PT1086236E - Ácidos gordos poliinsaturados em plantas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ÁCIDOS GORDOS POLIINSATDRADOS EM PLANTAS"

Campo Técnico

Esta invenção diz respeito à modulação de níveis de enzimas e/ou componentes enzimáticos com capacidade para alterar a produção de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa (PUFAS) numa planta hospedeira. A invenção é exemplificada pela produção de PUFAS em plantas.

INTRODUÇÃO

Antecedentes da Invenção

As três famílias principais de ácidos gordos poliinsaturados (PUFAs) são os 3 ácidos gordos, exemplificados por ácido araquidónico, os ácidos gordos ω9 exemplificados por ácido Mead, e os ácidos gordos ω3, exemplificados por ácido eicosapentaenóico. Os PUFAs são componentes importantes da membrana plasmática celular, onde podem ser encontrados na forma de fosfolípidos. Os PUFAs funcionam também como precursores de outras moléculas importantes em humanos e animais, incluindo as prosta-ciclinas, leucotrienos e prostaglandinas. Os PUFAs são 2 ΡΕ1086236 necessários para o desenvolvimento normal, particularmente no desenvolvimento do cérebro do bebé, e para a formação e reparação de tecidos.

Quatro PUFAs de cadeia longa de grande importância incluem ácido docosa-hexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA), que são encontrados sobretudo em diferentes tipos de óleo de peixe, ácido gama-linolénico (GLA), que se encontra nas sementes de várias plantas, incluindo Prímula da tarde (Oenoutraa biennis), borraqem (Borago officinalis) e Groselha negra (Ribes nigrum), e ácido estearidónico (SDA), que se encontra em óleos marinhos e sementes vegetais. Tanto o GLA como outro PUFA de cadeia longa importante, o ácido araquidónico (ARA), são encontrados em fungos filamentosos. O ARA pode ser purificado a partir de tecidos animais incluindo o fígado e a glândula adrenal. O ácido Mead acumula-se em animais deficientes em ácidos gordos essenciais.

Para o DHA, existem várias fontes para a produção comercial incluindo uma variedade de organismos marinhos, óleos obtidos a partir de peixes marinhos de água fria, e fracções de gema de ovo. Para o ARA, podem ser utilizados microrganismos incluindo os géneros Mortierella, Entomophthora, Phytium e Porphyridium para a produção comercial. As fontes comerciais de SDA incluem os géneros Trichodesma e Echium. As fontes comerciais de GLA incluem Prímula da tarde, Groselha negra e borragem. No entanto, existem várias desvantagens associadas com a produção 3 ΡΕ1086236 comercial de PUFAs a partir fontes naturais. As fontes naturais de PUFAs, tais como, animais e plantas, tendem a possuir composições de óleos altamente heterogéneas. Os óleos obtidos a partir destas fontes podem assim necessitar purificação extensiva para separar um ou mais PUFAs desejados ou para produzir um óleo que é enriquecido num ou mais PUFA. As fontes naturais estão também sujeitas a flutuações na disponibilidade não controláveis. Os stocks de peixe podem sofrer variação natural ou podem-se encontrar em baixo devido à sobrepesca. Os óleos de peixe possuem sabores e odores desagradáveis, que podem ser impossíveis de separar economicamente do produto desejado, e podem tornar tais produtos não aceitáveis como suplementos alimentares. Os óleos de animal, e particularmente os óleos de peixe, podem acumular poluentes ambientais. O tempo e doenças podem causar flutuações no rendimento das fontes de peixe e plantas. O terreno agrícola disponível para a produção de plantações alternativas de produção de óleos encontra-se sujeita a competição com a expansão constante das populações humanas e a necessidade crescente associada para a produção de alimento nos restantes terrenos aráveis. As plantações que produzem PUFAs, tais como borragem, não foram adaptadas para cultura comercial e podem não se dar bem em monocultura. A cultura de tais plantações não é assim competitiva economicamente quando podem ser cultivadas plantações mais rentáveis e melhor estabelecidas. A fermentação em grande escala de organismos, tais como, Mortierella também é dispendiosa. Os tecidos naturais de animal possuem baixas quantidades de 4 ΡΕ1086236 ARA e são difíceis de processar. Os microrganismos, tais como, Porphyridium e Mortierella são difíceis de cultivar em escala comercial.

Os suplementos de dieta e as formulações farmacêuticas contendo PUFAs podem reter as desvantagens da fonte de PUFA. Os suplementos, tais como, cápsulas óleo de peixe podem conter níveis baixos do componente particular desejado e assim serem necessárias grandes dosagens. As dosagens elevadas resultam na ingestão de níveis elevados de componentes indesejáveis, incluindo contaminantes. Devem ser tomados cuidados quando se ministram suplementos de ácidos gordos, uma vez que a sobre-adição pode resultar na supressão de vias biossintéticas endógenas e conduzir a competição com outros ácidos gordos necessários em várias fracções lipídicas in vivo, levando a resultados indesejáveis. Por exemplo, os esquimós com uma dieta rica em ácidos gordos ω3 possuem uma tendência aumentada para sangrar (Pat. U.S. N° 4 874 603). Os sabores e odores desagradáveis dos suplementos podem tornar tais regimes indesejáveis, e podem inibir a colaboração do doente.

Estão envolvidas várias enzimas na biossíntese de PUFA. O ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) é produzido a partir de ácido oleico (18:1 Δ9) por intermédio de uma Δ12-dessaturase. O GLA (18:3 Δ6, 9, 12) é produzido a partir de ácido linoleico (LA, 18:2 Δ9, 12) por intermédio de uma Δ6-dessaturase. A produção de ARA (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a partir de DGLA (20:3 Δ8, 11, 14) é catalizada por uma Δ5- 5 ΡΕ1086236 dessaturase Nc > entanto, os animais não conseguem dessaturar para além da posição Δ9 e consequentemente não conseguem converter ácido oleico (18:1 Δ9) em ácido linoleico (18:2 Δ9, 12) . Do mesmo modo, o ácido a- linolénico (ALA, 18:3 Δ9, 12 , 15) não pode ser sintetizado por mamíferos. Outros eucariotas, incluindo fungos e plantas, possuem enzimas que dessaturam nas posições Δ12 e Δ15. Os principais ácidos gordos poliinsaturados de animais são consequentemente derivados da dieta e/ou da dessaturação e elongação de ácido linoleico (18:2 Δ9, 12) ou ácido a-linolénico (18:3 Δ9, 12, 15).

Os ácidos gordos poliinsaturados são considerados úteis para fins nutricionais, farmacêuticos, industriais, e outros. Um fonte expansiva de ácidos gordos poliinsaturados a partir de fontes naturais e a partir de síntese química não é suficientes para as necessidades comerciais. Consequentemente é de interesse obter material genético envolvido na biossintese de PUFA a partir de espécies que produzem naturalmente estes ácidos gordos e expressar o material isolado individualmente ou em combinação num sistema heterólogo que pode ser manipulado para permitir a produção de quantidades comerciais de PUFAS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO São proporcionadas novas composições e métodos para a preparação de ácido estearidónico e dessaturases em plantas e célula vegetais. Os métodos envolvem a cultura de 6 ΡΕ1086236 uma planta que possui integrada no seu genoma uma primeira construção de DNA que compreende, na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente de uma planta, uma sequência de DNA que codifica uma delta-seis dessaturase, e uma região de terminação da transcrição funcional numa célula vegetal, e uma segunda construção que compreende na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente de uma planta, e uma sequência de DNA que codifica uma delta 15-dessaturase e a cultura da referida planta em condições em que a referida delta-seis dessaturase e a referida delta 15-dessaturase são expressas. De modo preferido, a referida planta possui uma terceira construção integrada no seu genoma, em que a referida terceira construção possui na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente de uma planta, e uma sequência de DNA que codifica uma delta 12 dessaturase. A expressão do polipéptido dessaturase proporciona uma alteração no perfil de PUFA das células vegetais hospedeiras como resultado das concentrações alteradas de enzimas envolvidas na biossíntese de PUFA. Possui interesse particular o controlo selectivo da produção de PUFA em sementes vegetais. A invenção é útil na produção em grande escala de ácido estearidónico e na modificação do perfil de ácido gordo de sementes e/ou de óleos de sementes vegetais. A invenção proporciona adicionalmente uma planta transgénica ou uma sua semente que possui integrada no seu genoma uma primeira construção de DNA que compreende, na 7 ΡΕ1086236 direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente de uma planta, um DNA que codifica uma delta-seis dessaturase, e uma região de terminação da transcrição funcional numa célula vegetal, e uma segunda construção que compreende a direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente de uma planta, e faz também parte da invenção uma sequência de DNA que codifica uma delta 15-dessaturase, que possui a capacidade de expressão de delta-seis dessaturase e delta 15-dessaturase e de produção de óleo de sementes contendo ácido estearidónico. A semente da planta transgénica acima mencionada compreende de modo preferido cerca de 5 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como um componente dos ácidos gordos totais encontrados no óleo da semente. A invenção proporciona adicionalmente óleo de sementes obtido a partir de uma semente da referida planta transgénica e um tecido vegetal da semente da referida planta transgénica que compreende o referido óleo de sementes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta vias possíveis para a síntese de ácido Mead (20:3 Δ5, 8, 11), ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11; 14) e ácido estearidónico (18:4 Δ6, 9, 12, 15) a partir de ácido palmítico (Ci6) a partir de vários organismos, incluindo algas, Mortierella e humanos. Estes PUFAs podem funcionar como precursores de outra moléculas importantes para humanos e outros animais, incluindo ΡΕ1086236 prostaciclinas, leucotrienos, e prostaglandinas, algumas das quais são apresentadas. A Figura 2 apresenta vias possíveis para a produção de PUFAs para além de ARA, incluindo ácido taxoleico e pinolénico, mais uma vez compilados a partir de uma variedade de organismos.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

De modo a garantir uma compreensão total da invenção, são proporcionadas as seguintes definições: Δδ-Dessaturase: a Δ5 dessaturase é uma enzima que introduz uma ligação dupla entre os carbonos 5 e 6 da extremidade carboxilo de uma molécula de ácido gordo. Δβ-Dessaturase: a Δβ-dessaturase é uma enzima que introduz uma ligação dupla entre os carbonos 6 e 7 da extremidade carboxilo de uma molécula de ácido gordo. A9-Dessaturase: a A9-dessaturase é uma enzima que introduz uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10 da extremidade carboxilo de uma molécula de ácido gordo.

