KR20220034872A - 신규의 유전자간 서열 영역 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제1 전이유전자 카세트와 제2 전이유전자 카세트 사이에 삽입될 때 제2 전이유전자 카세트에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키기 위해 식물에서 사용하기 위한 신규의 합성 유전자간 서열 영역을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 신규의 합성 유전자간 서열 영역을 포함하는 형질전환 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자를 제공한다. 본 발명은 또한 신규의 합성 유전자간 서열 영역을 사용하여 전이유전자 발현 카세트 사이의 상호작용을 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

신규의 유전자간 서열 영역 및 이의 용도

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2019년 7월 18일에 출원된 미국 가출원 제62/875,752호의 이익을 주장하고, 이는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

서열 목록의 포함

서열 목록의 컴퓨터-판독 가능한 형식을 함유하는 명칭 "MONS472WO_ST25.txt"의 파일은 2020년 6월 9일에 생성되었다. 이 파일은 38,698 바이트(MS-Windows®에서 측정됨)이고, (미국 특허청 EFS-웹 제출 시스템을 사용하여) 전자 제출에 의해 동시에 제출되고, 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 식물 분자 생물학 및 식물 유전 조작의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 식물에서 하나의 전이유전자 카세트가 다른 전이유전자 카세트의 발현에 대하여 갖는 영향을 감소시키는 데 유용한 DNA 분자에 관한 것이다.

유전자간 서열 영역("ISR(Intergenic Sequence Region)")은, 2개 초과의 전이유전자 카세트 사이에 배치될 때, 다른 전이유전자 카세트에 대한 하나의 전이유전자 카세트의 상호작용을 감소시켜서 카세트들 간의 발현 요소 상호작용으로 인한 전이유전자 카세트의 발현 패턴의 변경을 방지하는 DNA 서열이다.

프로모터, 인트론 및 3' 비번역된 영역(3' UTR)과 같은 발현 카세트에서의 발현 요소는 인접한 또는 이웃하는 발현 카세트의 발현에 영향을 미칠 가능성을 갖는 시스-작용 요소를 함유한다. 예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(CaMV 35S)의 것과 같은 식물 바이러스 프로모터는 근처의 유전자, 삽입 부위에서 4.3 Kb 상류 또는 하류까지의 활성화 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있는 인핸서 도메인으로 이루어진다(Gudynaite-Savitch et al. (2009) Strategies to mitigate transgene-promoter interactions. Plant Biotechnology Journal, 7: 472-485; Benfey et al. (1990) Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development. The EMBO Journal, 9:1677-1684). 예를 들어, 일 경우에 선택 가능한 마커 코딩 서열을 추진시키도록 CaMV 35S 프로모터를 사용하여 선택 카세트를 포함하는 식물 형질전환 벡터로 서브클로닝된 전이유전자 카세트는 더 구성적 패턴으로 전이유전자 카세트의 조직-특이적 발현을 변경시킨 CaMV 35S 프로모터의 존재에 의해 영향을 받았다(Yoo et al. (2005) The 35S promoter used in a selectable marker gene of a plant transformation vector affects the expression of the transgene. Planta, 221: 523-530).

점점 더, 식물 생명공학의 분야에서, 다수의 전이유전자 카세트를 포함하는 벡터는 단일 벡터 스택에서 몇몇 농업적으로 중요한 특징을 도입하기 위해 식물을 형질전환하도록 사용되고 있다. 이 과정의 이점은 몇몇 농업적인 특질이 단일 유전자 유전자좌에 포함될 수 있어서, 벡터 적층된 식물을 추가의 농업적 특징을 포함하는 다른 형질전환 식물과 육종할 때 더 효율적이고 덜 고가인 육종 과정이 가능하게 한다는 점이다. 그러나, 더 많은 발현 카세트가 벡터로 클로닝되면서, 하나의 발현 카세트로부터의 발현 요소가 벡터 스택에서의 다른 발현 카세트의 발현 프로파일을 변경하거나 이에 영향을 미칠 가능성이 있다. 종자에서의 발현과 같은 조직 발현의 특이적 패턴을 제공하도록 설계된 발현 카세트는 벡터 스택에서의 이웃하는 발현 카세트의 발현 요소 사이의 상호작용의 결과로서 발현을 변경할 수 있어서 종자-특이적 발현 패턴을 이웃하는 발현 카세트를 더 가깝게 닮은 것으로 변경한다. 이는 종자-특이적 발현 카세트의 의도된 표현형에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 벡터 스택에서 인접한 및 이웃하는 발현 카세트의 상호작용을 감소시키거나 방지할 수 있는 DNA 서열에 대한 식물 생명공학에서의 필요성이 있다.

이와 같이, 본 발명자는 형질전환 식물에서 벡터 스택에서의 발현 카세트의 상호작용을 최소화하는 신규의 합성 ISR을 본원에서 개시한다. 이 ISR은 개별 카세트의 발현 요소 사이의 상호작용을 막도록 단일 벡터 스택에서의 인접한 발현 카세트 사이에 배치될 수 있어서 벡터 스택 내에 각각의 발현 카세트의 의도된 발현 패턴 및 발현의 수준을 유지시킨다.

발명의 요약

본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규의 합성 유전자간 서열 영역 또는 ISR을 제공한다. 본 발명은 또한 ISR을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 ISR을 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 일 실시형태에서, ISR은 벡터 스택에서의 발현 카세트 사이에 삽입된다. 본 발명은 또한 ISR을 사용하는 방법 및 ISR을 포함하는재조합 DNA 작제물, 및 ISR을 포함하는형질전환 식물 세포, 식물 및 종자를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

이와 같이, 일 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 (b) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 구체적인 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 DNA 서열과 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 본원에는 (a) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 (b) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포가 제공된다. 소정의 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 외떡잎 식물 세포이다. 다른 실시형태에서, 형질전환 식물 세포는 외떡잎 식물 세포 또는 쌍떡잎 식물 세포이다.

또 다른 양태에서, 본원에는 (a) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 (b) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 또는 이의 부분이 추가로 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 형질전환 식물은 재조합 DNA 분자를 포함하는 임의의 세대의 자손 식물이다. 본원에는 성장할 때 이러한 형질전환 식물을 제조하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 종자가 또한 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물 또는 이의 부분을 수득하는 단계 및 이로부터의 원재료 제품(commodity product)을 제조하는 단계를 포함하는 원재료 제품을 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 원재료 제품은 종자, 가공 종자, 농축 단백질, 분리 단백질, 전분, 곡물, 식물 부분, 종자유, 바이오매스, 밀가루 및 굵은 가루(meal)이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 벡터 스택에 의해 형질전환된 형질전환 식물 내에 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 제1 전이유전자 카세트; (b) 제2 전이유전자 카세트: (c) (i) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 (ii) 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자이되; DNA 분자는 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입된 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 벡터 스택에 의해 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 (d) 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 벡터 스택은 2개 초과의 발현 카세트로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 DNA 분자는 벡터 스택 내의 발현 카세트의 각각 사이에 삽입된다.

서열의 간단한 설명

서열 번호 1은 ISR4(서열 번호 4) 및 5'말단 및 3' 말단 둘 다에서 3개의 중지 코돈을 포함하는 유전자간 서열 영역 ISR4_중지의 DNA 서열이다.

서열 번호 2는 유전자간 서열 영역 ISR89의 DNA 서열이다.

서열 번호 3은 유전자간 서열 영역 ISR2의 DNA 서열이다.

서열 번호 4는 유전자간 서열 영역 ISR4의 DNA 서열이다.

서열 번호 5는 유전자간 서열 영역 ISR97의 DNA 서열이다.

서열 번호 6은 유전자간 서열 영역 ISR69의 DNA 서열이다.

서열 번호 7은 유전자간 서열 영역 ISR88의 DNA 서열이다.

서열 번호 8은 유전자간 서열 영역 ISR86의 DNA 서열이다.

서열 번호 9는 유전자간 서열 영역 ISR_X의 DNA 서열이다.

서열 번호 10은 "E-CaMV.35S"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 인핸서의 DNA 서열, E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1이다.

서열 번호 11은 "P-Os.Act1"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 프로모터의 DNA 서열, P-Os.Act1:67이다.

서열 번호 12는 "L-Ta.Lhcb1"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 리더 또는 5' UTR의 DNA 서열, L-Ta.Lhcb1:1이다.

서열 번호 13은 "I-Os.Act1"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 인트론의 DNA 서열, I-Os.Act1-1:1:19이다.

서열 번호 14는 "nptII-1"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 서열, CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3이다.

서열 번호 15는 "T-Ta.Hsp17"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 3' UTR의 DNA 서열, T-Ta.Hsp17-1:1:1이다.

서열 번호 16은 "P-Zm.39486"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 프로모터의 DNA 서열, P-Zm.39486-1:1:1이다.

서열 번호 17은 "L- Zm.39486"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 리더 또는 5' UTR의 DNA 서열, L- Zm.39486-1:1:1이다.

서열 번호 18은 "I-Zm.DnaK"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 인트론의 DNA 서열, I-Zm.DnaK:1이다.

서열 번호 19는 "GUS-1"로서 도 1a 내지 도 1c에 제시된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(유전자은행 수탁번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 갖는 β-글루쿠로니다제(GUS-1: GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)에 대한 식물 발현에 최적화된 합성 코딩 서열의 DNA 서열이다.

서열 번호 20은 "T-Os.Mth"로 도 1a 내지 도 1c에 제시된 3' UTR의 DNA 서열, T-Os.Mth-1:1:1이다.

서열 번호 21은 "P-FMV.35S"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 프로모터의 DNA 서열, P-FMV.35S-enh-1:1:2이다.

서열 번호 22는 "L-Ph.DnaK"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 리더 또는 5' UTR의 DNA 서열, L-Ph.DnaK-1:1:3이다.

서열 번호 23은 "nptII-2"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 DNA 서열, CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2이다.

서열 번호 24는 "T-AC139600"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 3' UTR의 DNA 서열, T-Mt.AC139600v16:1이다.

서열 번호 25는 "P-Gm.Sphas"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 프로모터의 DNA 서열, P-Gm.Sphas1:14이다.

서열 번호 26은 "L-Gm.Sphas"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 리더 또는 5' UTR의 DNA 서열, L-Gm.Sphas1-1:1:1이다.

서열 번호 27은 "GUS-2"로서 도 2a 내지 도 2c에 제시된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(유전자은행 수탁번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 갖는 β-글루쿠로니다제(GUS-2: GOI-GUS:1:2)에 대한 합성 코딩 서열의 DNA 서열이다.

서열 번호 28은 "T- AC145767"로 도 2a 내지 도 2c에 제시된 3' UTR의 DNA 서열, T-Mt.AC145767v28:3이다.

