CN110312802B - 植物调控元件及其用途 - Google Patents
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- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
本发明提供了可用于调节植物中的基因表达的重组DNA分子和构建体，及其核苷酸序列。本发明还提供了包含与异源可转录DNA分子可操作地连接的重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子，及其使用方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求2017年1月19日提交的美国临时申请号62/448,019的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
序列表的并入
在命名为“MONS436WO-sequence_listing.txt”的文件中所含的计算机可读形式的序列表为59,917字节(在Microsoft中测量的)，创建于2018年1月12日，通过电子提交的方式同时随同本申请提交并且通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域。更具体地，本发明涉及可用于调节植物中的基因表达的DNA分子。
背景技术
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。此类元件可包括启动子、前导序列、内含子和3′非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物基因工程领域。
发明内容
本发明提供了用于植物中的新型合成基因调控元件。本发明还提供了包含所述调控元件的重组DNA分子和构建体。本发明还提供了包含所述合成调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，所述合成调控元件与异源可转录DNA分子可操作地连接。本发明还提供了使用所述合成调控元件的方法及制备和使用包含所述合成调控元件的重组DNA分子的方法，以及包含与可转录DNA分子可操作连接的合成调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。
因此，一方面，本发明提供了包含选自下组的DNA序列的重组DNA分子：(a)与SEQID NO：1-29和43-45中的任一个具有至少85％的序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的序列；以及(c)SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列与异源可转录DNA分子可操作地连接。用“异源可转录DNA分子”意指可转录DNA分子相对于与其可操作地连接的多核苷酸序列是异源的。在具体实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的DNA序列具有至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的DNA序列。在特定实施方案中，所述DNA序列包含调控元件。在一些实施方案中，所述调控元件包含启动子。在其它实施方案中，异源可转录DNA分子包含具有农学意义的基因，诸如能够在植物中提供除草剂抗性的基因，或能够在植物中提供植物害虫抗性的基因。在其它实施方案中，本发明提供了包含如本文提供的重组DNA分子的构建体。
另一方面，本文提供了包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自下组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个具有至少约85％的序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的序列；以及(c)SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列与异源可转录DNA分子可操作地连接。在某些实施方案中，所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其它实施方案中，所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
再另一方面，本文还提供了包含重组DNA分子的转基因植物或其部分，所述重组DNA分子包含选自下组的DNA序列：a)与SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个具有至少85％的序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO：1-29和43-45中的任一个的序列；以及c)SEQ IDNO：1-29和43-45中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列与异源可转录DNA分子可操作地连接。在具体实施方案中，转基因植物是包含所述重组DNA分子的任何世代的后代植物。本文还提供了包含重组DNA分子的转基因种子，所述转基因种子在生长时产生此类转基因植物。
另一方面，本发明提供了一种生产商品的方法，其包括获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分，并由所述转基因植物或其部分生产所述商品。在一个实施方案中，所述商品是经过加工的种子、谷物、植物部分、油和粗粉。
另一个方面，本发明提供了一种产生包含本发明的重组DNA分子的转基因植物的方法，其包括用本发明的重组DNA分子转化植物细胞以产生经转化的植物细胞并由经转化的植物细胞再生转基因植物。
序列简述
SEQ ID NO：1是合成调控表达元件组(EXP)即EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP442.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP442.nno：2)，合成前导序列5′与内含子(I-At.Cyco：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：2是合成启动子序列即P-At.GSP442.nno：2。
SEQ ID NO：3是合成前导序列即L-At.GSP442.nno：1。
SEQ ID NO：4是合成EXP即EXP-At.GSP571的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP571.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP571.nno：5)。
SEQ ID NO：5是合成启动子序列即P-At.GSP571.nno：5。
SEQ ID NO：6是合成前导序列即L-At.GSP571.nno：1。
SEQ ID NO：7是合成调控表达元件组(EXP)即EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP571.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP571.nno：5)，合成前导序列5′与内含子(I-At.Cyco：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：8是合成调控表达元件组(EXP)即EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP571.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP571.nno：5)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI21.nno：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：9是合成内含子序列即I-At.GSI21.nno：2。
SEQ ID NO：10是合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP571.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP571.nno：5)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI102.nno：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：11是合成内含子序列即I-At.GSI102.nno：1。
SEQ ID NO：12是合成EXP即EXP-At.GSP564的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP564.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP564.nno：3)。
SEQ ID NO：13是合成启动子序列即P-At.GSP564.nno：3。
SEQ ID NO：14是合成前导序列即L-At.GSP564.nno：1。
SEQ ID NO：15是合成EXP即EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco：2的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP564.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP564.nno：3)，合成前导序列5′与内含子(I-At.Cyco：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：16是合成EXP即EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP564.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP564.nno：3)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI17.nno：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：17是合成内含子序列即I-At.GSI17.nno：1。
SEQ ID NO：18是合成EXP即EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno：1的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP564.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP564.nno：3)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI102.nno：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：19是合成EXP即EXP-At.GSP579的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP579.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP579.nno：2)。
SEQ ID NO：20是合成启动子序列即P-At.GSP579.nno：2。
SEQ ID NO：21是合成前导序列即L-At.GSP579.nno：1。
SEQ ID NO：22是合成EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP579.nno：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP579.nno：2)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI102.nno：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：23是合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP442.nno：1)可操作地连接的合成嵌合启动子(P-At.GSP571/442，由5′与合成启动子(P-At.GSP442.nno：2)可操作地连接的合成增强子(E-At.GSP571.nno：1)组成)，合成前导序列(L-At.GSP442.nno：1)的5′与前导序列(L-At.Cyco-1：1：2)可操作地连接，前导序列(L-At.Cyco-1：1：2)的5′与内含子(I-At.Cyco：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：24是合成增强子序列即E-At.GSP571.nno：1。
SEQ ID NO：25是合成嵌合启动子即P-At.GSP571/442的DNA序列，其由5′与合成启动子(P-At.GSP442.nno：2)可操作地连接的合成增强子(E-At.GSP571.nno：1)组成。
SEQ ID NO：26是合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP576.nno：2)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP576.nno：4)，合成前导序列5′与合成内含子(I-At.GSI17.nno：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：27是合成启动子序列即P-At.GSP576.nno：4。
SEQ ID NO：28是合成前导序列即L-At.GSP576.nno：2。
SEQ ID NO：29是合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1。
SEQ ID NO：30是合成EXP即EXP-At.GSP221+At.Cyco：3的DNA序列，其包含5′与合成前导序列(L-At.GSP221：1)可操作地连接的合成启动子(P-At.GSP221：3)，合成前导序列5′与内含子(I-At.Cyco：2)可操作地连接。
SEQ ID NO：31是合成启动子序列即P-At.GSP221：3。
SEQ ID NO：32是合成前导序列即L-At.GSP221：1。
SEQ ID NO：33是源自来自于拟南芥属(Arabidopsis)的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因的内含子序列即I-At.Cyco：2。
SEQ ID NO：34是源自蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的Sali3基因的3′UTR序列即T-Mt.Sali3-2-1：2：1。
SEQ ID NO：35是源自来自于蒺藜苜蓿的假定氧化还原酶(OXR)蛋白基因的3′UTR序列即T-Mt.Oxr-1：2：1。