Al2-Dessaturase: a Al2-dessaturase é uma enzima que introduz uma ligação dupla entre os carbonos 12 e 13 da extremidade carboxilo de uma molécula de ácido gordo. 9 ΡΕ1086236 Ácidos gordos: Os ácidos gordos são uma classe de compostos contendo uma cadeia longa de hidrocarbonetos e um grupo carboxilato terminal. Os ácidos gordos incluem os seguintes: Ácido Gordo 12:0 ácido láurico 16:0 Ácido palmitico 16:1 Ácido palmitoleico 18:0 ácido esteárico 18:1 ácido oleico Δ9-18:1 18:2 Δ5,9 Ácido taxoleico Δ5,9-18:2 18:2 Δ6,9 ácido 6,9-octadecadienóico Δ6,9-18:2 18:2 Ácido linoleico Δ9,12-18:2 (LA) 18:3 Δ6,9,12 Ácido gama-linolénico Δ6,9,12-18:3 (GLA) 18:3 Δ5,9,12 Ácido pinolénico Δ5,9,12-18:3 18:3 ácido alfa-linolénico Δ9,12,15-18:3 (ALA) 18:4 Ácido estearidónico Δ6.9.12,15-18:4 (SDA) 20:0 Ácido araquídico 20:1 Ácido eicosnénico 20:2 Δ8,11 Δ8,11 20:3 Δ5,8,11 Ácido Mead Δ5,8,11 22:0 Ácido be-henóico 22:1 ácido erúcico 22:2 Ácido docasadienóico 20:4 γδ Ácido araquidónico Δ5,8,11,14-20:4 (ARA) 20:3 γ6 y6-cicosatrienóico di-homo-gama linolénico Δ8,11,14-20:3 (DGLA) 20:5 γ3 Eicosapentaenóico (Ácido timnodónico) Δ5,8,11,14,17-20:5 (EPA) 20:3 γ3 y3-eicosatrienóico Δ11,16,17-20:3 20:4 γ3 y3-eicosatetraenóico Δ8,11,14,17-20:4 22:5 γ3 Docosapentaenóico Δ7,10,13,16,19-22:5 (y3DPA) 22:6 γ3 Docosa-hexaenóico (ácido cervónico) Δ4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA) 24:0 Ácido lognocérico 10 ΡΕ1086236

Tendo em conta estas definições, a presente invenção é dirigida para construções de DNA relacionadas com a produção de ácidos gordos em plantas. São proporcionados métodos e composições que permitem a modificação do conteúdo de ácidos gordos de cadeia longa poliinsa-turados das células vegetais. As células vegetais são transformadas com uma cassete de expressão que compreende um DNA que codifica um polipéptido com capacidade de aumentar a quantidade de um ou mais PUFA numa célula vegetal. As construções de integração proporcionam a integração da cassete de expressão no genoma de uma célula hospedeira. As células hospedeiras são manipuladas para expressar um DNA sentido que codifica um(uns) polipéptido(s) que possuem actividade dessaturase. Por "dessaturase" pretende-se designar um polipéptido que tem a capacidade de dessaturar um ou mais ácidos gordos para produzir um ácido gordo mono-ou poliinsaturado ou seu precursor de interesse. Por "polipéptido" pretende-se designar qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós-tradução, por exemplo, glicosilação ou fosfo-rilação. 0(s) substrato(s) para a enzima expressa podem ser produzidos pela célula hospedeira ou podem ser fornecidos exogenamente.

Para se alcançar expressão numa célula hospedeira, o DNA transformado é associado operacionalmente com regiões reguladoras de iniciação e terminação da transcrição e tradução que são funcionais na célula hospedeira. As construções que compreendem o gene a ser expresso permitem 11 ΡΕ1086236 integração no genoma da célula hospedeira. Para a produção de SDA, as cassetes de expressão incluem uma cassete que proporciona actividade Δ6 dessaturase, particularmente numa célula hospedeira que produz ou pode incorporar ALA.

PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GORDOS EM PLANTAS TRANSGENICAS A produção de PUFAs em plantas transgénicas apresenta várias vantagens em relação à purificação a partir de fontes naturais, tais como, peixe ou plantas. A produção de ácidos gordos a partir de plantas recombinantes proporciona a capacidade de alterar o perfil de ácidos gordos vegetais que ocorrem na natureza proporcionando vias sintéticas no hospedeiro, aumentando assim os níveis de PUFAs desejados, ou suas formas conjugadas, e diminuindo os níveis de PUFAs indesejáveis. A produção de ácidos gordos em planta transgénicas proporciona também a vantagem de que a expressão de genes de dessaturase em tecidos e/ou partes vegetais particulares significa que podem ser atingidos níveis muito aumentados dos PUFAs desejados nesses tecidos e/ou partes, tornando a recuperação a partir desses tecidos mais económica. Os PUFAs desejados podem ser expressos em semente; os métodos para isolar óleos de sementes encontram-se bem estabelecidos. Para além de proporcionar uma fonte para a purificação dos PUFAs desejados, os componentes dos óleos de sementes podem ser manipulados através da expressão de genes de dessaturase, isoladamente ou em combinação com outros genes, tais como, das elongases, para proporcionam óleos de sementes que possuem um perfil 12 ΡΕ1086236 particular de PUFA em forma concentrada. Os óleos de sementes concentrados podem depois ser adicionados a leites de animal e/ou leites sintéticos ou semi-sintéticos para funcionarem como fórmulas para bebés quando é impossível ou indesejável a amamentação humana, ou em casos de subnutrição ou doença quer em adultos quer em bebés.

Para a produção de ácido estearidónico, dependendo da célula hospedeira, da disponibilidade de substrato, e dos produto(s) finais desejados, possuem interesse vários polipéptidos, particularmente dessa-turases, incluindo aqueles polipéptidos que catalizam a conversão de ALA em SDA, de ácido oleico em LA, ou de LA em ALA, o que inclui enzimas que dessaturam nas posições Δ6, Δ12, ou Δ15. As considerações para escolha de um polipéptido específico que possui actividade dessaturase incluem o pH óptimo do polipéptido, se o polipéptido é uma enzima que limita a taxa ou um seu componente, se a dessaturase utilizada é essencial para a síntese de um ácido gordo poliinsaturado desejado, e/ou co-factores necessários ao polipéptido. O polipéptido expresso possui de modo preferido parâmetros compatíveis com o ambiente bioquímico da sua localização na célula hospedeira. Por exemplo, o polipéptido pode ter de competir por substrato com outras enzimas na célula hospedeira. As análises de Km e actividade específica do polipéptido em questão são consequentemente consideradas na determinação da adequa-bilidade de um determinado polipéptido para a modificação da produção PUFA numa determinada célula hospedeira. O 13 ΡΕ1086236 polipéptido utilizado numa situação particular é consequentemente um que pode funcionar sob as condições presentes na célula hospedeira que se pretende mas que de outro modo pode ser qualquer polipéptido que possua actividade dessaturase que possui a caracteristica desejada de ser capaz de modificar a produção relativa de ácido estearidónico. É apresentado na Figura 1 um esquema exemplificativo para a sintese de ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a partir de ácido palmitico (Cie) · Uma enzima chave nesta via é a A5-dessaturase que converte ácido DH-y-linolénico (DGLA, ácido eicosatrienóico) em ARA. A conversão de ácido α-linolénico (ALA) em ácido estearidónico por uma Δβ-dessaturase é também apresentada. A produção de PUFAs para além de ARA, incluindo EPA e D HA é apresentada na Figura 2. Uma enzima chave na sintese de ácido araquidónico (20:4 Δ5, 8, 11, 14) a partir do ácido esteárico (Cie) é uma Δβ-dessaturase que converte o ácido linoleico em ácido γ-linolénico. A conversão de ácido a-linolénico (ALA) em ácido estearidónico por uma Δβ-dessaturase é também apresentada. A escolha da combinação de cassetes utilizadas depende em parte do perfil de PUFA da célula hospedeira.

FONTES DE POLIPÉPTIDOS QUE POSSUEM ACTIVIDADE DESSATURASE

As fontes de polipéptidos que possuem actividade dessaturase e de oligonucleótidos que codificam tais polipéptidos são organismos que produzem um ácido gordo poliinsaturado desejado. Por exemplo, os microrganismos com 14 ΡΕ1086236 GLA ou SDA podem ser utilizados como uma fonte de genes de A6-dessaturase e/ou Al2-dessaturase. Tais microrganismos incluem, por exemplo, os que pertencem aos géneros Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicitlium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, e Entomophthara. No contexto da invenção, a sequência que codifica Δβ-dessaturase é de modo preferido do género Mortierella. Dentro do género Porphyridium, Porphyridium cruentum possui interesse particular. Dentro do género Mortierella, Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var, angulispora. e Mortierella alpina possuem interesse particular. Dentro do género Mucor, Mucor circinelloides e Mucor javanicus possuem interesse particular.

Os DNAs que codificam dessaturases desejadas podem ser identificados por vários meios. Por exemplo, a fonte das dessaturase desejadas, por exemplo as bibliotecas genómicas ou de cDNA de Mortierella, é sujeita a rastreio com sondas detectáveis sintetizadas enzimaticamente ou quimicamente, que podem ser produzidas a partir de DNA, RNA, ou de nucleótidos que não ocorrem na natureza, ou suas misturas. As sondas podem ser sintetizadas enzimaticamente a partir de DNAs de dessaturases conhecidas para métodos de hibridação de restringência normal ou reduzida. As sondas oligonucleotidicas podem também ser utilizadas para o rastreio de fontes e podem ser baseadas nas sequências de dessaturases conhecidas, incluindo as sequências conser- 15 ΡΕ1086236 vadas entre dessaturases conhecidas, ou em sequências peptidicas obtidas a partir da proteína desejada purificada. As sondas oligonucleotídicas com base em sequências aminoacídicas podem ser degeneradas para abrangerem a degenerescência do código genético, ou podem ser enviesadas em favor dos codões preferidos do organismo fonte. Os oligonucleótidos podem também ser utilizados como iniciadores para PCR de mRNA transcrito reversamente de uma fonte conhecida ou suspeita: o produto de PCR pode ser o cDNA de comprimento completo ou pode ser utilizado para a produção de uma sonda para se obter o desejado cDNA de comprimento completo. Alternativamente, pode ser completamente sequenciada uma proteína desejada e realizada a síntese total de um DNA que codifica esse polipéptido.

Uma vez isolado o DNA genómico ou o cDNA desejado, pode ser sequenciado por métodos conhecidos. É reconhecido na arte que tais métodos estão sujeitos a erros, de tal modo que é rotina a múltipla sequenciação da mesma região e ainda é esperado conduzir taxas de erros mensuráveis na sequência resultante deduzida, particularmente em regiões que possuem domínios repetidos, estrutura secundária extensa, ou composições pouco comum de bases, tais como regiões com elevado conteúdo de bases GC. Quando aparecem discrepâncias, pode-se efectuar re-sequenciação e pode-se utilizar métodos especiais. Os métodos especiais podem incluir alterar as condições de sequenciação utilizando: diferentes temperaturas: diferentes enzimas: proteínas que alteram a capacidade dos oligonucleótidos 16 ΡΕ1086236 para formarem estruturas de ordem superior; nucleótidos alterados, tais como, ITP ou dGTP metilado: diferentes composições de gel, por exemplo adicionando formamida: diferentes iniciadores ou iniciadores localizados a diferentes distâncias da região problemática: ou diferentes moldes, tais como, DNAs de cadeia simples. Pode também ser utilizada a sequenciação de mRNA.