도 1a 내지 도 1c는 안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서의 서로의 발현에 대한 단일 벡터 스택에서의 2개의 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 데 있어서의 합성 유전자간 서열 영역("ISR")의 유효성을 분석하기 위해 사용된 벡터 스택의 도표적 표시이다. 도면에서의 참조 번호는 서열의 간단한 설명에 제시된 것처럼 각각의 유전 요소에 대한 상응하는 서열 식별자를 나타낸다. 도 1a는 인핸서가 없는 대조군인 대조군 벡터 스택에 대한 전이유전자 발현 카세트 구성을 보여준다. 인핸서가 없는 대조군은 다른 배향에서 클로닝된 2개의 전이유전자 발현 카세트로 이루어진다. 제1 전이유전자 카세트는 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Os.Act1:67(서열 번호 11), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ta.Lhcb1:1(서열 번호 12), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Os.Act1-1:1:19(서열 번호 13), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(서열 번호 14), T-Ta.Hsp17-1:1:1(서열 번호 15)로 이루어진다. 제1 전이유전자 카세트에 대한 다른 방향에서 클로닝된 제2 전이유전자 카세트는 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Zm.39486-1:1:1(서열 번호 16), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L- Zm.39486-1:1:1(서열 번호 17), GUS-1을 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Zm.DnaK:1(서열 번호 18), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1(서열 번호 19), T-Os.Mth-1:1:1(서열 번호 20)로 이루어진다. 도 1b는 인핸서를 갖는 대조군인 대조군 벡터 스택에 대한 전이유전자 발현 카세트 구성을 보여준다. 인핸서를 갖는 대조군은 강한 인핸서, 프로모터에 5' 작동 가능하게 연결된 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 유래된 특이적 인핸서 영역의 탠덤 반복부를 포함하는 E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1(서열 번호 10), 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Os.Act1:67(서열 번호 11), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ta.Lhcb1:1(서열 번호 12), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Os.Act1-1:1:19(서열 번호 13), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(서열 번호 14), T-Ta.Hsp17-1:1:1(서열 번호 15)로 이루어진다. 제1 전이유전자 카세트에 대한 다른 방향에서 클로닝된 제2 전이유전자 카세트는 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Zm.39486-1:1:1(서열 번호 16), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L- Zm.39486-1:1:1(서열 번호 17), GUS-1을 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Zm.DnaK:1(서열 번호 18), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1(서열 번호 19), T-Os.Mth-1:1:1(서열 번호 20)로 이루어진다. 도 1a에서의 인핸서를 갖는 대조군은 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 ISR이 결여된다. 그 결과, 제1 전이유전자 발현 카세트로부터의 인핸서는 제2 전이유전자 발현 카세트에서의 종자-특이적 프로모터와 상호작용하고 이의 발현을 변경하여서, 제2 발현 전이유전자 카세트의 발현을 종자-특이적으로부터 구성적으로 변경한다. 도 1c에서, ISR은 인핸서를 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 클로닝된다. ISR이 효과적이면, 이것은 제2 발현 전이유전자 카세트에서의 프로모터의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 인핸서의 상호작용을 감소시켜서, 인핸서를 갖는 대조군에 대한 비종자 조직에서의 발현을 감소시킬 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 안정하게 형질전환된 대두 식물에서의 서로의 발현에 대한 단일 벡터 스택에서의 2개의 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 데 있어서의 ISR의 유효성을 분석하기 위해 사용된 벡터 스택의 도표적 표시이다. 도면에서의 참조 번호는 서열의 간단한 설명에 제시된 것처럼 각각의 유전 요소에 대한 상응하는 서열 식별자를 나타낸다. 도 2a는 인핸서가 없는 대조군인 대조군 벡터 스택에 대한 전이유전자 발현 카세트 구성을 보여준다. 인핸서가 없는 대조군(도 2a)은 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Gm.Sphas1:14(서열 번호 25), GUS-2를 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Gm.Sphas1-1:1:1(서열 번호 26), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-GUS:1:2(서열 번호 27), T-Mt.AC145767v28:3(서열 번호 28)로 이루어진다. 종자-특이적 프로모터는 주로 인핸서가 없는 대조군에서 대두 식물의 종자에서 GUS 발현을 추진할 수 있다. 도 2b는 인핸서를 갖는 대조군인 대조군 벡터 스택에 대한 전이유전자 발현 카세트 구성을 보여준다. 인핸서를 갖는 대조군은 다른 배향에서 2개의 전이유전자 발현 카세트로 이루어진다. 제1 전이유전자 카세트는 재배열되고 중복된 인핸서를 갖는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 유래된 강한 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-FMV.35S-enh-1:1:2(서열 번호 21), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ph.DnaK-1:1:3(서열 번호 22), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2(서열 번호 23), T-Mt.AC139600v16:1(서열 번호 24)로 이루어진다. 제1 전이유전자 카세트에 대한 다른 방향에서 클로닝된 제2 전이유전자 카세트는 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Gm.Sphas1:14(서열 번호 25), GUS-2를 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Gm.Sphas1-1:1:1(서열 번호 26), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-GUS:1:2(서열 번호 27), T-Mt.AC145767v28:3(서열 번호 28)로 이루어진다. 인핸서를 갖는 대조군은 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 ISR이 결여된다. 그 결과, 제2 전이유전자 발현 카세트에서의 종자-특이적 프로모터 발현은 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 인핸서 영역에 의해 영향을 받아서, 제2 발현 전이유전자 카세트의 발현을 종자-특이적으로부터 구성적으로 변경한다. 도 2c에서, ISR은 인핸서를 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 클로닝된다. ISR이 효과적이면, 이것은 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 인핸서 영역과 제2 전이유전자 발현 카세트에서의 프로모터의 상호작용을 감소시켜서, 인핸서를 갖는 대조군에 비해 비종자 조직에서의 발현을 감소시킬 것이다.

본 발명은 형질전환 식물에서 사용하기 위한 신규의 합성 유전자간 서열 영역 또는 ISR을 제공한다. 이 신규의 합성 ISR의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로 제공된다. 이 합성 ISR은 제1 전이유전자 카세트와 제2 전이유전자 사이에 삽입될 때 형질전환 식물 에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 발현 요소의 상호작용을 감소시킨다. 본 발명은 또한 ISR을 포함하는 형질전환 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 본 발명은 또한 ISR을 사용하고 ISR을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.

하기 정의 및 방법은 본 발명을 더 잘 한정하고 본 발명의 실행 시 당업자를 지도하도록 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 당업자에 의해 종래의 용법에 따라 이해되어야 한다.

ISR 및 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용

본원에 사용된 것과 같이, "상호작용"이라는 용어는, 소정의 실시형태에서 벡터 스택을 사용하여 형질전환된, 형질전환 식물에서 서로에 인접하여 제공될 때 제2 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 하나 초과의 요소의 효과를 지칭한다.

각각의 전이유전자 발현 카세트 내의 조절 요소는 전이유전자의 전사를 가져오는 트랜스 작용 인자에 의해 결합된 다양한 시스 요소로 이루어진다. 예를 들어, 식물 프로모터는 전사의 개시 및 전사의 효율에 필수적인 시스 요소로 이루어진다. 게다가, 식물 프로모터는 스트레스(ABRE 및 AB14), 병원균(W Box) 또는 광(GT1-모티프)과 같은 특정 자극에 반응하여 전사를 조절할 수 있는 다른 시스 요소 모티프로 대개 이루어진다. 다른 시스 요소는 조직-특이적 또는 조직-선호 발현을 제공할 수 있다(Porto et al. (2014) Plant Promoters: An Approach of Structure and Function. Mol. Biotechnol 56: 38-49). 예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터는 2개의 도메인으로 제조된 인핸서 영역을 포함한다. 도메인 A인 하류 도메인은 주로 뿌리에서 발현을 부여한다. as-1인 도메인 A 내의 22개의 염기 쌍 영역 내의 시스 요소는 주로 이 발현의 원인이다. 도메인 B인 상류 도메인은 잎 및 줄기의 대부분의 세포 유형뿐만 아니라 뿌리의 혈관 조직에서 발현을 부여한다(Benfey et al. (1990) Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development. The EMBO Journal, 9:1677-1684).

2개의 전이유전자 발현 카세트가 식물 게놈에서 서로에 인접할 때, 하나의 전이유전자 발현 카세트의 발현 요소가 다른 전이유전자 발현 카세트의 발현을 변경할 가능성이 있다. 형질전환 식물에서 하나의 전이유전자 발현 카세트와 인접한 전이유전자 발현 카세트의 "상호작용"은 인핸서를 갖는 대조군에 의해 실시예 2 및 실시예 3에서 입증된다.

"누출성"은 제2 발현 카세트의 발현 프로파일에 대한 제1 발현 카세트에서의 발현 요소의 상호작용에 의해 생긴 조직에서의 평균 발현 변화의 수준을 기재하도록 사용된 용어이다. 누출성은 인핸서를 갖는 대조군의 발현 프로파일을 (2개의 전이유전자 카세트 사이에 삽입된 ISR을 갖는 인핸서를 갖는 대조군으로 이루어진) ISR을 갖는 시험 벡터 스택의 발현 프로파일과 비교하여 결정된다. 인핸서를 갖는 대조군과 비교하여 인핸서가 없는 대조군의 누출성은 100%이다. ISR을 포함하는 작제물의 누출성은 인핸서 작제물을 갖는 대조군의 비표적 조직에서의 평균 GUS 발현에 의해 시험 작제물에서의 비표적 조직에서의 평균 GUS 발현을 나누고 100을 곱해 결정된다. 누출성의 퍼센트 감소는 100%로부터 퍼센트 누출성을 공제하여 결정된다.

"유전자간 서열 영역" 또는 "ISR"은 서로의 발현에 대한 이웃하는 형질전환 카세트에서의 발현 요소의 상호작용을 최소화하도록 설계된 합성 뉴클레오타이드 서열이다. 본원에 개시된 유전자간 서열 영역은 컴퓨터 설계되었고, 식물 세포를 형질전환하도록 사용된 벡터 스택에서 제2 전이유전자 발현 카세트에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시켜서 형질전환 식물에서 개별적으로 관찰될 때의 것으로서 각각의 전이유전자 발현 카세트의 발현 프로파일을 보존하는 능력에 대해 분석되었다.

"합성 뉴클레오타이드 서열" 또는 "인공 뉴클레오타이드 서열"은 자연에서 발생하는 것으로 공지되지 않거나 자연 발생하지 않는 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명의 유전자간 서열 영역 요소는 합성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 합성 뉴클레오타이드 서열은 자연 서열과 적은 상동성을 공유하거나 연장된 상동성을 공유하지 않는다. 이 맥락에서의 연장된 상동성은 일반적으로 인접한 서열의 약 25개의 뉴클레오타이드를 넘어 연장되는 100% 서열 동일성을 지칭한다.

실시예 2에서, 대조군 옥수수 식물은 다른 배향에서 2개의 전이유전자 발현 카세트로 이루어진 2개의 벡터 스택을 사용하여 형질전환되었다. 하나의 대조군 벡터 스택은 항생제 내성 유전자의 발현을 추진하는 쌀 액틴 하나의 프로모터(인핸서가 없는 대조군, 도 1a 참조)를 포함하는 제1 전이유전자 발현 카세트 및 GUS 발현을 추진하는 종자-선호 프로모터를 포함한 제2 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 이 벡터 스택에 의해 형질전환된 옥수수 식물은 GUS의 종자-선호 발현을 나타냈다. 다른 대조군 벡터 스택(인핸서를 갖는 대조군)은 항생제 내성 유전자의 발현을 추진하는 쌀 액틴 하나의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CaMV 35S로부터 유래된 강한 인핸서를 포함하는 제1 전이유전자 발현 카세트 및 GUS 발현을 추진하는 종자-선호 프로모터를 포함한 제2 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 인핸서를 갖는 대조군에 의해 형질전환된 옥수수 식물은 뿌리, 잎, 꽃밥, 실크 및 종자에서의 GUS 발현의 높은 수준을 나타냈다. 이와 같이, 인핸서를 갖는 대조군에서, 제1 전이유전자 발현 카세트 인핸서는 제2 발현 전이유전자 카세트의 발현 프로파일의 발현 패턴을 변형시켜서, 제2 발현 전이유전자 카세트의 발현을 종자-선호로부터 구성적으로 변경하였다.

컴퓨터에 의해 설계된 소정의 ISR은 도 1c에 입증된 것처럼 인핸서를 갖는 대조군의 제1 전이유전자 카세트와 제2 전이유전자 카세트 사이에 삽입되었다. ISR ISR4_중지(서열 번호 1), ISR89(서열 번호 2) 및 ISR97(서열 번호 5)이 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입될 때 제2 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴의 상호작용에서의 퍼센트 누출성은 각각 16%, 8% 및 6%였다. 이와 같이, 이 ISR은 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 각각 84%, 92% 및 94%만큼 감소시켰다.

실시예 3에서, 유사한 실험 설계는 대두에서 소정의 ISR의 유효성을 시험하도록 사용되었다. 인핸서를 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이의 ISR2(서열 번호 3), ISR4(서열 번호 4), ISR69(서열 번호 6)의 삽입은 각각 불과 3%, 4% 및 5% 누출성으로 제2 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴의 효과를 감소시켰다. 이는 각각 97%, 96% 및 95%만큼 제2 전이유전자 발현 카세트의 발현 패턴에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 발현 요소의 상호작용을 감소시켰다.

실시예에 입증된 것처럼, 모든 컴퓨터-설계된 유전자간 서열 영역은 상호작용을 감소시키는 데 효율적이 아니었다. 추가로, 심지어 상호작용을 감소시킨 ISR은 여러 정도로 이렇게 했다. 예를 들어, ISR88(서열 번호 7) 및 ISR86(서열 번호 8)은 오직 각각 61% 및 32%의 누출성으로 형질전환 옥수수 식물에서 각각 39% 및 68%만큼 상호작용을 감소시켰다. 이 상호작용 감소는 ISR4_중지에 대한 84%, ISR89에 대한 92% 및 ISR97에 대한 94%와 비교할 때 훨씬 적었다. 마찬가지로, 형질전환 대두에서 ISR_X(서열 번호 9)는 오직 ISR2에 대한 97%, ISR4에 대한 96% 및 ISR69에 대한 95%와 비교하여 76%(퍼센트 누출성, 24%)만큼 상호작용을 감소시켰다. 이와 같이, 각각의 컴퓨터 설계된 ISR은 고유하고, 상이한 ISR은 하나 초과의 관심 유전자에 대한 원하는 발현 프로파일에 도달하도록 상이한 발현 카세트와 함께 사용될 수 있다.

DNA 분자

본원에 사용된 것과 같이, "DNA" 또는 "DNA 분자"라는 용어는 5'(상류) 말단으로부터 3'(하류) 말단으로 판독된 게놈 기원 또는 합성 기원의 이중-가닥 DNA 분자, 즉 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 DNA 분자의 중합체를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이, "DNA 서열"이라는 용어는 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 명명법은 미국 연방 규정집(United States Code of Federal Regulations) § 1.822의 타이틀 37의 것에 상응하고, WIPO 표준 ST.25(1998), 부록 2, 표 1 및 표 3에서의 표에 기재되어 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "이종성 분자"는 인간 중재 없이 자연에서 함께 발생하지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 분자이다. 예를 들면, 이종성 분자는 서로와 관련하여 이종성인 적어도 2개의 DNA 분자로 이루어진 DNA 분자, 자연에 존재하는 DNA 서열로부터 벗어난 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 합성 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 유전 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA로 도입된 DNA 분자일 수 있다.