SEQ ID NO：36是源自海岛棉(Gossypium barbadense)FbLate-2基因的3′UTR序列即T-Gb.FbL2：1。
SEQ ID NO：37是源自来自于蒺藜苜蓿的脱水反应蛋白RD22基因的3′UTR序列即T-Mt.RD22-1：2：1。
SEQ ID NO：38是源自来自于拟南芥属的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因的EXP即EXP-At.Cyco：1：1的DNA序列，其包含5′与前导序列(L-At.Cyco-1：1：2)可操作地连接的启动子(P-At.Cyco-1：1：2)，所述前导序列5′与内含子(I-At.Cyco-1：1：1)可操作地连接。
SEQ ID NO：39是源自来自于拟南芥属的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因的启动子序列即P-At.Cyco-1：1：2。
SEQ ID NO：40是源自来自于拟南芥属的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因的前导序列即L-At.Cyco-1：1：2。
SEQ ID NO：41是源自来自于拟南芥属的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因的前导序列即I-At.Cyco-1：1：1。
SEQ ID NO：42是具有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的编码序列。
SEQ ID NO：43是EXP即EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco的DNA序列，其包含5′与合成前导序列L-At.GSP442.nno：1可操作地连接的合成启动子P-At.GSP442.nno：2，合成前导序列L-At.GSP442.nno：1的5′与前导序列L-At.Cyco-1：1：2可操作地连接，前导序列L-At.Cyco-1：1：2的5′与内含子I-At.Cyco：2可操作地连接。
SEQ ID NO：44是合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2的DNA序列。
SEQ ID NO：45是EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1的DNA序列，其包含5′与合成前导序列L-At.GSP564.nno：1可操作地连接的合成启动子P-At.GSP564.nno：3，所述合成前导序列5′与内含子I-At.Cyco：2可操作地连接。
SEQ ID NO：46是EXP即EXP-CaMV.35S的DNA序列，其包含源自花椰菜花叶病毒的35S启动子和前导序列。
SEQ ID NO：47是源自来自于玉蜀黍(Zea mays)的热休克蛋白70(Hsp70)基因(DnaK)的内含子I-Zm.DnaK：1的DNA序列。
SEQ ID NO：48是源自来自于水稻(Oryza sativa)的脂质转移蛋白样基因(LTP)的3′UTR即T-Os.LTP：1的DNA序列。
SEQ ID NO：49是通过由深海虾(细角刺虾(Oplophorus gacilirostris))荧光素酶定向进化而工程改造的荧光素酶荧光蛋白(Promega，Madison，WI 53711)即Nluc的编码序列。
SEQ ID NO：50是EXP即EXP-At.Bglu21+At.Cyco：2的DNA序列，其包含5′与内含子I-At.Cyco-1：1：1可操作地连接的来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的β-葡萄糖醛酸酶21基因的启动子和前导序列。
SEQ ID NO：51是EXP即EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3的DNA序列，其包含5′与来自于矮牵牛(Petunia x hybrid)的热休克蛋白70(HSP70)基因的前导序列可操作地连接的增强型花椰菜花叶病毒35S启动子。
SEQ ID NO：52是EXP即EXP-Gm.Sphas1：1：1的DNA序列，其包含大豆的7Sαprime基因的启动子和前导序列。
SEQ ID NO：53是EXP即EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1的DNA序列，其包含5′与内含子I-Zm.DnaK：1可操作地连接的增强型花椰菜花叶病毒35S启动子。
SEQ ID NO：54是编码源自萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶蛋白(LUCIFERASE：1：3)的DNA序列。
SEQ ID NO：55是源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶基因的3′UTR即T-AGRtu.nos-1：1：13的DNA序列。
SEQ ID NO：56是EXP即EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1的DNA序列，其包含5′与小麦(Triticum aestivum)的捕光复合物的叶绿素a/b结合基因的前导序列可操作地连接的增强型花椰菜花叶病毒35S启动子。
SEQ ID NO：57是编码源自海肾(Renilla ren和rmis)的荧光素酶蛋白(CR-Ren.hRenilla Lucife-0：0：1)的DNA序列。
具体实施方式
本发明提供了在植物中具有基因调控活性的合成调控元件。这些合成调控元件的核苷酸序列作为SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45提供。这些合成调控元件能够影响可操作地连接的可转录DNA分子在植物组织中的表达，因此能够调节可操作连接的转基因在转基因植物中的基因表达。本发明还提供了修饰、产生和使用含有所提供的合成调控元件的重组DNA分子的方法。本发明还提供了包含含有本发明的重组DNA分子的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物，以及制备和使用所述组合物的方法。
提供以下定义和方法以更好地限定本发明并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外指出，否则术语应按照相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
DNA分子
如本文所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组来源或合成来源的双链DNA分子，即从5′(上游)末端向3′(下游)末端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或DNA分子的聚合物。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文所用的命名法对应于美国联邦法规(United States Code of Federal Regulations)§1.822的第37条的，并且在WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1和表3中阐述的命名法。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然存在的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是由至少两个彼此异源的DNA分子组成的DNA分子，包含与自然界中存在的DNA序列不同的DNA序列的DNA分子，包含合成DNA序列的DNA分子或已经通过遗传转化或基因编辑而整合到宿主细胞DNA中的DNA分子。
如本文所用，“合成核苷酸序列”或“人工核苷酸序列”是已知不会存在于自然界中，不是天然存在的，或在没有人为干预的情况下不存在的核苷酸序列。本发明的基因调控元件包含合成核苷酸序列。优选地，合成核苷酸序列与天然序列几乎没有延伸同源性。在该上下文中，延伸同源性通常是指延伸超过连续序列的约25个核苷酸的100％序列同一性。
本申请中对“分离的DNA分子”或等同术语或短语的提及旨在意指DNA分子是单独存在的或与其它组成组合存在的，但不存在于其天然环境中的DNA分子。例如，天然见于生物基因组的DNA内的核酸元件诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要所述元件在生物基因组内并且在基因组内的它所天然见于其中的位置处，则不被视为是“分离的”。然而，这些元件中的每一个，以及这些元件的子部分，在本公开的范围内将是“分离的”，只要该元件不在生物的基因组内并且不在基因组内的它所天然见于其中的位置处。在一个实施方案中，术语“分离的”是指与在其天然或自然状态下通常位于DNA分子侧翼的一些核酸至少部分分开的DNA分子。因此，由于例如重组技术而与通常不与其缔合的调控或编码序列融合的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子在被整合到宿主细胞的染色体中或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时，也被认为是分离的，因为它们不呈其天然状态。为了本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌细胞的基因组中，或存在于染色体外载体中的DNA核苷酸序列，都将被认为是分离的核苷酸序列，无论该序列是存在于用于转化细胞的质粒或类似结构内，植物或细菌的基因组内，还是以可检测的量存在于源自该植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品中。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过人工比对两个序列(例如，参考序列和另一序列)，以通过适当的内部核苷酸插入、缺失或空位来最大化序列比对中的核苷酸匹配数而创建最佳序列比对。如本文所用，术语“参考序列”是指作为SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45提供的DNA序列。
如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“同一性％”是同一性分数乘以100。与参考序列进行最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配数除以参考序列中的核苷酸总数，例如整个参考序列全长的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供了包含下述序列的DNA分子，所述序列在与本文中作为SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45中的任一个提供的参考序列进行最佳比对时，与参考序列具有至少约85％的同一性，至少约86％的同一性，至少约87％的同一性，至少约88％的同一性，至少约89％的同一性，至少约90％的同一性，至少约91％的同一性，至少约92％的同一性，至少约93％的同一性，至少约94％的同一性，至少约95％的同一性，至少约96％的同一性，至少约97％的同一性，至少约98％的同一性，至少约99％的同一性，或至少约100％的同一性。在其它具体实施方案中，与SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45中的任一个具有一定百分比同一性的序列可以定义为表现出它所来源的起始序列所具有的启动子活性。与SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45中的任一个具有一定百分比同一性的序列还可包含“最小启动子”，该“最小启动子”提供基础转录水平并且由TATA盒或用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以启动转录的等效序列组成。
调控元件
调控元件诸如启动子、前导序列(也称为5′UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3′UTR)在活细胞中的基因的总体表达方面起到不可或缺的作用。如本文所用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文所用，术语“基因调控活性”是指例如通过影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译而影响可操作地连接的可转录DNA分子的表达的能力。在植物中起作用的调控元件，诸如启动子、前导序列、增强子、内含子和3′UTR可用于通过基因工程改造而改变植物表型。
如本文所用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可以指一组可操作地连接的调控元件，诸如增强子、启动子、前导序列和内含子。例如，调控表达元件组可以由例如5′与前导序列可操作地连接的启动子组成。可用于实施本发明的EXP包括SEQ ID NO：1、4、7、8、10、12、15、16、18、19、22、23、26、30、43和45。
调控元件可以通过其基因表达模式来表征，例如正面和/或负面效应，诸如组成型表达或时序性、空间性、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学反应性表达，及其任何组合，以及可通过定量或定性指征来表征。如本文所用，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可以翻译以产生蛋白分子或者可以提供反义或其它调控RNA分子，诸如双链RNA(dsRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)等。
如本文所用，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可以通过其时序性、空间性、发育或形态学特征以及通过定量或定性指征来表征。
启动子可用作调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文所用，术语“启动子”通常是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其它蛋白质(诸如反式作用转录因子)以启动转录的DNA分子。启动子可以是最初从基因的基因组拷贝的5′非翻译区(5′UTR)分离的。可替代地，启动子可以是合成产生的或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的。嵌合启动子是通过两个或多个异源DNA分子的融合产生的。可用于实施本发明的启动子包括SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39中的任一个或其片段或变体内所包含的启动子元件。在本发明的具体实施方案中，如本文所述的要求保护的DNA分子及其任何变体或衍生物进一步定义为包含启动子活性，即能够在宿主细胞中，诸如在转基因植物中充当启动子。在其它具体实施方案中，片段可以定义为表现出该片段所来源的起始启动子分子所具有的启动子活性，或者片段可以包含“最小启动子”，该“最小启动子”提供基础转录水平并且由TATA盒或用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以启动转录的等效DNA序列组成。
