CN101065490B - 用于植物的启动子分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及调节植物中基因表达的多核苷酸分子。具体而言，本发明涉及用于调节异源多核苷酸分子在植物中的基因表达的分离自欧洲油菜的启动子。本发明也涉及含有该异源多核苷酸分子的表达构建体和转基因植物。

Description

用于植物的启动子分子
发明背景
本申请要求于2004年9月24日提交的临时申请序号60/613,081的优先权，所述临时申请的公开内容在此以其整体引用作为参考。
1.发明领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，并且更具体地涉及可用于在植物中表达转基因的多核苷酸分子。
2.相关技术描述
植物基因工程的目标之一是产生具有农业所需特征或性状的植物。基因工程的进展已提供了转化植物以含有并表达外来基因的必需工具。植物转化和再生中的技术进展已使研究人员能够获取外源多核苷酸分子(例如异源或天然来源的基因)、并将该多核苷酸分子整合到植物基因组中。该基因于是可以在植物细胞中得到表达以表现出添加的特征或性状。在一种方法中，基因在通常不表达这类基因的植物细胞或植物组织中的表达可能赋予所需的表型作用。在另一种方法中，基因或部分基因在反义方向的转录可以通过阻止或抑制内源基因的表达而产生所需的作用。
为了产生具有各种所需特征的转基因植物，有利的是具有多种启动子以提供基因表达，从而以产生所需作用所必需的量将基因有效转录。遗传改良种质的商业开发也已进展到将多种性状引入农作物植物的阶段，常称为基因堆积方法(gene stacking approach)。在该方法中，可以将赋予不同目的特征的多个基因引入植物。将多个基因引入植物中时常常需要将各基因进行调节或控制以进行最佳表达，从而导致需要不同的调节元件。有鉴于此以及其他考虑，基因表达的最佳控制及调节元件多样性在植物生物技术当中显然是重要的。
文献中已经描述了大量在植物细胞中起作用的启动子。这些启动子包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂氨酸(nos)启动子和章鱼氨酸合酶(ocs)启动子以及花椰菜花叶病毒(caulimovirus)启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S或35S启动子(美国专利5,352,605)、具有重复增强子的CaMV 35S启动子(美国专利5,164,316；5,196,525；5,322,938；5,359,142；和5,424,200)以及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(美国专利5,378,619)。这些启动子及众多其他启动子已经用于产生用于植物中转基因表达的构建体。在例如美国专利5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,614,399；5,633,441；6,232,526；和5,633,435中描述了其他有用的启动子，所有这些专利都在此引用作为参考。
尽管以前的工作已经提供了许多用于在转基因植物中指导转录的启动子，但仍然需要具有有利的表达特征的新启动子。具体而言，需要能够指导外源基因在双子叶种子中表达的启动子。完全实现所选择的基因在转基因植物中表达的利益所需的表达模式或水平不能由许多以前鉴定的启动子提供。因此，在植物基因工程领域需要用于双子叶(dicot)植物的新启动子。
发明概述
本发明涉及描述为长角果壁优选的启动子的启动子。短语“长角果壁优选的”指与任何其他测试的组织相比，驱动可操作地连接的基因在长角果壁中表达至更高水平的启动子。长角果壁优选的启动子可用于产生具有所需的种子性状的转基因植物。这些包括，但不限于，改变油含量、蛋白质质量、细胞增殖或者微量营养物质量。
在一个实施方案中，本发明提供了启动子，其包含与选自SEQ IDNOs：7、8和9的多核苷酸序列基本上同源的多核苷酸序列，或者其任何片段和变体，其能够调节可操作地连接的多核苷酸分子的转录，例如，具有启动子活性。在特定实施方案中，本文提供的序列的片段定义为包含本文描述的任一种启动子序列，包括例如，SEQ ID NOs：7、8和9的至少约30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、750、900、1000或更多连续核苷酸。
在另一实施方案中，本发明提供了包含启动子的植物表达构建体，所述启动子包含与本文描述的的多核苷酸序列，例如选自SEQ IDNOs：7、8和9的多核苷酸序列基本上同源的多核苷酸序列或者其片段或者变体，其中所述启动子可操作地连接可转录的多核苷酸分子。
在再一个实施方案中，本发明提供了用本发明提供的包含启动子的植物表达构建体稳定转化的转基因植物。在一个实施方案中，构建体包含与选自SEQ ID NOs：7、8和9的多核苷酸序列基本上同源的多核苷酸序列或者其片段、变体或区域，其中所述启动子可操作地连接可转录的多核苷酸分子。
在另一实施方案中，本发明提供了产生植物油的方法，其包括如下步骤：向植物基因组中整合可操作地连接赋予改变的油和/或蛋白质含量的可转录的多核苷酸分子的本发明的启动子，栽培所述植物以产生种子，并从种子提取所述油和/或蛋白质。在再一个实施方案中，本发明提供了制备食物或饲料的方法，其包括得到本发明的植物并从该植物或其部分制备食物或饲料。
本发明的前面和其他方面将从下面的详细描述变得更显而易见。
序列简述
SEQ ID NO：1给出了P-BN.RPC-0:1:1启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2给出了启动子GSP1的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：3给出了启动子AP1的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4给出了启动子GSP2的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5给出了启动子AP2的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6给出了启动子D11 nco的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：7给出了P-BN.SW1-0:1:2启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：8给出了P-BN.SW2-0:1:2启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：9给出了P-BN.SW3-0:1:2启动子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：10给出了引物#17637的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：11给出了引物#17636的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：12给出了引物#17669的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：13给出了引物#17668的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：14给出了引物#18210的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：15给出了引物#18209的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：16给出了引物#18115的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：17给出了引物#18167的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：18给出了引物#18206的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：19给出了引物#18340的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：20给出了引物#19944的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：21给出了引物#19945的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：22给出了含有P-BN.SW3-0:1:2的891bp片段的多核苷酸序列。
发明详述
提供下列定义和方法以更好地定义本发明并在本发明的实践中给本领域普通技术人员以指导。除非另外指出，相关领域普通技术人员将根据常规用法理解术语。
此处所用的短语“多核苷酸分子”指基因组或合成来源的单链或双链DNA或RNA，即分别为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物，从5’(上游)末端读向3’(下游)末端。
此处所用的短语“多核苷酸序列”指多核苷酸分子序列。使用如37CFR§1.822中所述的DNA碱基命名法。
启动子