Na maior parte dos casos, parte ou toda a sequência codificante para o polipéptido com actividade dessaturase é de uma fonte natural. Em algumas situações, no entanto, é desejável modificar toda ou uma porção dos codões, por exemplo, para aumentar a expressão utilizando codões preferidos pelo hospedeiro. Os codões preferidos pelo hospedeiro podem ser determinados a partir dos codões com a frequência mais elevada nas proteínas expressas em maior quantidade numa espécie hospedeira particular de interesse. Deste modo, a sequência codificante para um polipéptido com actividade dessaturase pode ser sintetizada na totalidade ou em parte. Pode também ser sintetizado todo ou porções do DNA para remover quaisquer sequências destabilizantes ou regiões de estrutura secundária que poderiam estar presentes no mRNA transcrito. Pode também ser sintetizado todo ou porções do DNA para alterar a composição de bases para uma mais preferida na célula hospedeira desejada. Os métodos para a síntese de sequências e para juntar sequências estão bem estabelecidos na literatura. A mutagénese e selecção in vitro, a mutagénese dirigida, ou outros meios podem ser utilizados 17 ΡΕ1086236 para se obterem mutações de genes de dessaturase que ocorrem na natureza para a produção de um polipéptido com actividade dessaturase ín vivo com parâmetros físicos e cinéticos mais desejáveis para função na célula hospedeira, tais como, uma semi-vida mais longa ou uma taxa de produção do ácido gordo poliinsaturado desejado mais elevada.

Os cDNAs desejáveis possuem composição A+T menor do que 60%, de modo preferido composição A+T menor do que 50%. Numa escala local de uma janela deslizante de 20 pares de bases, é preferível que não existam regiões localizadas do cDNA com composição A+T maior do que 75%; com uma janela de 60 pares de bases, é preferível que não existam regiões localizadas do cDNA com composição A+T maior do que 60%, de modo mais preferido nenhumas regiões localizadas com composição A+T maior do que 55%.

Dessaturases de Mortierella alpina São de interesse particular as A6-dessaturase, Al2-dessaturase e Δ15 dessaturase de Mortierella alpina. O gene que codifica a A6-dessaturase de Mortierella alpina pode ser expresso em planta ou animais transgénicos para efectuar maior síntese de ácido estearidónico (SDA) a partir ALA. Podem também ser utilizados outros DNAs que são substancialmente idênticos em sequência ao DNA de Δ6-dessaturase de Mortierella alpina, ou que codificam polipéptidos que são substancialmente idênticos em sequência ao polipéptido Δδ-dessaturase de Mortierella alpina. 18 ΡΕ1086236 O gene que codifica a Al2-dessaturase de Morti-erella alpina pode ser expresso em planta transgénicas para efectuar maior sintese de LA a partir do ácido oleico. Podem também ser utilizados outros DNAs que são substancialmente idênticos ao DNA de Al2-dessaturase de Mortie-rella alpina, ou que codificam polipéptidos que são substancialmente idênticos ao polipéptido Al2-dessaturase de Mortierella alpina.

Por substancialmente idêntico em sequência pretende-se designar uma sequência aminoacidica ou sequência de ácido nucleico que exibe, em ordem crescente de preferência, pelo menos 60%, 80%, 90% ou 95% de homologia com a sequência aminoacidica de dessaturase de Mortierella alpina ou sequência de ácido nucleico que codifica a sequência aminoacidica. Para os polipéptidos, o tamanho para comparação de sequências é geralmente pelo menos 16 aminoácidos, de modo preferido, pelo menos 20 aminoácidos, ou, de modo ainda mais preferido, 35 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, o tamanho para comparação de sequências é geralmente pelo menos 50 nucleótidos, de modo preferido, pelo menos 60 nucleótidos, e de modo mais preferido pelo menos 75 nucleótidos, e de modo ainda mais preferido, 110 nucleótidos. A homologia é tipicamente medida utilizando programas de análise de sequências, por exemplo, o pacote de programas de Análise de Sequências do Genéticos Computer Group, do University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, 19 ΡΕ1086236

Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), e MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Califórnia 95008). Estes programas combinam sequências similares atribuindo graus de homologia a várias substituições, deleções, e outras modificações. As substituições conservadoras incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina; valina, isoleucina e leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, e glutamina; serina e treonina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. As substituições podem também ser efectuadas com base em hidrofobicidade ou hidrofilicidade conservada (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982), ou com base na capacidade de assumir estrutura polipeptidica secundária similar (Chou e Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45-148, 1978).

EXPRESSÃO DE GENES DE DESSATURASE

Uma vez obtido o DNA que codifica um polipéptido dessaturase, é colocado num vector com capacidade de replicação numa célula hospedeira, ou é propagado in vitro por meio de técnicas, tais como, PCR ou PCR longa. Os vectores de replicação podem incluir plasmideos, fagos, virus e cosmideos. Os vectores desejáveis incluem os úteis para a mutagénese do gene de interesse ou para a expressão do gene de interesse em células hospedeiras. A técnica de PCR longa tornou possível a propagação in vitro de construções grandes, de tal modo que as modificações no 20 ΡΕ1086236 gene de interesse, tais como, mutagénese ou adição de sinais de expressão, e propagação das construções resultantes pode ocorrer inteiramente in vitro sem a utilização de um vector de replicação ou de uma célula hospedeira.

Para a expressão de um polipéptido dessaturase, são ligadas operacionalmente ao DNA que codifica o polipéptido dessaturase regiões funcionais de iniciação e terminação da transcrição e tradução. As regiões funcionais de iniciação e terminação da transcrição e tradução são derivadas a partir de várias fontes não exclusivas, incluindo o DNA a ser expresso, genes que se sabe ou se suspeita possuírem capacidade de expressão no sistema desejado, vectores de expressão, sintese quimica, ou a partir de um locus endógeno numa célula hospedeira. A expressão num tecido vegetal e/ou parte da planta apresenta certas eficiências, particularmente quando o tecido ou parte é um que é facilmente retirado, tais como, sementes, folhas, frutos, flores, raízes, etc. A expressão pode ser dirigida para esse local na planta utilizando sequências reguladoras específicas, tais como, as de USPN 5 463 174, USPN 4 943 674, USPN 5 106 739, USPN 5 175 095, USPN 5 420 034, USPN 5 188 958, e USPN 5 589 379. Alternativamente, a proteína expressa pode ser uma enzima que produz um produto que pode ser incorporado, quer directamente ou após modificações adicionais, numa fracção fluida da planta hospedeira. No presente caso, a expressão de genes de dessaturase pode alterar os níveis de ácido estearidónico presentes em sementes vegetais e/ou tecidos de sementes 21 ΡΕ1086236 vegetais. A região de iniciação é um promotor funcional numa célula de semente de uma planta. De modo preferido, o promotor da primeira construção de DNA é um promotor da napina ou é da subunidade 7S da região de iniciação da transcrição de β-conglicinina de soja. A região de terminação é funcional numa célula vegetal. Pode ser derivada a partir da região 3' do gene a partir do qual foi obtida a região de iniciação ou a partir de um gene diferente. São conhecidas e foram descobertas um grande número de regiões de terminação que são satisfatórias em vários hospedeiros do mesmo e de diferentes géneros e espécies. A região de terminação é geralmente seleccionada mais por uma questão de conveniência do que devido a qualquer propriedade em particular. A escolha da célula hospedeira é em parte influenciada pelo perfil de PUFA desejado da célula transgénica, e pelo perfil original da célula hospedeira. Por exemplo, para a produção de ácido linoleico a partir do ácido oleico a sequência de DNA utilizada codifica um polipéptido que possui actividade Δ12 dessaturase, e para a produção de GLA a partir do ácido linoleico, a sequência de DNA utilizada codifica um polipéptido que possui actividade Δ6 dessaturase. A utilização de uma célula hospedeira que expressa actividade Δ12 dessaturase e não possui ou está diminuída na actividade Δ15 dessaturase, pode ser utilizada com uma cassete de expressão o que proporciona sobre-expressão de Δ6 dessaturase, por si só é geralmente suficiente para proporcionar produção aumentada de GLA na 22 ΡΕ1086236 célula transgénica. Onde a célula hospedeira expressa actividade Δ9 dessaturase, a expressão de uma Δ12- e uma Δβ-dessaturase pode proporcionar produção aumentada de GLA. Em situações particulares, quando a expressão da actividade Δ6 dessaturase é associada com a expressão de actividade Δ12 dessaturase, é desejável que a célula hospedeira possua naturalmente, ou seja sujeita a mutação para possuir, baixa actividade Δ15 dessaturase. Alternativamente, uma célula hospedeira para expressão de Δ6 dessaturase pode possuir, ou ser sujeita a mutação para possuir, elevada actividade Δ12 dessaturase. A expressão numa célula hospedeira pode ser conseguida de um modo transiente ou estável. A expressão transiente pode ocorrer a partir de construções introduzidas que possuem sinais de expressão funcionais na célula hospedeira, mas cujas construções não se replicam e raramente são integradas na célula hospedeira, ou quando a célula hospedeira não se encontra em proliferação. A expressão transiente pode também ser conseguida induzindo a actividade de um promotor regulável ligado operacionalmente ao gene de interesse, embora tais sistemas induziveis apresentem frequentemente um nível basal de expressão baixo. A expressão estável pode ser alcançada pela introdução de uma construção que se pode integrar no genoma da hospedeira ou que automaticamente se replica na célula hospedeira. A expressão estável do gene de interesse pode ser seleccionada através da utilização de um marcador seleccionável localizado na ou transfectado com a constru- 23 ΡΕ1086236 ção de expressão, seguido pela selecção de células que expressão o marcador. Na presente invenção, a expressão estável na planta resulta da integração. A integração das construções pode ocorrer ao acaso no genoma do hospedeiro ou pode ser dirigida através da utilização de construções contendo regiões de homologia suficiente com o genoma do hospedeiro para dirigir a recombinação com o locus do hospedeiro. Quando as construções são dirigidas para um locus endógeno, todas ou algumas das regiões reguladoras de transcrição e tradução podem ser proporcionadas pelo locus endógeno.

Quando é desejada expressão aumentada do poli-péptido dessaturase na planta fonte, podem ser utilizados vários métodos. Podem ser introduzidos genes adicionais no organismo hospedeiro que codificam o polipéptido dessaturase. A expressão a partir dos locus nativos de dessaturase podem também ser aumentada através de recombinação homóloga, por exemplo, inserindo um promotor mais potente no genoma do hospedeiro para provocar expressão aumentada, removendo sequências destabilizadoras do mRNA ou da proteina codificada deletando essa informação do genoma do hospedeiro, ou adicionando sequências estabilizadoras ao mRNA (ver USPN 4 910 141 e USPN 5 500 365.)

Quando é desejável expressar mais do que um gene diferente, regiões reguladoras adequadas e métodos de expressão, os genes introduzidos podem ser propagados na célula hospedeira pela integração no genoma do hospedeiro. 24 ΡΕ1086236

Cada construção introduzida deverá ter um modo de selecção diferente e não deverá possuir homologia com as outras construções para se manter expressão estável e impedir rearranjo de elementos entre construções. As escolhas acertadas de regiões reguladoras, meios de selecção e método de propagação da construção introduzida podem ser determinadas experimentalmente de tal modo que todos os genes introduzidos sejam expressos nos niveis necessários para proporcionarem a síntese dos produtos desejados.