在一个实施方案中，提供了本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可以包含如上所述的启动子活性，并且可以单独使用或与其它启动子和启动子片段组合使用(诸如在构建嵌合启动子时)，或与其它表达元件和表达元件片段组合。在具体实施方案中，提供了启动子的片段，所述片段包含具有如本文所公开的启动子活性的DNA分子的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个或至少约1000个连续核苷酸或更长的连续核苷酸。在某些实施方案中，本发明提供了本文提供的启动子片段，所述片段具有全长序列的活性。由起始启动子分子产生此类片段的方法在本领域是众所周知的。
源自SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39中的任一个内所包含的任何启动子(诸如内部或5′缺失)的组合物，可以使用本领域已知的改善或改变表达的方法产生，包括去除对表达有正面或负面效应的元件；复制对表达有正面或负面效应的元件；和/或复制或去除对表达具有组织或细胞特异性效应的元件。源自SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39中的任一个内所包含的，包含其中TATA盒元件或其等效序列和下游序列被去除的3′缺失的任何启动子元件的组合物，可以用于例如制备增强子元件。可以产生进一步的缺失以去除对表达具有正面或负面效应；组织特异性效应；细胞特异性效应；或时间特定性(诸如但不限于昼夜节律)效应的任何元件。SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39中的任一个内所包含的任何启动子元件和源自启动子元件的片段或增强子可用于制备嵌合转录调控元件组合物。
根据本发明，可以分析启动子或启动子片段中是否存在已知的启动子元件，即DNA序列特征，诸如TATA盒和其它已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可以使用对此类已知启动子元件的鉴定来设计具有与原始启动子相似的表达模式的启动子变体。
如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的非翻译5′区域(5′UTR)分离的DNA分子，并且通常定义为转录起始位点(TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。可替代地，前导序列可以是合成产生的或操纵的DNA元件。前导序列可用作调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的5′调控元件。前导序列分子可以与异源启动子或其天然启动子一起使用。可用于实施本发明的前导序列包括SEQ ID NO：3、6、14、21、28、32和40；或SEQ IDNO：1、4、7、8、10、12、15、16、18、19、22、23、26、30、43和45中的任一个或其片段或变体内所包含的任何前导元件。在具体实施方案中，此类DNA序列可以定义为能够在宿主细胞(包括，例如转基因植物细胞)中充当前导序列。在一个实施方案中，此类序列被解码为包含前导序列活性。
如SEQ ID NO：3、6、14、21、28、32和40所示的前导序列(也称为5′UTR)或SEQ IDNO：1、4、7、8、10、12、15、16、18、19、22、23、26、30和43中的任一个内所包含的任何前导元件均可由调控元件组成，或者可以采用可以对可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译具有影响的二级结构。如SEQ ID NO：3、6、14、21、28、32和40所述的前导序列或SEQ ID NO：1、4、7、8、10、12、15、16、18、19、22、23、26、30、43和45中的任一个内所包含的任何前导元件均可根据本发明用于制备影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译的嵌合调控元件。
如本文所用，术语“内含子”是指可以从基因中分离或鉴定的DNA分子并且通常可以定义为在翻译之前在信使RNA(mRNA)加工期间被剪接掉的区域。可替代地，内含子可以是合成产生的或操纵的DNA元件。内含子可含有影响可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可以包含内含子，并且内含子相对于可转录DNA分子可以是或可以不是异源的。本领域已知的内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。
在植物中，相对于缺乏内含子的构建体，在基因构建体中包含一些内含子引起mRNA和蛋白质积聚增加。这种效应被称为基因表达的“内含子增强效应”(IME)。已经在玉蜀黍基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)中，在水稻基因(例如，tpi)中和在双子叶植物基因(如矮牵牛基因(例如，rbcS)、马铃薯基因(例如，st-1s1)和拟南芥基因(例如，ubq3和pat1))中鉴定出已知会刺激在植物中的表达的内含子。已经证实，内含子的剪接位点内的缺失或突变使基因表达减少，表明IME可能需要剪接。然而，双子叶植物中的IME已经通过来自拟南芥的pat1基因的剪接位点内的点突变得以证实。已经证实在一种植物中多次使用相同内含子会表现出缺点。在那些情况下，必须具有许多用于构建适当的重组DNA元件的基本控制元件。可用于实施本发明的示例性内含子如SEQ ID NO：9、11、17、33和41所示。
如本文所用，术语“3′转录终止分子”、“3′非翻译区”或“3′UTR”是指在转录为mRNA分子的3′部分的非翻译区的过程中使用的DNA分子。mRNA分子的3′非翻译区可以通过特异性切割和3′多聚腺苷酸化产生，也称为polyA尾。3′UTR可以与可转录DNA分子可操作地连接并位于其下游，并且可以包括多聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其它调控信号。polyA尾被认为在mRNA稳定性和翻译起始方面起作用。本领域中的3′转录终止分子的实例是胭脂碱合酶3′区；小麦hsp17 3′区、豌豆rubisco小亚基3′区、棉花E63′区和coixin 3′UTR。
3′UTR通常对特定DNA分子的重组表达具有有益用途。弱3′UTR具有产生通读的可能性，通读可影响位于相邻表达盒中的DNA分子的表达。适当控制转录终止可以防止通读进入位于下游的DNA序列(例如，其它表达盒)，并且还可以允许RNA聚合酶的有效再循环以改善基因表达。转录的有效终止(RNA聚合酶II从DNA上释放)是重新启动转录的先决条件，从而直接影响总体转录物水平。转录终止后，成熟的mRNA从合成位点释放，并将模板转运至细胞质。真核mRNA以poly(A)形式积聚在体内，使得难以通过常规方法来检测转录终止位点。然而，通过生物信息学方法预测功能性和有效3′UTR很困难，因为没有允许容易地预测有效3′UTR的保守性DNA序列。
从实际观点来看，表达盒中使用的3′UTR具有以下特征通常是有益的。首先，3′UTR应该能够高效且有效地终止转基因的转录并防止转录物通读进入可以由另一个表达盒组成的任何相邻DNA序列(如同多个表达盒留在一个转运DNA(T-DNA)中的情况一样)，或其中已经插入了T-DNA的相邻染色体DNA。其次，3′UTR不应导致用于驱动DNA分子表达的启动子、前导序列、增强子和内含子所赋予的转录活性的降低。最后，在植物生物技术中，3′UTR常用于引发从经转化的植物中提取的逆转录RNA的扩增反应，并且用于：(1)一旦整合到植物染色体中，就评估表达盒的转录活性或表达；(2)评估植物DNA中插入的拷贝数；以及(3)评估育种后所得种子的接合性。3′UTR还用于从经转化的植物中提取的DNA的扩增反应，以表征插入的盒的完整性。可用于实施本发明的3′UTR如SEQ ID NO：29、34、35、36、37和44所示。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，又称为顺式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动可操作地连接的可转录DNA分子的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件也可以与启动子融合以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的整体调节的一个方面。源自合成启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQ ID NO：5)的增强子元件的实例作为SEQ ID NO：24(E-At.GSP571.nno：1)提供。
据信许多启动子增强子元件会结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑结构，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或促进转录起始位点的双螺旋选择性打开的局部构象。增强子元件可以起到结合调控转录的转录因子的作用。一些增强子元件结合一种以上的转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与一个以上的增强子结构域相互作用。增强子元件可以通过多种技术鉴定，包括缺失分析，即，使启动子的5′末端或内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法的DNA结合蛋白分析；甲基化干扰；电泳迁移率变换测定；通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)进行的体内基因组足迹分析；和其它常规测定或通过用常规的DNA序列比较方法诸如BLAST，使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序而进行的DNA序列相似性分析。可以通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过本领域已知的其它常规方法进一步研究增强子结构域的精细结构。增强子元件可以通过化学合成或通过从包含此类元件的调控元件中分离而获得，并且它们可以用含有可用的限制性酶位点的附加侧翼核苷酸合成以促进后续操纵。因此，根据本文公开的方法设计、构建和使用用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的增强子元件涵盖在本发明范围内。可用于实施本发明的示例性增强子如SEQ ID NO：24所示。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单一DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子通常都不会以这种构型(即与另一DNA分子融合)存在。因此，嵌合DNA分子是另外通常不存在于自然界中的新DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过对DNA分子的此类操纵而产生的启动子。嵌合启动子可以组合两个或更多个DNA片段，例如，启动子与增强子元件融合。因此，根据本文公开的方法设计、构建和使用用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的嵌合启动子涵盖在本发明范围内。示例性嵌合启动子在本文中如SEQ ID NO：25(P-At.GSP571/442)所示。
嵌合调控元件可以设计成包含各种组成元件，所述组成元件可以通过本领域已知的各种方法可操作地连接，诸如限制酶消化和连接、非连接依赖性的克隆、扩增期间PCR产物的模块化组装，或调控元件的直接化学合成，以及本领域中已知的其它方法。所得的各种嵌合调控元件可以由相同组成元件或相同组成元件的变体组成，但在包含允许组成部分操作性连接的一个或多个连接性DNA序列的一个或多个DNA序列上不同。在本发明中，作为SEQID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45提供的DNA序列可以提供调控元件参考序列，其中包含参考序列的组成元件可以通过本领域已知的方法连接并且可包含一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或插入或在细菌和植物细胞转化中天然存在的突变。
如本文所用，术语″变体″是指与第一DNA分子组成相似但不相同的第二DNA分子(诸如调控元件)，并且其中第二DNA分子例如通过或多或少的等效转录活性仍然保持第一DNA分子的总体功能性，即相同或相似的表达模式。变体可以是第一DNA分子的较短或截短形式或第一DNA分子序列的改变形式，诸如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代或插入的变体。“变体”还可以涵盖具有下述核苷酸序列的调控元件，所述核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，其中衍生调控元件具有与相应的母体调控分子相比更高或更低或等效的转录或翻译活性。在本发明中，作为SEQ ID NO：1-32和SEQID NO：43-45提供的多核苷酸序列可用于产生与原始调控元件的DNA序列组成相似但不相同，而仍然保持原始调控元件的总体功能性(即相同或相似的表达模式)的变体。根据本公开内容，本发明的此类变体的产生完全在本领域的普通技术范围内，并且涵盖在本发明的范围内。
本文描述的修饰、重复或缺失对特定转基因的所需表达方面的功效可以根据经验在稳定和瞬时植物测定(诸如本文工作实施例中所述的测定)中进行测试，以验证可以根据在起始DNA分子中所做的改变和改变的目标而变化的结果。
构建体
如本文所用，术语″构建体″意指源自任何来源的能够基因组整合或自主复制的任何重组DNA分子诸如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者线性或环状DNA或RNA分子，其包含DNA分子，其中至少一个DNA分子以功能操作性方式与另一DNA分子连接(即可操作地连接)。如本文所用，术语“载体”意指可用于转化目的，即向宿主细胞内引入异源DNA或RNA的任何构建体。构建体通常包括一个或多个表达盒。如本文所用，“表达盒”是指DNA分子，其至少包含与一个或多个调控元件(通常至少是启动子和3′UTR)可操作地连接的可转录DNA分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子与第二DNA分子连接，其中第一和第二DNA分子如此排列，使得第一DNA分子影响第二个DNA分子的功能。所述两个DNA分子可以是或可以不是单个连续DNA分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中的目标可转录DNA分子的转录，则该启动子是与可转录DNA分子可操作地连接的。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，它与该DNA序列是可操作地连接的。
