KR20190104404A - 식물 조절 요소 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조절하는 데 유용한 재조합 DNA 분자 및 작제물뿐만 아니라 이들의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자, 이들의 사용 방법을 제공한다.
Description
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은 2017년 1월 19일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/448,019호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서의 그의 전문이 참고로 편입된다.
서열목록의 편입
파일명 "MONS436WO-sequence_listing.txt"으로 포함된 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태는 59,917 바이트(마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows)(등록상표)에서 측정함)이고, 2018년 1월 12월에 생성되었으며, 본 출원과 동시에 전자 제출에 의해 출원되고, 본 명세서에 그의 전체가 참고로 편입된다.
기술분야
본 발명은 식물 분자 생물학 및 식물 유전자 조작 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조절하는 데 유용한 DNA 분자에 관한 것이다.
조절 요소는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조절함으로써 유전자 활성을 조절하는 유전자 요소이다. 이러한 요소는 프로모터, 리더, 인트론 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있고, 식물 분자 생물학 및 식물 유전자 조작 분야에서 유용하다.
본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규한 합성 유전자 조절 요소를 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 DNA 분자 및 조절 요소를 포함하는 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 합성 조절 요소를 포함하는 유전자이식 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 일 실시형태에서, 합성 조절 요소는 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명은 또한 합성 조절 요소를 이용하는 방법 및 합성 조절 요소를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제조하고 이용하는 방법 및 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 합성 조절 요소를 포함하는 유전자 이식 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은: (a) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45를 포함하는 서열; 및 (c) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 단편으로서, 단편은 유전자-조절 활성을 갖는, 상기 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하되; 서열은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. "이종성의 전사 가능한 DNA 분자"는 전사 가능한 DNA 분자가 그것이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 구체적 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 DNA 서열에 대해 적어도 약 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, DNA 서열은 조절 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이종성의 전사 가능한 DNA 분자는 농업형질 관심 대상의 유전자, 예컨대, 식물에서 제초제 저항성을 제공할 수 있는 유전자, 또는 식물에서 식물 병충해 저항성을 제공할 수 있는 유전자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 바와 같은 재조합 DNA 분자를 포함하는 작제물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 명세서에 (a) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45에 대해 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45를 포함하는 서열; 및 (c) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 단편으로서, 단편은 유전자-조절 활성을 갖는, 상기 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 식물 세포가 제공되되; DNA 서열은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 실시형태에서, 유전자이식 식물 세포는 단자엽 식물 세포이다. 다른 실시형태에서, 유전자이식 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에 a) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열; b) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45를 포함하는 서열; 및 c) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 단편으로서, 단편은 유전자-조절 활성을 갖는, 상기 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는, 유전자이식 식물, 또는 이의 부분이 제공되되; 서열은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 구체적 실시형태에서, 유전자이식 식물은 재조합 DNA 분자를 포함하는 임의의 세대의 자손 식물이다. 성장할 때 이러한 유전자이식 식물을 생산하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 종자가 또한 본 명세서에 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 유전자이식 식물 또는 이의 일부를 얻는 단계 및 이것으로부터 상품을 생산하는 단계를 포함하는, 상품을 생산하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상품은 가공된 종자, 곡물, 식물 부분, 오일 및 으깬 곡물이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 형질전환된 식물 세포를 생산하기 위해 본 발명의 재조합 DNA 분자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 식물 세포로부터 유전자이식 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 인트론(I-At.Cyco:2) 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP442.nno:2)를 포함하는 합성 조절 발현 요소 그룹(expression elements group: EXP)인 EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3의 DNA 서열이다.
서열번호 2는 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP442.nno:2이다.
서열번호 3은 합성 리더 서열인 L-At.GSP442.nno:1이다.
서열번호 4는 합성 리더(L-At.GSP571.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP571.nno:5)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571의 DNA 서열이다.
서열번호 5는 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP571.nno:5이다.
서열번호 6은 합성 리더 서열인 L-At.GSP571.nno:1이다.
서열번호 7은 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP571.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP571.nno:5)를 포함하는 합성 조절 발현 요소 그룹(EXP)인 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2의 DNA 서열이다.
서열번호 8은 합성 인트론(I-At.GSI21.nno:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP571.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP571.nno:5)를 포함하는 합성 조절 발현 요소 그룹(EXP)인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10의 DNA 서열이다.
서열번호 9는 합성 인트론 서열인 I-At.GSI21.nno:2이다.
서열번호 10은 합성 인트론(I-At.GSI102.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP571.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP571.nno:5)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1의 DNA 서열이다.
서열번호 11은 합성 인트론 서열인 I-At.GSI102.nno:1이다.
서열번호 12는 합성 리더(L-At.GSP564.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP564.nno:3)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP564의 DNA 서열이다.
서열번호 13은 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP564.nno:3이다.
서열번호 14는 합성 리더 서열인 L-At.GSP564.nno:1이다.
서열번호 15는 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP564.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP564.nno:3)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2의 DNA 서열이다.
서열번호 16은 합성 인트론(I-At.GSI17.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP564.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP564.nno:3)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2의 DNA 서열이다.
서열번호 17은 합성 인트론 서열인 I-At.GSI17.nno:1이다.
서열번호 18은 합성 인트론(I-At.GSI102.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP564.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP564.nno:3)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 의 DNA 서열이다.
서열번호 19는 합성 리더(L-At.GSP579.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP579.nno:2)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP579의 DNA 서열이다.
서열번호 20은 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP579.nno:2이다.
서열번호 21은 합성 리더 서열인 L-At.GSP579.nno:1이다.
서열번호 22는 합성 인트론(I-At.GSI102.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP579.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP579.nno:2)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3의 DNA 서열이다.
서열번호 23은 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 키메라 프로모터(P-At.GSP571/442, 이는 합성 프로모터(P-At.GSP442.nno:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 인핸서(E-At.GSP571.nno:1)를 포함함)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1의 DNA 서열이다.
서열번호 24는 합성 인핸서 서열, E-At.GSP571.nno:1이다.
서열번호 25는 합성 프로모터(P-At.GSP442.nno:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 인핸서(E-At.GSP571.nno:1)를 포함하는 합성 키메라 프로모터인 P-At.GSP571/442의 DNA 서열이다.
서열번호 26은 합성 인트론(I-At.GSI17.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP576.nno:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP576.nno:4)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3의 DNA 서열이다.
서열번호 27은 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP576.nno:4이다.
서열번호 28은 합성 리더 서열인 L-At.GSP576.nno:2이다.
서열번호 29는 합성 3'UTR인 T-Zm.GST59.nno:1이다.
서열번호 30은 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP221:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP221:3)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP221+At.Cyco:3의 DNA 서열이다.
서열번호 31은 합성 프로모터 서열인 P-At.GSP221:3이다.
서열번호 32는 합성 리더 서열인 L-At.GSP221:1이다.
서열번호 33은 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래된 인트론 서열인 I-At.Cyco:2이다.
서열번호 34는 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)의 Sali3 유전자로부터 유래된 3' UTR 서열인 T-Mt.Sali3-2-1:2:1이다.
서열번호 35는 메디카고 트룬카툴라로부터의 추정 산화환원효소(oxidoreductase: OXR) 단백질 유전자로부터 유래된 3' UTR 서열, T-Mt.Oxr-1:2:1이다.
서열번호 36은 고시피움 바바덴스(Gossypium barbadense) FbLate-2 유전자로부터 유래된 3' UTR 서열인 T-Gb.FbL2:1이다.
서열번호 37은 메디카고 트룬카툴라로부터의 탈수-반응성 단백질 RD22 유전자로부터 유래된 3'UTR 서열인 T-Mt.RD22-1:2:1이다.
서열번호 38은 인트론(I-At.Cyco-1:1:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터(P-At.Cyco-1:1:2)를 포함하는 아라비돕시스로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래된 EXP인 EXP-At.Cyco:1:1의 DNA 서열이다.
서열번호 39는 아라비돕시스로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래된 프로모터 서열인 P-At.Cyco-1:1:2이다.
서열번호 40은 아라비돕시스로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래된 리더 서열인 L-At.Cyco-1:1:2이다.
서열번호 41은 아라비돕시스로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래된 인트론 서열인I-At.Cyco-1:1:1.
서열번호 42는 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(젠뱅크 등록: X04753)로부터 유래된 처리 가능한 인트론을 갖는 β-글루쿠로니다제(glucuronidase: GUS)에 대한 암호 서열이다.
서열번호 43은 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP442.nno:2)를 포함하는 EXP(EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco)의 DNA 서열이다.
서열번호 44는 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2의 DNA 서열이다.
서열번호 45는 인트론(I-At.Cyco:2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP564.nno:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP564.nno:3)를 포함하는 EXP(EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1)의 DNA 서열이다.
서열번호 46은 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus)로부터 유래된 35S 프로모터 및 리더를 포함하는 EXP(EXP-CaMV.35S)의 DNA 서열이다.
서열번호 47은 옥수수(Zea mays)로부터의 열 충격 단백질 70(Hsp70) 유전자(DnaK)로부터 유래된 인트론(I-Zm.DnaK:1)의 DNA 서열이다.
서열번호 48은 벼(Oryza sativa)로부터의 지질 전달 단백질-유사 유전자(Lipid Transfer Protein-like gene: LTP)로부터 유래된 3'UTR(T-Os.LTP:1)의 DNA 서열이다.
서열번호 49는 심해 새우(Oplophorus gacilirostris) 루시퍼라제로부터 관련된 진화에 의해 조작된 나노루크(NanoLuc)(등록상표) 루시퍼라제 형광 단백질(위스콘신주 53711 메디슨에 소재한 프로메가(Promega))인 Nluc에 대한 암호 서열이다.
서열번호 50은 인트론(I-At.Cyco-1:1:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 베타-글루쿠로니다제 21 유전자의 프로모터 및 리더를 포함하는 EXP(EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2)의 DNA 서열이다.
서열번호 51은 페튜니아 x 혼성체로부터의 열 충격 단백질 70(HSP70) 유전자의 리더에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 향상된 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하는 EXP(EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3)의 DNA 서열이다.
서열번호 52는 대두의 7S 알파 프라임 유전자의 프로모터 및 리더를 포함하는 EXP(EXP-Gm.Sphas1:1:1)의 DNA 서열이다.
서열번호 53은 인트론(I-Zm.DnaK:1)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 향상된 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하는 EXP(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1)의 DNA 서열이다.
서열번호 54는 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)(반딧불이)로부터 유래된 루시퍼라제 단백질(루시퍼라제:1:3)을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열번호 55는 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 합성효소 유전자로부터 유래된 3'UTR(T-AGRtu.nos-1:1:13)의 DNA 서열이다.
서열번호 56은 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)(밀)의 광-수확 복합체(광-채집 복합체)의 엽록소 a/b-결합 유전자의 리더에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 향상된 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하는 EXP(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1)의 DNA 서열이다.
서열번호 57은 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)(바다 팬지)로부터 유래된 루시퍼라제 단백질(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1)을 암호화하는 DNA 서열이다.
발명을 실시하기
위한 구체적 내용
본 발명은 식물에서 유전자-조절 활성을 갖는 합성 조절 요소를 제공한다. 이들 합성 조절 요소의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 제공된다. 이들 합성 조절 요소는 식물 조직에서 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있고, 따라서, 유전자이식 식물에서 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 유전자 발현을 조절한다. 본 발명은 또한 제공된 합성 조절 요소를 함유하는 재조합 DNA 분자를 변형, 생산 및 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 유전자이식 식물 세포, 식물, 식물 부분 및 종자를 포함하는 조성물, 및 이를 제조 및 이용하는 방법을 제공한다.
다음의 정의 및 방법은 본 발명을 더 양호하게 정의하기 위해 그리고 본 발명의 실행에서 당업자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 당업자에 의해 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
DNA 분자
본 명세서에서 사용되는 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 게놈 또는 합성 유래의 이중 가닥 DNA 분자, 즉, 5'(상류) 단부로부터 3'(하류) 단부로 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 DNA 분자의 중합체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 명명법은 미 연방법 규정(United States Code of Federal Regulations) § 1.822의 37항 및 WIPO 표준 ST.25(1998), 부록 2, 표 1 및 3의 표에 제시된 것에 대응한다.
본 명세서에 사용되는 "재조합 DNA 분자"는 인간 개입 없이 함께 자연적으로 생기지 않는 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자이다. 예를 들어, 재조합 DNA 분자는 서로에 대해 이종성인 적어도 2개의 DNA 분자, 자연에서 존재하는 DNA 서열로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자, 합성 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자 또는 유전자 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA 내로 혼입된 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "합성 뉴클레오타이드 서열" 또는 "인공 뉴클레오타이드 서열"은 천연에서 생기는 것으로 알려지지 않거나, 천연 유래가 아니거나, 또는 인간 개입 없이 생기지 않는 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명의 유전자-조절 요소는 합성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 합성 뉴클레오타이드 서열은 천연 서열에 대해 연장된 상동성을 거의 또는 전혀 공유하지 않는다. 본 문맥에서 연장된 상동성은 일반적으로 인접한 서열의 약 25개 이상의 뉴클레오타이드로 연장되는 100% 서열 동일성을 지칭한다.
"단리된 DNA 분자" 또는 동등한 용어 또는 어구에 대한 본 출원의 언급은 DNA 분자가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 존재하는 것이지만, 그의 천연 환경 내에 있지 않은 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소가 유기체의 게놈 내에 있고 그것이 자연적으로 발견되는 게놈 내의 위치에 있다면, 유기체 게놈의 DNA 내에서 자연적으로 발견되는 핵산 요소, 예컨대, 암호 서열, 인트론 서열, 비번역 리더 서열, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등은 "단리되는" 것으로 고려되지 않는다. 그러나, 각각의 이들 요소, 및 이들 요소의 하위부분은, 요소가 유기체의 게놈 내가 아니고 그것이 자연적으로 발견되는 게놈 내의 위치에서가 아니라면, 본 개시내용의 범주 내에서 "단리된다". 일 실시형태에서, 용어 "단리된"은 그의 천연 또는 천연 상태에서 DNA 분자에 정상적으로 측접하는 핵산의 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 정상적으로 결합되지 않는 조절 또는 암호 서열에 융합된 DNA 분자는, 예를 들어, 재조합 기법의 결과로서, 본 명세서에서 단리되는 것으로 고려된다. 이러한 분자는, 숙주 세포의 염색체 내에 통합되거나 또는 다른 DNA 분자와 함께 핵산 용액 중에 존재할 때, 그들이 그들의 천연 상태가 아니라는 점에서 단리되는 것으로 고려된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 유전자이식 뉴클레오타이드 서열, 즉, 식물 또는 박테리아의 세포 게놈 내로 삽입되거나, 또는 염색체외 벡터 내에 존재하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열은, 그것이 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 플라스미드 또는 유사한 구조 내에 존재하든, 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 존재하든, 또는 식물 또는 박테리아로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 상품에서 검출 가능한 양으로 존재하든 단리된 뉴클레오타이드 서열인 것으로 고려된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개의 최적으로 정렬된 폴리펩타이드 서열이 동일한 정도를 지칭한다. 최적의 서열 정렬은 적절한 내부 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 갭을 갖는 서열 정렬에서 뉴클레오타이드 매치의 수를 최대화하기 위해 두 서열, 예를 들어, 기준 서열 및 다른 서열을 수동으로 정렬함으로써 생성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "기준 서열"은 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 제공되는 DNA 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율" 또는 "동일성%"는 동일성 분율 곱하기 100이다. 기준 서열과 함께 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분율"은 최적의 정렬에서 뉴클레오타이드 매치의 수를 기준 서열에서 뉴클레오타이드의 총 수, 예를 들어, 전체 기준 서열의 전장 내 뉴클레오타이드의 총 수로 나눈 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태는 임의의 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 본 명세서에 제공된 기준 서열에 대해 최적으로 정렬될 때, 기준 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 86% 동일성, 적어도 약 87% 동일성, 적어도 약 88% 동일성, 적어도 약 89% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 91% 동일성, 적어도 약 92% 동일성, 적어도 약 93% 동일성, 적어도 약 94% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 적어도 약 99% 동일성 또는 적어도 약 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 또한 추가 구체적 실시형태에서, 임의의 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45에 대해 동일성 백분율을 갖는 서열은 그것이 유래된 시작 서열에 의해 소유되는 프로모터를 나타내는 것으로 정의될 수 있다. 임의의 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45에 대해 동일성 백분율을 갖는 서열은 전사의 기본 수준을 제공하고 전사의 개시를 위해 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 TATA 박스 또는 동등한 서열을 포함하는 "최소 프로모터"를 추가로 포함할 수 있다.
조절 요소
조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리더(또한 5' UTR로서 알려짐), 인핸서, 인트론 및 전사 종결 영역(또는 3' UTR)은 생세포 내 유전자의 전반적인 발현에서 통합적 부분의 역할을 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조절 요소"는 유전자-조절 활성을 갖는 DNA 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자-조절 활성"은, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미침으로써, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 영향을 미치는 능력을 지칭한다. 식물에서 작용하는 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리더, 인핸서, 인트론 및 3' UTR은 유전자 조작을 통해 식물 표현형을 변형시키는 데 유용하다.
본 명세서에서 사용되는, "조절 발현 요소 그룹" 또는 "EXP" 서열은 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 예컨대, 인핸서, 프로모터, 리더 및 인트론의 그룹을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 조절 발현 요소 그룹은, 예를 들어, 리더 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 EXP는 서열번호 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 및 45를 포함한다.
조절 요소는 그들의 유전자 발현 패턴, 예를 들어, 긍정적 및/또는 부정적 효과, 예컨대, 구성적 발현 또는 일시적, 공간적, 발생적, 조직, 환경적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기 및/또는 화학적으로 반응성인 발현, 및 이들의 임의의 조합뿐만 아니라, 정량적 또는 정성적 표시를 특징으로 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "유전자 발현 패턴"은 전사된 RNA 분자 내로 작동 가능하게 연결된 DNA 분자 전사의 임의의 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 단백질 분자를 생산하도록 번역될 수 있거나 또는 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자, 예컨대, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 마이크로RNA(miRNA) 등을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 번역의 임의의 패턴이다. 단백질 발현은 그의 일시적, 공간적, 발생적 또는 형태학적 질뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 표시를 특징으로 할 수 있다.
프로모터는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 조절 요소로서 유용하다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "프로모터"는 일반적으로 전사를 개시하기 위해 RNA 중합효소 II 및 다른 단백질, 예컨대, 트랜스-작용성 전사 인자의 인식 및 결합에 연루되는 DNA 분자를 지칭한다. 프로모터는 유전자의 게놈 복제물의 5' 비번역 영역(5' UTR)으로부터 초기에 단리될 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 합성에 의해 생산되거나 또는 조작된 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또한 키메라일 수 있다. 키메라 프로모터는 2 이상의 이종성 DNA 분자의 융합을 통해 생산된다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 프로모터는 임의의 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39 또는 이들의 단편 또는 변이체 내에 포함되는 프로모터 요소를 포함한다. 본 발명의 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 특허청구된 DNA 분자 및 이들의 임의의 변이체 또는 유도체는 추가로 프로모터 활성을 포함하는 것으로 정의되며, 즉, 숙주 세포에서, 예컨대, 유전자이식 식물에서 프로모터로서 작용할 수 있다. 또한 추가 구체적 실시형태에서, 단편은 그것이 유래된 시작 프로모터 분자에 의해 소유되는 프로모터 활성을 나타내는 것으로 정의될 수 있거나, 또는 단편은 전사의 기저 수준을 제공하고 전사의 개시를 위한 RNA 중합효소 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 TATA 박스 또는 동등한 DNA 서열을 포함하는 "최소 프로모터"를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 프로모터 서열의 단편이 제공된다. 프로모터 단편은 상기 기재한 바와 같은 프로모터 활성을 포함할 수 있고, 예컨대, 키메라 프로모터를 구성하는 데, 단독으로 또는 다른 프로모터 및 프로모터 단편과 조합하여, 또는 다른 발현 요소 및 발현 요소 단편과 조합하여 유용할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 프로모터 활성을 갖는 DNA 분자의 적어도 약 50, 적어도 약 75, 적어도 약 95, 적어도 약 100, 적어도 약 125, 적어도 약 150, 적어도 약 175, 적어도 약 200, 적어도 약 225, 적어도 약 250, 적어도 약 275, 적어도 약 300, 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 750, 적어도 약 800, 적어도 약 900 또는 적어도 약 1000개의 인접한 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함하는 프로모터의 단편이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 전장 서열의 활성을 갖는 본 명세서에 제공된 프로모터의 단편을 제공한다. 시작 프로모터 분자로부터 이러한 단편을 생산하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
임의의 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39, 예컨대, 내부 또는 5' 결실 내에 포함된 임의의 프로모터 요소로부터 유래된 조성물은, 예를 들어, 발현에 대해 긍정적 또는 부정적 효과를 갖는 요소를 제거; 발현에 대해 긍정적 또는 부정적 효과를 갖는 요소를 중복; 그리고/또는 발현에 대해 조직- 또는 세포-특이적 효과를 갖는 요소를 중복 또는 제거하는 것을 포함하는, 발현을 개선 또는 변경시키기 위한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생산될 수 있다. TATA 박스 요소 또는 이의 동등한 서열 및 하류의 서열이 제거된 3' 결실을 포함한 임의의 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39 내에 포함된 임의의 프로모터 요소로부터 유래된 조성물은, 예를 들어, 인핸서 요소를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 발현에 대해 긍정적 또는 부정적; 조직-특이적; 세포-특이적; 또는 시간-특이적(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 생물학적 주기의 리듬) 효과를 갖는 임의의 요소를 제거하기 위한 추가적인 결실이 만들어질 수 있다. 임의의 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39 및 이들로부터 유래된 단편 또는 인핸서 내에 포함된 임의의 프로모터 요소는 키메라 전사 조절 요소 조성물을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로모터 또는 프로모터 단편은 공지된 프로모터 요소, 즉, DNA 서열 특징, 예컨대, TATA 박스 및 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 공지된 프로모터 요소의 식별은 본래의 프로모터와 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 변이체를 설계하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리더"는 비번역 5' 영역(5' UTR) 유전자로부터 단리된 DNA 분자를 지칭하며, 일반적으로 전사 개시 부위(TSS)와 단백질 암호 서열 개시 부위 사이의 뉴클레오타이드 세그먼트로서 정의된다. 대안적으로, 리더는 합성으로 생산되거나 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 조작 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 이종성 프로모터와 함께 또는 그들의 천연 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 본 발명을 실행함에 있어서 유용한 리더는 서열번호 3, 6, 14, 21, 28, 32 및 40; 또는 임의의 서열번호 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 및 45 또는 이들의 단편 또는 변이체 내에 포함된 임의의 리더 요소를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 이러한 DNA 서열은, 예를 들어, 유전자이식 식물 세포를 포함하는 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로 정의될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로 해독된다.
