BR112019014797A2 - Elementos reguladores de planta e usos dos mesmos - Google Patents

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Abstract

a invenção refere-se a moléculas e construtos de dna recombinante, assim como suas sequências de nucleotídeo, úteis para modular a expressão de genes em plantas. a invenção também se refere a plantas transgênicas, células vegetais, partes de planta, e sementes que compreendem as moléculas de dna recombinantes operativamente ligadas às moléculas de dna transcritível heterólogas, conforme são métodos de seu uso.

Description

ELEMENTOS REGULADORES DE PLANTA E USOS DOS MESMOS.
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n° U.S. 62/448.019, depositado em 19 de janeiro de 2017, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] A forma legível por computador da listagem de sequências que está contida no arquivo nomeado MONS436WOsequencejisting.txt tem 59.917 bytes (conforme medido por Microsoft Windows®) e foi criada em 12 de janeiro de 2018, é depositada por envio eletrônico concomitantemente com seu pedido e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO [003] A invenção se refere ao campo de biologia molecular de planta e manipulação genética de planta. Mais especificamente, a invenção se refere a moléculas de DNA úteis para modular a expressão de genes em plantas.
ANTECEDENTES [004] Os elementos são elementos genéticos que regulam a atividade de gene modulando-se a transcrição de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. Tais elementos podem incluir promotores, líderes, introns, e regiões não traduzidas 3’ e são úteis no campo de biologia molecular de planta e manipulação genética de planta.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] A invenção fornece elementos reguladores de gene sintéticos inovadores para uso em plantas. A invenção também fornece moléculas de DNA recombinantes e construtos que compreendem os elementos reguladores. A presente invenção também fornece células
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2/85 de planta transgênica, plantas, e sementes que compreendem os elementos reguladores sintéticos. Em uma modalidade, os elementos reguladores sintéticos são operativamente ligados a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga. A presente invenção também fornece métodos para usar os elementos reguladores sintéticos e métodos para produzir e usar as moléculas de DNA recombinantes que compreendem os elementos reguladores sintéticos e as células de planta transgênica, plantas, e sementes que compreendem os elementos reguladores sintéticos operativamente ligados a uma molécula de DNA transcrevível. [006] Deste modo, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; (b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência é operativamente ligada a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga. Por molécula de DNA transcrevível heteróloga entende-se que a molécula de DNA transcrevível é heteróloga em relação à sequência de polinucleotídeos à qual é operativamente ligada. Em modalidades específicas, a molécula de DNA recombinante compreende uma sequência de DNA que tem pelo menos cerca de 90 por cento, pelo menos 91 por cento, pelo menos 92 por cento, pelo menos 93 por cento, pelo menos 94 por cento, pelo menos 95 por cento, pelo menos 96 por cento, pelo menos 97 por cento, pelo menos 98 por cento, ou pelo menos 99 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45. Em modalidades particulares, a sequência de DNA compreende um elemento regulador. Em algumas modalidades, o elemento regulador compreende um promotor. Em
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3/85 ainda outras modalidades, a molécula de DNA transcrevível heteróloga compreende um gene de interesse agronômico, como um gene com capacidade para conferir resistência a herbicida em plantas, ou um gene com capacidade para conferir resistência à praga em plantas. Em ainda outras modalidades, a invenção fornece um construto que compreende uma molécula de DNA recombinante, conforme fornecido no presente documento.
[007] Em outro aspecto, são fornecidas no presente documento as células de planta transgênica que compreendem uma molécula de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; (b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; e (c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência de DNA é operativamente ligada a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga. Em certas modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea. Em outras modalidades, a célula de planta transgênica é uma célula de planta dicotiledônea.
[008] Em ainda outro aspecto, é adicionalmente fornecida no presente documento uma planta transgênica, ou parte da mesma, que compreende uma molécula de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em: a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; b) uma sequência que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; e c) um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene; em que a sequência é operativamente ligada a uma molécula de DNA transcrevível
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4/85 heteróloga. Em modalidades específicas, a planta transgêníca é uma planta de progênie de qualquer geração que compreende a molécula de DNA recombinante. Uma semente transgêníca que compreende a molécula de DNA recombinante que produz tal planta transgêníca quando cultivada também é fornecida no presente documento.
[009] Em outro aspecto, a Invenção fornece um método para produzir um produto primário que compreende obter uma planta transgêníca ou parte da mesma que contém uma molécula de DNA recombinante da invenção e produzir o produto primário a partir da mesma. Em uma modalidade, o produto primário é sementes processadas, grãos, partes de planta, óleos e farelo.
[0010] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgêníca que compreende uma molécula de DNA recombinante da invenção que compreende transformar uma célula de planta com a molécula de DNA recombinante da invenção para produzir uma célula de planta transformada e regenerar uma planta transgêníca a célula de planta transformada.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS [0011] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA de um grupo de elementos de expressão reguladores sintéticos (EXP), EXPAt.GSP442.nno+At.Cyco:3 que compreende um promotor sintético (PAt.GSP442.nno:2), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (LAt.GSP442.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron (l-At.Cyco:2). [0012] SEQ ID NO:2 é uma sequência promotora sintética, PAt.GSP442.nno:2.
[0013] SEQ ID NO:3 é uma sequência-líder sintética, L~At.GSP442. nno: 1.
[0014] SEQ ID NO:4 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-AIGSP571 que compreende um promotor sintético (P~ At.GSP571.nno:5), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (LPetição 870190079852, de 16/08/2019, pág. 8/99
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At.GSP571.nno: 1).
[0015] SEQ ID NO:5 é uma sequência promotora sintética, PAt.GSP571.nno:5.
[0016] SEQ ID NO:6 é uma sequência-líder sintética, L· At.GSP571.nno: 1.
[0017] SEQ ID NO:7 é uma sequência de DNA de um grupo de elementos de expressão reguladores sintéticos (EXP), EXPAt.GSP571.nno+At.Cyco:2 que compreende um promotor sintético (PAt.GSP571.nno:5), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (LAt.GSP571.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron (l-AtCyco:2). [0018] SEQ ID NO:8 é uma sequência de DNA de um grupo de elementos de expressão reguladores sintéticos (EXP), EXPAt.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 que compreende um promotor sintético (P~At.GSP571.nno:5), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP571.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron sintético (l~At.GSI21.nno:2).
[0019] SEQ ID NO:9 é uma sequência de íntron sintético, IAt.GSI21.nno:2.
[0020] SEQ ID NO: 10 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP~At.GSP571.nno-fAt.GSI102.nno: 1 que compreende um promotor sintético (P-ALGSP571 ,nno:5), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L~At.GSP571.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron sintético (l-At.GSI102.nno: 1).
[0021] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de íntron sintético, IAt.GSI102.nno: 1.
[0022] SEQ ID NO: 12 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP564 que compreende um promotor sintético (PAt.GSP564.nno:3), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (LAt.GSP564.nno: 1).
[0023] SEQ ID NO: 13 é uma sequência promotora sintética, PPetição 870190079852, de 16/08/2019, pág. 9/99
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At.GSP564.nno:3.
[0024] SEQ ID NO: 14 é uma sequência-líder sintética, LAt.GSP564.nno: 1.
[0025] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 que compreende um promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP564.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron (l-At.Cyco:2).
[0026] SEQ ID NO: 16 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 que compreende um promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP564.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron sintético (l-At.GSI17.nno: 1).
[0027] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de íntron sintético, IAt.GSI17.nno: 1.
[0028] SEQ ID NO: 18 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno: 1 que compreende um promotor sintético (P-At.GSP564.nno:3), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP564.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um íntron sintético (l-At.GSI102.nno: 1).
[0029] SEQ ID NO: 19 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-ALGSP579 que compreende um promotor sintético (PAt.GSP579.nno:2), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L~ At.GSP579.nno: 1).
[0030] SEQ ID NO:20 é uma sequência promotora sintética, PAt.GSP579.nno:2.
[0031] SEQ ID NO:21 é uma sequência-líder sintética, LAt.GSP579.nno: 1.
[0032] SEQ ID NO:22 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 que compreende um
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7/85 promotor sintético (P-At.GSP579.nno:2), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP579.nno: 1), operativamente ligado 5’ ao íntron sintético (l-At.GSI102.nno: 1).
[0033] SEQ ID NO:23 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco: 1 que compreende um promotor quimérico sintético (P-ALGSP571/442, que é compreendido de um intensificador sintético (E-At.GSP571.nno: 1) operativamente ligado 5’ a um promotor sintético (P-At.GSP442.nno:2)), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (l~At.GSP442.nno: 1), operativamente ligado 5’ a um líder (L-At.Cyco-1: 1:2), operativamente ligado 5’ a um íntron (l-At.Cyco:2).
[0034] SEQ ID NO:24 é uma sequência intensificadora sintética, EAt.GSP571.nno: 1.
[0035] SEQ ID NO:25 é uma sequência de DNA de um promotor quimérico sintético, P-ALGSP571/442 compreendida de um intensificador sintético (E-At.GSP571.nno: 1) operativamente ligado 5’ a um promotor sintético (P-At.GSP442.nno:2).
[0036] SEQ ID NO:26 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 que compreende um promotor sintético (P-At.GSP576.nno:4), operativamente ligado 5’ a um líder sintético (L-At.GSP576.nno:2), operativamente ligado 5’ ao íntron sintético (l-At.GSI17.nno: 1).
[0037] SEQ ID NO:27 é uma sequência promotora sintética, P~ At.GSP576.nno:4.
[0038] SEQ ID NO:28 é uma sequência-líder sintética, LAt.GSP576.nno:2.
[0039] SEQ ID NO:29 é uma UTR 3’ sintética, T-Zm.GST59.nno: 1. [0040] SEQ ID NO:30 é uma sequência de DNA de um EXP sintético, EXP~At.GSP221+At.Cyco:3 que compreende um promotor sintético (P-At.GSP221:3), operativamente ligado 5’ a um líder sintético
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8/85 (L-AÍ.GSP221: 1), operativamente ligado 5’ a urn intron (l-At.Cyco:2).
[0041] SEQ ID NO:31 é uma sequência promotora sintética, PAt.GSP221:3.
[0042] SEQ ID NO:32 é uma sequência-líder sintética, LALGSP221: 1.
[0043] SEQ ID NO:33 é uma sequência de intron, l-At.Cyco:2 derivada de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis .
[0044] SEQ ID NO:34 é uma sequência de UTR 3’, T~Mt.Sali3-21:2: 1 derivada do gene Sali3 de Medicago truncatula.
[0045] SEQ ID NO:35 é uma sequência de UTR 3’, T-Mt.Oxr-1:2: 1 derivada de um gene de proteína oxidorredutase putativa (OXR) de Medicago truncatula.
[0046] SEQ ID NO:36 é uma sequência de UTR 3’, T-Gb.FbL2: 1 derivada do gene FbLate-2 de Gossypium barbadense.
[0047] SEQ ID NO:37 é uma sequência de UTR 3’, T-MLRD22-1:2: 1 derivada de um gene RD22 de proteína responsiva de desidratação de Medicago truncatula.
[0048] SEQ ID NO:38 é uma sequência de DNA de um EXP derivado de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis, EXP-At.Cyco: 1: 1 que compreende um promotor (PAt.Cyco-1: 1:2), operativamente ligado 5’ a um líder (L-At.Cyco-1: 1:2), operativamente ligado 5’ ao íntron (l-At.Cyco-1: 1:1).
[0049] SEQ ID NO:39 é uma sequência promotora, P-At.Cyco-1:1:2 derivada de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis.
[0050] SEQ ID NO:40 é uma sequência-líder, L-At.Cyco-1: 1:2 derivada de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis.
[0051] SEQ ID NO:41 é uma sequência de íntron, l-At.Cyco-1: 1: 1
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9/85 derivada de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis.
[0052] SEQ ID NO:42 é uma sequência de codificação para Bgiucuronidase (GUS) com um intron processável derivado do gene STLS 1 específico de tecido induzívei leve de batata (Acesso Genbank: X04753).
[0053] SEQ ID NO:43 é uma sequência de DNA de um EXP, EXPAT GSP442+1-1-At. Cy co que compreende o promotor sintético, PAt.GSP442.nno:2, operativamente ligado 5’ ao líder sintético, LAt.GSP442.nno: 1, operativamente ligado 5’ ao líder, L-AtCyco-1: 1:2, que é operativamente ligado 5’ ao intron, l-At.Cyco:2.
[0054] SEQ ID NO:44 é uma sequência de DNA da UTR 3’ sintética, T-Zm.GST7.nno:2.
[0055] SEQ ID NO:45 é uma sequência de DNA de um EXP, EXPAt.GSP576.nno+At.Cyco: 1 que compreende o promotor sintético, PAt.GSP564.nno:3, operativamente ligado 5’ ao líder sintético, LAt.GSP564.nno: 1, que é operativamente ligado 5’ ao intron, IAt.Cyco:2.
[0056] SEQ ID NO:46 é uma sequência de DNA do EXP, EXPCaMV.35S que compreende o promotor 35S e líder derivado do vírus do mosaico de couve-flor.
[0057] SEQ ID NO:47 é uma sequência de DNA do intron, IZm.DnaK: 1, derivado do gene (DnaK) de proteína de choque térmico 70 (Hsp70) de Zea mays.
[0058] SEQ ID NO:48 é uma sequência de DNA da UTR 3’, TOs.LTP: 1, derivadas do gene tipo Proteína de Transferência de Lipídio (LTP) de Oryza sativa.
[0059] SEQ ID NO:49 é uma sequência de codificação para a proteína fluorescente luciferase NanoLuc® (Promega, Madison, Wl 53711), Nluc que foi manipulada por evolução direcionada de uma
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10/85 luciferase de camarâo-de-profundidade (Oplophorus gacilirostris).
[0060] SEQ ID NO:50 é uma sequência de DNA do EXP, EXPAt.Bglu21-rAt.Cyco:2 que compreende o promotor e o líder de urn gene de beta-glucuronidase 21 de Arabidopsis thaiiana, operativamente ligado 5’ ao intron, l-At.Cyco-1: 1:1.
[0061] SEQ ID NO:51 é uma sequência de DNA do EXP, EXPCaMV.35S-enh+Ph.DnaK: 1:3 que compreende um promotor 35S de virus do mosaico de couve-flor intensificado, operativamente ligado 5’ ao líder do gene de proteína de choque térmico 70 (HSP70) de Petunia x híbrido.
[0062] SEQ ID NO:52 é uma sequência de DNA do EXP, EXPGm.Sphasl: 1: 1 que compreende o promotor e o líder do gene de início alfa 7S de soja.
[0063] SEQ ID NO:53 é uma sequência de DNA do EXP, EXPCaMV.35S-enh+Zm.DnaK: 1: 1 que compreende um promotor 35S de vírus do mosaico de couve-flor intensificado, operativamente ligado 5’ ao intron, l-Zm.DnaK: 1.
[0064] SEQ ID NO:54 é uma sequência de DNA que codifica uma proteína luciferase (LUCIFERASE: 1:3) derivada de Photinus pyralis (Libélula).
[0065] SEQ ID NO:55 é uma sequência de DNA da UTR 3’, TAGRtu.nos-1: 1: 13 derivada do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens.
[0066] SEQ ID NO:56 é uma sequência de DNA do EXP, EXPCaMV.35S-enh-Lhcbl que compreende um promotor 35S de vírus do mosaico de couve-flor intensificado, operatlvamente ligado 5’ ao líder de um gene de ligação a/b de clorofila do complexo de cultivo leve de Triticum aestivum (Trigo).
[0067] SEQ ID NO:57 é uma sequência de DNA que codifica uma proteína luciferase (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0: 1) derivada de Renilla
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11/85 reniformls (Rim-do-Mar).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0068] A invenção fornece eiemeníos reguladores sintéticos que têm atividade reguladora de gene em plantas. As sequências de nucleotídeo destes elementos reguladores sintéticos são fornecidas como SEQ ID NOs:1 ~ 32 e SEQ ID NOs:43-45. Estes elementos reguladores sintéticos têm capacidade para afetar a expressão de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente em tecidos de planta e, portanto, regular a expressão de genes de um transgene operativamente ligado em plantas transgênicas. A invenção também fornece métodos para modificar, produzir e usar moléculas de DNA recombinantes que contêm os elementos reguladores sintéticos fornecidos. A invenção também fornece composições que incluem células de planta transgênica, plantas, partes de planta, e sementes que contêm as moléculas de DNA recombinantes da invenção, e métodos para preparar e usar as mesmas.
[0069] As definições e os métodos seguintes são fornecidos para definir melhor a presente invenção e guiar aqueles de habilidade comum na técnica na prática da presente invenção. A menos que observado de outro modo, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles de habilidade comum na técnica relevante. MOLÉCULAS DE DNA [0070] Conforme usado no presente documento, o termo DNA ou molécula de DNA se refere a uma molécula de DNA de fita dupla de origem genômica ou sintética, isto é, um polímero de bases de desoxirribonucleotídeo ou uma molécula de DNA, lida a partir da extremidade 5’ (a montante) à extremidade 3’ (a jusante). Conforme usado no presente documento, o termo sequência de DNA se refere à sequência de nucleotídeo de uma molécula de DNA. A nomenclatura usada no presente documento corresponde àquela do Título 37 do Código dos Estados Unidos das Regulações Federais § 1.822, e conforme apresentado nas tabelas no Padrão WIPO ST.25 (1998),
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Apêndice 2, Tabelas 1 e 3.