此处所用的术语“启动子”指多核苷酸分子，所述多核苷酸分子在其天然状态位于可读框(或蛋白质编码区)的翻译起始密码子上游或5’，并参与RNA聚合酶II及其他蛋白质(反式作用转录因子)的识别和结合以启动转录。“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或非天然启动子。组成型植物启动子在植物发育始终的大部分或所有组织中发挥功能。可以将任何植物启动子用作5’调节元件以用于调节与其可操作地连接的一种或多种特定基因的表达。当与可转录的多核苷酸分子可操作地连接时，启动子一般引起该可转录的多核苷酸分子的转录，其转录方式与该启动子通常连接的可转录的多核苷酸分子的转录方式类似。植物启动子可以包括通过操作已知启动子以产生人工、嵌合或杂合启动子而产生的启动子。这类启动子也可以通过例如向具有其自身部分或全部调节元件的活性启动子加入异源调节元件而组合了来自一个或多个启动子的顺式元件。因此，本发明包括嵌合或杂合启动子的设计、构建和用途，所述嵌合或杂合启动子包含SEQID NOs：7、8和9的至少一个顺式元件以用于调节可操作地连接的多核苷酸序列的表达。
此处所用的术语“顺式元件”指赋予基因表达全面控制的一方面的顺式作用转录调节元件。顺式元件可以起到结合调节转录的转录因子，反式作用蛋白质因子的作用。一些顺式元件结合超过一种转录因子，而且转录因子可以与超过一种顺式元件以不同的亲和力相互作用。本发明的启动子合意地含有可以赋予或调节基因表达的顺式元件。可以通过许多技术鉴定顺式元件，所述技术包括缺失分析，即从启动子5’末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰分析、电泳迁移率变动分析、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹法以及其他常规测定法；或通过常规DNA序列比较方法与已知顺式元件基序的DNA序列相似性分析。可以通过诱变(或替代)一个或多个核苷酸或通过其他常规方法进一步研究顺式元件的精细结构。可以通过化学合成或从包含这类元件的启动子分离来获得顺式元件，而且将它们与额外的侧翼核苷酸一起合成，所述侧翼核苷酸含有有用的限制酶位点以促进后续操作。
在一个实施方案中，本发明的启动子包含多个顺式元件，每个顺式元件为基因表达的全面控制赋予不同的方面。在优选的实施方案中，使用专为鉴定序列内顺式元件、结构域或基序而设计的计算机程序鉴定来自SEQ ID NOs：7、8和9的多核苷酸分子的顺式元件。取决于条件，顺式元件可能正或负调节基因表达。本发明因此包含公开的启动子的顺式元件。
此处所用的短语“基本同源的”指通常表现出与在此提供的启动子具有相当大百分比序列同一性的多核苷酸分子。尤其感兴趣的是这样的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在植物中发挥功能以指导转录，并且与在此所述启动子的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性或甚至更高的序列同一性，具体包括至少约73％、75％、78％、83％、85％、88％、92％、94、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，所述启动子例如在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中提供的。能够调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子转录、并且与在此提供的启动子的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸分子包括在本发明的范围内。
在此所用的短语“百分比序列同一性”指当两个序列得到最佳比对时(具有适当的核苷酸插入、缺失或在比较窗口中总计低于参照序列20％的缺口)，与测试多核苷酸分子(或其互补链)相比，参照多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分数。比对比较窗口的最佳序列比对为本领域技术人员所熟知，并且可以通过工具(例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法)实施，并优选通过计算机化执行这类算法(例如作为Wisconsin
Figure G05840315820070528D000062
(Accelrys Inc.，San Diego，CA)的部分提供的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)而实施。测试序列和参照序列比对片段的“同一性分数”是两个比对序列共有的相同组分的数目除以参照序列片段(即整个参照序列或参照序列中详细说明的较小部分)中的组分总数目。将百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分、或与更长的多核苷酸序列比较。
此处所用的术语“同源性”指多核苷酸序列之间在百分比核苷酸位置同一性(即序列相似性或同一性)方面的相似性或百分同一性的水平。此处所用的术语同源性也指不同多核苷酸分子之间相似的功能特性的概念，例如具有相似功能的启动子可能具有同源的顺式元件。当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严格性条件)，一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。短语“严格条件”是关于核酸探针与靶核酸(即与特定的目的核酸序列)通过特定杂交程序杂交而功能性定义的，所述杂交程序在Sambrook等人(2000)中进行讨论。因此，本发明的核苷酸序列可以因其与多核苷酸分子片段的一段互补序列选择性地形成双链体分子的能力而得到利用。
根据设想的应用，人们需要采用不同的杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于要求高选择性的应用，人们一般需要采用相对的高严格条件以形成杂交体，例如，人们将选择相对低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃温度、约0.02M至约0.15M NaCl所提供的条件。例如，高严格条件是以高严格性洗涤缓冲液(0.2XSSC，0.1％SDS，65℃)将杂交过滤器(filter)洗涤至少两次。促进DNA杂交的合适的中等严格性条件为本领域技术人员所公知，例如约45℃、6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后为50℃的2.0x SSC洗涤。另外，可以从50℃、约2.0x SSC的低严格性至50℃、约0.2x SSC的高严格性选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，可以从室温(约22℃)的低严格性条件至约65℃的高严格性条件增加洗涤步骤中的温度。温度和盐均可以变化，或者可以保持温度或盐浓度恒定而改变另一个变量。这样的选择性条件允许探针和模板或靶链之间的很少的错配。通过杂交检测多核苷酸分子为本领域技术人员所熟知，且美国专利4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的示例。
也可以通过计算机程序确定同源性，所述计算机程序比对多核苷酸序列并评价多核苷酸分子在确定的严格性条件下形成双链体分子的能力。将共有高同源性程度的不同来源的多核苷酸分子称为“同源的”。
可以使用本领域技术人员熟知的方法鉴定具有与在此所述的启动子相似的活性的目的启动子。例如，可以使用目的细胞或组织构建cDNA文库，并筛选所述文库以鉴定具有与在此所述的启动子相似的表达模式的基因。然后可以使用鉴定的基因的cDNA序列分离基因的启动子以进行进一步表征。见例如美国专利6,096,950；5,589,583；和5,898,096，在此引用作为参考。另外，也可以使用转录特征分析(profiling)或电子RNA印迹(northern)技术鉴定具有与在此所述的启动子相似的表达模式的基因。一旦这些基因得到鉴定，就可以分离其启动子以进行进一步表征。见例如美国专利6,506,565和6,448,387，在此引用作为参考。电子RNA印迹技术指以计算机为基础的序列分析，所述序列分析使得能够将来自多个cDNA文库的序列基于研究人员确定的参数(包括在多个cDNA文库中EST群体的丰度)、或是专门与来自一个文库或文库组合的EST组电子地进行比较。转录特征分析技术是用于对数千基因系统监控基因表达谱的高通量方法。基于DNA芯片的技术将数千cDNA序列排列于支持物表面上。将这些阵列同时与一群标记的cDNA探针杂交，所述cDNA探针从不同细胞或组织类型的RNA样品制备，从而允许表达的直接比较分析。该方法可以用于分离调节序列，例如与这些基因相关的启动子。
在另一个实施方案中，可以修饰在此公开的启动子。本领域技术人员可以生成在多核苷酸序列中有变化的启动子。可以修饰或改变如SEQ ID NOs：7、8和9中所示的本发明的启动子多核苷酸序列，以增强其控制特征。改变多核苷酸序列的一个优选方法是使用PCR以修饰序列中所选核苷酸或区域。这些方法为本领域技术人员所熟知。可以在基于PCR的DNA修饰方法中通过例如模板序列的插入、缺失或置换而修饰序列。在本发明的上下文中，“变体”是含有变化的启动子，在所述启动子中，优选在基本保持启动子功能的同时缺失、添加和/或替代原始启动子的一个或多个核苷酸。例如，可以从启动子5’或3’末端缺失一个或多个碱基对以产生“截短的”启动子。可以在启动子内部插入、缺失或替代一个或多个碱基对。在启动子片段的情况下，变体启动子可以包含影响与其可操作地连接的最小启动子转录的改变。最小或基本启动子是能够招募并结合基本转录机器的多核苷酸分子。真核细胞中基本转录机器的一个实例是RNA聚合酶II复合物及其附属蛋白质。可以通过例如标准DNA诱变技术或通过化学合成变体启动子或其部分而产生变体启动子。