서열번호 3, 6, 14, 21, 28, 32 및 40로서 제시된 리더 서열(또한 5' UTR로서 지칭됨) 또는 임의의 서열번호 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30 및 43 내에 포함된 임의의 리더 요소는 조절 요소를 포함할 수 있거나, 또는 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 대해 효과를 가질 수 있는 2차 구조를 채택할 수 있다. 서열번호 3, 6, 14, 21, 28, 32 및 40으로서 제시된 리더 서열 또는 임의의 서열번호 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 및 45 내에 포함된 임의의 리더 서열은 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 키메라 조절 요소를 생성하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인트론"은 유전자로부터 단리되거나 또는 동정될 수 있고 번역 전에 전령 RNA(mRNA) 동안 스플라이싱된 영역으로서 일반적으로 정의될 수 있는 DNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 인트론은 합성으로 생산되거나 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 인핸서 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위한 조절 요소로서 사용될 수 있다. 작제물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사 가능한 DNA 분자에 대해 이종성일 수도 있고 이종성이 아닐 수도 있다. 당업계에 공지된 인트론의 예는 벼 액틴 인트론 및 옥수수 HSP70 인트론을 포함한다.
식물에서, 유전자 작제물 내 일부 인트론의 포함은 인트론을 결여하는 작제물에 비해 증가된 mRNA 및 단백질 축적을 야기한다. 이 효과는 유전자 발현의 "인트론 매개 향상"(intron mediated enhancement: IME)으로 칭해졌다. 식물에서 발현을 자극하는 것으로 알려진 인트론은 메이즈 유전자(예를 들어, tubA1, Adh1, Sh1 및 Ubi1)에서, 벼 유전자(예를 들어, tpi)에서 그리고 페튜니아(예를 들어, rbcS), 감자(예를 들어, st-ls1)로부터 그리고 아라비돕시스 탈리아나로부터의 유전자(예를 들어, ubq3 및 pat1)와 유사한 쌍떡잎식물의 유전자에서 동정되었다. 인트론의 스플라이드 부위 내의 결실 또는 돌연변이는 유전자 발현을 감소시키는 것으로 나타났는데, 이는 스플라이싱이 IME에 필요할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 쌍떡잎식물에서 IME는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 pat1 유전자의 스플라이스 부위 내에서 점 돌연변이에 의해 나타났다. 하나의 식물에서 동일한 인트론의 다중 용도는 단점을 나타내는 것으로 나타내었다. 상기 경우에, 적절한 재조합 DNA 요소의 구성을 위한 기본적 대조군 요소의 수집을 갖는 것이 필요하다. 본 발명을 실행하는데 유용한 예시적인 인트론은 서열번호 9, 11, 17, 33 및 41로서 제시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "3' 전사 종결 분자", "3' 비번역 영역" 또는 "3' UTR"은 mRNA 분자의 3' 부분의 비번역 영역에 대한 전사동안 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. mRNA 분자의 3' 비번역 영역은 특정 절단 및 폴리A 꼬리로서도 알려진 3' 폴리아데닐화에 의해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되고 이의 하류에 위치될 수 있고, 전사, mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 폴리아데닐화 신호 및 다른 조절 신호를 포함할 수 있다. 폴리A 꼬리는 mRNA 안정성에서 그리고 번역의 개시에서 작용하는 것으로 생각된다. 당업계의 3' 전사 종결 분자의 예는 노팔린 합성효소 3' 영역; 밀 hsp17 3' 영역, 완두 루비스코(rubisco) 작은 서브유닛 3' 영역, 목화 E6 3' 영역 및 코익신(coixin) 3' UTR이다.
3' UTR은 전형적으로 특정 DNA 분자의 재조합 발현을 위한 유리한 용도를 발견한다. 약한 3' UTR은 읽고 지나감 전사(read-through)를 생성하는 잠재력을 가지는데, 이는 이웃하는 발현 카세트에 위치된 DNA 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 적절한 전사 종결의 제어는 하루에 위치된 DNA 서열(예를 들어, 다른 발현 카세트) 내로의 읽고 지나감 전사를 방지할 수 있고, 추가로 유전자 발현을 개선시키기 위한 RNA 중합효소의 효율적인 재순환을 허용할 수 있다. 전사의 효율적인 종결(DNA로부터 RNA 중합효소 II의 방출)은 전사의 재개시에 대한 전제 조건이며, 이에 의해 전반적인 전사체 수준에 직접적으로 영향을 미친다. 전사 종결에 후속적으로, 성숙 mRNA는 합성 부위 및 세포질에 수송된 주형으로부터 방출된다. 진핵 생물 mRNA는 생체내에서 폴리(A) 형태로서 축적되어, 통상적인 방법에 의해 전사 종결 부위를 검출하는 것을 어렵게 한다. 그러나, 생물정보학 방법에 의한 기능성이고 효율적인 3' UTR의 예측은 효과적인 3' UTR의 용이한 예측을 허용하는 보존된 DNA 서열이 없다는 점에서 어렵다.
실행적 견지로부터, 발현 카세트에서 사용되는 3' UTR은 다음의 특징을 갖는다는 점에서 전형적으로 유리하다. 첫째로, 3' UTR은 이식유전자의 전사를 효율적으로 그리고 효과적으로 종결시키고 전사체의 임의의 이웃하는 DNA 서열로의 읽고 지나감 전사를 방지할 수 있어야 하며, 이는 하나의 전달 DNA(T-DNA)에 존재하는 다중 발현 카세트, 또는 T-DNA가 삽입되는 이웃하는 염색체의 DNA의 경우에서와 같이, 다른 발현 카세트를 포함할 수 있다. 둘째로, 3' UTR은 DNA 분자의 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터, 리더, 인핸서 및 인트론에 의해 부여되는 전사 활성의 감소를 야기하지 않아야 한다. 최종적으로, 식물 생명공학에서, 3' UTR은 종종 형질전환 식물로부터 추출된 역전사된 RNA의 증폭 반응의 프라이밍을 위해 사용되고, (1) 일단 식물 염색체 내로 통합된 발현 카세트의 전사 활성 또는 발현을 평가하기 위해; (2) 식물 DNA 내에서 삽입의 복제수를 평가하기 위해; 그리고 (3) 육종 후에 얻어진 종자의 접합성을 평가하기 위해 사용된다. 3' UTR은 또한 삽입된 카세트의 무손상을 특성규명하기 위해 형질전환된 식물로부터 추출된 DNA의 증폭 반응에서 사용된다. 본 발명을 실행하는데 유용한 3' UTR은 서열번호 29, 34, 35, 36, 37 및 44로서 제시된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "인핸서" 또는 "인핸서 요소"는 전반적인 발현 패턴의 양상을 부여하지만, 보통 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 유도하는데 단독으로는 불충분한 시스-작용성 조절 요소(시스-요소라고도 함)를 지칭한다. 프로모터와 달리, 인핸서 요소는 보통 전사 개시 부위(TSS) 또는 TATA 박스 또는 동등한 DNA 서열을 포함하지 않는다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 작동 가능하게 연결된 DNA 서열의 전사에 영향을 미치는 하나 이상의 인핸서 요소를 자연적으로 포함할 수 있다. 인핸서 요소는 또한 유전자 발현의 전반적인 조절의 양상을 부여하는 키메라 프로모터 시스-요소를 생성하도록 프로모터에 융합될 수 있다. 합성 프로모터로부터 유래된 인핸서 요소의 예(P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5))는 서열번호 24(E-At.GSP571.nno:1)로서 제공된다.
다수의 프로모터 인핸서 요소는 DNA-결합 단백질에 결합하는 것으로 여겨지고/지거나 DNA 위상배치에 영향을 미쳐서, DNA 주형에 대한 RNA 중합효소의 평가를 선택적으로 허용하거나 또는 제한하거나 또는 전사 개시 부위에서 이중나선의 선택적 개방을 용이하게 하는 국소 입체배좌를 생성한다. 인핸서 요소는 전사를 조절하는 전사 인자에 결합하는 작용을 할 수 있다. 일부 인핸서 요소는 하나 초과의 전사 인자에 결합하고, 전사 인자는 하나 초과의 인핸서 도메인과 상이한 친화도로 상호작용할 수 있다. 인핸서 요소는 결실 분석, 즉, 5' 말단 또는 내부로부터 프로모터까지 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실; DNase I 풋프린팅을 이용하는 DNA 결합 단백질 분석; 메틸화 간섭; 전기영동 이동성 분석; 결찰-매개 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 생체내 게놈 풋프린팅; 및 다른 통상적인 분석을 포함하는 다수의 기법에 의해 또는 통상적인 DNA 서열 비교 방법, 예컨대, BLAST에 의해 표적 서열 또는 표적 모티프로서 공지된 시스-요소 모티프 또는 인핸서 요소를 이용하는 DNA 서열 유사성 분석에 의해 동정될 수 있다. 인핸서 도메인의 미세한 구조는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 돌연변이유발(또는 치환)에 의해 또는 당업계에 공지된 다른 통상적인 방법에 의해 추가로 연구될 수 있다. 인핸서 요소는 화학적 합성에 의해 또는 이러한 요소를 포함하는 조절 요소로부터 단리에 의해 얻을 수 있고, 그들은 후속적 조작을 용이하게 하게 의해 유용한 제한 효소 부위를 함유하는 추가적인 측접 뉴클레오타이드에 의해 합성될 수 있다. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위해 본 명세서에 개시된 방법에 따른 인핸서 요소의 설계, 구성 및 사용은 본 발명에 포함된다. 본 발명을 실행하는 데 유용한 예시적인 인핸서는 서열번호 24로서 제시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자도 제2 DNA 분자도 정상적으로 입체배치에서 발견되지 않으며, 즉, 서로 융합되는 경우에, 제2 DNA 분자에 제1 DNA 분자를 융합함으로써 생성된 단일 DNA 분자를 지칭한다. 따라서 키메라 DNA 분자는 자연에서 달리 정상적으로 발견되지 않는 새로운 DNA 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 프로모터"는 DNA 분자의 이러한 조작을 통해 생성된 프로모터를 지칭한다. 키메라 프로모터는 2 이상의 DNA 단편, 예를 들어, 인핸서 요소에 대한 프로모터의 융합을 조합할 수 있다. 따라서, 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 조절하기 위해 본 명세서에 개시된 방법에 따른 키메라 프로모터의 설계, 구성 및 사용은 본 발명에 포함된다. 예시적인 키메라 프로모터는 본 명세서에서 서열번호 25로서 제시된다(P-At.GSP571/442).
키메라 조절 요소는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 제한 효소 분해 및 결찰, 결찰 독립적 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈러 조립체, 또는 조절 요소의 직접적인 화학적 합성뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있는 다양한 구성요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 얻어진 다양한 키메라 조절 요소는 이들, 또는 이들의 변이체, 구성요소를 포함할 수 있지만, 구성요소 부분이 작동 가능하게 연결되도록 허용하는 연결 DNA 서열 또는 서열들을 포함하는 DNA 서열 또는 DNA 서열들은 상이하다. 본 발명에서, 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 제공되는 DNA 서열은 조절 요소 기준 서열을 제공할 수 있되, 기준 서열을 포함하는 구성요소는 당업계에 공지된 방법에 의해 결합될 수 있고, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및/또는 삽입 또는 박테리아 및 식물 세포 형질전환에서 자연적으로 생기는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 제1 DNA 분자와 유사하지만, 동일하지 않은 제2 DNA 분자, 예컨대, 조절 요소를 지칭하고, 제2 DNA 분자는, 예를 들어, 제1 DNA 분자의 거의 동등한 전사 활성을 통해 일반적인 작용성, 즉, 동일 또는 유사한 발현 패턴을 여전히 유지한다. 변이체는 제1 DNA 분자의 더 짧은 또는 절단된 형태 또는 제1 DNA 분자 서열의 변경된 형태, 예컨대, 상이한 제한 효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환 또는 삽입을 갖는 것일 수 있다. "변이체"는 또한 기준 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 조절 요소를 포함할 수 있되, 유도체 조절 요소는 대응하는 모 조절 분자와 거의 동등한 전사 또는 번역 활성을 가진다. 본 발명에서, 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 조성물에서 유사하지만 본래의 조절 요소의 DNA 서열과 동일하지 않은 한편, 본래의 조절 요소의 일반적 작용성, 즉, 동일 또는 유사한 발현 패턴을 여전히 유지하는 변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 변이체의 생산은 본 개시내용에 비추어 당업자의 기술 내에서 용이하고, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
특정 이식유전자의 목적으로 하는 발현 양상에 대한 본 명세서에 기재된 변형, 중복 또는 결실의 효능은 시작 DNA 분자로 만들어진 변화 및 이의 변화 목적에 따라 다를 수 있는 결과를 입증하기 위해 작업예에 기재된 것과 같은 안정하고 일시적인 식물 분석에서 경험적으로 시험될 수 있다.
작제물
본 명세서에서 사용되는 용어 "작제물"은 DNA 분자를 포함하는 게놈 통합 또는 자율 복제를 할 수 있는 임의의 공급원으로부터 유래된 임의의 재조합 DNA 분자, 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA를 의미하고, 적어도 하나의 DNA 분자는 기능적으로 조작되는 방식으로 다른 DNA 분자에 연결되었고, 즉, 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 형질전환, 즉, 숙주 세포 내로 이종성 DNA 또는 RNA의 도입의 목적을 위해 사용될 수 있는 임의의 작제물을 의미한다. 작제물은 전형적으로 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "발현 카세트"는 하나 이상의 조절 요소, 전형적으로 적어도 프로모터 및 3'UTR에 작동 가능하게 연결된 적어도 전사 가능한 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 DNA 분자에 결합된 제1 DNA 분자를 지칭하되, 제1 및 제2 DNA 분자는 제1 DNA 분자가 제2 DNA 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 두 DNA 분자는 단일의 인접한 DNA 분자의 부분일 수도 있고 부분이 아닐 수도 있고, 인접할 수도 있고 인접하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심 대상의 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조절한다면 프로모터는 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된다. 리더는, 예를 들어, 그것이 DNA 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있을 때 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 작제물은, 일 실시형태에서, 아그로박테륨 투메파시엔스 세포에 의해 제공되는 전달 분자와 함께, 식물 세포의 게놈 내로 T-DNA의 통합을 허용하는 T-DNA를 포함하는 아그로박테륨 투메파시엔스로부터 단리된 Ti 플라스미드의 우측 경계(RB 또는 AGRtu.RB) 및 좌측 경계(LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖는 이중 종양-유도성(Ti) 플라스미드 경계 작제물로서 제공될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,603,061호). 작제물은 또한 박테리아 세포에서 복제 기능 및 항생제 선택을 제공하는 플라스미드 골격 DNA 세그먼트, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 복제 기점, 예컨대, ori322, 넓은 숙주 범위 복제 기점, 예컨대, oriV 또는 oriRi, 및 선택 가능한 마커, 예컨대, 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신, 또는 겐타마이신(Gm, Gent) 선택 가능 마커에 대해 Tn7 아미노글리코사이드 아데닐트랜스퍼라제(aadA) 부여 내성을 암호화하는 Spec/Strp에 대한 암호 영역을 함유할 수 있다. 식물 형질전환을 위해, 숙주 박테리아 균주는 종종 아그로박테륨 투메파시엔스로 ABI, C58 또는 LBA4404이지만, 그러나 식물 형질전환의 당업자에게 공지된 다른 균주는 본 발명에서 작용할 수 있다.
전사 가능한 DNA 분자가 단백질로서 번역되고 발현되는 기능성 mRNA로 전사되는 방식으로 세포 내로 작제물을 조립하고 도입하기 위한 방법은 공지되어 있다. 본 발명의 실행을 위해, 작제물 및 숙주 세포를 제조하고 이용하기 위한 통상적인 조성물 및 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 더 고등 식물에서 핵산의 발현에 유용한 전형적인 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 아그로박테리움 투메파시엔스의 Ti 플라스미드로부터 유래된 벡터 및 pCaMVCN 전달 제어 벡터를 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 것을 포함하는 다양한 조절 요소가 작제물에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 조합은 바람직한 조절 특징을 생성하도록 설계되거나 또는 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 작제물은 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 작제물은 본 명세서에 제공되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로모터는 이종성 비번역 5' 리더, 예컨대, 열 충격 단백질 유전자로부터 유래된 것에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 리더는 이종성 프로모터, 예컨대, 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S 전사체 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
발현 카세트는 또한 특히 엽록체, 백색체 또는 다른 색소체 세포소 기관; 미토콘드리아; 퍼옥시좀; 액포; 또는 세포외 위치에 작동 가능하게 연결된 단백질의 하위 세포 표적화에 유용한 펩타이드를 암호화하는 수송 펩타이드 암호 서열을 포함할 수 있다. 다수의 엽록체-국소화된 단백질은 전구체로서 핵 유전자로부터 발현되고, 엽록체 수송 펩타이드(CTP)에 의해 엽록체에 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제, 페레독신, 페레독신 산화환원효소, 광-채집 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F 및 엔올피루빌 시키메이트 인산염 합성효소(EPSPS)의 작은 서브유닛(SSU)과 관련된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 엽록체 수송 펩타이드는, 예를 들어, 미국 특허 제7,193,133호에 기재되어 있다. 비엽록체 단백질은 비-엽록체 단백질을 암호화하는 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 이종성 CTP의 발현에 의해 엽록체에 표적화될 수 있다는 것이 입증되었다.
전사 가능한 DNA 분자
본 명세서에서 사용되는, 용어 "전사 가능한 DNA 분자"는 단백질 암호 서열을 갖는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생성하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 지칭한다. DNA 분자의 유형은 동일한 식물로부터의 DNA 분자, 다른 식물로부터의 DNA 분자, 상이한 유기체로부터의 DNA 분자 또는 합성 DNA 분자, 예컨대, 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 DNA 분자 또는 인공, 합성 또는 달리 변형된 형태의 이식유전자를 암호화하는 DNA 분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 작제물 내로 혼입을 위한 예시적인 전사 가능한 DNA 분자는, 예를 들어, DNA 분자 또는 DNA 분자가 혼입된 종 이외의 종으로부터의 유전자 또는 동일한 종으로부터 유래되거나 또는 동일한 종에 존재하지만, 고전적 번식 기법보다는 유전자 조작 방법에 의해 수용자에 혼입된 유전자를 포함한다.
"이식유전자"는 적어도 숙주 세포 게놈 내 위치에 대해 숙주 세포에 대해 이종성인 전사 가능한 DNA 분자 및/또는 현재의 또는 임의의 이전 세대의 세포에서 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 혼입된 전사 가능한 DNA 분자를 지칭한다.
조절 요소, 예컨대, 본 발명의 합성 프로모터는 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "이종성"은 2 이상의 DNA 분자의 조합이 천연에서 발견되지 않을 때의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 DNA 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고/있거나 2개의 DNA 분자는 상이한 유전자, 예를 들어, 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있거나, 또는 DNA 분자 중 하나는 합성이고 천연에서 발견되지 않을 수 있다. 조절 요소는 이러한 조합이 천연에서 정상적으로 발견되지 않는다면 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자에 대해 이종성이고, 즉, 조절 요소에 대해 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 DNA 분자는 천연에서 생기지 않는다.
전사 가능한 DNA 분자는 일반적으로 전사체의 발현에 요망되는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 전사체의 이러한 발현은 얻어진 mRNA 분자의 번역, 및 그에 따른 단백질 발현을 초래할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 전사 가능한 DNA 분자는 특정 유전자 또는 단백질의 감소된 발현을 궁극적으로 야기하도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 안티센스 방향으로 배향된 전사 가능한 DNA 분자를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 이러한 안티센스 기법을 이용하는데 익숙하다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 음성으로 조절될 수 있고, 일 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 dsRNA, siRNA 또는 miRNA 분자의 발현을 통한 특정 유전자의 억제에 대해 설계될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태는 본 발명의 조절 요소, 예컨대, 유전자이식 식물 세포의 게놈에 통합될 때 목적으로 하는 수준에서 또는 목적으로 하는 패턴으로 전사 가능한 DNA 분자의 전사를 조절하기 위해 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로서 제공된 것을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 일 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 유전자의 단백질-암호 영역을 포함하고 다른 실시형태에서, 전사 가능한 DNA 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함한다.
