的35个循环的PCR，随后为72℃7分钟的一个循环。

通过PCR分离含有P-Dgat1启动子的1250bp片段，随后用PstI和SpeI限制酶限制酶切消化而制备P-Dgat1：大肠杆菌(Escherichiacoli)葡糖醛酸糖苷酶(uidA)报告基因构建体。将产生的片段连接到也已用PstI和SpeI消化的pMON63925中。将产生的质粒命名为pMON63922。通过用NcoI和NotI限制酶消化从pMON63922取出含有P-Dgat1和P-CaMV-70启动子的1496bp片段。将产生的片段连接到也已用NcoI和NotI消化的pMON65424中。然后将产生的质粒命名为pMON65430，该质粒含有与大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶(uidA)报告基因和napin 3’UTR可操作地连接的P-Dgat1启动子(图2)。使用草甘膦作为选择标记(美国专利5633435)。使用如上所述的标准方法学通过PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)确定核酸序列，并证实克隆连接的完整性。在下文实施例2中所述的后续鼠耳芥和低芥酸芥子转化中使用pMON65430载体。

P-Dgat2启动子

使用PCR(聚合酶链反应)分离P-Dgat2启动子(SEQ ID NO：4)。PCR反应的反应条件遵照制造商规程(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)。使用各30nmol正向引物(SEQ ID NO：5)和反向引物(SEQ ID NO：6)，和各10微摩尔dATP、dCTP、dGTP和TTP，2.5个单位的AmpliTaq Gold在1X Opti-Prime^TM Buffer 3(Stratagene，Jolla，California美国)中扩增大约100ng如上所述制备的鼠耳芥基因组DNA。最初于95℃温育10分钟后，进行于92℃15秒，随后为15个于62℃开始、并每个循环降低0.7℃的20秒循环，并于72℃2分钟的15个循环的PCR，随后为92℃15秒、52℃20秒和72℃2分钟的20个循环，随后为72℃7分钟的一个循环。

根据厂商说明书使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.Valencia，CA，美国)纯化PCR反应产物，并根据厂商说明书将其克隆到pCR2.1Topo(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA，美国)中。将产生的质粒命名为pMON65421。使用由PE Applied Biosystems(Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc.，Foster City CA，美国)提出的标准测序方法学确定该克隆的完整序列。

通过用PmeI和NcoI限制酶限制酶切消化从pMON65421分离含有P-Dgat2启动子的1082bp片段，而制备P-Dgat2：大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶(uidA)报告基因构建体。将产生的片段连接到也已用PmeI和NcoI消化的pMON65424中。随后将产生的质粒命名为pMON65429，该质粒含有与大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶(uidA)报告基因和napin 3’UTR可操作地连接的P-Dgat2启动子(图1)。使用草甘膦作为选择标记(美国专利5633435)。使用如上所述的标准方法学通过PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0protocol(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)确定核酸序列，并证实克隆连接的完整性。将该载体用于实施例2中所述的后续鼠耳芥和低芥酸芥子转化中。

实施例2：含有P-Dgat启动子构建体的鼠耳芥和低芥酸芥子转化。

将实施例1中所述启动子与构建体中的标记基因大肠杆菌uidA可操作地连接以证明鼠耳芥和低芥酸芥子中的表达。表2列举了启动子构建体细节。

表2.鼠耳芥和低芥酸芥子转化构建体

构建体	启动子	SEQ ID NO	标记基因	3’UTR	图
						PMON65429	P-Dgat2	4	uidA	Napin	2
PMON65430	P-Dgat1	1	uidA	Napin	1

通过将种子播种在含有反渗透水(ROW)饱和的MetroMix 200(The Scotts Company，Columbus，OH，美国)的4英寸罐中栽培鼠耳芥植物。通过将罐置于4-7℃栽培室的加盖浅箱(flat)中4-7天，8小时光照/天而将植物春化。将该浅箱转移到22℃、55％相对湿度、并且16小时光照/天、平均强度160-200μEinstein/s/m²的栽培室中。将盖升起，并在萌发后滑回1英寸，然后在形成真叶时去除。根据需要用ROW从底部给植物注水直至萌发后2-3周。然后根据需要用Plantex15-15-18溶液(Plantex Corporation，Ottawa，加拿大)在50ppm N2从底部给植物注水。萌发后2-3周将罐间苗(thinned)从而每罐保留一株植物。一旦植物开始形成花柄(bolt)，就修剪初级花序以鼓励腋生花柄(axillary bolts)的生长。