可以通过多种方法设计或工程改造新的嵌合启动子。许多启动子含有激活、增强或限定启动子强度和/或特异性的顺式元件。例如，启动子可能含有定义了转录起始位点的“TATA”框以及位于转录起始位点上游调节转录水平的其它顺式元件。例如，可以通过将第一个启动子片段与第二个启动子片段融合而产生嵌合启动子，所述第一个启动子片段含有来自一个启动子的激活剂顺式元件，而所述第二个启动子片段含有来自另一个启动子的激活剂顺式元件；产生的嵌合启动子可以引起可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达增加。可以构建启动子，从而通过将这类片段置于最小启动子上游而把启动子片段或元件可操作地连接。本发明的顺式元件和片段可以用于构建这类嵌合启动子。构建本发明的嵌合和变体启动子的方法包括但是不限于组合不同启动子的控制元件、或将启动子的部分或区域重复(见例如美国专利4,990,607、5,110,732和5,097,025，所有专利都在此引用作为参考)。本领域技术人员熟知标准资源材料，所述资源材料描述了构建、操作和分离大分子(例如多核苷酸分子、质粒等)、以及产生重组生物并筛选和分离多核苷酸分子的具体条件和程序。
在另一个实施方案中，包含SEQ ID NOs：7、8和9所示多核苷酸序列的启动子包括该多核苷酸序列的任何长度，所述多核苷酸序列能够调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子。例如，SEQ ID NOs：7、8和9中公开的启动子可以是截短的，或者缺失了部分的，且仍然能够调节可操作地连接的多核苷酸分子转录。在有关实施方案中，公开的启动子的顺式元件可以赋予特定的特异性，例如赋予可操作地连接的多核苷酸分子在确定组织内表达的增强，并由此也能够调节可操作地连接的多核苷酸分子的转录。因此，包含SEQ ID NOs：7、8和9中所示多核苷酸序列的启动子的任何片段、部分或区域可以用作调节多核苷酸分子，包括但是不限于公开的多核苷酸分子的顺式元件或基序。可以组合替代、缺失、插入或其任何组合以产生最终构建体。
多核苷酸构建体
此处所用的短语“多核苷酸构建体”指来自任何来源的任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环形单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个多核苷酸分子已以功能上可操作的方式连接的多核苷酸分子。术语“多核苷酸构建体”和“构建体”在此互换使用。
此处所用的短语“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选地，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。
此处所用的短语“可转录的多核苷酸分子”指能够被转录为RNA分子的任何多核苷酸分子。已知以使可转录的多核苷酸分子被转录为功能mRNA分子的方式将构建体引入细胞的方法，所述功能mRNA分子得到翻译并从而表达为蛋白质产物。为了抑制特定的目的RNA分子的翻译，也可以构建能够表达反义RNA分子的构建体。为了实施本发明，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知，见例如Sambrook等人。
本发明的构建体一般可以含有与可转录的多核苷酸分子可操作地连接的启动子，该可转录的多核苷酸分子与3’转录终止多核苷酸分子可操作地连接。另外，构建体可以包括但不限于来自植物基因3’-非翻译区(3’UTR)的额外的调节多核苷酸分子(例如，增加mRNA的mRNA稳定性的3’UTR，比如马铃薯PI-II终止区、或章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶3’终止区)。构建体可以包含但不限于mRNA多核苷酸分子的5’非翻译区(5’UTR)，所述5’非翻译区在翻译起始中具有重要作用，并且也可以是植物表达构建体中的基因组分。例如，已经在植物中证明来自热激蛋白基因的非翻译的5’前导多核苷酸分子增强基因表达(见，例如美国专利5,659,122和5,362,865，以及美国公开申请号2002/0192812，在此引用作为参考)。这些额外的上游和下游调节多核苷酸分子可以来自天然来源、或来自与启动子构建体上存在的其他元件异源的来源。
因此，本发明的构建体包括例如SEQ ID NOs：7、8和9提供的、或如上所述修饰的那些启动子，该启动子与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，从而在把该构建体引入植物细胞中后，启动子指导所述可转录的多核苷酸分子以所需水平或在所需组织或以所需的发育模式表达。在有些情况下，可转录的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，且启动子提供功能mRMA分子的转录，该功能mRNA分子经过翻译并表达为蛋白质产物。为了在靶宿主细胞中抑制特定目的RNA分子的表达，也可以为转录反义RNA分子或其他相似的抑制性RNA而构建构建体。
整合到本发明的构建体中的示范性可转录的多核苷酸分子包括例如来自种类不同于靶基因种类的DNA分子或基因，或者是甚至起源于或存在于相同物种中、但通过不同于经典生殖或育种技术的基因工程方法整合到受体细胞中的基因。外源基因或遗传因子意指引入受体细胞内的任何基因或DNA分子。外源DNA中包含的DNA类型可以包括已经存在于植物细胞中的DNA，来自另一种植物的DNA，来自不同生物的DNA，或外部产生的DNA，例如含有基因反义信息的DNA分子，或编码基因的人造或修饰形式的DNA分子。
可以按照说明将本发明的启动子整合到使用标记基因的构建体中，并在瞬时分析中测试，所述瞬时分析在稳定植物体系中为基因表达提供指示。如此处所用的短语“标记基因”指可以通过某种方法筛选或评定其表达的任何可转录的多核苷酸分子。在瞬时测定中测试标记基因表达的方法为本领域技术人员所公知。已经使用多种植物、组织和DNA送递体系报导了标记基因的瞬时表达。例如，瞬时分析的类型可包括但不限于在任何瞬时植物测定中使用任何目的植物物种通过组织电穿孔或粒子轰击的直接基因送递。这类瞬时体系可包括但不限于多种组织来源的原生质体电穿孔或特定的目的组织的粒子轰击。本发明包括使用任何瞬时表达体系来评价与任何可转录的多核苷酸分子可操作地连接的启动子或启动子片段，所述可转录的多核苷酸分子包括但不限于经过选择的报告基因、标记基因或具有农业重要性的基因。预想在瞬时中通过合适的送递体系测试的植物组织的实例包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。
在瞬时测定中可使用任何可评价或筛选标记基因。本发明的启动子或启动子片段瞬时分析的优选标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670，在此引用作为参考)或GFP基因(美国专利5,491,084，在此引用作为参考)。将含有启动子或启动子片段的构建体送递至组织，所述启动子或启动子片段与标记基因可操作地连接，并依赖于标记通过合适的机制分析该组织。当与稳定植物中具有农业重要性的基因可操作地连接时，使用定量或定性分析作为工具来评价该启动子或启动子片段可能的表达谱。
因此，在一个优选实施方案中，将能够调节转录的SEQ ID NOs：7、8或9所示的本发明的多核苷酸分子或其片段、变体或衍生物与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，所述可转录的多核苷酸分子提供选择标记、筛选标记或评价标记。用于实施本发明的标记包括但不限于编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUC)、赋予抗生素抗性的蛋白质或赋予除草剂耐受的蛋白质的可转录的多核苷酸分子。有用的抗生素抗性标记为本领域所公知，包括编码赋予对卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的蛋白质的那些标记。已经证明了转基因植物耐受、并且可以应用本发明方法的除草剂，包括但不限于草甘膦、草铵膦、磺酰脲、咪唑啉酮类、溴苯腈、茅草枯(delapon)、cyclohezanedione、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制剂和isoxasflutole除草剂。编码参与除草剂耐受的蛋白质的多核苷酸分子为本领域所公知，且包括但不限于美国专利5627061、5633435和6040497中所述编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)的多核苷酸分子；以及美国专利5094945中关于草甘膦耐受所述的aroA；美国专利4810648中关于溴苯腈耐受所述的编码溴苯腈腈水解酶的多核苷酸分子(Bxn)；Misawa等人(1993)和Misawa等人(1994)关于达草灭耐受所述的编码八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸分子(crtI；Sathasiivan等人(1990)关于对磺酰脲除草剂耐受所述的编码乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacidsynthase)(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；以及DeBlock等人(1987)关于草铵膦和双丙氨酰膦耐受所述的bar基因。