관심 대상의 농업형질 유전자
전사 가능한 DNA 분자는 관심 대상의 농업형질 유전자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "관심 대상의 농업형질 유전자"는 특정 식물 조직, 세포 또는 세포 유형에서 발현될 때, 바람직한 특징을 부여하는 전사 가능한 DNA 분자를 지칭한다. 관심대상의 농업형질 유전자 산물은 식물 형태, 생리학, 성장, 발생, 수율, 곡물 조성, 영양 프로파일, 질환 또는 병해충 저항성 및/또는 환경적 또는 화학적 내성에 대한 효과를 야기하기 위해 식물 내에서 작용할 수 있거나 또는 식물 상에서 먹이를 먹는 해충의 먹이 내 살균살충성 제제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 조절 요소가 관심 대상의 농업형질 유전자인 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결되도록 본 발명의 조절 요소는 작제물 내로 혼입된다. 이러한 작제물을 함유하는 유전자이식 식물에서, 관심 대상의 농업형질 유전자의 발현은 유리한 농업형질 속성을 부여할 수 있다. 유리한 농업형질 속성은, 예를 들어, 제초제 내성, 해충 구제, 변성된 수율, 질환 내성, 병원균 내성, 변성된 식물 성장 및 발생, 변성된 전분 함량, 변성된 오일 함량, 변성된 지방산 함량, 변성된 단백질 함량, 변성된 과일 숙성, 향상된 동물 및 인간 영양, 생중합체 생산, 환경적 스트레스 저항성, 약제학적 펩타이드, 개선된 가공 품질, 개선된 향미, 잡종 종자 생산 효용, 개선된 섬유 생산 및 바람직한 생체연료 생산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
당업계에 공지된 관심 대상의 농업형질 유전자의 예는 제초제 저항성(미국 특허 제6,803,501호; 제6,448,476호; 제6,248,876호; 제6,225,114호; 제6,107,549호; 제5,866,775호; 제5,804,425호; 제5,633,435; 및 제5,463,175호), 증가된 수율(미국 특허 USRE38,446호; 제6,716,474호; 제6,663,906호; 제6,476,295호; 제6,441,277호; 제6,423,828호; 제6,399,330호; 제6,372,211호; 제6,235,971호; 제6,222,098; 및 제5,716,837호), 해충 구제(미국 특허 제6,809,078호; 제6,713,063호; 제6,686,452호; 제6,657,046호; 제6,645,497호; 제6,642,030호; 제6,639,054호; 제6,620,988호; 제6,593,293호; 제6,555,655호; 제6,538,109호; 제6,537,756호; 제6,521,442호; 제6,501,009호; 제6,468,523호; 제6,326,351호; 제6,313,378호; 제6,284,949호; 제6,281,016호; 제6,248,536호; 제6,242,241호; 제6,221,649호; 제6,177,615호; 제6,156,573호; 제6,153,814호; 제6,110,464호; 제6,093,695호; 제6,063,756호; 제6,063,597호; 제6,023,013호; 제5,959,091호; 제5,942,664호; 제5,942,658호, 제5,880,275호; 제5,763,245호; 및 제5,763,241호), 진균 질환 내성(미국 특허 제6,653,280호; 제6,573,361호; 제6,506,962호; 제6,316,407호; 제6,215,048호; 제5,516,671호; 제5,773,696호; 제6,121,436호; 제6,316,407호; 및 6,506,962호), 바이러스 저항성(미국 특허 제6,617,496호; 제6,608,241호; 제6,015,940호; 제6,013,864호; 제5,850,023호; 및 제5,304,730호), 선충 저항성(미국 특허 제6,228,992호), 박테리아 질환 내성(미국 특허 제5,516,671호), 식물 성장 및 발생(미국 특허 제6,723,897호 및 제6,518,488호), 전분 생산(미국 특허 제6,538,181호; 제6,538,179호; 제6,538,178호; 제5,750,876호; 제6,476,295호), 변성된 오일 생산(미국 특허 제6,444,876호; 제6,426,447호; 및 제6,380,462호), 고 유지 생산(미국 특허 제6,495,739호; 제5,608,149호; 제6,483,008호; 및 제6,476,295호), 변성된 지방산 함량(미국 특허 제6,828,475호; 제6,822,141호; 제6,770,465호; 제6,706,950호; 제6,660,849호; 제6,596,538호; 제6,589,767호; 제6,537,750호; 제6,489,461호; 및 제6,459,018호), 고단백질 생산(미국 특허 제6,380,466호), 과일 숙성(미국 특허 제5,512,466호), 향상된 동물 및 인간 영양(미국 특허 제6,723,837호; 제6,653,530호; 제6,5412,59호; 제5,985,605호; 및 제6,171,640호), 생체 중합체(미국 특허 USRE37,543호; 제6,228,623호; 및 제5,958,745호 및 제6,946,588호), 환경 스트레스 저항성(미국 특허 제6,072,103호), 약제학적 펩타이드 및 분비 가능한 펩타이드(미국 특허 제6,812,379호; 제6,774,283호; 제6,140,075호; 및 제6,080,560호), 개선된 가공 속성(미국 특허 제6,476,295호), 개선된 분해성(미국 특허 제6,531,648) 낮은 라피노스(미국 특허 제6,166,292호), 산업적 효소 생산(미국 특허 제5,543,576), 개선된 향미(미국 특허 제6,011,199호), 질소 고정(미국 특허 제5,229,114), 잡종종자 생산(미국 특허 제5,689,041), 섬유질 생산(미국 특허 제6,576,818호; 제6,271,443호; 제5,981,834호; 및 제5,869,720호) 및 생체연료 생산(미국 특허 제5,998,700호)에 대한 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
대안적으로, 관심대상의 농업형질 유전자는, 예를 들어, 안티센스(예를 들어, 미국 특허 제5,107,065호 참조); 저해 RNA("RNAi", 예를 들어, 공개된 출원 미국 특허 제2006/0200878호 및 미국 특허 제2008/0066206호에서, 그리고 미국 특허 출원 제11/974,469호에 기재된 바와 같은 miRNA-, siRNA-, 트랜스-작용성 siRNA-, 및 위상 sRNA-매개 메커니즘에 의한 유전자 발현의 조절에 의한 유전자 발현의 조절을 포함); 또는 공동억제-매개 메커니즘에 의한 내인성 유전자의 유전자 발현의 표적화된 조절을 야기하는 RNA 분자를 암호화함으로써 상기 언급된 식물 특징 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. RNA는 또한 목적으로 하는 내인성 mRNA 산물을 절단하도록 조작된 촉매적 RNA 분자(예를 들어, 리보자임 또는 리보스위치; 예를 들어, 미국 특허 제2006/0200878호)일 수 있었다. 전사 가능한 DNA 분자가 유전자 억제를 야기할 수 있는 분자로 전사되는 방식으로 세포 내로 작제물을 작제하고 도입하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
선택 가능한 마커
선택 가능한 마커 이식유전자는 또한 본 발명의 조절 요소와 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커 이식유전자"는 유전자이식 식물, 조직 또는 세포에서의 발현, 또는 이들의 결여가 일부 방법으로 선별되거나 또는 점수화될 수 있는 임의의 전사 가능한 DNA 분자를 지칭한다. 본 발명의 실행에서 사용하기 위한 선택 가능한 마커 유전자, 및 그들의 관련된 선택 및 선별 기법은 당업계에 공지되어 있으며, β-글루쿠로니다제(GUS), 녹색 형광 단백질(GFP), 항생제 저항성을 부여하는 단백질 및 제초제 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 전사 가능한 DNA 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선택 가능한 마커 이식유전자의 예는 서열번호 42로서 제공된다.
세포 형질전환
본 발명은 또한 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 형질전환된 세포 및 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
용어 "형질전환"은 수용자 숙주 내로 DNA 분자의 도입을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "숙주"는 박테리아, 진균, 또는 식물의 임의의 세포, 조직, 기관 또는 자손을 포함하는 박테리아, 진균 또는 식물을 지칭한다. 특정 관심 대상의 식물 조직 및 세포는 원형질체, 꽃, 근류, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아 및 꽃가루를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "형질전환된"은 외래 DNA 분자, 예컨대, 작제물이 도입된 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 DNA 분자가 후속적 자손에 의해 유전되도록 도입된 DNA 분자가 수용자 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "유전자이식" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손 및 교배 시 모체로서 이러한 유전자이식 유기체를 사용하고 외래 DNA 분자의 존재로부터 초래되는 변경된 표현형을 나타내는 번식 프로그램으로부터 생산된 자손을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 분자가 후속적 자손에 의해 유전되지 않도록 도입된 DNA 분자는 또한 수용자 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다. 용어 "유전자이식"은 하나 이상의 이종성 DNA 분자를 함유하는 박테리아, 진균 또는 식물을 지칭한다.
식물 세포 내로 DNA 분자를 도입하기 위해 당업자에게 잘 공지된 다수의 방법이 있다. 상기 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계 및 형질전환된 숙주 세포를 얻는 단계를 포함한다. 본 발명의 실행에서 식물 게놈 내로 식물 작제물을 도입함으로써 식물 세포를 형질전환하기 위한 방법 및 물질은 임의의 잘 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 특히 박테리아 감염(예를 들어, 아그로박테륨), 이원 BAC 벡터, DNA의 직접 전달(예를 들어, PEG-매개 형질전환, 건조/저해-매개 DNA 흡수, 전기천공, 탄화규소 섬유와 함께 교반, 및 DNA 코팅 입자의 가속화에 의함), 및 유전자 편집(예를 들어, CRISPR-Cas 시스템)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용은 개시된 합성 발현 요소가 당업계에 공지된 다양한 유전자 편집 방법을 이용함으로써 식물에서 조작될 수 있다는 것을 추가로 상정한다. 게놈 편집을 위해 사용된 이러한 기법은 ZFN(아연-핑거 뉴클레아제), 메가뉴클레아제, TALEN(전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제) 및 CRISPR(주기적으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-관련) 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 게놈 편집 방법은 식물 세포 내의 발현 요소 서열을 상이한 서열로 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
숙주 세포는 임의의 세포 또는 유기체, 예컨대, 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 진균, 박테리아 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포 및 형질전환된 세포는 작물 식물로부터의 세포를 포함할 수 있다.
유전자이식 식물은 후속적으로 본 발명의 유전자이식 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 통상적인 번식 기법 또는 자가-수분을 이용하여, 종자는 이 유전자이식 식물로부터 생산될 수 있다. 이러한 종자, 및 이러한 종자로부터 성장된 얻어진 자손은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유할 것이고, 따라서 유전자이식일 것이다.
본 발명의 유전자이식 식물은 본 발명의 동형 접합적 유전자이식 식물에 대한 종자(재조합 DNA 분자에 대한 동형 접합성)를 제공하도록 자가 수분될 수 있거나 또는 본 발명의 이형 접합적 유전자이식 식물에 대한 종자(재조합 DNA 분자에 대한 이형 접합성)를 제공하도록 비-유전자이식 식물 또는 상이한 유전자이식 식물과 교배될 수 있다. 이러한 동형 접합적 유전자이식 식물과 이형 접합적 유전자이식 식물은 둘 다 본 명세서에서 "자손 식물"로서 지칭된다. 자손 식물은 본래의 유전자이식 식물로부터 유래되고 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 유전자이식 식물이다. 본 발명의 유전자이식 식물을 이용하여 생산된 종자는 본 발명의 작제물을 포함하고, 관심 대상의 농업형질 유전자를 발현시키는 유전자이식 식물의 세대, 즉, 본 발명의 자손 식물을 성장시키기 위해 채취되고 사용될 수 있다. 상이한 작물에 대해 통상적으로 사용되는 번식 방법의 설명은 몇몇 참고문헌 중 하나에서 찾을 수 있다, 예를 들어, 문헌[Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249(1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) 및 Crop Species Soybean (Vol.2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987)] 참조.
형질전환된 식물은 관심 대상의 유전자 또는 유전자들의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 프로파일에 대해 분석될 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석에 대해 이용 가능한 수많은 방법을 알 것이다. 예를 들어, 식물 분석을 위한 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근, 생화학적 분석, 표현형 선별 방법, 임상 평가 및 면역진단 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전사 가능한 DNA 분자의 발현은 TaqMan(등록상표)(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 시약 및 제조업자에 의해 기재된 바와 같은 방법 및 TaqMan(등록상표) 시험 기질을 이용하여 결정된 PCR 주기 시간을 이용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 인베이더(Invader)(등록상표)(위스콘신주 메디슨에 소재한 써드 웨이브 테크놀로지즈(Third Wave Technologies)) 시약 및 제조업자에 의해 기재된 바와 같은 방법은 이식유전자 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배젖, 밑씨 및 꽃가루를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 식물 부분은 생육 가능, 생육 불능, 재생 가능 및/또는 재생 불가능일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고 제공한다. 본 발명의 형질전환된 또는 유전자이식 식물 세포는 재생 가능하고 그리고/또는 재생 불가능한 식물 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 유전자이식 식물 또는 이의 부분으로부터 생산된 상품을 제공한다. 본 발명의 상품은 서열번호 1 내지 32 및 서열번호 43 내지 45로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하는 검출 가능한 양의 DNA를 함유한다. 본 명세서에서 사용되는, "상품"은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 유전자이식 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물 부분으로부터 유래된 물질을 포함하는 임의의 조성물 또는 생성물을 지칭한다. 상품은 가공된 종자, 곡물, 식물 부분 및 음식을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 상품은 본 발명의 재조합 DNA 분자에 대응하는 검출 가능한 양의 DNA를 함유할 것이다. 샘플 내 이 DNA 중 하나 이상의 검출은 상품의 내용물 또는 공급원을 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 검출 방법을 포함하는, DNA 분자에 대한 임의의 표준 검출 방법이 사용될 수 있다.
본 발명은 예시에 의해 제공되고, 달리 구체화되지 않는 한, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는, 다음의 예를 참고로 하여 더 용이하게 이해될 수 있다. 다음의 실시예에서 개시된 기법은 본 발명의 실행에서 제대로 작용하는 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타낸다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 다수의 변화가 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나는 일 없이 개시된 그리고 비슷하거나 또는 유사한 결과를 얻는 구체적 실시형태에서 만들어질 수 있고, 따라서 수반하는 도면에 제시되거나 또는 나타낸 모든 대상은 예시적으로 그리고 제한적 의미가 아니도록 해석되어야 한다는 것을 인식하여야 한다.
실시예
실시예 1
합성 조절 요소의 설계, 합성 및 클로닝
표 1에 제공된 조절 요소는 알고리즘 방법을 통해 설계된 신규한 합성 발현 요소이다. 이들 컴퓨터로 설계된 합성 조절 요소를 화학적으로 합성하고 나서, 합성 조절 발현 요소 그룹(EXP)을 생성하기 위해 클로닝시켰다. 1,000개 훨씬 초과의 합성 조절 요소를 대두 원형질체에서 설계하고 분석하고 나서, 목적으로 하는 특징, 예컨대, 단백질 발현 수준 및 발현의 패턴을 제공하는 합성 조절 요소를 동정하도록 대두 식물을 안정적으로 형질전환시켰다. 표 1에 기재한 합성 조절 요소는 다수의 상이한 암호 서열 및 관심 대상의 농업형질의 간섭 RNA의 발현을 유도하는 데 유용한 발현의 다양한 패턴을 제공한다.
컴퓨터로 설계된 합성 조절 요소는 천연에서 존재하는 임의의 공지된 핵산 서열에 대해 연장된 상동성을 갖지 않는다. 합성 EXP 및 대응하는 프로모터, 리더, 인트론 및 3' UTR은 표 1에 제시한다. 합성 EXP는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 β-글루쿠로니다제(GUS) 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 이원 식물 형질전환 벡터 내로 클로닝시켰고, 안정적으로 형질전환된 대두, 목화 및 옥수수 식물에서 합성 EXP에 의해 제공된 발현 수준 및 패턴을 평가하기 위해 벡터를 사용하였다.
형질전환된 식물 조직을 이용하여 합성 조절 요소 전사 개시 부위(TSS) 및 인트론/엑손 스플라이스 접합의 분석을 수행할 수 있다. 간략하게, 식물은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 클로닝된 DNA 단편을 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된다. 다음에, cDNA 말단의 빠른 증폭을 위한 5' RACE 시스템(5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends), 버전 2.0(캘리포니아주 92008 칼스베드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 생성된 mRNA 전사체의 DNA 서열을 분석함으로써 합성 조절 요소 TSS 및 인트론/엑손 스플라이스 접합을 확인한다.
실시예 2
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 및 EXP-At.GSP221+At.Cyco:3의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
대두 식물을 내인성 EXP, EXP-At.Cyco:1:1(서열번호 38), 및 2개의 합성 EXP인 EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3(서열번호 1) 및 EXP-At.GSP221+At.Cyco:3(서열번호 30)을 포함하는 식물 GUS 발현 작제물로 형질전환시켰다. EXP-At.Cyco:1:1(서열번호 38)은 아라비돕시스로부터의 사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIa 유전자로부터 유래되고, 인트론(I-At.Cyco-1:1:1)(서열번호 41)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)(서열번호 40)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터(P-At.Cyco-1:1:2)(서열번호 39)를 포함한다. EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3(서열번호 1) 및 EXP-At.GSP221+At.Cyco:3(서열번호 30)은 각각 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터 및 리더를 포함하였다. I-At.Cyco-1:1:1의 서열에 포함된 인트론 스플라이스 부위 다음에 2개의 뉴클레오타이드가 있다는 것을 제외하고, I-At.Cyco:2의 서열(서열번호 33)은 I-At.Cyco-1:1:1의 서열(서열번호 41)과 동일하다. I-At.Cyco 인트론은 둘 다 이를 스플라이스한다.
당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 조절 요소를 기본 식물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 얻어진 식물 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역(B-AGRtu.우측 경계), 항생제인 스펙티노마이신에 대핸 저항성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 위해 사용되는 제1 이식유전자 선택 카세트; 고시피움 바바데스 FbLate-2 유전자(젠뱅크 등록번호: X04753)(T-Gb.FbL2:1, 서열번호 36)로부터의 3' UTR에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열번호 42)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP 서열을 포함하는 조절 요소의 활성을 평가하기 위한 제2 이식유전자 카세트; 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역(B-AGRtu.좌측 경계)을 함유하였다.
당업계에 잘 공지된 바와 같이 이들 이원 형질전환 벡터 작제물을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 대두 식물 세포를 형질전환시켰다. 전체 대두 식물을 형성하기 위해 얻어진 형질전환된 식물 세포를 유도하였다.
형질전환된 식물의 정성적 및 정량적 발현 분석을 위해 조직화학적 GUS 분석을 사용하였다. 전체 조직 절편을 적절한 길이의 시간 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로나이드)(1 밀리그램/밀리리터)와 함께 인큐베이션시키고 나서, 린스하고, 청색에 대해 시각적으로 검사하였다. 직접 시각적 검사 또는 선택된 식물 기관 및 조직을 이용하여 현미경 하에 검사에 의해 GUS 활성을 정성적으로 결정하였다.
GUS 발현의 정량적 분석을 위해, 형질전환된 대두 식물의 선택된 조직으로부터 총 단백질을 추출하였다. 총 반응 용적 50 마이크로리터로 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(MUG)와 함께 1마이크로그램의 총 단백질을 사용하였다. 반응 생성물인 4-메틸움벨리페론(4-MU)은 높은 pH에서 최대로 형광성이며, 여기서 하이드록실기는 이온화된다. 탄산나트륨의 염기성 용액의 첨가는 동시에 분석을 중단시키며, 형광 생성물을 정량화하기 위해 pH를 조절한다. 마이크로맥스 판독기(Micromax Reader)가 있는 플루오로맥스-3(Fluoromax-3)을 이용하여 여기 365㎚, 방출 445㎚로 형광을 측정하였고, 슬릿폭을 여기 2㎚ 및 방출 3㎚로 설정하였다. 값을 n㏖ GUS/시간/㎎ 총 단백질의 단위로 제공한다.