As construções que compreende o gene de interesse podem ser introduzidas numa célula hospedeira por técnicas convencionais. Estas técnicas incluem transfecção, infecção, impacto bolístico, electroporaçâo, microinjeção, raspagem, ou qualquer outro método que introduz o gene de interesse na célula hospedeira (ver USPN 4 743 548, USPN 4 795 855, USPN 5 068 193, USPN 5 188 958, USPN 5 463 174, USPN 5 565 346 e USPN 5 565 347) . Por conveniência, uma célula hospedeira que tenha sido manipulada por qualquer método para incorporar uma sequência ou construção de DNA será aqui referida como "transformada" ou "recombinante". O sujeito hospedeiro possuirá pelo menos uma cópia da construção de expressão e poderá possuir duas ou mais, dependendo se o gene é apenas integrado no genoma ou se é amplificado adicionalmente, ou se está presente num elemento extra-cromossómico que possui vários números de cópias. A célula hospedeira transformada pode ser 25 ΡΕ1086236 identificada por selecção para um marcador contido na construção introduzida. Alternativamente, pode ser introduzida uma construção marcador separada com a construção desejada, uma vez que várias técnicas de transformação introduzem várias moléculas de DNA em células hospedeiras. Tipicamente, são seleccionados hospedeiros transformados pela sua capacidade de crescerem em meios selectivos. Os meios selectivos podem incorporar um antibiótico ou não possuírem um factor necessário para a cultura do hospedeiro não transformado, tais como, um nutriente ou factor de crescimento. Assim sendo, um gene marcador introduzido pode conferir resistência a antibióticos, ou codificar um factor de crescimento ou enzima essencial, e permitir a cultura em meios selectivos quando expresso na célula hospedeira transformada. Desejavelmente, a resistência à canamicina e ao amino glicósido G418 são de interesse (ver USPN 5 034 322) . A selecção de um hospedeiro transformado pode também ocorrer quando a proteína marcador expressa pode ser detectada, quer directamente ou indirectamente. A proteína marcador pode ser expressa isoladamente ou como uma fusão com outra proteína. A proteína marcador pode ser detectada pela sua actividade enzimática: por exemplo, a β-galactosidase pode converter o substrato X-gal num produto colorido, e a luciferase pode converter a luciferina num produto que emite luz. A proteína marcador pode ser detectada pelas suas características produção de luz ou de modificação; por exemplo, a proteína verde fluorescente de Aequorea victoria fluoresce quando iluminada com luz azul. Podem ser 26 ΡΕ1086236 utilizados anticorpos para detectar a proteína marcador ou uma marcação molecular, por exemplo, uma proteína de interesse. As células que expressam a proteína marcador ou marcação podem ser seleccionadas, por exemplo, visualmente, ou por técnicas, tais como, FACS ou biosselecção utilizando anticorpos. O ácido estearidónico produzido utilizando estes métodos e composições pode ser encontrado no tecido da semente de uma planta e/ou semente de uma planta hospedeira como ácidos gordos livres ou em formas conjugadas, tais como, acilgliceróis, fosfolípidos, sulfolípidos ou glicolípidos, e podem ser extraídos a partir da célula hospedeira através de uma variedade de meios bem conhecidos na arte. Tais meios podem incluir extracção com solventes orgânicos, sonicação, extracção em fluido supercrítico utilizando por exemplo dióxido de carbono, e meios físicos, tais como, prensas, ou suas combinações. Possui interesse particular a extracção com hexano ou metanol e clorofórmio. Quando desejável, a camada aquosa pode ser acidificada para adicionar protões a unidades carregadas negativamente e assim aumentar a separação dos produtos desejados para a camada orgânica. Após a extracção, os solventes orgânicos podem ser removidos por evaporação sob um fluxo de nitrogénio. Quando isolado em formas conjugadas, os produtos são clivados enzimaticamente ou quimicamente para libertarem o ácido gordo livre ou um conjugado de interesse menos complexo, e são seguidamente sujeitos a manipulações adicionais para a produção do produto final desejado. 27 ΡΕ1086236

Desejavelmente, as formas conjugadas de ácidos gordos são clivadas com hidróxido de potássio.

De modo surpreendente, como melhor demonstrado nos exemplos que se seguem, a expressão da Δβ dessaturase de Mortierella leva à produção de ácido esteariodónico no óleo extraido a partir de tecido da semente de células de plantas hospedeiras. Adicionalmente, a expressão da Δβ dessaturase com dessaturases adicionais proporcionou a produção aumentada de SDA no óleo da semente.

Deste modo, a presente invenção proporciona métodos para a produção de ácido esteariodónico (C18:4) na semente da planta hospedeira. Os métodos permitem a produção de SDA semente da planta hospedeira variando entre 0,3% em peso a pelo menos 30% em peso, de modo preferido, entre 5% em peso a pelo menos 25% em peso, de modo mais preferido entre 7% em peso a pelo menos 25% em peso. O SDA é de modo preferido produzido no óleo da semente de plantas hospedeira contendo uma ou mais construções de expressão como aqui descrito.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona uma nova fonte de óleos vegetais contendo ácido esteariodónico. Os óleos são de modo preferido obtidos a partir do tecido da semente da planta ou por extracção do óleo da referida semente da planta. Os óleos da semente possuem quantidades de SDA que variam entre 0,3% em peso a pelo menos 30% em peso, de modo preferido, entre 5% em peso a 28 ΡΕ1086236 pelo menos 25% em peso, de modo mais preferido entre 7% em peso a pelo menos 25% em peso.

PURIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GORDOS

Se for necessária purificação adicional, podem ser utilizados métodos convencionais. Tais métodos incluem extracção, tratamento com ureia, cristalização fraccionada, HPLC, destilação fraccionada, cromatografia em sílica gel, centrifugação ou destilação de alta velocidade, ou combinações destas técnicas. A protecção de grupos reac-tivos, tais como os grupos ácido ou alquenilo, pode ser efectuada durante qualquer passo através de técnicas conhecidas, por exemplo, alquilação ou iodinação. Os métodos utilizados incluem metilação dos ácidos gordos para produzir ésteres metílicos. De modo semelhante, os grupos de protecção podem ser removidos em qualquer passo. Desejavelmente, a purificação de fracções contendo ARA, DHA e EPA é conseguida por tratamento com ureia e/ou destilação fraccionada.

UTILIZAÇÕES DE ÁCIDOS GORDOS

As utilizações dos ácidos gordos da presente invenção são várias. As sondas com base nos DNAs da presente invenção podem ser úteis em métodos de isolamento de moléculas aparentadas ou em métodos de detecção de organismos que expressão dessaturases. Quando utilizados como sondas, os DNAs ou oligonucleótidos têm de ser detec- 29 ΡΕ1086236 táveis. Isto consegue-se normalmente ligando uma marcação quer num local interno, por exemplo, via incorporação de um residuo modificado, ou no terminal 5' ou 3'. Tais marcações podem ser detectáveis directamente, podem-se ligar a uma molécula secundária que está marcada, ou podem-se ligar a uma molécula secundária não marcada e a uma molécula terciária marcada, este processo pode ser estendido enquanto seja prático para se conseguir um sinal detectável satisfatoriamente sem níveis não aceitáveis de ruído. Os sistemas secundários, terciários, ou de ponte podem incluir a utilização de anticorpos dirigidos contra qualquer outra molécula, incluindo marcações ou outros anticorpos, ou podem envolver quaisquer moléculas que se ligam entre si, por exemplo, um sistema biotina-estreptavidina/avidina. As marcações detectáveis incluem tipicamente isótopos radioactivos, moléculas que quimicamente ou enzimaticamente produzem ou alteram luz, enzimas que produzem produtos de reacção detectáveis, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes ou moléculas cujas características de fluorescência ou de emissão de luz são alteradas após ligação. Podem ser encontrados exemplos de métodos de marcação na USPN 5 011 770. Alternativamente, a ligação de moléculas alvo pode ser detectada directamente medido a alteração no calor da solução aquando da ligação da sonda ao alvo via calorimetria isotermal de titulação, ou revestindo a sonda ou alvo numa superfície e detectando a alteração na dispersão da luz pela superfície produzida pela ligação, respectivamente, do alvo ou sonda, como pode ser efectuado com o sistema da BIAcore. 30 ΡΕ1086236 A invenção será melhor compreendida fazendo referência aos seguintes exemplos.

Exemplos

Exemplo 1

Expressão de ω-3 dessaturase de C. elegans em plantas transqénicas. A actividade Δΐ5/ω-3 de Brassica napus pode ser aumentada pela expressão de uma ω-3 dessaturase de C. elegans. O clone de cDNA fat-1 (Número de acesso do Genbank L41807; Spychalla, J. P., Kinney, A. J., e Browse, J. 1997 P.N.A.S. 94, 1142-1147) foi obtido de John Browse da

Washington State University. O clone de cDNA fat-1 foi modificado por PCR para introdução de sitios de clonagem utilizando os seguintes iniciadores:

Fat-lem sentido directo: 5'-CUACUACUACUACTGCAGACAATGGTCGCTCATTCCTCAGA-3' (SEQ ID NO:l) Fat-lem sentido reverso: 5'-CAUCAUCAUCAUGCGGCCGCTTACTTGGCCTTTGCCTT-3' (SEQ ID NO:2)

Estes iniciadores permitiram a amplificação completa da região codificante e adicionaram sitios PstI e NotI, respectivamente, às extremidades 5' e 3'. O produto 31 ΡΕ1086236 de PCR foi subclonado em pAMP 1 (GIBCOBRL) utilizando o sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para produzir pCGN5562. A sequência foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias para assegurar que não foram introduzida nenhumas alterações por PCR.

Foi observada uma diferença de um par de bases na região codificante de fat-1 de pCGN5562 vs. a sequência fat-1 do Genbank. 0 C na posição 705 da sequência fat-1 foi alterado para um A em pCGN5562. Isto provoca uma alteração de um codão GAC para um GAA, alterando o residuo Asp na posição 231 do fat-1 para um residuo Glu. Uma alteração idêntica foi observada produtos de duas reacções de PCR independentes utilizando como molde fat-1 e provavelmente não é o resultado de incorporação errada de um nucleótido durante a PCR. Para a expressão específica em semente, a região codificante Fat-1 foi cortada de pCGN5562 como um fragmento PstI/Notl e inserida entre os sítios PstI/Notl do vector binário, pCGN8623, para produzir pCGN5563. 0 PCGN5563 pode ser introduzido em Brassica napus via transformação mediada por Agrobacterium.

Construção de pCGN8623 A região de sítios múltiplos de ligação da cassete do promotor da napina, pCGN7770, foi substituída ligando os seguintes oligonucleótidos: 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO:3) e 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:4). Estes 32 ΡΕ1086236 oligonucleótidos foram ligados em pCGN7770 digerido com Sall/Xhol para produzir pCGN8619. Estes oligos codificam sítios de restrição BamEI, Notl, HindIII e PstI. O pCGN8619 possui os oligos orientados de tal modo que o sítio PstI se encontra mais perto da região reguladora da napina 5'. Foi removido um fragmento contendo a região reguladora da napina 5', sítios múltiplos de ligação, e a região napina 3' do pCGN8619 por digestão com Asp718I. As extremidades do fragmento foram tornadas rombas preenchendo as regiões proeminentes em 5' com fragmento de Klenow seguidamente ligados em pCGN5139 que tinha sido digerido com Asp718I e HindIII e as extremidades foram tornadas rombas preenchendo as regiões proeminentes em 5' com fragmento de Klenow. Um plasmídeo contendo a inserção orientada de tal modo que o promotor da napina estava mais perto do sítio Asp718I rombo do pCGN5139 e a napina 3' estava mais perto do sítio HindIII rombo foi sujeito a análise de sequência para confirmar tanto a orientação da inserção como a integridade das junções de clonagem. 0 plasmídeo resultante foi designado pCGN8623.

