CN114174521A - 新型基因间序列区及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含用于植物中的新型合成基因间序列区的重组DNA分子，所述新型合成基因间序列区在插入第一转基因盒与第二转基因盒之间时减少第一转基因表达盒对第二转基因盒的相互作用。本发明还提供了包含新型合成基因间序列区的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子。本发明还提供了使用新型合成基因间序列区减少转基因表达盒之间相互作用的方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求2019年7月18日提交的美国临时申请序列号62/875,752的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
于2020年6月9日创建包含计算机可读形式的序列表的名为“MONS472WO_ST25.txt”的文件。该文件是38,698字节(在
中测量)，通过电子提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)同时提交，并通过引用将其全文并入本申请。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程领域。更具体地，本发明涉及可用于降低一个转基因盒对另一个转基因盒在植物中表达的影响的DNA分子。
背景技术
基因间序列区(“ISR”)是这样的DNA序列，当将其置于两个或多个转基因盒之间时，减少一个转基因盒与另一个转基因盒的相互作用，防止由于盒之间的表达元件相互作用而改变转基因盒的表达模式。
表达盒中的表达元件如启动子、内含子和3′非翻译区(3′UTR)含有具有影响相邻或邻近表达盒表达的潜力的顺式作用元件。例如，植物病毒启动子如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35S)的启动子由增强子结构域组成，所述增强子结构域可以影响附近基因的转录，激活插入位点上游或下游高达4.3Kb的基因(Gudynaite-Savitch等人(2009)Strategies to mitigate transgene-promoter interactions.Plant BiotechnologyJournal,7:472-485；Benfey等人(1990)Tissue-specific expression from CaMV 35Senh ancer subdomains in early stages of plant development.The EMBO Journ al,9:1677-1684)。例如，在一种情况下，将转基因盒亚克隆到使用CaM V 35S启动子驱动选择标记编码序列的包含选择盒的植物转化载体中受CaMV 35S启动子的存在的影响，其将转基因盒的组织特异性表达改变为更具组成性的模式(Yoo等人(2005)The 35S promoter usedin a select able marker gene of a plant transformation vector affects theexpression of the transgene.Planta,221:523-530)。
在植物生物技术领域中，包含多个转基因盒的载体越来越多地被用于转化植物以在单个载体堆叠中引入若干农艺学上重要的特征。该过程的优点是几个农艺学性状可以包含在单个遗传基因座中，当用包含额外农艺学特征的另一种转基因植物培育载体堆叠的植物时，允许更有效且成本更低的培育过程。然而，当更多的表达盒被克隆到载体中时，来自一个表达盒的表达元件有可能改变或影响载体堆叠中另一个表达盒的表达谱。设计用于提供组织表达的特定模式(例如在种子中的表达)的表达盒可由于载体堆叠中相邻表达盒的表达元件之间的相互作用而改变表达，从而将种子特异性表达模式改变为更类似于相邻表达盒的表达模式。这可能负面影响种子特异性表达盒的预期表型。因此，在植物生物技术中需要能减少或防止载体堆叠中相邻和邻近表达盒相互作用的DNA序列。
因此，本发明人在此公开了使转基因植物中载体堆叠中表达盒的相互作用最小化的新型合成ISR。这些ISR可置于单个载体堆叠中的相邻表达盒之间，以防止各个盒的表达元件之间的相互作用，从而保持载体堆叠内每个表达盒的预期表达模式和表达水平。
发明内容
本发明提供了用于植物中的新型合成基因间序列区或ISR。本发明还提供了包含ISR的重组DNA构建体。本发明还提供了包含ISR的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，将ISR插入载体堆叠中的表达盒之间。本发明还提供了使用ISR以及制备和使用包含ISR的重组DNA构建体的方法，以及包含ISR的转基因植物细胞、植物和种子。
因此，一方面，本发明提供了包含选自由以下组成的群组的DNA序列的重组DNA分子：(a)与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；和(b)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列。在特定实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。
在另一方面，本文提供了包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的群组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；和(b)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。
在又另一方面，本文还提供了包含重组DNA分子的转基因植物或其部分，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的群组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；和(b)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列。在具体实施方案中，转基因植物是包含重组DNA分子的任何世代的子代植物。本文还提供包含在生长时产生这类转基因植物的重组DNA分子的转基因种子。
在另一方面，本发明提供产生商品产品的方法，其包括获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分并且从其中产生所述商品产品。在一个实施方案中，商品产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
在又另一方面，本发明提供了降低用载体堆叠转化的转基因植物中第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用的方法，所述方法包括用包含重组DNA分子的载体堆叠转化植物细胞，所述重组DNA分子包含：(a)第一转基因盒；(b)第二转基因盒：(c)DNA分子，其包含选自由以下组成的群组的序列：(i)与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；和(ii)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列；其中将所述DNA分子插入第一转基因表达盒和第二转基因表达盒之间；和(d)从转化的植物细胞再生转基因植物。在某些实施方案中，载体堆叠由两个以上的表达盒组成。在其他实施方案中，将SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA分子插入载体堆叠内的每个表达盒之间。
序列简要说明
SEQ ID NO:1是基因间序列区ISR4_Stop的DNA序列，其包含ISR4(SEQ ID NO:4)和5'和3'末端的三个终止密码子。
SEQ ID NO:2是基因间序列区ISR89的DNA序列。
SEQ ID NO:3是基因间序列区ISR2的DNA序列。
SEQ ID NO:4是基因间序列区ISR4的DNA序列。
SEQ ID NO:5是基因间序列区ISR97的DNA序列。
SEQ ID NO:6是基因间序列区ISR69的DNA序列。
SEQ ID NO:7是基因间序列区ISR88的DNA序列。
SEQ ID NO:8是基因间序列区ISR86的DNA序列。
SEQ ID NO:9是基因间序列区ISR_X的DNA序列。
SEQ ID NO:10是增强子E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“E-CaMV.35S”。