다음의 조직을 R0 세대; V5기 뿌리, 잎-수용부, 및 공급원-잎; R1기 뿌리, 잎-잎자루, 잎-공급원 및 꽃; R3기 종자-미숙 및 꼬투리; R5기 종자-자엽; 및 R8기 종자-배아 및 종자-자엽에서 GUS 발현에 대해 샘플링하였다. 표 2는 시험한 EXP 조절 요소 그룹에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타내되, "ND"는 특정 조직 내 발현이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.
| 합성 조절 요소 그룹 및 내인성 EXP인 EXP-At.Cyco:1:1에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서의 평균 정량적 GUS 발현. | ||||
| 발생 단계 |
기관 | EXP-At.Cyco:1:1(서열번호 38) | EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3(서열번호 1) | EXP-At.GSP221+At.Cyco:3(서열번호 30) |
| V5 | 뿌리 | 151 | 399 | 928 |
| 잎-수용부 | 39 | 65 | 59 | |
| 잎-공급원 | 52 | 109 | 100 | |
| R1 | 뿌리 | ND | 616 | 1893 |
| 잎-잎자루 | 97 | 470 | 136 | |
| 잎-공급원 | 46 | 177 | 240 | |
| 꽃 | 71 | 277 | 140 | |
| R3 | 종자-미숙 | 64 | 477 | ND |
| 꼬투리 | 84 | 575 | 702 | |
| R5 | 종자-자엽 | 91 | 564 | 58 |
| R8 | 종자-배아 | 57 | 149 | 301 |
| 종자-자엽 | 100 | 1118 | 414 | |
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 각각의 합성 조절 요소 그룹은 내인성 EXP에 비해 샘플링된 조직 내 발현의 독특한 패턴을 가진다. 예를 들어, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3(서열번호 1)의 합성 At.GSP442 프로모터인 P-At.GSP442.nno:2(서열번호 2) 및 리더인 L-At.GSP442.nno:1(서열번호 3)은 동일한 인트론 서열을 포함하는 내인성 EXP-At.Cyco:1:1(서열번호 38)에 비해 모든 분석 기관에서 더 큰 수준의 GUS 발현을 제공한다. TSS의 분석은 일관된 TSS를 입증하였다. 인트론은 예상한 바와 같이 얻어진 mRNA에서 적절하게 절단하였다. 추가로, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3(서열번호 30)의 합성 At.GSP221 프로모터인 P-AT.GSP221:3(서열번호 31) 및 리더인 L-At.GSP221:1(서열번호 32)은 또한 내인성 EXP-At.Cyco:1:1에 비해 분석한 대부분의 기관에서 더 고수준의 구성적 발현을 제공하고, 일관된 TSS를 입증한다. 그러나, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3의 TSS는 예측된 위치에 위치되지 않았다 - 다중 잠재적 TATA 요소가 있었다. 이는 다중 암호 서열을 생성할 수 있는 다중 전사체에 대한 잠재적 관심을 생성한다. 이렇게 해서, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3은 안정적으로 형질전환된 쌍자엽 식물에서 이식유전자 발현을 유도함에 있어서 사용하는 데 허용 가능한 것으로 고려되지 않았다. 이는 합성 발현 요소를 설계함에 있어서 복잡성 중 하나를 입증한다. 수많은 합성 요소는 합성 발현 요소의 발생 및 동정에서 분석하였지만, 작은 서브유닛만이 효과적인 합성 전사 조절 요소를 설계함에 있어서 복잡성을 예시하는 바람직한 특징 및 조절 활성을 제공하였다.
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3(서열번호 1) 내에 포함된 합성 프로모터인 P-At.GSP442.nno:2(서열번호 2) 및 L-At.GSP442.nno:1(서열번호 3)은 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 이식유전자 발현을 유도할 수 있다.
실시예 3
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성 At.
GSP571
프로모터 및 리더, 및 합성 At.
GSI21
및 At.
GSI102
인트론의
분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
합성 EXP인 EXP-At.GSP571(서열번호 4), EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2(서열번호 7), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10(서열번호 8) 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 10)을 포함하는 식물 GUS 발현 작제물을 이용하여 대두 식물을 형질전환시켰다. 각각의 합성 EXP는 합성 At.GSP571 프로모터(서열번호 5) 및 리더(서열번호 6)를 포함하였다. EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2는 내인성 아라비돕시스 인트론인 I-At.Cyco:2(서열번호 33)를 포함하였다. EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1은 각각 합성 인트론인 I-At.GSI21.nno:2(서열번호 9) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 포함하였다. 이원 식물 형질전환 벡터는 각각의 At.GSP571 EXP 벡터가 메디카고 트룬카툴라의 Sali3 유전자로부터 유래된 3' UTR인 T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 34)을 포함하였다는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재한 것과 유사하였다.
정량적 및 정성적 GUS 발현 분석은 실시예 2에 기재한 바와 같이 수행하였다. 분석을 위해 사용한 조직 샘플은 실시예 2에 기재한 것과 동일하였다. 표 3은 시험한 합성 EXP 조절 요소 그룹에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타내되, "ND"는 특정 조직 내 발현이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.
| 합성 조절 요소에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | |||||
| 발생단계 | 기관 | EXP-At.GSP571 (서열번호 4) | EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (서열번호 7) |
EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 (서열번호 8) | EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 (서열번호 10) |
| V5 | 뿌리 | 40 | 57 | 165 | 579 |
| 잎-수용부 | 650 | 612 | 792 | 1683 | |
| 잎-공급원 | 1379 | 1090 | 1475 | 2128 | |
| R1 | 뿌리 | 110 | ND | 457 | 645 |
| 잎-잎자루 | 951 | 1091 | 1267 | 1167 | |
| 잎-공급원 | 1995 | 3538 | 2094 | 2129 | |
| 꽃 | 703 | 830 | 1408 | 350 | |
| R3 | 종자-미숙 | 75 | 609 | 495 | 232 |
| 꼬투리 | 852 | 2228 | 4014 | 1535 | |
| R5 | 종자-자엽 | 650 | 474 | 540 | 1433 |
| R8 | 종자-배아 | 1153 | 1004 | 603 | 1122 |
| 종자-자엽 | 2449 | 4524 | 2533 | 2648 | |
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 At.GSP571 프로모터 및 리더는 분석한 모든 기관에서 구성적 발현을 제공한다. 발현은 잎 및 종자에서 가장 높았다. TSS의 분석은 일관된 TSS를 입증하였다. 인트론 서열을 작동 가능하게 연결하는 것은 다수의 기관에서 발현을 변경시켰는데, 이는 구성적 발현을 "미세-조율"하기 위한 수단을 제공한다. 합성 인트론인 I-At.GSI21.nno:2(서열번호 9) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 작동 가능하게 연결할 때 발현의 차이를 관찰하였다. 합성 인트론은 일부 조직에서 발현을 향상시켰지만, 각각의 기관에 대한 향상 수준은 상이하였다. 예를 들어, R3 꼬투리에서 합성 인트론 I-At.GSI21.nno:2를 이용하는 향상은 EXP-At.GSP571에 비해 합성 인트론 I-At.GSI102.nno:1 및 내인성 인트론 I-At.Cyco:2을 이용할 때 보이는 향상보다 더 높았다. 발현은 R1 잎자루에서 3개의 작동 가능하게 연결된 인트론에 의해 단지 약간 향상되었다. R1 꽃에서, I-At.GSI21.nno:2 및 I-At.Cyco:2는 발현을 향상시켰고, I-At.GSI21.nno:2는 고수준의 발현 향상을 제공하였으며, I-At.Cyco:2는 보통 수준의 향상을 제공하였다. 흥미롭게도, I-At.GSI102.nno:1은 R1 꽃에서 발현을 감소시켰다.
얻어진 mRNA의 분석은 인트론 요소의 적절하고 일관된 가공을 나타내었다.
EXP-At.GSP571(서열번호 4) 내에 포함된 합성 프로모터인 P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5) 및 리더 L-At.GSP571.nno:1(서열번호 6)은 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 발현을 제공한다. 각각 합성 인트론 I-At.GSI21.nno:2(서열번호 9) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 포함하는 아라비돕시스 인트론 I-At.Cyco:2(서열번호 33) 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10(서열번호 8) 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 10)을 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2(서열번호 7)는 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 구성적 발현의 독특한 패턴을 제공한다. 합성 인트론인 I-At.GSI21.nno:2(서열번호 9) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)은 EXP-At.GSP571(서열번호 4)에 작동 가능하게 연결된 다수의 식물 기관에서 향상되거나 또는 조절된 발현을 제공한다. 이들 독특한 발현 패턴은 특정 이식유전자를 유도하는 데 사용될 수 있는데, 이때 4개의 At.GSP571 EXP 중 하나의 특정 발현 패턴이 가장 바람직하다.
실시예 4
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성 At.
GSP564
프로모터 및 리더, 및 합성 At.
GSI17
및 At.
GSI102
인트론의
분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
합성 EXP인 EXP-At.GSP564(서열번호 12), EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2(서열번호 15), EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2(서열번호 16) 및 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 18)을 포함하는 식물 GUS 발현 작제물을 이용하여 대두 식물을 형질전환시켰다. 각각의 합성 EXP는 합성 P-At.GSP564.nno:3 프로모터(서열번호 13) 및 합성 L-At.GSP564.nno.1 리더(서열번호 14)를 포함하였다. EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2는 아라비돕시스 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)을 포함하였다. EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 및 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1은 각각 합성 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 포함하였다. 이원 식물 형질전환 벡터는 각각의 At.GSP564 EXP 벡터가 메디카고 트룬카툴라로부터의 추정 산화환원효소(OXR) 단백질 유전자로부터 유래된 3'UTR, T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 35)을 포함한다는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재한 것과 유사하였다.
정량적 및 정성적 GUS 발현 분석은 실시예 2에 기재한 바와 같이 수행하였다. 분석을 위해 사용한 조직 샘플은 실시예 2에 기재한 것과 동일하였다. 표 4는 시험한 합성 EXP 조절 요소 그룹에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타내되, "ND"는 특정 조직 내 발현이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.
| 합성 조절 요소에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | |||||
| 발생 단계 | 기관 | EXP-At.GSP564 (서열번호12) | EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 (서열번호15) |
EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (서열번호16) |
EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 (서열번호18) |
| V5 | 뿌리 | 61 | 108 | 54 | 145 |
| 잎-수용부 | 38 | 220 | 89 | 259 | |
| 잎-공급원 | 74 | 421 | 209 | 1229 | |
| R1 | 뿌리 | 118 | 165 | 2348 | 627 |
| 잎-잎자루 | 90 | 235 | 273 | 148 | |
| 잎-공급원 | 140 | 205 | 436 | 917 | |
| 꽃 | 66 | 91 | ND | 305 | |
| R3 | 종자-미숙 | 26 | ND | 101 | ND |
| 꼬투리 | 40 | ND | 749 | ND | |
| R5 | 종자-자엽 | 25 | 88 | 78 | 61 |
| R8 | 종자-배아 | 38 | 97 | 137 | 70 |
| 종자-자엽 | 79 | 288 | 655 | 572 | |
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 At.GSP564 프로모터 및 리더는 분석한 모든 기관에서 구성적 발현을 제공한다. 발현은 잎 및 종자에서 가장 높았다. TSS의 분석은 일관된 TSS를 입증하였다. 인트론 서열을 작동 가능하게 연결하는 것은 다수의 기관에서 발현을 변경시켰는데, 이는 구성적 발현을 "미세-조율"하기 위한 수단을 제공한다. 합성 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 작동 가능하게 연결할 때 발현의 차이를 관찰하였다. 합성 인트론은 EXP-At.GSP564에 비해 일부 조직에서 발현을 향상시켰지만, 각각의 기관에 대한 향상 수준은 상이하였다. 예를 들어, V5 공급원 잎에서 합성 인트론 I-At.GSI102.nno:1을 이용하는 향상은 합성 인트론 I-At.GSI17.nno:1을 이용하여 보인 향상보다 더 높았다. R1 뿌리에서, 합성 인트론 I-At.GSI17.nno:1을 이용하는 향상은 합성 인트론 I-At.GSI102.nno:1에 의해 부여되는 향상보다 더 높았다. 합성 인트론은 둘 다 내인성 인트론인 I-At.Cyco:2보다 R1 공급원 잎에서 더 큰 발현의 향상을 제공하였다.
얻어진 mRNA의 분석은 인트론 요소의 적절하고 일관된 가공을 나타내었다.
EXP-At.GSP564(서열번호 12)를 포함하는 합성 At.GSP564 프로모터인 P-At.GSP564.nno.3(서열번호 13) 및 리더인 L-At.GSP564.nno:1(서열번호 14)은 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 발현을 제공한다. 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)을 각각 포함하는 아라비돕시스 인트론 I-At.Cyco:2(서열번호 33) 및 합성 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2(서열번호 16) 및 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 18)을 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2(서열번호 15)는 안정적으로 형질전환된 대두 식물의 구성적 발현의 독특한 패턴을 제공한다. 합성 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17) 및 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)은 EXP-At.GSP564(서열번호 12)에 작동 가능하게 연결될 때 다수의 식물 기관에서 향상된 또는 조절된 이식유전자 발현을 제공한다. 이들 독특한 발현 패턴은 특정 이식유전자를 유도하는 데 사용될 수 있는데, 이때 4개의 At.GS564 EXP 중 하나의 특정 발현 패턴이 가장 바람직하다.
실시예 5
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
EXP인
EXP
-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 합성 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
합성 EXP인 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3(서열번호 22)을 포함하는 식물 GUS 발현 작제물을 이용하여 대두 식물을 형질전환시켰다. EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3은 합성 인트론인 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 At.GSP 프로모터 및 리더(각각 서열번호 20 및 21)로 이루어진 EXP-At.GSP579(서열번호 19)를 포함한다. GUS 이식유전자 카세트는 또한 메디카고 트룬카툴라로부터의 탈수-반응성 단백질 RD22 유전자로부터 유래된 3' UTR인 T-Mt.RD22-1:2:1(서열번호 37)을 포함한다.
정량적 및 정성적 GUS 발현 분석은 실시예 2에 기재한 바와 같이 수행하였다. 분석을 위해 사용한 조직 샘플은 실시예 2에 기재한 것과 동일하였다. 표 5는 합성 EXP인 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타내되, "ND"는 특정 조직 내 발현이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.
| EXP -At. GSP579.nno +At. GSI102.nno:3에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | ||
| 발생 단계 | 기관 | EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (서열번호22) |
| V5 | 뿌리 | 187 |
| 잎-수용부 | 311 | |
| 잎-공급원 | 458 | |
| R1 | 뿌리 | 148 |
| 잎-잎자루 | 118 | |
| 잎-공급원 | 425 | |
| 꽃 | 130 | |
| R3 | 종자-미숙 | ND |
| 꼬투리 | ND | |
| R5 | 종자-자엽 | ND |
| R8 | 종자-배아 | 127 |
| 종자-자엽 | 266 | |
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3(서열번호 22)은 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 구성적 발현을 제공한다. EXP-At.GSP579(서열번호 19) 내에 포함된 합성 프로모터 P-At.GSP579.nno:2(서열번호 20) 및 리더 L-At.GSP579.nno:1(서열번호 21)은 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 발현을 유도한다. 이는 샘플링한 기관의 적어도 일부에서 EXP-At.GSP579에 의해 부여된 구성적 발현을 I-At.GSI102.nno:1이 향상시키거나 또는 조절하는 다른 구성적 합성 프로모터에 합성 인트론인 I-At.GSI102.nno:1(서열번호 11)이 작동 가능하게 연결된 이전의 실시예에 의해 추론할 수 있다.
실시예
6
안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
EXP인
EXP
-At.GSP571.nno+At.Cyco:2의 분석
목화 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 합성 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
실시예 3에 기재한 것과 유사한 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2(서열번호 7)를 포함하는 식물 이원 벡터를 사용하여 목화 식물을 안정적으로 형질전환시켰다. GUS 이식유전자 카세트는 고시피움 바바데스 FbLate-2 유전자(T-Gb.FbL2:1, 서열번호 36)로부터의 3' UTR에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(젠뱅크 등록번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열번호 42)에 대한 암호 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2를 포함하였다. 얻어진 형질전환된 목화 사건을 성장시켰고, 조직 샘플은 4마디 잎; 8마디 잎자루, 수용부 잎 및 공급원 잎; 수정전 정사각형 포엽 및 정사각형 싹; 개화기 꽃밥 및 꽃 씨방으로부터 유래되었고; 그리고 수분 후 8일(Days After Pollination: (DAP)에 꼬투리 벽을 샘플링하고 나서, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석하였다.
표 6은 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타낸다.
| EXP -At. GSP571.nno +At. Cyco:2에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | ||
| 단계 | 기관 | 평균 |
| 4마디 | 잎 | 1232.57 |
| 8마디 | 잎, 잎자루 | 223.68 |
| 잎, 수용부 | 612.14 | |
| 잎, 공급원 | 618.9 | |
| 수정전 | 정사각형 포엽 | 381.69 |
| 정사각형 눈 | 347.22 | |
| 개화기 | 꽃밥 | 64.66 |
| 꽃, 씨방 | 210.92 | |
| 8DAP | 꼬투리 벽 | 835.94 |
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 조직에서 발현된 EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2를 샘플링하였다. 발현은 4마디 잎에서 가장 높았고, 개화기 꽃밥에서 가장 낮았다. 8마디 수용부 및 공급원 잎에서의 발현은 상대적으로 동일하고, 4마디 잎의 거의 절반이었다. 발현은 또한 꼬투리 벽에서 높았다. 표 6은 프로모터인 P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5)가 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 구성적 발현을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 내에서 인트론인 I-At.Cyco:2(서열번호 33)는 실시예 3에서 나타낸 바와 같이 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 P-At.GSP571.nno:5 프로모터의 발현을 향상시켰다.
실시예 7
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
키메라
프로모터 P-At.
GSP571
/442의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
대두 식물은 합성 프로모터 P-At.GSP442.nno:2(서열번호 2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결되고 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)(서열번호 40)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)(서열번호 3)와 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터 P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5)로부터 유래된 합성 인핸서 E-At.GSP571.nno:1(서열번호 24)를 포함하는 합성 키메라 프로모터 P-At.GSP571/442(서열번호 25)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1(서열번호 23)을 포함하는 식물 이원 벡터로 형질전환된다. GUS 이식유전자 카세트는 합성 3' UTR인 T-Zm.GST59.nno:1(서열번호 29)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(젠뱅크 등록번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열번호 42)에 대한 암호 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1을 포함하였다.
키메라 프로모터의 활성을 비교하기 위해 사용되는 식물 이원 벡터를 또한 작제하였다. 상기 벡터는 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)(서열번호 40)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)(서열번호 3)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터(P-At.GSP442.nno:2)(서열번호 2)를 포함하는 EXP인 EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco(서열번호 43)를 포함하였다. 상기 이원 벡터는 각각의 GUS 이식유전자 카세트가 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 합성 3' UTR인 T-Zm.GST59.nno:1(서열번호 29)을 가진다는 것을 제외하고, 실시예 2 내지 6에 기재한 것과 유사하다.
대두 식물은 2개의 이원 벡터로 형질전환되었다. 특정 발생 단계에서 선택한 기관의 조직 샘플을 취하고, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석하였다. 표 7은 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 및 EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco에 의해 유도된 각각의 샘플링 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타낸다.
| EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 및 EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서의 평균 정량적 GUS 발현. | |||
| EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco (서열번호43) | EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1 (서열번호23) | ||
| 단계 | 기관 | 평균 | 평균 |
| V5 | 잎, 수용부 | 69.61 | 72.12 |
| 잎, 공급원 | 88.22 | 96.06 | |
| 뿌리 | 74.67 | 102.9 | |
| R1 | 꽃 | 79.16 | 62.01 |
| 잎, 잎자루 | 77.07 | 87 | |
| 잎, 공급원 | 66.59 | 114.33 | |
| 뿌리 | 76.88 | 123.12 | |
| R3 | 꼬투리 | 93.19 | 102.54 |
| 종자, 미숙 | 71.15 | 61.62 | |
| R5 | 종자, 자엽 | 78.72 | 92.83 |
| R8 | 종자, 자엽 | 65.55 | 72.15 |
| 종자, 배아 | 129.95 | 107.66 | |
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 인핸서 E-At.GSP571.nno:1의 첨가는 다수의 샘플링 조직에서 발현을 향상시켰다. EXP는 둘 다 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 구성적 발현을 제공하였다. 합성 3' UTR인 T-Zm.GST59.nno:1은 전사체의 적절한 종결 및 폴리아데닐화를 제공함에 있어서 천연 3' UTR과 유사한 방식으로 작용하였다.
실시예 8
안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
키메라
프로모터 P-At.
GSP571
/442의 분석
목화 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 합성 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
목화 식물은 합성 프로모터 P-At.GSP442.nno:2(서열번호 2)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결되고 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더(L-At.Cyco-1:1:2)(서열번호 40)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 리더(L-At.GSP442.nno:1)(서열번호 3)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 합성 프로모터 P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5)로부터 유래된 합성 인핸서 E-At.GSP571.nno:1(서열번호 24)를 포함하는 합성 키메라 프로모터 P-At.GSP571/442(서열번호 25)를 포함하는 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1(서열번호 23)을 포함하는 식물 이원 벡터로 형질전환된다. GUS 이식유전자 카세트는 합성 3' UTR인 T-Zm.GST59.nno:1(서열번호 29)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(젠뱅크 등록번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열번호 42)에 대한 암호 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1을 포함하였다. 얻어진 형질전환된 목화 사건을 성장시켰고, 조직 샘플은 4마디 잎; 8마디 잎자루, 수용부 잎 및 공급원 잎; 수정전 정사각형 포엽 및 정사각형 싹; 개화기 꽃밥 및 꽃 씨방으로부터 유래되었고; 그리고 수분 후 8일(DAP)에 꼬투리 벽을 샘플링하고 나서, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석하였다.
표 8은 합성 EXP인 EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타내되, "bdl"은 검출 하한을 의미한다.
| EXP -At. GSP571.nno +At. GSP442.nno +At. Cyco:1에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | ||
| 단계 | 기관 | 평균 |
| 4마디 | 잎 | 177.74 |
| 8마디 | 잎, 잎자루 | bdl |
| 잎, 수용부 | 108.39 | |
| 잎, 공급원 | 294.99 | |
| 수정전 | 정사각형 포엽 | 78.84 |
| 정사각형 눈 | 118.21 | |
| 개화기 | 꽃밥 | 69.19 |
| 꽃, 씨방 | 69.78 | |
| 8DAP | 꼬투리 벽 | 159.58 |
표 8에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1(서열번호 23)은 샘플링한 조직에서 구성적 GUS 발현을 유도할 수 있었다. 잎자루에서 발현은 검출 하한이 되도록 결정하였다. 발현은 8마디 공급원 잎에서 가장 높았다. 발현은 개화 꽃밥 및 꽃 씨방에서 상대적으로 동일하였다. 추가로, 합성 3' UTR인 T-Zm.GST59.nno:1(서열번호 29)은 전사체의 적절한 종결 및 폴리아데닐화를 제공함에 있어서 천연 3' UTR과 유사한 방식으로 작용하였다.