Para a produção de níveis elevados de ácido estearidónico em Brassica a ω-3 dessaturase de C. elegans pode ser combinada com Δ6- e Al2-dessaturases de Mortie-rella alpina. As plantas transformadas com PCGN5563 podem ser cruzadas com plantas transformadas com pCGN5544 que expressam as Δ6- e Al2-dessaturases, descritas em baixo.

As sementes F1 resultantes podem ser analisadas 33 ΡΕ1086236 para o conteúdo em ácido estearidónico e as plantas Fl seleccionadas podem ser utilizadas para auto polinização para produção de sementes F2, ou como dadoras para a produção de di-haplóides, ou cruzamentos adicionais.

Um método alternativo para combinar o cDNA de fat-1 com Δ6 e Δ12 dessaturases de M. alpina consiste em combiná-los num T-DNA para transformação. A região fat-1 codificante de pCGN5562 pode ser excisada como um fragmento PstI/Notl e inserida em pCGN8619 digerido com PstI/NotI. A unidade de transcrição que consiste na região reguladora da napina 5', a região codificante fat-1, e a região reguladora da napina 3' pode ser pode ser excisada como um fragmento Sse83871 e inserida em pCGN5544 cortado com Sse83871. O plasmideo resultante possuiria três unidades de transcrição da napina contendo uma ω-3 dessaturase de C. elegans, uma Δ6 dessaturase de M. alpina, e uma Δ12 dessaturase de M. alpina, todas orientadas na mesma direcção da unidade de transcrição 35S/nptII/tmI utilizada para selecção do tecido transformado.

Exemplo 2

Sobre-Expressão da actividade Al5-dessaturase em Canola Transgénica A actividade Δΐδ-dessaturase de Brassica napus pode ser aumentada por sobre-expressão do clone de cDNA de

Al5-dessaturase. 34 ΡΕ1086236

Foi obtido um clone de cDNA de Al5-dessaturase de B. napus por amplificação por PCR da primeira cadeia de cDNA derivado de B. napus cv. 212/86. Os iniciadores foram baseados na sequência publicada: Genbank N°. L01418 Arondel et al., 1992 Science 258: 1 353 - 1 355.

Foram utilizados os seguintes iniciadores:

BncL15-EM SENTIDO DIRECTO

5'-CUACUACUACUAGAGCTCAGCGATGGTTGTTGGTATGGAC-3' (SEQ ID NO:5) Bndl5-EM SENTIDO REVERSO 5'-CAUCAUCAUCAUGAATTCTTAATTGATTTTAGATTTG-3' (SEQ ID NO:6)

Estes iniciadores permitiram a amplificação completa da região codificante e a adição de sítios Saci e EcoRI, respectivamente, às extremidades 5' e 3'. O produto de PCR foi subclonado em pAMPl (GIBCOBRL) utilizando o sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para produzir pCGN5520. A sequência foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias para assegurar que a grelha de leitura aberta se manteve intacta. Para a expressão específica em sementes, a região codificante Δ15-dessaturase foi excisada do pCGN5520 como um fragmento BamRI/SalI e inserida entre os sítios BglII e Xhol do pCGN7770; para produzir pCGN5557. O fragmento PstI de 35 ΡΕ1086236 pCGN5557 contendo a região reguladora da napina 5' de Δ15-dessaturase de B. napus, e a região reguladora da napina 3' foi inserido no sitio PstI do vector binário, pCGN5138 para produzir pCGN5558. O pCGN5558 foi introduzido em Brassica napus via transformação mediada por Agrobacterium.

Para produzir níveis elevados de ácido esteari-dónico em Brassica, a Δΐδ-dessaturase pode ser combinada com Δ6- e Al2-dessaturases de Mortierella alpina. As plantas transformadas com PCGN5558 podem ser cruzadas com plantas transformadas com pCGN5544 que expressam a Δ6 e a Al2-dessaturases. As sementes F1 resultantes são analisadas para o conteúdo em ácido estearidónico. A análise GC-FAME de meias sementes F1 revelou uma acumulação significativa de SDA no óleo da semente das linhas de Brassica. Os níveis de SDA (18:4) maiores do que aproximadamente 25% foram obtidos em linhas hemizigóticas e são apresentados na Tabela I. Podem ser utilizadas plantas F1 seleccionadas para auto polinização para a produção de sementes F2, ou como dadoras para a produção de di-haplóides, ou cruzamentos adicionais. ΡΕ1086236 - 36 -

Tabela 1 ID da Estirpe 16:0 18:0 18:1 18:2 18:2 C912 18:3 18:3 C91215 18:3 C6912 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 22:1 22:2 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 6 1,34 2,97 9,58 9,58 52,79 34,76 18,03 25,21 0,7 0,56 0,16 0,41 0,03 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,45 0,86 10,42 9,06 9,06 49,08 25,68 23,4 23,45 0,5 0,84 0,55 0,49 0 0,03 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 5,8 2,36 12,5 11,13 11,13 47,47 18,86 28,61 17,55 1,01 0,86 0,3 0,85 0 0,07 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 3,65 0,66 14,26 14,97 14,97 50,94 23,3 27,64 13,22 0,43 0,88 0,23 0,48 0,04 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,86 2,42 18,74 14,23 14,23 46,22 23 23,22 10,67 0,89 0,92 0,18 0,7 0,02 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 6,57 1,07 16,79 14 14 48,98 32,88 16,09 10,24 0,52 0,94 0,22 0,39 0,02 0,01 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 5,85 2,09 8,81 19,12 19,12 50,89 12,03 38,86 9,09 1,39 0,78 0,45 1,23 0 0,04 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,69 2,04 17,46 21,1 21,1 43,38 24,28 19,1 8,5 0,73 0,96 0,37 0,56 0 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 5,43 1,69 16,59 22,2 22,2 44,4 16,57 27,83 6,34 0,9 1,03 0,32 0,81 0,03 0,05 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,28 1,34 18,83 27,24 27,24 40,54 20,91 19,63 5,03 0,73 0,88 0,27 0,7 0 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,47 1,38 21,43 26,89 26,89 39,04 18,78 20,26 4,06 0,73 0,91 0,41 0,48 0 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,77 1,12 18,4 31,1 31,1 38,51 19,62 18,88 3,52 0,64 0,8 0,21 0,7 0 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,34 1,86 24,73 35,49 35,49 28,79 10,79 18 1,91 0,67 1,07 0,45 0,48 0 0,02 ΡΕ1086236 - 37 - (continuação) ID da Estirpe* 16:0 18:0 18:1 18:2 18:2 C912 18:3 18:3 C91215 -ALA 18:3 C6912 - GLA 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 22:1 22:2 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,71 1,75 20,72 34,68 34,68 34,01 4,65 29,36 1,62 0,71 0,89 0,1 0,63 0 0 (5558-SP30021-26 X 5544-LP30108-6-16-1-3) 4,3 0,8 40,79 14,34 14,34 37 36,88 0,12 0 0,43 1,47 0,29 0,29 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-H) 6,61 1,5 22,09 11,23 11,23 39,9 25,84 14,06 16,25 0,75 0,75 0,27 0,57 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,64 1,89 22,73 15,12 15,12 44,48 32,21 12,27 8,78 0,73 0,89 0,23 0,43 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 5,51 1,45 24,82 17,79 17,79 41,84 27,46 14,38 6,45 0,59 0,82 0,23 0,39 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,06 1,67 26,39 16,93 16,93 42,64 32,65 9,99 6 0,64 0,96 0,24 0,41 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 5,24 1,44 22,2 20,02 20,02 42,76 28,69 14,07 5,98 0,67 0,79 0,26 0,45 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 5,34 2,2 22,68 18,6 18,6 43,14 31,45 11,69 5,5 0,82 0,87 0,25 0,53 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,98 2,9 25,23 21,21 21,21 38,78 24,6 14,18 4,98 1,02 1,04 0,24 0,57 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,94 1,77 28,92 20,89 20,89 37,02 21,71 15,32 4,96 0,64 1,09 0,3 0,43 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 5,12 1,24 27,7 19,02 19,02 40,2 31,05 9,16 4,76 0,48 0,77 0,23 0,35 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,16 1,52 28,59 21,99 21,99 36,85 23,33 13,53 4,55 0,6 0,98 0,27 0,41 0 0 (5558-SP30021-19 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,91 1,32 30,46 18,01 18,01 38,59 30,23 8,36 4,34 0,58 0,93 0,25 0,4 0 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,66 1,52 29,52 20,52 20,52 36,61 20,09 16,52 5,63 0,67 1,12 0,14 0,52 0 0 ΡΕ1086236 - 38 - (continuação) ID da Estirpe* 16:0 18:0 18:1 18:2 18:2 C912 18:3 18:3 C91215 -ALA 18:3 C6912 -GLA 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 22:1 22:2 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 5,09 1,81 25,81 21,54 21,54 38,2 22,52 15,68 4,92 0,75 0,96 0,12 0,57 0,02 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,77 1,5 29,79 22,36 22,36 35,46 14,84 20,62 4,39 0,74 1,17 0,18 0,59 0,02 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,71 1,45 32,18 23,86 23,86 32,32 17 15,32 3,92 0,63 1,12 0,15 0,5 0,02 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,55 1,56 33,27 25,21 25,21 30,69 16,63 14,06 3,08 0,68 1,2 0,16 0,54 0,03 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,04 1,52 33,63 24,47 24,47 30,72 18,19 12,53 3,07 0,63 1,17 0,14 0,46 0 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,67 1,58 31,98 26,13 26,13 30,89 15,92 14,97 3,05 0,69 1,21 0,16 0,51 0 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,58 1,8 30,2 27,22 27,22 31,42 15,48 15,94 2,85 0,79 1,21 0,17 0,61 0,02 0,01 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 4,68 1,41 28,32 28 28 32,22 14,92 17,3 2,74 0,65 U 0,18 0,53 0,01 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,5 1,46 34,13 25,92 25,92 29,7 16,77 12,93 2,65 0,67 1,26 0,15 0,51 0,01 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,9 1,68 33,44 26,18 26,18 29,43 16,1 13,31 2,6 0,72 1,23 0,18 0,5 0,02 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-H6-1-1) 3,82 1,71 31,84 27,78 27,78 29,49 15,28 14,2 2,59 0,73 1,19 0,16 0,55 0,02 0 (5558-SP30021-36 X 5544-LP30108-6-16-1-1) 3,6 1,78 29,45 28,14 28,14 31,64 12,83 18,81 2,57 0,76 1,21 0,17 0,58 0 0 39 ΡΕ1086236

Um método alternativo para combinar a Δ15-dessaturase de B. napus com as Δ6 e Δ12 dessaturases de M. alpina é combiná-las num T-DNA para transformação. A cassete de transcrição consistindo na região reguladora da napina 5', na região codificante Al5-dessaturase, e na região reguladora da napina 3' pode ser excisada do pCGN5557 como um fragmento Swal e inserida em pCGN5544 digerido com Swal. O plasmideo resultante, pCGN5561, possui três unidades de transcrição da napina contendo a Δβ dessaturase de M. alpina, a Al5-dessaturase de B. napus, e aAl2 dessaturase de M. alpina, todas orientadas na mesma direcção do que a unidade de transcrição 35S/nptll/tml utilizada para a selecção do tecido transformado. Adicionalmente, a sequência codificante de ω-3 dessaturase de C. elegans foi também clonada no pCGN5544 para produzir a construção pCGN5565.