SEQ ID NO:11是启动子P-Os.Act1:67的DNA序列，在图1a-c中表示为“P-Os.Act1”。
SEQ ID NO:12是前导序列或5'UTR L-Ta.Lhcb1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“L-Ta.Lhcb1”。
SEQ ID NO:13是内含子I-Os.Act1-1:1:19的DNA序列，在图1a-c中表示为“I-Os.Act1”。
SEQ ID NO:14是编码新霉素磷酸转移酶CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3的DNA序列，在图1a-c中表示为“nptII-1”。
SEQ ID NO:15是3′UTR T-Ta.Hsp17-1:1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“T-Ta.Hsp17”。
SEQ ID NO:16是启动子P-Zm.39486-1:1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“P-Zm.39486”。
SEQ ID NO:17是前导序列或5'UTR L-Zm.39486-1:1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“L-Zm.39486”。
SEQ ID NO:18是内含子I-Zm.DnaK:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“I-Zm.DnaK”。
SEQ ID NO:19是优化用于β-葡糖醛酸苷酶的植物表达的合成编码序列(GUS-1:GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)的DNA序列，其具有源自马铃薯光诱导组织特异性ST-LS1基因(基因库登录号：X04753)的可加工内含子，在图1a-c中表示为“GUS-1”。
SEQ ID NO:20是3'UTR T-Os.Mth-1:1:1的DNA序列，在图1a-c中表示为“T-Os.Mth”。
SEQ ID NO:21是启动子P-FMV.35S-enh-1:1:2的DNA序列，在图2a-c中表示为“P-FMV.35S”。
SEQ ID NO:22是前导序列或5'UTR L-Ph.DnaK-1:1:3的DNA序列，在图2a-c中表示为“L-Ph.DnaK”。
SEQ ID NO:23是编码新霉素磷酸转移酶CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2的DNA序列，在图2a-c中表示为“nptII-2”。
SEQ ID NO:24是3'UTR T-Mt.AC139600v16:1的DNA序列，在图2a-c中表示为“T-AC139600”。
SEQ ID NO:25是启动子P-Gm.Sphas1:14的DNA序列，在图2a-c中表示为“P-Gm.Sphas”。
SEQ ID NO:26是前导序列或5'UTR L-Gm.Sphas1-1:1:1的DNA序列，在图2a-c中表示为“L-Gm.Sphas”。
SEQ ID NO:27是β-葡糖醛酸苷酶的合成编码序列(GUS-2:GOI-GUS:1:2)的DNA序列，其具有源自马铃薯光诱导组织特异性ST-LS1基因(基因库登录号：X04753)的可加工内含子，在图2a-c中表示为“GUS-2”。
SEQ ID NO:28是3'UTR T-Mt.AC145767v28:3的DNA序列，在图2a-c中表示为“T-AC145767”。
附图说明
图1a-c是用于测定合成基因间序列区(“ISR”)在降低单个载体堆叠中的两个转基因表达盒对稳定转化的玉米植物中彼此表达的相互作用中的有效性的载体堆叠的图示。附图中的参考数字表示序列简述中给出的每个遗传元件的相应序列标识符。图1a显示了对照载体堆叠(没有增强子的对照)的转基因表达盒构型。无增强子的对照由两个以不同方向克隆的转基因表达盒组成。第一转基因盒包含启动子P-Os.Act1:67(SEQ ID NO:11)，5'可操作连接到前导序列L-Ta.Lhcb1:1(SEQ ID NO:12)，5'可操作连接到内含子I-Os.Act1-1:1:19(SEQ ID NO:13)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(SEQ ID NO:14)，5'可操作连接到3'UTR T-Ta.Hsp17-1:1:1(SEQ ID NO:15)。以相对于第一转基因盒不同的方向克隆的第二转基因盒包含种子特异性启动子P-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:16)，5'可操作连接到前导序列L-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:17)，5'可操作连接到内含子I-Zm.DnaK:1(SEQ ID NO:18)，5'可操作连接到编码GUS-1,GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1的编码序列(SEQ ID NO:19)，5'可操作连接到3'UTR,T-Os.Mth-1:1:1(SEQID NO:20)。图1b显示了对照载体堆叠(具有增强子的对照)的转基因表达盒构型。具有增强子的对照包含强增强子E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1(SEQ ID NO:10)，5'可操作连接到启动子P-Os.Act1:67(SEQ ID NO:11)，其包含源自花椰菜花叶病毒35S启动子的特异性增强子区的串联重复序列，5'可操作连接到前导序列L-Ta.Lhcb1:1(SEQ ID NO:12)，5'可操作连接到内含子I-Os.Act1-1:1:19(SEQ ID NO:13)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶的编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(SEQ ID NO:14)，5'可操作连接到3'UTR,T-Ta.Hsp17-1:1:1(SEQ ID NO:15)。以相对于第一转基因盒不同的方向克隆的第二转基因盒包含种子特异性启动子P-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:16)，5'可操作连接到前导序列L-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:17)，5'可操作连接到内含子I-Zm.DnaK:1(SEQ ID NO:18)，5'可操作连接到编码GUS-1,GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1的编码序列(SEQ ID NO:19)，5'可操作连接到3'UTR,T-Os.Mth-1:1:1(SEQ ID NO:20)。图1a中具有增强子的对照在第一和第二转基因表达盒之间缺乏ISR。因此，来自第一转基因表达盒的增强子与第二转基因表达盒中的种子特异性启动子相互作用并改变其表达，将第二表达转基因盒的表达从种子特异性改变为组成型。在图1c中，ISR被克隆在具有增强子的对照的第一和第二转基因表达盒之间。如果ISR是有效的，那么它将减少第一转基因表达盒中的增强子对第二表达转基因盒中的启动子表达的相互作用，相对于具有增强子的对照，减少非种子组织中的表达。