[0071] Conforme usado no presente documento, uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que compreende uma combinação de moléculas de DNA que podem não ocorrer naturalmente junto sem intervenção humana. Por exemplo, uma molécula de DNA recombinante pode ser uma molécula de DNA que é compreendida de pelo menos duas moléculas de DNA heterólogas uma em relação à outra, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA que desvia das sequências de DNA que existem na natureza, uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA sintética ou uma molécula de DNA que foi incorporada a um DNA da célula hospedeira por transformação genética ou edição de gene.
[0072] Conforme usado no presente documento, uma sequência de nucleotídeo sintética ou sequência de nucleotídeo artificial é uma sequência de nucleotídeo que não é conhecida por ocorrer na natureza, que não é de ocorrência natural, ou que não ocorre sem intervenção humana. Os elementos reguladores de gene da presente invenção compreendem sequências de nucleotídeo sintético. Preferencialmente, as sequências de nucleotídeo sintético compartilham pouco ou a nenhuma homologia estendida a sequências naturais. A homologia estendida neste contexto se refere em geral a 100% de identidade de sequência que se estende além de 25 nucleotídeos de sequência contígua.
[0073] A referência neste pedido a uma molécula de DNA isolada” ou um termo ou expressão equivalente, pretende significar que a molécula de DNA é uma presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu ambiente natural. Por exemplo, os elementos de ácido nucleico, como uma sequência de codificação, sequência de íntron, sequência-líder não traduzida, sequência promotora, sequência de terminação de transcrição, e
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13/85 semelhantes, que são naturalmente encontradas no DNA do genoma de um organismo não são consideradas isoladas enquanto o elemento estiver dentro no genoma do organismo e na localização no genoma em que é naturalmente encontrado. Entretanto, cada um destes elementos, e subpartes destes elementos, seria isolado no escopo desta divulgação enquanto o elemento não estiver no genoma do organismo e na localização no genoma em que é naturalmente encontrado. Em uma modalidade, o termo isolado se refere a uma molécula de DNA que é pelo menos parcialmente separada de alguns dos ácidos nucleicos que flanqueiam normalmente a molécula de DNA em seu estado nativo ou natural. Deste modo, moléculas de DNA fundidas para sequências reguladoras ou de codificação às quais não são normalmente associadas, por exemplo, como resultado de técnicas recombinantes, são consideradas isoladas no presente documento. Tais moléculas são consideradas isoladas quando integradas ao cromossomo de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucleico com outras moléculas de DNA, por não estarem em seu estado nativo. Com os propósitos desta divulgação, qualquer sequência de nucleotídeo transgênica, isto é, a sequência de nucleotídeo do DNA inserido no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente em um vetor extracromossômico, seria considerada como uma sequência de nucleotídeo isolada na possibilidade de estar presente no plasmídeo ou estrutura similar usada para transformar as células, no genoma da planta ou bactéria, ou presente em quantidades detectáveis em tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos de comodidade derivados da planta ou bactéria. [0074] Conforme usado no presente documento, o termo identidade de sequência se refere à extensão à qual duas sequências de polinucleotídeo alinhadas de modo otimizado ou duas sequências de polipeptídeo alinhadas de modo otimizado são idênticas. Um
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14/85 alinhamento de sequência otimizado é criado alinhando-se manualmente duas sequências, por exemplo, uma sequência de referência e outra sequência, para maximizar o número de correspondências de nucleotídeo no alinhamento de sequência com inserções, deleções ou lacunas de nucleotídeo interno. Conforme usado no presente documento, o termo sequência de referência se refere a uma sequência de DNA fornecida como as SEQ ID NOs: 1 -32 e SEQ ID NOs:43-45.
[0075] Conforme usado no presente documento, o termo por cento de identidade de sequência” ou por cento de identidade ou % de identidade é a fração de identidade multiplicada por 100. A fração de identidade para uma sequência alinhada de modo otimizado com uma sequência de referência é o número de correspondências de nucleotídeo no alinhamento otimizado, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência de referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no comprimento completo da sequência de referência inteira. Deste modo, uma modalidade da invenção fornece uma molécula de DNA que compreende uma sequência que, quando alinhada de modo otimizado a uma sequência de referência, fornecida no presente documento como qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45, tem pelo menos cerca de 85 por cento de identidade, pelo menos cerca de 86 porcento de identidade, pelo menos cerca de 87 por cento de identidade, pelo menos cerca de 88 por cento de identidade, pelo menos cerca de 89 por cento de identidade, pelo menos cerca de 90 por cento de identidade, pelo menos cerca de 91 por cento de identidade, pelo menos cerca de 92 por cento de identidade, pelo menos cerca de 93 por cento de identidade, pelo menos cerca de 94 por cento de Identidade, pelo menos cerca de 95 por cento de identidade, pelo menos cerca de 96 porcento de identidade, pelo menos cerca de 97 por cento de identidade, pelo menos cerca de 98 por cento
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15/85 de identidade, pelo menos cerca de 99 por cento de identidade, ou pelo menos cerca de 100 por cento de identidade com a sequência de referência. Em modalidades específicas ainda adicionais, uma sequência que tem um por cento de identidade de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45 pode ser definida como exibindo atividade promotora possuída pela sequência inicial da qual é derivada. A sequência que tem uma porcentagem de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45 pode compreender adicionalmente um promotor mínimo que fornece um nível basal de transcrição e é compreendido de uma caixa TATA box ou sequência equivalente para reconhecimento e ligação do complexo de RNA polimerase II para iniciação de transcrição.
ELEMENTOS REGULADORES [0076] Os elementos reguladores, como promotores, líderes (também conhecidos como UTRs 5’), intensificadores, introns, e regiões de terminação de transcrição (ou UTRs 3’) têm uma função integral na expressão geral de genes em células vivas. O termo elemento regulador, conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula de DNA que tem atividade reguladora de gene. O termo atividade reguladora de gene, conforme usado no presente documento, se refere à capacidade para afetar a expressão de uma molécula de DNA transcrevível ligada operatlvamente, por exemplo, afetando-se a transcrição e/ou tradução da molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. Os elementos reguladores, como promotores, líderes, intensificadores, introns e UTRs 3’ que funcionam em plantas, são úteis para modificar fenótipos de planta através da manipulação genética.
[0077] Conforme usado no presente documento, um grupo de elemento de expressão reguladora ou sequência de ΈΧΡ pode se referir a um grupo de elementos reguladores ligados operativamente,
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16/85 como intensificadores, promotores, líderes e introns. Por exemplo, um grupo de elemento de expressão reguladora pode ser compreendido, por exemplo, de um promotor operativamente ligado 5’ a uma sequência-líder. Os EXP’s úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 e 45.
[0078] Os elementos reguladores podem ser caracterizados pelo seu padrão de expressão de genes, por exemplo, efeitos positivos e/ou negativos, como expressão constitutiva ou temporal, expressão espacial, de desenvolvimento, de tecido, ambiental, fisiológica, patológica, de ciclo de célula e/ou quimicamente responsiva, e qualquer combinação dos mesmos, assim como por indicações quantitativas ou qualitativas. Conforme usado no presente documento, um padrão de expressão de genes é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA operativamente ligada em uma molécula de RNA transcrita. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode fornecer um RNA antissenso ou outra molécula de RNA reguladora, como um RNA de fita dupla (dsRNA), um RNA de transferência (tRNA), um RNA ribossômico (rRNA), um microRNA (miRNA), e semelhantes.
[0079] Conforme usado no presente documento, o termo expressão de proteína é qualquer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. A expressão de proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, de desenvolvimento ou morfológicas, assim como por indicações quantitativas ou qualitativas.
[0080] Um promotor é útil como um elemento regulador para modular a expressão de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. Conforme usado no presente documento, o termo promotor se refere geralmente a uma molécula de DNA que é
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17/85 envolvida no reconhecimento e na ligação de RNA polimerase II e outras proteínas, como fatores de transcrição de atuação trans, para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado da região não traduzida 5’ (5’ UTR) de uma cópia genômica de um gene. Alternativamente, os promotores podem ser moléculas de DNA sinteticamente produzidas ou manipuladas. Os promotores também podem ser quiméricos. Os promotores químérioos são produzidos através da fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Os promotores úteis na prática da presente invenção incluem elementos promotores compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 e 39 ou fragmentos ou variantes das mesmas. Em modalidades específicas da invenção, as moléculas de DNA reivindicadas e quaisquer variantes ou derivados das mesmas, conforme descrito no presente documento, são adicionalmente definidas como compreendendo atividade promotora, isto é, têm capacidade para atuar como um promotor em uma célula hospedeira, como em uma planta transgênica. Em modalidades específicas ainda adicionais, um fragmento pode ser definido como exibindo atividade promotora possuída pela molécula promotora inicial a partir da qual é derivada, ou um fragmento pode compreender uma porção mínima que fornece um nível basal de transcrição e é compreendida de uma caixa TATA ou sequência de DNA equivalente para reconhecimento e ligação do complexo de RNA polimerase II para iniciação de transcrição. [0081] Em uma modalidade, fragmentos de uma sequência promotora divulgada no presente documento são fornecidos. Os fragmentos promotores podem compreender atividade promotora, conforme descrito acima, e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros promotores e fragmentos promotores, como na construção de promotores quiméricos, ou em combinação com outros elementos de expressão e fragmentos de elemento de expressão. Em
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18/85 modalidades específicas, fragmentos de um promotor são fornecidos compreendendo pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 175, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 225, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 275, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou mais, de uma molécula de DNA que tem atividade promotora, conforme divulgado no presente documento. Em certas modalidades, a invenção fornece fragmentos de um promotor fornecido no presente documento, que tem a atividade da sequência de comprimento completo. Os métodos para produzir tais fragmentos de uma molécula promotora inicial são bem conhecidos na técnica.
[0082] As composições derivadas de qualquer um dos elementos promotores compreendida em qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 e 39, como internas ou deleções 5’, por exemplo, podem ser produzidas com os métodos conhecidos na técnica para melhorar ou alterar a expressão, incluindo a remoção dos elementos que têm efeitos positivos ou negativos em expressão; duplicando-se elementos que têm negativos positivos ou negativos em expressão; e/ou duplicando ou removendo-se os elementos que têm efeitos específicos de tecido ou célula em expressão. As composições derivadas de qualquer um dos elementos promotores compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5, 13, 20, 25, 27, 31 e 39 compreendidas de deleções 3’ em que o elemento de caixa TATA ou sequência equivalente da mesma e sequência a jusante é removida podem ser usadas, por exemplo, para produzir elementos intensificadores. As deleções adicionais podem ser feitas para remover quaisquer elementos que têm
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19/85 efeitos positivos ou negativos; específicos de tecido; específicos de célula; ou específicos de temporização (como, mas sem limitação, ritmo circadiano) na expressão. Qualquer um dos elementos promotores compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5, 13, 20, 25, 27, e 39 e fragmentos ou intensificadores derivados dos mesmos pode ser usado para produzir composições de elemento regulador de transcrição quimérico.
[0083] De acordo com a invenção, um promotor ou fragmento promotor pode ser analisado pela presença de elementos promotores conhecidos, isto é, características de sequência de DNA, como uma caixa TATA e outros motivos de sítio de ligação de fator de transcrição conhecidos. A identificação de tais elementos promotores conhecidos pode ser usada por um versado na técnica para projetar variantes do promotor que têm um padrão de expressão similar ao promotor original. [0084] Conforme usado no presente documento, o termo líder se refere a uma molécula de DNA isolada da região 5’ não traduzida (UTR 5’), um gene e definido geralmente como um segmento de nucleotídeo entre o sítio de início de transcrição (TSS) e o sítio de início de sequência de codificação de proteína. Alternativamente, os líderes podem ser elementos de DNA sinteticamente produzidos ou manipulados. Um líder pode ser usado como um elemento regulador 5’ para modular a expressão de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. As moléculas-líder podem ser usadas com um promotor heterólogo ou com seu promotor nativo. Os líderes úteis na prática da presente invenção incluem as SEQ ID NOs:3, 6, 14, 21, 28, e 40; ou qualquer um dos elementos-líder compreendidos em qualquer uma dasSEQIDNOs: 1,4, 7,8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22,23, 26, 30, 43 e 45 ou fragmentos ou variantes das mesmas. Em modalidades específicas, tais sequências de DNA podem ser definidas como com capacidade para atuar como um líder em uma célula
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20/85 hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, tais sequências são decodificadas como compreendendo atividade-líder.
[0085] As sequências-líder (também denominadas UTRs 5’) apresentadas como SEQ ID NOs:3, 6, 14, 21, 28, 32 e 40 ou qualquer um dos elementos-líder compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30 e 43 podem ser compreendidas de elementos reguladores, ou podem adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito na transcrição ou tradução de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. As sequênciaslíder apresentadas como SEQ ID NOs:3, 6, 14, 21, 28, 32 e 40 ou qualquer um dos elementos-líder compreendidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 8, 10, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 23, 26, 30, 43 e 45 podem ser usadas de acordo com a invenção para produzir elementos reguladores quiméricos que afetam a transcrição ou tradução de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente.
[0086] Conforme usado no presente documento, o termo íntron se refere a uma molécula de DNA que pode ser isolada ou identificada de um gene e pode ser definida geralmente como uma região submetida a splicing durante o processamento de RNA mensageiro (mRNA) antes da tradução. Alternativamente, um íntron pode ser um elemento de DNA sinteticamente produzido ou manipulado. Um íntron pode conter elementos intensificadores que efetuam a transcrição de genes operativamente ligados. Um íntron pode ser usado como um elemento regulador para modular a expressão de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. Um construto pode compreender um íntron, e o íntron pode ou pode não ser heterólogo em relação à molécula de DNA transcrevível. Os exemplos de introns conhecidos na técnica incluem o íntron de actina de arroz e o íntron de HSP70 de milho. [0087] Em plantas, a inclusão de alguns introns em construtos de
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21/85 gene leva ao mRNA aumentado e o acúmulo de proteína relativo a construtos que não têm o intron. Este efeito foi denominado intensificação mediada por intron (IME) de expressão de genes. Os introns conhecidos por estimular a expressão em plantas foram identificados em genes de mais (por exemplo, tubAI, Adhl, Shi, e Ubil), em genes de arroz (por exemplo, tpi) e em genes de planta dicotiledônea, como aqueles de petúnias (por exemplo, rbcS), batata (por exemplo, st-lsl) e de Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e patl). Foi mostrado que as deleções ou mutações nos sítios de splice de um íntron reduzem a expressão de genes, o que indica que o splicing pode ser necessário para IME. Entretanto, IME em plantas dicotiledôneas foi mostrado por mutações de ponto nos sítios de splice do gene patl de A. thaliana. Múltiplos usos do mesmo íntron em uma planta demonstraram exibir desvantagens. Nestes casos, é necessário ter uma coleção de elementos de controle básicos para a construção de elementos de DNA recombinantes apropriados. Os introns exemplificativos úteis na prática da presente invenção são apresentados como as SEQ ID NOs:9, 11, 17, 33 e 41.
[0088] Conforme usado no presente documento, os termos molécula de terminação de transcrição 3 região não traduzida 3 ou UTR 3 se referem a uma molécula de DNA que é usada durante a transcrição à região não traduzida da porção 3’ de uma molécula de mRNA. A região não traduzida 3’ de uma molécula de mRNA pode ser gerada por divagem específica e poliadenilação 3’, também conhecida como uma cauda polyA. Uma UTR 3’ pode ser operativamente ligada a e localizada a jusante de uma molécula de DNA transcrevível e pode incluir um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores com capacidade para afetar a transcrição, processamento de mRNA, ou expressão de genes. As caudas de PolyA são consideradas por funcionar em estabilidade de mRNA e em iniciação de tradução. Os
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22/85 exemplos de moléculas de terminação de transcrição 3’ na técnica são a região de nopalina sintase 3’; região hsp17 3’ de trigo, região de subunidade pequena de rubisco de ervilha 3’, região E6 3’ de algodão, e a UTR 3’ de coixina.
[0089] As UTRs 3’ encontram tipicamente o uso benéfico para a expressão recombinante de moléculas de DNA específicas. Uma UTR 3’ fraca tem o potencial de gerar leitura, o que pode afetar a expressão da molécula de DNA localizada nos genes de expressão adjacentes. Controle apropriado de terminação de transcrição pode impedir a leitura em sequências de DNA (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e pode permitir adlcionalmente a reciclagem eficaz de RNA polimerase para melhorar a expressão de genes. A terminação eficaz de transcrição (liberação de RNA Polimerase II do DNA) é um pré-requisito para reiniciação de transcrição e assim afeta diretamente o nível de transcrição geral. Subsequente à terminação de transcrição, o mRNA maduro é liberado do sítio de síntese e transportado por modelo ao citoplasma. Os mRNAs eucarióticos são acumulados como formas de poly(A) in vivo, tornando difícil detectar sítios de terminação de transcrição por métodos convencionais. Entretanto, a predição de UTRs 3’ funcionais e eficazes por métodos de bioinformática é difícil por não haver sequências de DNA conservadas que permitiríam a predição fácil de uma UTR 3’ eficaz.