在一个实施方案中，本发明的构建体可以作为双肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体提供，其具有包含T-DNA的从根癌农杆菌中分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区域，所述构建体连同根癌农杆菌细胞所提供的转运分子一起，容许T-DNA整合到植物细胞的基因组中(参见，例如美国专利6,603,061)。构建体还可以含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点如ori322、广谱宿主范围复制起点如oriV或oriRi和选择标记的编码区如Spec/Strp(其编码赋予对壮观霉素或链霉素的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰基转移酶(aadA))或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404；但是，植物转化领域的技术人员已知的其它菌株也可以在本发明中起作用。
本领域已知用于将构建体以使得可转录DNA分子转录成功能性mRNA分子的方式组装和引入细胞的方法，功能性mRNA分子被翻译并表达成蛋白质。对于本发明的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员熟知的。可用于在高等植物中进行核酸表达的典型载体是本领域熟知的，包括源自根癌农杆菌Ti质粒的载体和pCaMVCN转运控制载体。
各种调控元件都可以包括在构建体中，包括本文提供的任何调控元件。任何此类调控元件都可与其它调控元件组合提供。可以设计或修改此类组合以产生期望的调控特征。在一个实施方案中，本发明的构建体包含至少一个与可转录DNA分子可操作地连接的调控元件，该可转录DNA分子与3′UTR可操作地连接。
本发明的构建体可包括本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以与异源非翻译5′前导序列，诸如源自热休克蛋白基因的前导序列可操作地连接。可替代地，本发明的前导序列可以与异源启动子，诸如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子可操作地连接。
表达盒还可以包括转运肽编码序列，其编码可用于使可操作地连接的蛋白质亚细胞靶向于尤其是叶绿体、白色体或其它质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置的肽。许多叶绿体定位蛋白作为前体由核基因表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向至叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相关的那些叶绿体蛋白。叶绿体转运肽例如在美国专利号7,193,133中有描述。已经证明，可以通过表达与编码非叶绿体蛋白的转基因可操作地连接的异源CTP而使非叶绿体蛋白靶向至叶绿体。
可转录DNA分子
如本文所用，术语“可转录DNA分子”是指能够转录成RNA分子的任何DNA分子，包括但不限于具有蛋白编码序列的那些和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子的那些。DNA分子的类型可包括但不限于来自相同植物的DNA分子，来自另一植物的DNA分子，来自不同生物的DNA分子，或合成DNA分子，诸如含有基因的反义信息的DNA分子，或编码人工、合成或其它修饰形式的转基因的DNA分子。用于并入本发明构建体中的示例性可转录DNA分子包括，例如来自于除向其中并入DNA分子的物种以外的物种的DNA分子或基因，或源于或存在于相同物种中但是通过基因工程方法而不是经典育种技术并入受体细胞中的基因。
“转基因”至少就其在宿主细胞基因组中的位置而言与宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或人工并入当前或任何前代细胞中的宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。
调控元件，诸如本发明的合成启动子，可以与异源可转录DNA分子可操作地连接。如本文所用，术语“异源的”是指当两个或更多个DNA分子的组合通常不存在于自然界中时的这种组合。例如，两个DNA分子可源自不同物种和/或两个DNA分子可源自不同基因，例如来自相同物种的不同基因，或来自不同物种的相同基因，或其中一个DNA分子可能是合成的并且不存在于自然界中。如果此类组合通常不存在于自然界中，则调控元件相对于可操作地连接的可转录DNA分子是异源的，即可转录DNA分子不是与该调控元件可操作地连接而天然存在的。
该可转录DNA分子通常可以是需要其转录物表达的任何DNA分子。转录物的此类表达可引起所得mRNA分子的翻译，因此引起蛋白质表达。可替代地，例如，可设计可转录DNA分子以最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。在一个实施方案中，这可以通过使用以反义方向定向的可转录DNA分子来实现。本领域的普通技术人员熟悉使用此类反义技术。可以以这种方式对任何基因进行负调控，并且在一个实施方案中，可以设计可转录DNA分子，用于通过dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。
因此，本发明的一个实施方案是包含本发明的调控元件(诸如作为SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45提供的那些)的重组DNA分子，所述调控元件与异源可转录DNA分子可操作地连接以便在构建体整合到转基因植物细胞的基因组中时，以所需水平或以所需模式调节可转录DNA分子的转录。在一个实施例中，可转录DNA分子包含基因的蛋白编码区并且在另一个实施方案中，可转录DNA分子包含基因的反义区域。
具有农学意义的基因
可转录DNA分子可以是具有农学意义的基因。如本文所用，术语“具有农学意义的基因”是指在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时，赋予所需特征的可转录DNA分子。具有农学意义的基因的产物可以在植物内起作用以便对植物形态、生理、生长、发育、产量、谷粒组成、营养特征、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性产生影响或者可以在以植物为食的害虫的饮食中充当杀虫剂。在本发明的一个实施方案中，将本发明的调控元件并入构建体中，使得调控元件与作为具有农学意义的基因的可转录DNA分子可操作地连接。在含有此类构建体的转基因植物中，具有农学意义的基因的表达可以赋予有益的农学性状。有益的农学性状可包括，例如但不限于除草剂耐受性、昆虫防治、改良的产量、抗病性、病原体抗性、改良的植物生长和发育、改良的淀粉含量、改良的含油量、改良的脂肪酸含量、改良的蛋白质含量、改良的果实成熟、增强的动物和人类营养、生物聚合物产生、环境胁迫抗性、药物肽、改善的加工品质、改善的风味、杂交种子生产效用、改善的纤维生产和期望的生物燃料生产。
本领域已知的具有农学意义的基因包括但不限于针对以下的那些基因：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)、增加产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)、昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658；5,880,275；5,763,245；和5,763,241)、真菌性疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)；病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)、线虫抗性(美国专利号6,228,992)、细菌性疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉生产(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改良的油生产(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)、高产油量(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)、高蛋白生产(美国专利号6,380,466)、果实成熟(美国专利号5,512,466)、增强的动物和人类营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623；及5,958,745和6,946,588)、环境胁迫抗性(美国专利号6,072,103)、药物肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)、改善的加工性状(美国专利号6,476,295)、改善的消化性(美国专利号6,531,648)、低棉子糖(美国专利号6,166,292)、工业酶生产(美国专利号5,543,576)、改进的风味(美国专利号6,011,199)、固氮(美国专利号5,229,114)、杂交种子生产(美国专利号5,689,041)、纤维生产(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料生产(美国专利号5,998,700)。
可替代地，具有农学意义的基因可通过编码引起对内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上面提到的植物特征或表型，例如通过反义物(参见，例如美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA、siRNA、反式作用siRNA和定相sRNA介导的机制进行的基因表达调节，例如，如公开的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206以及美国专利申请11/974,469中所述)；或共同抑制介导的机制。RNA也可以是催化性RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见，例如U.S.2006/0200878)，其经工程改造以切割所需的内源mRNA产物。本领域已知用于构建构建体并以使得可转录DNA分子转录成能够引起基因抑制的分子的方式将构建体引入细胞内的方法。
选择标记
选择标记转基因也可以与本发明的调控元件一起使用。如本文所用，术语“选择标记转基因”是指可以以某种方式对其在转基因植物、组织或细胞中的表达或其缺乏进行筛选或评分的任何可转录DNA分子。用于实施本发明的选择标记基因及其相关的选择和筛选技术是本领域已知的，包括但不限于编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白，以及赋予除草剂耐受性的蛋白的可转录DNA分子。选择标记转基因的实例作为SEQ ID NO：42提供。
细胞转化
本发明还涉及产生经转化的细胞和植物的方法，所述经转化的细胞和植物包含与可转录DNA分子可操作地连接的一个或多个调控元件。
术语“转化”是指将DNA分子引入受体宿主中。如本文所用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括所述细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。特别感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚和花粉。
如本文所用，术语“经转化的”是指已向其中引入了外源DNA分子(诸如构建体)的细胞、组织、器官或生物。引入的DNA分子可以整合到受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA中，使得引入的DNA分子被后续后代遗传。″转基因的″或″经转化的″细胞或生物也包括细胞或生物的后代，以及由在杂交中采用此类转基因生物作为母本的育种程序产生的并且显示出因外源DNA分子的存在而产生的改变表型的后代。引入的DNA分子也可以瞬时引入受体细胞，使得引入的DNA分子不被后续后代遗传。术语“转基因”是指含有一种或多种异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
本领域技术人员熟知许多用于将DNA分子引入植物细胞的方法。该过程通常包括选择合适的宿主细胞，用载体转化宿主细胞和获得经转化的宿主细胞的步骤。在本发明的实践中通过将植物构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括公知的和得到证明的任何方法。合适的方法包括但不限于细菌感染(例如，农杆菌)、二元BAC载体、DNA的直接递送(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌，以及DNA包被颗粒的加速)和基因编辑(例如，CRISPR-Cas系统)等。
本公开还考虑到可以通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物原位工程改造合成表达元件。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可以用于将植物细胞内的表达元件序列改变为不同的序列。
宿主细胞可以是任何细胞或生物，诸如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体实施方案中，宿主细胞和经转化的细胞可包括来自作物植物的细胞。
随后可以从本发明的转基因植物细胞再生出转基因植物。使用常规育种技术或自花授粉，可以由该转基因植物产生种子。此类种子和由此类种子长出的所得后代植物将含有本发明的重组DNA分子，因此将是转基因的。
本发明的转基因植物可以自花授粉以提供本发明的纯合转基因植物的种子(对于重组DNA分子而言是纯合的)或与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以提供本发明的杂合转基因植物的种子(对于重组DNA分子而言是杂合的)。此类纯合和杂合转基因植物在本文中均称为“后代植物”。后代植物是起源于原始转基因植物并含有本发明的重组DNA分子的转基因植物。可以收获使用本发明的转基因植物产生的种子并用于培育多代转基因植物，即包含本发明的构建体并表达具有农学意义的基因的本发明后代植物。常用于不同作物的育种方法的描述可以在几本参考书中的一本中找到，参见，例如，Allard，Principlesof Plant Breeding，John Wiley&Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98(1960)；Simmonds，Principles of Crop Improvement，Longman，Inc.，NY，369-399(1979)；Sneep和Hendriksen，Plant breeding Perspectives，Wageningen(编辑)，Center forAgricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr，Soybeans：Improvement，Production and Uses，第2版，Monograph，16：249(1987)；Fehr，Principles of VarietyDevelopment，Theory and Technique，(第1卷)and Crop Species Soybean(第2卷)，IowaState Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376(1987)。