图2a-c是用于测定ISR在降低单个载体堆叠中的两个转基因表达盒对稳定转化的大豆植物中彼此表达的相互作用中的有效性的载体堆叠的图示。附图中的参考数字表示序列简述中给出的每个遗传元件的相应序列标识符。图2a显示了对照载体堆叠(没有增强子的对照)的转基因表达盒构型。没有增强子的对照(图2a)包含种子特异性启动子P-Gm.Sphas1:14(SEQ ID NO:25)，5'可操作连接到前导序列L-Gm.Sphas1-1:1:1(SEQ ID NO:26)，5'可操作连接到编码GUS-2,GOI-GUS:1:2的编码序列(SEQ ID NO:27)，5'可操作连接到3'UTR,T-Mt.AC145767v28:3(SEQ ID NO:28)。种子特异性启动子能够驱动GUS主要在无增强子的对照中的大豆植物种子中表达。图2b显示了对照载体堆叠(具有增强子的对照)的转基因表达盒构型。具有增强子的对照由两个不同方向的转基因表达盒组成。第一转基因盒包含源自具有重排和复制的增强子的玄参花叶病毒35S启动子的强启动子P-FMV.35S-enh-1:1:2(SEQ ID NO:21)，5'可操作连接到前导序列L-Ph.DnaK-1:1:3(SEQ ID NO:22)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶的编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2(SEQ ID NO:23)，5'可操作连接到3'UTR,T-Mt.AC139600v16:1(SEQ ID NO:24)。相对于第一转基因盒以不同方向克隆的第二转基因盒包含种子特异性启动子P-Gm.Sphas1:14(SEQ ID NO:25)，5'可操作连接到前导序列L-Gm.Sphas1-1:1:1(SEQ ID NO:26)，5'可操作连接到编码GUS-2,GOI-GUS:1:2的编码序列(SEQ ID NO:27)，5'可操作连接到3'UTR,T-Mt.AC145767v28:3(SEQ IDNO:28)。具有增强子的对照在第一和第二转基因表达盒之间缺少ISR。因此，第二转基因表达盒中的种子特异性启动子表达受第一转基因表达盒中玄参花叶病毒35S启动子的增强子区的影响，将第二表达转基因盒的表达从种子特异性改变为组成型。在图2c中，ISR被克隆在具有增强子的对照的第一和第二转基因表达盒之间。如果ISR是有效的，那么它将减少第一转基因表达盒中玄参花叶病毒35S启动子的增强子区与第二转基因表达盒中的启动子的相互作用，相对于具有增强子的对照减少非种子组织中的表达。
具体实施方式
本发明提供了用于转基因植物中的新型合成基因间序列区(“ISR”)。这些新型合成ISR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-6所提供。当插入第一转基因盒和第二转基因之间时，这些合成的ISR减少了第一转基因表达盒中的表达元件对转基因植物中的第二转基因盒的表达的相互作用。本发明还提供了包含ISR的转基因植物细胞、植物和种子。本发明还提供了使用ISR以及制备和使用包含ISR的重组DNA分子的方法。
提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本领域的一般技术人员实践本发明。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。
ISR和第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用
如本文所用，术语“相互作用”是指当在转基因植物中彼此紧密接近提供时，第一转基因表达盒中的一个或多个元件对第二转基因表达盒的表达模式的影响，在某些实施方案中，所述转基因植物已经使用载体堆叠转化。
每个转基因表达盒内的调节元件由各种顺式元件组成，所述顺式元件与影响转基因转录的反式作用因子结合。例如，植物启动子由转录起始和转录效率所必需的顺式元件组成。此外，植物启动子通常由其他顺式元件基序组成，这些基序可响应于特定刺激如应激(ABRE和AB14)、病原体(W Box)或光(GT1基序)而调节转录。其他顺式元件可提供组织特异性或组织优选的表达(Porto等人(2014)Plant Promoters:An Approach of Structureand Function.Mol.Biotechnol 56:38-49)。例如，花椰菜花叶病毒35S启动子包含由两个结构域组成的增强子区。下游结构域(结构域A)赋予主要在根中的表达。结构域A内22个碱基对区域内的顺式元件as-1主要负责该表达。上游结构域(结构域B)赋予在叶和茎的大多数细胞类型中以及在根的维管组织中的表达(Benfey等人(1990)Tissue-specificexpression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plantdevelopment.The EMBO Journal,9:1677-1684)。
当两个转基因表达盒在植物基因组中彼此相邻时，一个转基因表达盒的表达元件有可能改变另一个转基因表达盒的表达。转基因植物中一个转基因表达盒与相邻转基因表达盒的这种“相互作用”在实施例2和3中由具有增强子的对照证明。
“渗漏”是用于描述由第一表达盒中的表达元件对第二表达盒的表达谱的相互作用引起的组织中平均表达变化水平的术语。通过将具有增强子的对照的表达谱与具有ISR的测试载体堆叠(其由具有插入在两个转基因盒之间的ISR的具有增强子的对照组成)的表达谱进行比较来确定渗漏。与具有增强子的对照相比，无增强子的对照的渗漏为100％。包含ISR的构建体的渗漏通过将测试构建体的非靶组织中的平均GUS表达除以具有增强子的对照构建体的非靶组织中的平均GUS表达并乘以100来确定。通过从100％中减去渗漏百分比来确定渗漏减少的百分比。
“基因间序列区”或“ISR”是合成核苷酸序列，其被设计为最小化相邻转基因盒中的表达元件对彼此表达的相互作用。本文公开的基因间序列区是通过计算设计的，并分析减少用于转化植物细胞的载体堆叠中第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用的能力，从而保持每个转基因表达盒的表达谱，如在转基因植物中单独观察到的。
“合成核苷酸序列”或“人工核苷酸序列”是已知在自然界中不存在或不天然存在的核苷酸序列。本发明的基因间序列区元件包含合成核苷酸序列。优选地，合成核苷酸序列与天然序列共享很少或没有扩展同源性。在本文中，扩展同源性通常是指延伸超过连续序列的约25个核苷酸的100％序列同一性。
在实施例2中，对照玉米植物用由两个不同方向的转基因表达盒组成的两个载体堆叠转化。一个对照载体堆叠包含第一转基因表达盒和第二转基因表达盒，所述第一转基因表达盒包含驱动抗生素抗性基因表达的水稻肌动蛋白1启动子(无增强子的对照，参见图1a)，所述第二转基因表达盒包含驱动GUS表达的种子优选的启动子。用该载体堆叠转化的玉米植株证实了GUS的种子优选表达。另一个对照载体堆叠(具有增强子的对照)包含第一转基因表达盒和第二转基因表达盒，所述第一转基因表达盒包含源自CaMV 35S的强增强子，该强增强子可操作地连接到驱动抗生素抗性基因表达的水稻肌动蛋白1启动子，所述第二转基因表达盒包含驱动GUS表达的种子优选的启动子。用具有增强子的对照转化的玉米植物在根、叶、花药、丝和种子中表现出高水平的GUS表达。因此，在具有增强子的对照中，第一转基因表达盒增强子改变了第二表达转基因盒的表达谱的表达模式，将第二表达转基因盒的表达从种子优选改变为组成型。
将某些计算设计的ISR插入到具有增强子的对照的第一和第二转基因盒之间，如图1c所示。当ISRs ISR4_Stop(SEQ ID NO:1)、ISR89(SEQ ID NO:2)和ISR97(SEQ ID NO:5)被插入第一和第二转基因表达盒之间时，第一转基因表达盒的表达模式对第二转基因表达盒的表达模式的相互作用的渗漏百分比分别为16％、8％和6％。因此，这些ISR将第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用分别减少84％、92％和94％。
在实施例3中，使用类似的实验设计来测试大豆中某些ISR的有效性。在具有增强子的对照的第一转基因表达盒和第二转基因表达盒之间插入ISR2(SEQ ID NO:3)、ISR4(SEQ ID NO:4)、ISR69(SEQ ID NO:6)导致第一转基因表达盒的表达模式对第二转基因表达盒的影响减少，分别只有3％、4％和5％的渗漏。这导致第一转基因表达盒中的表达元件对第二转基因表达盒的表达模式的相互作用分别减少97％、96％和95％。
如实施例中所证明的，并非所有计算设计的基因间序列区在减少相互作用方面都同样有效。此外，甚至导致相互作用减少的ISR也在不同程度上如此。例如，ISR88(SEQ IDNO:7)和ISR86(SEQ ID NO:8)在转基因玉米植物中仅分别使相互作用减少39％和68％，渗漏分别为61％和32％。与ISR4_Stop的84％，ISR89的92％和ISR97的94％相比，这种相互作用的减少要小得多。同样，在转基因大豆中，与ISR2的97％，ISR4的96％和ISR69的95％相比，ISR_X(SEQ ID NO:9)仅使相互作用减少76％(渗漏百分比，24％)。因此，每个计算设计的ISR是独特的，并且不同的ISR可以与不同的表达盒结合使用以达到一个或多个所关注基因的所需表达谱。
DNA分子
如本文使用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核苷酸碱基的聚合物或DNA分子，从5'(上游)端读到3'(下游)端。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法对应于美国联邦法规§1.822的标题37，并且在WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1和3的表中阐明。