如Bent等人，Science，265：1856-1860(1994)或Bechtold等人，C.R.Acad.Sci，Life Sciences，316：1194-1199(1993)所述获得转基因鼠耳芥植物。使含有转化载体pMON65429或pMON65430的根癌土壤杆菌菌株ABI培养物在LB(10％细菌用胰蛋白胨，5％酵母提取物和10％NaCl，含有卡那霉素(75mg/L)、氯霉素(25mg/L)和壮观霉素(100mg/L))中生长过夜。将细菌培养物离心并重悬于5％蔗糖+.05％Silwet-77溶液中。将完整鼠耳芥植株(约5-7周龄)的空气中部分在得到的溶液中浸2-3秒。通过将植株在在纸巾上吸干以去除过量溶液。将浸过的植株以其侧面置于加盖浅箱中，并转移到19℃的栽培室中。16至24小时后去除圆顶并将植株竖立。当植物达到成熟时，在收获种子之前停止供水2-7天。将收获的种子通过不锈钢网筛(40孔/英寸)以去除碎片。将收获的种子在分析前于室温保存在纸硬币信封(paper coin envelopes)中。

使用气相灭菌规程将鼠耳芥种子表面灭菌(surfacedsterilized)。将种子的开放容器置于具有烧杯的干燥器中，所述烧杯中含有100mL家用漂白剂(bleach)。临密封干燥器之前，将3mL浓HCL加入漂白剂。将干燥器密封并施加真空以使得能通过氯气灭菌。将种子温育几小时。将灭菌的种子播撒于鼠耳芥萌发培养基上，所述萌发培养基含有MS盐(1X)、蔗糖(1％)、肌醇(100mg/L)、硫胺素-HCl(1mg/L)、吡哆醇-HCl(500mg/L)、烟酸(500mg/L)、MESpH 5.7(0.05％)和植物琼脂(Phytagar)(0.7％)，补加50mg/L草甘膦。

将最多16株草甘膦抗性幼苗移植到含有MetroMix 200的

-英寸罐中，每罐一株幼苗，并在上述条件下栽培直至形成的初始长角果开始干化。从各个T1植株取出组织(莲座叶、茎生叶、茎、花、花芽和发育中的长角果)用于后来的组织化学染色。在用pMON65430转化的鼠耳芥植物中使用组织化学染色分析β-葡糖醛酸糖苷酶的表达。将来自转化的和对照植物的组织在溶液中于37℃温育约24小时，所述溶液含有50mM NaPO4(pH 7.2)、100μM铁氰化钾、100μM亚铁氰化钾、0.03％Triton X-100、20％甲醇以及2.5mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖醛酸(X-gluc)。通过在70％乙醇/30％H₂O中于37℃温育过夜对染色的组织清除叶绿素。立即对染色的组织拍照或将其转移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，并于4℃保存至拍照。对于pMON65430，测试的15个事件中的14个在发育中的种子中具有可检测的GUS活性水平。

实施例3：含有P-Dgat构建体的低芥酸芥子转化。

将载体pMON65429和pMON65430引入用于转化欧洲油菜(Brassica napus)的根癌土壤杆菌株ABI中。使用由Moloney和Radke在美国专利5,720,871中描述的规程转化低芥酸芥子植物。简要地，将欧洲油菜cv Ebony种子种植到含有Metro Mix 350(The ScottsCompany，Columbus，OH，美国)的2英寸罐中。将植物在栽培室中于24℃、16/8小时光周期、光照强度400mEm-2sec-1(HID灯)栽培。2-1/2周后，将植物移植到6英寸罐中，并在15/10℃的白天/晚上温度、16/8小时光周期、光照强度800mEm-2sec-1(HID灯)栽培室中栽培。