可以分析经转化的植物中所述一个或多个目标基因的存在以及本发明的调控元件所赋予的表达水平和/或表达谱。本领域的技术人员知道许多可用于分析经转化的植物的方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹法或northern印迹法、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价和免疫诊断测定。可转录DNA分子的表达可以使用(Applied Biosystems，FosterCity，CA)试剂和如制造商描述的方法测量，并使用测试矩阵测定PCR循环次数。可替代地，(Third WaveTechnologies，Madison，WI)试剂和如制造商描述的方法可用于评价转基因表达。
本发明还提供了本发明植物的部分。植物部分包括但不限于，叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可以是有活力的、无活力的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并提供了包含本发明的DNA分子的经转化的植物细胞。本发明的经转化的或转基因植物细胞包括可再生和不可再生的植物细胞。
本发明还提供了由含有本发明的重组DNA分子的转基因植物或其部分产生的商品。本发明的商品含有可检测量的DNA，其包含选自SEQ ID NO：1-32和SEQ ID NO：43-45的DNA序列。如本文所用，“商品”是指由源自含有本发明的重组DNA分子的转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商品包括但不限于经过加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。本发明的商品将含有可检测量的与本发明的重组DNA分子相对应的DNA。对样品中一个或多个这种DNA的检测可以用于测定商品的含量或来源。可以使用检测DNA分子的任何标准方法，包括本文公开的检测方法。
通过参考以下实施例可以更容易地理解本发明，除非另有说明，否则这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。本领域的技术人员应当了解在以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实践中起很好作用的技术。然而，鉴于本公开，本领域技术人员了解到在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以在公开的具体实施方案中进行许多变化并且仍然获得同样或类似的结果，因此附图中阐述或示出的所有内容都应解释为例示性的，而不应以限制性意义进行解释。
实施例
实施例1
合成调控元件的设计、合成和克隆
表1中提供的调控元件是通过计算方法设计的新型合成表达元件。这些计算设计的合成调控元件经化学合成并克隆以制备合成调控表达元件组(EXP)。设计超过1,000种合成调控元件并在大豆原生质体和经稳定转化的大豆植物中进行测定，以鉴定提供所需特征(诸如蛋白质表达水平和表达模式)的那些合成调控元件。表1中描述的合成调控元件提供了各种可用于驱动许多不同编码序列和具有农学意义的干扰RNA的表达的表达模式。
计算设计的合成调控元件与自然界中存在的任何已知核酸序列都没有延伸同源性。合成EXP和相应的启动子、前导序列、内含子和3′UTR如表1所示。使用本领域已知的方法将合成EXP克隆到二元植物转化载体中，使其与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)编码序列可操作地连接，并将载体用于评价经稳定转化的大豆、棉花和玉米植物中由合成EXP提供的表达水平和模式。
可以使用经转化的植物组织进行合成调控元件转录起始位点(TSS)和内含子/外显子剪接点的分析。简言之，用包含与异源可转录DNA分子可操作地连接的克隆DNA片段的植物表达载体转化植物。接下来，使用用于快速扩增cDNA末端的5′RACE系统2.0版(Invitrogen，Carlsbad，California 92008)，通过分析产生的mRNA转录物的DNA序列来确认合成调控元件TSS和内含子/外显子剪接点。
实施例2
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3和EXP-At.GSP221+At.Cyco：3的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件组对表达的影响。
用包含内源EXP即EXP-At.Cyco：1：1(SEQ ID NO：38)和两个合成EXP即EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3(SEQ ID NO：1)和EXP-At.GSP221+At.Cyco：3(SEQ ID NO：30)的植物GUS表达构建体转化大豆植物。EXP-At.Cyco：1：1(SEQ ID NO：38)源自来自于拟南芥属的细胞色素c氧化酶亚基VIa基因并且由5′与前导序列L-At.Cyco-1：1：2(SEQ ID NO：40)可操作地连接的启动子P-At.Cyco-1：1：2(SEQ ID NO：39)组成，所述前导序列5′与内含子I-At.Cyco-1：1：1(SEQ ID NO：41)可操作地连接。EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3(SEQ IDNO：1)和EXP-At.GSP221+At.Cyco：3(SEQ ID NO：30)各自均包含合成启动子和5′与内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)可操作地连接的前导序列。I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)的序列与I-At.Cyco-1：1：1(SEQ ID NO：41)的序列相同，除了在I-At.Cyco-1：1：1的序列中包括在内含子剪接位点之后的两个核苷酸外。两个I-At.Cyco内含子剪接相同。
使用本领域已知的标准方法将调控元件克隆到基础植物表达载体中。所得植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区(B-AGRtu.右边界)，用于选择赋予抗生素即壮观霉素抗性的经转化的植物细胞的第一转基因选择盒；用于评估调控元件活性的第二转基因盒，所述调控元件包含5′与β-葡萄糖醛酸酶的编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1，SEQ ID NO：42)可操作地连接的EXP序列，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，该内含子5′与来自海岛棉FbLate-2基因(T-Gb.FbL2：1，SEQ ID NO：36)的3′UTR可操作地连接；和来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。
如本领域所熟知的，通过农杆菌介导的转化，使用这些二元转化载体构建体来转化大豆植物细胞。诱导所得经转化的植物细胞形成完整的大豆植物。
使用组织化学GUS分析进行经转化的植物的定性和定量表达分析。将整个组织切片与GUS染色溶液X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)一起孵育适当的时间长度，漂洗并目视检查其蓝色着色情况。使用选定的植物器官和组织，通过直接目视检查或在显微镜下检查来定性地测定GUS活性。
为了定量分析GUS表达，从经转化的大豆植物的选定组织中提取总蛋白。将一微克总蛋白用于50微升总反应体积中的荧光底物4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下最大程度地发荧光，其中羟基被离子化。添加碳酸钠碱性溶液同时终止了测定并且调节pH以量化荧光产物。使用具有Micromax读数器的Fluoromax-3，以365nm激发波长，445nm发射波长测量荧光，狭缝宽度设定为激发波长2nm和发射波长3nm。值以nmol GUS/小时/mg总蛋白为单位提供。
对以下组织进行取样用于在R0代中进行GUS表达；V5期的根、库叶和源叶；R1期的根、叶柄、源叶和花；R3期未成熟的种子和荚；R5期的种子子叶；和R8期的种胚和种子子叶。表2示出了对于每个取样组织而言由测试的EXP调控元件组驱动的平均定量GUS表达，其中“ND”表示未测定在特定组织中的表达。
表2.经稳定转化的大豆植物中由合成调控元件组和内源EXP即EXP-At.Cyco：1：1驱动的平均定量GUS表达。
如表2中可以看出，与内源性EXP相比，每个合成调控元件组在取样的组织中具有独特的表达模式。例如，EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3(SEQ ID NO：1)的合成At.GSP442启动子P-At.GSP442.nno：2(SEQ ID NO：2)和前导序列L-At.GSP442.nno：1(SEQ ID NO：3)，在所有测定的器官中相对于包含相同内含子序列的内源EXP-At.Cyco：1：1(SEQ ID NO：38)，提供更高水平的GUS表达。对TSS的分析展示出一致的TSS。正如所预期的，在所得mRNA中适当地切除内含子。此外，EXP-At.GSP221+At.Cyco：3(SEQ ID NO：30)的合成At.GSP221启动子P-AT.GSP221：3(SEQ ID NO：31)和前导序列L-At.GSP221：1(SEQ ID NO：32)，在测定的大多数器官中也相对于内源EXP-At.Cyco：1：1提供更高水平的组成型表达，并且展示出一致的TSS。然而，EXP-At.GSP221+At.Cyco：3的TSS不位于预测位置-存在多个潜在的TATA元件。这引起了对可以产生多个编码序列的多种转录物的潜在关注。因而，不认为EXP-At.GSP221+At.Cyco：3可接受用于在经稳定转化的双子叶植物中驱动转基因表达。这证明了设计合成表达元件的复杂性之一。在合成表达元件的开发和鉴定中测定了许多合成元件，但只有一小部分提供了所需的特征和调控活性，说明了设计有效的合成转录调控元件的复杂性。
正如表2中可以看出，EXP-At.GSP442.nno+At.Cyco：3(SEQ ID NO：1)内所包含的合成启动子P-At.GSP442.nno：2(SEQ ID NO：2)和L-At.GSP442.nno：1(SEQ ID NO：3)能够在经稳定转化的大豆植物中驱动可操作地连接的转基因的组成型转基因表达。
实施例3
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成At.GSP571启动子和前导序列以及合成At.GSI21和At.GSI102内含子的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)、EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2(SEQ ID NO：7)、EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10(SEQ ID NO：8)和EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：10)的植物GUS表达构建体转化大豆植物。每个合成EXP均包含合成At.GSP571启动子(SEQ ID NO：5)和前导序列(SEQ ID NO：6)。EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2包含内源性拟南芥内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)。EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10和EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1分别包含合成内含子I-At.GSI21.nno：2(SEQ ID NO：9)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)。二元植物转化载体与实施例2中描述的那些相似，除了每个At.GSP571 EXP载体包含源自蒺藜苜蓿的Sali3基因的3′UTR即T-Mt.Sali3-2-1：2：1(SEQ ID NO：34)外。
如实施例2中所述进行定量和定性GUS表达分析。用于分析的组织样品与实施例2中描述的相同。表3示出了对于每个取样组织而言由测试的合成EXP调控元件驱动的平均定量GUS表达，其中“ND”表示未测定在特定组织中的表达。
正如表3中可以看出，合成At.GSP571启动子和前导序列在测定的所有器官中都提供组成型表达。叶和种子中的表达最高。对TSS的分析展示出一致的TSS。可操作地连接内含子序列改变了许多器官中的表达，从而提供了“微调”组成型表达的手段。当可操作地连接合成内含子I-At.GSI21.nno：2(SEQ ID NO：9)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)时，观察到表达差异。合成内含子增强了一些组织中的表达，但每种器官的增强水平不同。例如，R3荚中使用合成内含子I-At.GSI21.nno：2引起的增强作用高于使用合成内含子I-At.GSI102.nno：1和内源性内含子I-At.Cyco：2相对于EXP-At.GSP571所见到的增强作用。在R1叶柄中三个可操作地连接的内含子仅使表达略微增强。在R1花中，I-At.GSI21.nno：2和I-At.Cyco：2增强表达，I-At.GSI21.nno：2提供高水平的表达增强作用而I-At.Cyco：2提供中等水平的增强作用。有趣的是，I-At.GSI102.nno：1降低了R1花中的表达。
对所得mRNA的分析显示了对内含子元件正确一致的加工。
EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)内所包含的合成启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQID NO：5)和前导序列L-At.GSP571.nno：1(SEQ ID NO：6)在经稳定转化的大豆植物中提供可操作地连接的转基因的组成型表达。合成EXP，包含拟南芥内含子I-At.Cyco：2(SEQ IDNO：33)的EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2(SEQ ID NO：7)和分别包含合成内含子I-At.GSI21.nno：2(SEQ ID NO：9)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)的EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10(SEQ ID NO：8)和EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：10)，在经稳定转化的大豆植物中提供了独特的组成型表达模式。合成内含子I-At.GSI21.nno：2(SEQ ID NO：9)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)当与EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)可操作地连接时，在许多植物器官中提供受增强或调节的表达。这些独特的表达模式可用于驱动其中最需要四种At.GSP571 EXP之一的特定表达模式的特定转基因。