실시예 9
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
EXP인
EXP
-At.GSP576.nno+At.Cyco:1의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 합성 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
대두 식물을 합성 EXP인 EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1(서열번호 45)을 포함하는 식물 이원 벡터로 형질전환시켰다. GUS 이식유전자 카세트는 또한 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 고시피움 바바데스 FbLate-2 유전자(T-Gb.FbL2:1, 서열번호 36)으로부터의 3' UTR을 포함하였다. 얻어진 형질전환된 대두 사건을 성장시켰고, 몇몇 발생 단계로부터 선택한 기관의 조직 샘플을 샘플링하고 나서, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석하였다. EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS의 발현을 표 9에 제시한다.
| EXP -At. GSP576.nno +At. Cyco:1에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | ||
| 발생 단계 | 기관 | 평균 |
| V5 | 뿌리 | 60.95 |
| 잎-수용부 | 97.43 | |
| 잎-공급원 | 181.64 | |
| R1 | 뿌리 | 82.4 |
| 잎-잎자루 | 208.28 | |
| 잎-공급원 | 214 | |
| 꽃 | 123.37 | |
| R3 | 종자-미숙 | 95.29 |
| 꼬투리 | 158.24 | |
| R5 | 종자-자엽 | 85.97 |
| R8 | 종자-배아 | 67.4 |
| 종자-자엽 | 52.92 | |
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1(서열번호 45)은 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 구성적 발현을 제공하였다. 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4(서열번호 27) 및 리더 L-At.GSP576.nno:2(서열번호 28)는 작동 가능하게 연결된 이식 유전자의 구성적 발현을 유도한다. 이는 I-At.Cyco:2가 샘플링된 기관의 적어도 일부에서 P-At.GSP576.nno:4에 의해 부여된 구성적 발현을 향상시키거나 또는 조절하는 다른 구성적 합성 프로모터에 인트론(I-At.Cyco:2)(서열번호 33)이 작동 가능하게 연결된 이전의 실시예에 의해 추론할 수 있다.
실시예 10
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
EXP인
EXP
-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시킨다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석한다.
대두 식물은 합성 EXP인 EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3(서열번호 26), 또는 EXP인 EXP-At.Cyco:1:1(서열번호 38) 중 하나를 포함하는 식물 이원 벡터로 형질전환시킨다. GUS 이식유전자 카세트는 또한 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 고시피움 바바데스 FbLate-2 유전자(T-Gb.FbL2:1, 서열번호 36)로부터의 3' UTR을 포함한다. 얻어진 형질전환된 대두 사건을 성장시키고, 몇몇 발생 단계로부터 선택한 기관의 조직 샘플을 샘플링하고 나서, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석한다. EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS의 발현을 EXP-At.Cyco:1:1에 의해 유도된 발현과 비교한다. EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 GUS의 발현은 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 발현을 유도하는 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4(서열번호 27) 및 리더 L-At.GSP576.nno:2(서열번호 28)의 능력을 입증한다.
실시예 9 및 11에서 입증한 바와 같이, 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4(서열번호 27) 및 리더 L-At.GSP576.nno:2(서열번호 28)는 작동 가능하게 연결된 이식 유전자의 구성적 발현을 유도한다. 실시예 4에서 입증한 바와 같이 합성 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17)은 EXP-At.GSP564(서열번호 12)에 작동 가능하게 연결될 때 다수의 식물 기관에서 향상된 또는 조절된 이식유전자 발현을 제공한다. 마찬가지로, 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4 및 리더 L-At.GSP576.nno:2의 발현이 유사한 방식으로 향상되거나 또는 조절된다는 것을 합리적으로 예상할 수 있다.
실시예 11
안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 GUS 발현을 유도하는 합성
EXP인
EXP
-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3의 분석
목화 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 합성 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 합성 조절 요소 그룹 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
목화 식물을 실시예 10에서 앞서 기재한 바와 같이 합성 EXP인 EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3(서열번호 26)을 포함하는 이원 벡터로 형질전환시켰다. GUS 이식유전자 카세트는 또한 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 고시피움 바바데스 FbLate-2 유전자(T-Gb.FbL2:1, 서열번호 36)로부터의 3' UTR을 포함하였다. 얻어진 형질전환된 목화 사건을 성장시켰고, 조직 샘플은 4마디 잎; 8마디 잎자루, 수용부 잎 및 공급원 잎; 수정전 정사각형 포엽 및 정사각형 싹; 개화기 꽃밥 및 꽃 씨방으로부터 유래되었고; 그리고 수분 후 8일(DAP)에 꼬투리 벽을 샘플링하고 나서, 정성적 및 정량적 GUS 발현에 대해 분석하였다.
표 10은 합성 EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3에 의해 유도된 각각의 샘플링된 조직에 대한 평균 정량적 GUS 발현을 나타낸다.
| EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3에 의해 유도된 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 평균 정량적 GUS 발현. | ||
| 단계 | 기관 | 평균 |
| 4마디 | 잎 | 579.03 |
| 8마디 | 잎, 잎자루 | 301.57 |
| 잎, 수용부 | 159.4 | |
| 잎, 공급원 | 577.11 | |
| 수정전 | 정사각형 포엽 | 262.66 |
| 정사각형 눈 | 223.59 | |
| 개화기 | 꽃밥 | 171.2 |
| 꽃, 씨방 | 109 | |
| 8DAP | 꼬투리 벽 | 433.64 |
표 10에서 알 수 있는 바와 같이, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3(서열번호 26)은 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 GUS 이식유전자의 구성적 발현을 유도하였다. 발현은 4마디 잎, 8마디 공급원 잎 및 8DAP 꼬투리 벽에서 가장 높았다. 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4(서열번호 27) 및 리더 L-At.GSP576.nno:2(서열번호 28)는 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 작동 가능하게 연결된 이식유전자의 구성적 발현을 유도할 수 있다. 실시예 4에서 입증한 바와 같이 합성 인트론인 I-At.GSI17.nno:1(서열번호 17)은 EXP-At.GSP564(서열번호 12)에 작동 가능하게 연결될 때 다수의 식물 기관에서 향상된 또는 조절된 이식유전자 발현을 제공한다. 마찬가지로, 합성 프로모터 P-At.GSP576.nno:4 및 리더 L-At.GSP576.nno:2의 발현이 안정적으로 형질전환된 목화 식물에서 유사한 방식으로 향상되거나 또는 조절된다는 것을 합리적으로 예상할 수 있다.
실시예 12
조절요소로부터 유래된 인핸서 요소
인핸서는 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39로서 제시된 프로모터 요소로부터 유래된다. 인핸서 요소는 프로모터 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가적인 인핸서 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결될 때, 전사 가능한 DNA 분자의 발현 수준을 향상시키거나 또는 조절하거나, 또는 특정 세포 유형 또는 식물 기관에서 또는 발생 또는 생물학적 주기의 리듬에서 특정 시점에 전사 가능한 DNA 분자의 발현을 제공할 수 있는 하나 이상의 시스 조절 요소를 포함할 수 있다. 서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39 또는 이들의 단편으로서 제시된 프로모터로부터 전사가 개시되도록 허용하는 프로모터로부터 TATA 박스 또는 기능적으로 유사한 요소 및 임의의 하류 서열을 제거함으로써 인핸서가 생성된다. 예를 들어, 합성 인핸서, E-At.GSP571.nno:1(서열번호 24)은 합성 프로모터인 P-At.GSP571.nno:5(서열번호 5)로부터 유래되었고, P-At.GSP571.nno:5의 뉴클레오타이드 1 내지 422로 이루어지며, 합성 프로모터의 TATA 박스를 또한 함유하는 3' 하류 서열을 제거한다.
인핸서 요소의 추가적인 개선이 필요할 수 있으며, 경험에 의해 입증된다. 추가로, 키메라 조절 요소 그룹 내의 다른 요소에 대한 인핸서 요소의 위치는 또한 경험에 의해 결정되는데, 키메라 조절 요소 그룹 내의 각각의 요소의 순서가 각각의 요소의 상대적 위치에 따라서 상이한 효과를 부여할 수 있기 때문이다. 일부 프로모터 요소는 다중 TATA 박스 또는 TATA 박스-유사 요소 및 잠재적으로 다중 전사 개시 부위를 가질 것이다. 해당 상황 하에서, 제1 TSS가 위치되는 경우를 처음 동정하는 것이 필요할 수 있고, 이어서, 전사의 잠재적 개시가 추정적 인핸서 요소 내에서 생기는 것을 방지하기 위해 제1 TSS를 이용하여 인핸서를 설계하는 것을 시작한다.
서열번호 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 및 39로서 제시된 합성 프로모터 요소로부터 유래된 인핸서 요소는 프로모터 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가적인 인핸서 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당업계에 공지된 방법을 이용하여 클로닝된다. 대안적으로, 인핸서 요소는 인핸서의 2개 이상의 복제물을 포함하고, 프로모터 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 키메라 전사 조절 요소를 생성하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 추가적인 인핸서 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당업계에 공지된 방법을 이용하여 클로닝된 거대 인핸서 요소를 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 클로닝될 수 있다. 인핸서 요소는 또한 상이한 유기체 속으로부터 유래된 프로모터 요소에 대해 5'에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 동일 또는 상이한 유기체 속 중 하나로부터 유래된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 다른 유기체 속으로부터 유래된 추가적인 인핸서 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결되도록 당업계에 방법을 이용하여 클로닝되어, 키메라 조절 요소를 생성할 수 있다. GUS 발현 식물 형질전환 벡터는 얻어진 식물 발현 벡터가 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역(B-AGRtu.우측 경계), 항생제인 스펙티노마이신에 대해 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택을 위해 사용되는 제1 이식유전자 선택 카세트; 및 프로모터 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결된 인핸서, 또는 3' 종결 영역, 및 아그로박테리움 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역(B-AGRtu.좌측 경계)에 작동 가능하게 연결된 감자 광-유도성 조직-특이적 ST-LS1 유전자(젠뱅크 등록번호: X04753)로부터 유래된 가공 가능한 인트론을 함유하는 β-글루쿠로니다제(GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1, 서열번호42)에 대한 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 리더 요소에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 프로모터에 결국 작동 가능하게 연결된 추가적인 인핸서 요소에 대해 5' 또는 3'에 작동 가능하게 연결된 인핸서를 포함하는 인핸서 요소를 시험하기 위한 제2 이식유전자 카세트를 함유하는 실시예 2에 기재된 작제물과 유사한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성될 수 있다. 얻어진 플라스미드는 실시예에 기재한 방법에 의해 대두 식물 또는 다른 식물 속을 형질전환시키기 위해 사용된다. 대안적으로, 대두 또는 다른 식물속으로부터 유래된 원형질체 세포는 일시적 분석을 수행하기 위해 당업계에 공지된 방법을 이용하여 형질전환된다.
하나 이상의 인핸서를 포함하는 조절 요소에 의해 유도된 GUS 발현은 전사 가능한 DNA 분자의 발현에 대한 인핸서 요소의 효과를 결정하기 위해 안정한 또는 일시적 식물 분석에서 평가된다. 하나 이상의 인핸서 요소에 대한 변형 또는 하나 이상의 인핸서 요소의 중복은 경험적 실험 및 각각의 조절 요소 조성물을 이용하여 관찰된 얻어진 유전자 발현 조절에 기반하여 수행될 수 있다. 얻어진 조절 또는 키메라 조절 요소에서 하나 이상의 인핸서의 상대적 위체를 변경시키는 것은 조절 또는 키메라 조절 요소의 전사 활성 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있고, 대두 식물 또는 다른 식물속 내에서 목적으로 하는 이식유전자 발현 프로파일에 대한 최고의 인핸서를 동정하기 위해 경험적으로 결정된다.
실시예 13
안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 합성 3'
UTR인
T-
Zm
.
GST7.nno:2에
의해 부여된 GUS 발현에 대한 효과의 분석
대두 식물을 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 식물을 발현에 대한 선택된 조절 요소의 효과를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
대두 식물을 GUS 발현을 유도하는 EXP-At.GSP571(서열번호 4)을 포함하는 2개의 이원 벡터로 형질전환시켰다. GUS 이식유전자 카세트는 또한 내인성 3'UTR T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 34) 또는 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2(서열번호 44) 중 하나를 포함하였다. GUS 단백질 발현은 2개 작제물로 안정적으로 형질전환된 대두 식물의 기관에서 정량적으로 측정하였다. 작제물 간에 GUS의 발현을 비교하였다. 이하의 표 11은 내인성 3'UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1에 비해 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2에 의해 조절된 평균 GUS 발현을 나타내되, "nd"는 결정되지 않음을 의미하고, "bdl"은 검출 하한의 의미한다.
| 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 평균 정량적 GUS 발현 | ||||
| 발생 단계 | 기관 |
T-
Mt
.
Sali3
-2-1:2:1
( 서열번호34 ) |
T-
Zm
.
GST7.nno:2
( 서열번호44 ) |
감쇠 배수 |
| V5 | 뿌리 | 40 | bdl | |
| 잎-수용부 | 650 | 88 | 7.4 | |
| 잎-공급원 | 1379 | 278 | 5.0 | |
| R1 | 뿌리 | 110 | 72 | 1.5 |
| 잎-잎자루 | 951 | 199 | 4.8 | |
| 잎-공급원 | 1995 | 642 | 3.1 | |
| 꽃 | 703 | 139 | 5.1 | |
| R3 | 종자-미숙 | 75 | bdl | |
| 꼬투리 | 852 | 386 | 2.2 | |
| R5 | 종자-자엽 | 650 | 174 | 3.7 |
| R8 | 종자-배아 | 1153 | nd | |
| 종자-자엽 | 2449 | nd | ||
표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2는 분석한 모든 조직에서 3' UTR인 T-Mt.Sali3-2-1:2:1에 비해 발현이 감쇠되었다. 감쇠 정도는 각각의 조직에 대해 R1 뿌리에서 1.5배로부터 V5 수용부 잎에서 7.4배까지 다양하였다. 안정적으로 형질전환된 식물에서 발현을 감쇠시키기 위한 3' UTR의 사용은 큰 효용을 가진다. 예를 들어, 3' UTR은 이식유전자의 발현을 미세 조율하기 위해 다른 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리더 및 인트론과 조합하여 사용될 수 있되, 특히, 고발현은 형질전환된 식물에 대해 유해한 표현형을 벗어난 효과를 야기할 수 있다. 얻어진 GUS 전사체의 분석은 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2에 의해 부여되는 전사체의 적절한 종결을 확인하였다. 합성 3'UTR인 T-Zm.GST7.nno:2는 안정적으로 형질전환된 대두 식물에서 발현을 조절하고 전사를 적절하게 종결시킬 수 있다.
실시예
14
옥수수 원형질체 세포에서 GUS
발현에 대한 합성 3
'
UTR인
T-
Zm
.
GST7.nno:2
및 T-
Zm
.
GST59.nno:1의
분석
옥수수 잎 원형질체를 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 시험 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환된 옥수수 잎 원형질체를 발현에 대해 선택된 조절 요소를 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
잎 조직으로부터 유래된 옥수수 원형질체를 합성 발현 요소를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시켰고, 당업계에 공지된 발현 요소와 비교하였다. 두 발현 벡터를 작제하여 합성 3' UTR인 T-Zm.GST7.nno:2(서열번호 44) 및 T-Zm.GST59.nno:1(서열번호 29)의 활성을 평가하였고, 두 작제물 발현 벡터를 또한 작제하였다. 각각의 4개의 작제물은 GUS 암호 서열인 GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1(서열번호 42)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 인트론 I-Zm.DnaK:1(서열번호 47)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 리더인 EXP-CaMV.35S(서열번호 46) 및 구성적 프로모터를 포함하는 이식유전자 카세트를 포함하였다. 합성 3' UTR을 평가하기 위해 사용한 발현 벡터는 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 T-Zm.GST7.nno:2 또는 T-Zm.GST59.nno:1 중 하나를 포함하였다. 하나의 대조군 벡터는 GUS 암호 서열에 대해 3'에 작동 가능하게 연결된 3' UTR T-Os.LTP:1(서열번호 48)을 포함하였다. 다른 대조군 벡터는 3' UTR을 결여하였다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 원형질체의 공동 형질전환 및 데이터의 정규화에서 사용되는 플라스미드를 또한 작제하였다. 3' UTR인 T-Os.LTP:1(서열번호 48)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 NanoLuc(등록상표) 루시퍼라제 형광 단백질(위스콘신주 53711 메디슨에 소재한 프로메가(Promega))인 Nluc(서열번호 49)를 암호화하는 암호 서열에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 EXP-CaMV.35S(서열번호 46)를 포함한 이식유전자 카세트를 포함하였다.
옥수수 잎 원형질체는 당업계에 공지된 것과 유사한 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 원형질체 세포를 96개의 웰 형식에서 형질전환시켰다. 12 마이크로그램의 시험 벡터 DNA 또는 대조군 벡터 DNA, 및 6 마이크로그램의 NanoLuc(등록상표) 벡터 DNA를 사용하여 3.2 × 105개의 원형질체/웰을 형질전환시켰다. 형질전환 후에, 원형질체를 25℃로 암실에서 16 내지 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 원형질체를 용해시키고 나서, 루시퍼라제 및 GUS 발현을 측정하기 위해 용해물을 사용하였다. 세포를 용해시키기 위해, 원심분리를 통해 플레이트 내 세포를 펠릿화하였고, 세척 후에, 소 용적으로 재현탁시키고 나서, 웰 관을 벗기기 위해 옮겼다. 관을 다시 원심분리시키고 나서, 상청액을 흡입하여 원형질체 세포 펠릿을 뒤에 남겼다. 세포 펠릿을 QB 완충제(100mM KPO4, pH 7.8; 1mM EDTA; 1% 트리톤(Triton) X-100; 10% 글리세롤; 1mM DTT) 중에서 재현탁시켰다. 세포를 몇회 격렬하게 피펫팅함으로써 세포를 용해시키고, 관을 교반시키고 나서, 5분 동안 얼음 상에서 관을 인큐베이션시켰다. 이어서, 용해물을 원심분리시켜 세포 파편을 펠릿화하였다. 이어서, 얻어진 용해물을 깨끗한 플레이트에 전달하였다.
QB 완충제 중의 나노-글로(Nano-Glo)(등록상표) 루시퍼라제 활성 기질(위스콘신주 53711 메디슨에 소재한 프로메가)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 요약하면, 소 용적의 용해물, QB 완충제 및 나노-글로(등록상표) 루시퍼라제 분석 기질/QB 용액을 흰색의 96 웰 플레이트에서 함께 혼합하였다. 이어서, PHERAstar(등록상표) 플레이트 판독기(노스캐롤라이나주 27513 캐리에 소재한 BMG 랩테크 인코포레이티드(BMG LABTECH Inc.))를 이용하여 형광을 측정하였다.
50 마이크로리터의 총 반응 용적으로 형광원 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드(MUG)를 이용하여 GUS 활성을 분석하였다. 반응 생성물인 4-메틸움벨리페론(4-MU)은 높은 pH에서 최대로 형광성이며, 여기서 하이드록실기는 이온화된다. 탄산나트륨의 염기성 용액의 첨가는 동시에 분석을 중단시키며, 형광 생성물을 정량화하기 위해 pH를 조절한다. 용해물의 분취액을 QB 완충제 중에 용해된 MUG의 분취액과 혼합하고 나서, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 용해물/MUG 반응 혼합물의 적은 분취액을 제거하고 나서, 3가지 상이한 시점; (1) "0분 시점"으로서 용해물/MUG 반응물을 혼합한 직후; (2) 20분; 및 (3) 60분에 중단 완충제에 첨가하였다. PHERAstar(등록상표) 플레이트 판독기(노스캐롤라이나주 27513 캐리에 소재한 BMG 랩테크 인코포레이티드)를 이용하여 여기 355㎚, 방출 460㎚에서 형광을 측정하였다.
각각의 발현 벡터에 대해 플레이트 당 4 내지 8회의 형질전환으로 적어도 2개의 플레이트를 형질전환에서 사용하였다. 각각의 플레이트에 대해, 각각의 작제물을 4 내지 8개의 웰에서 형질전환시킨다. MUG 분석을 위해 각각의 형질전환으로부터 분취액을 취하고 나서, "가수분해된 nM MUG"는 플레이트 내-표준 곡선으로부터 유도한다. 또한 NanoLuc(등록상표) 판독(NanoLuc(등록상표) RLU)에 대해 각각의 형질전환으로부터 분취액을 취한다. 각각의 발현 벡터에 대한 평균 가수분해된 nM MUG/NanoLuc(등록상표) RLU을 100%로 설정한 EXP-CaMV.35S/I-Zm.DnaK:1/T-Os.LTP:1 발현 벡터에 대해 정규화시킨다. 표 12는 합성 3' UTR T-Zm.GST7.nno:2 및 T-Zm.GST59.nno:1 및 대조군을 포함하는 각각의 발현 벡터에 대해 형질전환에서 사용되는 모든 플레이트에 대한 평균의 평균을 나타낸다.
| 각각의 발현 벡터에 대한 평균 가수분해된 nM MUG/NanoLuc(등록상표) RLU의 평균. | ||
| 3' UTR | 평균의 평균 | 표준오차 |
| T-Os.LTP:1 | 100.00 | 8.09 |
| No 3' UTR | 51.95 | 4.71 |
| T-Zm.GST59.nno:1 | 505.45 | 37.75 |
| T-Zm.GST7.nno:2 | 345.31 | 40.73 |
표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 3' UTR이 없는 발현 벡터는 T-Os.LTP:1 대조군보다 더 적은 발현을 제공하였다. 발현은 T-Os.LTP:1 대조군에 비해 합성 3'UTR T-Zm.GST7.nno:2 및 T-Zm.GST59.nno:1에 의해 향상되었다. 전사체의 분석은 합성 3'UTR T-Zm.GST7.nno:2 및 T-Zm.GST59.nno:1에 의해 부여된 적절한 종결을 입증하였다. 합성 3' UTR T-Zm.GST7.nno:2 및 T-Zm.GST59.nno:1은 형질전환된 옥수수 잎 원형질체 세포에서 발현을 조절하고 전사를 적절하게 종결시킬 수 있다.