如本文所用，“异源分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的DNA分子组合的分子。例如，异源分子可以是由相对于彼此异源的至少两个DNA分子组成的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，包含合成DNA序列的DNA分子或已通过遗传转化或基因编辑并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
在本申请中，提及“分离的DNA分子”或者等同术语或短语旨在意指一种DNA分子，其单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中存在。例如，在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，就不被认为是“分离的”。然而，只要所述元件不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内就将会是“分离的”。类似地，编码杀昆虫蛋白或所述蛋白质的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在编码所述蛋白质的序列天然存在的细菌的DNA内即可。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论所述核苷酸序列是否存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，或以可检测量存在于来源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过人工比对两个序列(例如参考序列和另一个序列)产生最佳序列比对，以通过适当内部核苷酸插入、缺失或缺口使序列比对中的核苷酸匹配数目最大化。如本文使用，术语“参考序列”是指提供为SEQ ID NO:1-6的DNA序列。
如本文使用，术语“％序列同一性”或“％同一性(percent identity/％identity)”是同一性分数乘以100。与参考序列最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配的数目，除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供包含序列的DNA分子，所述序列在与本文提供为SEQ ID NO:1-6的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或至少约100％同一性。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1-6中任一个具有给定百分比同一性的序列保持了SEQ ID NO:1-6中任一个的一般功能性，即，表现出减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒的表达的影响的相同或相似能力。在某些实施方案中，就减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒的表达的影响而言，与SEQ ID NO:1-6中任一个具有给定百分比同一性的序列具有SEQ ID NO:1-6中任一个的活性。
调控元件
调控元件如启动子、前导序列(也称为5’UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3'UTR)在活细胞中的总体基因表达中起整体作用。如本文使用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文使用，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作地连接可转录DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接可转录DNA分子的表达的能力。在植物中起作用的调控元件，如启动子、前导序列、增强子、内含子和3'UTR适用于经由遗传工程来修饰植物表现型。
调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应如组成性表达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达，和其任何组合，以及通过定量或定性指示来表征。如本文使用，“基因表达模式”是将可操作地连接DNA分子转录至转录RNA分子中的任何模式。转录RNA分子可翻译以产生蛋白质分子或可提供反义或其他调控RNA分子，如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小分子RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)等。
如本文使用，术语“蛋白质表达”是转录RNA分子翻译至蛋白质分子中的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。
启动子适用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文使用，术语“启动子”总体上是指涉及识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质，如反式作用转录因子，以启始转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5'未翻译区域(5'UTR)分离。或者，启动子可为合成产生或操纵的DNA分子。启动子还可为嵌合的。嵌合启动子经由两个或更多个异源DNA分子的融合来产生。可用于证明本发明的启动子包括如SEQ ID NO:11、16、21和25提供的启动子元件。
如本文使用，术语“前导序列”是指从基因的未翻译5'区域(5'UTR)分离的DNA分子并且总体上定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸节段。或者，前导序列可为合成产生或操纵DNA元件。前导序列可用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的5'调控元件。前导序列分子可与异源启动子或与其原生启动子一起使用。可用于证明本发明的前导序列包括SEQ ID NO:12、17、22和26。
如本文使用，术语“内含子”是指可从基因分离或鉴定的DNA分子并且可总体上定义为在翻译之前的信使RNA(mRNA)处理期间剪接的区域。或者，内含子可为合成产生或操纵DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接基因的转录的增强子元件。内含子可用作调节可操作地连接可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包括内含子，并且内含子可或可不相对于可转录DNA分子异源。可用于证明本发明的内含子如SEQ ID NO:13和18所示。
如本文使用，术语“3'转录终止分子”、“3'未翻译区域”或“3'UTR”是指在mRNA分子的3'部分的未翻译区域的转录期间所使用的DNA分子。mRNA分子的3'未翻译区域可通过特异性裂解和也称为聚腺苷酸尾部的3'多聚腺苷酸化来产生。3'UTR可以可操作地连接至和位于可转录DNA分子的下游并且可包括多聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA处理或基因表达的其他调控信号。聚腺苷酸尾部被认为在mRNA稳定性和启始翻译中起作用。
如本文使用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接可转录DNA分子的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包括一个或多个影响可操作地连接DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。