Um conjunto de sementes T2 de plantas contendo 5561 possui quantidades significativa de SDA (18:4), apresentado na Tabela 2. Os níveis superiores a cerca de 7% de SDA são obtidos em conjuntos de sementes que segregam 5561. Adicionalmente, foram obtidos níveis significativos de SDA a partir de sementes de linhas 5565 de Brassica, também apresentado na Tabela 2. Como apresentado na Tabela 2 com as construções 5561 e 5565, podem ser obtidos níveis de SDA entre cerca de 0,8% em peso a mais do que cerca de 7% em peso. ΡΕ1086236 40

Tabela 2 ID da Estirpe 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 C6, 9 18:2 C6,12 18:3 C6, 9,12 18:3 C9,12,15 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 22:1 22:2 55561-6 4,46 0,21 3,5 22,85 0 18,33 18,71 21,61 7,79 1,04 0,76 0,19 0,47 0 0 55561-4 4,14 0,15 2, 62 33,07 0 21,07 17,61 14,56 4,39 0,87 0, 92 0,14 0,39 0 0,02 55561-2 4,26 0,15 2,21 30,42 0 22,02 21,06 12,88 4,25 0,89 0,98 0,2 0,51 0 0,02 55561-8 4,29 0,18 2 33,05 0 22,44 16,23 15,3 3,95 0,84 0, 96 0,19 0,43 0 0,04 55561-3 3,95 0,12 2,04 32, 93 0 24,48 17,42 13,33 3,27 0,79 0, 94 0,21 0,4 0,03 0,03 55561-7 4,26 0,17 2,02 38,4 0 23,3 13,35 13,3 2,73 0,75 1,06 0,16 0,41 0 0 55561-13 4,38 0,18 1,86 58, 94 0,65 13,98 7,1 8,26 1,88 0,77 1,27 0,29 0,35 0,03 0 55561-15 4,29 0,15 2,3 40,96 0 26,63 8,58 12,98 1,51 0,83 1,07 0,19 0,45 0 0,02 55561-1 4,25 0,15 1, 91 47,41 0 24,46 5,56 12,81 1 0,72 1,14 0,15 0,39 0 0 55561-5 4,07 0,16 1,96 52,29 0 20,88 5,02 12,17 0,97 0,72 1,16 0,21 0,28 0 0,06 CONTROLC 3,89 0,21 1, 65 58,48 0 22,44 0 11,03 0 0,6 1,15 0,16 0,27 0,01 0 (Tabela 2 - continuação) ID da Estirpe 16:0 18:0 18:1 18:2 069 18:2 LA 18:3 GLA 18:3 ALA 18:4 20:0 5565-SP30021-7 4,03 1,93 41,24 0,43 14,46 21,39 6, 62 7,38 0, 68 5565-SP30021-12 3,95 2,46 40,19 0 30,35 7,3 10, 92 2,57 0,7 5565-SP30021-9 4,03 1,82 35,76 0 33,49 8,63 11,58 2,54 0,51 5565-SP30021-3 3,86 1,8 32,3 0 35,57 11,3 10,05 2,37 0, 61 55 65—SP3 0021—1 3,98 1,92 59,99 1,84 11,24 8,07 7,46 2,32 0,76 5565-SP30021-8 4,67 1,72 38,95 0 30,38 8,99 10,83 2,25 0,52 5565-SP30021-10 4,03 1,43 47,04 0 26,96 5,97 11,1 1,35 0,52 5565-SP30021-6 3,87 1,77 46,73 0 28,79 5,31 10,4 0,79 0,56 CONTROLO 3,89 1,65 58,48 0 22,44 0 11,03 0 0,6

Exemplo 3 (Exemplo Referência)

Expressão de Δ5 Dessaturase em Plantas que Expressam nas

Folhas A Ma29 é uma Δ5 dessaturase de M. alpina puta- 41 ΡΕ1086236 tiva, como determinado por homologia de sequências. Esta experiência foi concebida para determinar se as folhas que expressam Ma29 (como determinado por Northern) possuíam a capacidade de converter DGLA (20:3) aplicado exogenamente em ARA (20:4) . O cDNA da Ma29 dessaturase foi modificado por PCR para introdução de sítios de restrição convenientes para clonagem. A região codificante da dessaturase foi inserida numa cassete d35 sob o controlo do promotor duplo 35S para a expressão em folhas de Brassica (pCGN5525) de acordo protocolos convencionais (ver USPN 5 424 200 e USPN 5 106 739). As plantas Brassica transgénicas contendo o pCGN5525 foram produzidas de acordo com protocolos convencionais (ver USPN 5 188 958 e USPN 5 463 174).

Na primeira experiência foram utilizadas três plantas: um controlo, LP004-1, e duas transgénicas, 5525-23 e 5525-29. A LP004 é uma variedade de Brassica com baixo linolénico. Foram seleccionadas folhas de cada para um dos três tratamentos: água, GLA ou DGLA. O GLA e DGLA foram adquiridos como sais de sódio à NuChek Prep e dissolvidos em água a 1 mg/mL. As alíquotas foram protegidas com N2 e armazenadas a -70 graus C. As folhas foram tratadas aplicando uma gota de 50 pL à superfície superior e espalhando cuidadosamente com um dedo protegido com uma luva para cobrir completamente a superfície. As aplicações foram efectuadas aproximadamente 30 minutos antes do fim do 42 ΡΕ1086236 ciclo de luz para minimização de qualquer foto-oxidação dos ácidos gordos aplicados. Após 6 dias de tratamento foi colhida uma folha de cada tratamento e cortada a meio pelo veio central. Uma das metades foi lavada com água para se tentar remover o ácido gordo não incorporado. As amostras de folha foram liofilizadas durante a noite, e a composição de ácidos gordos foi determinada por cromatografia de gás (GC). Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Análise de Ácidos Gordos de Folhas de Plantas Transgénicas de Brassica Ma29

Tratamento AMO 16:00 16:01 18:00 18:01 18:02 18:3g 18:03 18:04 20:00 20:01 N° % % % % % % % % % % Água 33 12,95 0,08 2,63 2,51 16, 76 0 45,52 0 0,09 0 34 13,00 0,09 2, 67 2,56 16,86 0 44,59 0 0,15 0 35 14,13 0,09 2,37 2,15 16, 71 0 49, 91 0 0,05 0,01 36 13, 92 0,08 2,32 2, 07 16,16 0 50,25 0 0,05 0 37 13,79 0,11 2,10 2,12 15, 90 0,08 46,29 0 0,54 0,01 38 12,80 0,09 1, 94 2, 08 14,54 0,11 45, 61 0 0,49 0,01 GLA 39 12,10 0,09 2,37 2,10 14,85 1,63 43, 66 0 0,53 0 40 12,78 0,10 2,34 2,22 15,29 1,72 47,22 0 0,50 0,02 41 13,71 0,07 2, 68 2,16 15, 92 2,12 46,55 0 0,09 0 42 14,10 0,07 2,75 2,35 16, 66 1,56 46, 41 0 0,09 0,01 43 13, 62 0,09 2,22 1, 94 14, 68 2, 42 46, 69 0 0,51 0,01 44 13, 92 0,09 2,20 2,17 15, 22 2,30 46,05 0 0,53 0,02 DGLA 45 12,45 0,14 2,30 2,28 15, 65 0,07 44,62 0 0,12 0,01 46 12, 67 0,15 2, 69 2,50 15, 96 0,09 42,77 0 0,56 0,01 47 12,56 0,23 3,40 1, 98 13, 57 0,03 45,52 0 0,51 0,01 48 13,07 0,24 3, 60 2,51 13,54 0,04 45,13 0 0,50 0,01 49 13,26 0,07 2,81 2,34 16, 04 0,04 43,89 0 0,59 0 50 13,53 0,07 2,84 2,41 16, 07 0,02 44,90 0 0, 60 0,01 ΡΕ1086236 43

Tabela 3 - Continuação

Análise de Ácidos Gordos de Folhas de Plantas Transgénicas de Brassica Ma29

Tratamento AMO 20:02 20:03 20:04 20:05 22:00 22:01 22:02 22:03 22:06 24:0 24:1 N° % % % % % % % % % % Agua 33 0 0 0,29 0 0, 01 0,09 16,26 0 0 0,38 0, 18 34 0,01 0 0,26 0 0, 14 0,10 16,82 0,02 0,05 0,36 0,27 35 0,01 0 0,25 0 0,12 0,06 11,29 0,04 0,05 0,29 0,25 36 0 0,01 0,26 0 0, 07 0,04 11,82 0,03 0,36 0,28 0,21 37 0,02 0 0,21 0 0,18 0,08 15,87 0,06 0,20 0,30 0,17 38 0,01 0 0,24 0 0,15 0,07 13, 64 0,09 0,08 5,89 0,23 GLA 39 0,02 0,01 0,27 0 0,10 0,08 16,25 3,42 0,19 0,37 0,17 40 0,01 0 0,27 0 0,10 0,10 14, 74 0,05 0,10 0,36 0,14 41 0 0 0,27 0 0, 20 0,10 13,15 0,13 0,29 0,33 0,20 42 0 0 0,28 0 0, 11 0,11 12, 60 0,02 0,24 0,38 0,13 43 0,01 0 0,28 0 0,10 0,03 14,73 0,01 0,24 0,34 0, 14 44 0,02 0 0,26 0 0, 13 0,07 14,43 0,05 0,16 0,33 0,17 DGLA 45 0,06 1,21 0,26 0 0, 07 0,07 18, 67 0,02 0,21 0,36 0,13 46 0 1, 94 0,27 0 0, 11 0,09 17, 97 0,09 0,39 0,41 0, 11 47 0,01 0, 69 0, 96 0 0,11 0,07 17, 96 0 0,22 0,49 0,20 48 0,01 0,70 0, 74 0 0, 14 0,09 17,14 0,05 0,32 0,52 0,10 49 0 0,35 1, 11 0 0, 10 0,07 17,26 0,07 0,23 0,39 0,18 50 0 0,20 0, 87 0 0,21 0,07 15,73 0,04 0,15 0,37 0,18

As folhas tratadas com GLA possuíam entre 1,56 a 2,4% em peso de GLA. A análise de ácidos gordos demonstrou que a composição lipídica de folhas controlo e transgénica era essencialmente a mesma. As folhas de plantas controlo tratadas com DGLA possuíam 1,2-1,9 w% de DGLA e quantidades de ARA de fundo (0,26-0,27% em peso). As folhas transgénicas possuíam apenas 0,2-0,7% em peso de DGLA, mas os níveis de ARA eram superiores (0,74-1,1% em peso) o que indica que o DGLA foi nestas folhas convertido em ARA. 44 ΡΕ1086236

Expressão na Semente 0 objectivo desta experiência foi determinar se uma construção com o promotor da napina especifico da semente permitiria a expressão em sementes. O cDNA Ma29 foi modificado por PCR para a introdução de sítios de clonagem Xhol a montante e a jusante, respectivamente, dos codões de iniciação e terminação utilizando os seguintes iniciadores:

Madxho-em sentido directo: 5'-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG (SEQ ID NO:7)

Madxho-em sentido reverso: 5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG (SEQ ID NO:8) 0 produto de PCR foi subclonado em pAMPl (GIBCOBRL) utilizando o sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para produzir pCGN5522 e a sequência de Δ5 dessaturase foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias.