在一个优选的实施方案中，将能够调节转录的SEQ ID NOs：7、8或9所示本发明的多核苷酸分子或其片段、变体或衍生物与可转录的多核苷酸分子可操作地连接，所述可转录的多核苷酸分子是具有农业重要性的基因。如此处所用的短语“具有农业重要性的基因”指可转录的多核苷酸分子，其包括但不限于提供与植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受有关的所需特征的基因。为了赋予农业重要的性状，需要表达具有农业重要性的基因。为农作物植物提供有利农业性状的具有农业重要性的基因可以是例如，包括但不限于遗传因子，包括除草剂抗性(美国专利5633435和5463175)、增加的产量(美国专利5716837)、昆虫控制(美国专利6063597、6063756、6093695、5942664和6110464)、真菌疾病抗性(美国专利5516671、5773696、6121436、6316407和6506962)、病毒抗性(美国专利5304730和6013864)、线虫抗性(美国专利6228992)、细菌疾病抗性(美国专利5516671)、淀粉生产(美国专利5750876和6476295)、修饰的油生产(美国专利6444876)、高油生产(美国专利5608149和6476295)、修饰的脂肪酸含量(美国专利6537750)、高蛋白生产(美国专利6380466)、水果成熟(美国专利5512466)、增强的动物和人类营养(5985605和6171640)、生物聚合物(美国专利5958745和美国公开申请号2003/0028917)、环境应激抗性(美国专利6072103)、药物肽(美国专利6080560)、改善的加工性状(美国专利6476295)、改善的可消化性(美国专利6531648)、低棉子糖(美国专利6166292)、工业酶生产(美国专利5543576)、改善的风味(美国专利6011199)、固氮作用(美国专利5229114)、杂种种子生产(美国专利5689041)以及生物燃料生产(美国专利5998700)，上面所列专利中描述的遗传因子和转基因在此引用作为参考。
另外，可转录的多核苷酸分子可以通过编码不可翻译的RNA分子而影响上述表型，所述不可翻译的RNA分子通过例如反义、RNAi或共抑制介导的机制引起内源性基因表达的靶向抑制。RNA也可以是经过工程改造的催化性RNA分子(即核酶)以切割所需内源性mRNA产物。因此，可以在本发明的实践中使用编码表达目的表型或形态学改变的蛋白质或mRNA的任何多核苷酸分子。
在一个实施方案中本发明的构建体可以是双Ti质粒边界DNA构建体，所述双Ti质粒边界DNA构建体具有从根癌土壤杆菌分离的包含T-DNA的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，所述Ti质粒与由土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞提供的转移分子一起，允许T-DNA向植物细胞基因组中的整合。该构建体也可以含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒主链DNA片段，例如，大肠杆菌(E.coli)的复制起点例如ori322、宽宿主范围的复制起点例如oriV或oriRi、以及选择标记编码区，例如Spec/Strp，其编码赋予壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酸转移酶(aadA)，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株常常为根癌土壤杆菌ABI、C58或LBA4404，然而，植物转化领域技术人员已知的其它菌株也可以在本发明中发挥功能。
转化的植物和植物细胞
如此处所用的术语“转化的”指已引入了外来多核苷酸分子例如构建体的细胞、组织、器官或生物。优选将引入的多核苷酸分子整合到受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA中，从而使引入的多核苷酸分子由后来的后代遗传。“转基因的”或“转化的”细胞或生物也包括细胞或生物的后代，以及在杂交中采用这样的转基因植物作为亲本、并表现出由于存在外来多核苷酸分子而产生的改变的表型的育种程序产生的后代。可以通过任何植物转化方法将含有本发明启动子的植物转化构建体引入植物。在本发明的实践中通过将植物表达构建体引入植物基因组而转化植物的方法和材料可以包含任何公知的和经过证明的方法，包括美国专利5384253中说明的电穿孔；美国专利5015580、5550318、5538880、6160208、6399861和6403865中说明的微粒轰击；美国专利5635055、5824877、5591616、5981840和6384301中说明的土壤杆菌介导的转化；以及美国专利5508184中说明的原生质体转化，所有这些专利都在此引用作为参考。
转化双子叶植物的特定方法为本领域技术人员所熟知。使用这些方法的转化和植物再生已经关于许多农作物进行了说明，所述农作物包括但不限于大豆(Glycine max)、芸苔属物种(Brassica sp.)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、花生(落花生(Arachus hypogaea))、向日葵(Helianthus annuus)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum L.)以及苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))。对本领域技术人员显而易见的是，为了产生来自任何数目的目的靶农作物的稳定转基因植物，可以使用并修饰许多转化方法。
在另一个实施方案中，本发明提供制备植物油的方法，其包括将本发明启动子整合到植物基因组中、栽培该植物以产生种子、并从种子中提取油和/或蛋白质的步骤，所述启动子与赋予改变的油和/或蛋白质含量的可转录的多核苷酸分子可操作地连接。
可对转化的植物分析目的基因的存在以及由本发明启动子赋予的表达水平和/或表达谱。本领域技术人员知道大量可利用的分析转化植物的方法。例如，植物分析的方法包括但不限于DNA印迹或RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价(fieldevaluations)和免疫诊断测定。
本发明的种子可以从可育的转基因植物收获，并且可以用于栽培本发明的转化植物的后代世代。将术语“种子”和“核”理解为含义相同。在本发明的上下文中，种子指由种皮、胚、糊粉和胚乳组成的成熟胚珠。
短语“细胞增殖”指如在快速生长的组织中进行细胞有丝分裂的细胞。
短语“微量营养物含量”指在种子中按照重量基础表示的微量营养物的量，所述微量营养物即维生素或类胡萝卜素。
短语“油含量”指以重量百分比或百万分率基础表示的油级分的浓度，其可以通过例如低分辨率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等人，1974)或Rubel，1994)或近红外透射(NIT)光谱学(Orman等人，1992；Patrick等人，1997)确定。
短语“蛋白质质量”指无论是游离的还是整合到蛋白质中的一种或多种必需氨基酸的水平，所述必需氨基酸即组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
包含下列实施例在内以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下面实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地发挥功能的技术。然而，根据本发明公开内容的指导，本领域技术人员应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中进行许多改变并仍然获得相似或类似结果，因此将所述或附图中所示所有内容解释为说明性的，并且没有限制性意义。
实施例1
该实施例描述了使用电子文库扣除方法从欧洲油菜(Brassicanapus)鉴定和分离表达序列标签(EST)。专有的欧洲油菜EST文库用作靶组织并且专有的鼠耳芥(Arabidopsis)和欧洲油菜cDNA文库用作背景组织。鉴定为可能仅在长角果组织中表达的EST通过杂交进一步表征。
EST文库构建
从自温室生长的欧洲油菜(栽培种Quantum)分离的多种组织构建靶组织EST文库。分离的组织包括：授粉后10、20、30、40和50天(DAP)的长角果壁、25-28DAP时的糊粉和种皮。将组织在液氮中瞬间冻结并在RNA提取前在-70℃中保存。通过在液氮中用研钵和研杵研磨约500mg植物组织来提取RNA。将研磨的组织与5ml REC.8+(Tris-HCl，pH9，0.8M NaCl，10mM EDTA，0.5％β-巯基乙醇，和0.5％十六烷基三甲基溴化铵)加0.1g交联聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)混合。将混合物用研钵和研杵匀浆并以5000g离心5分钟。水相用1.5ml苯酚∶氯仿(1∶1，v/v)提取一次并用1.5ml氯仿提取一次。用等体积的95％乙醇从含水层沉淀RNA并以10,000x g沉淀20分钟。将沉淀的RNA重悬浮在水中并加入1体积的8M LiCl。将混合物在-20℃温育1小时，然后以10,000x g离心20分钟。将沉淀的RNA用70％乙醇洗涤，风干，并溶解在用焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC水)中。使用SuperScript Plasmid System(Invitrogen CorporationCarlsbad，CA)，根据生产商的方案，将约25μg总RNA用于制备双链cDNA。
为上述六个文库的每一个产生EST序列。通过使用来自每个文库的EST序列作为对Monsanto专有的鼠耳芥和欧洲油菜cDNA文库和公共cDNA集合查询，鉴定了候选序列。是NIH遗传序列数据库，为所有可公开获得的DNA序列的注解的集合(NucleicAcids Research，32(1)：23-6(2004))。通过确定所有cDNA集合中的出现频率鉴定每个文库的最高表达的基因。完成额外的BLAST检索以鉴定对每个文库特异的克隆。