实施例4
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成At.GSP564启动子和前导序列以及合成At.GSI17和At.GSI102内含子的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP564(SEQ ID NO：12)、EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco：2(SEQ ID NO：15)、EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2(SEQ ID NO：16)和EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：18)的植物GUS表达构建体转化大豆植物。每个合成EXP均包含合成P-At.GSP564.nno：3启动子(SEQ ID NO：13)和合成L-At.GSP564.nno.1前导序列(SEQ ID NO：14)。EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco：2包含拟南芥内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)。EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2和EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno：1分别包含合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)。二元植物转化载体与实施例2中描述的那些相似，除了每个At.GSP564EXP载体包含源自来自于蒺藜苜蓿的假定氧化还原酶(OXR)蛋白基因的3′UTR即T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：35)外。
如实施例2中所述进行定量和定性GUS表达分析。用于分析的组织样品与实施例2中描述的相同。表4示出了对于每个取样组织而言由测试的合成EXP调控元件驱动的平均定量GUS表达，其中“ND”表示未测定在特定组织中的表达。
正如表4中可以看出，合成At.GSP564启动子和前导序列在测定的所有器官中都提供组成型表达。叶和种子中的表达最高。对TSS的分析展示出一致的TSS。可操作地连接内含子序列改变了许多器官中的表达，从而提供了“微调”组成型表达的手段。当可操作地连接合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)时，观察到表达差异。相对于EXP-At.GSP564，合成内含子增强了一些组织中的表达，但每种器官的增强水平不同。例如，在V5源叶中使用合成内含子I-At.GSI102.nno：1引起的增强作用高于使用合成内含子I-At.GSI17.nno：1所见的增强作用。在R1根中，使用合成内含子I-At.GSI17.nno：1引起的增强作用高于合成内含子I-At.GSI102.nno：1所赋予的增强作用。两种合成内含子在R1源叶中提供的表达增强作用比内源内含子I-At.Cyco：2更强。
对所得mRNA的分析显示了对内含子元件正确一致的加工。
EXP-At.GSP564(SEQ ID NO：12)内所包含的合成At.GSP564启动子P-At.GSP564.nno.3(SEQ ID NO：13)和前导序列L-At.GSP564.nno：1(SEQ ID NO：14)在经稳定转化的大豆植物中提供可操作地连接的转基因的组成型表达。合成EXP，包含拟南芥内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)的EXP-At.GSP564.nno+At.Cyco：2(SEQ ID NO：15)和分别包含合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)的EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2(SEQ ID NO：16)和EXP-At.GSP564.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：18)，在经稳定转化的大豆植物中提供了独特的组成型表达模式。合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)和I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)当与EXP-At.GSP564(SEQ ID NO：12)可操作地连接时，在许多植物器官中提供受增强或调节的表达。这些独特的表达模式可用于驱动其中最需要四种At.GS564EXP之一的特定表达模式的特定转基因。
实施例5
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的合成调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选合成调节元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3(SEQ ID NO：22)的植物GUS表达构建体转化大豆植物。EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3包含由At.GSP启动子和前导序列(分别为SEQ ID NO：20和21)组成的EXP-At.GSP579(SEQ ID NO：19)，所述前导序列5′与合成内含子I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)可操作地连接。GUS转基因盒还包含源自来自于蒺藜苜蓿的脱水反应蛋白RD22基因的3′UTR即T-Mt.RD22-1：2：1(SEQ ID NO：37)。
如实施例2中所述进行定量和定性GUS表达分析。用于分析的组织样品与实施例2中描述的相同。表5示出了对于每个取样组织而言由合成EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3驱动的平均定量GUS表达，其中“ND”表示未测定在特定组织中的表达。
表5.经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3驱动的平均定量GUS表达。
正如表5中可以看出，EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3(SEQ ID NO：22)在经稳定转化的大豆植物中提供组成型表达。EXP-At.GSP579(SEQ ID NO：19)内所包含的合成启动子P-At.GSP579.nno：2(SEQ ID NO：20)和前导序列L-At.GSP579.nno：1(SEQ ID NO：21)驱动可操作地连接的转基因的组成型表达。可以通过其中合成内含子I-At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：11)与其它组成型合成启动子可操作地连接的前述实施例推断，I-At.GSI102.nno：1增强或调节至少一些取样器官中由EXP-At.GSP579所赋予的组成型表达。
实施例6
在经稳定转化的棉花植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的合成调控元件组的植物表达载体转化棉花植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估合成调控元件组对表达的影响。
使用包含合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2(SEQ ID NO：7)，与实施例3中所述的植物二元载体相似的植物二元载体稳定转化棉花植物。GUS转基因盒包含5′与β-葡糖醛酸酶的编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1，SEQ ID NO：42)可操作地连接的EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，该内含子5′与来自海岛棉FbLate-2基因(T-Gb.FbL2：1，SEQ ID NO：36)的3′UTR可操作地连接。使所得经转化的棉花事件生长并从以下得到组织样品：4节叶片；8节叶柄、库叶和源叶；受精前方形苞片和方形芽；开花花粉囊和花子房；并且在授粉后8天(DAP)对棉铃壁进行取样并测定其定性和定量GUS表达。
表6示出了对于每个取样组织而言由合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2驱动的平均定量GUS表达。
表6.经稳定转化的棉花植物中由EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2驱动的平均定量GUS表达。
正如表6中可以看出，EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2在所有取样组织中表达。表达在4节叶片中最高而在开花花粉囊中最低。8节库叶和源叶中的表达相对相同，约为4节叶片的一半。在棉铃壁的表达也很高。表6证明启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQ ID NO：5)能够在经稳定转化的棉花植物中驱动组成型表达。EXP-At.GSP571.nno+At.Cyco：2内的内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)增强P-At.GSP571.nno：5在经稳定转化的大豆植物中的表达，如实施例3所示。
实施例7
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成嵌合启动子P-At.GSP571/442的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选合成调节元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1(SEQ ID NO：23)的植物二元载体转化大豆植物，所述合成EXP由包含源自合成启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQ ID NO：5)的合成增强子E-At.GSP571.nno：1(SEQ ID NO：24)的合成嵌合启动子P-At.GSP571/442(SEQ ID NO：25)组成，所述合成增强子5′与合成启动子P-At.GSP442.nno：2(SEQ ID NO：2)可操作地连接并且5′与合成前导序列L-At.GSP442.nno：1(SEQ ID NO：3)可操作地连接，所述合成前导序列5′与前导序列L-At.Cyco-1：1：2(SEQ ID NO：40)可操作地连接，后者的5′与内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)可操作地连接。GUS转基因盒包含5′与β-葡糖醛酸酶的编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1，SEQ ID NO：42)可操作地连接的EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，该内含子5′与合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1(SEQ ID NO：29)可操作地连接。
还构建了用于比较嵌合启动子活性的植物二元载体。所述载体包含EXP即EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco(SEQ ID NO：43)，其由5′与合成前导序列L-At.GSP442.nno：1(SEQID NO：3)可操作地连接的合成启动子P-At.GSP442.nno：2(SEQ ID NO：2)组成，所述合成前导序列的5′与前导序列L-At.Cyco-1：1：2(SEQ ID NO：40)可操作地连接，后者的5′与内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)可操作地连接。所述二元载体与实施例2-6中描述的那些相似，除了每个GUS转基因盒具有3′与GUS编码序列可操作地连接的合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1(SEQ ID NO：29)外。
用两种二元载体转化大豆植物。在特定发育期从所选器官中取出组织样品，并测定其定性和定量GUS表达。表7示出了对于每个取样组织而言由合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1和EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco驱动的平均定量GUS表达。
表7.经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1和EXP-At.GSP442+L-I-At.Cyco驱动的平均定量GUS表达。
正如表7中可以看出，合成增强子E-At.GSP571.nno：1的添加增强了许多取样组织中的表达。两种EXP均在经稳定转化的大豆植物中提供组成型表达。合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1，以与天然3′UTR相似的方式，在提供转录物的正确终止和多聚腺苷酸化方面起作用。
实施例8
在经稳定转化的棉花植物中驱动GUS表达的合成嵌合启动子P-At.GSP571/442的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的合成调控元件组的植物表达载体转化棉花植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选合成调节元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1(SEQ ID NO：23)的植物二元载体转化棉花植物，所述合成EXP由包含源自合成启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQ ID NO：5)的合成增强子E-At.GSP571.nno：1(SEQ ID NO：24)的合成嵌合启动子P-At.GSP571/442(SEQ ID NO：25)组成，所述合成启动子5′与合成启动子P-At.GSP442.nno：2(SEQ ID NO：2)可操作地连接并且5′与合成前导序列L-At.GSP442.nno：1(SEQ ID NO：3)可操作地连接，所述合成前导序列5′与前导序列L-At.Cyco-1：1：2(SEQ ID NO：40)可操作地连接，后者的5′与内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)可操作地连接。GUS转基因盒包含5′与β-葡糖醛酸酶的编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1，SEQ ID NO：42)可操作地连接的EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，该内含子5′与合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1(SEQ ID NO：29)可操作地连接。使所得经转化的棉花事件生长并从以下得到组织样品：4节叶片；8节叶柄、库叶和源叶；受精前方形苞片和方形芽；开花花粉囊和花子房；并且在授粉后8天(DAP)对棉铃壁进行取样并测定其定性和定量GUS表达。