Para a expressão específica em sementes, a região codificante Ma29 foi excisada do pCGN5522 como um fragmento XhoI e foi inserida no sítio SalI da cassete de expressão da napina, pCGN3223, para produzir pCGN5528. 0 fragmento HindIII de pCGN5528 contendo a região reguladora da napina 5', a região codificante Ma29, e a região reguladora da 45 ΡΕ1086236 napina 3' foi inserido no sitio HindiII de pCGN1557 para produzir pCGN5531. Foram inseridas em tandem duas cópias da unidade de transcrição da napina. Esta construção em tandem pode permitir expressão aumentada da dessaturases por loci genético. O pCGN5531 foi introduzido em Brassica napus cv.LP004 via transformação mediada por Agrobacterium. A composição de ácidos gordos de vinte grupos de sementes de sementes T2 maduras foi analisada por GC. A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos com linhas transformadas independentemente comparados com sementes LP004 não transformadas. As sementes transgénicas contendo pCGN5531 possuem dois ácidos gordos que não estão presentes nas sementes controlo, identificados como ácido taxoleico (5,9-18:2) e pinolénico ácido (5,9,12-18:3), com base na sua eluição relativa ao ácido oleico e linoleico. Estes seriam os produtos esperados da Δ5 dessaturação dos ácidos oleico e linoleico. Não foram observadas outras diferenças na composição de ácidos gordos nas sementes transgénicas.

Exemplo 4 (Exemplo Referência)

Produção de Ácidos Gordos D5-dessaturados em Plantas Transgénicas A construção de pCGN5531 (A5-dessaturase) e a composição de ácidos gordos de grupos de sementes T2 são descritas no Exemplo 3. Neste exemplo as sementes são mantidas durante mais uma geração e são discutidos meios de maximizar os ácidos gordos A5-dessaturados. 46 ΡΕ1086236 O Exemplo 3 descreve a composição de ácidos gordos de grupos de sementes T2 de plantas B. napus cv. LP004 transformadas com pCGN5531. Para investigar a segregação de ácidos gordos A5-dessaturados nas sementes T2 e para a identificação de plantas individuais para serem mantidas em gerações subsequentes, procedeu-se à análise de meias sementes. As sementes foram germinadas durante a noite em escuridão a 30 graus em papel de filtro embebido em água. 0 cotiledónio exterior foi excisado para análise por GC e o resto da semente germinada foi plantado no solo. Os resultados de algumas destas análises são apresentados na Tabela 4. 0 Δ5,9-18:2 acumulou-se até valores tão elevados como 12% dos ácidos gordos totais e ο Δ5,9,12-18:3 acumulou-se até 0,77% dos ácidos gordos. Estas e outras plantas T2 individualmente seleccionadas foram cultivadas na estufa para produzirem sementes T3.

Tabela 4

Composição do grupo de Sementes T2 16:0 % 16:1 % 18:0 % 18:1 % Δ5,9 18:2 % 18:2 % Δ5,9,12 18:3 % 18:3 % 20:0 % 20:1 % 20:2 % 22:0 % 22:1 % 24:0 % Controlo LP004 3, 86 0,15 3,05 69,1 0 18,51 0,01 1,65 1,09 1,40 0,03 0, 63 0,05 0,42 5531-1 4,26 0,15 3,23 62,33 4,07 21,44 0,33 1,38 0, 91 1,04 0,05 0,41 0,03 0,27 5531-2 3, 78 0,14 3,37 66,18 4,57 17,31 0,27 1,30 1,03 1,18 0 0,47 0,01 0,30 5531-6 3, 78 0,13 3,47 63, 61 6,21 17,97 0,38 1,34 1, 04 1,14 0,05 0,49 0,02 0,26 5531-10 3, 96 0,17 3,28 63,82 5,41 18,58 0,32 1,43 0, 98 1,11 0,02 0,50 0 0,31 5531-16 3, 91 0,17 3,33 64,31 5,03 18,98 0,33 1,39 0, 96 1,11 0 0,44 0 0 5531-28 3,81 0,13 2,58 62, 64 5,36 20,95 0,45 1,39 0, 83 1,15 0,01 0,36 0,05 0,21 47 ΡΕ1086236

Tabela 4

Análise de ácidos gordos de meias sementes T2 seleccionadas de eventos pCGN5531-LP004 ID do Ciclo N° Amostra ID da Estirpe 12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 Δ5,9 18:2 Δ9,12 18:3 Δ5,9,12 18:3 Δ9,12,15 97XX1539 93 5531-LP004-6 0,03 0,07 3,92 0,17 3,5 61,32 12,22 15,36 0,77 1,36 97XX1539 29 5531-LP004-6 0,01 0,04 3,6 0,09 3,23 63,77 10,63 14,47 0 1,22 97XX1539 38 5531-LP004-6 0,01 0,05 3,71 0,09 3,02 65,13 10,57 13,98 0 1,06 97XX1539 41 5531-LP004-6 0,01 0,05 3,64 0,07 3,22 62,51 9,7 16,63 0 1,28 97XX1539 18 5531-LP004-6 0,02 0,06 3,69 0,09 3,36 63,79 9,63 15,29 0,63 1,15 97XX1539 85 5531-LP004-6 0,01 0,06 3,6 0,09 3,54 64,81 9,54 13,69 0,6 1,26 98GC0023 98 5531-LP004-23 0,01 0,05 3,5 0,09 3,12 64,97 9,92 13,62 0,55 1,25 98GC0023 32 5531-LP004-23 0,01 0,05 3,43 0,08 2,62 65,21 9,83 14,28 0,59 1,15 98GC0023 78 5531-LP004-23 0,01 0,05 3,45 0,07 2,78 64,97 9,34 14,69 0,58 1,17 98GC0023 86 5531-LP004-23 0,01 0,05 3,32 0,08 2,7 64,18 9,08 15,99 0, 68 1,18 98GC0023 67 5531-LP004-23 0,01 0,04 3,49 0,08 3,03 64,14 8,78 15,95 0,62 1,08 98GC0023 52 5531-LP004-23 0,01 0,03 3,38 0,07 2,56 67,44 8,65 13,55 0,5 1,02

Para maximizar a acumulação de Δ5,9 18:2 no óleo da semente, a construção pCGN5531 pode ser introduzida numa variedade de canola rica em ácido oleico. Pode ser obtida uma variedade rica em ácido oleico por mutação, por co-supressão ou supressão anti-sentido das Δ12 e Δ15 dessaturases ou de outros co-factores necessários.

Para maximizar a acumulação de Δ5,9,12 18:3 em canola, a construção pCGN5531 pode ser introduzida numa estirpe de canola rica em linoleico. Isto pode-se conseguir cruzando plantas transformadas com pCGN5531 com plantas transformadas com pCGN5542- (A12-dessaturase de M. alpina) transformada plantas. Alternativamente, as Δ5 e Δ12 dessaturases podem ser combinadas num T-DNA para transformação. 48 ΡΕ1086236 A unidade de transcrição que consiste numa região reguladora da napina 5', numa região codificante de Δ12-dessaturase de M. alpina, e numa região reguladora da napina 3' pode ser excisada de pCGN5541 como um fragmento NotI. Os ligantes Notl/Xbal podem ser ligados e o fragmento resultante inserido no sitio xbal do pCGN5531. O plasmídeo resultante possuirá três unidades de transcrição da napina contendo a Δ12 dessaturase de M. alpina, e duas cópias da unidade napinaMó dessaturase de M. alpina/napina, todas orientadas na mesma direcção que a unidade de transcrição 35S/nptII/tmI utilizada para a selecção do tecido transformado.

Exemplo 5

Expressão de Δ6 Dessaturase de M. alpina em Brassica napus

Foi obtida uma sequência de ácido nucleico de um clone parcial de cDNA Ma524, que codifica uma Δ6 dessaturase de ácido gordo de Mortíerella alpina por sequen-ciação aleatória de clones da biblioteca de cDNA de M. alpina. O cDNA Ma524 foi modificado por PCR para introdução de sítios de clonagem utilizando os seguintes iniciadores:

Ma524PCR-l 5'-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCT CCAGTGTG (SEQ ID NO:9) Ma524PCR-2 5'-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT (SEQ ID NO:10) 49 ΡΕ1086236

Estes iniciadores permitiram a amplificação completa da região codificante e adicionaram sitios Xbal e Xhol à extremidade 5' e sitios Xhol e StuI à extremidade 3'. 0 produto de PCR foi subclonado em pAMPl (GIBCOBRL) utilizando o sistema CloneAmp (GIBCOBRL) para produzir pCGN5535 e a sequência de Δ6 dessaturase foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias.

Construção de pCGN5544

As construções para expressão em plantas foram preparadas para expressarem a Δ6 dessaturase de Mortierella alpina e a Δ12 dessaturase de Mortierella alpina numa célula hospedeira vegetal. As construções preparadas utilizaram regiões de iniciação da transcrição derivadas de genes expressos preferencialmente numa semente de uma planta. 0 isolamento das sequências de cDNA que codificam a Δ6 dessaturase de M. alpina e a Δ12 dessaturase de M. alpina é descrito nos documentos WO 98/46763 e WO 98/46764.

Para a expressão especifica em sementes, a região codificante Ma524 foi excisada do pCGN5535 como um fragmento Xhol e inserida no sitio Sal I da cassete de expressão da napina, pCGN3223, para produzir pCGN5536. O fragmento Not I de pCGN5536 contendo a região reguladora napina 5', a região codificante Ma524, e a região reguladora da napina 3' foi inserido no sitio NotI do pCGN 1557 para produzir pCGN5538. 50 ΡΕ1086236 O cDNA 5542, que codifica a Δ12 dessaturase de M. alpina, foi modificado por PCR para a introdução sítios de clonagem utilizando os seguintes iniciadores:

Ma648PCR-for 5'-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACACT (SEQ ID NO:11) Ma648PCR-for 5'-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC (SEQ ID NO:12)

Estes iniciadores permitiram a amplificação completa da região codificante e adicionaram um sítio BamHI à extremidade 5' e sítios Kpnl e Xhol à extremidade 3'. O produto de PCR foi subclonado em pAMPl (Gibco-BRL, Gaithersburg. MD) utilizando o sistema CloneAmp (Gibco-BRL) para produzir pCGN5540, e a sequência da Δ12 dessaturase foi verificada por sequenciação de ambas as cadeias.