然后使用专有的文库扣除程序(Library Subtraction Program)进行第二次生物信息学筛选。上述六个文库均用作靶文库。所有可利用的Monsanto专有的、非长角果壁欧洲油菜cDNA文库用作背景文库。在任何靶文库中存在但是不在任何背景文库中存在的序列被鉴定为满足进行进一步研究的标准。进一步表征满足这些标准的200个最丰富的信息。由于与最初筛选重叠除去了15种序列。由于与反转录转座子具有显著同一性除去了额外的7种序列。然后将剩余的序列对来自叶、根、茎、花芽、开放的花和发育中的种子的鼠耳芥cDNA文库进行BLAST检索。考虑到与非长角果壁序列具有显著同一性，除去了这些序列的89种。从而从该筛选鉴定了剩余的89个EST克隆并通过杂交筛选进一步研究。
杂交筛选
将上面鉴定的EST序列用SalI和NotI消化以释放插入片段。片段在1X TBE中的0.8％琼脂糖凝胶上分离。为了促进转移，将凝胶暴露于短波紫外线2-3分钟。将DNA在0.5N NaOH；1.5M NaCl中变性并使用TurboBlotter系统(Schleicher & Schuell)转移到Nytran Plus(Schleicher & Schuell BioScience，Dassel，德国)。使用SMART cDNAPCR扩增试剂盒(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)根据生产商的说明书，将印迹与来自10、20、30、40和50DAP的长角果壁、糊粉/种皮、发育中的胚(15-18DAP)、花芽、开放的花、叶和根的放射性标记的cDNA杂交，其中向最终的PCR反应加入放射性标记的dCTP。由于与来自发育中的胚(15-18DAP)、花芽、开放的花、叶和/或根的cDNA杂交，除去了许多克隆。剩余的67个克隆用作针对从10、15、20、25、30、35、40、45和50DAP的长角果壁、糊粉/种皮、发育中的胚(15-18DAP)、花芽、开放的花、叶和根分离的SMARTTM cDNAs(BD Biosciences)衍生的RNA的探针。6个候选物主要与长角果壁和/或糊粉杂交。一个克隆与根来源的cDNA特异杂交。
克隆LIB4156-008-R1-K1-A4被表征为在根细胞中表达。克隆LIB4153-003-R1-K9-C1被表征为在长角果壁、糊粉/种皮和开放的花中表达。克隆LIB4156-012-R1-K1-D2被表征为在长角果壁、糊粉/种皮和根中表达。克隆LIB4153-011-R1-K1-E3被表征为在长角果壁、糊粉/种皮和开放的花中表达。克隆LIB4169-011-Q1-K1-G2被表征为在糊粉/种皮中表达。克隆LIB4169-008-Q1-K1-D8被表征为在长角果壁、糊粉/种皮和发育中的胚中表达。提交克隆LIB4153-003-R1-K9-C1、LIB4156-012-R1-K1-D2、LIB4153-011-R1-K1-E3和LIB4156-008-R1-K1-A4用于序列验证。除了克隆LIB4156-008-R1-K1-A4外都被验证为预期的序列。确定LIB4156-008-R1-K1-A4的正确的克隆命名为LIB4156-011-R1-K1-C3。
实施例2
该实施例描述了使用上面鉴定的EST序列从欧洲油菜分离启动子序列。
基因组Walker文库制备
收获欧洲油菜叶并在液氮中冷冻保存直到提取。用研钵和研杵将组织研磨为细粉，同时用液氮保持组织冷冻。向离心管中转移约0.4g研磨的组织。仅在使用前加入6毫升65℃ SDS提取缓冲液(1M Tris；0.25M EDTA；用HCl调节到pH 8.0；20％SDS；5M NaCl β-巯基乙醇(7.1∶10))。将混合物剧烈涡旋30-60秒。然后将样品在65℃温育45分钟，每15分钟倒置。加入2毫升冰温度的5M乙酸钾溶液，将样品温和倒置以混合，并在冰上温育20分钟。通过向每管中加入3ml氯仿并温和摇动10分钟，用氯仿提取样品。然后将样品以9,000RPM离心20分钟。上清液通过一层miracloth过滤并收集在清洁离心管中。通过如下方法沉淀DNA，加入2ml 100％异丙醇，并通过倒置管3-4次温和混合，然后以9,000RPM离心20分钟。倒出异丙醇，并将沉淀重悬浮在200μlRNA酶A溶液(1μl 100mg/ml来自Qiagen Inc.，Valencia，CA的原液，在1ml 50mM Tris-HCL；10mM EDTA中稀释)中。加入300μl体积的乙酸铵/100％异丙醇(1∶7)。将样品涡旋并以9,000RPM离心15分钟。倒出所得上清液，用500μl 80％乙醇洗涤沉淀。轻轻倒出乙醇并在桌面(bench top)允许沉淀风干。将沉淀重悬浮在约200μl TE缓冲液(10mM Tris-HCL pH8，1mM EDTA)中。所得DNA用于按照生产商推荐的方案(Clontech，Palo Alto，CA)制备基因组WalkerTM文库。
P-BN.RPC-0:1:1的分离
从上述基因组WalkerTM文库分离P-BN.RPC-0:1:1根优选的启动子序列[SEQ ID NO：1]。使用生产商的关于长度、解链温度(Tm)和序列组成的参数，从克隆LIB4156-011-R1-K1-C3的可利用的EST序列设计引物。使用基因组Walker文库作为模板和下面的引物进行第一轮PCR反应：
GSP1
5’-GCTACGGCGATGAGAAGAGAAATAAAATG-3’[SEQ ID NO：2]，和
AP1
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’[SEQ ID NO：3](由BD Biosciences提供)。
使用本领域公知的标准技术分离所得扩增产物。然后用第一轮扩增产物作为模板和下面的引物进行第二次PCR反应：
GSP2
5’-CCCACAGATTTTCTATTTCGGTTCTCATAC-3’[SEQ ID NO：4]，和
AP2
5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’[SEQ ID NO：5](由BD Biosciences提供)。
根据本领域公知的标准方法纯化PCR反应的产物并根据生产商的指导克隆到pCR2.1Topo(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)中。所得质粒命名为2d11-2。使用PE Applied Biosystems，(Foster City，CA)给出的标准测序方法测定该克隆的序列。为了促进进一步克隆，按照酶生产商(PE Applied Biosystems)推荐的PCR方案，在启动子片段的3’末端加入NcoI位点。简言之，约10纳克质粒2d11-2用作模板并使用各30纳摩尔下面的引物进行扩增：
D11 nco(#18337)
5’-GAGAAACCATGGTGAATAAATGG-3’[SEQ ID NO：6]，和
AP1[SEQ ID NO：3，上述]。
此外，反应中在1X Opti-PrimeTM Buffer 3(Stratagene)中使用各10微摩尔dATP、dCTP、dGTP和TTP和2.5单位AmpliTaq Gold。在95℃最初温育10分钟后，进行25个PCR循环，每个循环定义为92℃30秒，56℃30秒和72℃2分钟，接着是1个循环的72℃7分钟。根据本领域公知的标准方法纯化PCR反应产物并根据生产商的说明书将其克隆到pCR2.1Topo(Invitrogen)中。所得质粒命名为pMON69833。使用如PE Applied Biosystems给出的标准测序方法确定该克隆的序列。
P-BN.SW1-0:1:2、P-BN.SW2-0:1:2和P-BN.SW3-0:1:2的分离
使用与上述关于P-BN.RPC-0:1:1相似的方法与生产商的说明书，从基因组WalkerTM文库分离长角果壁优选的启动子序列P-BN.SW1-0:1:2、P-BN.SW2-0:1:2和P-BN.SW3-0:1:2。对于第一轮PCR反应，使用生产商关于长度、Tm和序列组成的参数，从各自的EST序列为每种靶序列设计引物。
下表显示了用于所列启动子序列的分离中的第一轮PCR反应的用作模板DNA的EST克隆和引物。
  启动子   EST克隆ID   引物1   引物2
  P-BN.SW1-0:1:2   LIB4153-003-R1-K9-C1   #17637   #17636
  P-BN.SW2-0:1:2   LIB4156-012-R1-K1-D2   #17669   #17668
  P-BN.SW3-0:1:2   LIB4153-011-R1-K1-E3   #18210   #18209
引物序列
#176375’-TTCATATCTGCGTAAGTACGTCCATGTTC-3’[SEQ ID NO：10]
#176365’-CGAGAAACAGAATGATGAAACTAGAGAGAC-3’[SEQ ID NO：11]
#176695’-CACCATGCTTTCACGTCTTTTGAGTTG-3’[SEQ ID NO：12]
#176685’-TCGATGCCACGAAAATGCATAAGAAC-3’[SEQ ID NO：13]
#182105’-CCTCATCCTCATCCTCATCCTCAACC-3’[SEQ ID NO：14]
#182095’-CCGTACACGGTAAAATAGTTCTTGACGGA-3’[SEQ ID NO：15]
类似于上面关于P-BN.RPC-0:1:1描述的，使用来自各自反应的第一轮扩增产物作为模板，和下面的引物进行第二次扩增：
P-BN.SW1-0:1:1 GSP2[SEQ ID NO：4]和
               AP2[SEQ ID NO：5](由生产商提供)，
P-BN.SW2-0:1:1GSP1[SEQ ID NO：2]和
               AP2[SEQ ID NO：5]，
P-BN.SW3-0:1:1GSP2[SEQ ID NO：4]和
               AP2[SEQ ID NO：5].