본원에서 "단리된 DNA 분자" 또는 동등한 용어 또는 구절의 언급은 DNA 분자가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 존재하지만 이의 자연 환경 내에 있지 않는 것이라는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 유기체의 게놈의 DNA 내에 자연 발견되는 코딩 서열, 인트론 서열, 비번역된 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 및 기타와 같은 핵산 요소는 그 요소가 유기체의 게놈 내에 있고 이것이 자연에서 발견된 게놈 내의 위치에 있는 한 "단리"되는 것으로 여겨지지 않는다. 그러나, 이들 요소의 각각 및 이 요소의 하위부분은 그 요소가 유기체의 게놈 내에 없고 이것이 자연에서 발견된 게놈 내의 위치에 있는 한 본 개시내용의 범위 내에 "단리"될 것이다. 유사하게, 살충성 단백질 또는 그 단백질의 임의의 자연 발생 살충성 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열이 단백질을 암호화하는 서열이 자연에서 발견된 박테리아의 DNA 내에 있지 않는 한 단리된 뉴클레오타이드 서열일 것이다. 자연에서 발생하는 살충성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 합성 뉴클레오타이드 서열은 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 여겨질 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 형질전환 뉴클레오타이드 서열, 즉 식물 또는 박테리아의 세포의 게놈으로 삽입되거나 염색체외 벡터에 존재하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은 이것이 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 세포를 형질전환하도록 사용된 플라스미드 또는 유사한 구조 내에 존재하든, 또는 조직, 자손, 식물 또는 박테리아로부터 유래된 생물학적 샘플 또는 원재료 제품에 검출 가능한 양으로 존재하든 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 여겨질 것이다.

본원에 사용된 것과 같이, "서열 동일성"이라는 용어는 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개의 최적으로 정렬된 폴리펩타이드 서열이 동일한 정도를 지칭한다. 최적 서열 정렬은 적절한 내부 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 갭과의 서열 정렬에서의 뉴클레오타이드 일치의 수를 최대화하도록 2개의 서열, 예를 들어 기준 서열 및 다른 서열을 수동 정렬하여 생성된다. 본원에 사용된 것과 같이, "기준 서열"이라는 용어는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로서 제공된 DNA 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같이, "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성" 또는 "% 동일성"이라는 용어는 동일성 분율에 100을 곱한 것이다. 기준 서열과 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분율"은 기준 서열에서의 뉴클레오타이드의 총 수, 예를 들어 전체 기준 서열의 전체 길이에서의 뉴클레오타이드의 총 수로 나눈 최적 정렬에서의 뉴클레오타이드 일치의 수이다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시형태는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로 본원에 제공된 기준 서열에 대해 최적으로 정렬될 때 기준 서열과 적어도 약 85%의 동일성, 적어도 약 86%의 동일성, 적어도 약 87%의 동일성, 적어도 약 88%의 동일성, 적어도 약 89%의 동일성, 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 91%의 동일성, 적어도 약 92%의 동일성, 적어도 약 93%의 동일성, 적어도 약 94%의 동일성, 적어도 약 95%의 동일성, 적어도 약 96%의 동일성, 적어도 약 97%의 동일성, 적어도 약 98%의 동일성, 적어도 약 99%의 동일성 또는 적어도 약 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 주어진 퍼센트 동일성을 갖는 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 일반적인 기능을 유지하고, 즉 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 동일한 또는 유사한 능력을 나타낸다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 주어진 퍼센트 동일성을 갖는 서열은 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 것과 관련하여 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 활성을 갖는다.

조절 요소

프로모터, 리더(5' UTR로도 공지됨), 인핸서, 인트론 및 전사 종결 영역(또는 3' UTR)과 같은 조절 요소는 살아 있는 세포에서 유전자의 전체 발현에서 통합 부분을 맡는다. 본원에 사용된 것과 같이, "조절 요소"라는 용어는 유전자-조절 활성을 갖는 DNA 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이, "유전자-조절 활성"이라는 용어는 예를 들면 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미쳐서 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미치는 능력을 지칭한다. 식물에서 작용하는 프로모터, 리더, 인핸서, 인트론 및 3' UTR과 같은 조절 요소는 유전 조작을 통해 식물 표현형을 변형시키는 데 유용하다.

조절 요소는 이의 유전자 발현 패턴, 예를 들어 구성적 발현 또는 시간적, 공간적, 발생적, 조직, 환경, 생리학적, 병리학적, 세포 주기 및/또는 화학적으로 반응성인 발현, 및 임의의 이들의 조합과 같은 양성 효과 및/또는 음성 효과뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 표시에 의해 규명될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "유전자 발현 패턴"은 전사된 RNA 분자로의 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 전사의 임의의 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 단백질 분자를 제조하도록 번역될 수 있거나, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 운반 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 마이크로RNA(miRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 기타와 같은 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자를 제공할 수있다.

본원에 사용된 것과 같이, "단백질 발현"이라는 용어는 단백질 분자로의 전사된 RNA 분자의 번역의 임의의 패턴이다. 단백질 발현은 이의 시간적, 공간적, 발생적 또는 형태학적 품질뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 표시에 의해 규명될 수 있다.

프로모터는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 조절 요소로서 유용하다. 본원에 사용된 것과 같이, "프로모터"라는 용어는 일반적으로 전사를 개시하도록 RNA 중합효소 II 및 트랜스-작용 전사 인자와 같은 다른 단백질의 인식 및 결합에서 관여된 DNA 분자를 지칭한다. 프로모터는 유전자의 게놈 카피의 5'비번역된 영역(5' UTR)으로부터 초기에 단리될 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 합성으로 제조되거나 조작된 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또한 키메라일 수 있다. 키메라 프로모터는 2개 초과의 이종성 DNA 분자의 융합을 통해 제조된다. 본 발명을 입증하는 데 유용한 프로모터는 서열 번호 11, 서열 번호 16, 서열 번호 21 및 서열 번호 25로서 제공된 프로모터 요소를 포함한다.

본원에 사용된 것과 같이, "리더"라는 용어는 유전자인 비번역된 5' 영역(5' UTR)으로부터 단리되고 일반적으로 전사 시작 부위(TSS)와 단백질 코딩 서열 시작 부위 사이의 뉴클레오타이드 분절로 정의된 DNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 리더는 합성으로 제조되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 이종성 프로모터 또는 이의 자연적 프로모터와 사용될 수 있다. 본 발명을 입증하는 데 유용한 리더는 서열 번호 12, 서열 번호 17, 서열 번호 22 및 서열 번호 26을 포함한다.

본원에 사용된 것과 같이, "인트론"이라는 용어는 유전자로부터 단리되거나 확인될 수 있고 일반적으로 번역 전에 메신저 RNA(mRNA) 가공 동안 슬라이싱된 영역으로서 정의될 수 있는 DNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 인트론은 합성으로 제조되거나 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 가져오는 인핸서 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 조절 요소로서 사용될 수 있다. 작제물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사 가능한 DNA 분자와 관련하여 이종성이거나 이종성이 아닐 수 있다. 본 발명을 입증하는 데 유용한 인트론은 서열 번호 13 및 서열 번호 18로서 제시된다.

본원에 사용된 것과 같이, "3' 전사 종결 분자", "3' 비번역된 영역" 또는 "3' UTR"이라는 용어는 mRNA 분자의 3' 부분의 비번역된 영역에 전사 동안 사용된 DNA 분자를 지칭한다. mRNA 분자의 3' 비번역된 영역은 polyA 꼬리로도 공지된 특이적 절단 및 3' 폴리아데닐화에 의해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 위치할 수 있고, 폴리아데닐화 신호 및 전사, mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. PolyA 꼬리는 mRNA 안정성 및 번역의 개시에서 작용하는 것으로 생각된다.

본원에 사용된 것과 같이, "인핸서" 또는 "인핸서 요소"라는 용어는 전체 발현 패턴의 양태를 부여하지만 전사를 유도하기 위해 보통 단독으로는 불충분한, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의, 시스-요소로도 공지된 시스-작용 조절 요소를 지칭한다. 프로모터와 달리, 인핸서 요소는 보통 전사 시작 부위(TSS) 또는 TATA 박스 또는 동등한 DNA 서열을 포함하지 않는다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 작동 가능하게 연결된 DNA 서열의 전사에 영향을 미치는 하나 초과의 인핸서 요소를 자연적으로 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 또한 유전자 발현의 전체 조절의 양태를 부여하는 키메라 프로모터 시스 요소를 제조하도록 프로모터에 융합될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, "변이체"라는 용어는 제1 DNA 분자와 조성이 유사하지만 동일하지 않은 제2 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 ISR 중 하나의 변이체는 약간 상이한 서열 조성을 가질 것이지만, 이것이 유래된 ISR과 동일한 방식으로 형질전환 식물에서의 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 능력을 유지할 것이다. 변이체는 상이한 제한 효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환 또는 삽입을 갖는 것과 같은 제1 DNA 분자의 더 짧거나 절두된 버전 또는 제1 DNA 분자의 변경된 버전일 수 있다. "변이체"는 또한 기준 서열의 하나 초과의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 ISR을 포함할 수 있고, 유도체 유전자간 서열 영역 요소는 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 더 많거나 더 적은 능력 또는 동등한 능력을 갖는다. 본 발명에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적인 기능, 즉 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 동일한 또는 유사한 능력을 여전히 유지하면서 원래의 ISR의 DNA 서열과 조성이 유사하지만 동일하지 않은 변이체를 생성하도록 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 변이체는 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 것과 관련하여 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 활성을 갖는다. 본 발명의 이러한 변이체의 제조는 본 개시내용의 견지에서 당해 분야의 일반 기술 내에 완전히 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

소정의 예에서, ISR의 변이체는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 단편일 수 있다. 서열 번호 1 내지 서열 번호 6의 단편은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 적어도 약 50개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 150개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 200개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 250개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 300개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 350개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 400개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 450개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 500개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 550개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 600개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 650개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 700개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 750개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 800개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 850개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 900개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 950개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1000개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1100개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1200개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1300개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1400개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1500개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1600개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1700개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1800개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 1900개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2000개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2100개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2200개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2300개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2400개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2500개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2600개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2700개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2800개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 2900개의 인접한 뉴클레오타이드, 적어도 약 3000개의 인접한 뉴클레오타이드, 또는 이것 초과를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 단편은 형질전환 식물에서 제2 전이유전자 카세트의 발현에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 영향을 감소시키는 것과 관련하여 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 활성을 갖는다.

작제물

본원에 사용된 것과 같이, "작제물"이라는 용어는 적어도 하나의 DNA 분자가 기능적으로 작동성인 방식으로 다른 DNA 분자에 연결된, 즉 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 게놈 통합 또는 자율 복제를 할 수 있는 임의의 원천으로부터 유래된 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자와 같은 임의의 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본원에 사용된 것과 같이, "벡터"라는 용어는 형질전환, 즉 숙주 세포로의 이종성 DNA 또는 RNA의 도입의 목적에 사용될 수 있는 임의의 작제물을 의미한다. "벡터 스택"은 형질전환을 위해 함께 적층된 2개 초과의 카세트로 이루어진 벡터이다. 벡터 스택에서의 2개 초과의 전이유전자 발현 카세트는 벡터 스택을 작제하기 위해 사용된 클로닝 또는 합성의 방법에 따라 대략 10개의 뉴클레오타이드 내지 대략 수백개의 뉴클레오타이드, 또는 수천개의 뉴클레오타이드, 또는 이것 초과만큼 적을 수 있는 DNA 서열의 단편에 의해 분리된다. 본원에 사용된 것과 같이, "발현 카세트"는 하나 초과의 조절 요소, 통상적으로 적어도 프로모터 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 전사 가능한 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같이, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 제2 DNA 분자에 연결된 제1 DNA 분자를 지칭하고, 여기서 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자는 제1 DNA 분자가 제2 DNA 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 DNA 분자는 단일의 인접한 DNA 분자의 일부일 수 있거나 아닐 수 있고, 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 전사 가능한 관심 DNA 분자의 전사를 조절하면 프로모터는 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 리더는 예를 들어 DNA 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있을 때 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다.

전사 가능한 DNA 분자가 단백질로서 번역되고 발현되는 기능적 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 세포로 작제물을 어셈블링하고 도입하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 실행을 위해, 작제물 및 숙주 세포를 제조하고 사용하기 위한 종래의 조성물 및 방법은 당업자에게 완전히 공지되어 있다. 고등 식물에서의 핵산의 발현에 성공적인 통상적인 벡터는 당해 분야에 완전히 공지되어 있고, 아그로박테륨 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드로부터 유래된 벡터 및 pCaMVCN 운반 대조군 벡터를 포함한다.