[0090] A partir de um ponto de vista prático, é tipicamente benéfico que uma UTR 3’ usada em um cassete de expressão possua as características a seguir. Primeiro, a UTR 3’ deve poder terminar de modo eficaz e eficiente a transcrição do transgene e impedir a leitura da transcrição em qualquer sequência de DNA adjacente, o que pode ser compreendido de outro cassete de expressão como nos múltiplos cassetes de expressão que residem em um DNA de transferência (TDNA), ou o DNA cromossômico adjacente no qual o T-DNA foi inserido.
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Segundo, a UTR 3’ nâo deve causar uma redução na atividade de transcrição conferida pelo promotor, líder, intensiflcadores, e introns que são usados para acionar a expressão da molécula de DNA. Finalmente, em biotecnologia de planta, a UTR 3’ é frequentemente usada para iniciação de reações de amplificação de RNA transcrita reversa extraída da planta transformada e usada para: (1) avaliar a atividade ou expressão de transcrição do cassete de expressão uma vez integrado ao cromossomo de planta; (2) avaliar o número de cópia de inserções no DNA de planta; e (3) avaliar zigosidade da semente resultante após a reprodução. A UTR 3’ também é usada em reações de amplificação de DNA extraído da planta transformada para caracterizar a natureza intacta do cassete inserido. Uma UTR 3’ útil na prática da presente invenção é apresentada como as SEQ ID NOs:29, 34, 35, 36, 37, e 44. [0091] Conforme usado no presente documento, o termo intensificador ou elemento intensificador se refere a um elemento regulador de atuação czs, também conhecido como elemento cis, que confere um aspecto do padrão de expressão geral, mas é usualmente insuficiente para acionar transcrição sozinho, de uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente. Diferente de promotores, elementos intensiflcadores não incluem usualmente um sítio de início de transcrição (TSS) ou caixa TATA ou sequência de DNA equivalente. Um promotor ou fragmento promotor pode compreender naturalmente um ou mais elementos intensificadores que afetam a transcrição de uma sequência de DNA operativamente ligada. Um elemento intensificador também pode ser fundido a um promotor para produzir um elemento cis promotor quimérico, que confere um aspecto da modulação geral de expressão de genes. Um exemplo de um elemento intensificador derivado do promotor sintético, P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) é fornecido como a SEQ ID NO:24 (E~At.GSP571.nno: 1).
[0092] Acredita-se que muitos elementos promotores
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24/85 intensificadores ligam proteínas de ligação de DNA e/ou afetam a topologia de DNA, produzindo conformações locais que permitem seletivamente ou restringem o acesso de RNA polimerase ao modelo de DNA ou que facilitam a abertura seletiva da hélice dupla no local de iniciação de transcrição. Um elemento intensificador pode funcionar para ligar fatores de transcrição que regulam a transcrição. Alguns elementos intensificadores se ligam mais do que um fator de transcrição, e fatores de transcrição podem interagir com afinidades diferentes com mais do que um domínio intensificador. Os elementos intensificadores podem ser identificados por um número de técnicas, incluindo a análise de deleção, isto é, deletar um ou mais nucleotídeos da extremidade 5’ ou internos a um promotor; análise de proteína de ligação de DNA com o uso de pegada de DNase I; interferência de metllação; ensaios de deslocamento de mobilidade de eletroforese; pegada genômica in vivo por reação em cadeia de (PCR) mediada por ligação; e outros ensaios convencionais ou por análise de similaridade de sequência de DNA com o uso de motivos de elemento eis conhecidos ou elementos intensificadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com métodos de comparação de sequência de DNA convencionais, como BLAST. A estrutura fina de um domínio intensificador pode ser adicionalmente estudada por mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou por outros métodos convencionais conhecidos na técnica. Os elementos intensificadores podem ser obtidos por síntese química ou por isolamento de elementos reguladores que incluem tais elementos, e podem ser sintetizados com nucleotídeos de flanqueamento adicionais que contêm sítios de enzima de restrição úteis para facilitar a manipulação de subsequência. Deste modo, o projeto, a construção e o uso de elementos intensificadores de acordo com os métodos revelados no presente documento para modular a expressão de moléculas de DNA transcrevíveis operativamente ligadas são
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25/85 abrangidos pela invenção. Um intensificador útil exemplificative na prática desta invenção é apresentado como a SEQ ID NO: 24.
[0093] Conforme usado no presente documento, o termo quimérico se refere a uma molécula de DNA única produzida fundindose uma primeira molécula de DNA com uma segunda molécula de DNA, em que nem a primeira, nem a segunda molécula de DNA seriam normalmente encontradas nesta configuração, isto é, fundida com a outra. A molécula de DNA quimérica é, deste modo, uma nova molécula de DNA não encontrada normalmente de outro modo na natureza. Conforme usado no presente documento, o termo promotor quimérico se refere a um promotor produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA, por exemplo, a fusão de um promotor com um elemento intensificador. Deste modo, o projeto, a construção e o uso de promotores quiméricos de acordo com os métodos revelados no presente documento para modular a expressão de moléculas de DNA transcrevíveis operativamente ligadas são abrangidos pela presente invenção. Um promotor quimérico exemplificative é apresentado no presente documento como SEQ ID NO:25 (P-ALGSP571/442).
[0094] Os elementos reguladores quiméricos podem ser projetados para compreender vários elementos constituintes que podem ser operacionalmente ligados por vários métodos conhecidos na técnica, como digestão e ligação de enzima de restrição, clonagem independente de ligação, montagem modular de produtos de PCR durante amplificação, ou síntese química direta do elemento regulador, assim como outros métodos conhecidos na técnica. Os vários elementos reguladores quiméricos resultantes podem ser compreendidos dos mesmos, ou variantes dos mesmos, elementos constituintes, mas diferem na sequência de DNA ou sequências de DNA que compreendem a sequência de DNA de ligação ou sequências que
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26/85 permitem que as partes constituintes sejam operacionalmente ligadas. Na invenção, as sequências de DNA fornecidas como as SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43~45 podem fornecer sequências de referência de elemento regulador, em que os elementos constituintes que compreendem a sequência de referência podem ser unidos por métodos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, deleções, e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente em transformação de célula bacteriana e de planta.
[0095] Conforme usado no presente documento, o termo variante se refere a uma segunda molécula de DNA, como um elemento regulador, que está em composição similar, mas não idêntica a, uma primeira molécula de DNA, e em que a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade geral, isto é, o mesmo ou padrão de expressão similar, por exemplo, através de mais ou menos atividade de transcrição equivalente, da primeira molécula de DNA. Um variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, como uma com sítios de enzima de restrição diferentes e/ou deleções, substituições ou inserções Internas. Um variante também pode abranger um elemento regulador que tem uma sequência de nucleotídeo que compreende uma substituição, deleção, ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência de referência, em que o elemento regulador derivado tem mais ou menos ou atividade de transcrição ou tradução equivalente em relação à molécula reguladora parental correspondente. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeos fornecida como as SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45 pode ser usada para criar variantes que são similares em composição, mas não idênticas, à sequência de DNA do elemento regulador original, enquanto ainda mantêm a funcionalidade geral, isto é, o mesmo ou padrão de expressão similar, do elemento regulador
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27/85 original. A produção de tais variantes da invenção está bem dentro da habilidade comum na técnica em luz da divulgação e é abrangida pelo escopo da invenção.
[0096] A eficácia das modificações, duplicações ou deleções descritas no presente documento nos aspectos de expressão desejáveis de um transgene particular pode ser testada empiricamente em ensaios de planta estáveis e transientes, como aqueles descritos nos exemplos de trabalho, de modo a validar os resultados, os quais podem variar dependendo das mudanças feitas e do objetivo da mudança na molécula de DNA inicial.
CONSTRUTOS [0097] Conforme usado no presente documento, o termo construto significa qualquer molécula de DNA recombinante, como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fago, ou DNA linear ou circular ou molécula de RNA, derivado de qualquer fonte, com capacidade para integração genômica ou replicação autônoma, que compreende uma molécula de DNA em que pelo menos uma molécula de DNA foi ligada a outra molécula de DNA de maneira funcionalmente operacional, isto é, operativamente ligada. Conforme usado no presente documento, o termo vetor significa qualquer construto que pode ser usado com o propósito de transformação, isto é, a introdução de DNA ou RNA heterólogo em uma célula hospedeira. Um construto inclui tipicamente um ou mais cassetes de expressão. Conforme usado no presente documento, um cassete de expressão se refere a uma molécula de DNA que compreende pelo menos uma molécula de DNA transcrevível operativamente ligada a um ou mais elementos reguladores, tipicamente pelo menos um promotor e uma UTR 3’.
[0098] Conforme usado no presente documento, o termo operativamente ligado se refere a uma primeira molécula de DNA unida a uma segunda molécula de DNA, em que a primeira e a segunda
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28/85 moléculas de DNA são dispostas de modo que a primeira molécula de DNA afete a função da segunda molécula de DNA. As duas moléculas de DNA podem ou podem não ser parte de uma molécula de DNA contígua única e podem ou podem não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma molécula de DNA transcrevível se o promotor modula a transcrição da molécula de DNA transorevível de interesse em uma célula. Um líder, por exemplo, é operativamente ligado à sequência de DNA quando tem capacidade para afetar a transcrição ou tradução da sequência de DNA.
[0099] Os construtos da invenção podem ser fornecidos, em uma modalidade, como construtos de borda de plasmídeo de indução de tumor (Ti) duplo que têm as regiões de borda direita (RB ou AGRtu.RB) e a borda esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isolado de Agrobacterium tumefaciens que compreende um T-DNA que, juntamente com moléculas de transferência fornecidas pelas células de A. tumefaciens, permitem a integração do T-DNA ao genoma de uma célula de planta (consultar, por exemplo, a Patente n° U.S. 6.603.061). Os construtos também podem conter os segmentos de DNA de cadeia principal de plasmídeo que fornecem função de replicação e seleção de antibiótico em células bacterianas, por exemplo, uma origem de Escherichia coll de replicação, como ori322, uma origem de faixa de hospedeiro ampla de replicação, como oriV ou oriRi, e uma região de codificação para um marcador selecionável, como Spec/Strp, que codifica Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável gentamicina (Gm, Gent). Para transformação de planta, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente A. tumefaciens ABI, C58, ou LBA4404, entretanto, outras cepas conhecidas por aqueles versados na técnica de transformação de planta podem funcionar na invenção. [00100] Os métodos são conhecidos na técnica por montar e
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29/85 introduzir construtos em uma célula de tal maneira que a molécula de DNA transcrevível é transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressada como uma proteína. Para a prática da invenção, as composições e os métodos convencionais para preparar e usar construtos e células hospedeiras são bem conhecidos por um versado na técnica. Os vetores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens e o vetor de controle de transferência pCaMVCN.
[00101] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em um construto, incluindo aqueles fornecidos no presente documento. Quaisquer tais elementos reguladores podem ser fornecidos em combinação com outros elementos reguladores. Tais combinações podem ser projetadas ou modificadas para produzir recursos reguladores desejáveis. Em uma modalidade, os construtos da invenção compreendem pelo menos um elemento regulador operativamente ligado a uma molécula de DNA transcrevível operativamente ligada a uma UTR 3’.
[00102] Os construtos da invenção podem incluir qualquer promotor ou líder fornecido no presente documento ou conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da invenção pode ser operativamente ligado a um líder 5’ não traduzido heterólogo, como um derivado de um gene de proteína de choque térmico. Alternativamente, um líder da invenção pode ser operativamente ligado a um promotor heterólogo, como o promotor de transcrição de Vírus do Mosaico de Couve-flor 35S.
[00103] Os cassetes de expressão também podem incluir uma sequência de codificação de peptídeo de trânsito que codifica um peptídeo que é útil para alvejamento subcelular de uma proteína operativamente ligada, particularmente a um cloroplasto, leucoplasto, ou outra organela de plastídeo; mitocôndria; peroxissomo; vacúolo; ou
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30/85 uma localização extracelular. Muitas proteínas localizadas por cloroplasto são expressadas a partir de genes nucleares como precursores e são alvejadas ao cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP). Os exemplos de tais proteínas de cloroplasto isoladas incluem, mas sem limitação, aquelas associadas à subunidade pequena (SSU) de ribulose-1,5,-bifosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, a proteína I e a proteína II de complexo de colheita leve, tiorredoxina F, e enolpiruvil shiquimato fosfato sintase (EPSPS). Os peptídeos de trânsito de cloroplasto são descritos, por exemplo, na Patente n° U.S. 7.193.133. Foi demonstrado que as proteínas de não cloroplasto podem ser alvejadas ao cloroplasto pela expressão de um CTP heterólogo operativamente ligado ao transgene que codifica proteínas de não cloroplasto.
MOLÉCULAS DE DNÂ TRANSCREVÍVEIS [00104] Conforme usado no presente documento, o termo molécula de DNA transcrevível se refere a qualquer molécula de DNA com capacidade para ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, mas sem limitação, aquelas que têm sequências de codificação de proteína e aquelas que produzem moléculas de RNA que têm sequências úteis para supressão de gene. O tipo de molécula de DNA pode incluir, mas sem limitação, uma molécula de DNA da mesma planta, uma molécula de DNA de outra planta, uma molécula de DNA de um organismo diferente, ou uma molécula de DNA sintética, como uma molécula de DNA que contém uma mensagem antissenso de um gene, ou uma molécula de DNA que codifica uma versão artificial, sintética ou modificada de outro modo de um transgene. As moléculas de DNA transcrevíveis exemplificativas para incorporação a construtos da invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de uma espécie diferente da espécie na qual a molécula de DNA é incorporada ou genes que originam de ou estão presentes na mesma espécie, mas
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31/85 são incorporados a células recipientes por métodos de manipulação genética em vez de técnicas de reprodução clássicas.
[00105] Um transgene se refere a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga a uma célula hospedeira pelo menos em relação a sua localização no genoma de célula hospedeira e/ou uma molécula de DNA transcrevível artificialmente incorporada a um genoma da célula hospedeira na geração atual ou qualquer geração anterior da célula.
[00106] Um elemento regulador, como um promotor sintético da invenção, pode ser operativamente ligado a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga. Conforme usado no presente documento, o termo heterólogo se refere à combinação de duas ou mais moléculas de DNA, quando tal combinação não é normalmente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas de DNA podem ser derivadas de genes diferentes, por exemplo, genes diferentes da mesa espécie ou os mesmos genes de espécies diferentes, ou uma das moléculas de DNA podem ser sintéticas e não encontradas na natureza. Um elemento regulador é heterólogo em relação a uma molécula de DNA transcrevível ligada operativamente se tal combinação não for normalmente encontrada na natureza, isto é, a molécula de DNA transcrevível não ocorre naturalmente operativamente ligada ao elemento regulador.
[00107] A molécula de DNA transcrevível pode ser geralmente qualquer molécula de DNA cuja expressão de uma transcrição é desejável. Tal expressão de uma transcrição pode resultar na tradução da molécula de mRNA resultante e, deste modo, na expressão de proteína. Alternativamente, por exemplo, uma molécula de DNA transcrevível pode ser projetada para causar finalmente a expressão diminuída de um gene ou proteína específico. Em uma modalidade, isto
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32/85 pode ser alcançado usando-se uma molécula de DNA transcrevível que é orientada na direção antissenso. Uma pessoa de habilidade comum na técnica é familiar com o uso de tal tecnologia antissenso. Qualquer gene pode ser negativamente regulado desta maneira, e, em uma modalidade, uma molécula de DNA transcrevível pode ser projetada para supressão de um gene específico através da expressão de uma molécula de dsRNA, siRNA ou miRNA.
[00108] Deste modo, uma modalidade da invenção é uma molécula de DNA recombinante que compreende um elemento regulador da invenção, como aqueles fornecidos como as SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45, operativamente ligados a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga de modo a modular a transcrição da molécula de DNA transcrevível em um nível desejável ou em um padrão desejável quando o construto é integrado no genoma de uma célula de planta transgênica. Em uma modalidade, a molécula de DNA transcrevível compreende uma região de codificação de proteína de um gene e, em outra modalidade, a molécula de DNA transcrevível compreende uma região antissenso de um gene.