根据本领域公知的标准方法纯化各自PCR反应的产物并根据生产商的说明书将其克隆到pCR2.1 Topo(Invitrogen)中。所得质粒分别对启动子P-BN.SW1-0:1:2、P-BN.SW2-0:1:2和P-BN.SW3-0:1:2命名为3d2-2、3d3-46和4G5-1。使用PE Applied Biosystems，(FosterCity，CA)给出的标准测序方法测定这些克隆的序列。
类似于上面关于P-BN.RPC-0:1:1描述的方法，在每个启动子片段的3’末端加入NcoI位点以促进克隆。如上所述，PCR反应的反应条件按照酶生产商(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)推荐的方案。用于特定反应的引物如下：
质粒DNA 3d2-2(P-BN.SW1-0:1:2)
#18115 5’-CTAAAGCCATGGTCTTAGAAAAGTTG-3’[SEQ ID NO：16]，和#181675’-AATACGACTCACTATAGGGCACGC-3’[SEQ ID NO：17]；
质粒DNA 3d3-46(P-BN.SW2-0:1:2)
#182065’-GAAAAGCCATGGTAAGGCCAATATT-3’[SEQ ID NO：18]，和AP1[SEQ ID NO：3]
质粒DNA 4G5-1(P-BN.SW3-0:1:2)
#18340 5’-CTTCTGCCATGGAAAGAAAAAGTTG-3’[SEQ ID NO：19]，和AP1[SEQ ID NO：3]。
根据本领域公知的标准方法纯化PCR反应的产物并根据生产商的说明书将其克隆到pCR2.1 Topo(Invitrogen)中。所得质粒命名为pMON69828、pMON69829和pMONM69830，分别含有P-BN.SW1-0:1:2、P-BN.SW2-0:1:2和P-BN.SW3-0:1:2的核酸序列。使用如PEApplied Biosystems给出的标准测序方法测定这些克隆的序列。
实施例3
该实施例描述了含有上述启动子序列的植物转化载体的构建。将启动子序列连接到标记基因大肠杆菌uidA，得到设计用来阐明鼠耳芥和低芥酸芥子(Canola)中的表达的构建体。
PMON69832(P-BN.RPC-0:1:1::GUS)
通过用SmaI和Nco I消化从pMON69833取出含有P-BN.RPC-0:1:1[SEQ ID NO：1]的1661bp片段。将片段连接到质粒pMON65425中，其也已经用SmaI和Nco I消化。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-BN.RPC-0:1:1和油菜籽蛋白(napin)3’UTR，将该质粒命名为pMON69832。使用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。
PMON69827(P-BN.SW1-0:1:2::GUS)
通过用SmaI和Nco I消化从pMON69828取出含有P-BN.SW1-0:1:2[SEQ ID NO：7]的1297bp片段。将该片段连接到质粒pMON65425中，其也已经用SmaI和NcoI消化。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-BN.SW1-0:1:2并且具有油菜籽蛋白3’UTR，将该质粒命名为pMON69827。使用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。
PMON69825(P-BN.SW2-0:1:2::GUS)
通过用SmaI和Nco I消化从pMON69829取出含有P-BN.SW2-0:1:2[SEQ ID NO：8]的854bp片段。将该片段连接到pMON65425中，其也已经用SmaI和NcoI消化。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-BN.SW2-0:1:2并且具有油菜籽蛋白3’UTR，将该质粒命名为pMON69825。使用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。
PMON69831(P-BN.SW3-0:1:2::GUS)
通过用SmaI和Nco I消化从pMON69830取出含有P-BN.SW3-0:1:2(SEQ ID NO：9)的888bp片段。将该片段连接到pMON65425中，其也已经用SmaI和NcoI消化。所得质粒含有驱动大肠杆菌uidA基因的P-BN.SW3-0:1:2并且具有油菜籽蛋白3’UTR，将该质粒命名为pMON69831。使用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。
实施例4
该实施例给出了用上述载体转化鼠耳芥植物的方法。通过将种子播种在含有反渗透水(ROW)饱和的MetroMix 200(The ScottsCompany，Columbus，OH)的4英寸罐中，栽培鼠耳芥植物。通过将罐于4-7℃放置在栽培室加盖的浅箱(flat)内4-7天，8小时光照/天，将植物春化。将浅箱转移到22℃、55％相对湿度、和16小时光照/天、160-200μEinstein/s/m2的平均强度下的栽培室中。将盖子抬起并在萌发后滑回1英寸，并且到形成真叶时移走盖子。根据需要，用ROW对植物从底部浇水直到萌发后2-3周。然后根据需要用Plantex15-15-18溶液(Plantex Corporation Ottawa，加拿大)以50ppm N2对植物从底部浇水。萌发后2-3周将罐间苗(thinned)从而每罐保留1株植物。一旦植物开始形成花柄(bolt)，就修剪初级花序以促进腋生花柄(axillary bolt)的生长。
如Bent等人(1994)或Bechtold等人(1993)描述的得到转基因鼠耳芥植物。含有转化载体pMON69832、pMON69827、pMON69825或pMON69831之一的根癌土壤杆菌菌株ABI的培养物在LB(10％细菌用胰蛋白胨，5％酵母提取物，和10％NaCl，含有卡那霉素(75mg/L)，氯霉素(25mg/L)，和壮观霉素(100mg/L))中过夜生长。将细菌培养物离心并重悬浮在5％蔗糖+0.05％Silwet-77溶液中。将完整鼠耳芥植物(约5-7周龄)的空气中部分浸入所得溶液中2-3秒。通过将植物在纸巾上吸干以除去过量溶液。将浸过的植物侧放在有盖的浅箱中并转移到19℃下的栽培室中。16到24小时后，除去圆顶并将植物竖立。当植物达到成熟后，种子收获前停止供水2-7天。收获的种子穿过不锈钢网筛(40孔/英寸)以除去碎片。然后将收获的种子在室温下保存在纸硬币信封(paper coin envelope)中直到分析。
使用气相灭菌方案将来自转基因鼠耳芥植物的种子进行表面灭菌。简言之，将种子的开放容器放置在带有烧杯的干燥器中，该烧杯装有100ml家用漂白剂(bleach)。临封闭干燥器前，向漂白剂溶液中加入3ml浓盐酸以产生氯气。封闭干燥器并应用真空以允许通过氯气灭菌。将种子温育几小时。在补加了50mg/L草甘膦的鼠耳芥萌发培养基[MS盐(1X)；蔗糖(1％)；肌醇(100mg/L)；硫胺素-HCl(1mg/L)；盐酸吡哆醇(500mg/L)；烟酸(500mg/L)；MES pH 5.7(0.05％)和植物琼脂(Phytagar)(0.7％)]上播撒灭菌的种子。将最高达16棵草甘膦抗性幼苗移植到含有MetroMix 200的21/4-英寸罐中，间苗到每个罐1棵幼苗，然后在上述条件下生长直到形成的最初的长角果开始干化。从每个T1植物取出组织(莲座叶、茎生叶、茎、花、花芽和发育中的长角果)用于随后的组织化学染色。
用Moloney和Radke在美国专利5,720,871中描述的方案转化低芥酸芥子植物。简言之，将欧洲油菜cv Ebony的种子栽培在含有Metro Mix 350(The Scotts Company，Columbus，OH)的2英寸罐中。植物在24℃栽培在栽培室中，光周期为16/8小时，光强度为400μEm-2sec-1(HID灯)。2-1/2周后，将植物移植到6英寸罐中并在栽培室中15/10℃昼/夜温度、16/8小时光周期、800μEm-2sec-1(HID灯)光强度下栽培。恰在形成花柄前或者形成花柄过程中但是在开花前从植物取出四个末端结间部，用70％v/v乙醇1分钟，2％w/v次氯酸钠20分钟表面灭菌并用无菌去离子水冲洗3次。将6到7个茎段切成5mm圆片，保持基部末端的方向。含有转化载体pMON69832、pMON69827、pMON69825或pMON69831之一的根癌土壤杆菌菌株ABI的培养物在旋转振荡器上24℃下在2ml含有50mg/l卡那霉素，24mg/l氯霉素和100mg/l壮观霉素的Luria Broth，LB，(10％细菌用胰蛋白胨，5％酵母提取物，和10％NaCl)中过夜生长。在MS培养基(Murashige和Skoog，1962)中进行1∶10稀释，从而得到约9×108个细胞/ml。将茎圆片(外植体)接种1.0ml土壤杆菌并且从外植体吸出过量的农杆菌。将外植体基底侧向下放在含有培养基的培养皿中，该培养基含有1/10MS盐、B5维生素(1％肌醇；0.1％硫胺素HCl；0.01％烟酸；0.01％盐酸吡哆醇)，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.7，1.0mg/l 6-苄基腺嘌呤(BA)。将平板用1.5ml含有MS盐，B5维生素，3％蔗糖，pH5.7，4.0mg/l对氯苯氧基乙酸，0.005mg/l激动素的培养基分层并用无菌滤纸覆盖。2-3天共培养后，将外植体转移到含有MS盐，B5维生素，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.7，1mg/l BA，500mg/l羧苄青霉素，50mg/1头孢噻肟，和25mg/l的草甘膦的深盘培养皿板中用于选择。在每个平板上放7个外植体。3周后，将它们转移到新鲜培养基，每个平板5个外植体。在栽培室中25℃连续光照下培养外植体。