表8示出了对于每个取样组织而言由合成EXP即EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1驱动的平均定量GUS表达，其中“bdl”意指低于检测限值。
表8.经稳定转化的棉花植物中由EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1驱动的平均定量GUS表达。
正如表8中可以看出，EXP-At.GSP571.nno+At.GSP442.nno+At.Cyco：1(SEQ IDNO：23)能够在取样组织中驱动组成型GUS表达。经测定叶柄中的表达低于检测限值。在8节源叶中表达最高。在开花花粉囊和花子房中表达相对相等。另外，合成3′UTR即T-Zm.GST59.nno：1(SEQ ID NO：29)，以与天然3′UTR相似的方式，在提供转录物的正确终止和多聚腺苷酸化方面起作用。
实施例9
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的合成调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选合成调节元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1(SEQ ID NO：45)的植物二元载体转化大豆植物。GUS转基因盒还包含来自海岛棉FbLate-2基因(T-Gb.FbL2：1，SEQ ID NO：36)的，3′与GUS编码序列可操作地连接的3′UTR。使所得经转化的大豆事件生长并对来自几个发育期的所选器官的组织样品取样，并测定其定性和定量GUS表达。经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1驱动的GUS表达如表9所示。
表9.经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1驱动的平均定量GUS表达。
正如表9中可以看出，EXP-At.GSP576.nno+At.Cyco：1(SEQ ID NO：45)在经稳定转化的大豆植物中提供组成型表达。合成启动子P-At.GSP576.nno：4(SEQ ID NO：27)和前导序列L-At.GSP576.nno：2(SEQ ID NO：28)驱动可操作地连接的转基因的组成型表达。可以通过其中内含子I-At.Cyco：2(SEQ ID NO：33)与其它组成型合成启动子可操作地连接的前述实施例推断，I-At.Cyco：2增强或调节至少一些取样器官中由P-At.GSP576.nno：4所赋予的组成型表达。
实施例10
在经稳定转化的大豆植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件组对表达的影响。
用包含合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3(SEQ ID NO：26)或EXP即EXP-At.Cyco：1：1(SEQ ID NO：38)的植物二元载体转化大豆植物。GUS转基因盒还包含来自海岛棉FbLate-2基因(T-Gb.FbL2：1，SEQ ID NO：36)的，3′与GUS编码序列可操作地连接的3′UTR。使所得经转化的大豆事件生长并对来自几个发育期的所选器官的组织样品取样，并测定其定性和定量GUS表达。经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3驱动的GUS表达与由EXP-At.Cyco：1：1驱动的表达进行比较。经稳定转化的大豆植物中由EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3驱动的GUS表达证明了合成启动子P-At.GSP576.nno：4(SEQ ID NO：27)和前导序列L-At.GSP576.nno：2(SEQ ID NO：28)驱动可操作地连接的转基因的组成型表达的能力。
如实施例9和11中所证明的，合成启动子P-At.GSP576.nno：4(SEQ ID NO：27)和前导序列L-At.GSP576.nno：2(SEQ ID NO：28)驱动可操作地连接的转基因的组成型表达。如实施例4中所证明的，合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)当与EXP-At.GSP564(SEQID NO：12)可操作地连接时，在许多植物器官中提供受增强或调节的表达。同样地，可以合理地预计合成启动子P-At.GSP576.nno：4和前导序列L-At.GSP576.nno：2的表达将以相似的方式受到增强或调节。
实施例11
在经稳定转化的棉花植物中驱动GUS表达的合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的合成调控元件组的植物表达载体转化棉花植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选合成调节元件组对表达的影响。
如先前在实施例10中所述，用包含合成EXP即EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3(SEQ ID NO：26)的二元载体转化棉花植物。GUS转基因盒还包含来自海岛棉FbLate-2基因(T-Gb.FbL2：1，SEQ ID NO：36)的，3′与GUS编码序列可操作地连接的3′UTR。使所得经转化的棉花事件生长并从以下得到组织样品：4节叶片；8节叶柄、库叶和源叶；受精前方形苞片和方形芽；开花花粉囊和花子房；并且在授粉后8天(DAP)对棉铃壁进行取样并测定其定性和定量GUS表达。
表10示出了对于每个取样组织而言由合成EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3驱动的平均定量GUS表达。
表10.经稳定转化的棉花植物中由EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3驱动的平均定量GUS表达。
正如表10中可以看出，EXP-At.GSP576.nno+At.GSI17.nno：3(SEQ ID NO：26)在经稳定转化的棉花植物中驱动GUS转基因的组成型表达。在4节叶片、8节源叶和8DAP棉铃壁中表达最高。合成启动子P-At.GSP576.nno：4(SEQ ID NO：27)和前导序列L-At.GSP576.nno：2(SEQ ID NO：28)能够在经稳定转化的棉花植物中驱动可操作地连接的转基因的组成型表达。如实施例4中所证明的，合成内含子I-At.GSI17.nno：1(SEQ ID NO：17)当与EXP-At.GSP564(SEQ ID NO：12)可操作地连接时，在许多植物器官中提供受增强或调节的表达。同样地，可以合理地预计在经稳定转化的棉花植物中，合成启动子P-At.GSP576.nno：4和前导序列L-At.GSP576.nno：2的表达将以相似的方式受到增强或调节。
实施例12
源自调控元件的增强子元件
增强子源自如SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39所示的启动子元件。增强子元件可由一个或多个顺式调控元件组成，所述顺式调控元件当5′或3′与启动子元件可操作地连接，或5′或3′与和启动子可操作地连接的附加增强子元件可操作地连接时，可以增强或调节可转录DNA分子的表达水平，或在特定细胞类型或植物器官中或在发育或昼夜节律的特定时间点提供可转录DNA分子的表达。增强子是通过从启动子上去除TATA盒或功能上相似的元件和允许从SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39所示的启动子或其片段启动转录的任何下游序列而制备的。例如，合成增强子E-At.GSP571.nno：1(SEQ ID NO：24)源自合成启动子P-At.GSP571.nno：5(SEQ ID NO：5)并且由P-At.GSP571.nno：5的核苷酸1至422组成，消除了也含有合成启动子的TATA盒的3′下游序列。
可能需要进一步细化增强子元件并且凭经验进行验证。另外，增强子元件相对于嵌合调控元件组内的其它元件的位置也是凭经验确定的，因为嵌合调控元件组内每个元件的顺序可以根据每个元件的相对位置赋予不同的效应。一些启动子元件将具有多个TATA盒或TATA盒样元件并且可能具有多个转录起始位点。在那些情况下，可能有必要首先鉴定第一个TSS所在的位置，然后开始使用第一个TSS设计增强子，以防止在推定的增强子元件内发生转录的潜在性启动。
使用本领域已知的方法克隆源自SEQ ID NO：2、5、13、20、25、27、31和39所示的合成启动子元件的增强子元件使其5′或3′与启动子元件可操作地连接，或5′或3′与和启动子可操作地连接的附加增强子元件可操作地连接。可替代地，可以使用本领域已知的方法克隆增强子元件，以提供由两个或更多个增强子拷贝组成的更大的增强子元件，并使用本领域已知的方法克隆，使其5′或3′与启动子元件可操作地连接，或5′或3′与和启动子可操作地连接的附加增强子元件可操作地连接，从而产生嵌合转录调控元件。还可以使用本领域已知的方法克隆增强子元件，使其5′与源自不同属的生物的启动子元件可操作地连接，或者5′或3′与源自其它属的生物的附加增强子元件(与源自相同或不同属的生物的启动子可操作地连接)可操作地连接，从而产生嵌合调控元件。GUS表达植物转化载体可以使用本领域已知的方法构建，类似于实施例2中描述的构建体，其中所得植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界区(B-AGRtu.右边界)，用于选择赋予抗生素即壮观霉素抗性的经转化的植物细胞的第一转基因选择盒；和用于检验增强子元件的第二转基因盒，所述增强子元件由5′或3′与启动子元件可操作地连接或5′或3′与附加增强子元件可操作地连接的增强子元件组成，附加增强子元件又与启动子可操作地连接，该启动子5′与前导元件可操作地连接，前导元件与β-葡萄糖醛酸酶的编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1，SEQ ID NO：42)可操作地连接，所述编码序列含有源自马铃薯光诱导型组织特异性ST-LS1基因(Genbank登录号：X04753)的可加工内含子，该内含子与3′终止区可操作地连接，并且所得植物表达载体含有来自根癌农杆菌的左边界区(B-AGRtu.左边界)。使用所得质粒通过实施例中描述的方法转化大豆植物或其它属的植物。可替代地，使用本领域已知的方法转化源自大豆或其它属的植物的原生质体细胞以进行瞬时测定。
在稳定或瞬时植物测定中评价由包含一个或多个增强子的调控元件驱动的GUS表达，以确定增强子元件对可转录DNA分子表达的影响。可以基于经验性实验和使用每种调控元件组合物观察到的所得基因表达调节来进行对一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增强子元件的复制。改变所得调控元件或嵌合调控元件中一个或多个增强子的相对位置可影响调控元件或嵌合调控元件的转录活性或特异性，并根据经验确定以鉴定大豆植物或其它属植物中针对所需转基因表达谱的最佳增强子。
实施例13
经稳定转化的大豆植物中合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2对GUS表达所赋予的影响的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的植物表达载体转化大豆植物。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件对表达的影响。
用包含驱动GUS表达的EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)的两个二元载体转化大豆植物。GUS转基因盒还包含内源性3′UTR即T-Mt.Sa1i3-2-1：2：1(SEQ ID NO：34)或合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2(SEQ ID NO：44)。在用两种构建体转化的经稳定转化的大豆植物的器官中定量测量GUS蛋白表达。在构建体之间比较GUS的表达。下表11示出了相对于内源3′UTR即T-Mt.Sali3-2-1：2：1，受合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2调节的平均GUS表达，其中“nd”意指未测定并且“bdl”意指低于检测限值。
表11.经稳定转化的大豆植物中的平均定量GUS表达。
正如表11中可以看出，在测定的所有组织中，合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2相对于3′UTR即T-Mt.Sali3-2-1：2：1使表达减弱。每个组织的减弱程度从R1根中的1.5倍变化到V5库叶中的7.4倍。使用3′UTR来减弱经稳定转化的植物中的表达具有很大的实用性。例如，3′UTR可以与其它调控元件(诸如启动子、前导序列和内含子)组合使用以微调转基因的表达，特别是那些其中高表达可导致对经转化的植物有害的脱表型(off-phenotypic)效应的转基因的表达。对所得GUS转录物的分析证实合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2赋予的转录物的正确终止。合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2，能够在经稳定转化的大豆植物中调节表达并正确终止转录。
实施例14
玉米原生质体细胞中合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2和T-Zm.GST59.nno：1关于GUS表达的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的试验调控元件的表达载体转化玉米叶原生质体。分析所得经转化的玉米叶原生质体的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件对表达的影响。