GENES DE INTERESSE AGRONÔMICO [00109] Uma molécula de DNA transcrevível pode ser um gene de interesse agronômico. Conforme usado no presente documento, o termo gene de interesse agronômico se refere a uma molécula de DNA transcrevível que, quando expressada em um tecido de planta, célula, ou tipo de célula particular, confere uma característica desejável. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar na planta a fim de causar um efeito mediante a morfologia, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, composição de grão, perfil nutricional, doença ou resistência a pragas, e/ou tolerância ambientai ou química de planta ou pode atuar como um agente pesticida na dieta de uma praga que se alimenta da planta. Em uma modalidade da invenção, um
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33/85 elemento regulador da invenção é incorporado a um construto de modo que o elemento regulador seja operativamente ligado a uma molécula de DNA transcrevível que é um gene de interesse agronômico. Em uma planta transgênica que contém tal construto, a expressão do gene de interesse agronômico pode conferir um traço agronômico benéfico. Um traço agronômico benéfico pode incluir, por exemplo, mas sem limitação, tolerância herbicida, controle de inseto, rendimento modificado, resistência a doenças, resistência a patógeno, crescimento e desenvolvimento de planta modificada, teor de amido modificado, teor de óleo modificado, teor de ácido graxo modificado, teor de proteína modificado, maturação de fruta modificada, nutrição animal e humana intensificada, produções de biopolímero, resistência ao estresse ambiental, peptídeos farmacêuticos, qualidades de processamento melhoradas, sabor melhorado, utilidade de produção de semente híbrida, produção de fibra melhorada, e produção de biocombustível desejável.
[00110] Os exemplos de genes de interesse agronômico conhecidos na técnica incluem, mas sem limitação, aqueles para resistência a herbicida (Patentes n° U.S. 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; e 5.463.175), rendimento aumentado (Patentes n° U.S. USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; e 5.716.837), controle de inseto (Patentes n° U.S. 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658, 5.880.275; 5.763.245; e 5.763.241), resistência à doença fúngica (Patentes n° U.S. 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962;
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6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; e 6.506.962), resistência a vírus (Patentes n° U.S. 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; e 5.304.730), resistência a nemátodo (Patente n° U.S. 6.228.992), resistência a doenças bacterianas (Patente n° U.S. 5.516.671), crescimento e desenvolvimento de planta (Patentes n° U.S. 6.723.897 e 6.518.488), produção de amido (Patentes n° U.S. 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificada (Patentes n° U.S. 6.444.876; 6.426.447; e 6.380.462), alta produção de óleo (Patentes n° U.S. 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; e 6.476.295), teor de ácido graxo modificado (Patentes n° U.S. 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; e 6.459.018), alta produção de proteína (Patente n° U.S. 6.380.466), maturação de fruta (Patente n° U.S. 5.512.466), nutrição animal e humana intensificada (Patentes n° U.S. 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; e 6.171.640), biopolímeros (Patentes n° U.S. USRE37.543; 6.228.623; e 5.958.745, e 6.946.588), resistência a estresse ambiental (Patente n° U.S. 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (Patentes n° U.S. 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; e 6.080.560), traços de processamento melhorados (Patente n° U.S. 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente n° U.S. 6.531.648), rafinose inferior (Patente n° U.S. 6.166.292), produção de enzima industrial (Patente n° U.S. 5.543.576), sabor melhorado (Patente n° U.S. 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente n° U.S. 5.229.114), produção de semente híbrida (Patente n° U.S. 5.689.041), produção de fibra (Patentes n° U.S. 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; e 5.869.720) e produção de biocombustível (Patente n° U.S. 5.998.700).
[00111] Alternativamente, um gene de interesse agronômico pode afetar as características de planta mencionadas acima ou fenótipos codificando-se uma molécula de RNA que faz com que a modulação
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35/85 alvejada de expressão de genes de um gene endógeno, por exemplo, por antissenso (consultar, por exemplo, Patente n° 5.107.065); RNA inibidor ÇRNAi, incluindo a modulação de expressão de genes por mecanismos mediados por mIRNA, siRNA, siRNA de atuação trans, e sRNA em fase, por exemplo, conforme descrito nos pedidos publicados U.S. 2006/0200878 e U.S. 2008/0066206, e no pedido de patente n° U.S. 11/974,469); ou mecanismos mediados por cossupressão. O RNA também pode ser uma molécula de RNA catalítico (por exemplo, uma ribozima ou um riboswitch; consultar, por exemplo, documento n° U.S. 2006/0200878) manipulada para clivar um produto de mRNA endógeno desejável. Os métodos são conhecidos na técnica para construir e introduzir construtos em uma célula de tal maneira que a molécula de DNA transcrevível seja transcrita em uma molécula que tem capacidade para causar a supressão de gene.
MARCADORES SELECIONÁVEIS [00112] Os transgenes marcadores selecionáveis também podem ser usados com os elementos reguladores da invenção. Conforme usado no presente documento, o termo transgene marcador selecionável se refere a qualquer molécula de DNA transcrevível cuja expressão em uma planta transgênica, tecido ou célula, ou falta da mesma, pode sertriada por ou pontuada de alguma maneira. Os genes marcadores selecionáveis, e sua seleção associada e técnicas de triagem, para uso na prática da invenção são conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, moléculas de DNA transcrevíveis que codificam B-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), proteínas que conferem resistência a antibiótico, e proteínas que conferem tolerância a herbicida. Um exemplo de um transgene marcador selecionável é fornecido como a SEQ ID NO:42.
TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULA [00113] A invenção também é direcionada a um método para
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36/85 produzir células transformadas e plantas que compreendem um ou mais elementos reguladores operativamente ligados a uma molécula de DNA transcrevível.
[00114] O termo transformação se refere à introdução de uma molécula de DNA em um hospedeiro recipiente. Conforme usado no presente documento, o termo hospedeiro se refere às bactérias, fungos, ou plantas, incluindo quaisquer células, tecidos, órgãos, ou progênie das bactérias, fungos ou plantas. Os tecidos e as células de interesse particular incluem protoplastos, caules, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, mudas, embriões e pólen.
[00115] Conforme usado no presente documento, o termo transformado se refere a uma célula, tecido, órgão, ou organismo em que uma molécula de DNA estranha, como um construto, foi introduzida. A molécula de DNA introduzida pode ser integrada ao DNA genômico da célula recipiente, tecido, órgão, ou organismo de modo que a molécula de DNA introduzida é herdada por progênie subsequente. Uma célula ou organismo transgênico ou transformado também pode incluir progênie da célula ou organismo e progênie produzido a partir de um programa de reprodução que emprega tal organismo transgênico como um parente em um cruzamento e que exibe um fenótipo alterado resultante da presença de uma molécula de DNA estranha. A molécula de DNA introduzida também pode ser transientemente introduzida na célula recipiente de modo que a molécula de DNA introduzida não é herdada por progênie subsequente. O termo transgênico se refere a uma bactéria, fungo, ou planta que contém uma ou mais moléculas de DNA heteróloga.
[00116] Há muitos métodos bem conhecidos na técnica para introduzir moléculas de DNA em células de planta. O processo compreende geralmente as etapas de selecionar uma célula hospedeira adequada, que transforma a célula hospedeira com um vetor, e obtém
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37/85 a célula hospedeira transformada. Os métodos e os materiais para transformar células de planta introduzindo-se um construto de planta em um genoma de planta na prática desta invenção pode incluir qualquer um dos métodos bem conhecidos e demonstrados. Os métodos adequados incluem, mas sem limitação, infecção bacteriana (por exemplo, Agrobacterium), vetores BAC binários, entrega direta de DNA (por exemplo, por transformação mediada por PEG, ingestão de DNA mediada por dessecamento/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carbeto de silício, e aceleração de partículas revestidas com DNA), e edição de gene (por exemplo, sistemas CRISPR-Cas), entre outros. [00117] Esta divulgação contempla adicionalmente que os elementos de expressão sintéticos divulgados podem ser manipulados em planta usando-se vários métodos de edição de gene conhecidos na técnica. Tais tecnologias usadas para edição de genoma incluem, mas sem limitação, ZFN (nuclease de dedo de zinco), meganucleases, TALEN (nucleases efetoras tipo ativador de transcrição), e sistemas CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente lnterespaçadas)/Cas (associados a CRISPR). Estes métodos de edição de genoma podem ser usados para alterar a sequência de elemento de expressão em uma célula de planta para uma sequência diferente.
[00118] As células hospedeiras podem ser qualquer célula ou organismo, como uma célula de planta, célula de alga, algas, célula fúngicas, fungos, célula bacterianas, ou célula de inseto. Em modalidades específicas, as células hospedeiras e células transformadas podem incluir células de plantas de cultura.
[00119] Uma planta transgênica pode ser subsequentemente regenerada a partir de uma célula de planta transgênica da invenção. Com o uso de técnicas de reprodução convencionais ou autopolinação, a semente pode ser produzida a partir desta planta transgênica. Tal semente, e a planta de progênie resultante cultivada a partir de tal
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38/85 semente, conterá a molécula de DNA recombinante da invenção, e, portanto, será transgênica.
[00120] As plantas transgênicas da invenção podem ser autopolinadas para fornecer a semente para plantas transgênicas homozigóticas da invenção (homozigótica para a molécula de DNA recombinante) ou cruzadas com plantas não transgênicas ou plantas transgênicas diferentes para fornecer semente para plantas transgênicas heterozigóticas da invenção (heterozigóticas para a molécula de DNA recombinante). Tanto as plantas transgênicas homozigóticas quanto heterozigóticas são denominadas no presente documento como plantas de progênie. As plantas de progênie são plantas transgênicas descendentes da planta transgênica original e que contém a molécula de DNA recombinante da invenção. As sementes produzidas com o uso de uma planta transgênica da invenção podem ser cultivadas e usadas para cultivar gerações de plantas transgênicas, isto é, plantas de progênie da invenção, que compreendem o construto desta invenção e expressam um gene de interesse agronômico. As descrições de métodos de reprodução que são comumente usadas para culturas diferentes podem ser encontradas em um dentre diversos livros de referência, consultar, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960): Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369399 (1979); Sneep e Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a Edição, Monograph, 16:249 (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Volume 1) and Crop Species Soybean (Volume 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
[00121] As plantas transformadas podem ser analisadas pela presença do gene ou genes de interesse e o nível de expressão e/ou
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39/85 perfil conferido pelos elementos reguladores da invenção. Aqueles de habilidade na técnica estão cientes dos vários métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, os métodos para análise de planta incluem, mas sem limitação, Southern blots ou northern blots, abordagens com base em PCR, análises bioquímicas, métodos de triagem fenotípicos, avaliações de campo e ensaios imunodiagnósticos. A expressão de uma molécula de DNA transcrevível pode ser medid com o uso de TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) reagentes e métodos conforme descrito pelo fabricante e tempos de ciclo de PCR determinados com o uso de TaqMan® Testing Matrix. Alternativamente, os reagentes Invader® (Third Wave Technologies, Madison, Wl) e métodos conforme descrito pelo fabricante podem ser usados para avaliar a expressão de transgene.
[00122] A invenção também fornece partes de uma planta da invenção. As partes de planta incluem, mas sem limitação, folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endoesperma, óvulo e pólen. As partes de planta da invenção podem ser viáveis, não viáveis, regeneráveis e/ou não regenerávels. A invenção também inclui e fornece células de planta transformadas que compreende uma molécula de DNA da invenção. As células de planta transformada ou transgênica da invenção incluem células de planta regeneráveis e/ou não regeneráveis.
[00123] A invenção também fornece um produto primário que é produzido de uma planta transgênica ou parte da mesma que contém a molécula de DNA recombinante da invenção. Os bens de consumo da invenção contêm uma quantidade detectável de DNA que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-32 e SEQ ID NOs:43-45. Conforme usado no presente documento, um produto primário se refere a qualquer composição ou produto que é compreendido de material derivado de uma planta
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40/85 transgênica, semente, célula de planta, ou parte de planta que contém a molécula de DNA recombinante da invenção. Os produtos primários incluem, mas sem limitação, sementes processadas, grãos, partes de planta, e farelo. Um produto primário da invenção conterá uma quantidade detectável de DNA correspondente à molécula de DNA recombinante da invenção. A detecção de um ou mais deste DNA em uma amostra pode ser usada para determinar o conteúdo ou a fonte do produto primário. Qualquer método padrão de detecção para moléculas de DNA pode ser usado, incluindo métodos de detecção divulgados no presente documento.
[00124] A invenção pode ser mais prontamente entendida através da referência aos exemplos seguintes, os quais são fornecidos a título de ilustração, e não são destinados a serem limitantes da invenção, a menos que especificado. Deve ser observado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas constatadas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, em luz da presente divulgação, observam que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obtém um resultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, portanto, toda a matéria apresentada ou mostrada nos desenhos a seguir deve ser interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 PROJETO, SÍNTESE E CLONAGEM DE ELEMENTOS REGULADORES SINTÉTICOS [00125] Os elementos reguladores fornecidos na Tabela 1 são novel elementos de expressão sintéticos projetados através de métodos algorítmicos. Estes elementos reguladores sintéticos projetados de
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41/85 modo computacional foram quimicamente sintetizados e clonados para produzir grupos de elemento de expressão reguladores sintéticos (EXPs). Mais do que 1000 elementos reguladores sintéticos foram projetados e ensaiados em protoplastos de soja e plantas de soja transformadas de modo estável para identificar aqueles elementos reguladores sintéticos que forneceram características desejáveis, como níveis de expressão de proteína e padrões de expressão. Os elementos reguladores sintéticos descritos na Tabela 1 fornecem vários padrões de expressão úteis no acionamento de expressão de muitas sequências de codificação diferentes e RNAs interferentes de interesse agronômico. [00126] Os elementos reguladores sintéticos projetados de modo computacional não estenderam a homologla a quaisquer sequências de ácido nucleico conhecidas que existem em natureza. Os EXPs sintéticos e os promotores correspondentes, líderes, introns e UTRs 3’ são apresentados na Tabela 1. Os EXPs sintéticos foram clonados com o uso de métodos conhecidos na técnica em vetores de transformação de planta binária, operativamente ligados a uma sequência de codificação de β-glucuronidase (GUS), e os vetores foram usados para avaliar os níveis e padrões de expressão fornecidos pelos EXPs sintéticos em plantas de soja, algodão e milho estavelmente transformadas.
[00127] A análise do sítio de início de transcrição (TSS) de elemento regulador sintético e junções de splice de íntron/éxon podem ser realizados com o uso de tecido de planta transformado. Brevemente, as plantas são transformadas com os vetores de expressão de planta que compreende os fragmentos de DNA operativamente ligados a uma molécula de DNA transcrevível heteróloga. A seguir, o Sistema para Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA 5’ RACE, Versão 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California 92008) é usado para confirmar o elemento regulador sintético TSS e junções de splice de íntron/éxon analisando~se a sequência de DNA das transcrições de mRNA produzidas.
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Figure BR112019014797A2_D0001
lu
Q
LU
Q
Q.