실시예 15
목화 잎 원형질체에서 GUS를 유도하는 조절 요소의 분석
목화 잎 원형질체를 벡터, 구체적으로는 β-글루쿠로니다제(GUS) 이식유전자의 발현을 유도하는 조절 요소 그룹을 함유하는 발현 벡터로 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환된 목화 잎 원형질체를 발현에 대해 선택된 조절 요소 그룹을 평가하기 위해 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.
잎 조직으로부터 유래된 목화 원형질체를 합성 발현 요소를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시켰고, 당업계에 공지된 발현 요소와 비교하였다. EXP인 EXP-At.GSP571(서열번호 4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10(서열번호 8), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 10), EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2(서열번호 16) 및 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3(서열번호 22)의 활성을 평가하기 위해 별개의 실험을 수행하였다. 발현 요소를 발현 벡터에 클로닝시키고 나서, 가공 가능한 인트론을 포함한 GUS 암호 서열인 GOI-Ec.uidA+St.LS1:1:1(서열번호 42)에 작동 가능하게 연결된다. 대조군 발현 벡터는 공지된 발현 요소의 상이한 입체배치를 포함하였다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 공동 형질전환 및 데이터의 정규화에서 사용하기 위한 2개의 플라스미드를 또한 작제하였다. 각각의 플라스미드는 구성적 EXP 서열에 의해 유도된 구체적 루시퍼라제 암호 서열을 함유하였다. 식물 벡터 pFLUC는 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성효소 유전자(T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열번호 55)로부터의 3' UTR에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 반딧불이(포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)) 루시퍼라제 암호 서열(루시퍼라제LUCIFERASE:1:3, 서열번호 54)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 인트론(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1, 서열번호 53)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 구성적 프로모터를 갖는 이식유전자 카세트를 포함하였다. 식물 벡터 pRLUC는 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성효소 유전자(T-AGRtu.nos-1:1:13, 서열번호 55)로부터의 3' UTR에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 바다 팬지(레닐라 레니포미스(Renilla reniformis)) 루시퍼라제 암호 서열(CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, 서열번호 57)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 구성적 EXP 서열(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1, 서열번호 56)을 갖는 이식유전자 카세트를 포함하였다.
목화 잎 원형질체는 당업계에 공지된 PEG-기반 형질전환 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 원형질체 세포를 플라스미드인 pFLUC 및 pRLUC, 및 등몰량의 EXP 발현 벡터로 형질전환시켰다. 상기와 같은 형질전환된 세포의 용해된 제제의 분취액을 두 상이한 작은-웰 트레이에 위치시킴으로써 GUS와 루시퍼라제 둘 다의 측정을 수행하였다. GUS 측정을 위해 하나의 트레이를 사용하였고, 이중 루시퍼라제 리포터 분석 시스템(위스콘신주 메디슨에 소재한 프로메가 코포레이션(Promega Corp.); 예를 들어, 문헌[Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02] 참조)을 이용하여 이중 루시퍼라제 분석을 수행하기 위해 제2 트레이를 사용하였다. 샘플 측정은 실시예 14에 제시된 것과 유사한 다중 형질전환에 기반하였다. 평균 GUS/FLUC 값은 실시예 14와 유사한 방식으로 계산하였지만, 대조군 EXP 벡터에 대해 정규화되지 않았다.
EXP인 EXP-At.GSP571(서열번호 4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10(서열번호 8) 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 10)을 3' UTR인 T-Mt.Sali3-2-1:2:1(서열번호 34)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 GUS 암호 서열(서열번호 42)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 식물 발현 벡터로 클로닝시켰다. 두 대조군 식물 발현 벡터를 목화 잎 원형질체에서 불량하게 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2(서열번호 50) 및 목화 잎 원형질체에서 잘 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 51)으로 작제하였다. 대조군 EXP를 동일한 GUS 및 3' UTR 서열에 작동 가능하게 연결하였다. 추가로, GUS에 작동 가능하게 연결된 EXP인 EXP-At.GSP571(서열번호 4)을 포함하는 GUS 이식유전자 카세트를 포함하는 식물 발현 벡터는 합성 3' UTR의 활성을 평가하기 위해 합성 3' UTR인 T-Zm.GST7.nno:2(서열번호 44)를 포함한다. 다중 형질전환을 위한 평균 GUS/FLUC 값을 표 13에 제시한다.
| 형질전환된 목화 잎 원형질체로부터의 평균 GUS/ FLUC 값 | ||||
| EXP |
EXP
서열 번호 |
3' UTR |
3'
UTR
서열 번호 |
평균 GUS/FLUC |
| EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2 | 50 | T-Mt.Sali3-2-1:2:1 | 34 | 0.09 |
| EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 | 51 | T-Mt.Sali3-2-1:2:1 | 34 | 1.70 |
| EXP-At.GSP571 | 4 | T-Mt.Sali3-2-1:2:1 | 34 | 0.56 |
| EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:10 | 8 | T-Mt.Sali3-2-1:2:1 | 34 | 1.02 |
| EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1 | 10 | T-Mt.Sali3-2-1:2:1 | 34 | 0.95 |
| EXP-At.GSP571 | 4 | T-Zm.GST7.nno:2 | 44 | 0.46 |
표 13에서 알 수 있는 바와 같이, EXP인 EXP-At.GSP571(서열번호 4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno:2(서열번호 8) 및 EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno:1(서열번호 10)은 목화 잎 원형질체 세포에서의 발현을 입증하였다. 합성 3' UTR인 T-Zm.GST7.nno:10(서열번호 44)은 내인성 3' UTR인 T-Mt.Sali3-2-1:2:1과 유사한 방식으로 작용하였다.
EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2(서열번호 16)는 내인성 3' UTR인 T-Mt.Oxr-1:2:1(서열번호 35)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 GUS 암호 서열(서열번호 42)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 식물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 두 대조군 식물 발현 벡터를 목화 잎 원형질체에서 불량하게 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-Gm.Sphas1:1:1(서열번호 52) 및 목화 잎 원형질체에서 잘 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 51)으로 작제하였다. 대조군 EXP를 동일한 GUS 및 3' UTR 서열에 작동 가능하게 연결하였다. 다중 형질전환을 위한 평균 GUS/FLUC 값을 표 14에 제시한다.
| 형질전환된 목화 잎 원형질체로부터의 평균 GUS/ FLUC 값 | ||||
| EXP |
EXP
서열 번호 |
3' UTR |
3'
UTR
서열 번호 |
평균 GUS/FLUC |
| EXP-Gm.Sphas1:1:1 | 52 | T-Mt.Oxr-1:2:1 | 35 | 0.01 |
| EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 | 51 | T-Mt.Oxr-1:2:1 | 35 | 2.30 |
| EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 | 16 | T-Mt.Oxr-1:2:1 | 35 | 0.34 |
표 14에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 EXP인 EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:1(서열번호 16)은 목화 잎 세포 원형질체에서의 발현을 입증하였다.
EXP인 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3(서열번호 22)은 내인성 3' UTR인 T-Mt.RD22-1:2:1(서열번호 37)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 GUS 암호 서열(서열번호 42)에 대해 5'에 작동 가능하게 연결된 식물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 두 대조군 식물 발현 벡터를 목화 잎 원형질체에서 불량하게 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-Gm.Sphas1:1:1(서열번호 52) 및 목화 잎 원형질체에서 잘 발현하는 것으로 알려진 EXP인 EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3(서열번호 51)으로 작제하였다. 대조군 EXP를 동일한 GUS 및 3' UTR 서열에 작동 가능하게 연결하였다. 다중 형질전환을 위한 평균 GUS/FLUC 값을 표 15에 제시한다.
| 형질전환된 목화 잎 원형질체로부터의 평균 GUS/ FLUC 값 | ||||
| EXP |
EXP
서열 번호 |
3' UTR |
3'
UTR
서열 번호 |
평균
GUS/ FLUC |
| EXP-Gm.Sphas1:1:1 | 52 | T-Mt.RD22-1:2:1 | 37 | 0.01 |
| EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 | 51 | T-Mt.RD22-1:2:1 | 37 | 2.88 |
| EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 | 22 | T-Mt.RD22-1:2:1 | 37 | 1.19 |
표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 합성 EXP인 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3(서열번호 22)은 목화 잎 세포 원형질체에서의 발현을 입증하였다.
본 발명의 원칙을 예시하고 기재하였지만, 본 발명은 이러한 원칙으로부터 벗어나는 일 없이 정연하게 그리고 상세하게 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 분명하여야 한다. 본 발명자들은 청구범위의 정신 및 범주 내인 모든 변형을 특허청구한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 공개된 특허 문헌은 각각의 개개 간행물 또는 특허 출원이 참고로 편입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시하는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 편입된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Monsanto Technology LLC
<120> PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF
<130> WO/2018/136594
<140> PCT/US2018/014155
<141> 2017-01-18
<150> US 62/448,019
<151> 2017-01-19
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 855
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3.
<400> 1
tgttaatgtt atccgaacta gtcataatta caaccgacaa aataaggtta ttttgtgtgt 60
tatagaattt tttggacagt ttttgttttg gttttcgatt gtagtaaaaa tagatttatg 120
taataagatt tacttttctt gttgaaacaa aataatctta gaattaactc aacttttatg 180
ttagaacaaa tgataaaaaa atttcccctt ttctatgcga ttattttcaa tcagagagaa 240
atacatataa tatatataat tcaaattaat ctgccaaatt aataaatttg gattaaaatt 300
tataaatgaa acaatggtgt aaggcaatta aaaacacaac actaaaaata tgagaacatt 360
ttatctgggc attaagagtt tgggctttag atctaaaata aaggccggcc caacgagaat 420
attaaaccct aattgaccta gttccctata tatataaacc ctatatttct ctcgtcactc 480
ctcaactctc agctaaacca cggaccgcag gtaatttctc tcctctctat ttttaccatt 540
ttccattgac gacgatctag gttttctgat ttgattttgg agaacgcctc gatgagttta 600
tagattcgta gattggtttt gagattcagt ataatttcac ccggattcca atttttgaac 660
cgatacctaa ttttgaattg atttggtaga tcgattggtc aaatttgaaa ttgatttttc 720
tccataatat ctgaagcgtc ttattggatc aaatctacaa catttctctg ttgaaaggat 780
cgattttttt tttcttggaa catgataact tttgattatt catcaaagtt ttgttctttt 840
taatatttca caggt 855
<210> 2
<211> 480
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic promoter, P-At.GSP442.nno:2.
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tatagaattt tttggacagt ttttgttttg gttttcgatt gtagtaaaaa tagatttatg 120
taataagatt tacttttctt gttgaaacaa aataatctta gaattaactc aacttttatg 180
ttagaacaaa tgataaaaaa atttcccctt ttctatgcga ttattttcaa tcagagagaa 240
atacatataa tatatataat tcaaattaat ctgccaaatt aataaatttg gattaaaatt 300
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ttatctgggc attaagagtt tgggctttag atctaaaata aaggccggcc caacgagaat 420
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<212> DNA
<213> Artificial
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agtacaatca tacaagagca atatatatat ttttggttat tgaaatttaa atatcatctt 60
cacaaaatga aaaagcacaa aaagtattaa ttaatatcat gttttgagac tcctttttac 120
caagaatata aatttcacac ctaagaaaat tctgaactag gaaaataacc agcatacaat 180
taaggaataa gaaaatgcaa ttacgataaa cacttgtcac aaattgttta ataagtcact 240
atccaatcaa ttatcaaaag taagatattg ccacgtggca accagtattt tcatcacctt 300
atcaaaagat aagcaaaaga accacatcaa agccacaaaa tgccaaccac agatggataa 360
ggaaaatcca accaaccaca tgtaatccca cacctcatca ccttatccac acctctgtct 420
atatatataa acacacactt cgtaaccact catcactcac cacaaacaga gaatatctca 480
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<213> Artificial
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cacaaaatga aaaagcacaa aaagtattaa ttaatatcat gttttgagac tcctttttac 120
caagaatata aatttcacac ctaagaaaat tctgaactag gaaaataacc agcatacaat 180
taaggaataa gaaaatgcaa ttacgataaa cacttgtcac aaattgttta ataagtcact 240
atccaatcaa ttatcaaaag taagatattg ccacgtggca accagtattt tcatcacctt 300
atcaaaagat aagcaaaaga accacatcaa agccacaaaa tgccaaccac agatggataa 360
ggaaaatcca accaaccaca tgtaatccca cacctcatca ccttatccac acctctgtct 420
atatatataa acacacactt cgtaaccact catcactcac cacaaacaga gaatatctca 480
tctcttctta gcaaacaaag tttcaggttt agctttctct ccgatctcgg ctttcgatct 540
gatctcgtct gatctccgat ttcgatcccc gtccgatctc gatctgatcc catccgatct 600
gtgattgatt cgttgagatt cagatctgat cttaggatct ctctgataga tcatagattc 660
aatctctcga gatagagatg attgatgttg ttcagatcgg ttttgatctc tgatctgatc 720
agctcgattg attcgatttg attctcgatt cgatttgatc gacaattgat ctgattctct 780
aattgatgtt ctgtttttgt tacaggtttt 810
<210> 11
<211> 310
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic intron, I-At.GSI102.nno:1.
<400> 11
tttcaggttt agctttctct ccgatctcgg ctttcgatct gatctcgtct gatctccgat 60
ttcgatcccc gtccgatctc gatctgatcc catccgatct gtgattgatt cgttgagatt 120
cagatctgat cttaggatct ctctgataga tcatagattc aatctctcga gatagagatg 180
attgatgttg ttcagatcgg ttttgatctc tgatctgatc agctcgattg attcgatttg 240
attctcgatt cgatttgatc gacaattgat ctgattctct aattgatgtt ctgtttttgt 300
tacaggtttt 310
<210> 12
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP564.
<400> 12
agagttacaa tatagagaaa aaatgtattc tgtgtttttc acttttcttc ttctttgaaa 60
atccaaaaac aactatttat tgattggcaa attgcatcaa atttttcatg ctaaatccaa 120
cataaatata aaatctttta atcaaataca gaatctaaag atagtagggt tttttttatt 180
taaaatgatg tttcaaaaaa ttagaaagca tgttttccac acttggaaaa tataaataaa 240
ttaagattta ttttttccca aacaagataa atctataaat attcatcaca atcacgtgta 300
caaaaataaa tccaacaaga gataaggata agccaacgga cccatatatt aggcccattt 360
taaaataagg aaataagcag ataattatcc accaccttat ccaaaaccct agatccacaa 420
cataaatctc tataaaaacc cttttcactc acactcacat cactcacata agaactaaaa 480
tctctaaaga gtcgtctctg 500
<210> 13
<211> 461
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic promoter, P-At.GSP564.nno:3.
<400> 13
agagttacaa tatagagaaa aaatgtattc tgtgtttttc acttttcttc ttctttgaaa 60
atccaaaaac aactatttat tgattggcaa attgcatcaa atttttcatg ctaaatccaa 120
cataaatata aaatctttta atcaaataca gaatctaaag atagtagggt tttttttatt 180
taaaatgatg tttcaaaaaa ttagaaagca tgttttccac acttggaaaa tataaataaa 240
ttaagattta ttttttccca aacaagataa atctataaat attcatcaca atcacgtgta 300
caaaaataaa tccaacaaga gataaggata agccaacgga cccatatatt aggcccattt 360
taaaataagg aaataagcag ataattatcc accaccttat ccaaaaccct agatccacaa 420
cataaatctc tataaaaacc cttttcactc acactcacat c 461
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic leader, L-At.GSP564.nno:1.
<400> 14
actcacataa gaactaaaat ctctaaagag tcgtctctg 39
<210> 15
<211> 855
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2.
<400> 15
agagttacaa tatagagaaa aaatgtattc tgtgtttttc acttttcttc ttctttgaaa 60
atccaaaaac aactatttat tgattggcaa attgcatcaa atttttcatg ctaaatccaa 120
cataaatata aaatctttta atcaaataca gaatctaaag atagtagggt tttttttatt 180
taaaatgatg tttcaaaaaa ttagaaagca tgttttccac acttggaaaa tataaataaa 240
ttaagattta ttttttccca aacaagataa atctataaat attcatcaca atcacgtgta 300
caaaaataaa tccaacaaga gataaggata agccaacgga cccatatatt aggcccattt 360
taaaataagg aaataagcag ataattatcc accaccttat ccaaaaccct agatccacaa 420
cataaatctc tataaaaacc cttttcactc acactcacat cactcacata agaactaaaa 480
tctctaaaga gtcgtctctg cggaccgcag gtaatttctc tcctctctat ttttaccatt 540
ttccattgac gacgatctag gttttctgat ttgattttgg agaacgcctc gatgagttta 600
tagattcgta gattggtttt gagattcagt ataatttcac ccggattcca atttttgaac 660
cgatacctaa ttttgaattg atttggtaga tcgattggtc aaatttgaaa ttgatttttc 720
tccataatat ctgaagcgtc ttattggatc aaatctacaa catttctctg ttgaaaggat 780
cgattttttt tttcttggaa catgataact tttgattatt catcaaagtt ttgttctttt 840
taatatttca caggt 855
<210> 16
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2.
<400> 16
agagttacaa tatagagaaa aaatgtattc tgtgtttttc acttttcttc ttctttgaaa 60
atccaaaaac aactatttat tgattggcaa attgcatcaa atttttcatg ctaaatccaa 120
cataaatata aaatctttta atcaaataca gaatctaaag atagtagggt tttttttatt 180
taaaatgatg tttcaaaaaa ttagaaagca tgttttccac acttggaaaa tataaataaa 240
ttaagattta ttttttccca aacaagataa atctataaat attcatcaca atcacgtgta 300
caaaaataaa tccaacaaga gataaggata agccaacgga cccatatatt aggcccattt 360
taaaataagg aaataagcag ataattatcc accaccttat ccaaaaccct agatccacaa 420
cataaatctc tataaaaacc cttttcactc acactcacat cactcacata agaactaaaa 480
tctctaaaga gtcgtctctg cggaccgcag gtaaacccag atctctttct tctcttctct 540
tcatctcgat ctctccattt tcataaaccc aattttttct ctgatttgtt tgatttggtt 600
tggatctttc tgtgtttcca tggttttagg aattttagga tagatttttg tttgttcatg 660
ttattcatcg gatatataga tttcaaattc ttttgcaatt tttctctctc tttagttttg 720
ctcaattttg gttgttgttg tgatgagtgt tctctttatg ggtttatctg agcttggtga 780
gagttttttg atattgattt tgcaggt 807
<210> 17
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic intron, I-At.GSI17.nno:1.
<400> 17
caggtaaacc cagatctctt tcttctcttc tcttcatctc gatctctcca ttttcataaa 60
cccaattttt tctctgattt gtttgatttg gtttggatct ttctgtgttt ccatggtttt 120
aggaatttta ggatagattt ttgtttgttc atgttattca tcggatatat agatttcaaa 180
ttcttttgca atttttctct ctctttagtt ttgctcaatt ttggttgttg ttgtgatgag 240
tgttctcttt atgggtttat ctgagcttgg tgagagtttt ttgatattga ttttgcaggt 300
<210> 18
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1.
<400> 18
agagttacaa tatagagaaa aaatgtattc tgtgtttttc acttttcttc ttctttgaaa 60
atccaaaaac aactatttat tgattggcaa attgcatcaa atttttcatg ctaaatccaa 120
cataaatata aaatctttta atcaaataca gaatctaaag atagtagggt tttttttatt 180
taaaatgatg tttcaaaaaa ttagaaagca tgttttccac acttggaaaa tataaataaa 240
ttaagattta ttttttccca aacaagataa atctataaat attcatcaca atcacgtgta 300
caaaaataaa tccaacaaga gataaggata agccaacgga cccatatatt aggcccattt 360
taaaataagg aaataagcag ataattatcc accaccttat ccaaaaccct agatccacaa 420
cataaatctc tataaaaacc cttttcactc acactcacat cactcacata agaactaaaa 480
tctctaaaga gtcgtctctg tttcaggttt agctttctct ccgatctcgg ctttcgatct 540
gatctcgtct gatctccgat ttcgatcccc gtccgatctc gatctgatcc catccgatct 600
gtgattgatt cgttgagatt cagatctgat cttaggatct ctctgataga tcatagattc 660
aatctctcga gatagagatg attgatgttg ttcagatcgg ttttgatctc tgatctgatc 720
agctcgattg attcgatttg attctcgatt cgatttgatc gacaattgat ctgattctct 780
aattgatgtt ctgtttttgt tacaggtttt 810
<210> 19
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP579.