다양한 조절 요소는 임의의 본원에 제공된 것을 포함하여 작제물에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합되어 제공될 수 있다. 이러한 조합은 바람직한 조절 특징을 제조하도록 설계되거나 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물은 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 요소를 포함한다.

본 발명의 작제물은 본원에 제공되거나 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로모터는 열 쇼크 단백질 유전자로부터 유래된 것과 같은 이종성 비번역된 5' 리더에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 리더는 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 전사체 프로모터와 같은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.

전사 가능한 DNA 분자

본원에 사용된 것과 같이, "전사 가능한 DNA 분자"라는 용어는 비제한적인 예로서 단백질 코딩 서열을 갖는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 제조하는 것을 포함하는 RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 지칭한다. DNA 분자의 유형은 동일한 식물로부터의 DNA 분자, 다른 식물로부터의 DNA 분자, 상이한 유기체로부터의 DNA 분자, 또는 합성 DNA 분자, 예컨대 유전자의 안티센스 메세지를 함유하는 DNA 분자, 또는 전이유전자의 인공, 합성, 또는 달리 변형된 버젼을 암호화하는 DNA 분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 작제물로의 혼입을 위한 예시적인 전사 가능한 DNA 분자는 예를 들어 DNA 분자가 혼입된 종 이외의 종으로부터의 DNA 분자 또는 유전자, 또는 동일한 종으로부터 기원하거나 이것에 존재하지만, 전통적인 육종 기법보다는 유전 조작 방법에 의해 수혜자 세포로 혼입되는 유전자를 포함한다.

"전이유전자"는 현재의 또는 임의의 이전의 세포 생성에서 숙주 세포의 게놈으로 인공으로 혼입된 숙주 세포 게놈 및/또는 전사 가능한 DNA 분자에서의 적어도 이의 위치와 관련하여 숙주 세포에 이종성인 전사 가능한 DNA 분자를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 전이유전자는 식물에서 제초제 저항을 제공할 수 있는 유전자, 또는 식물에서 식물 해충 저항을 제공할 수 있는 유전자와 같은 농업적으로 관심 있는 유전자를 포함한다.

프로모터와 같은 조절 요소는 조절 요소와 관련하여 이종성인 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "이종성"이라는 용어는 이러한 조합이 자연에서 보통 발견되지 않을 때 2개 초과의 DNA 분자의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 DNA 분자는 상이한 종 유래일 수 있고/있거나, 2개의 DNA 분자는 상이한 유전자, 예를 들어 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 조절 요소는 이와 같이 이러한 조합이 자연에서 보통 발견되지 않으면, 즉 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 전사 가능한 DNA 분자가 자연에서 발생하지 않으면 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자와 관련하여 이종성이다.

본원에 사용된 것과 같이, "재조합 DNA 분자"는 인간 중재 없이 자연에서 함께 발생하지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 예를 들면, 재조합 DNA 분자는 서로와 관련하여 이종성인 적어도 2개의 DNA 분자로 이루어진 DNA 분자, 자연에 존재하는 DNA 서열과 다른 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 합성 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 유전 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA로 혼입된 DNA 분자일 수 있다.

전사 가능한 DNA 분자는 일반적으로 전사체의 발현이 원해지는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 전사체의 이러한 발현은 생성된 mRNA 분자의 번역 및 이에 따라 단백질 발현을 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 전사 가능한 DNA 분자는 궁극적으로 특이적 유전자 또는 단백질의 발현의 감소를 야기하도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 안티센스 방향으로 배향된 전사 가능한 DNA 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 이러한 안티센스 기술을 사용하는 것에 친숙하다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 음성으로 조절될 수 있고, 일 실시형태에서 전사 가능한 DNA 분자는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA 분자의 발현을 통한 특이적 유전자의 억제를 위해 설계될 수 있다.

선택 가능한 마커

선택 가능한 마커 전이유전자는 본 발명의 조절 요소와 또한 사용될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이, "선택 가능한 마커 전이유전자"라는 용어는 형질전환 식물, 조직 또는 세포에서의 발현 또는 이의 결여가 일부 방식으로 스크리닝되거나 점수화될 수 있는 임의의 전사 가능한 DNA 분자를 지칭한다. 본 발명의 실행에 사용하기 위한 선택 가능한 마커 유전자, 및 이의 연관된 선택 및 스크리닝 기법은 당해 분야에 공지되어 있고, β-글루쿠로니다제(GUS)를 암호화하는 전사 가능한 DNA 분자, 녹색 형광 단백질(GFP), 항생제 내성을 부여하는 단백질 및 제초제 관용성을 부여하는 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 선택 가능한 마커 전이유전자의 예는 서열 번호 18 및 서열 번호 26으로서 제공된다.

세포 형질전환

본 발명은 또한 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 하나 초과의 조절 요소를 포함하는 형질전환된 세포 및 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

"형질전환"이라는 용어는 수혜자 숙주로의 DNA 분자의 도입을 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이, "숙주"라는 용어는 박테리아, 진균 또는 식물의 임의의 세포, 조직, 기관 또는 자손을 포함하는 박테리아, 진균 또는 식물을 지칭한다. 특히 관심 있는 식물 조직 및 세포는 원형질체, 캘러스, 뿌리, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아 및 화분을 포함한다.

본원에 사용된 것과 같이, "형질전환된"이라는 용어는 작제물 또는 벡터 스택과 같은 외래 DNA 분자가 도입된 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 DNA 분자는 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수혜자 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 게놈 DNA으로 통합될 수 있다. "형질전환" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손 및 교배에서 부모로서 이러한 형질전환 유기체를 사용하고 외래 DNA 분자의 존재로부터 생긴 변경된 표현형을 나타내는 육종 프로그램으로부터 제조된 자손을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 분자는 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되지 않도록 수혜자 세포로 또한 일시적으로 도입될 수 있다. "형질전환"이라는 용어는 하나 초과의 이종성 DNA 분자를 함유하는 박테리아, 진균 또는 식물을 지칭한다.

DNA 분자를 식물 세포로 도입하기 위한 당업자에게 완전히 공지된 많은 방법이 있다. 그 과정은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 벡터로 형질전환하는 단계 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 실행에서 식물 작제물을 식물 게놈으로 도입함으로써 식물 세포를 형질전환하는 방법 및 재료는 임의의 완전히 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 다른 것들 중에서 박테리아 감염(예를 들어, 아그로박테륨), 2원 BAC 벡터, (예를 들어, PEG-매개된 형질전환, 건조/억제-매개된 DNA 유입, 전기천공, 탄화규소 섬유에 의한 교반 및 DNA 코팅된 입자의 가속화에 의한) DNA의 직접 전달 및 유전자 편집(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

숙주 세포는 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 진균, 박테리아 세포 또는 곤충 세포와 같은 임의의 세포 또는 유기체일 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 농작물로부터의 세포를 포함할 수 있다.

형질전환 식물은 후속하여 본 발명의 형질전환 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 종래의 육종 기법 또는 자가수분을 사용하여, 종자는 이 형질전환 식물로부터 제조될 수 있다. 이러한 종자 및 이러한 종자로부터 성장한 생성된 자손 식물은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유할 것이고, 따라서 형질전환일 것이다.

본 발명의 형질전환 식물은 본 발명의 동형접합성 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대한 동형접합성)에 대한 종자를 제공하도록 자가수분되거나 본 발명의 이형접합성 형질전환 식물(재조합 DNA 분자에 대한 이형접합성)에 대한 종자를 제공하도록 비형질전환 식물 또는 상이한 형질전환 식물과 교배될 수 있다. 이러한 동형접합성 식물 및 이형접합성 형질전환 식물 둘 다는 본원에서 "자손 식물"로 칭해진다. 자손 식물은 원래의 형질전환 식물로부터 유래되고 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물이다. 본 발명의 형질전환 식물을 사용하여 제조된 종자는 본 발명의 작제물을 포함하고 작물학적 관심 유전자를 발현하는 형질전환 식물, 즉 본 발명의 자손 식물의 세대를 성장시키도록 수확되고 사용될 수 있다. 상이한 농작물에 흔히 사용되는 육종 방법의 설명은 몇몇 참고 도서 중 하나에서 발견될 수 있고, 예를 들어 Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) 및 Crop Species Soybean (Vol.　2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)을 참고한다.

형질전환된 식물은 관심 유전자 또는 유전자들의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 프로파일에 대해 분석될 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석에 이용 가능한 많은 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석을 위한 방법은 사우던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근법, 생화학 분석, 표현형 스크리닝 방법, 실증 시험 및 면역진단 검정을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 전사 가능한 DNA 분자의 발현은 제조사에 의해 기재된 것과 같은 TaqMan®(Applied Biosystems, 캘리포니아주 포스터 시티) 시약 및 방법을 사용하여 측정될 수 있고, PCR 사이클 회차는 TaqMan® Testing Matrix를 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 제조사에 의해 기재된 것과 같은 Invader®(Third Wave Technologies, 위스콘신주) 시약 및 방법은 전이유전자 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 내배유, 배주 및 화분을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 식물 부분은 생존 가능, 생존 불가능, 재생 가능 및/또는 재생 불가능일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고 제공한다. 본 발명의 형질전환된 또는 형질전환 식물 세포는 재생 가능 식물 세포 및/또는 재생 불가능 식물 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물 또는 이의 부분으로부터 제조된 원재료 제품을 제공한다. 본 발명의 원재료 제품은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 함유하는 DNA의 검출 가능한 양을 함유한다. 본원에 사용된 것과 같이, "원재료 제품"은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 형질전환 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물 부분으로부터 유래된 재료로 이루어진 임의의 조성물 또는 생성물을 지칭한다. 원재료 제품은 가공 종자, 곡물, 식물 부분 및 굵은 가루를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 원재료 제품은 본 발명의 재조합 DNA 분자에 상응하는 DNA의 검출 가능한 양을 함유할 것이다. 샘플에서 이 DNA의 하나 초과의 검출은 원재료 제품의 함량 또는 원천을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 검출 방법을 포함하여 DNA 분자에 대한 검출의 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예의 참조를 통해 더 용이하게 이해될 수 있고, 이는 달리 규정되지 않는 한 예시의 방식으로 제공되고 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다. 하기 실시예에 개시된 기법이 본 발명의 실행에서 완전히 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타낸다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용의 견지에서 많은 변경이 개시된 구체적인 실시형태에서 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 비슷한 또는 유사한 결과를 여전히 얻고, 따라서 첨부된 도면에 기재되거나 도시된 모든 대상은 예시로서 해석되어야 하고 제한 의미로 있지 않는 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다.

실시예

실시예 1

유전자간 서열 영역 요소의 설계, 합성 및 클로닝

합성 유전자간 서열 영역 요소("ISR")는 알고리즘적 방법을 통해 컴퓨터에 의해 설계되었다. 각각의 ISR은 식물 게놈으로 삽입 후 원치 않는 단백질을 부적절하게 생성시키는 임의의 가능한 오픈 리딩 프레임(ORF: Open Reading Frame)을 함유하지 않도록 설계되었다. 게다가, 많은 ISR은 모든 6개의 리딩 프레임에서 중지 코돈을 제공하는 방식으로 배치된 ISR의 5'말단 및 3' 말단에서 중지 코돈을 함유하도록 설계되었다.

ISR은 설계되면 이종성 벡터 스택에서 전이유전자 발현 카세트 사이에 화학적으로 합성되고 클로닝되었다. 100개 훨씬 초과의 합성 유전자간 서열 영역 요소가 제1 전이유전자 카세트와 제2 전이유전자 카세트의 상호작용을 감소시킨 합성 ISR을 확인하도록 안정하게 형질전환된 옥수수 및 대두 식물에서 설계되고 분석되었다.

소정의 설계되고 시험된 ISR은 표 1에 제시된다. ISR4_중지는 ISR4의 변이체이고, 여기서 중지 코돈은 ISR4의 3' 말단 및 5'말단에 부착되었다.

서열 번호 1 내지 서열 번호 6으로서 제시된 합성 유전자간 서열 영역 요소는 실시예 2 및 실시예 3에 제시된 것처럼 안정하게 형질전환된 옥수수 및 대두 식물에서 벡터 스택에서 제2 전이유전자 카세트에 대한 제1 전이유전자 카세트의 상호작용을 감소시키는 능력을 입증하였다.

실시예 2

안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서의 ISR4_중지, ISR89 및 ISR97에 의한 전이유전자 발현 카세트 상호작용의 감소

이 실시예는 옥수수 식물을 안정하게 형질전환하도록 사용된 벡터 스택의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입될 때 전이유전자 발현 카세트 상호작용을 감소시키는 ISR ISR4_중지, ISR89 및 ISR97의 능력을 입증한다.

옥수수 식물은 전이유전자 발현 카세트 상호작용을 감소시키는 ISR의 능력을 평가하도록 2개의 전이유전자 발현 카세트 사이에 ISR과 다른 배향으로 2개의 전이유전자 발현 카세트를 포함하는 2원 식물 형질전환 벡터 스택에 의해 형질전환되었다. 2개의 대조군 벡터 스택은 또한 옥수수 식물로 형질전환되고 시험되었다.