:□
Figure BR112019014797A2_D0002
Figure BR112019014797A2_D0003
Descrição e/ou elementos reguladores de EXP ligados na direção 5’~»3’ (SEQ ID NOs): EXP: P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), L- At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) Promotor Líder EXP: P-At.GSP571.nno: 5 (SEQ ID NO:5), LAt.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:6) Promotor Líder EXP: P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5), L- At.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:6), l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) EXP: P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5), LAt.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:6), l-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9)
Tamanho (bp) 855 480 20 500 451 49 855 816
A σ o LU Z to — OJ CO iD CD CO
Anotação EXP-At. GSP442. nno+At. Cyco: 3 PAt.GSP442.nno:2 V” õ c c N a. to 0 < EXP-At.GSP571 P-At.GSP571.nno:5 -Ç· ó c c: ?— iD Q. to 0 < ...J EXP-At.GSP571 ,nno+At.Cyco:2 o Ύ— õ c c x— CN to 0 < 4O C C S“ LO CL to 0 < CL X LU
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Descrição e/ou elementos reguladores de EXP ligados na direção 5’-»3’ (SEQ ID NOs): íntron EXP: P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5), LAt.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:6), l-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO: 11) íntron EXP: P-At.GSP564.nno:3 (SEQ ID NO: 13), L- At.GSP564.nno:1 (SEQ ID NO: 14) Promotor Líder EXP: P-At.GSP564.nno:3 (SEQ ID NO: 13), L- At.GSP564.nno:1 (SEQ ID NO: 14), l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) EXP: P-At.GSP564.nno:3 (SEQ ID NO: 13), L- At.GSP564.nno:1 (SEQ ID NO: 14), l-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO: 17) íntron
Tamanho (bp) 309 810 310 o o LO 39 855 807 300
SEQ ID NO: σ> — — 12 I 13 14 17
Anotação l-At.GSI21.nno:2 EXP-ALGSP571 ,nno+At.GSI102.nno: 1 X— b c: c CN O 5 0 < EXP-ALGSP564 P-At.GSP564.nno:3 V” b c c s CO CL ω 0 < EXP-At. GSP564. nno+At. Cyco:2 CN b c c s 0 < + o c £2 s CO IX CO 0 < CL X LU \— b c £2 0 <
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Descrição e/ou elementos reguladores de EXP ligados na direção 5’-»3’ (SEQ ID NOs): EXP: P-At.GSP564.nno:3 (SEQ ID NO: 13), LAt.GSP564.nno:1 (SEQ ID NO: 14), l-ALGSI102.nno:1 (SEQ ID NO: 11) EXP: P-At.GSP579.nno:2 (SEQ ID NO:20), L- At.GSP579.nno:1 (SEQ ID NO:21) Promotor Líder EXP: P-At.GSP579.nno:2 (SEQ ID NO:20), LAt,GSP579.nno:1 (SEQ ID NO:21), l-At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO: 11) EXP: E-At.GSP571.nno:1 (SEQ ID NO:24), PAt,GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), L-At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), L-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NQ:40), I- At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) Intensificador Promotor Quimérico: E-A1.GSP571 .nno:1 (SEQ ID NO:24), P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2)
Tamanho (bp) 810 o o IO 51 0t8 OSSl· 422 902
SEQ ID NO: 19 20 21 22 23 24 2S
Anotação EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno:1 EXP-ALGSP579 P-At.GSP579.nno:2 L-At.GSP579.nno:1 EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 EXP- ALGSP571 ,nno+At,GSP442.nno+At,Cyco: 1 E-At.GSP571.nno:1 P-ALGSP571/442
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Descrição e/ou elementos reguladores de EXP ligados na direção 5’-»3’ (SEQ ID NOs): EXP: P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27), L- At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28), l-At.GSI17.nno:1 (SEQ ID NO: 17) Promotor Líder UTR 3’ EXP: P-ALGSP221:3 (SEQ ID NO:31), L-ALGSP221:1 (SEQ ID NO:32), l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) Promotor Líder EXP: P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), L- At.GSP442.nno:1 (SEQ ID NO:3), L-At.Cyco-1:1:2 (SEQ co CO Ò z Q σ UJ 00 CN Õ O O o Õ z Q UTR 3’ EXP: P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27), L- At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28), l-At.Cyco:2 (SEQ ID (εεΌΝ
Tamanho (bp) o o CO 458 42 400 947 370 229 928 300 855
SEQ ID NO: 26 27 28 29 30 31 32 44 45
Anotação EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 P-At.GSP576.nno:4 L-At.GSP576.nno:2 Έ- õ c c σ> ID 00 0 E N EXP-AÍ.GSP221 +At.Cyco:3 P-At.GSP221:3 L-At.GSP221:1 EXP-At GSP442+L-I-A1. Cyco CN Õ c c cõ 0 É N EXP-At. GSP576.nno+At. Cyco: 1
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EXEMPLO 2
ANÁLISE DOS EXPs SINTÉTICOS, EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 E EXP-AtGSP221+At.Cyco:3, ACIONAMENTO DE EXPRESSÃO DE GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00128] As plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene βglucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito dos grupos de elemento regulador selecionados em expressão.
[00129] As plantas de soja foram transformadas com planta construtos de expressão GUS que compreendem o EXP endógeno, EXP-At.Cyco: 1: 1 (SEQ ID NO:38), e dois EXPs sintéticos, EXPAt.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO: 1) e EXPAt.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30). EXP-At.Cyco: 1: 1 (SEQ ID NO:38) é derivado de um gene Via de subunidade de citocromo c oxidase de Arabidopsis e é compreendido do promotor, P-At.Cyco-1:1:2 (SEQ ID NO:39), operativamente ligado 5’ ao líder, L-At.Cyco-1: 1:2 (SEQ ID NO:40), que é operativamente ligado 5’ a um íntron, l-At.Cyco1:1:1 (SEQ ID NO:41). EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO: 1) e EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30), cada um compreendeu um promotor sintético e líder operativamente ligado 5’ ao íntron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). A sequência de l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33) é idêntica à sequência de l-At.Cyco-1: 1: 1 (SEQ ID NO:41), com a exceção de que há dois nucleotídeos após o sítio de splice de íntron incluído na sequência de l-At.Cyco-1: 1:1. Ambos os introns IAt.Cyco são submetidos a splicing igualmente.
[00130] Os elementos reguladores foram clonados em vetores de expressão de planta de base com o uso de métodos padrão conhecidos
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47/85 na técnica. Os vetores de expressão de planta resultantes continham uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu .borda direita), um primeiro cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de planta transformadas que conferem resistência à espectinomicina antibiótica; um segundo cassete de transgene para avaliar a atividade do elemento regulador, que compreendeu uma sequência de EXP operativamente ligada 5’ a uma sequência de codificação para β-glucuronldase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS 1: 1: 1, SEQ ID NO:42) que contém um íntron processável derivado do gene ST-LS 1 específico de tecido induzível leve de batata (Acesso Genbank: X04753), operativamente ligado 5’ a uma UTR 3’ do gene de Gossypium barbadense FbLate-2 (T~Gb.FbL2: 1, SEQ ID NO:36); e uma região de borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda).
[00131] As células de planta de soja foram transformadas por transformação mediada por Agrobacterium com o uso destes construtos de vetor de transformação binária, assim como é bem conhecida na técnica. As células de planta transformadas resultantes forma induzidas para formar plantas de soja integral.
[00132] A análise GUS hlstoquímica foi usada para análise de expressão qualitativa e quantitativa das plantas transformadas. As seções de tecido inteiras foram incubadas com solução X-Gluc de coloração GUS (5-bromo~4~cloro~3~indolil·b~glucoronídeo) (1 miligrama/mililitro) por um comprimento apropriado de tempo, enxaguadas, e visualmente inspecionadas pela coloração azul. A atividade GUS foi qualitativamente determinada por inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio com o uso de órgãos e tecidos de planta selecionados.
[00133] Para análise quantitativa de expressão de GUS, a proteína total foi extraída dos tecidos selecionados de plantas de soja
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48/85 transformadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil- -D-glucuronídeo (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitros. O produto de reação, 4~ metilumbeliferona (4-MU), é fluorescente de modo máximo em alto pH, enquanto o grupo hidroxila é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio interrompe simultaneamente o ensaio e ajusta o pH para quantificar o produto fluorescente. A fluorescência foi medida com excitação em 365 nm, emissão em 445 nm com o uso de um Fluoromax-3 com Leitor Micromax, com largura de fenda definida em excitação 2 nm e emissão 3 nm. Os valores são fornecidos em unidades de nmol GUS/hora/mg de proteína total.
[00134] Os tecidos a seguir foram amostrados para expressão de GUS na geração Ro; raiz de estágio V5, dreno de folha, e fonte de folha; raiz de estágio R1, pecíolo de folha, fonte de folha, e flores; semente de estágio R3 imatura e botão; semente de estágio R5 de cotiledônea; e semente de estágio R8 de embrião e semente de cotiledônea. A Tabela 2 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelos grupos de elemento regulador de EXP testados, em que ND indica que a expressão em um tecido particular não foi determinada.
TABELA 2. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADAS POR GRUPOS DE ELEMENTO REGULADOR SINTÉTICO E O EXP endógeno, EXP-At.Cyco:1:1.
Estágio de Desenvol vimento Órgão EXP- At.Cyco:1:1 (SEQ ID NO:38) EXPAt.GSP442.nno+ At.Cyco:3 (SEQ ID NO: 1) EXP- At.GSP221+At.Cyc o:3 (SEQ ID NO:30)
V5 Raiz 151 399 928
Dreno de Folha 39 65 59
Fonte de Folha 52 109 100
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R1 Raiz ND 616 1893
Pecíolo de Folha 97 470 136
Fonte de Folha 46 177 240
Flores 71 277 140
R3 Semente Imatura 64 477 ND
Botão 84 575 702
R5 Semente Cotiledônea 91 564 58
R8 Embrião de Semente 57 149 301
Semente Cotiledônea 100 1118 414
00135] Conforme pode ser visto na Tabela 2, cada um dos grupos de elemento regulador sintético tem um padrão único de expressão nos tecidos amostrados para o EXP endógeno. Por exemplo, o promotor ALGSP442 sintético, P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), e líder, LAt.GSP442.nno: 1 (SEQ ID NO:3), de EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO: 1) fornece níveis maiores de expressão GUS em todos os órgãos ensaiados em relação ao EXP-AtCyco: 1: 1 (SEQ ID NO:38) endógeno, que compreende uma sequência de íntron idêntica. A análise do TSS demonstrou um TSS consistente. O íntron foi removido no mRNA resultante conforme esperado. Adicionalmente, o promotor ALGSP221 sintético, P-AT.GSP221:3 (SEQ ID NO:31), e o líder, LALGSP221: 1 (SEQ ID NO:32), de EXP-At.GSP221+At.Cyco:3 (SEQ ID NO:30) também fornece níveis mais altos de expressão constitutiva na maioria dos órgãos ensaiados em relação ao EXP-At.Cyco: 1: 1 endógeno, e demonstra um TSS consistente. Entretanto, o TSS de EXPAt.GSP221+At.Cyco:3 não estava localizado na localização prevista havia múltiplos elementos TATA potenciais. Isto cria questões potenciais para múltiplas transcrições, as quais podem produzir
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50/85 múltiplas sequências de codificação. Como tal, EXPAt.GSP221+At.Cyco:3 não foi considerado aceitável para uso em acionamento de expressão de transgene em plantas dicotiledôneas transformadas de modo estável. Isto demonstra uma das complexidades na projeção de elementos de expressão sintéticos. Vários elementos sintéticos foram ensaiados no desenvolvimento e identificação de elementos de expressão sintéticos, mas apenas um pequeno subconjunto forneceu características desejáveis e atividade reguladora, ilustrando a complexidade na projeção de elementos reguladores de transcrição sintéticos.
[00136] Conforme pode ser visto na Tabela 2, o promotor sintético, P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) e L-At.GSP442.nno: 1 (SEQ ID NO:3) compreendido em EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco:3 (SEQ ID NO: 1) pode acionar a expressão de transgene constitutiva de um transgene operativamente ligado em uma planta de soja transformada de modo estável.
EXEMPLO 3
ANÁLISE DO PROMOTOR E LÍDER ALGSP571 SINTÉTICO, E OS INTRONS ALGSI21 E ALGSI102 SINTÉTICOS, ACIONAMENTO DE EXPRESSÃO DE GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00137] As plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene βglucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito dos grupos de elemento regulador selecionados em expressão.
[00138] As plantas de soja foram transformadas com construtos expressão GUS de planta, que compreende os EXPs sintéticos, EXPALGSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-ALGSP571 ,nno+At.Cyco:2 (SEQ ID
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N0:7), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 (SEQ ID NO:8), e EXPAt.GSP571.nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 10). Cada urn dos EXPs sintéticos compreendeu o promotor At.GSP571 sintético (SEQ ID NO:5) e líder (SEQ ID NO:6). EXP-ALGSP571 ,nno+ALCyco:2 compreendeu o íntron de Arabidopsis endógeno, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 e EXPAt.GSP571.nno+ALGSI102.nno: 1 compreendeu os introns sintéticos, IAt.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), respectivamente. Os vetores de transformação de planta binária foram similares àqueles descritos no Exemplo 2 com a exceção de cada um dos vetores de EXP ALGSP571 compreenderem a UTR 3’, T-Mt.Sali32- 1:2: 1 (SEQ ID NO:34), derivada do gene Sali3 de Medicago truncatula.
[00139] A análise de expressão GUS quantitativa e qualitativa foi realizada conforme descrito no Exemplo 2. As amostras de tecido usadas para análise foram as mesmas usadas que as descritas no Exemplo 2. A Tabela 3 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelos elementos reguladores de EXP sintéticos testados, em que ND indica que a expressão em um tecido particular não foi determinada.
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TABELA 3. EXPRESSÃO DE GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADOS POR ELEMENTOS REGULADORES SINTÉTICOS.
EXPALGSP571 .nno+ At.GSI102.nno:1 (SEQ ID NO: 10) 579 1683 2128 645 1167 2129 350 232 1535 1433 1122 2648
EXP- At.GSP571.nno+ At.GSI21.nno:10 (SEQ ID NO:8) 165 792 1475 457 1267 2094 1408 495 4014 540 603 2533
EXPAt.GSP571.nno+ At.Cyco:2 (SEQ ID NO:7) 57 612 1090 ND 1091 3538 830 609 2228 474 1004 4524
EXP- ALGSP571 (SEQ ID I NO:4) I o 650 1379 110 951 1995 703 to 852 650 1153 2449
Órgão Raiz Dreno de Folha Fonte de Folha Raiz Pecíolo de Folha Fonte de Folha Flores Semente Imatura Botão Semente Cotiledônea Embrião de Semente Semente Cotiledônea
Estágio de Desenvolvimento > R1 R3 R5 R8
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53/85 [00140] Conforme pode ser visto na Tabela 3, o promotor At.GSP571 sintético e líder fornecem expressão constitutiva em todos os órgãos ensaiados. A expressão foi a mais alta na folha e em sementes. A análise do TSS demonstrou um TSS consistente. Ligar de modo operacional uma sequência de íntron alterou a expressão em muitos dos órgãos, o que fornece um meio para regular precisamente a expressão constitutiva. As diferenças em expressão foram observadas quando ligam operativamente os introns sintéticos, l-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11). Os introns sintéticos intensificaram a expressão em alguns tecidos, mas diferiram no nível de intensificação para cada órgão. Por exemplo, a intensificação com o uso do íntron sintético l~At.GSI21.nno:2 no botão R3 foi mais alta do que a intensificação vista com o uso do íntron sintético l-At.GSI102.nno: 1 e o íntron endógeno l-At.Cyco:2 em relação a EXP-At.GSP571. A expressão foi apenas levemente intensificada pelos três introns operativamente ligados em pecíolo R1. Em flores R1, l-At.GSI21.nno:2 e l-At.Cyco:2 intensificaram a expressão, com IAt.GSI21.nno:2 que fornece um alto nível de intensificação de expressão e l-At.Cyco:2 que fornece um nível moderado de intensificação. De modo interessante, l-At.GSI102.nno: 1 reduziu a expressão em flores R1.
[00141] A análise dos mRNAs resultantes mostrou processamento apropriado e consistente dos elementos de íntron.
[00142] O promotor sintético, P-ALGSP571 ,nno:5 (SEQ ID NO:5) e o líder L-At.GSP571.nno: 1 (SEQ ID NO:6) compreendidos em EXPALGSP571 (SEQ ID NO:4) fornecem expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado em plantas de soja transformadas de modo estável. Os EXPs sintéticos, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:7), que compreendem o íntron de Arabidopsis l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33), e EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 (SEQ ID
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N0:8) e EXP-ALGSP571 ,nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 10 que compreende os introns sintéticos, l-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) e IAt.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), respectivamente, fornece padrões únicos de expressão constitutiva em plantas de soja transformadas de modo estável. Os introns sintéticos, l-At.GSI21.nno:2 (SEQ ID NO:9) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), fornecem expressão intensificada ou modulada em muitos dos órgãos de planta quando operativamente ligados a EXP-ALGSP571 (SEQ ID NO:4). Estes padrões de expressão únicos podem ser usados para acionar transgenes específicos nos quais o padrão de expressão específico de um dos quatro ALGSP571 EXPs é mais desejável.
EXEMPLO 4
Análise do Promotor e Líder ALGSP564 SINTÉTICO, E OS ÍNTRONS ALGSI17 E ALGSI102 SINTÉTICOS, ACIONAMENTO DE EXPRESSÃO DE GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00143] As plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene βglucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito dos grupos de elemento regulador selecionados em expressão.
[00144] As plantas de soja foram transformadas com construtos de expressão GUS de planta que compreendem os EXPs sintéticos, EXPALGSP564 (SEQ ID NO: 12), EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO: 15), EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO: 16), e EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 18). Cada um dos EXPs sintéticos compreenderam o promotor P-At.GSP564.nno:3 sintético (SEQ ID NO: 13) e o líder L-At.GSP564.nno.l sintético (SEQ ID NO: 14). EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco:2 compreendeu o íntron de
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Arabidopsis, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33), EXPAt.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 e EXPAt.GSP564.nno4-At.GSH02.nno: 1 compreendeu os introns sintéticos, IAt.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), respectivamente. Os vetores de transformação de planta binária foram similares àqueles descritos no Exemplo 2 com a exceção de cada um dos vetores de EXP At.GSP564 compreenderem a UTR 3’, TMt.Oxr- 1:2: 1 (SEQ ID NO:35), derivada de um gene de proteína de oxidorredutase putativa (OXR) de Medicago truncatula.
[00145] A análise de expressão GUS quantitativa e qualitativa foi realizada conforme descrito no Exemplo 2. As amostras de tecido usadas para análise foram as mesmas usadas que as descritas no Exemplo 2. A Tabela 4 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelos elementos reguladores de EXP sintéticos testados, em que ND” indica que a expressão em um tecido particular não foi determinada.
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TABELA 4. EXPRESSÃO DE GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADOS POR ELEMENTOS REGULADORES SINTÉTICOS.