如本文所用，术语“变体”是指在组成上与第一DNA分子相似但不相同的第二DNA分子。例如，本文公开的ISR中一种的变体将具有略微不同的序列组成，但将保持以与其来源的ISR相同的方式减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒表达的影响的能力。变体可为缩短或截短型式的第一DNA分子或改变型式的第一DNA分子的序列，如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代或插入的DNA分子。“变体”还可以包括具有包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入的核苷酸序列的ISR，其中衍生的基因间序列区元件具有或多或少或等同的减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒表达的影响的能力。在本发明中，以SEQ ID NO:1-6提供的多核苷酸序列可用于产生在组成上与原始ISR的DNA序列相似但不相同的变体，同时仍保持一般功能，即，减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒表达的影响的相同或相似能力。在某些实施方案中，SEQ IDNO:1-6中任一个的变体在减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒表达的影响方面具有SEQ ID NO:1-6中任一个的活性。鉴于本公开，本发明的这类变体的产生完全本领域的普通技能范围内并且涵盖于本发明范围中。
在某些实施例中，ISR的变体可以是SEQ ID NO:1-6中任一个的片段。SEQ ID NO:1-6的片段可包含SEQ ID NO:1-6中任一个的至少约50个连续核苷酸、至少约100个连续核苷酸、至少约150个连续核苷酸、至少约200个连续核苷酸、至少约250个连续核苷酸、至少约300个连续核苷酸、至少约350个连续核苷酸、至少约400个连续核苷酸、至少约450个连续核苷酸、至少约500个连续核苷酸、至少约550个连续核苷酸、至少约600个连续核苷酸、至少约650个连续核苷酸、至少约700个连续核苷酸、至少约750个连续核苷酸、至少约800个连续核苷酸、至少约850个连续核苷酸、至少约900个连续核苷酸、至少约950个连续核苷酸、至少约1000个连续核苷酸、至少约1100个连续核苷酸、至少约1200个连续核苷酸、至少约1300个连续核苷酸、至少约1400个连续核苷酸、至少约1500个连续核苷酸、至少约1600个连续核苷酸、至少约1700个连续核苷酸、至少约1800个连续核苷酸、至少约1900个连续核苷酸、至少约2000个连续核苷酸、至少约2100个连续核苷酸、至少约2200个连续核苷酸、至少约2300个连续核苷酸、至少约2400个连续核苷酸、至少约2500个连续核苷酸、至少约2600个连续核苷酸、至少约2700个连续核苷酸、至少约2800个连续核苷酸、至少约2900个连续核苷酸、至少约3000个连续核苷酸，或更多个。在某些实施方案中，就减少第一转基因表达盒对转基因植物中第二转基因盒表达的影响而言，SEQ ID NO:1-6中任一个的片段具有SEQ ID NO:1-6中任一个的活性。
构建体
如本文使用，术语“构建体”意指来源于任何来源的能够基因组整合或自主复制的任何重组DNA分子如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或线性或圆形DNA或RNA分子，包括其中至少一个DNA分子以功能操作方式连接至另一个DNA分子，即，可操作地连接的DNA分子。如本文使用，术语“载体”意指可用于转化目的，即，将异源DNA或RNA引入宿主细胞中的任何构建体。“载体堆叠”是由堆叠在一起用于转化的两个或多个盒组成的载体。根据用于构建载体堆叠的克隆或合成方法，载体堆叠中的两个或多个转基因表达盒被DNA序列片段分开，所述DNA序列片段可以少至约10个核苷酸至约几百个核苷酸、或几千个核苷酸或更多。如本文使用，“表达盒”是指包含可操作地连接至一个或多个调控元件，通常至少启动子和3'UTR的至少一个可转录DNA分子的DNA分子。
如本文使用，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子连接至第二DNA分子，其中第一和第二DNA分子如此布置以使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。两个DNA分子可或可不为单一邻接DNA分子的一部分并且可或可不相邻。举例来说，如果启动子调节细胞中的所关注可转录DNA分子的转录，那么启动子可操作地连接至可转录DNA分子。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，所述前导序列就是与DNA分子可操作连接的。
本领域中已知以使得可转录DNA分子转录成翻译并表达为蛋白质的功能性mRNA分子的方式将构建体组装并引入细胞中的方法。为了实践本发明，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员熟知的。适用于在较高植物中表达核酸的典型载体在本领域中是熟知的并且包括来自根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN传递控制载体。
各种调控元件可包含于构建体中，包括本文提供的那些元件中的任何一个。任何这类调控元件可与其它调控元件组合来提供。这类组合可设计或改良以产生所需调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包括可操作地连接至可操作地连接至3”UTR的可转录DNA分子的至少一个调控元件。
本发明的构建体可以包括本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。举例来说，本发明的启动子可以可操作地连接至异源非翻译5'前导序列如来自热休克蛋白质基因的前导序列。或者，本发明的前导序列可以可操作地连接至异源启动子如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子。
可转录DNA分子
如本文使用，术语“可转录DNA分子”是指能够转录至RNA分子中的任何DNA分子，包括但不限于，具有蛋白质编码序列的那些分子和产生具有适用于基因抑制的序列的RNA分子的那些分子。DNA分子的类型可包括，但是不限于，来自相同植物的DNA分子，来自另一种植物的DNA分子，来自不同生物体的DNA分子，或合成DNA分子，如含有基因的反义信息的DNA分子，或编码人工、合成或另外修饰型式的转基因的DNA分子。并入本发明的构建体中的示例性可转录DNA分子包括，例如，来自除了DNA分子并入其中的物种以外的物种的DNA分子或基因或来源于或存在于相同物种中但是通过遗传工程方法而非经典育种技术来并入受体细胞中的基因。
“转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或在当前或任何以前世代的细胞中人工并入宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因包含具有农艺学重要性的基因，如能够在植物中提供除草剂抗性的基因，或能够在植物中提供植物害虫抗性的基因。
调控元件，如启动子，可以可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA分子。如本文使用，术语“异源”是指两个或更多个DNA分子的组合，在这类组合通常不存在于自然界中时。举例来说，两个DNA分子可来自不同物种和/或两个DNA分子可来自不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，调控元件相对于可操作地连接可转录DNA分子为异源的，如果这类组合通常不存在于自然界中，即，可转录DNA分子并非自然地可操作地连接至调控元件而出现。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是由相对于彼此异源的至少两个DNA分子组成的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子、包含合成DNA序列的DNA分子或已通过遗传转化或基因编辑并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
可转录DNA分子总体上可为需要转录物的表达的任何DNA分子。转录物的这类表达可导致所得mRNA分子的翻译，并且由此导致蛋白质表达。或者，例如，可转录DNA分子可被设计成最终导致特异性基因或蛋白质的表达减少。在一个实施方案中，此可使用在反义方向上定向的可转录DNA分子来完成。本领域普通技术人员熟悉使用这类反义技术。任何基因可以此方式负性调控，并且在一个实施方案中，可转录DNA分子可被设计成经由dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。
选择性标记