하나의 대조군 벡터 스택(도 1a, 인핸서가 없는 대조군)은 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Os.Act1:67(서열 번호 11), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ta.Lhcb1:1(서열 번호 12), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Os.Act1-1:1:19(서열 번호 13), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(서열 번호 14), T-Ta.Hsp17-1:1:1(서열 번호 15)을 포함하는 제1 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 제1 전이유전자 발현 카세트에 대한 다른 배향으로 클로닝된 제2 전이유전자 발현 카세트는 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Zm.39486-1:1:1(서열 번호 16), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L- Zm.39486-1:1:1(서열 번호 17), GUS-1을 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Zm.DnaK:1(서열 번호 18), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1(서열 번호 19), T-Os.Mth-1:1:1(서열 번호 20)을 포함하였다. 인핸서 벡터 스택이 없는 대조군은 글리포세이트 선택을 사용하여 형질전환된 세포의 선택에 사용된 추가의 전이유전자 발현 카세트를 또한 포함하였다.

다른 대조군 벡터 스택(도 1b, 인핸서를 갖는 대조군)은 강한 인핸서, 프로모터에 5' 작동 가능하게 연결된 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 유래된 특이적 인핸서 영역의 탠덤 반복부를 포함하는 E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1(서열 번호 10), 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Os.Act1:67(서열 번호 11), 인트론에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ta.Lhcb1:1(서열 번호 12), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 I-Os.Act1-1:1:19(서열 번호 13), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3(서열 번호 14), T-Ta.Hsp17-1:1:1(서열 번호 15)을 포함하는 제1 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 제1 전이유전자 발현 카세트에 대한 다른 배향으로 클로닝된 제2 전이유전자 발현 카세트는 종자-특이적 프로모터를 포함하였고, 상기 기재된 것처럼 동일한 전이유전자 발현 카세트였다. 인핸서 벡터 스택을 갖는 대조군은 글리포세이트 선택을 사용하여 형질전환된 세포의 선택에 사용된 추가의 전이유전자 발현 카세트를 또한 포함하였다.

제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이의 상호작용을 감소시키는 데 있어서의 ISR의 유효성을 분석하기 위해, ISR ISR4_중지(서열 번호 1), ISR89(서열 번호 2), ISR97(서열 번호 5), ISR88(서열 번호 7) 및 ISR86(서열 번호 8)은 도 1c에 도시된 것처럼 인핸서 벡터 스택을 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 클로닝되었다. 품종 LH244 옥수수 식물 세포는 2개의 대조군 벡터 스택 및 ISR을 포함하는 5개의 벡터 스택에 의해 당해 분야에 공지된 것과 유사한 아그로박테륨 매개된 형질전환 방법을 사용하여 형질전환되었다. 형질전환된 식물 세포는 전체 식물을 형성하도록 유도되었다.

정성적 및 정량적 GUS 분석은 형질전환된 식물에서 선택된 식물 기관 및 조직에서 발현 요소 활성을 평가하도록 사용되었다. 조직화학적 염색에 의한 GUS 발현의 정성적 분석을 위해, 전조직-표본 또는 절편화된 조직을 37℃에서 5시간 동안 1 mg/mL의 X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로나이드)를 함유하는 GUS 염색 용액과 항온처리하고, 35% EtOH 및 50% 아세트산으로 탈염색하였다. GUS의 발현은 절제 또는 화합물 현미경 하에 청색 착색처리를 위해 선택된 식물 기관 또는 조직의 시각적 조사에 의해 정성적으로 결정되었다. 효소 검정에 의한 GUS 발현의 정량적 분석을 위해, 형질전환된 옥수수 식물의 선택된 조직으로부터 총 단백질을 추출하였다. 1 내지 2 마이크로그램의 총 단백질을 50 마이크로리터의 총 반응 용적에서 1 mM 농도로 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(MUG)인 형광원 기질과 항온처리하였다. 37℃에서 1시간 항온처리 후, 350 마이크로리터의 200 mM 중탄산나트륨 용액을 첨가하여 반응이 중단되었다. 4-메틸움벨리페론(4-MU)인 반응 생성물은 높은 pH에서 최대로 형광이고, 여기서 하이드록실 기가 이온화된다. 염기성 탄산나트륨 용액의 첨가는 형광 생성물 4-MU를 정량화하기 위해 동시에 검정을 중단하고 pH를 조정한다. FLUOstar Omega Microplate Reader(BMG LABTECH)(355 nm에서의 여기, 460 nm에서의 방출)를 사용하여 형광을 측정하여 형성된 4-MU의 양이 추정되었다. GUS 활성 값은 4-MU /시간/mg 총 단백질의 nmole로 제공된다.

하기 조직은 R₀ 세대에서 GUS 발현에 대해 샘플링되었다: 수분 후 21일(DAP)에 V3 단계 잎 및 뿌리; V7 단계 잎 및 뿌리; VT 단계 잎, 뿌리, 및 꽃밥 및 실크; 및 R3 단계 종자 배아 및 종자 내배유. 표 2는 식물생장, 생식 및 종자 조직에서의 평균 GUS 발현을 나타내고, 여기서 "bdl"은 GUS 발현이 검출 수준보다 낮다는 것을 나타낸다. 표 3은 식물생장 및 생식 조직에서의 평균 GUS 발현을 나타낸다. 인핸서를 갖는 대조군은 제1 전이유전자 발현 카세트 인핸서와 제2 전이유전자 발현 카세트의 종자-특이적 프로모터의 전체 상호작용을 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서, 제1 전이유전자 발현 카세트의 강한 구성적 인핸서에 의해 영향을 받는 종자-특이적 프로모터인 P-Zm.39486-1:1:1에 의해 추진된 GUS 카세트로부터의 평균 식물생장 및 생식 조직 발현은 100%의 누출성을 나타낸다. ISR을 포함하는 벡터 스택의 퍼센트 누출성은 인핸서를 갖는 대조군의 식물생장 및 생식 조직에서의 평균 GUS 발현에 의해 ISR을 포함하는 작제물에 의해 형질전환된 식물의 식물생장 및 생식 조직에서의 평균 GUS 발현을 나누고 그 결과에 100을 곱해 결정되었다.

표 2에서 볼 수 있는 것처럼, 인핸서를 갖는 대조군은 인핸서가 없는 대조군과 비교할 때 안정하게 형질전환된 옥수수 식물의 모든 조직에서의 높은 GUS 발현을 입증하였다. 이는 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 강한 인핸서가 제2 전이유전자 발현 카세트의 종자-특이적 발현 패턴을 더 구성적인 발현 패턴으로 변형시켰다는 것을 입증한다.

표 2에 기재된 것처럼, 제2 전이유전자 발현 카세트에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트에서의 강한 인핸서의 상호작용은 ISR ISR4_중지, ISR89 및 ISR97이 카세트들 사이에 삽입될 때 감소하였다. ISR4_중지, ISR89 및 ISR97를 갖는 벡터 스택에서의 식물생장 및 생식 조직의 평균 GUS 발현은 인핸서 벡터를 갖는 대조군의 것보다 훨씬 낮았다. ISR4_중지, ISR89 및 ISR97의 퍼센트 누출성은 각각 16%, 8% 및 6%여서, 2개의 전이유전자 발현 카세트 사이의 상호작용에서의 각각 84%, 92% 및 94%만큼의 감소를 제공한다. 비교하면, ISR88 및 ISR86은 훨씬 더 누출이지만(각각 61% 및 32%), 2개의 전이유전자 발현 카세트 사이의 상호작용을 각각 39% 및 68%만큼 오직 감소시켰다.

ISR4_중지(서열 번호 1), ISR89(서열 번호 2) 및 ISR97(서열 번호 5)은 안정하게 형질전환된 옥수수 식물에서 벡터 스택에서 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 능력을 입증하였다.

실시예 3

안정하게 형질전환된 대두 식물에서의 ISR2 및 ISR4에 의한 전이유전자 발현 카세트 상호작용의 감소

이 실시예는 대두 식물을 안정하게 형질전환하도록 사용된 벡터 스택의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입될 때 전이유전자 발현 카세트 상호작용을 감소시키는 유전자간 서열 영역 요소, ISR2 및 ISR4의 능력을 입증한다.

대두 식물은 전이유전자 발현 카세트 상호작용을 감소시키는 ISR의 능력을 평가하도록 2개의 전이유전자 발현 카세트 사이에 ISR과 다른 배향으로 2개의 전이유전자 발현 카세트를 포함하는 2원 식물 형질전환 벡터 스택에 의해 형질전환되었다. 2개의 대조군 벡터 스택은 또한 대두 식물로 형질전환되고 시험되었다.

하나의 대조군 벡터 스택(도 2a, 인핸서가 없는 대조군)은 종자-특이적 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-Gm.Sphas1:14(서열 번호 25), GUS-2를 암호화하는 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Gm.Sphas1-1:1:1(서열 번호 26), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 GOI-GUS:1:2(서열 번호 27), T-Mt.AC145767v28:3(서열 번호 28)로 이루어진 단일 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 인핸서 벡터 스택이 없는 대조군은 항생제 선택을 사용하여 형질전환된 세포의 선택에 사용된 추가의 전이유전자 발현 카세트를 또한 포함하였다.

다른 대조군 벡터 스택(도 2b, 인핸서를 갖는 대조군)은 다른 배향으로 2개의 전이유전자 발현 카세트를 포함하였다. 제1 전이유전자 카세트는 재배열되고 중복된 인핸서를 갖는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 유래된 강한 프로모터, 리더에 5' 작동 가능하게 연결된 P-FMV.35S-enh-1:1:2(서열 번호 21), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 코딩 서열에 5' 작동 가능하게 연결된 L-Ph.DnaK-1:1:3(서열 번호 22), 3' UTR에 5' 작동 가능하게 연결된 CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2(서열 번호 23), T-Mt.AC139600v16:1(서열 번호 24)을 포함하였다. 제2 전이유전자 발현 카세트는 상기 기재된 종자-특이적 전이유전자 발현 카세트와 동일하였다. 인핸서 벡터 스택을 갖는 대조군은 항생제 선택을 사용하여 형질전환된 세포의 선택에 사용된 추가의 전이유전자 발현 카세트를 또한 포함하였다.

제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이의 상호작용을 감소시키는 데 있어서의 ISR의 유효성을 분석하기 위해, ISR ISR2(서열 번호 3), ISR4(서열 번호 2), ISR69(서열 번호 6) 및 ISR_X(서열 번호 8)는 도 2c에 도시된 것처럼 인핸서 벡터 스택을 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 클로닝되었다. 품종 A3555 대두 식물 세포는 인핸서가 없는 대조군, 인핸서를 갖는 대조군, 및 ISR을 포함하는 3개의 벡터 스택에 의해 당해 분야에 공지된 것과 유사한 아그로박테륨-매개된 형질전환 방법을 사용하여 형질전환되었다. 형질전환된 식물 세포는 전체 식물을 형성하도록 유도되었다.

정성적 및 정량적 GUS 분석은 이전에 실시예 2에 기재된 것처럼 수행되었다. 하기 조직은 R₀ 세대에서 GUS 발현에 대해 샘플링되었다: Vn5 뿌리, Vn5 침하 잎, Vn5 근원 잎, R1 근원 잎, R1 잎자루, R1 꽃, R3 미숙 종자, R3 꼬투리, R5 떡잎, 황색 꼬투리(YP) 배아 및 황색 꼬투리(YP) 떡잎.

인핸서를 갖는 대조군은 제1 전이유전자 발현 카세트 인핸서와 제2 전이유전자 발현 카세트의 종자-특이적 프로모터의 전체 상호작용을 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서, 제1 전이유전자 발현 카세트의 강한 구성적 인핸서에 의해 영향을 받는 종자-특이적 프로모터인 P-Gm.Sphas1:14에 의해 추진된 GUS 카세트로부터의 평균 식물생장 및 생식 조직 발현은 100%의 누출성을 나타낸다. ISR을 포함하는 작제물의 퍼센트 누출성은 인핸서를 갖는 대조군의 Vn5, R1 및 R3 조직의 평균 GUS 발현에 의해 ISR을 포함하는 작제물에 의해 형질전환된 식물의 Vn5, R1 및 R3 조직에서의 평균 GUS 발현을 나누고 그 결과에 100을 곱해 결정되었다.

Vn5, R1 및 R3 조직의 평균 GUS 발현은 표 4에 제시되어 있고, 여기서 "nd"는 결정되지 않음을 나타낸다. R5 및 황색 꼬투리 조직의 평균 GUS 발현, 평균 Vn5, R1 및 R3 조직 발현 및 퍼센트 누출성은 표 5에 제시되어 있다.