EXP- At.GSP564.nno+ At.GSI102.nno:1 (SEQIDNO:18) 145 259 1229 627 148 917 305 ND ND 61 70 572
EXP- At.GSP564.nno+ At.GSI17.nno:2 (SEQIDNO:16) 54 89 209 2348 273 436 ND 101 749 78 137 655
EXPAt.GSP564.nno+ At.Cyco:2 (SEQIDNO:15) CO o — 220 421 165 235 205 91 ND ND 88 97 288
EXPALGSP564 (SEQIDNO:12) 61 38 74 118 06 140 99 26 40 25 38 79
Órgão Raiz Dreno de Folha Fonte de Folha Raiz Pecíolo de Folha Fonte de Folha Flores Semente Imatura Botão Semente Cotiledônea Embrião de Semente Semente Cotiledônea
Estágio de Desenvolvimento 9Λ R1 R3 R5 R8 ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________!
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57/85 [00146] Conforme pode ser visto na Tabela 4, o promotor At.GSP564 sintético e líder fornecem expressão constitutiva em todos os órgãos ensaiados. A expressão foi a mais alta na folha e em sementes. A análise do TSS demonstrou um TSS consistente. Ligar de modo operacional uma sequência de íntron alterou a expressão em muitos dos órgãos, o que fornece um meio para regular precisamente a expressão constitutiva. As diferenças na expressão foram observadas quando ligam operativamente os introns sintéticos, l~At.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11). Os introns sintéticos intensificaram a expressão em alguns tecidos em relação a EXPALGSP564, mas diferiram no nível de intensificação para cada órgão. Por exemplo, a intensificação com o uso do íntron sintético IAt.GSI102.nno: 1 em folha de fonte V5 foi mais alta do que a intensificação vista com o uso do íntron sintético l~At.GSI17.nno: 1. Na raiz R1, a intensificação com o uso do íntron sintético l-At.GSI17.nno: 1 foi mais alta do que a intensificação conferida pelo íntron sintético IAt.GSI102.nno: 1. Ambos os introns sintéticos forneceram intensificação maior de expressão em folha de fonte R1 do que o íntron endógeno, l-At.Cyco:2.
[00147] A análise dos mRNAs resultantes mostrou processamento apropriado e consistente dos elementos de íntron.
[00148] O promotor ALGSP564 sintético, P~At.GSP564.nno.3 (SEQ ID NO: 13) e líder, L-At.GSP564.nno: 1 (SEQ ID NO: 14) que compreende EXP~At.GSP564 (SEQ ID NO: 12) fornecem expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado em plantas de soja transformadas de modo estável. Os EXPs sintéticos, EXPAt.GSP564.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO: 15), que compreendem o íntron de Arabidopsis l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33), e EXPAt.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO: 16) e EXPAt.GSP564.nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 18), que compreende
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58/85 os introns sintéticos, l-At.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17) e IAt.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), respectivamente, fornece padrões únicos de expressão constitutiva em plantas de soja transformadas de modo estável. Os introns sintéticos, l-At.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17) e l-At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), fornecem expressão de transgene intensificada ou modulada em muitos dos órgãos de planta quando operativamente ligados a EXP-ALGSP564 (SEQ ID NO: 12). Estes padrões de expressão únicos podem ser usados para acionar transgenes específicos nos quais o padrão de expressão específico de um dos quatro ALGS564 EXPs é mais desejável.
EXEMPLO 5
ANÁLISE DO EXP SINTÉTICO, EXPAt.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3, QUE ACIONA EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00149] As plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm um grupo de elemento regulador sintético que aciona a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito do grupo de elemento regulador sintético selecionado em expressão.
[00150] As plantas de soja foram transformadas com um construto de expressão GUS de planta, que compreende o EXP sintético, EXPAt.GSP579.nno-rAt.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22). EXPAt.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 compreende EXP-ALGSP579 (SEQ ID NO: 19) que consiste no promotor At.GSP e líder (SEQ ID NQs:20 e 21, respectivamente), operativamente ligados 5’ ao íntron sintético, IAt.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11). O cassete de transgene GUS também compreende a UTR 3’, T-MLRD22- 1:2: 1 (SEQ ID NO:37) derivada de um gene RD22 de proteína de resposta à desidratação de Medicago truncatula.
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59/85 [00151] A análise de expressão GUS quantitativa e qualitativa foi realizada conforme descrito no Exemplo 2. As amostras de tecido usadas para análise foram as mesmas usadas que as descritas no Exemplo 2. A Tabela 5 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelo EXP sintético, EXPAt.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3, em que ”ND indica que a expressão em um tecido particular não foi determinada.
TABELA 5. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL
ACIONADAS POR EXP-AtGSP579.nno+At.GSI102.nno:3.
Estágio de Desenvolvimento Órgão EXP- At.GSP579.nno+At.G SI102.nno:3 (SEQ ID NO:22)
V5 Raiz 187
Dreno de Folha 311
Fonte de Folha 458
R1 Raiz 148
Pecíolo de Folha 118
Fonte de Folha 425
Flores 130
R3 Semente Imatura ND
Botão ND
R5 Semente Cotiledônea ND
R8 Embrião de Semente 127
Semente Cotiledônea 266
[00152] Conforme pode ser visto na Tabela 5, EXPAt.GSP579.nno-r-At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22) fornece a expressão constitutiva em plantas de soja transformadas de modo estável. O
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60/85 promotor sintético P-At.GSP579.nno:2 (SEQ ID NO:20) e o líder L· At.GSP579.nno: 1 (SEQ ID NO:21) compreendidos em EXP-ALGSP579 (SEQ ID NO: 19) acionam a expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado. Os mesmos podem ser inferidos pelos Exemplos anteriores nos quais o íntron sintético, I- At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 11), foi operativamente ligado a outros promotores sintéticos constitutivos que l-At.GSI102.nno: 1 intensificou ou modulou a expressão constitutiva conferida por EXP-AÍ.GSP579 em pelo menos parte dos órgãos amostrados.
EXEMPLO 6
ANÁLISE DO EXP Sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2, QUE ACIONA A EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00153] As plantas de algodão foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de planta que contém um grupo de elemento regulador sintético que aciona a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito do grupo de elemento regulador sintético em expressão.
[00154] Um vetor binário de planta que compreende o EXP sintético, EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 (SEQ ID NO:7), similar àquele descrito no Exemplo 3, foi usado para transformar de modo estável as plantas de algodão. O cassete de transgene GUS compreendeu EXPAt.GSP571.nno+At.Cyco:2 operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS 1: 1: 1, SEQ ID NO:42) que contém um íntron processável derivado do gene ST-LS 1 específico de tecido induzível leve de batata (Acesso Genbank: X04753), operativamente ligado 5’ a uma UTR 3’ do gene de Gossypium barbadense FbLate-2 (T-Gb.FbL2: I, SEQ ID NO:36). Os eventos de algodão transformado resultantes foram cultivados e as amostras de
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61/85 tecido foram derivadas de Folha de 4 Nós; Pecíolo de 8 Nós, Folha de Dreno, e Folha de Fonte; Brácteas Quadradas Pré-fertilização e Broto Quadrado; Antera de Floração e Ovário de Flor; e Parede de Algodão 8 Dias Após Polinação (DAP) foram amostrados e ensaiados para expressão GUS qualitativa e quantitativa.
[00155] A Tabela 6 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelo EXP sintético, EXPALGSP571 .nno-rAt.Cyco:2.
TABELA 6. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADAS POR EXP-AtGSP571.nno+AtCyco:2.
de Desenvolvimento Órgão Média
4 Nós Folha 1232,57
8 Nós Folha, Pecíolo 223,68
Folha, Dreno 612,14
Folha, Fonte 618,9
Pré-fertilização Brácteas Quadradas 381,69
Broto Quadrado 347,22
Floração Antera 64,66
Flor, Ovário 210,92
8DAP Parede de Algodão 835,94
[00156] Conforme pode ser visto na Tabela 6, EXPAt.GSP571.nno+AtCyco:2 se expressou em todos os tecidos amostrados. A expressão foi mais alta na Folha de 4 Nós e mais baixa na Antera de Floração. A expressão em Dreno de 8 Nós e Folha de Fonte foram relativamente iguais e cerca da metade da Folha de 4 Nós. A expressão também foi alta na Parede de Algodão. A Tabela 6 demonstra que o promotor, P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5), também pode acionar a expressão constitutiva em plantas de algodão transformadas de modo estável. O intron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33),
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62/85 em EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco:2 intensificou a expressão do promotor P-At.GSP571.nno:5 em plantas de soja transformadas de modo estável, conforme mostrado no Exemplo 3.
EXEMPLO 7
ANÁLISE DO PROMOTOR QUIMÉRICO SINTÉTICO P» ALGSP571/442 QUE ACIONA A EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00157] As plantas de soja foram transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene βglucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito dos grupos de elemento regulador sintético selecionados em expressão.
[00158] As plantas de soja foram transformadas com um vetor binário de planta que compreende o EXP sintético, EXPAt.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco: I (SEQ ID NO:23), que é compreendido do promotor quimérico sintético P-ALGSP571/442 (SEQ ID NO:25) que compreende um intensificador sintético EAt.GSP571.nno: 1 (SEQ ID NO:24) derivado do promotor sintético PAt.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) que é operativamente ligado 5’ ao promotor sintético P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) e é operativamente ligado 5’ com o líder sintético, L~At.GSP442.nno: 1 (SEQ ID NO:3), operativamente ligado 5’ ao líder, L-At.Cyco~1:1:2 (SEQ ID NO:40), que é operativamente ligado 5’ ao íntron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). O cassete de transgene GUS compreendeu EXPAt.GSP571 .nno+A.t.GSP442.nno+A.t.Cyco:1 operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS, GOIEc.uidA+St.LS 1: 1: 1, SEQ ID NO:42) que contém um íntron processável derivado do gene ST-LS 1 específico de tecido induzível leve de batata (Acesso Genbank: X04753), operativamente ligado 5’ à
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UTR 3’ sintética, T-Zm.GST59.nno: 1 (SEQ ID NO:29).
[00159] Um vetor binário de planta usada para comparar a atividade do promotor quimérico também foi construído. O vetor compreendeu um EXP, EXP-At.GSP442+L-l-At.Cyco (SEQ ID NO:43), que é compreendido do promotor sintético, P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2), operativamente ligado 5’ ao líder sintético, L-At.GSP442.nno: 1 (SEQ ID NO:3), operativamente ligado 5’ ao líder, L-ALCyco-1:1:2 (SEQ ID NO:40), que é operativamente ligado 5’ ao íntron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). Os vetores binários são similares àqueles descritos nos Exemplos 2 a 6, com a exceção de que cada cassete de transgene GUS tem a UTR 3’ sintética, T-Zm.GST59.nno: 1 (SEQ ID NO:29) operativamente ligada 3’ à sequência de codificação GUS.
[00160] As plantas de soja foram transformadas com os dois vetores binários. As amostras de tecido foram tomadas de órgãos selecionados em estágios de desenvolvimento específicos e ensaiados por expressão GUS qualitativa e quantitativa. A Tabela 7 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelos EXPs sintéticos, EXP-ALGSP571 ,nno+AtGSP442.nno+At.Cyco: 1 e EXP-At.GSP442+L-l-At.Cyco.
TABELA 7. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADA POR EXP-AtGSP571.nno+AtGSP442.nno+At.Cyco:l E EXP-At.GSP4424-L-l-At.Cyco.
EXPAt.GSP442+L-l· ALCyco (SEQ ID NO:43) EXPALGSP571 ,nno4At.GS P442.rmo4-AtCyco:l (SEQ ID NO:23)
de Desenvolvimento Órgão Média Média
V5 Folha, Dreno 69,61 72,12
Folha, Fonte 88,22 96,06
Raiz 74,67 102,9
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R1 Flores 79,16 62,01
Folha, Pecíolo 77,07 87
Folha, Fonte 66,59 114,33
Raiz 76,88 123,12
R3 Botão 93,19 102,54
Semente, Imatura 71,15 61,62
R5 Semente, Cotiledônea 78,72 92,83
R8 Semente, Cotiledônea 65,55 72,15
Semente, Embrião 129,95 107,66
Ό0161] Conforme pode ser visto na Tabela 7, a adição do intensificador sintético E-At.GSP571.nno: 1 intensificou a expressão em muitos dos tecidos amostrados. Ambos os EXPs forneceram expressão constitutiva nas plantas de soja transformadas de modo estável. A UTR 3’ sintética, T-Zm.GST59.nno: 1, funcionou de maneira similar como uma UTR 3’ nativa no fornecimento de terminação apropriada e poliadenilação da transcrição.
EXEMPLO 8
ANÁLISE DO PROMOTOR QUIMÉRICO SINTÉTICO PALGSP571/442 QÜE ACIONA A EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00162] As plantas de algodão foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de planta que contém um grupo de elemento regulador sintético que aciona a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito do grupo de elemento regulador sintético selecionado em expressão.
[00163] As plantas de algodão foram transformadas com um vetor binário de planta que compreende o EXP sintético, EXP
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At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco: I (SEQ ID NO:23), que é compreendido do promotor quimérico sintético P-ALGSP571/442 (SEQ ID NO:25) que compreende um intensificador sintético EAt.GSP571.nno: 1 (SEQ ID NO:24) derivado do promotor sintético PAt.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) que é operativamente ligado 5’ ao promotor sintético P-At.GSP442.nno:2 (SEQ ID NO:2) e é operativamente ligado 5’ ao líder sintético, L-At.GSP442.nno: 1 (SEQ ID N0:3), operativamente ligado 5’ ao líder, L-At.Cyco-1: 1:2 (SEQ ID NO:40), que é operativamente ligado 5’ ao íntron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33). O cassete de transgene GUS compreendeu EXPAt.GSP571.nnOhAt.GSP442.nnOhAt.Cyco:1 operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS, GOIEc.uidA+St.LS 1: 1: 1, SEQ ID NO:42) que contém um íntron processável derivado do gene ST-LS 1 específico de tecido induzível leve de batata (Acesso Genbank: X04753), operativamente ligado 5’ à UTR 3’ sintética, T-Zm.GST59.nno: 1 (SEQ ID NO:29). Os eventos de algodão transformado resultantes foram cultivados e as amostras de tecido derivadas de Folha de 4 Nós; Pecíolo de 8 Nós, Folha de Dreno, e Folha de Fonte; Brácteas Quadradas Pré-fertilização e Broto Quadrado; Antera de Floração e Ovário de Flor; e Parede de Algodão 8 Dias Após Polinação (DAP) foram amostrados e ensaiados para expressão GUS qualitativa e quantitativa.
[00164] A Tabela 8 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelo EXP sintético, EXPAt.GSP571.nno+ALGSP442.nno+At.Cyco: 1 em que bdF significa abaixo do limite de detecção abaixo.
TABELA 8. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADAS POR EXP-AtGSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco:1.
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66/85
de Desenvolvimento Órgão Média
4 Nós Folha 177,74
8 Nós Folha, Pecíolo bdl
Folha, Dreno 108,39
Folha, Fonte 294,99
Pré-fertilização Brácteas Quadradas 78,84
Broto Quadrado 118,21
Floração Antera 69,19
Flor, Ovário 69,78
8DAP Parede de Algodão 159,58
[00165] Conforme pode ser visto na Tabela 8, EXPAt.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco: 1 (SEQ ID NO:23) pôde acionar a expressão GUS constitutiva nos tecidos amostrados. A expressão no Pecíolo foi determinada como abaixo dos limites de detecção. A expressão foi mais alta em Folha de Fonte de 8 Nós. A expressão foi relativamente igual na Antera de Floração e Ovário de Flor. Além disso, a UTR 3’ sintética, T~Zm.GST59.nno: 1 (SEQ ID NO:29), funcionou de maneira similar como uma UTR 3’ nativa no fornecimento de terminação apropriada e poliadenilação da transcrição. EXEMPLO 9
ANÁLISE DO EXP Sintético, EXP-AtGSP576.nno+At.Cyco:l, QUE ACIONA A EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00166] As plantas de soja foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de planta que contém um grupo de elemento regulador sintético que aciona a expressão do transgene
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67/85 β-glucuronidase (GLJS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito do grupo de elemento regulador sintético selecionado em expressão.
[00167] As plantas de soja foram transformadas com a vetor binário de planta que compreende o EXP sintético, EXPAt.GSP576.nno+At.Cyco: 1 (SEQ ID NO:45). O cassete de transgene GUS também compreendeu a UTR 3’ do gene Gossypium barbadense FbLate~2 (T-Gb.FbL2: 1, SEQ ID NO:36), operativamente ligado 3’ à sequência de codificação GUS. Os eventos de soja transformada resultantes foram cultivados e amostras de tecido de órgãos selecionados a partir de diversos estágios de desenvolvimento foram amostrados e ensaiados para expressão GUS qualitativa e quantitativa. A expressão de GUS nas plantas de soja transformadas de modo estável, acionadas por EXP~At.GSP576.nno+At.Cyco: 1, é apresentada na Tabela 9.
TABELA 9. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL
ACIONADAS POR EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco:1.