选择性标记转基因还可与本发明的调控元件一起使用。如本文使用，术语“可选择标记转基因”是指可筛选或以某种方式获得其在转基因植物、组织或细胞中的表达，或不存在这种表达的任何可转录DNA分子。用于本发明实践的可选择标记基因，和其相关联选择和筛选技术在本领域中为已知的并且包括但不限于，编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质，和赋予除草剂耐性的蛋白质的可转录DNA分子。选择性标记转基因的实例提供为SEQ ID NO:18和26。
细胞转化
本发明还针对产生包含可操作地连接至可转录DNA分子的一个或多个调控元件的转化细胞和植物的方法。
术语“转化”是指将DNA分子引入受体宿主中。如本文使用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或子代。特别受到关注的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、秧苗、胚胎和花粉。
本文中使用的术语“转化”是指已经向其中引入外部DNA分子(如构建体或载体堆叠)的细胞、组织、器官或有机体。优选地，引入的DNA分子被整合到受体细胞、组织、器官或有机体的基因组DNA中，以使引入的DNA分子被随后的子代继承。“转基因”或“转化”细胞或有机体也包括细胞或有机体的子代以及由杂交中使用这种转基因植物作为亲代的育种计划中产生并且表现由外部DNA分子的存在引起的改变表现型的子代。所引入DNA分子还可瞬时引入受体细胞中以使得所引入DNA分子不由后续子代承袭。术语“转基因”是指含有一个或多个异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
存在本领域技术人员熟知的将DNA分子引入植物细胞中的许多方法。此过程总体上包括选择合适宿主细胞、将宿主细胞用载体转化，并且获得转化宿主细胞的步骤。在本发明的实践中通过将植物构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何熟知和证明方法。合适方法尤其包括但不限于细菌感染(例如农杆菌)、二元BAC载体、直接递送DNA(例如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA吸收、电穿孔、使用碳化硅纤维来搅拌，和DNA涂布粒子的加速)、以及基因编辑(例如，CRISPR-Cas系统)。
宿主细胞可为任何细胞或生物体，如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体实施方案中，宿主细胞和转化细胞可包括来自作物植物的细胞。
转基因植物随后可从细胞本发明的转基因植物再生。使用常规育种技术或自花受粉，可从这个转基因植物产生种子。这类种子，和从这类种子生长的所得子代植物含有本发明的重组DNA分子，因此为转基因的。
本发明的转基因植物可自花受粉以提供本发明的纯合转基因植物(对于重组DNA分子为纯合的)的种子或与非转基因植物或不同转基因植物杂交以提供本发明的杂合转基因植物(对于重组DNA分子为杂合的)的种子。这类纯合和杂合转基因植物在本文中称为“子代植物”。子代植物是起源于原始转基因植物并且含有本发明的重组DNA分子的转基因植物。使用本发明的转基因植物产生的种子可收获并且用于生长几个世代的本发明转基因植物，即，子代植物，其包含本发明的构建体并且表达具有农艺学重要性的基因。通常用于不同作物的育种方法的描述可发现于多个参考书籍中的一个，参见，例如，Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(编),Center for AgriculturalPublishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production andUses,第2版,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of Variety Development,Theory and Technique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),Iowa State Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。
转化植物可针对所关注的一个或多个基因的存在和由本发明的调控元件赋予的表达水平和/或概况来分析。本领域技术人员知道可用于分析转化植物的许多方法。举例来说，植物分析方法包括但不限于DNA印迹或RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可转录DNA分子的表达可使用如制造商所描述的
(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂和方法来测量并且PCR循环时间使用
Testing Matrix来确定。或者，如制造商所描述的
(Third WaveTechnologies，Madison，WI)试剂和方法可用于评估转基因表达。
本发明还提供本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可为能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并且提供包含本发明的DNA分子的转化植物细胞。本发明的转化或转基因植物细胞包含可再生和/或不可再生植物细胞。
本发明还提供从含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分产生的商品产品。本发明的商业产品含有可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1-6组成的组的DNA序列。如本文使用，“商品产品”是指包含来源于含有本发明的重组DNA分子的转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料的任何组合物或产物。商品产品包括但不限于加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。本发明的商品产品含有可检测量的对应于本发明的重组DNA分子的DNA。样品中此DNA的一种或多种的检测可用于确定商业产品的含量或来源。可以使用任何标准的DNA分子检测方法，包括本文公开的检测方法。
本发明可经由参考以下实施例来更容易理解，所述实施例提供用于说明，并且不意欲限制本发明，除非指定。本领域技术人员应当了解在下面的实施例中公开的技术代表本发明者发现的在实践本发明中起较好作用的技术。但是，鉴于本公开，本领域技术人员了解到可以在公开的具体实施方案中进行许多变化，并且仍然获得同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，附图中提出或示出的所有事项应理解为例示性的，而不具有限制意义。
实施例
实施例1
基因间序列区元件的设计、合成和克隆
合成的基因间序列区元件(“ISR”)通过算法方法进行计算设计。每个ISR被设计为不包含任何潜在的开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框在插入植物基因组后可能无意中导致产生不需要的蛋白质。此外，许多ISR被设计为在ISR的5'和3'末端包含终止密码子，以在所有六个阅读框中提供终止密码子的方式定位。
设计后，就化学合成ISR并将其克隆到异源载体堆叠中的转基因表达盒之间。在稳定转化的玉米和大豆植物中设计并分析了超过100个合成基因间序列区元件，以鉴定减少第一转基因盒与第二转基因盒相互作用的那些合成ISR。
某些设计和测试的ISR示于表1中。ISR4_Stop是ISR4的变体，其中终止密码子附加到ISR4的3'和5'末端。
表1.合成的基因间序列区元件。
如实施例2和3所示，SEQ ID NO:1-6所示的合成基因间序列区元件证明了在稳定转化的玉米和大豆植物中减少载体堆叠中第一转基因盒与第二转基因盒相互作用的能力。
实施例2
在稳定转化的玉米植物中通过ISR4_Stop、ISR89和ISR97减少转基因表达盒相互作用
该实施例证明了ISR ISR4_Stop、ISR89和ISR97在插入用于稳定转化玉米植物的载体堆叠的第一转基因表达盒和第二转基因表达盒之间时减少转基因表达盒相互作用的能力。
用二元植物转化载体堆叠转化玉米植物，所述二元植物转化载体堆叠包含两个不同方向的转基因表达盒和两个转基因表达盒之间的ISR，以评价ISR减少转基因表达盒相互作用的能力。也将两个对照载体堆叠转化到玉米植物中并测试。