紧在形成花柄前或形成花柄过程中但是在开花前从植物取出四个末端结间部，用70％(v/v)乙醇1分钟、2％(w/v)次氯酸钠20分钟表面灭菌，并用无菌去离子水漂洗3次。将六至七个茎段切割为5mm圆片，保持基部末端方向。将用于转化低芥酸芥子的土壤杆菌培养物在含有50mg/L卡那霉素、24mg/L氯霉素和100mg/L壮观霉素的2mLLuria Broth，LB(10％细菌用胰蛋白胨，5％酵母提取物和10％NaCl)中于24℃在旋转振荡器上生长过夜。在MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15：473 497，(1962))中制备1∶10稀释物，从而得到约每毫升9×10⁸个细胞。用1.0mL土壤杆菌接种茎圆片(stemdiscs)(外植体)，并将过量部分从外植体吸出。

将外植体基底侧向下置于含有培养基的培养皿板中，所述培养基包含1/10MS盐、维生素B5(1％肌醇；0.1％硫胺素-HCl；0.01％烟酸；0.01％吡哆醇HCl)，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1.0mg/L 6苄基腺嘌呤(BA)。用含有MS盐、维生素B5，3％蔗糖，pH5.7，4.0mg/L对氯苯氧基乙酸、0.005mg/L激动素的1.5mL培养基将平板分层，并用无菌滤纸覆盖。共培养2至3天后，将外植体转移到含有MS盐、维生素B5，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1.0mg/L BA，500mg/l羧苄青霉素，50mg/L头孢噻肟和25mg/L草甘膦的深盘培养皿板中进行选择。各平板放置七个外植体。3周后将其转移到新鲜培养基中，各平板5个外植体。将外植体在栽培室中于25℃在连续光照(CoolWhite)下培养。

在转移到温室之前，将转化的植物在栽培室中于22℃、16/8小时光照-黑暗周期、光照强度mEm^-2sec^-1栽培几周。将植物保持在温室中直至收获。在授粉后各个阶段收获发育中的长角果，并保存于负70℃。也采集茎、花和叶；并在采集后不经预先冷冻而立刻染色(如下所述)。采集成熟种子并保存于由约17℃和30％湿度组成的控制的条件下。

于授粉后几个时间点从单个R0植物收获最多5个长角果。使用18号针头刻划长角果以使染色液能够接触发育中的种子。将长角果和种子于37℃在溶液中温育约24小时，所述溶液含有50mM NaPO₄(pH7.2)，100mM铁氰化钾，100mM亚铁氰化钾，0.03％Triton X 100，20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-葡糖醛酸(X gluc)。通过于37℃在70％乙醇/30％H₂O中温育过夜清除染色的组织中的叶绿素。立即将染色的组织拍照或将其转移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，并保存于4℃直至拍照。将样品对蓝色记录为正(+)或负(-)。

对于用pMON65429转化的植物，筛选的10个植物中8个在来自至少一个时间点的种子中具有可检测水平的GUS活性(表3)。对于用pMON65430转化的植物，筛选的10个植物中7个在来自至少一个时间点的种子中具有可检测水平的GUS活性(表4)。

表3.pMON65429在发育中的低芥酸芥子种子中的表达

表4.pMON65430在发育中的低芥酸芥子种子中的表达

举例并说明本发明原理后，对本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离这些原理的情况下将本发明在安排上和细节上进行修改。我们请求保护在附加权利要求的精神和范围之内的所有修改。在本说明书中引用的所有出版物和公开的专利文件都在此引用作为参考，其程度与每个单独出版物或专利申请经明确和单独说明引用作为参考一样。

Claims

1.启动子，其多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包含权利要求1的启动子的构建体，该启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接。

3.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是编码二酰甘油酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶或无色花色素双加氧酶的基因。

4.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是编码蔗糖磷酸化酶的基因。

5.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是标记基因。

6.用权利要求2的构建体转化的植物细胞。