표 4에서 볼 수 있는 것처럼, 인핸서가 없는 대조군에 의해 형질전환된 식물에서 Vn5, R1 및 R3 조직에서 매우 적은 GUS 발현이 관찰된다. 인핸서를 갖는 대조군에 의해 형질전환된 식물은 구성적 발현 패턴을 입증하고, 높은 GUS 발현이 Vn5, R1 및 R3 조직에서 관찰된다. 마찬가지로, 표 5에서 볼 수 있는 것처럼, 인핸서가 없는 대조군에 의해 형질전환된 식물은 P-Gm.Sphas1:14의 공지된 종자-특이적 발현 패턴과 일치하는 황색 꼬투리 배아 및 떡잎에서의 높은 GUS 발현을 오직 나타낸다. 매우 적은 발현은 R5 떡잎에서 관찰되고, 여기서 발현은 R3 미숙 종자에 비해 약간 증가하는 것으로 보인다. 인핸서를 갖는 대조군에 의해 형질전환된 식물은 R5 떡잎에서의 높은 발현 수준 및 인핸서가 없는 대조군에 의해 형질전환된 식물에 비해 황색 꼬투리 배아 및 떡잎에서의 증가를 나타낸다. 이와 같이, 인핸서를 갖는 대조군의 제1 전이유전자 발현 카세트의 P-FMV.35S-enh-1:1:2 프로모터에 포함된 강한 인핸서는 제2 전이유전자 발현 카세트의 P-Gm.Sphas1:14의 종자-특이적 발현과 상호작용하고 이를 구성적 발현 패턴으로 변경하였다.

표 5에서 입증된 것처럼, 유전자간 서열 영역 ISR2, ISR4 및 ISR69는 인핸서 구성을 갖는 대조군의 제2 전이유전자 발현 카세트에 대한 제1 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 각각 97%, 96% 및 95%만큼 감소시킬 수 있었다(불과 3%, 4% 및 5% 누출하였음). ISR_X는 인핸서 구성을 갖는 대조군의 제2 전이유전자 발현 카세트에서의 제1 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 데 있어서 그렇게 효과적이지 않았고, 24%의 누출성을 나타냈다. ISR_X는 오직 ISR2, ISR4 및 ISR69에 대한 97%, 96%, 95%와 비교하여 76%만큼 상호작용을 감소시켰다.

ISR2(서열 번호 3), ISR4(서열 번호 4) 및 ISR69(서열 번호 6)는 안정하게 형질전환된 대두 식물에서의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키는 능력을 나타냈다.