一个对照载体堆叠(图1a，无增强子的对照)包含第一转基因表达盒，其包含启动子P-Os.Act1:67(SEQ ID NO:11)，5'可操作连接到前导序列L-Ta.Lhcb1:1(SEQ ID NO:12)，5'可操作连接到内含子I-Os.Act1-1:1:19(SEQ ID NO:13)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(SEQ ID NO:14)，5'可操作连接到3'UTR,T-Ta.Hsp17-1:1:1(SEQ ID NO:15)。以相对于第一转基因表达盒不同的方向克隆的第二转基因表达盒包含种子特异性启动子P-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:16)，5'可操作连接到前导序列L-Zm.39486-1:1:1(SEQ ID NO:17)，5'可操作连接到内含子I-Zm.DnaK:1(SEQ ID NO:18)，5'可操作连接到编码GUS-1,GOI-Ec.uidA+St.LS1.nn o:1的编码序列(SEQ ID NO:19)，5'可操作连接到3'UTR,T-Os.Mth-1:1:1(SEQ ID NO:20)。无增强子的对照载体堆叠也包含另外的转基因表达盒，其用于使用草甘膦选择来选择转化的细胞。
另一个对照载体堆叠(图1b，具有增强子的对照)包含第一转基因表达盒，其包含强增强子E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1(SEQ ID NO:10)，其包含源自花椰菜花叶病毒35S启动子的特异性增强子区的串联重复序列，5'可操作连接到启动子P-Os.Act1:67(SEQ IDNO:11)，5'可操作连接到前导序列L-Ta.Lhcb1:1(SEQ ID NO:12)，5'可操作连接到内含子I-Os.Act1-1:1:19(SEQ ID NO:13)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶的编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(SEQ ID NO:14)，5'可操作连接到3'UTR,T-Ta.Hsp17-1:1:1(SEQ IDNO:15)。以相对于第一转基因表达盒不同的方向克隆的第二转基因表达盒包含种子特异性启动子并且是与上述相同的转基因表达盒。具有增强子的对照载体堆叠也包含另外的转基因表达盒，其用于使用草甘膦选择来选择转化的细胞。
为了测定ISR在减少第一和第二转基因表达盒之间相互作用中的有效性，将ISRISR4_Stop(SEQ ID NO:1)、ISR89(SEQ ID NO:2)、ISR97(SEQ ID NO:5)、ISR88(SEQ ID NO:7)和ISR86(SEQ ID NO:8)克隆在具有增强子的对照载体堆叠的第一和第二转基因表达盒之间，如图1c所示。使用与本领域已知的那些类似的农杆菌介导的转化方法，用两个对照载体堆叠和包含ISR的五个载体堆叠转化品种LH244玉米植物细胞。诱导转化的植物细胞以形成整株植物。
使用定性和定量GUS分析来评价转化植物中所选植物器官和组织中的表达元件活性。为了通过组织化学染色来定性分析GUS表达，将整块或切片组织与含有1mg/mL X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)的GUS染色溶液在37℃下孵育5小时并用35％EtOH和50％乙酸脱色。通过在解剖显微镜或复合显微镜下目测所选植物器官或组织的蓝色来定性测定GUS的表达。为了通过酶测定来定量分析GUS表达，从转化的玉米植物的所选组织中提取总蛋白。将1-2微克总蛋白与荧光底物4-甲基伞形基--D-葡糖苷酸(MUG)以1mM浓度在50微升的总反应体积中孵育。在37℃下孵育1小时后，通过添加350微升200mM碳酸氢钠溶液停止反应。反应产物，4–甲基伞形酮(4-MU)在羟基得以电离的较高pH下最大限度地发荧光。加入碱性碳酸钠溶液同时停止测定并调节pH以定量荧光产物4-MU。形成的4-MU的量通过使用FLUOstar Omega酶标仪(BMG LABTECH)(在355nm激发，在460nm发射)测量其荧光来估计。以4-MU/小时/mg总蛋白的纳摩尔数提供GUS活性值。
针对在R0世代中的GUS表达对以下组织取样：V3阶段叶和根；V7阶段叶和根；VT阶段叶、根、花药和丝；以及授粉后21天(DAP)的R3阶段种子胚和种子胚乳。表2显示了营养组织、生殖组织和种子组织中的平均GUS表达，其中“bdl”表示GUS表达低于检测水平。表3显示了营养组织和生殖组织中的平均GUS表达。具有增强子的对照被认为代表第一转基因表达盒增强子与第二转基因表达盒的种子特异性启动子的完全相互作用。因此，受第一转基因表达盒的强组成型增强子影响的种子特异性启动子P-Zm.39486-1:1:1驱动的GUS盒的平均营养和生殖组织表达表示100％的渗漏。通过将包含ISR的构建体转化的植物的营养和生殖组织中的平均GUS表达除以具有增强子的对照的营养和生殖组织中的平均GUS表达，并将结果乘以100，确定包含ISR的载体堆叠的渗漏百分比。
表2.在LH244稳定转化的玉米植物的营养、生殖和种子组织中的平均GUS表达。
表3.平均营养和生殖GUS表达和与对照相比，ISR的平均渗漏百分比。
| 对照/ISR | SEQ ID NO: | 平均营养和生殖表达 | ％渗漏 |
| 无增强子的对照 | 12 | 1％ | |
| 具有增强子的对照 | 1070 | 100％ | |
| ISR4_Stop | 1 | 172 | 16％ |
| ISR89 | 2 | 87 | 8％ |
| ISR97 | 5 | 55 | 6％ |
| ISR88 | 7 | 652 | 61％ |
| ISR86 | 8 | 346 | 32％ |
如表2所示，与无增强子的对照相比，具有增强子的对照在稳定转化的玉米植物的所有组织中均表现出高GUS表达。这表明第一转基因表达盒中的强增强子将第二转基因表达盒的种子特异性表达模式改变为更具组成型的表达模式。
如表2所示，当ISR ISR4_Stop、ISR89和ISR97插入盒之间时，第一转基因表达盒中的强增强子对第二转基因表达盒的相互作用减少。具有ISR4_Stop、ISR89和ISR97的载体堆叠中营养组织和生殖组织的平均GUS表达远低于具有增强子的对照载体。ISR4_Stop、ISR89和ISR97的渗漏百分比分别为16％、8％和6％，因此使两个转基因表达盒之间的相互作用分别减少84％、92％和94％。相比之下，ISR88和ISR86渗漏更多(分别为61％和32％)，并且仅使两个转基因表达盒之间的相互作用分别减少39％和68％。
ISR4_Stop(SEQ ID NO:1)、ISR89(SEQ ID NO:2)和ISR97(SEQ ID NO:5)表明在稳定转化的玉米植物中减少载体堆叠中第一转基因表达盒与第二转基因表达盒相互作用的能力。
实施例3
在稳定转化的大豆植物中通过ISR2和ISR4减少转基因表达盒相互作用
该实施例表明了当插入用于稳定转化大豆植物的载体堆叠的第一转基因表达盒和第二转基因表达盒之间时，基因间序列区元件ISR2和ISR4减少转基因表达盒相互作用的能力。
用二元植物转化载体堆叠转化大豆植物，所述二元植物转化载体堆叠包含两个不同方向的转基因表达盒和两个转基因表达盒之间的ISR，以评价ISR减少转基因表达盒相互作用的能力。也将两个对照载体堆叠转化到大豆植物中并测试。
一个对照载体堆叠(图2a，无增强子的对照)包含单个转基因表达盒，其包含种子特异性启动子P-Gm.Sphas1:14(SEQ ID NO:25)，5'可操作连接到前导序列L-Gm.Sphas1-1:1:1(SEQ ID NO:26)，5'可操作连接到编码GUS-2,GOI-GUS:1:2的编码序列(SEQ ID NO:27)，5'可操作连接到3'UTR,T-Mt.AC145767v28:3(SEQ ID NO:28)。无增强子的对照载体堆叠也包含另外的转基因表达盒，其用于使用抗生素选择来选择转化的细胞。
另一个对照载体堆叠(图2b，具有增强子的对照)包含两个不同方向的转基因表达盒。第一转基因盒包含源自具有重排和复制的增强子的玄参花叶病毒35S启动子的强启动子P-FMV.35S-enh-1:1:2(SEQ ID NO:21)，5'可操作连接到前导序列L-Ph.DnaK-1:1:3(SEQID NO:22)，5'可操作连接到新霉素磷酸转移酶的编码序列CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2(SEQID NO:23)，5'可操作连接到3'UTR,T-Mt.AC139600v16:1(SEQ ID NO:24)。第二转基因表达盒与上述种子特异性转基因表达盒相同。具有增强子的对照载体堆叠也包含另外的转基因表达盒，其用于使用抗生素选择来选择转化的细胞。