Estágio de Desenvolvimento Órgão Média
V5 Raiz 60,95
Dreno de Folha 97,43
Fonte de Folha 181,64
R1 Raiz 82,4
Pecíolo de Folha 208,28
Fonte de Folha 214
Flores 123,37
R3 Semente Imatura 95,29
Botão 158,24
R5 Semente Cotiledônea 85,97
R8 Embrião de Semente 67,4
Semente Cotiledônea 52,92
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68/85 [00168] Conforme pode ser visto na Tabela 9, EXPAt.GSP576.nno+At.Cyco: 1 (SEQ ID NO:45) forneceu a expressão constitutiva em plantas de soja transformadas de modo estável. O promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) e líder LAt.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) acionam a expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado. O mesmo pode ser inferido pelos Exemplos anteriores em que o íntron, l-At.Cyco:2 (SEQ ID NO:33), foi operativamente ligado a outros promotores sintéticos constitutivos, que l-At.Cyco:2 intensificou ou modulou a expressão constitutiva conferida por P-At.GSP576.nno:4 em pelo menos alguns dos órgãos amostrados. EXEMPLO 10
ANÁLISE DO EXP SINTÉTICO, EXPAt.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, QUE ACIONA EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00169] As plantas de soja são transformadas com vetores, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene β~ glucuronidase (GUS). As plantas resultantes são analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito dos grupos de elemento regulador selecionados em expressão.
[00170] As plantas de soja são transformadas com vetores binários de planta que compreendem o EXP sintético, EXPAt.GSP576.nno-rAt.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO:26), ou o EXP, EXPAt.Cyco: 1: 1 (SEQ ID NO:38). Os cassetes de transgene GUS também compreendem a UTR 3’ do gene Gossypium barbadense FbLate-2 (TGb.FbL2: 1, SEQ ID NO:36), operativamente ligado 3’ à sequência de codificação GUS. Os eventos de soja transformada resultantes são cultivados e amostras de tecido de órgãos selecionados a partir de diversos estágios de desenvolvimento são amostrados e ensaiados para expressão GUS qualitativa e quantitativa. A expressão de GUS nas
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69/85 plantas de soja transformadas de modo estável, acionadas por EXPAt.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3, é comparada com a expressão acionada por EXP-At.Cyco: 1: 1. A expressão de GUS em plantas de soja transformadas de modo estável acionada por EXPAt.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 é demonstrativa da capacidade do promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) e líder LAt.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) para acionar a expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado.
[00171] Conforme demonstrado nos Exemplos 9 e 11, o promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) e o líder LAt.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) acionaram a expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado. Conforme demonstrado no Exemplo 4, o íntron sintético, l-At.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17), intensificou ou modulou expressão de transgene em muitos dos órgãos de planta quando operativamente ligados a EXP-ALGSP564 (SEQ ID NO: 12). De modo semelhante, pode ser razoavelmente esperado que a expressão do promotor sintético P-At.GSP576.nno:4 e do líder L~ At.GSP576.nno:2 seria intensificada ou modulada de maneira similar. EXEMPLO 11
ANÁLISE DO EXP SINTÉTICO, EXPAt.GSP576.nno*At.GSI17.nno:3, QUE ACIONA EXPRESSÃO GUS EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00172] As plantas de algodão foram transformadas com um vetor, especificamente um vetor de expressão de planta que contém um grupo de elemento regulador sintético que aciona a expressão do transgene β-glucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito do grupo de elemento regulador sintético selecionado em expressão.
[00173] As plantas de algodão foram transformadas com um vetor
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70/85 binário que compreende o EXP sintético, EXPAt.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO:26), conforme anteriormente descrito no Exemplo 10. Os cassetes de transgene GUS também compreenderam a UTR 3’ do gene Gossypium barbadense FbLate-2 (T-Gb.FbL2: 1, SEQ ID NO:36), operativamente ligado 3’ à sequência de codificação GUS. Os eventos de algodão transformado resultantes foram cultivados e as amostras de tecido derivadas de Folha de 4 Nós; Pecíolo de 8 Nós, Folha de Dreno, e Folha de Fonte; Brácteas Quadradas Pré-fertilização e Broto Quadrado; Antera de Floração e Ovário de Flor; e Parede de Algodão 8 Dias Após Polinação (DAP) foram amostrados e ensaiados para expressão GUS qualitativa e quantitativa.
[00174] A Tabela 10 mostra a expressão GUS quantitativa média para cada um dos tecidos amostrados acionados pelo EXPAt.GSP576.nno-rAt.GSI17.nno:3 sintético.
TABELA 10. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE ALGODÃO TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL ACIONADAS POR EXP-AtGSP576.nno+AtGSI17.nno:3.
de Desenvolvimento Órgão Média
4 Nós Folha 579,03
8 Nós Folha, Pecíolo 301,57
Folha, Dreno 159,4
Folha, Fonte 577,11
Pré-fertilização Brácteas Quadradas 262,66
Broto Quadrado 223,59
Floração Antera 171,2
Flor, Ovário 109
8DAP Parede de Algodão 433,64
[00175] Conforme pode ser visto na Tabela 10, EXPAt.GSP576.nno+At.GSI17.nno:3 (SEQ ID NO: 26) acionou a expressão
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71/85 constitutiva do transgene de GUS em plantas de algodão transformadas de modo estável. A expressão foi mais alta em Folha de 4 Nós, Folha de 8 Nós, e Parede de Algodão 8DAP. O promotor sintético PAt.GSP576.nno:4 (SEQ ID NO:27) e líder L-At.GSP576.nno:2 (SEQ ID NO:28) podem acionar expressão constitutiva de um transgene operativamente ligado em plantas de algodão transformadas de modo estável. Conforme demonstrado no Exemplo 4, o íntron sintético, IAt.GSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 17), intensificou ou modulou expressão de transgene em muitos dos órgãos de planta quando operativamente ligados a EXP-ALGSP564 (SEQ ID NO: 12). De modo semelhante, pode ser razoavelmente esperado que a expressão do promotor sintético P~ At.GSP576.nno:4 e do líder L-At.GSP576.nno:2 seria intensificada ou modulada de maneira similar em plantas de algodão transformadas de modo estável.
EXEMPLO 12
ELEMENTOS INTENSIFICADORES DERIVADOS DO ELEMENTO REGULADOR [00176] Os intensificadores são derivados dos elementos promotores apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31, e 39. O elemento intensificador pode ser compreendido de um ou mais elementos reguladores cis do que quando operativamente ligado 5 ou 3’ a um elemento promotor, ou operativamente ligado 5’ ou 3’ a elementos intensificadores adicionais que são operativamente ligados a um promotor, pode intensificar ou modular níveis de expressão de uma molécula de DNA transcrevível, ou fornecer expressão de uma molécula de DNA transcrevível em um tipo de célula específico ou órgão de planta ou em um ponto no tempo particular em desenvolvimento ou ritmo circadiano. Os intensificadores são feitos removendo-se a caixa TATA ou elementos funcionalmente similares e qualquer sequência a jusante dos promotores que permitem que a transcrição seja iniciada dos
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72/85 promotores apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31, e 39 ou fragmentos das mesmas. Por exemplo, o intensificador sintético, E-At.GSP571.nno: 1 (SEQ ID NO:24)foi derivado do promotor sintético, P-At.GSP571.nno:5 (SEQ ID NO:5) e consiste nos nucleotídeos 1 a 422 de P-ALGSP571 .nno:5, que elimina a sequência a jusante 3’ que também contém a caixa TATA do promotor sintético.
[00177] O refinamento adicional do elemento intensificador pode ser necessário e é validado empiricamente. Além disso, a posição do elemento intensificador em relação aos outros elementos em um grupo de elemento regulador quimérico também é empiricamente determinada, visto que a ordem de cada elemento no grupo de elemento regulador quimérico pode conferir efeitos diferentes, dependendo das posições relativas de cada elemento. Alguns elementos promotores terão múltiplas caixas TATA ou elementos tipo caixa TATA e potencialmente múltiplos sítios de início de transcrição. Sob estas circunstâncias, pode ser necessário identificar primeiro onde o primeiro TSS está localizado e, então, começar a projetar os intensificadores com o uso do primeiro TSS para impedir a iniciação potencial de transcrição de ocorrer em um elemento intensificador putativo.
[00178] Os elementos intensificadores, derivados dos elementos promotores sintéticos apresentados como as SEQ ID NOs: 2, 5, 13, 20, 25, 27, 31, e 39 são clonados com o uso de métodos conhecidos na técnica por serem operativamente ligados 5’ ou 3’ a um elemento promotor, ou operativamente ligados 5’ ou 3’ a elementos intensificadores adicionais que são operativamente ligados a um promotor. Alternativamente, os elementos intensificadores podem ser clonados, com o uso de métodos conhecidos na técnica, para fornecer um elemento intensificador maior que é compreendido de duas ou mais cópias do intensificador e clonados com o uso de métodos conhecidos na técnica para ser operativamente ligados 5’ ou 3’ a um elemento
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73/85 promotor, ou operativamente ligados 5’ ou 3’ a elementos intensificadores adicionais que são operativamente ligados a um promotor que produz um elemento regulador de transcrição quimérico. Os elementos intensificadores também podem ser clonados com o uso de métodos conhecidos na técnica para serem operativamente ligados 5’ a um elemento promotor derivado de um organismo de gênero diferente, ou operativamente ligado 5’ ou 3’ a elementos intensificadores adicionais derivados de outros organismos de gênero que são operativamente ligados a um promotor derivado do mesmo ou de organismo de gênero diferente, resultando em um elemento regulador quimérico. Um vetor de transformação de planta de expressão GUS pode ser construído com o uso de métodos conhecidos na técnica similar aos construtos descritos no Exemplo 2 em que os vetores de expressão de planta resultantes contêm uma região de borda direita de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu. borda direita), um primeiro cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de planta transformadas que conferem resistência ao antibiótico, espectinomicina; e um segundo cassete de transgene para testar o elemento intensificador compreendido do elemento intensificador operativamente ligado 5’ ou 3’ a um elemento promotor ou operativamente ligado 5’ ou 3’ a elementos intensificadores adicionais que são, por sua vez, operativamente ligados a um promotor que é operativamente ligado 5’ a um elemento líder, operativamente ligado a uma sequência de codificação para β-glucuronidase (GUS, GOIEc.uidA+St.LS 1: 1: 1, SEQ ID NO:42) que contém um íntron processável derivado do gene ST-LS 1 específico de tecido induzível leve de batata (Acesso Genbank: X04753), operativamente ligado a uma região de terminação 3’, e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens (B-AGRtu.borda esquerda). Os plasmídeos resultantes são usados para transformar plantas de soja ou outras plantas de gênero
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74/85 pelos métodos descritos nos Exemplos. Alternativamente, as células de protoplasto derivadas de soja ou outras plantas de gênero são transformadas com o uso de métodos conhecidos na técnica para realizar ensaios transientes.
[00179] A expressão GUS acionada por um elemento regulador que compreende um ou mais intensificadores é avaliada em ensaios de planta estável ou transiente para determinar os efeitos do elemento intensificador na expressão de uma molécula de DNA transcrevível. As modificações a um ou mais elementos intensificadores ou duplicação de um ou mais elementos intensificadores podem ser realizadas com base no experimento empírico e a regulação de expressão de genes resultantes que é observada com o uso de cada composição de elemento regulador. Alterar as posições relativas de um ou mais intensificadores nos elementos reguladores ou reguladores quiméricos pode afetar a atividade ou especificidade de transcrição do elemento regulador ou regulador qulmérico e é determinado empiricamente por identificar os melhores intensificadores para o perfil de expressão transgene desejável na planta de soja ou outra planta de gênero.
EXEMPLO 13
ANÁLISE DO EFEITO MEDIANTE EXPRESSÃO GUS CONFERIDA PELA UTR 3’ SINTÉTICA, T- Zm.GST7.nno:2, EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL [00180] As plantas de soja foram transformadas com um vetor, especificamente vetores de expressão de planta que contêm grupos de elemento regulador que acionam a expressão do transgene βglucuronidase (GUS). As plantas resultantes foram analisadas por expressão de proteína GUS para avaliar o efeito de elementos reguladores selecionados em expressão.
[00181] As plantas de soja transformadas com dois vetores binários que compreendem EXP-ALGSP571 (SEQ ID NO:4) acionam a
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75/85 expressão GUS. Os cassetes de transgene GUS também compreenderam a UTR 3’ T-Mt.Sali3-2- 1:2: 1 endógena (SEQ ID NO:34) ou a UTR 3’ sintética, T-Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44). A expressão GUS de proteína foi quantitativamente medida nos órgãos de plantas de soja transformadas de modo estável transformadas com os dois construtos. A expressão de GUS foi comparada entre os construtos. A Tabela 11 abaixo mostra a expressão GUS média modulada pela UTR 3’ sintética, T~Zm.GST7.nno:2, em relação à UTR 3’ endógena, T-Mt.Sali3-2-1:2:1, em que nd não significa determinada e bdl significa abaixo do limite de detecção.
TABELA 11. EXPRESSÃO GUS QUANTITATIVA MÉDIA EM PLANTAS DE SOJA TRANSFORMADAS DE MODO ESTÁVEL.
Estágio de Desenvolví mento Órgão T-Mt.Sali3-2- 1:2:1 (SEQ ID NO:34) T- Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44) Atenuação em Vezes
V5 Raiz 40 bdl
Dreno de Folha 650 88 7,4
Fonte de Folha 1379 278 5,0
R1 Raiz 110 72 1,5
Pecíolo de Folha 951 199 4,8
Fonte de Folha 1995 642 3,1
Flores 703 139 5,1
R3 Semente Imatura 75 bdl
Botão 852 386 2,2
R5 Semente Cotiledônea 650 174 3,7
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76/85
R8 Semente Embrião 1153 nd
Semente Cotiledônea 2449 nd
00182] Conforme pode ser visto na Tabela 11, a UTR 3’ sintética, TZm.GST7.nno:2 atenuou a expressão em relação à UTR 3’, T-Mt.Sali32- 1:2: 1 em todos os tecidos ensaiados. O grau de atenuação variou para cada tecido de 1,5 vezes em Raízes R1 a 7,4 vezes em Folha de Dreno V5. O uso de uma UTR 3’ para atenuar a expressão em plantas transformadas de modo estável tem grande utilidade. Por exemplo, uma UTR 3' pode ser usada em combinação com outros elementos reguladores, como promotores, líderes, e introns para regular precisamente a expressão de um transgene, particularmente aqueles em que a alta expressão pode levar aos efeitos fenotípicos que são prejudiciais à planta transformada. A análise da transcrição GUS resultante confirmou a terminação apropriada da transcrição conferida pela UTR 3S sintética, T~Zm.GST7.nno:2. A UTR 3’ sintética, T~ Zm.GST7.nno:2, pode modular a expressão e terminar apropriadamente a transcrição em plantas de soja transformadas de modo estável.
EXEMPLO 14
ANÁLISE DE UTRs 3’ SINTÉTICAS, T-Zm.GST7.nno:2 E TZm.GST59.nno:1, na EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE PROTOPLASTO DE MILHO GUS [00183] Os protoplastos de folha de milho foram transformados com vetores, especificamente vetores de expressão que contêm elementos reguladores de teste que acionam a expressão do transgene de βglucuronidase (GUS). Os protoplastos de folha de milho transformados resultantes foram analisados para expressão GUS de proteína para avaliar o efeito dos elementos reguladores selecionados em expressão. [00184] Os protoplastos de milho, derivados de tecido de folha, foram
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77/85 transformados com vetores de expressão que compreendem elementos de expressão sintéticos e comparados com elementos de expressão conhecidos na técnica. Dois vetores de expressão foram construídos para avaliara atividade das UTRs 3’ sintéticas, T~Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44) e T-Zm.GST59.nno: 1 (SEQ ID NO:29) e dois vetores de expressão de construto também foram construídos. Cada um dos quatro construtos compreenderam um cassete de transgene que compreende o promotor constitutivo e líder, EXP~CaMV.35S (SEQ ID NO:46), operativamente ligado 5’ ao íntron l-Zm.DnaK: 1 (SEQ ID NO:47), operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação GUS, GOIEc.uidA*St.LS 1:1:1 (SEQ ID NO:42). Os vetores de expressão usados para avaliar as UTRs 3’ sintéticas compreenderam T-Zm.GST7.nno:2 ou T-Zm.GST59.nno: 1 operativamente ligado 3’ à sequência de codificação GUS. Um vetor de controle compreendeu a UTR 3’ T~ Os.LTP: I (SEQ ID NO:48) operativamente ligada 3’ à sequência de codificação GUS. O outro vetor de controle não teve uma UTR 3’.
[00185] Um plasmídeo usado em cotransformação dos protoplastos e normalização dos dados também foi construído com o uso de métodos conhecidos na técnica. O mesmo compreendeu um cassete de transgene compreendido de, EXP~CaMV.35S (SEQ ID NO:46) operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação que codifica a proteína fluorescente NanoLuc® luciferase (Promega, Madison, Wl 53711), Nluc (SEQ ID NO:49), que foi operativamente ligada 5’ a uma UTR 3’, T-Os.LTP: 1 (SEQ ID NO:48).