在栽培室中22℃、16-8小时光照黑暗周期和220μEm-2s-1的光强度下栽培转化的植物几周后转移到温室。然后在温室条件下栽培植物直到成熟。收集所得成熟R1种子用于分析。在温室中标准条件下保持植物。在授粉后各个阶段收获发育中的种子并在-70℃下保存。收集成熟的种子并在由约17℃和30％湿度组成的受控条件下保存。
实施例5
该实施例描述了使用组织化学染色，对用pMON69832、pMON69827、pMON69825或pMON69831转化的鼠耳芥植物中β-葡糖醛酸糖苷酶的表达进行的分析。该分析的结果提供了对不同启动子的表达的表征。
将从转化的鼠耳芥植物新收获的组织在含有50mM NaPO4(pH7.2)；100μM铁氰化钾；100μM亚铁氰化钾，0.03％Triton X-100；20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖醛酸(X-gluc)的溶液中于37℃下温育约24小时。在一些情况中，从染色溶液省略铁氰化钾、亚铁氰化钾和甲醇。通过在70％乙醇/30％H2O在37℃下过夜温育清除染色的组织的叶绿素。将染色的组织立即照相或者转移到70％乙醇/30％甘油(v/v)的溶液中并在4℃下保存直到照相。然后将样品对于染上蓝色打正分(+)或者负分(-)。
为了检测低芥酸芥子中的表达，在授粉后7个时间点从单个R0植物收集最多5个长角果。用18号针对长角果刻划以允许染色溶液接触发育中的种子。将长角果在含有50mM NaPO4(pH 7.2)；100μM铁氰化钾；100μM亚铁氰化钾，0.03％Triton X-100；20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖醛酸(X-gluc)的溶液中37℃下温育约24小时。通过在70％乙醇/30％H2O中在37℃下过夜温育清除染色的组织的叶绿素。将染色的组织立即照相或者转移到70％乙醇/30％甘油(v/v)的溶液中并在4℃下保存直到照相。然后将样品对蓝色打正分(+)或者负分(-)。
对于P-BN.RPC-0:1:1，pMON69832中含有的根优选的启动子，所筛选的10株植物中没有一株在长角果壁中有可检测水平的活性(数据未显示)。对于pMON69827，筛选的10株植物中的3株在长角果壁中具有来自至少一个时间点的可检测水平的活性。对于pMON69825，筛选的10株植物中的6株在长角果壁中具有来自至少一个时间点的可检测水平的活性。对于pMON69831，筛选的10株植物中的5株在长角果壁中具有来自至少一个时间点的可检测水平的活性。在用pMON69831转化的植物的种皮或者糊粉中没有检测到活性。在表1-3中给出了各转化体的时间过程数据。
表1.发育中的低芥酸芥子长角果中的P-BN.SW1-0:1:2表达
授粉后天数
  构建体   事件   3   6   9   12   15   20   25   30   35   40
  pMON69827   BN_G1427   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1428   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1429   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1430   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1480   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1481   -   ND   -   ND   +   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1482   -   -   -   +   -   +   -   -   -   +
  pMON69827   BN_G1507   +   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  pMON69827   BN_G1539   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69827   BN_G1540   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  对照   SP30052   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表2.发育中的低芥酸芥子长角果中的P-BN.SW2-0:1:2表达
授粉后天数
  构建体   事件   3   6   9   12   15   20   25   30   35   40
  pMON69825   BN_G1474   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69825   BN_G1475   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69825   BN_G1476   +   +   +   +   NA   +   +   +   +   +
  pMON69825   BN_G1477   +   +   +   NA   +   +   -   -   -
  pMON69825   BN_G1478   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  pMON69825   BN_G1479   -   ND   +   +   -   -   -   -   -   -
  pMON69825   BN_G1536   -   -   -   -   -   -   -   -   -   +
  pMON69825   BN_G1537   -   -   -   -   +   +   +   -   -   -
  pMON69825   BN_G1538   +   -   -   -   +   +   -   -   -   -
  pMON69825   BN_G1580   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  对照   SP30052   -   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表3.发育中的低芥酸芥子长角果中的P-BN.SW3-0:1:2表达
授粉后天数
构建体       事件        3    6    9    12    15    20   25   30   35   40
pMON69831    BN_G1839    +    +    +    +     +     -    +    +    +    +
pMON69831    BN_G1901    -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
pMON69831    BN_G1902    -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
pMON69831    BN_G1903    -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
pMON69831    BN_G1904    -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
pMON69831    BN_G1905    -    -    -    +     +     +    -    -    -    -