为了测定ISR在减少第一和第二转基因表达盒之间相互作用的有效性，将ISRISR2(SEQ ID NO:3)、ISR4(SEQ ID NO:2)、ISR69(SEQ ID NO:6)和ISR_X(SEQ ID NO:8)克隆在具有增强子的对照载体堆叠的第一和第二转基因表达盒之间，如图2c所示。使用与本领域已知的类似的农杆菌介导的转化方法，用无增强子的对照、具有增强子的对照和包含ISR的三个载体堆叠转化品种A3555大豆植物细胞。诱导转化的植物细胞以形成整株植物。
如先前在实施例2中所述进行定性和定量GUS分析。针对在R0世代中的GUS表达对以下组织取样：Vn5根、Vn5沉叶、Vn5源叶、R1源叶、R1叶柄、R1花、R3未成熟种子、R3荚、R5子叶、黄色荚(YP)胚和黄色荚(YP)子叶。
具有增强子的对照被认为代表第一转基因表达盒增强子与第二转基因表达盒的种子特异性启动子的完全相互作用。因此，受第一转基因表达盒的强组成型增强子影响的种子特异性启动子P-Gm.Sphas1:14驱动的GUS盒的平均营养和生殖组织表达表示100％的渗漏。通过用包含ISR的构建体转化的植物的Vn5、R1和R3组织中的平均GUS表达除以具有增强子的对照的Vn5、R1和R3组织的平均GUS表达，并将结果乘以100，确定包含ISR的构建体的渗漏百分比。
Vn5、R1和R3组织的平均GUS表达呈现于表4中，其中“nd”指示未测定。R5和黄色荚组织的平均GUS表达，平均Vn5、R1和R3组织表达和渗漏百分比呈现于表5中。
表4.在稳定转化的A3555大豆植物中Vn5、R1和R3组织的平均GUS表达。
表5.R5和黄色荚组织的平均GUS表达，平均Vn5、R1和R3组织表达和稳定转化的A3555大豆植物中的渗漏百分比。
如表4所示，在用无增强子的对照转化的植物的Vn5、R1和R3组织中观察到非常少的GUS表达。用具有增强子的对照转化的植物表明组成型表达模式，在Vn5、R1和R3组织中观察到高GUS表达。同样，如表5所示，用无增强子的对照转化的植物仅在黄色荚胚和子叶中表现出高GUS表达，与P-Gm.Sphas1:14的已知种子特异性表达模式一致。在R5子叶中观察到非常少的表达，其中观察到表达相对于R3未成熟种子略微增加。相对于用无增强子的对照转化的植物，用具有增强子的对照转化的植物在R5子叶中表现出高水平的表达，并且在黄色荚胚和子叶中表现出增加。因此，包含在具有增强子的对照的第一转基因表达盒的P-FMV.35S-enh-1:1:2启动子中的强增强子与第二转基因表达盒的P-Gm.Sphas1:14相互作用，并将其种子特异性表达改变为组成型表达模式。
如表5所示，基因间序列区ISR2、ISR4和ISR69能够将具有增强子的对照构型的第一转基因表达盒对第二转基因表达盒的相互作用分别减少97％、96％和95％(只有3％、4％和5％渗漏)。ISR_X在减少具有增强子的对照构型的第一转基因表达盒对第二转基因表达盒的相互作用方面不那么有效，并且显示24％的渗漏。与ISR2、ISR4和ISR69的97％、96％、95％相比，ISR_X仅使相互作用减少76％。
ISR2(SEQ ID NO:3)、ISR4(SEQ ID NO:4)和ISR69(SEQ ID NO:6)表明了在稳定转化的大豆植物中减少第一转基因表达盒与第二转基因表达盒相互作用的能力。
已经示出和描述本发明的原则，本领域技术人员显而易知本发明可在安排和细节上改进而不背离这些原则。我们要求在权利要求书的精神和范围内的所有改进。本文中的所有公布都以引用的方式并入本文，该引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个别公布或专利申请以引用的方式并入本文一般。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的群组的DNA序列：
a.与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；以及
b.包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列插入在载体堆叠中的第一表达盒和第二表达盒之间。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO:1-6中的任一个。
6.一种转基因植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
7.如权利要求6所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
8.如权利要求6所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
9.一种转基因植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
10.一种如权利要求9所述的转基因植物的子代植物或其部分，其中所述子代植物或其部分包含所述重组DNA分子。
11.一种转基因种子，其中所述种子包含如权利要求1所述的重组分子。
12.一种生产商品产品的方法，其包括获得
如权利要求9所述的转基因植物或其部分以及由其生产所述商品产品。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述商品产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
14.一种用于在用载体堆叠转化的转基因植物中减少第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用的方法，所述方法包括用包含异源转移DNA(T-DNA)的载体堆叠来转化植物细胞，所述异源转移DNA包含：
a.第一转基因表达盒；
b.第二转基因盒；
c.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA分子插入在所述第一转基因表达盒和所述第二转基因表达盒之间；以及
d.从所转化的植物细胞再生转基因植物。
15.如权利要求14所述的方法，其中SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA分子插入在所述载体堆叠内的所述第一转基因表达盒和所述第二转基因表达盒之间。
Claims (15)
1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的群组的DNA序列：
a.与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少85％序列同一性的序列；以及
b.包含SEQ ID NO:1-6中任一个的序列。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列插入在载体堆叠中的第一表达盒和第二表达盒之间。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO:1-6中的任一个。
6.一种转基因植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
7.如权利要求5所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
8.如权利要求5所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
9.一种转基因植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
10.一种如权利要求8所述的转基因植物的子代植物或其部分，其中所述子代植物或其部分包含所述重组DNA分子。
11.一种转基因种子，其中所述种子包含如权利要求1所述的重组分子。
12.一种生产商品产品的方法，其包括获得如权利要求8所述的转基因植物或其部分以及由其生产所述商品产品。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述商品产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
14.一种用于在用载体堆叠转化的转基因植物中减少第一转基因表达盒与第二转基因表达盒的相互作用的方法，所述方法包括用包含异源T-DNA的载体堆叠来转化植物细胞，所述异源T-DNA包含：
a.第一转基因表达盒；
b.第二转基因盒；
c.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA分子插入在所述第一转基因表达盒和所述第二转基因表达盒之间；以及
d.从所转化的植物细胞再生转基因植物。
15.如权利要求13所述的方法，其中SEQ ID NO:1-6中任一个的DNA分子插入在所述载体堆叠内的所述第一转基因表达盒和所述第二转基因表达盒之间。
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