[00186] Os protoplastos de folha de milho foram transformados com o uso de um método de transformação com base em PEG, similar àqueles conhecidos na técnica. As células de protoplasto foram transformadas em um formato de noventa e seis poços. Doze microgramas do DNA de vetor de teste ou DNA de vetor de controle, e seis microgramas do DNA de vetor NanoLuc® foram usados para
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78/85 transformar 3,2 X 105 protoplastos por poço. Após a transformação, os protoplastos foram incubados a 25°C no escuro por dezesseis a vinte horas. Após a incubação, os protoplastos foram lisados e o iisado usado para medir a luciferase e a expressão GUS. Para lisar as células, as células na placa foram peletizadas através da centrifugação, lavadas, ressuspensas em um volume menor, e transferidas para tubos de poços. Os tubos foram centrifugados novamente e o sobrenadante foi aspirado deixando o pélete de célula de protoplasto para trás. O pélete de célula foi ressuspenso em tampão QB (KPO4100 mM, pH 7,8; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; 10% de Glicerol; DTT 1 mM). As células foram lisadas pipetando-se vigorosamente as células por diversas vezes, submetendo-se os tubos a vórtice, e incubando-se os tubos em gelo por cinco minutos. O Iisado foi, então, centrifugado para peletizar os detritos de célula. O Iisado resultante foi, então, transferido para uma placa limpa.
[00187] A atividade de luciferase foi ensaiada com 0 uso do Substrato de Ensaio de Luciferase Nano-Gio® (Promega, Madison, Wl 53711) em tampão QB. Em um volume pequeno curto de Iisado, tampão QB, e 0 Substrato de Ensaio de Luciferase Nano-Glo®/solução QB foram misturados juntos em placas de noventa e seis poços brancas. A fluorescência foi, então, medida com 0 uso de um leitor de placa PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).
[00188] A atividade GUS foi ensaiada com 0 uso do substrato fluorogênico 4-metileumbeliferil-D-glucuronídeo (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitros. O produto de reação, 4metilumbeliferona (4-MU), é fluorescente de modo máximo em alto pH, enquanto 0 grupo hidroxila é ionizado. A adição de uma solução básica de carbonato de sódio interrompe simultaneamente 0 ensaio e ajusta 0 pH para quantificar 0 produto fluorescente. Uma alíquota de Iisado foi misturada com uma alíquota de MUG dissolvida em tampão QB e
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79/85 incubada a 37°C. Uma pequena alíquota da mistura de reação lisado/MUG foi removida e adicionada a um tampão de parada em três pontos no tempo diferentes; (1) imediatamente após misturar a reação lisado/MUG como Tempo de zero minutos; (2) vinte minutos; e (3) sessenta minutos. A fluorescência foi medida com excitação a 355 nm, emissão a 460 nm com o uso de um leitor de placa PHERAstar® (BMG LABTECH Inc., Cary, NC 27513).
[00189] Pelo menos duas placas foram usadas na transformação com quatro a oito transformações por placa para cada vetor de expressão. Para cada placa, cada construto é transformado em quatro a oito poços. Uma alíquota é retirada de cada transformação para o ensaio MUG e nM MUG hidrolisado é derivado da curva padrão em placa. Uma alíquota também é retirada de cada transformação para a leitura NanoLuc® (NanoLuc® RLU). A MUG hidrolisada/ NanoLuc® RLU nM média para cada vetor de expressão é normalizada em relação ao vetor de expressão EXP-CaMV.35SZ l-Zm.DnaK: 1/ T-Os.LTP: 1 que é definido em 100%. A Tabela 12 mostra a média do meio para todas as placas usadas em transformação para cada vetor de expressão que compreende as UTRs 3’ sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 e TZm.GST59.nno: 1, e os controles.
TABELA 12. MÉDIA DO MEIO MUG HIDROLISADO/ NanoLuc RLU nM PARA CADA VETOR DE EXPRESSÃO.
UTR 3’ Média de Meio Stderr
T-Os.LTP: 1 100,00 8,09
Nenhuma UTR 3’ 51,95 4,71
TZm.GST59.nno:1 505,45 37,75
T-Zm.GST7.nno:2 345,31 40,73
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80/85 [00190] Conforme pode ser visto na Tabela 12, o vetor de expressão sem uma UTR 3’ forneceu menos expressão do que o controle de TOs.LTP: 1. A expressão foi intensificada pelas UTRs 3’ sintéticas TZm.GST7.nno:2 e T-Zm.GST59.nno: 1 em comparação com o controle T-Os.LTP: 1. A análise das transcrições demonstraram terminação apropriada conferida pelas UTRs 3’ sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 e TZm.GST59.nno: 1. As UTRs 3’ sintéticas T-Zm.GST7.nno:2 e TZm.GST59.nno: 1 podem modular a expressão e terminar apropriadamente a transcrição em células de protoplasto de folha de milho transformadas.
EXEMPLO 15
ANÁLISE DE ELEMENTOS REGULADORES QUE ACIONAM GUS EM PROTOPLASTOS DE FOLHA DE ALGODÃO [00191] Os protoplastos de folha de algodão foram transformados com vetores, especificamente vetores de expressão que contêm grupos de elementos reguladores que acionam a expressão do transgene de βglucuronidase (GUS). Os protoplastos de folha de algodão transformados resultantes foram analisados para expressão GUS de proteína para avaliar o efeito dos grupos de elementos reguladores selecionados em expressão.
[00192] Os protoplastos de algodão, derivados de tecido de folha, foram transformados com vetores de expressão que compreendem elementos de expressão sintéticos e comparados com elementos de expressão conhecidos na técnica. Experimentos separados foram conduzidos para avaliar a atividade dos EXP’s, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 (SEQ ID NO:8), EXPAt.GSP571.nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 10), EXPAt.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO: 16), e EXPAt.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22). Os elementos de expressão foram clonados em vetores de expressão e operativamente
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81/85 ligados a uma sequência de codificação GUS, GOI-Ec.uidA+St.LS 1:1: 1 (SEQ ID NO:42) que compreendeu um íntron processável. Os vetores de expressão de controle compreenderam configurações diferentes de elementos de expressão conhecidos.
[00193] Dois plasmídeos, para uso em cotransformação e normalização de dados, também foram construídos com o uso de métodos conhecidos na técnica. Cada plasmídeo conteve uma sequência de codificação de luciferase específica que foi acionada por uma sequência EXP constitutiva. O vetor de planta pFLUC compreendeu um cassete de transgene com um promotor constitutivo operativamente ligado 5’ a um íntron, (EXP-CaMV.35S~enh+Zm.DnaK: 1:1, SEQ ID NO: 53), operativamente ligado 5’ a uma sequência de codificação de luciferase de libélula (Photinus pyralis) (LUCIFERASE: 1:3, SEQ ID NO: 54), operativamente ligada 5’ a uma UTR 3' do gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1: 1:13, SEQ ID NO: 55). O vetor de planta pRLUC compreendeu um cassete de transgene com uma sequência de EXP constitutiva (EXP~CaMV.35S~ enh-Lhcbl, SEQ ID NO: 56), operativamente ligada 5’ a uma sequência de codificação de luciferase de rim-do-mar (Renilia reniformis) (CRRen.hRenilla Lucife~0:0: 1, SEQ ID NO: 57), operativamente ligada 5’ a uma UTR 3' do gene nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (TAGRtu.nos-1: 1: 13, SEQ ID NO: 55).
[00194] Os protoplastos de folha de algodão foram transformados com o uso de um método de transformação com base em PEG, conhecido na técnica. As células de protoplasto foram transformadas com os plasmídeos, pFLUC e pRLUC, e uma quantidade equimolar dos vetores de expressão EXP. As medições tanto de GUS quanto de luciferase foram conduzidas colocando-se alíquotas de uma preparação lisada de células transformadas conforme acima em duas bandejas de poços pequenos diferentes. Uma bandeja foi usada para medições de
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GUS, e uma segunda bandeja foi usada para realizar um ensaio de luciferase duplo com o uso do sistema de ensaio repórter de luciferase dupla (Promega Corp., Madison, Wl; consultar por exemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02). As medições de amostra tiveram base em múltiplas transformações similares àquelas apresentadas no Exemplo 14. Os valores de GUS/FLUC médios foram calculados de maneira similar àquela do Exemplo 14, mas nâo foram normalizados em relação aos vetores de EXP de controle.
[00195] Os EXPs, EXP-AtGSP571 (SEQ ID NO:4), EXPAt.GSP571.nno+At.GSI21.nno: 10 (SEQ ID NO:8), e EXPAt. GSP571 .nncw-At.GS1102.nno: 1 (SEQ ID NO: 10) foram clonados em vetores de expressão de planta operativamente ligados 5’ a uma sequência de codificação GUS (SEQ ID NO:42), operativamente ligada 5’ à UTR 3’, T-Mt.Sali3-2- 1:2: 1 (SEQ ID NO:34). Dois vetores de expressão de planta de controle foram construídos com o EXP, EXPAt.Bglu21+At.Cyco:2 (SEQ ID NQ:50), conhecidos por se expressar insatisfatoriamente protoplastos de folha de algodão e o EXP, EXPCaMV.35S-enh+Ph.DnaK: 1:3 (SEQ ID NO:51), conhecido por se expressar de modo satisfatório em protoplastos de folha de algodão. Os EXPs de controle foram operativamente ligados ao mesmo GUS e à sequência de UTR 3’. Além disto, um vetor de expressão de planta que compreende um cassete de transgene GUS que compreende o EXP, EXP-At.GSP571 (SEQ ID NO:4), operativamente ligado a GUS compreendeu a UTR 3’ sintética, T-Zm.GST7.nno:2 (SEQ ID NO:44) para avaliar a atividade da UTR 3’ sintética. Os valores GUS/FLUC médios para múltiplas transformações são apresentados na Tabela 13. TABELA 13. VALORES GUS/FLUC MÉDIOS DE PROTOPLASTOS DE FOLHA DE ALGODÃO TRANSFORMADA
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EXP EXP SEQ ID NO: UTR 3’ UTR 3’ SEQ ID NO: Média GUS/FLUC
EXP-At.Bglu21+At.Cyco:2 50 T-Mt.Sali3-2-1:2:1 34 0,09
EXP-CaMV.35S- enh+Ph.DnaK: 1:3 51 T-Mt.Sali3-2-1:2:1 34 1,70
EXP-AÍ.GSP571 4 T-Mt.Sali3-2-1:2:1 34 0,56
EXP· At.GSP571.nno+At.GSI21 ,nno:10 8 T-Mt.Sali3-2-1:2:1 34 1,02
EXP- At.GSP571.nno+At.GSI10 2.nno:1 10 T-Mt.Sali3-2-1:2:1 34 0,95
EXP-ALGSP571 4 T-Zm.GST7.nno:2 44 0,46
[00196] Conforme pode ser visto na Tabeia 13, os EXPs, EXPALGSP571 (SEQ ID NO:4), EXP-ALGSP571 .nno+At.GSI21 ,nno:2 (SEQ ID NO:8), e EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno: 1 (SEQ ID NO: 10) demonstraram expressão em células de protoplasto de folha de algodão. A UTR 3’ sintética, T-Zm.GST7.nno: 10 (SEQ ID NO:44) funcionou de maneira similar à UTR 3’ endógena, T-Mt.SaH3“2-1:2: 1.
[00197] O EXP, EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno:2 (SEQ ID NO: 16) foi cionado em vetores de expressão de planta operativamente ligados 5’ a uma sequência de codificação GUS (SEQ ID NO:42), operativamente ligada 5’ à UTR 3’ endógena, T-Mt.Oxr- 1:2: 1 (SEQ ID NO:35). Dois vetores de expressão de planta de controle foram construídos com o EXP, EXP-Gm.Sphasl: 1: 1 (SEQ ID NO:52), conhecidos por expressar insatisfatoriamente os protoplastos de folha de algodão e o EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK: 1:3 (SEQ ID NO:51), conhecido por se expressar de modo satisfatório em protoplastos de folha de algodão. Os EXPs de controle foram
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84/85 operativamente ligados ao mesmo GUS e à sequência de UTR 3’. Os valores GUS/FLUC médios para múltiplas transformações são apresentados na Tabela 14.
TABELA 14. VALORES GUS/FLUC MÉDIOS DE PROTOPLASTOS DE FOLHA DE ALGODÃO TRANSFORMADA
EXP EXP SEQ ID NO: UTR 3’ UTR 3’ SEQ ID NO: Média GUS/FLUC
EXP-Gm. Sphas 1:1:1 52 T-Mt.Oxr1:2:1 35 0,01
EXP-CaMV.35Senh+Ph.DnaK: 1:3 51 T-Mt.Oxr1:2:1 35 2,30
EXP· At.GSP564.nno+At.GSI17. nno:2 16 T-Mt.Oxr1:2:1 35 0,34
00198] Conforme pode ser visto na Tabela 14, o EXP sintético, EXPAt.GSP564.nno+AtGSI17.nno: 1 (SEQ ID NO: 16) demonstrou expressão em protoplastos de célula de folha de algodão.
[00199] O EXP, EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22) foi clonado em vetores de expressão de planta operativamente ligados 5’ a uma sequência de codificação GUS (SEQ ID NO:42), operativamente ligada 5’ à UTR 3’ endógena, T-MLRD22 1:2: 1 (SEQ ID NO:37). Dois vetores de expressão de planta de controle foram construídos com o EXP, EXP-Gm.Sphasl: 1: 1 (SEQ ID NO:52), conhecidos por expressar insatisfatoriamente os protoplastos de folha de algodão e o EXP, EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK: 1:3 (SEQ ID NO:51), conhecido por se expressar de modo satisfatório em protoplastos de folha de algodão. Os EXPs de controle foram operativamente ligados ao mesmo GUS e à sequência de UTR 3’. Os valores GUS/FLUC médios para múltiplas transformações são apresentados na Tabela 15.
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TABELA 15. VALORES GUS/FLUC MÉDIOS DE PROTOPLASTOS DE FOLHA DE ALGODÃO TRANSFORMADA
EXP EXP SEQ ID NO: UTR 3’ UTR 3’ SEQ ID NO: Média GUS/FLUC
EXP-Gm. Sphas 1:1:1 52 T-MÍ.RD221:2:1 37 0,01
EXP-CaMV.35S-enh-i-Ph.DnaK: 1:3 51 T-Mt.RD221:2:1 37 2,88
EXP· At.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 22 T-MÍ.RD221:2:1 37 1,19
Ό0200] Conforme pode ser visto na Tabela 15, o EXP sintético, EXPAt.GSP579.nno+At.GSI102.nno:3 (SEQ ID NO:22), demonstrou expressão em protoplastos de célula de folha de algodão.
[00201] Ao ilustrar e descrever os princípios da presente invenção, deve ser evidente para versados na técnica que a invenção pode ser modificada em disposição e detalhes sem se afastar de tais princípios. São reivindicadas todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patente publicados citados no presente documento estão aqui incorporados a título de referência, ao mesmo ponto, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Molécula de DNA recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA selecionada do grupo que consiste em:
    a) uma sequência com pelo menos 85 por cento de identidade de sequência com qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45;
    b) uma sequência que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45; e
    c) um fragmento de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-29 e 43-45, em que o fragmento tem atividade reguladora de gene.
  2. 2. Molécula de DNA recomblnante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA é operativamente ligada a uma molécula de DNAtranscritível heteróloga.
  3. 3. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA tem pelo menos 90 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs:1-29 e 4345.
  4. 4. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA tem pelo menos 95 por cento de identidade de sequência com a sequência de DNA de qualquer uma dentre as SEQ ID NOs:1-29 e 4345.
  5. 5. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA compreende atividade reguladora de gene.
  6. 6. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA transcritível heteróloga compreende um gene de interesse agronômico.
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    2/3
  7. 7. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere tolerância a herbicida em plantas.
  8. 8. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse agronômico confere resistência à praga em plantas.
  9. 9. Célula de planta transgênica caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.
  10. 10. Célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a sequência de DNA é operativamente ligada a uma molécula de DNA transcritível heteróloga.
  11. 11. Célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula de planta transgênica é uma célula de planta monocotiledônea.
  12. 12. Célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula de planta transgênica é uma célula de planta dicotiledônea.
  13. 13. Planta transgênica, ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de DNA recombinantecomo definida na reivindicação 1.
  14. 14. Planta progenitora da planta transgênica, como definida na reivindicação 13, ou uma parte da mesma, caracterizada pelo fato de que a planta progenitora ou parte da mesma compreende a molécula de DNA recombinante.
  15. 15. Semente transgênica caracterizada pelo fato de que a semente compreende a molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 1.
  16. 16. Método de produção de um produto primário caracterizado pelo fato de que compreende obter uma planta
    Petição 870190079852, de 16/08/2019, pág. 91/99
    3/3 transgênica ou parte da mesma, como definida na reivindicação 13, e de produção do produto primário do mesmo.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o produto primário é concentrado de proteína, isolado de proteína, grão, amido, sementes, farelo, farinha, biomassa ou óleo de semente.
  18. 18. Método de expressão de uma molécula de DNA transcritível caracterizado pelo fato de que compreende obter uma planta transgênica, como definida na reivindicação 13, e de cultivo de planta, em que o DNA transcritível é expresso.
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