<400> 19
catagagcag tcttgtctca aaaaaatcga attaagcagt tgaaagtgtt cgtcttatca 60
agatgaaaat ctgacaaaaa ttttgttaaa atttggtagt atttgataag atatgtacct 120
taaaattgat gttaataatc ttcttatcca aaaaaagaac caatccattg cagtcttaaa 180
tgaaatattt caagaaagga ttgagccaaa aaccgtgttt ataaaatttt caaatccaca 240
atttccacat tcacttggat attacaagtg tggcatctca taaaaaaaaa gaaaaagaaa 300
aaccacgtgg actattatat ccagccacgt ggctttaaaa tcttatccaa aatcacctct 360
catccaacgg ataaggtaac cacacagcct tatccaacca catcacacga atccactcta 420
tatatactcc atataaccat cactcacacg tctttcatca cacaagtaaa acagcatcac 480
taaaagaaaa aaaacaagaa 500
<210> 20
<211> 449
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic promoter, P-At.GSP579.nno:2.
<400> 20
catagagcag tcttgtctca aaaaaatcga attaagcagt tgaaagtgtt cgtcttatca 60
agatgaaaat ctgacaaaaa ttttgttaaa atttggtagt atttgataag atatgtacct 120
taaaattgat gttaataatc ttcttatcca aaaaaagaac caatccattg cagtcttaaa 180
tgaaatattt caagaaagga ttgagccaaa aaccgtgttt ataaaatttt caaatccaca 240
atttccacat tcacttggat attacaagtg tggcatctca taaaaaaaaa gaaaaagaaa 300
aaccacgtgg actattatat ccagccacgt ggctttaaaa tcttatccaa aatcacctct 360
catccaacgg ataaggtaac cacacagcct tatccaacca catcacacga atccactcta 420
tatatactcc atataaccat cactcacac 449
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic leader, L-At.GSP579.nno:1.
<400> 21
gtctttcatc acacaagtaa aacagcatca ctaaaagaaa aaaaacaaga a 51
<210> 22
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3.
<400> 22
catagagcag tcttgtctca aaaaaatcga attaagcagt tgaaagtgtt cgtcttatca 60
agatgaaaat ctgacaaaaa ttttgttaaa atttggtagt atttgataag atatgtacct 120
taaaattgat gttaataatc ttcttatcca aaaaaagaac caatccattg cagtcttaaa 180
tgaaatattt caagaaagga ttgagccaaa aaccgtgttt ataaaatttt caaatccaca 240
atttccacat tcacttggat attacaagtg tggcatctca taaaaaaaaa gaaaaagaaa 300
aaccacgtgg actattatat ccagccacgt ggctttaaaa tcttatccaa aatcacctct 360
catccaacgg ataaggtaac cacacagcct tatccaacca catcacacga atccactcta 420
tatatactcc atataaccat cactcacacg tctttcatca cacaagtaaa acagcatcac 480
taaaagaaaa aaaacaagaa tttcaggttt agctttctct ccgatctcgg ctttcgatct 540
gatctcgtct gatctccgat ttcgatcccc gtccgatctc gatctgatcc catccgatct 600
gtgattgatt cgttgagatt cagatctgat cttaggatct ctctgataga tcatagattc 660
aatctctcga gatagagatg attgatgttg ttcagatcgg ttttgatctc tgatctgatc 720
agctcgattg attcgatttg attctcgatt cgatttgatc gacaattgat ctgattctct 780
aattgatgtt ctgtttttgt tacaggtttt 810
<210> 23
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1.
<400> 23
agtacaatca tacaagagca atatatatat ttttggttat tgaaatttaa atatcatctt 60
cacaaaatga aaaagcacaa aaagtattaa ttaatatcat gttttgagac tcctttttac 120
caagaatata aatttcacac ctaagaaaat tctgaactag gaaaataacc agcatacaat 180
taaggaataa gaaaatgcaa ttacgataaa cacttgtcac aaattgttta ataagtcact 240
atccaatcaa ttatcaaaag taagatattg ccacgtggca accagtattt tcatcacctt 300
atcaaaagat aagcaaaaga accacatcaa agccacaaaa tgccaaccac agatggataa 360
ggaaaatcca accaaccaca tgtaatccca cacctcatca ccttatccac acctctgtct 420
attgttaatg ttatccgaac tagtcataat tacaaccgac aaaataaggt tattttgtgt 480
gttatagaat tttttggaca gtttttgttt tggttttcga ttgtagtaaa aatagattta 540
tgtaataaga tttacttttc ttgttgaaac aaaataatct tagaattaac tcaactttta 600
tgttagaaca aatgataaaa aaatttcccc ttttctatgc gattattttc aatcagagag 660
aaatacatat aatatatata attcaaatta atctgccaaa ttaataaatt tggattaaaa 720
tttataaatg aaacaatggt gtaaggcaat taaaaacaca acactaaaaa tatgagaaca 780
ttttatctgg gcattaagag tttgggcttt agatctaaaa taaaggccgg cccaacgaga 840
atattaaacc ctaattgacc tagttcccta tatatataaa ccctatattt ctctcgtcac 900
tcctcaactc tcagctaaac cacggaccgc agtgagtcac ataaccctct tggaaagagt 960
ctcaacactt gcagagaaaa agaacaagga agatcccgga aacaggtaat ttctctcctc 1020
tctattttta ccattttcca ttgacgacga tctaggtttt ctgatttgat tttggagaac 1080
gcctcgatga gtttatagat tcgtagattg gttttgagat tcagtataat ttcacccgga 1140
ttccaatttt tgaaccgata cctaattttg aattgatttg gtagatcgat tggtcaaatt 1200
tgaaattgat ttttctccat aatatctgaa gcgtcttatt ggatcaaatc tacaacattt 1260
ctctgttgaa aggatcgatt ttttttttct tggaacatga taacttttga ttattcatca 1320
aagttttgtt ctttttaata tttcacaggt 1350
<210> 24
<211> 422
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic enhancer, E-At.GSP571.nno:1.
<400> 24
agtacaatca tacaagagca atatatatat ttttggttat tgaaatttaa atatcatctt 60
cacaaaatga aaaagcacaa aaagtattaa ttaatatcat gttttgagac tcctttttac 120
caagaatata aatttcacac ctaagaaaat tctgaactag gaaaataacc agcatacaat 180
taaggaataa gaaaatgcaa ttacgataaa cacttgtcac aaattgttta ataagtcact 240
atccaatcaa ttatcaaaag taagatattg ccacgtggca accagtattt tcatcacctt 300
atcaaaagat aagcaaaaga accacatcaa agccacaaaa tgccaaccac agatggataa 360
ggaaaatcca accaaccaca tgtaatccca cacctcatca ccttatccac acctctgtct 420
at 422
<210> 25
<211> 902
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic chimeric promoter, P-At.GSP571/442.
<400> 25
agtacaatca tacaagagca atatatatat ttttggttat tgaaatttaa atatcatctt 60
cacaaaatga aaaagcacaa aaagtattaa ttaatatcat gttttgagac tcctttttac 120
caagaatata aatttcacac ctaagaaaat tctgaactag gaaaataacc agcatacaat 180
taaggaataa gaaaatgcaa ttacgataaa cacttgtcac aaattgttta ataagtcact 240
atccaatcaa ttatcaaaag taagatattg ccacgtggca accagtattt tcatcacctt 300
atcaaaagat aagcaaaaga accacatcaa agccacaaaa tgccaaccac agatggataa 360
ggaaaatcca accaaccaca tgtaatccca cacctcatca ccttatccac acctctgtct 420
attgttaatg ttatccgaac tagtcataat tacaaccgac aaaataaggt tattttgtgt 480
gttatagaat tttttggaca gtttttgttt tggttttcga ttgtagtaaa aatagattta 540
tgtaataaga tttacttttc ttgttgaaac aaaataatct tagaattaac tcaactttta 600
tgttagaaca aatgataaaa aaatttcccc ttttctatgc gattattttc aatcagagag 660
aaatacatat aatatatata attcaaatta atctgccaaa ttaataaatt tggattaaaa 720
tttataaatg aaacaatggt gtaaggcaat taaaaacaca acactaaaaa tatgagaaca 780
ttttatctgg gcattaagag tttgggcttt agatctaaaa taaaggccgg cccaacgaga 840
atattaaacc ctaattgacc tagttcccta tatatataaa ccctatattt ctctcgtcac 900
tc 902
<210> 26
<211> 800
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3.
<400> 26
aattaaattc aacacgtttg ttatatattt tttattgaaa ttattcttca ttcgtctttt 60
aatggataaa aaggtataat caagtatatt ttatacacat ctttctattt gtgtgtacca 120
aatgttaaaa tggccaattt tgaccaaaaa accgcataat tttcttaatt tcttaaatat 180
gattaattca tcaataactt ggaatttcac aatacacaaa agtgggtgta gttaccgtta 240
ttatatttat acacaacaac tcatctcctc atagaaagaa aagaaaaata aaataagaaa 300
tcaaaaaacg acaagataac caatctccac atcatccacg tggcgtaagg ataaggtcac 360
aaccaccact cagccacgtg gcagaatctt atccaatcac tctcaccaca caaaccttat 420
ccacttctat atataatctc ttcttctcat tatcactcac cacacatcct tgcaaaagta 480
aagagaaaaa acaaacaaga caggtaaacc cagatctctt tcttctcttc tcttcatctc 540
gatctctcca ttttcataaa cccaattttt tctctgattt gtttgatttg gtttggatct 600
ttctgtgttt ccatggtttt aggaatttta ggatagattt ttgtttgttc atgttattca 660
tcggatatat agatttcaaa ttcttttgca atttttctct ctctttagtt ttgctcaatt 720
ttggttgttg ttgtgatgag tgttctcttt atgggtttat ctgagcttgg tgagagtttt 780
ttgatattga ttttgcaggt 800
<210> 27
<211> 458
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic promoter, P-At.GSP576.nno:4.
<400> 27
aattaaattc aacacgtttg ttatatattt tttattgaaa ttattcttca ttcgtctttt 60
aatggataaa aaggtataat caagtatatt ttatacacat ctttctattt gtgtgtacca 120
aatgttaaaa tggccaattt tgaccaaaaa accgcataat tttcttaatt tcttaaatat 180
gattaattca tcaataactt ggaatttcac aatacacaaa agtgggtgta gttaccgtta 240
ttatatttat acacaacaac tcatctcctc atagaaagaa aagaaaaata aaataagaaa 300
tcaaaaaacg acaagataac caatctccac atcatccacg tggcgtaagg ataaggtcac 360
aaccaccact cagccacgtg gcagaatctt atccaatcac tctcaccaca caaaccttat 420
ccacttctat atataatctc ttcttctcat tatcactc 458
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic leader, L-At.GSP576.nno:2.
<400> 28
accacacatc cttgcaaaag taaagagaaa aaacaaacaa ga 42
<210> 29
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic 3' UTR, T-Zm.GST59.nno:1.
<400> 29
ttgttttgtt tgtaccataa tatatttgct gtgtgtttgc tgccatctca tgtgcagagg 60
aatatatatt ttttcgtggt ttctgtcgtg ctgtactgag gaccgttgta aacatatgaa 120
taaaagtaat aaatttgttt tttgtttcat accccattgg tggtgctcct ttggttctcg 180
tttgttgctg gagacagata tgtttgtgtt gtttgtgttc ttgttttatc tggaggcgag 240
cagctttttg tttgggaaga acaaaatcag tttggatgct ttgctccatc ctgtactgtt 300
gtaaactgca tatatatata tatatatgaa taaaactggt tttgtttcat accatgtttg 360
tgtgttctgt tctgttgctc gagacgagga ataaattgtt 400
<210> 30
<211> 947
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP221+At.Cyco:3.
<400> 30
gctagcgctt atggagcgtg atggactgaa agagacccct accacgtgtt gacgtaagca 60
atgacataaa accgatccta atctctccta cgaacgacag cggagagtac tgctgaaagc 120
tatgctttta tttttcttta tttttctcgt cagtggaata cacgttttgt cggtgtgtgt 180
ccttttccaa agaaagacgg aactgcctag gacaacgtcg gctaccaaag cacaatgtaa 240
agtagacatg atgatcgacg acgtcatgca tgacgtttaa catgcattgt atgtgtccgt 300
cagtctataa ataggtcaag aacaaacatc gagaaaaggc agaggcgaaa tacccatctg 360
cctatctctc aagaaataac tctctcttgt tcttcatcct ttctttcata gtttaaaaac 420
ctgaaattgg gcaagcccca taggcatttt ggtatcagag cgagtaagga caagtaggta 480
agtccctaaa atacttctat caataaaatt tctacgccaa gaagggtaag ttgtacgttt 540
atcctacacc cttgtgtttg taaccaggct tggtcaagtg cacaagggta tttgagtccc 600
aggtaatttc tctcctctct atttttacca ttttccattg acgacgatct aggttttctg 660
atttgatttt ggagaacgcc tcgatgagtt tatagattcg tagattggtt ttgagattca 720
gtataatttc acccggattc caatttttga accgatacct aattttgaat tgatttggta 780
gatcgattgg tcaaatttga aattgatttt tctccataat atctgaagcg tcttattgga 840
tcaaatctac aacatttctc tgttgaaagg atcgattttt tttttcttgg aacatgataa 900
cttttgatta ttcatcaaag ttttgttctt tttaatattt cacaggt 947
<210> 31
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic promoter, P-At.GSP221:3.
<400> 31
gctagcgctt atggagcgtg atggactgaa agagacccct accacgtgtt gacgtaagca 60
atgacataaa accgatccta atctctccta cgaacgacag cggagagtac tgctgaaagc 120
tatgctttta tttttcttta tttttctcgt cagtggaata cacgttttgt cggtgtgtgt 180
ccttttccaa agaaagacgg aactgcctag gacaacgtcg gctaccaaag cacaatgtaa 240
agtagacatg atgatcgacg acgtcatgca tgacgtttaa catgcattgt atgtgtccgt 300
cagtctataa ataggtcaag aacaaacatc gagaaaaggc agaggcgaaa tacccatctg 360
cctatctctc 370
<210> 32
<211> 229
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic leader, L-At.GSP221:1.
<400> 32
aagaaataac tctctcttgt tcttcatcct ttctttcata gtttaaaaac ctgaaattgg 60
gcaagcccca taggcatttt ggtatcagag cgagtaagga caagtaggta agtccctaaa 120
atacttctat caataaaatt tctacgccaa gaagggtaag ttgtacgttt atcctacacc 180
cttgtgtttg taaccaggct tggtcaagtg cacaagggta tttgagtcc 229
<210> 33
<211> 348
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(348)
<223> An intron, I-At.Cyco:2 derived from a Cytochrome c oxidase
subunit VIa gene from Arabidopsis.
<400> 33
caggtaattt ctctcctctc tatttttacc attttccatt gacgacgatc taggttttct 60
gatttgattt tggagaacgc ctcgatgagt ttatagattc gtagattggt tttgagattc 120
agtataattt cacccggatt ccaatttttg aaccgatacc taattttgaa ttgatttggt 180
agatcgattg gtcaaatttg aaattgattt ttctccataa tatctgaagc gtcttattgg 240
atcaaatcta caacatttct ctgttgaaag gatcgatttt ttttttcttg gaacatgata 300
acttttgatt attcatcaaa gttttgttct ttttaatatt tcacaggt 348
<210> 34
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(500)
<223> 3' UTR, T-Mt.Sali3-2-1:2:1 derived from the Sali3 gene of
Medicago truncatula.
<400> 34
gagtactctc caacatggac acaccatggg attgtgtaac ataaataatg tgtcgtttgt 60
aatgaatgct cgcaactttt ctagctaatt aagctagagt tgaacttgag ctacttttat 120
gtaccctaaa gaggcacaat ctttgctgtt gatgtactat gatcatgtta taatatgatg 180
aaaatggagt gtgcctcatt ttataatttt tattttcctg agtatatgtt tttagggcta 240
aacaccttat aaaaaaaggt cacttagaat atgaaacatg aacttttgta aaaaagtaga 300
gattaaaatt gaaatcaaaa atttttatag gatcaatatt cgaagaattt ttttagaggg 360
attaaaatta aatatagttt cggactgacc caaggcacaa tccggctccg ctcgggttcg 420
acctgagtcc accatgcatc tgtcacctta ccattgacac gccctaaaat acattagatc 480
gcagtacaaa ttgagagtta 500
<210> 35
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(500)
<223> 3' UTR, T-Mt.Oxr-1:2:1 derived from a putative oxidoreductase
(OXR) protein gene from Medicago truncatula.
<400> 35
aaatgaatga atcagctttc tcttgttcat aaagaattgt gtggaaatga attgtgtgtt 60
gctatataca tgagtgtgtt ggttgctgcc ttatgtgttc ttctagggtt attttttctt 120
ttgctttgta ataatttgtg cgttactatt gtaaacaatg tatttaatga ataatgaaag 180
tctaaagttt gtaatggagg gaagtaaatg taaatccttt cgcaagtgtt tttttagctt 240
gaaagtcttt catgcattgg tttggagtac catcatatca cccttaattt ttctagttat 300
gattttaggg acaagagaag ttcaaattac actccaatta tgtgctcggg gaaatttaat 360
tggtagcaga caatacacga aaaagtaaca catttagtat cttactatca tctgcaaatc 420
gtgcatatgt tcatatcatt tcacattttt ataatccagc atattataaa ttcaaaccta 480
attttggtac ataatagtat 500
<210> 36
<211> 315
<212> DNA
<213> Gossypium barbadense
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(315)
<223> 3' UTR, T-Gb.FbL2:1 derived from the Gossypium barbadense
FbLate-2 gene.
<400> 36
accatatgac actggtgcat gtgccatcat catgcagtaa tttcatggta tatcttaatt 60
atatggttaa taaaaaaaag atggtgagtg aataatgtgc gtgcattcct ccatgcacca 120
atggtgaatc tctttgcata catagagatt ctgaatgatt atagtttatg ttgtagtgaa 180
attaattttg aatgttgttt ttaaatttta atgtcacttg gcttgattta tgttttaacg 240
aagcttatgt tatgtatttt actttaatga tattgcatgt attgttaatt taacattgct 300
tgatcagtat actct 315
<210> 37
<211> 500
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(500)
<223> 3' UTR, T-Mt.RD22-1:2:1 derived from a dehydration-responsive
protein RD22 gene from Medicago truncatula.
<400> 37
aaacaccaat tccatcttct tcaataataa ccactatata tatatagaag caacttcaaa 60
aatacttaat acttgtatta taaattgagt tactttgaat gtcctacgat agagacggag 120
ttcaaatctc ctcaagtatg gttgaaaaat ggtcttcaat gtaactttaa ataaaaactt 180
tgtacgtcct cgctaataaa aataatgttt gtttaattac tttatatatg tattttttaa 240
tgctatttta tatatgttgt accccaaact tgtctgacca atttaatcag aagaacatgt 300
agagtgtagg tttgccggga agatttggat taaagtcttc gtttggttgg gtttggtctt 360
ggtcatgccg gaaaatttat tttccttgta cttcaaatgt tttgcttttt cgatcggaaa 420
gggaatagga gattaaaggg cctcctttta atatggcaaa cagaattata gctttagact 480
gacgctgcgg tttagcttca 500
<210> 38
<211> 1204
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1204)
<223> EXP-At.Cyco:1:1, derived from a Cytochrome c oxidase subunit VIa
gene from Arabidopsis.
<400> 38
tgcgagtggg cgaattccgg agcactctga ttggctgaaa aaatagaaat agtagtgatg 60
ttgctcctcc tctcctcctc tattattaat ttttcgtcgt tcttcttctg aaagttgtgt 120
ggtttttaga ggtcaccaaa aaaaatctat tttgagatac taaaaatatt tcgttttgca 180
ttttgttgtg cagccatttg ttacacaggt tgaagcttat aactgaaaat tggattcaaa 240
gaatcgtaga tgaagaaatc gaagtgagtt gaatattttc tgaacatatg aaaattggaa 300
caagtttttt ctcattttgc tagtttcctg tttttatgtt ttcttgactt taggagatga 360
catatggagg tgaactatac aaaggttgtt gcaacgataa cattctcctt aattcagttt 420
ttgcaactcg gttacaagca ctcagtggac ttttggccaa gacaattttt tttttttttt 480
tctctctctc taaaatgtta tagatacgaa tcctttgttg aataaaggaa aaagttgaac 540
atttgattac acataagact ttaacataat ccaacttttt tttatatgaa gctacaaaca 600
agatttaaaa catcaaagat tccatctaaa cttcattcat cttcaatctt caacatcctt 660
caatgactag tatgtatgta cataagtaaa attgttgata agaaaacaaa acaatgatgg 720
gctaaaatag cccataaaag gcccattaaa cttgggttta gactttagat tcaacgacgc 780
cagattagtg agtcacataa ccctcttgga aagagtctca acacttgcag agaaaaagaa 840
caaggaagat cccggaaaca ggtaatttct ctcctctcta tttttaccat tttccattga 900
cgacgatcta ggttttctga tttgattttg gagaacgcct cgatgagttt atagattcgt 960
agattggttt tgagattcag tataatttca cccggattcc aatttttgaa ccgataccta 1020
attttgaatt gatttggtag atcgattggt caaatttgaa attgattttt ctccataata 1080
tctgaagcgt cttattggat caaatctaca acatttctct gttgaaagga tcgatttttt 1140
ttttcttgga acatgataac ttttgattat tcatcaaagt tttgttcttt ttaatatttc 1200
acag 1204
<210> 39
<211> 786
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(786)
<223> Promoter, P-At.Cyco-1:1:2 derived from a Cytochrome c oxidase
subunit VIa gene from Arabidopsis.