본 발명의 원칙이 예시되고 기재되어 있지만, 이러한 원칙을 벗어나지 않으면서 본 발명이 배열 및 상세내용이 변형될 수 있다는 것이 당업자에게 명확해야 한다. 본 발명자들은 본 청구항의 정신 및 범위 내에 있는 모든 변형을 청구한다. 본원에 인용된 모든 공보 및 공개 특허 문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> NOVEL INTERGENIC SEQUENCE REGIONS AND USES THEREOF <130> MONS:472WO <150> US 62/875,752 <151> 2019-07-18 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1219 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR4_Stop. <400> 1 ttagttagtt agcgtcagcc cctccaaggt ggatcaagac tgcaccggca agcagtgtag 60 tctctctttc tagatttggc aaagtcactt gtcggagcgg tgtgatcgca cgctttagcg 120 cggcgagagc gtcctcgcga gttatcccca ggctcgccaa ggcccgtgtt gcgcgtatca 180 agaatcttag agttcgactg ctgttcacag aggagctaag gagattggac cgtgccgctg 240 aacagccaga tccaccgggg gctccggacc taagctgcta aagatttcgc aagcggaatc 300 cgccaaatct atacagatcc gaaccagaca ggcgactacg ccgttgatca ggggtgaagt 360 tacttactat cggatctatc gtcgcaagga gagacggttt ctggaaacgg cccactcacg 420 tctgctggtc tacacgggtc ttaaatatcg gatagaatcg cttatccgcg gcttctagca 480 agcagagaga acaacgtctt ctttcgcgcc cgtgcgactt caataaattg cgagcaattg 540 cccgtagccc aaaaataaaa atcgatcagg ctaccagaac 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accgtaccgc 960 cactcacggg gcgtcttgaa cgtccgtacc ccgactccgc agattaagtg cactagttag 1020 ttaa 1024 <210> 3 <211> 1195 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR2. <400> 3 aacgtaatcg tatcgatcgt ttactagatc tggcaccgaa aggaccgcca agctcagttc 60 ttgaattgtg atacccccgc tcctagccca gtacgggttt cgagacacgt cagatccttt 120 aacggcaaat ataatcggtt actgaactgc tgtctattgg ggatatcgac actcaatcac 180 cgcacgcggg atcaacctat ttggctgctg agttgtcgca cgggtctctc ccttcctctt 240 atagcgagga ttgtatcgct ccttttgccg gtgctttacg aaagaccttg cagctgttaa 300 gacttcttcg tgatagggtc ccctaaaaga agactatctt gtttccgttc ccccaactca 360 gtaaacgagg cactcaccag gaggcaggtt gtacgtcaac gttagcgcgt cttaggggca 420 gactttacgg taacttctcc gcaccctggt cacgtcctgg gcctaaagga aagcccgccc 480 aacggggctt taaatccgag tccaaggaaa actctgggta cagatacaga ctttaagtaa 540 agcttcgatc actccttgaa tacggaggat acgaactgtc cgccttattg aagagaggtg 600 gcagcgaggt atccgacttt ggcgccggct accgtatcaa gaaggccgcc tttaggatag 660 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gattggaccg tgccgctgaa cagccagatc 240 caccgggggc tccggaccta agctgctaaa gatttcgcaa gcggaatccg ccaaatctat 300 acagatccga accagacagg cgactacgcc gttgatcagg ggtgaagtta cttactatcg 360 gatctatcgt cgcaaggaga gacggtttct ggaaacggcc cactcacgtc tgctggtcta 420 cacgggtctt aaatatcgga tagaatcgct tatccgcggc ttctagcaag cagagagaac 480 aacgtcttct ttcgcgcccg tgcgacttca ataaattgcg agcaattgcc cgtagcccaa 540 aaataaaaat cgatcaggct accagaacga tcaggcaggt acttatattg taatcaaggg 600 aaattttaac gagttccgac aaggtggaag ccagattgta tcacttaagg cttctgcttc 660 caactactta ccctcaccac cacttacgct tcacctcaag aagtaacttc gtggttctgt 720 acgccggaga gctgctcggt aattaacgac taggaccagc ggagccttag ctttagagat 780 cacttgaact acaccacttt cgactgggaa gtagcaggca gccttctctc cgcgggtaac 840 gtcgaatctg ctgatcggcg tgcagctggc cttaaatctg aactcgtccg cctttttctg 900 ttgaccaaga gtggaaaaag tggcccgctc tttttaaatc agcgtgactt cgcgaaactc 960 cttcgttctg tgaagggtgt ggcttttgct tagacctaac gctcgccgtg gtacgcttcg 1020 gaacacctgc ggggtcgatt cgatctccag gtcgagttca gctcagtaaa ggtttatatc 1080 accgtaaagt ctgagccgtc cgactgagca caaattaaca cagtattacg acagggagta 1140 ttacaataga tttgcagcgc gggaccctct cagatcaacg gttgtacacg ataat 1195 <210> 5 <211> 3024 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR97. <400> 5 ctagctagct aaatcaaagc cgtaaggttt ggcgccgaca attgtgcggc agctggccgc 60 agaggggacg cgcgaaggga caccacgtaa gtcaagggac cggcaagttc agtgaggcgt 120 caagcttctg gagagttgtt ttcacgtaag cgttgcggag ccggcctcag ttgccagcgt 180 tgaggacgcc accggaaatc gcctggaaat cggcgcgtgt atcactgaaa ggctagcctc 240 aggcggtact taaatcgccc ccgagcttcg gtccacgggg tgttcttcac gtacggggtt 300 cagacctcag cgtggtccac gggccaggga cgttaagcta tcccggtcct aggcggaagg 360 gacggttccg cctcaattga aggcgaggcc gcacggttga ccgacggccc cccagattga 420 caggcttcgt ctaaactttg cgacttcctc gagccctgtc agttgtagca gaggcaggct 480 ctgtcgttgg tcctccctac cggacgggct ccggcttcac ggtgagtaac tggaaacggt 540 ggggggggcc tcgatagatc gtaccagacg ttacagtgga tcttcgcaca ctactgattc 600 agtgaagtac gttccgcccc ggctggtcgc gtacgatctt tgacgtcagc actagagccc 660 aagcttgaag ggcgacgtgc gtctggtatt tagggctgtg ttggggtgct ctggagcaag 720 gaggtcacaa agagatcttc cagggtccta cgccgggtta gccgcgttgc taactctaat 780 tggcgagccc cccgagaggt gtttatagct gaatatcagc agtcggccgc caactgaacc 840 agactactgc gaaattttta agtccttaga tcagcgaaca gccaacgctc cgttgggcac 900 agccccttgt ccggtagtgc cctcacctag caggcgcccc gtgacccctt ggcgataacg 960 aacagctgcc cacaccgtcg tagacctttc tcactggccg ccacctgaac ctagcttctg 1020 cgagtggctc tgtgctctag acctctcgca cgtttaaccc ggcagtgtgg cagaaggctc 1080 ggctaccagc tagcggtgat ttgggtaacc gacgtacagc acgtcagaca ccacggataa 1140 gccccaaata atatccaagg ggcggccaat cgccgcgaac ttactcccta ccgcctgagc 1200 ctggtcggtt gcacggacgc gaagacacta cgcgcctacc cgcaacgtgg caactacagc 1260 gagtgtcaat aatagtgcgg gccgcgggag ttcgtgtata ttaagcggac ccccctcttc 1320 tagtgcacac ccctagccac tcagggcgga cgccgcctgc cgggatacgt ctaccaccgc 1380 gtgttcgccc ctctaacacc acctagaact tgccggagag ggagggggtc cagggagtga 1440 cgaagtcaac accactcctc ttgtctccgt cccttggctc cagcgaccga gtcgattgga 1500 aggttagagg gtagtgcgga tcccgtgctt tgaacggccg acgccctcac gatactctag 1560 cctagaccaa cctacggctg ctcaggcgct tgggcagtgg ccgtgggtcc gatcggccaa 1620 aggggatagc ctccaggcgg tcttcccccc ttgactgtgt tcgcgcgctc tacgacgtag 1680 acgcaatcta ctggtccctg gcgctgcgag gctagttcca gaaactactg tttacaaata 1740 gggtccctcc tgtcgatcgt agcttgacga cgcctctgcc gcccgtagcg tactggaagg 1800 agggagtgct agagtaaccg tggcggcgtg cctagcgaat cccgattcga gcgcgacccg 1860 gttgtgtgaa aaagactaag atcgggactt agcacgtatc agtaggtttc tacccgaagt 1920 gccgttttac cacgcaggga acttggcggt atccccgctc cttgcacacg tcgtctagcc 1980 tagctgcggt tcgttctcag ggctgggccg tttaatcttg cgcggagggg actcctggat 2040 ccagggggtc ggcggcaagg gggcaccaga tccgaagatc tagacggccg tcggtagcgt 2100 aattacgcag gggatccgtc agttggtagt cctagataac acttgttggg gtggcgtagt 2160 tctggccccg gttcctgacg tgcaaagttt acccgcccgg ggccgaccac gttttataca 2220 ggcgtttgtt gtttagtgca atcctatcca ggatccgctc ccgcgttcgg ctacaggcac 2280 cccacagtta aacggcacct gtgttagacc ttgggcggcg gcgctctacg gcgacccgtg 2340 ctacaagggt tagcggtcgc gctccgacga tccggtggct caagagacga gggcagcgtg 2400 tgtgaaagag tcactagtgg tggccccgcg acttaaacgt ccgcacaggt ggatcctaaa 2460 tcttacgcgg cccgccccga cctagccctg gttcgggaga gtgtactttg attgcaagca 2520 gggcgccacg tcagatcgtc ctgtagcctc gcccttatcg caattttgag tgcacggtta 2580 ggcccccgga gaatcaccta ataccccgaa agagccctgt gaccgcttgg ccaccgtcgt 2640 agaactggga tccgacgcac gggcgaaagc gagggaggat acactgtcgg gggtaagacc 2700 cacctaaact aacacccgct caccgctgtt tcgtgccccc gactcttgcc tggacgcaat 2760 aactgggacc gggagtcaaa ctcttactcg ggacggtcga ccgcgtaggc ggacagcaca 2820 gtaacagtta ggctagctga cagagcaagc agccgaactg gtaagacctt gctctattcg 2880 gagcctggac ctggctgttg cggtgtgtgt caccgggtgt aacagtaacg gagtctcaag 2940 ggcgacctgc taaaggtcta tctacgcggt aagcgggttt ctgtcggtta agcgcagcac 3000 cgcttgttct agttagttag ttag 3024 <210> 6 <211> 1035 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR69. <400> 6 cgcgccttag ttagctaggt ggttcgtagt ttaagcactc ctagtggact gattattccg 60 tcctttcaga cggtcagcct taccgagagg cctctccaaa tagcagacac agtatatacg 120 ttaaaaagac cgcgtagtgg tgctgcctga caggcgaagg tcaaagggac ggcccctatc 180 gattataaaa gccctcagtg cacgaggcgg aggtacaagg tcccacagtt gtcgtcccct 240 gcagcctctt ggacgcctag cgcctcgtga tagctagcag ctgaggggtt acgggccgtg 300 atattccgac tataccacta gtctgcggcc tctgatcacg ccttgctgca atctatcggt 360 taaaccagag cttctttgct cactgagggg atacctcaaa tacctaaaag atcccagtgg 420 aggtggttag ttctgcacaa gataccgata cgccggttct tgccctcgcg tcgctaatcc 480 caaattagga tcagggattg agtttggccg ccgggtcctc gtgaacaggg atcgtcgttt 540 ccttcaggga agccaccctg atttactctg gggggccgat tagggtgacg ctcgccacca 600 atagcgtacc gggagtgctc tcactttccc gcacaagcac actggttacg atctagccta 660 cggagtcgct ccttttcaag tgggagggtg cttcttcttt aaccgcgact aacgaagctc 720 agcttgttgt ttcacccggt ttacttccca gtaccagtat ttaatagctt agagttgaat 780 ctcaattaaa agtcagggga ggaacctcac gagaaggacg attacacgtg aagctagtac 840 gcgcgataca cgtagttcac gctagatcgt tgtatagacg caatataccg gaccttacac 900 tctttttccc tgagtgctaa aagaccgcag tctaatctcc actcgaatcc aaagcggtca 960 ggtggctaag tggcctcgat cggtggacag gagtaaagca ctgtcgatca cagtgctgtt 1020 agctaactag ggtac 1035 <210> 7 <211> 1024 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR88. <400> 7 ttagctagtt aatccgggcc ctgattcgcc cctagtgctc ctcaaactct tcaaagaggg 60 ctgcgagggt ggtatacttt ggtagcaaca gggtgcttgg gcagcaaggt ccccctagga 120 gaggttcctt ttgataatag attttaggac tttacgcgcg cgcaattccg cgcaggcttg 180 cgggcactaa acgccgtacc gtgggctcgc gcggggtagc gggtgggcgc tgatcacggt 240 aagacttgcc gggtgatacc gggcaagagg ttcagagaag atacgttttc ctccctcagg 300 acaaatattc ttgcccacca gctgcggacg ggcctgctac tccgaaggac ctaggacgtc 360 gtgtagtaca ggggctccgt ttgtccctgt aggttcaagt ccttagtgcg gaaggtggtg 420 gcgaaggagt gccgtttcgg ggctgctggc tgaggtggag ttggtgtgcg cccgttaata 480 ccccggccga ctgactactg gtagggacaa ttcgcaaacg gacgcactac tactaacacg 540 gaggcagagc gaccaccgtg agggtccaca cccgagggct cgttcgacta cgcacgtcac 600 agagacggac gctcgggctc ggcctcaata gcgctgtgca gcgtacagcc ctctgtttaa 660 tacaggccta acgcgtcaag accggaaccc ctttcgacta ctgtgaagag cgccttcggg 720 cccccgtttg gccacaactt cacaaccgcc ccctgacgga atactaattc gcttggtccc 780 taaaggctag cgagcccaag gacctatcac taggggacgg cgctcgtggc cttagattcc 840 ctgaggcgcc ccttcctcag cgagtcggcc tgtgtcggtc ccccgattcg agtaaccacg 900 caaggcgtac aagcgcctaa cttgagccgc tcaccgaggt ccttaagacc ctagaaacgg 960 cttcccaaac ctgcgtctta agtctgacgc ccctagcgga ccacgacggc agttagctag 1020 ctag 1024 <210> 8 <211> 1024 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR86. <400> 8 ttaactaact aatagcaaac ccccgcacca gcaaacttag aggaaacagt caacggatct 60 aggcacaaaa aactcagatc gacagaggga atcgaggcga atcgtagtgg actagtgcta 120 ctgtctgtat acaaggatta tttgtgctct gggtgaagcg ttccgcgttt ccttcggcgg 180 ttgagaggcg ggaatcccga taaacgctga gattaagata gccctagtag gggatcgtcg 240 tcacgttatc gaaccgcccg gtccctctat ttcttcactg cctagccggt agttcgaagt 300 gacccttact tgcccagaga taataagctc tgctgggcct tcttattgca atcaggcgta 360 attgtgtatc cgtcccacgc aactatattt aaacgtgacg tccctcccta gaaagtaagg 420 cctacgattt tatcccgaac gggtcggatt ggggaaggtg cgcttttggt ctaccttctg 480 ggatcactat caccttggtc cgtacccgta agcgctgctt tgtattttag tacggcgcta 540 tagaccgcta taagaatcgc tctgcttccc ccaagtcaac taaactagac gaaaggatca 600 gctgggtaat cctggacgtc taggatcttt gttcgttcaa gtattacgca gggcggatcc 660 acagtacctg taaacaaggc cgttccgtcc ctaagccgtt ttaatcctca ggctagtaca 720 ggcacgttac tgctgtagtt ttgggtgtgc cgcgacggag aacagtccgc acgggtagcg 780 ctgcggcgcg ggacgagttt aacctactgt gcaatcgcag tgcagtgccg tagcactatc 840 gtccgttaga accacagtaa gtcaaactag ccttccgagg ttcaccactc gtggctttca 900 ggcaccaaac cggtagaatt tttgccagcg agccgctaaa gaatccactc aagccagatt 960 aaaaattata attcgaggag gccagtgtac gtggactccg tggtattagg tgttagctag 1020 ctaa 1024 <210> 9 <211> 1219 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an Intergenic Sequence Region or ISR, ISR_X. <400> 9 ttagttagtt agcgtaaggc ccgcccaggt ggtgctagac tccgccccta gcaagtgttc 60 gctgtcttgc tagttttggc gacgtgactt ctctgagcgg agctatctta cgaaaaacgc 120 cgccctgagt gtgctcacag gatagctcca cggaggagaa cgctcgtgta ccgctttaga 180 tcactctgag ggagtgtctc ctagtgacac gggagcttag cggaaccctg cgagccccag 240 atcagaaaga ttcaccgcga gctctgatcg ttaggtgcta aaggaatcgc aagcccaatc 300 ccgcaatcct attcaaatcc aaaggaggca caagacccca ccctagattt gaggtaaagt 360 tcgtaacgat ctgatatctt gccgcaagga gtggttctgt ttggtaatcg aatcctcaag 420 tcttcagttc acctcaggtc ttaagtctcg tcttgattag gctgtccgtc gtcccgaaca 480 aggacggtat acccgttctt gtataggtac agtccgcctc actaaaattg cctgtaattg 540 cgaataacgg aataattaaa atagatcacg ctaaggaaac gctcacaccg gtccttctat 600 tggagtctcg gtgatttttg gcgtccgcgg acaacctact agccagttag ttccccgtaa 660 cgataccgtg tcctaggagt tagcctgggc agcctttacc ctttaccacc tgaggcttct 720 taagactaca gattgtctcg aagctgatcg gttctaatcg accaatacta ccggagcgtc 780 ggttggacag atcacctcca gaacacctct accctctggc tcccagcagg tagcttagtg 840 cccacgggtt aagtgtaaat tgcttatcgg cgtggtgctg gcctgtaacc tgtccaagac 900 ctcgcgtatc cgaacactaa gcgtgtaaaa agtgcggcgt tgctgatata tcaaagcaac 960 ttggcgtagc gccttcgttc agtaaaggca gtccctgttt cttcgaggac tccaccgaaa 1020 gcgcgcgcta cggagctaga gcggcgtagg atcgtaatcc acgctcagtg agcgaaagta 1080 tttgtatata gcacggtcca gccagtttag ttctacctat ccctaatcaa caccgtattt 1140 taccaccaac ccttgtcaga gtattcaaca cgtagactct cgccgatcaa cggtagtcca 1200 ccaaacttta gttagttag 1219 <210> 10 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of an enhancer, E-CaMV.35S.2xA1-B3-1:1:1. <400> 10 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 60 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 120 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgaggcctc atcgttgaag 180 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 240 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 300 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cga 333 <210> 11 <211> 840 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(840) <223> DNA sequence of a promoter, P-Os.Act1:67. <400> 11 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 60 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 120 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 180 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 240 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 300 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 360 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 420 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 480 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 540 aagcccagcc caacccaacc caacccaacc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 600 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 660 aaaaaaagaa agaaaaaaaa gaaaaagaaa aaacagcagg tgggtccggg tcgtgggggc 720 cggaaacgcg aggaggatcg cgagccagcg acgaggccgg ccctccctcc gcttccaaag 780 aaacgccccc catcgccact atatacatac ccccccctct cctcccatcc ccccaaccct 840 <210> 12 <211> 61 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(61) <223> DNA sequence of a leader or 5' UTR, L-Ta.Lhcb1:1. <400> 12 aaccatcttc cacacactca agccacacta ttggagaaca cacagggaca acacaccata 60 a 61 <210> 13 <211> 480 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(480) <223> DNA sequence of an intron, I-Os.Act1-1:1:19. <400> 13 ccgccgccgc cggtaaccac cccgcccctc tcctctttct ttctccgttt ttttttccgt 60 ctcggtctcg atctttggcc ttggtagttt gggtgggcga gaggcggctt cgtgcgcgcc 120 cagatcggtg cgcgggaggg gcgggatctc gcggctgggg ctctcgccgg cgtggatccg 180 gcccggatct cgcggggaat ggggctctcg gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg 240 ggagatgatg gggggtttaa aatttccgcc gtgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa 300 gggcactatg gtttatattt ttatatattt ctgctgcttc gtcaggctta gatgtgctag 360 atctttcttt cttctttttg tgggtagaat ttgaatccct cagcattgtt catcggtagt 420 ttttcttttc atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagaag 480 <210> 14 <211> 795 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(795) <223> DNA sequence encoding neomycin phosphotransferase, CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:3. <400> 14 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac gcatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 15 <211> 210 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(210) <223> DNA sequence of a 3' UTR, T-Ta.Hsp17-1:1:1. <400> 15 ctgcatgcgt ttggacgtat gctcattcag gttggagcca atttggttga tgtgtgtgcg 60 agttcttgcg agtctgatga gacatctctg tattgtgttt ctttccccag tgttttctgt 120 acttgtgtaa tcggctaatc gccaacagat tcggcgatga ataaatgaga aataaattgt 180 tctgattttg agtgcaaaaa aaaaggaatt 210 <210> 16 <211> 1456 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1456) <223> DNA sequence of a promoter, P-Zm.39486-1:1:1. <400> 16 tgtttggact ccagaaaatt tacgggagtt ggtggagcag gtcattaagt actataaaaa 60 atcatgtagc tgaagctgca agtatttaga agacatttag ataagttatt ttatttatca 120 tttagattaa gaaaatttaa aactatttaa attgatatta taaactacag ctccacactg 180 gagctagatc ctggagtcat tacaaacacc cccttaatgg gaaaagagaa gataatgtat 240 atctaattat tgtttctgtg tcacctatag ctattagttc aaaacttcat aatcactggt 300 acaaataagc tctagagagg cggttcggaa cccattttta ttgttgtttt tcaaaaccac 360 tagtgttagg gaccgccagt ggaaactgaa acgccattgg aaattgattt tcactgatgg 420 tgagctaaga aaaccgccat tggtaatcct ttgcagaaaa cataaactag gttttaaaaa 480 tagtaaacaa atatttttat taggagaggc cccacatagt cgcaccattt ttcgcgcatt 540 attcacgcgc tacgcaacca atggtaattg aacctcagag acttcactct tgtgtagcct 600 cctttgccac tccactaaac acttacttgt gtcttgattg cattttgttg cccacatatt 660 agaacaaaca gagtgtaaat tgattgtttg aggctgtaaa caaattcaaa tgaaaaagta 720 gtcaactact aaattgaata attgtttatg ttctaccact tttattttgg tacttttccc 780 atcggaggcg gtttgtaaaa tttgcatttt aagttttaca aatttcaatg aaattttgag 840 agcccaaatg atttcaaata aaaaagttgt caactacaat gttttataac ttttaatttg 900 gtggtttttt aaacaagctc atttgaaaaa ctaaaatgat cgattctaca tgatttttag 960 gtcgattttt taaggaatcg cctgtacaaa tatttctact gacagttttt aagaaaccac 1020 ctgtggaaat catagatttg tactagcggt ttttctcaag taactgctag tagaaatatg 1080 gtggttttct taagaaaact gtttgtagga atgcacgatt tatataaatg gatttgttaa 1140 gaaaaccgct agtggaatgt tctttcaact aacggttatt gagtcgtgac agccaattta 1200 atttccttga taactaaaag cggctgtaaa aattagacca tgatgtaggc acggagctgt 1260 tttgtactga atgcgcccac tgttttgttg gaaaagtgca tgtacttatt attcattctg 1320 tttatttcta gctggcattc agttcttaca gccacagatt atgcaaaacg cctatttctg 1380 ccagcaaatt tacaggaaaa gtcatggact tttccgggtt attttcctat aagtacagcc 1440 attcctttca cttaca 1456 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> DNA sequence of a leader or 5' UTR, L- Zm.39486-1:1:1. <400> 17 ggccccaaca ttagcacaaa gaacacaata gaccactgat ttaaca 46 <210> 18 <211> 804 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> misc_feature <222> (1)..(804) <223> DNA sequence of an intron, I-Zm.DnaK:1. <400> 18 accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60 tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120 atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180 ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240 tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300 gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360 gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420 tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480 acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540 cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600 tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660 ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720 cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780 cattgtaatg cagataccaa gcgg 804 <210> 19 <211> 2001 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of synthetic coding sequence optimized for plant expression for beta-glucuronidase, GUS-1: GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1. <400> 19 atggtgaggc ccgttgagac cccgactagg gagatcaaga agctggacgg cctctgggcc 60 ttctccctcg accgtgagaa ctgcggcatc gaccagcgct ggtgggagtc cgccctccag 120 gagtctaggg ccatcgccgt gcccggttcc ttcaacgacc agttcgccga cgccgacatc 180 cgcaactacg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaggtgt tcatcccgaa gggctgggcg 240 ggccagcgca tcgtgctccg cttcgacgcc gtgacccact acggcaaggt ctgggtgaac 300 aatcaggagg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta 360 gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt 420 gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca 480 aaatttgttg atgtgcaggt gatggagcac cagggcggtt acaccccgtt cgaggccgac 540 gtgacgccgt acgtgatcgc cgggaagtcc gtccgcatca ccgtctgcgt gaacaatgag 600 ctgaactggc agaccatccc gcctggcatg gtcatcaccg acgagaacgg caagaagaag 660 cagtcctact tccacgactt cttcaactac gctggcatcc accgctccgt gatgctctac 720 accactccca acacctgggt ggacgacatc accgtggtca cccacgtggc ccaggactgc 780 aaccacgcct ccgtggactg gcaagtcgtt gccaacggcg acgtcagcgt cgagctgcgc 840 gacgccgacc agcaagtcgt tgccaccggc cagggcacca gcggcaccct ccaagtcgtc 900 aaccctcacc tctggcagcc tggcgagggc tacctctacg agctgtgcgt caccgccaag 960 agccagactg agtgcgacat ctaccctctc cgcgtcggca tcaggagcgt cgctgtcaag 1020 ggcgagcagt tcctcatcaa ccacaagcct ttctacttca ctggtttcgg ccgccacgag 1080 gacgctgacc tgaggggcaa gggtttcgac aacgtcctga tggtccacga ccacgctctg 1140 atggactgga tcggtgccaa cagctacagg accagtcact acccgtacgc tgaggagatg 1200 ctggactggg ctgacgagca cggtatcgtc gtgatcgacg agactgctgc ggtcggtttc 1260 aacctgtctc tgggcattgg tttcgaggct gggaacaagc cgaaggagct gtactctgag 1320 gaagctgtca acggcgagac tcagcaagct catctccagg cgattaagga gctgattgcc 1380 agggacaaga accatccgtc tgtcgtgatg tggtctattg cgaatgagcc ggacaccaga 1440 ccgcaagggg cgcgtgaata cttcgcgccg ctggcggagg cgactcgcaa actggaccca 1500 acccgtccaa tcacgtgcgt caatgtcatg ttctgcgacg cccatacgga tacgatctcg 1560 gacctgttcg atgttctttg tctcaatcgg tactatgggt ggtatgttca gagcggggat 1620 cttgagacgg cggagaaggt tcttgagaag gaactcctgg cgtggcaaga gaagctccat 1680 cagccgatca ttatcacgga gtacggggtt gacacacttg cgggccttca cagtatgtac 1740 acagatatgt ggtcggagga ataccagtgt gcatggttgg atatgtacca tcgtgtcttc 1800 gaccgggttt cagcggttgt cggcgaacaa gtctggaact tcgcagactt cgccacgagc 1860 caagggatac tgcgggtagg agggaacaag aagggaatct tcacacggga tcggaagccc 1920 aagtcagcag ccttcctgtt gcagaagcga tggacaggaa tgaacttcgg agaaaagcca 1980 cagcaaggcg gaaagcagtg a 2001 <210> 20 <211> 300 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(300) <223> DNA sequence of a 3' UTR, T-Os.Mth-1:1:1. <400> 20 ggccaaggcg atctatgact gaattgccaa tgcaccagcc tgtctacatg atgaataaat 60 aaagagtcca tccagtgtga tggctcatgc ctgtgtgagt gtgactgaat ccatcagtgt 120 gtgtgtgtgt ttgtgtcaac catgtgtgaa tcaggtgtca aaaatcgtgg ctggaaatcc 180 atgtggtttc tagctttatg taaatgttgt ttgtgaaata taaatattgt tttgtgtatg 240 tgaattttac tctctcattt ttctcttgca ctcaccattc tattatagta atttttttaa 300 <210> 21 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of a promoter, P-FMV.35S-enh-1:1:2. <400> 21 aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60 agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120 tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180 ttgaaagtaa tcttgtcaac atcgagcagc tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240 ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300 cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagctgt cctgacagcc 360 cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 420 gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta cgagccatat cactttattc 480 aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540 tctcagtcca aagcctcaac aaggtcaggg tacagagtct ccaaaccatt agccaaaagc 600 tacaggagat caatgaagaa tcttcaatca aagtaaacta ctgttccagc acatgcatca 660 tggtcagtaa gtttcagaaa aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg ggcatctttg 720 aaagtaatct tgtcaacatc gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa aaggaatggt 780 gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa gataaagcag 840 attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct gacagcccac 900 tcactaatgc gtatgacgaa cgcagtgacg accacaaaag aattccctct atataagaag 960 gcattcattc ccatttgaag g 981 <210> 22 <211> 96 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <220> <221> misc_feature <222> (1)..(96) <223> DNA sequence of a leader or 5' UTR, L-Ph.DnaK-1:1:3. <400> 22 cagaaaaatt tgctacattg tttcacaaac ttcaaatatt attcatttat ttgtcagctt 60 tcaaactctt tgtttcttgt ttgttgattg agaata 96 <210> 23 <211> 795 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(795) <223> DNA sequence encoding neomycin phosphotransferase, CR-Ec.nptII-Tn5-1:1:2. <400> 23 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 24 <211> 500 <212> DNA <213> Medicago truncatula <220> <221> misc_feature <222> (1)..(500) <223> DNA sequence of a 3' UTR, T-Mt.AC139600v16:1. <400> 24 gcatgaataa tcaagctcat aaatttcatg gctttgaatt tgtactattt tggttactag 60 aaagtgtatt tgtgtgttta tgcagtaata aatctctaag agatatatgt ttgttatttt 120 ttataattat ccaaaaaatc gttaatgttg aaaattgatt caaaattgat attgaagttc 180 tgaaaaaatc gtggcgtgat taaaaatcca aactttttta taaaataata ttgtgtctat 240 atcttttata aatgacgata aatgggataa agtaaatgaa acaaaaccgt taatgcaatg 300 ttcatctgca caatatatat aattaaaaaa cattataaaa ccttgtttct tcactcattt 360 acaatcttga aattttagtc tttaccattt gaaagtacaa tcttttcatg aaagtttata 420 gtacaaatca agagtttgga taagctgctc tgctttttat aatcactggg aaatgattta 480 tgacttggaa aaacaacttg 500 <210> 25 <211> 828 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (1)..(828) <223> DNA sequence of a promoter, P-Gm.Sphas1:14. <400> 25 ggcaaaaaca tttaattcgt attatttaag aaaaaaatat gtaataatat atttatattt 60 taatatctat tcttatgtat tttttaaaaa tctattatat attgatcaac taaaatattt 120 ttatatctac acttattttg catttttatc aattttcttg cgttttttgg catatttaat 180 aatgactatt ctttaataat caatcattat tcttacatgg tacatattgt tggaaccata 240 tgaagtgtcc attgcatttg actatgtgga tagtgttttg atccaggcct ccatttgccg 300 cttattaaat aatttggtaa cagtccgtac taatcagtta cttatccttc ctccatcata 360 attaatcttg gtagtctcga atgccacaac actgactagt ctcttggatc ataagaaaaa 420 gccaaggaac aaaagaagac aaaacacaat gagagtatcc tttgcatagc aatgtctaag 480 ttcataaaat tcaaacaaaa acgcaatcac acacagtgga catcacttat ccactagctg 540 atcaggatcg ccgcgtcaag aaaaaaaaac tggaccccaa aagccatgca caacaacacg 600 tactcacaaa ggtgtcaatc gagcagccca aaacattcac caactcaacc catcatgagc 660 ccacacattt gttgtttcta acccaacctc aaactcgtat tctcttccgc cacctcattt 720 ttgtttattt caacacccgt caaactgcat gccaccccgt ggccaaatgt ccatgcatgt 780 taacaagacc tatgactata aatatctgca atctcggccc aggttttc 828 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> DNA sequence of a leader or 5' UTR, L-Gm.Sphas1-1:1:1. <400> 26 atcatcaaga acc 13 <210> 27 <211> 2001 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence of synthetic coding sequence for beta-glucuronidase, GUS-2: GOI-GUS:1:2. <400> 27 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtaggtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420 taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480 gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540 ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600 ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660 cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720 accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780 aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840 gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900 aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960 agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020 ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080 gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140 atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200 ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260 aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320 gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380 cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440 ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500 acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560 gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620 ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680 cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740 accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800 gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860 caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920 aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980 cagcagggag gcaaacaatg a 2001 <210> 28 <211> 499 <212> DNA <213> Medicago truncatula <220> <221> misc_feature <222> (1)..(499) <223> DNA sequence of a 3' UTR, T-Mt.AC145767v28:3. <400> 28 taatcatctg aaactgttca ccatgcatgc aatcttgtga aatatatggt tttaattaga 60 cttcaatctt atgttggcta ttgtactaat aaaagcatgt catgttattt tcatttgatt 120 ttatctgtac tttggtttgt ttgaagaata aagatgagct tgctatgcat gcatgcatgc 180 catcgattat cagggtttcc ttttttcttt tctggcttcc catcaatttg gtgtgaatta 240 gtgtgtgtga tatattatat tatgctattt atgaaataaa ttgttggtta tatttgatct 300 acaatctaca tacatgtgat ttttatcaac aaaatatctc gggaaacaat acctttttgg 360 tagcaaaatt caaataatac tattttaaat aaatcaaagt taaccaatac cttattcaag 420 ttggagggga ctcaaacaag caaaagaatt caagttgtta atgaacttcg gttaatgata 480 aaagaattcg catttaaaa 499