用包含合成表达元件的表达载体转化源自叶组织的玉米原生质体，并与本领域已知的表达元件进行比较。构建两种表达载体以评估合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2(SEQ IDNO：44)和T-Zm.GST59.nno：1(SEQ ID NO：29)的活性，并且还构建了两种构建体表达载体。四种构建体中的每一种都包含转基因盒，转基因盒包含组成型启动子和前导序列EXP-CaMV.35S(SEQ ID NO：46)，前导序列5′与内含子I-Zm.DnaK：1(SEQ ID NO：47)可操作地连接，内含子5′与GUS编码序列GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1(SEQ ID NO：42)可操作地连接。用于评估合成3′UTR的表达载体包含3′与GUS编码序列可操作地连接的T-Zm.GST7.nno：2或T-Zm.GST59.nno：1。一种对照载体包含3′与GUS编码序列可操作地连接的3′UTR T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：48)。另一种对照载体没有3′UTR。
还使用本领域已知的方法构建用于原生质体的共转化和数据标准化的质粒。它包含由5′与编码荧光素酶荧光蛋白(Promega，Madison，WI 53711)的编码序列Nluc(SEQ ID NO：49)可操作地连接的EXP-CaMV.35S(SEQ ID NO：46)组成的转基因盒，所述编码序列5′与3′UTR即T-Os.LTP：1(SEQ ID NO：48)可操作地连接。
使用类似于本领域已知的那些的基于PEG的转化方法转化玉米叶原生质体。以九十六孔的形式转化原生质体细胞。使用12微克的试验载体DNA或对照载体DNA，以及6微克的载体DNA转化每孔的3.2X 105个原生质体。转化后，将原生质体在25℃下在黑暗中孵育十六至二十四小时。孵育后，使原生质体裂解，将裂解物用于测量荧光素酶和GUS表达。为了裂解细胞，通过离心使板中的细胞团块化，洗涤，重新悬浮于较小体积中，并转移到条带孔管中。将管再次离心并吸出上清液，留下原生质体细胞团块。将细胞沉淀重新悬浮于QB缓冲液(100mM KPO4，pH 7.8；1mM EDTA；1％Triton X-100；10％甘油；1 mM DTT)。通过对细胞进行剧烈移液数次，涡旋该管，并使该管在冰上孵育5分钟来裂解细胞。然后将裂解物离心以使细胞碎片团块化。然后将所得裂解物转移到干净的板上。
使用荧光素酶测定底物(Promega，Madison，WI 53711)在QB缓冲液中测定荧光素酶活性。简言之，使少量裂解液、QB缓冲液和荧光素酶测定底物/QB溶液在白色的九十六孔板中混合在一起。然后使用酶标仪(BMG LABTECHInc.，Cary，NC 27513)测量荧光。
使用荧光底物4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)在50微升的总反应体积中测定GUS活性。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下最大程度地发荧光，其中羟基被离子化。添加碳酸钠碱性溶液同时终止了测定并且调节pH以量化荧光产物。将裂解物的等分试样与溶解在QB缓冲液中的MUG等分试样混合，并在37℃下孵育。取出裂解物/MUG混合物的一小等分试样并在三个不同的时间点添加到终止缓冲液中：(1)将裂解物/MUG反应物混合后立即，作为“零时分钟”；(2)二十分钟；和(3)六十分钟。使用酶标仪(BMG LABTECHInc.，Cary，NC 27513)在355nm激发波长、460nm发射波长下测量荧光。
对于每种表达载体，使用至少两张板进行转化，每张板转化4至8次。对于每张板，每个构建体在4至8个孔中转化。从每次转化中取出等分试样用于MUG测定，并且从板内标准曲线得到“水解的MUG量(nM)”。从每次转化中取出一等分试样用于读数(RLU)。将每种表达载体的平均水解MUG量(nM)/RLU相对于设为100％的EXP-CaMV.35S/I-Zm.DnaK：1/T-Os.LTP：1表达载体进行标准化。表12示出了对于包含合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2和T-Zm.GST59.nno：1的每种表达载体和对照而言，用于转化的所有板的均值平均数。
表12.每种表达载体的平均水解MUG量(nM)/RLU的平均数。
| 3′UTR | 均值平均数 | 标准误差 |
| T-Os.LTP：1 | 100.00 | 8.09 |
| 无3′UTR | 51.95 | 4.71 |
| T-Zm.GST59.nno：1 | 505.45 | 37.75 |
| T-Zm.GST7.nno：2 | 345.31 | 40.73 |
正如表12中可以看出，无3′UTR的表达载体提供比T-Os.LTP：1对照低的表达。与T-Os.LTP：1对照相比，合成3′UTR T-Zm.GST7.nno：2和T-Zm.GST59.nno：1增强了表达。对转录物的分析证明由合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2和T-Zm.GST59.nno：1所赋予的正确终止。合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2和T-Zm.GST59.nno：1，能够在经稳定转化的玉米叶原生质体细胞中调节表达并正确终止转录。
实施例15
在棉花叶原生质体中驱动GUS的调控元件的分析
用载体，特别是含有驱动β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的调控元件组的表达载体转化棉花叶原生质体。分析所得经转化的棉花叶原生质体的GUS蛋白表达，以评估所选调控元件组对表达的影响。
用包含合成表达元件的表达载体转化源自叶组织的棉花原生质体，并与本领域已知的表达元件进行比较。进行单独的实验以评估EXP即EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)、EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10(SEQ ID NO：8)、EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：10)、EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2(SEQ ID NO：16)和EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3(SEQ ID NO：22)的活性。将表达元件克隆到表达载体中并使其与包含可加工的内含子的GUS编码序列GOI-Ec.uidA+St.LS1：1：1(SEQ ID NO：42)可操作地连接。对照表达载体包含已知表达元件的不同构型。
还使用本领域已知的方法构建了用于共转化和数据标准化的两种质粒。每个质粒含有受组成型EXP序列驱动的特异性荧光素酶编码序列。植物载体pFLUC包含转基因盒，该转基因盒具有5′与内含子(EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK：1：1，SEQ ID NO：53)可操作地连接的组成型启动子，该内含子5′与萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码序列(LUCIFERASE：1：3，SEQ ID NO：54)可操作地连接，该编码序列5′与来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：55)的3′UTR可操作地连接。植物载体pRLUC包含转基因盒，该转基因盒具有5′与海肾(Renilla reniformis)荧光素酶编码序列(CR-Ren.hRenilla Lucife-0：0：1，SEQ ID NO：57)可操作地连接的组成型EXP序列(EXP-CaMV.35S-enh-Lhcb1，SEQ ID NO：56)，该编码序列5′与来自根癌农杆菌胭脂碱合酶基因(T-AGRtu.nos-1：1：13，SEQ ID NO：55)的3′UTR可操作地连接。
使用本领域已知的基于PEG的转化方法转化棉花叶原生质体。用质粒pFLUC和pRLUC以及等摩尔量的EXP表达载体转化原生质体细胞。通过将如上进行转化的裂解细胞制剂的等分试样放入两个不同的小孔托盘中来进行GUS和荧光素酶的测量。一个托盘用于GUS测量，第二个托盘用于使用双重荧光素酶报告测定系统(Promega Corp.，Madison，WI；参见，例如Promega Notes Magazine，No：57，1996，p.02)进行双重荧光素酶测定。样品测量基于类似于实施例14中所示的多次转化。以与实施例14中相似的方式计算平均GUS/FLUC值，但未相对于对照EXP载体进行标准化。
将EXP即EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)、EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：10(SEQ ID NO：8)和EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：10)克隆到植物表达载体中，使其5′与GUS编码序列(SEQ ID NO：42)可操作地连接，该编码序列5′与3′UTR即T-Mt.Sali3-2-1：2：1(SEQ ID NO：34)可操作地连接。用已知在棉花叶原生质体中弱表达的EXP即EXP-At.Bglu21+At.Cyco：2(SEQ ID NO：50)和已知在棉花叶原生质体中良好表达的EXP即EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：51)构建两种对照植物表达载体。对照EXP与相同的GUS和3′UTR序列可操作地连接。另外，包含含有与GUS可操作地连接的EXP即EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)的GUS转基因盒的植物表达载体包含合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：2(SEQ ID NO：44)以评估合成3′UTR的活性。多次转化的平均GUS/FLUC值如表13所示。
表13.来自经转化的棉花叶原生质体的平均GUS/FLUC值
正如表13中可以看出，EXP即EXP-At.GSP571(SEQ ID NO：4)、EXP-At.GSP571.nno+At.GSI21.nno：2(SEQ ID NO：8)和EXP-At.GSP571.nno+At.GSI102.nno：1(SEQ ID NO：10)在棉花叶原生质体细胞中展示出表达。合成3′UTR即T-Zm.GST7.nno：10(SEQ ID NO：44)以与内源3′UTR即T-Mt.Sali3-2-1：2：1相似的方式起作用。
将EXP即EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：2(SEQ ID NO：16)克隆到植物表达载体中，使其5′与GUS编码序列(SEQ ID NO：42)可操作地连接，该编码序列5′与内源3′UTR即T-Mt.Oxr-1：2：1(SEQ ID NO：35)可操作地连接。用已知在棉花叶原生质体中弱表达的EXP即EXP-Gm.Sphas1：1：1(SEQ ID NO：52)和已知在棉花叶原生质体中良好表达的EXP即EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：51)构建两种对照植物表达载体。对照EXP与相同的GUS和3′UTR序列可操作地连接。多次转化的平均GUS/FLUC值如表14所示。
表14.来自经转化的棉花叶原生质体的平均GUS/FLUC值
正如表14中可以看出，合成EXP即EXP-At.GSP564.nno+At.GSI17.nno：1(SEQ IDNO：16)在棉花叶细胞原生质体中展示出表达。
将EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3(SEQ ID NO：22)克隆到植物表达载体中，使其5′与GUS编码序列(SEQ ID NO：42)可操作地连接，该编码序列5′与内源3′UTR即T-Mt.RD22-1：2：1(SEQ ID NO：37)可操作地连接。用已知在棉花叶原生质体中弱表达的EXP即EXP-Gm.Sphas1：1：1(SEQ ID NO：52)和已知在棉花叶原生质体中良好表达的EXP即EXP-CaMV.35S-enh+Ph.DnaK：1：3(SEQ ID NO：51)构建两种对照植物表达载体。对照EXP与相同的GUS和3′UTR序列可操作地连接。多次转化的平均GUS/FLUC值如表15所示。
表15.来自经转化的棉花叶原生质体的平均GUS/FLUC值
正如表15中可以看出，合成EXP即EXP-At.GSP579.nno+At.GSI102.nno：3(SEQ IDNO：22)在棉花叶细胞原生质体中展示出表达。
已经说明和描述了本发明的原理，对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不背离这些原理的情况下，可以在排列和细节上对本发明进行修改。我们要求保护在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文引用的所有公开案和公开的专利文件均特此通过引用并入，其程度如同特别单独地指出将每个单独的公开案或专利申请通过引用并入一样。
Claims (15)
1. 一种重组DNA分子，其包含SEQ ID NO: 26、45或27的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与异源可转录DNA分子可操作地连接。
3.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列具有基因调控活性。
4.根据权利要求2所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子包含具有农学意义的基因。
5.根据权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述具有农学意义的基因在植物中赋予除草剂耐受性。
6.根据权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述具有农学意义的基因在植物中赋予害虫抗性。
7.一种转基因植物细胞，其包含根据权利要求1所述的重组DNA分子，所述植物细胞是不可再生的。
8.根据权利要求7所述的转基因植物细胞，其中所述DNA序列与异源可转录DNA分子可操作地连接。
9.根据权利要求7所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
10.根据权利要求7所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
11.一种生产商品的方法，其包括获得包含根据权利要求1所述的重组DNA分子的转基因植物或其部分，并由所述转基因植物或其部分生产所述商品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述商品是蛋白分离物、粉状物或种子油。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述商品是蛋白浓缩物、粗粉或谷物。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述商品是种子。
15.一种表达可转录DNA分子的方法，其包括获得包含根据权利要求2所述的重组DNA分子的转基因植物并培育所述植物，其中表达所述可转录DNA。
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