<400> 39
tgcgagtggg cgaattccgg agcactctga ttggctgaaa aaatagaaat agtagtgatg 60
ttgctcctcc tctcctcctc tattattaat ttttcgtcgt tcttcttctg aaagttgtgt 120
ggtttttaga ggtcaccaaa aaaaatctat tttgagatac taaaaatatt tcgttttgca 180
ttttgttgtg cagccatttg ttacacaggt tgaagcttat aactgaaaat tggattcaaa 240
gaatcgtaga tgaagaaatc gaagtgagtt gaatattttc tgaacatatg aaaattggaa 300
caagtttttt ctcattttgc tagtttcctg tttttatgtt ttcttgactt taggagatga 360
catatggagg tgaactatac aaaggttgtt gcaacgataa cattctcctt aattcagttt 420
ttgcaactcg gttacaagca ctcagtggac ttttggccaa gacaattttt tttttttttt 480
tctctctctc taaaatgtta tagatacgaa tcctttgttg aataaaggaa aaagttgaac 540
atttgattac acataagact ttaacataat ccaacttttt tttatatgaa gctacaaaca 600
agatttaaaa catcaaagat tccatctaaa cttcattcat cttcaatctt caacatcctt 660
caatgactag tatgtatgta cataagtaaa attgttgata agaaaacaaa acaatgatgg 720
gctaaaatag cccataaaag gcccattaaa cttgggttta gactttagat tcaacgacgc 780
cagatt 786
<210> 40
<211> 72
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<223> Leader, L-At.Cyco-1:1:2 derived from a Cytochrome c oxidase
subunit VIa gene from Arabidopsis.
<400> 40
agtgagtcac ataaccctct tggaaagagt ctcaacactt gcagagaaaa agaacaagga 60
agatcccgga aa 72
<210> 41
<211> 346
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(346)
<223> Intron, I-At.Cyco-1:1:1 derived from a Cytochrome c oxidase
subunit VIa gene from Arabidopsis.
<400> 41
caggtaattt ctctcctctc tatttttacc attttccatt gacgacgatc taggttttct 60
gatttgattt tggagaacgc ctcgatgagt ttatagattc gtagattggt tttgagattc 120
agtataattt cacccggatt ccaatttttg aaccgatacc taattttgaa ttgatttggt 180
agatcgattg gtcaaatttg aaattgattt ttctccataa tatctgaagc gtcttattgg 240
atcaaatcta caacatttct ctgttgaaag gatcgatttt ttttttcttg gaacatgata 300
acttttgatt attcatcaaa gttttgttct ttttaatatt tcacag 346
<210> 42
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Coding sequence for beta-glucuronidase (GUS) with a processable
intron derived from the potato light-inducible tissue-specific
ST-LS1 gene (Genbank Accession: X04753).
<400> 42
atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360
tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa 420
taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat 480
gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt 540
ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa 600
ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag 660
cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac 720
accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt 780
aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt 840
gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg 900
aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa 960
agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020
ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080
gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140
atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200
ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260
aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320
gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380
cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440
ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500
acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560
gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620
ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680
cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740
accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800
gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860
caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920
aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980
cagcagggag gcaaacaatg a 2001
<210> 43
<211> 928
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco.
<400> 43
tgttaatgtt atccgaacta gtcataatta caaccgacaa aataaggtta ttttgtgtgt 60
tatagaattt tttggacagt ttttgttttg gttttcgatt gtagtaaaaa tagatttatg 120
taataagatt tacttttctt gttgaaacaa aataatctta gaattaactc aacttttatg 180
ttagaacaaa tgataaaaaa atttcccctt ttctatgcga ttattttcaa tcagagagaa 240
atacatataa tatatataat tcaaattaat ctgccaaatt aataaatttg gattaaaatt 300
tataaatgaa acaatggtgt aaggcaatta aaaacacaac actaaaaata tgagaacatt 360
ttatctgggc attaagagtt tgggctttag atctaaaata aaggccggcc caacgagaat 420
attaaaccct aattgaccta gttccctata tatataaacc ctatatttct ctcgtcactc 480
ctcaactctc agctaaacca cggaccgcag tgagtcacat aaccctcttg gaaagagtct 540
caacacttgc agagaaaaag aacaaggaag atcccggaaa caggtaattt ctctcctctc 600
tatttttacc attttccatt gacgacgatc taggttttct gatttgattt tggagaacgc 660
ctcgatgagt ttatagattc gtagattggt tttgagattc agtataattt cacccggatt 720
ccaatttttg aaccgatacc taattttgaa ttgatttggt agatcgattg gtcaaatttg 780
aaattgattt ttctccataa tatctgaagc gtcttattgg atcaaatcta caacatttct 840
ctgttgaaag gatcgatttt ttttttcttg gaacatgata acttttgatt attcatcaaa 900
gttttgttct ttttaatatt tcacaggt 928
<210> 44
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic 3' UTR, T-Zm.GST7.nno:2.
<400> 44
atgtctgctg cggcggcctt cacagtttgt ttatttccta ctgtttgctg cggcgattgt 60
tgttgttttc tgttttataa ataataaagg aggaggagat ttgttttggt ttgtgtttgt 120
ttccatcctt gctgctccat cacactatct gtaatttgta aacagcgaca ataaataaat 180
taataaattt ggtttctcat acctatatgt gtctgtttgg aggcttgttt gtttgagaca 240
tctgtctggt tgtttttttg ctgccagccg gtagtataaa ttttgttttt ggacgacgaa 300
<210> 45
<211> 855
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic EXP, EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1.
<400> 45
aattaaattc aacacgtttg ttatatattt tttattgaaa ttattcttca ttcgtctttt 60
aatggataaa aaggtataat caagtatatt ttatacacat ctttctattt gtgtgtacca 120
aatgttaaaa tggccaattt tgaccaaaaa accgcataat tttcttaatt tcttaaatat 180
gattaattca tcaataactt ggaatttcac aatacacaaa agtgggtgta gttaccgtta 240
ttatatttat acacaacaac tcatctcctc atagaaagaa aagaaaaata aaataagaaa 300
tcaaaaaacg acaagataac caatctccac atcatccacg tggcgtaagg ataaggtcac 360
aaccaccact cagccacgtg gcagaatctt atccaatcac tctcaccaca caaaccttat 420
ccacttctat atataatctc ttcttctcat tatcactcac cacacatcct tgcaaaagta 480
aagagaaaaa acaaacaaga cggaccgcag gtaatttctc tcctctctat ttttaccatt 540
ttccattgac gacgatctag gttttctgat ttgattttgg agaacgcctc gatgagttta 600
tagattcgta gattggtttt gagattcagt ataatttcac ccggattcca atttttgaac 660
cgatacctaa ttttgaattg atttggtaga tcgattggtc aaatttgaaa ttgatttttc 720
tccataatat ctgaagcgtc ttattggatc aaatctacaa catttctctg ttgaaaggat 780
cgattttttt tttcttggaa catgataact tttgattatt catcaaagtt ttgttctttt 840
taatatttca caggt 855
<210> 46
<211> 835
<212> DNA
<213> Cauliflower mosaic virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(835)
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-CaMV.35S comprising the 35S promoter
and leader derived from the Cauliflower mosaic virus.
<400> 46
agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60
cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120
ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180
aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240
acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300
aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360
aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420
tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480
gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540
cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600
atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660
atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720
agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780
cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acacg 835
<210> 47
<211> 804
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(804)
<223> DNA sequence of the intron, I-Zm.DnaK:1, derived from the heat
shock protein 70 (Hsp70) gene (DnaK) from corn.
<400> 47
accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60
tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120
atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180
ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240
tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300
gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360
gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420
tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480
acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540
cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600
tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660
ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720
cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780
cattgtaatg cagataccaa gcgg 804
<210> 48
<211> 300
<212> DNA
<213> Orzya sativa
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(300)
<223> DNA sequence of the 3' UTR, T-Os.LTP:1, derived from the Lipid
Transfer Protein-like gene (LTP) from rice .
<400> 48
attaatcgat cctccgatcc cttaattacc ataccattac accatgcatc aatatccata 60
tatatataaa ccctttcgca cgtacttata ctatgttttg tcatacatat atatgtgtcg 120
aacgatcgat ctatcactga tatgatatga ttgatccatc agcctgatct ctgtatcttg 180
ttatttgtat accgtcaaat aaaagtttct tccacttgtg ttaataatta gctactctca 240
tctcatgaac cctatatata actagtttaa tttgctgtca attgaacatg atgatcgatg 300
<210> 49
<211> 516
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Coding sequence for an engineered luciferase flourescent protein.
<400> 49
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 50
<211> 1848
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2 comprising the
promoter and leader of a beta-glucuronidase 21 gene from
Arabidopsis thaliana, operably linked 5' to the intron,
I-At.Cyco-1:1:1.
<400> 50
aaataaattt cttaaagtgt gtgttttaat ctaaaacatc atataatttg aaatagagga 60
aatatcatct aataaagtaa tggtatattt gtatagttaa tgatttgtct ttttattcgc 120
gcaaaatgtg tcaattataa aatataaaga ggatataatt tagtttagag ttttagacac 180
gaggactata tattggaaaa caaaaaagta atgtaaacca tatagatcat ggaatgagtc 240
atcctattaa acagttgtat tatatattta tattttagtc actaacacat taataactta 300
acgtccataa caaaataaga tccaaaactc gatctagatc tatacgaggc actaaatgat 360
ccattgactt agggccggcc gattggttcg aggactcctc atgctgtaaa cttttttttt 420
ggacatacat gatatatttt taagtcacgt ttttatatta tatgttccac gcccaatata 480
atatgttcca aactaggaaa aataagtaag aattagtcaa tgatcgagat aatgcaatga 540
atcatcctat ttattaaata gatttactaa actatatata atacaatgat cgagatcgtg 600
ccatgaagca tcctatatac tataaaaata gtcttactaa atacatactc atatagttta 660
gtcattcatt agtccaaaca ttaaatgaga gatcctttac ttgctacctg aattttttca 720
gaataaggta taactttttt tcgaattaga aactgattta tgaaagatta agagtaatgt 780
tcgttaaaca agttaaaaaa tatgttttta caattaagtt ttgaaaaata ataaagtctc 840
caattatttg agtatcaaaa ataggcttgt tattatttag ggttttcgtt ggtttaaatg 900
caacggggtg tggttgtcat tgtggaagtt aatggaagta attggttgag gttttaaacg 960
ttatcggaca ttttaaatga ctggtttaca gttaaaaata tgtgtattta cggcaatttt 1020
atgattggct tagcagtaga tgcgacagtg gtttaaacca aaaattacca aataaataat 1080
atacaattat taaattatat aaaacaccaa tattatatat ttatatatat atgaacatag 1140
ttaattatcg aaaccataga caaagtacat aagagttatt ccgaaaaagg tttattatga 1200
aacacaaata atcatattgg gagattatga tatccaaaat ggactaatca aataattaaa 1260
tccaaaatgg atgaagaact tatattagtt ccacgcacaa tataatatgt tccaaactaa 1320
gtaagaacac aacggtcgag gtcatgcaat gaatcatcct atatataaaa tagttttact 1380
aaacaattat attttagtca ctcgttaaca aacaatcaaa atcgctatat aaagaactcc 1440
gattggatgt aaacaaatca tcataaactt gttctcttcc agaagaaact aaaaacaaaa 1500
caggtaattt ctctcctctc tatttttacc attttccatt gacgacgatc taggttttct 1560
gatttgattt tggagaacgc ctcgatgagt ttatagattc gtagattggt tttgagattc 1620
agtataattt cacccggatt ccaatttttg aaccgatacc taattttgaa ttgatttggt 1680
agatcgattg gtcaaatttg aaattgattt ttctccataa tatctgaagc gtcttattgg 1740
atcaaatcta caacatttct ctgttgaaag gatcgatttt ttttttcttg gaacatgata 1800
acttttgatt attcatcaaa gttttgttct ttttaatatt tcacaggt 1848
<210> 51
<211> 712
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK:1:3 comprising
an enhanced Cauliflower mosaic virus 35S promoter, operably
linked 5' to the leader of the heat shock protein 70 (HSP70) gene
from Petunia.
<400> 51
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 300
aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 360
ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 420
ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 480
agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 540
ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 600
tcatttggag aggacactct agacagaaaa atttgctaca ttgtttcaca aacttcaaat 660
attattcatt tatttgtcag ctttcaaact ctttgtttct tgtttgttga tt 712
<210> 52
<211> 841
<212> DNA
<213> Glycine max
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(841)
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-Gm.Sphas1:1:1 comprising the
promoter and leader of the 7S alpha prime gene of soybean.
<400> 52
ggcaaaaaca tttaatacgt attatttaag aaaaaaatat gtaataatat atttatattt 60
taatatctat tcttatgtat tttttaaaaa tctattatat attgatcaac taaaatattt 120
ttatatctac acttattttg catttttatc aattttcttg cgttttttgg catatttaat 180
aatgactatt ctttaataat caatcattat tcttacatgg tacatattgt tggaaccata 240
tgaagtgtcc attgcatttg actatgtgga tagtgttttg atccaggcct ccatttgccg 300
cttattaatt aatttggtaa cagtccgtac taatcagtta cttatccttc ctccatcata 360
attaatcttg gtagtctcga atgccacaac actgactagt ctcttggatc ataagaaaaa 420
gccaaggaac aaaagaagac aaaacacaat gagagtatcc tttgcatagc aatgtctaag 480
ttcataaaat tcaaacaaaa acgcaatcac acacagtgga catcacttat ccactagctg 540
atcaggatcg ccgcgtcaag aaaaaaaaac tggaccccaa aagccatgca caacaacacg 600
tactcacaaa ggtgtcaatc gagcagccca aaacattcac caactcaacc catcatgagc 660
ccacacattt gttgtttcta acccaacctc aaactcgtat tctcttccgc cacctcattt 720
ttgtttattt caacacccgt caaactgcat gccaccccgt ggccaaatgt ccatgcatgt 780
taacaagacc tatgactata aatatctgca atctcggccc aggttttcat catcaagaac 840
c 841
<210> 53
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1:1 comprising
an enhanced Cauliflower mosaic virus 35S promoter, operably
linked 5' to the intron, I-Zm.DnaK:1.
<400> 53
ggtccgattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 60
ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120
catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180
gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 240
aagcaagtgg attgatgtga tggtccgatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 300
aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 360
gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 420
tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa 480
gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg 540
gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt 600
catttggaga ggacacgctg acaagctgac tctagcagat ctaccgtctt cggtacgcgc 660
tcactccgcc ctctgccttt gttactgcca cgtttctctg aatgctctct tgtgtggtga 720
ttgctgagag tggtttagct ggatctagaa ttacactctg aaatcgtgtt ctgcctgtgc 780
tgattacttg ccgtcctttg tagcagcaaa atatagggac atggtagtac gaaacgaaga 840
tagaacctac acagcaatac gagaaatgtg taatttggtg cttagcggta tttatttaag 900
cacatgttgg tgttataggg cacttggatt cagaagtttg ctgttaattt aggcacaggc 960
ttcatactac atgggtcaat agtataggga ttcatattat aggcgatact ataataattt 1020
gttcgtctgc agagcttatt atttgccaaa attagatatt cctattctgt ttttgtttgt 1080
gtgctgttaa attgttaacg cctgaaggaa taaatataaa tgacgaaatt ttgatgttta 1140
tctctgctcc tttattgtga ccataagtca agatcagatg cacttgtttt aaatattgtt 1200
gtctgaagaa ataagtactg acagtatttt gatgcattga tctgcttgtt tgttgtaaca 1260
aaatttaaaa ataaagagtt tcctttttgt tgctctcctt acctcctgat ggtatctagt 1320
atctaccaac tgacactata ttgcttctct ttacatacgt atcttgctcg atgccttctc 1380
cctagtgttg accagtgtta ctcacatagt ctttgctcat ttcattgtaa tgcagatacc 1440
aagcgg 1446
<210> 54
<211> 1653
<212> DNA
<213> Photinus pyralis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1653)
<223> DNA sequence encoding a luciferase protein derived from Firefly.
<400> 54
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caataatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgataatgaa ttcctctgga 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatagaa ctgcctgcgt cagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttt tacgatccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatacg acaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagag aggcgaatta tgtgtcagag gacctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tagttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggata tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat attgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gtccaaattg taa 1653
<210> 55
<211> 253
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(253)
<223> DNA sequence of the 3' UTR, T-AGRtu.nos-1:1:13 derived from the
Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase gene.
<400> 55
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 56
<211> 675
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of the EXP, EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1 comprising an
enhanced Cauliflower mosaic virus 35S promoter, operably linked
5' to the leader of a chlorophyll a/b-binding gene of the
light-harvesting complex of wheat.
<400> 56
ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240
aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360
aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600
ttcatttgga gaggaaccat cttccacaca ctcaagccac actattggag aacacacagg 660
gacaacacac cataa 675
<210> 57
<211> 936
<212> DNA
<213> Renilla reniformis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(936)
<223> DNA sequence encoding a luciferase protein derived from Sea
Pansey.
<400> 57
atggcttcca aggtgtacga ccccgagcaa cgcaaacgca tgatcactgg gcctcagtgg 60
tgggctcgct gcaagcaaat gaacgtgctg gactccttca tcaactacta tgattccgag 120
aagcacgccg agaacgccgt gatttttctg catggtaacg ctgcctccag ctacctgtgg 180
aggcacgtcg tgcctcacat cgagcccgtg gctagatgca tcatccctga tctgatcgga 240
atgggtaagt ccggcaagag cgggaatggc tcatatcgcc tcctggatca ctacaagtac 300
ctcaccgctt ggttcgagct gctgaacctt ccaaagaaaa tcatctttgt gggccacgac 360
tggggggctt gtctggcctt tcactactcc tacgagcacc aagacaagat caaggccatc 420
gtccatgctg agagtgtcgt ggacgtgatc gagtcctggg acgagtggcc tgacatcgag 480
gaggatatcg ccctgatcaa gagcgaagag ggcgagaaaa tggtgcttga gaataacttc 540
ttcgtcgaga ccatgctccc aagcaagatc atgcggaaac tggagcctga ggagttcgct 600
gcctacctgg agccattcaa ggagaagggc gaggttagac ggcctaccct ctcctggcct 660
cgcgagatcc ctctcgttaa gggaggcaag cccgacgtcg tccagattgt ccgcaactac 720
aacgcctacc ttcgggccag cgacgatctg cctaagatgt tcatcgagtc cgaccctggg 780
ttcttttcca acgctattgt cgagggagct aagaagttcc ctaacaccga gttcgtgaag 840
gtgaagggcc tccacttcag ccaggaggac gctccagatg aaatgggtaa gtacatcaag 900
agcttcgtgg agcgcgtgct gaagaacgag cagtaa 936
Claims (18)
- 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자:
a) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45를 포함하는 서열; 및
c) 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 단편으로서, 상기 단편은 유전자-조절 활성을 갖는, 상기 단편. - 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 대해 작동 가능하게 연결된, 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 DNA 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 임의의 서열번호 1 내지 29 및 43 내지 45의 DNA 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 재조합 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 유전자-조절 활성을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
- 제2항에 있어서, 상기 이종성의 전사 가능한 DNA 분자는 관심 대상의 농업형질의 유전자를 포함하는, 재조합 DNA 분자.
- 제6항에 있어서, 상기 관심대상의 농업형질의 유전자는 식물에서 제초제 내성을 부여하는, 재조합 DNA 분자.
- 제6항에 있어서, 상기 관심대상의 농업형질 유전자는 식물에서 병해충 저항성을 부여하는, 재조합 DNA 분자.
- 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 식물 세포.
- 제9항에 있어서, 상기 DNA 서열은 이종성의 전사 가능한 DNA 분자에 작동 가능하게 연결된, 유전자이식 식물 세포.
- 제9항에 있어서, 상기 유전자이식 식물 세포는 단자엽 식물 세포인, 유전자이식 식물 세포.
- 제9항에 있어서, 상기 유전자이식 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포인, 유전자이식 식물 세포.
- 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 유전자이식 식물 또는 이의 부분.
- 제13항의 유전자이식 식물의 자손 식물 또는 이의 부분으로서, 상기 자손 식물 또는 이의 부분은 재조합 DNA 분자를 포함하는, 유전자이식 식물의 자손 식물 또는 이의 부분.
- 유전자이식 종자로서, 상기 종자는 제1항의 재조합 DNA 분자를 포함하는, 유전자이식 종자.
- 상품을 생산하는 방법으로서, 제13항에 따른 유전자이식 식물 또는 이의 부분을 얻는 단계 및 이로부터 상품을 생산하는 단계를 포함하는, 상품을 생산하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 상품은 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 음식, 가루, 바이오매스 또는 종자유인, 상품을 생산하는 방법.
- 전사 가능한 DNA 분자를 발현시키는 방법으로서, 제13항에 따른 유전자이식 식물을 얻는 단계 및 식물을 배양시키는 단계를 포함하되, 상기 전사 가능한 DNA는 발현되는, 전사 가능한 DNA 분자를 발현시키는 방법.
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