pMON69831    BN_G1906    -    -    +    +     +     +    +    +    +    +
pMON69831    BN_G1907    -    -    -    -     +     +    +    -    -    -
pMON69831    BN_G1908    -    -    -    -     +     -    +    -    -    -
pMON69831    BN_G1951    -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
对照         SP30052     -    -    -    -     -     -    -    -    -    -
表1-3中的数据表明三种启动子P-BN.SW1-0:1:2(SEQ ID NO：7)、P-BN.SW2-0:1:2(SEQ ID NO：8)和P-BN.SW3-0:1:2(SEQ ID NO：9)能够驱动鼠耳芥和低芥酸芥子中长角果壁表达。
实施例6
该实施例描述了含有可操作地连接鼠耳芥异柠檬酸裂合酶基因的P-BN.SW3-0:1:2启动子的植物转化载体的构建。为了促进克隆，使用pMON69830作为模板用下面的引物扩增P-BN.SW3-0:1:2启动子：
19944
5’-CCCGGGCTGGTCCTGCGAAGATTCTCAG-3’[SEQ ID NO：20]，和
19945
5’-
CTCGAGCGGCCGCTTCTATGTCGACTGGAAAGAAAAAGTTGTGCCAACAA
AAG-3’[SEQ ID NO：21]。
在Expand High Fidelity酶生产商(Roche Applied Biosciences，Indianapolis，IN)推荐的条件下进行反应。根据本领域公知的标准方法纯化PCR反应的产物并根据生产商的说明书将其克隆到pCR2.1Topo(Invitrogen)中。所得质粒命名为pMON79578。
通过用SmaI和NotI消化从载体pMON79578取出含有P-Bn.SW3-0:1:2[SEQ ID NO：9]的910个碱基对的片段。将片段克隆到pMON82374中，其已经用PmeI和NotI消化，以代替pBr.Snap2启动子。载体pMON82374含有胭脂氨酸T-DNA右边界序列和章鱼氨酸T-DNA左边界序列，在两个T-DNA边界之间含有2个表达盒。第一个盒含有pBr.Snap2启动子和T-Br.Snap2-1终止子。第二个盒在两个T-DNA边界之间含有来自玄参花叶病毒(FMV)的35S启动子，其驱动嵌合EPSP合酶基因的表达，该嵌合EPSP合酶基因含有来自鼠耳芥EPSP合酶基因(GenBank标识号gi：16272)的叶绿体靶定序列，该序列连接到合成的EPSP合酶编码区(美国专利5,633,435)和来自豌豆rbcS E9基因的3’非翻译区。此外，pMON82374含有cre重组酶的识别位点。重组酶位点为FMV启动子的5’和E93’UTR的3’。所得质粒命名为pMON79581。
通过用SalI和NotI限制酶消化从EST克隆pMON82360取出含有L-At.ICL、CR-At.ICL和T-At.ICL的2111片段，并将其克隆在SalI和NotI消化的pMON79581中的pBr.Snap2启动子和T-Br.Snap2-13’UTR之间。所得质粒命名为pMON79583。用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。pMON79583用于转化欧洲油菜。
通过用SmaI和SalI消化从载体pMON79578取出含有P-Bn.SW3-0:1:2启动子序列[SEQ ID NO：9]的891-碱基对片段[SEQID NO：22]。将该片段克隆到已用PacI和SalI消化的DMRUEZ03.0112中。SalI消化和凝胶纯化前，根据生产商(Stratagene)的说明书用Pfu聚合酶将PacI突出端平端化。所得质粒含有胭脂氨酸T-DNA右边界序列和章鱼氨酸T-DNA左边界序列，它们之间为启动子、5’UTR和来自鼠耳芥act7基因的第一个内含子，其驱动CP4EPSP合酶基因的表达。该CP4 EPSP合酶基因包含连接到合成的EPSP合酶编码区和来自豌豆rbsc E9基因的3’UTR的CTP；可操作地连接到鼠耳芥异柠檬酸裂合酶基因(如PCT申请WO 03/79766中描述)的P-Bn.SW3-0:1:2启动子和油菜籽蛋白3’UTR。用公知的方法测定核酸序列并证实克隆连接的完整性。所得质粒命名为pMON82378并用于大豆的转化。
实施例7
该实施例给出了用实施例5中描述的构建体对大豆植物的转化。
使用如Martinell(美国专利6,384,301)描述的土壤杆菌介导的转化方法转化大豆植物。对于该方法，用本领域已知的标准方法，将含有包括目的基因的质粒如pMON75201的根癌土壤杆菌的过夜培养物生长到对数期，然后稀释到0.3到0.6的最终光密度。这些培养物用于接种如下所述制备的大豆胚外植体。简言之，该方法是向切除的大豆胚的分生组织中个体大豆细胞的直接种系转化。表面灭菌和种子萌发后取出大豆胚。然后将外植体铺平板在OR培养基上，其是如Barwale等人(1986)修饰的标准MS培养基，加上3mg/L BAP，200mg/L羧苄青霉素，62.5mg/L头孢噻肟，和60mg/L苯菌灵，并在黑暗中15℃过夜保存。第二天用解剖刀片将外植体划伤并接种如上所述制备的土壤杆菌培养物。然后在室温培养接种的外植体3天。转化后培养后，将分生组织区在标准植物组织培养基上在除草剂草甘膦(Monsanto Company，St.Louis，MO)存在下培养，草甘膦作为选择剂和枝条诱导激素。培养基组成和培养时间长度在前述Martinell专利中详述。5到6周后，将具有阳性表型的存活外植体转移到土壤中并在温室条件下生长直到成熟。
收获被转化的植物的成熟种子并用标准方法，如Williams和Norris(1987)中描述的近红外反射(NIR)光谱法分析油含量。来自表达受P-Bn.SW3-0:1:2启动子驱动的鼠耳芥异柠檬酸裂合酶基因的植物的种子与来自未转化的植物的种子相比具有更高的油含量。
参考文献
下面列出的参考文献引入本文作为参考，其程度为它们补充、解释、提供背景，或者教导方法、技术和/或本文中使用的组合物的程度。
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Figure IYZ000001900142200111

Claims (18)

1.启动子，其由SEQ ID NO：9的核酸序列所示的多核苷酸序列组成。
2.构建体，其包含可操作地连接到异源的可转录的多核苷酸分子的权利要求1的启动子。
3.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子可操作地连接到3’转录终止多核苷酸分子。
4.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是具有农学重要性的基因。
5.权利要求2的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是标记基因。
6.用权利要求2的构建体稳定转化的转基因植物细胞。
7.权利要求6的转基因植物细胞，其中该转基因植物是双子叶植物。
8.权利要求7的转基因植物细胞，其中所述双子叶植物选自烟草、番茄、马铃薯、大豆、棉花、低芥酸芥子、向日葵和苜蓿。
9.权利要求6的转基因植物细胞，其中所述可转录的多核苷酸分子赋予所述转基因植物种子中改变的细胞增殖。
10.权利要求6的转基因植物细胞，其中所述可转录的多核苷酸分子赋予所述转基因植物种子中改变的油含量。
11.权利要求6的转基因植物细胞，其中所述可转录的多核苷酸分子赋予所述转基因植物种子中改变的蛋白质质量。
12.权利要求6的转基因植物细胞，其中所述可转录的多核苷酸分子赋予所述转基因植物改变的微量营养物含量。
13.被转化的植物细胞，其具有稳定整合到它的基因组中的权利要求2的构建体。
14.制备植物油的方法，其包括步骤：
a)得到用权利要求2的构建体稳定转化的转基因植物的种子；和
b)从种子提取油。
15.制备植物蛋白质的方法，其包括步骤：
a)得到用权利要求2的构建体稳定转化的转基因植物的种子；和
c)从种子提取蛋白质。
16.指导可转录的多核苷酸序列在植物细胞中表达的方法，其包括将权利要求1的启动子可操作地连接到所述多核苷酸序列并用可操作地连接到该多核苷酸序列的启动子转化植物细胞。
17.权利要求16的方法，其包括从植物细胞再生植物。
18.制备食物或者饲料的方法，其包括
a)得到用权利要求2的构建体稳定转化的转基因植物；并
b)从所述植物或者其部分制备食物或者饲料。
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