Claims (15)

1. 재조합 DNA 분자로서,
   a. 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 서열; 및
   b. 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는 서열
   로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, DNA 서열은 벡터 스택에서 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트 사이에 삽입된, 재조합 DNA 분자.
3. 제1항에 있어서, DNA 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 DNA 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는, 재조합 DNA 분자.
4. 제1항에 있어서, DNA 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 DNA 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는, 재조합 DNA 분자.
5. 제1항에 있어서, DNA 서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
6. 형질전환 식물 세포로서, 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 세포.
7. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물 세포는 외떡잎 식물 세포인, 형질전환 식물 세포.
8. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물 세포는 쌍떡잎 식물 세포인, 형질전환 식물 세포.
9. 형질전환 식물 또는 이의 부분으로서, 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환 식물 또는 이의 부분.
10. 제8항의 형질전환 식물의 자손 식물 또는 이의 부분으로서, 자손 식물 또는 이의 부분은 재조합 DNA 분자를 포함하는 자손 식물 또는 이의 부분.
11. 형질전환 종자로서, 종자는 제1항의 재조합 분자를 포함하는 형질전환 종자.
12. 원재료 제품(commodity product)을 제조하는 방법으로서, 제8항에 따른 형질전환 식물 또는 이의 부분을 수득하는 단계 및 이로부터의 원재료 제품을 제조하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제11항에 있어서, 원재료 제품은 종자, 가공 종자, 농축 단백질, 분리 단백질, 전분, 곡물, 식물 부분, 종자유, 바이오매스, 밀가루 및 굵은 가루(meal)인, 방법.
14. 벡터 스택에 의해 형질전환된 형질전환 식물 내의 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트의 상호작용을 감소시키기 위한 방법으로서,
    상기 방법은 식물 세포를
    a. 제1 전이유전자 발현 카세트;
    b. 제2 전이유전자 카세트;
    c. 제1항의 재조합 DNA 분자이되, DNA 분자는 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입된, 재조합 DNA 분자
    를 포함하는 이종성 DNA(T-DNA)를 포함하는 벡터 스택에 의해 형질전환하는 단계; 및
    d. 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생하는 단계
    를 포함하는 방법.
15. 제13항에 있어서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 것의 DNA 분자는 벡터 스택 내에 제1 전이유전자 발현 카세트와 제2 전이유전자 발현 카세트 사이에 삽입된, 방법.

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