Foi preparada uma construção de expressão preferencial em sementes para a sequência de cDNA da Δ12 dessaturase. A região codificante Ma648 foi excisada do pCGN5540 como um fragmento BamHI/Xhol e inserida entre os sítios BglII e Xhol da cassete de expressão da napina, pCGN3223 (descrito em USPN 5 639 790), para produzir pCGN5542.

De modo a expressar as sequências Δ6 e Δ12 dessaturase de M. alpina a partir do mesmo T-DNA, foi preparada a seguinte construção para expressão preferencial em sementes. 51 ΡΕ1086236 O fragmento NotI de pCGN5536 contendo a região de iniciação da transcrição da napina 5', a região codificante Ma524, e região de terminação da transcrição da napina 3' foi inserido no sitio NotI de pCGN5542 para produzir pCGN5544. As cassetes de expressão foram orientadas de tal modo que a direcção de transcrição a partir de Ma524 e Ma648 e do marcador nptll é a mesma.

Para a expressão especifica em sementes, a região codificante Ma524 foi excisada do pCGN5535 como um fragmento Xhol e inserida no sitio Sall da cassete de expressão da napina, pCGN3223, para produzir pCGN5536. 0 fragmento NotI do pCGN5536 contendo a região reguladora napina 5', a região codificante Ma524, e a região reguladora napina 3' foi inserido no sitio NotI do pCGN1557 para produzir pCGN5538. 0 pCGN5538 foi introduzido em Brassica napus cv.LP004 via transformação mediada por Agrobacterium.

Foram recolhidas na estufa sementes T2 em maturação a partir de 6 eventos independentes de transformação. A composição de ácidos gordos de sementes singulares foi analisada por GC. A Tabela 5 apresenta os resultados das sementes controlo LP004 e de seis linhas 5538. Todas as linhas 5538, excepto a n° 8, produziram sementes contendo GLA. A presença de GLA evidenciou-se nestas sementes como é esperado para a população de sementes T2 de auto-polinização. Para além de GLA, a Δ6 dessaturase de M. alpina tem a capacidade de produzir ácido gordo 18:4 (estearidónico) e outro ácido gordo: Δ6,9-18:2. - 52 - ΡΕ1086236

Tabela 5 Análise de ácidos gordos de Sementes de Plantas Brassica Ma524 Transgénicas AMO 16:0 16:1 18:0 18:1 6,9 18:2 18:2 18:3ga 18:3 18:4 20:1 22:0 22:1 24:0 24:1 N° *0 *0 *0 *0 *0 *0 *0 *0 0, 0, 0, 0, 0, LP004-1 4,33 0,21 3,78 72,49 0 13,97 0 1,7 0 1,34 0,71 0,02 0,58 0,27 -2 4,01 0,16 3,09 73,59 0 14,36 0,01 1,4 0 1,43 0,66 0,02 0,5 0,2 -3 4,12 0,19 3,56 70,25 0 17,28 0 1,57 0 1,28 0,5 0,02 0,39 0,2 -4 4,22 0,2 2,7 70,25 0 17,86 0 1,61 0 1,31 0,53 0,02 0,4 0,24 -5 4,02 0,16 3,41 72,91 0 14,45 0,01 1,45 0 1,37 0,7 0,02 0,51 0,26 -6 4,22 0,18 3,23 71,47 0 15,92 0,01 1,52 0 1,32 0,69 0,02 0,51 0,27 -7 4,1 0,16 3,47 72,06 0 15,23 0 1,52 0 1,32 0,63 0,03 0,49 0,23 -9 4,01 0,17 3,71 72,98 0 13,97 0,01 1,41 0 1,45 0,74 0,03 0,58 0,23 -10 4,04 0,16 3,57 70,03 0 17,40 0 1,5 0 1,33 0,61 0,03 0,36 0,24 5538-1-1 4,61 0,2 3,48 68,12 1,37 10,68 7,48 1,04 0,33 1,19 0,49 0,02 0,33 0,13 -2 4,61 0,22 3,46 68,84 1,36 10,28 7,04 1,01 0,31 1,15 0,48 0,02 0,39 0 -3 4,78 0,24 3,24 65,86 0 21,36 0 1,49 0 1,08 0,46 0,02 0,38 0,22 -4 4,84 0,3 3,89 67,64 1,67 9,9 6,97 1,02 0,36 1,14 0,53 0,02 0,5 0,18 -5 4,64 0,2 3,58 64,5 3,61 8,85 10,14 0,95 0,48 1,19 0,47 0,01 0,31 0,12 -6 4,91 0,27 3,44 66,51 1,48 11,14 7,74 1,15 0,33 1,08 0,49 0,02 0,34 0,13 -7 4,87 0,22 3,24 65,78 1,27 11,92 8,38 1,2 0 1,12 0,47 0,02 0,37 0,16 -8 4,59 0,22 3,4 70,77 0 16,71 0 1,35 0 1,14 0,48 0,02 0,39 0,15 -9 4,63 0,23 3,51 69,66 2,01 8,77 7,24 0,97 0 1,18 0,52 0,02 0,3 0,11 -10 4,56 0,19 3,55 70,68 0 16,89 0 1,37 0 1,22 0,54 0,02 0,22 0,03 5538-3-1 4,74 0,21 3,43 67,52 1,29 10,91 7,77 1,03 0,28 1,11 0,5 0,02 0,35 0,14 - 53 - ΡΕ1086236 (continuação) N° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0. 0. 0. 0. -2 4,72 0,21 3,24 67,42 1,63 10,37 U 0,99 0 1,12 0,49 0,02 0,36 0,15 -3 4,24 0,21 3,52 71,31 0 16,53 0 1,33 0 1,12 0,45 0,02 0,4 0,14 -4 4,64 0,21 3,45 67,92 1,65 9,91 7,97 0,91 0,33 1,14 0,47 0,02 0,37 0,14 -5 4,91 0,25 3,31 67,19 0 19,92 0,01 1,39 0 1,05 0,48 0,02 0,37 0,14 -6 4,67 0,21 3,25 67,07 1,23 11,32 8,35 0,99 0 1,16 0,47 0,02 0,33 0,16 -7 4,53 0,19 2,94 64,8 4,94 8,45 9,95 0,93 0,44 1,13 0,37 0,01 0,27 0,12 -8 4,66 0,22 3,68 67,33 0,71 12 6,99 1,1 0,24 1,18 0,48 0,03 0,36 0,17 -9 4,65 0,24 3,11 67,42 0,64 12,71 6,93 1,16 0,25 1,08 0,45 0,02 0,32 0,17 -10 4,88 0,27 3,33 65,75 0,86 12,89 7,7 1,1 0,24 1,08 0,46 0,01 0,34 0,16 5538-4-1 4,65 0,24 3,8 62,41 0 r-o oo 0 M 0,01 0,99 0,45 0,02 0,33 0,13 -2 5,37 0,31 3 57,98 0,38 18,04 10,5 1,41 0 0,99 0,48 0,02 0,3 0,19 -3 4,61 0,22 3,07 63,62 0,3 16,46 7,67 1,2 0 1,18 0,45 0,02 0,29 0,14 -4 4,39 0,19 2,93 65,97 0 22,36 0 1,45 0 1,17 0,41 0,03 0,32 0,15 -5 5,22 0,29 3,85 62,1 2,35 10,25 11,39 0,93 0,41 1,04 0,6 0,02 0,47 0,17 -6 4,66 0,18 2,85 66,79 0,5 13,03 7,66 0,97 0,22 1,28 0,42 0,02 0,31 0,14 -7 4,85 0,26 3,03 57,43 0,26 28,04 0,01 2,59 0,01 1,13 0,56 0,02 0,4 0,23 -8 5,43 0,28 2,94 54,8 1,84 13,79 15,67 1,36 0,53 1,1 0,55 0,02 0,35 0,19 -9 4,88 0,24 3,32 62,3 0,58 14,86 9,04 1,34 0,29 1,13 0,52 0,02 0,37 0,19 -10 4,53 0,2 2,73 64,2 0,07 24,15 0 1,52 0 1,09 0,39 0,02 0,27 0,17 5538-5-1 4,5 0,15 3,35 66,71 0,88 11,7 8,38 1,04 0,3 1,24 0,49 0,02 0,29 0,17 -2 4,77 0,23 3,06 62,67 0,68 15,2 8,8 1,31 0,28 1,15 0,46 0,02 0,3 0,19 -3 4,59 0,22 3,61 64,35 2,29 9,95 10,57 1,01 0,45 1,21 0,48 0,02 0,26 0,16 -4 4,86 0,26 3,4 67,69 0,65 12,24 6,61 1,09 0,23 1,07 0,45 0,02 0,32 0,14 -5 4,49 0,21 3,3 69,25 0,04 16,51 2,18 1,2 0 1,11 0,44 0,02 0,33 0,16 - 54 - ΡΕ1086236 (continuação) N° 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0. 0. 0. 0. -6 4,5 0,21 3,47 70,48 0,08 14,9 2,19 1,22 0 1,13 0,49 0,02 0,33 0,16 -7 4,39 0,21 3,44 67,59 2,38 9,24 8,98 0,89 0 1,18 0,44 0,02 0,28 0,14 -8 4,52 0,22 3,17 68,33 0,01 18,91 0,73 1,32 0,01 1,08 0,45 0,02 0,29 0,17 -9 4,68 0,2 3,05 64,03 1,93 11,03 11,41 1,02 0,01 1,15 0,39 0,02 0,21 0,15 -10 4,57 0,2 3,1 67,21 0,61 12,62 7,68 1,07 0,25 1,14 0,43 0,02 0,25 0,15 5538-8-1 4,95 0,26 3,14 64,04 0 23,38 0 1,54 0 0,99 0,42 0,02 0,38 0,17 -2 4,91 0,26 3,71 62,33 0 23,97 0 1,77 0 0,95 0,53 0,02 0,42 0,19 -3 4,73 0,25 4,04 63,83 0 22,36 0,01 1,73 0 1,05 0,55 0,02 0,45 0,16 -4 5,1 0,35 3,8 60,45 0 24,45 0,01 2,13 0 1,07 0,65 0,03 0,53 0,24 -5 4,98 0,3 3,91 I^> oo 0 23,44 0 1,77 0 1,01 0,51 0,01 0,43 0,21 -6 4,62 0,21 3,99 66,14 0 20,38 0 1,48 0 1,15 0,53 0,02 0,48 0,19 -7 4,64 0,22 3,55 64,6 0 22,65 0 1,38 0 1,09 0,45 0,02 0,41 0,19 -8 5,65 0,38 3,18 56,6 0 30,83 0,02 0,02 0 0,98 0,55 0,03 0,39 0,26 -9 8,53 0,63 6,9 51,76 0 26,01 0 0,01 0 1,41 1,21 0,07 0,96 0,33 -10 5,52 0,4 3,97 57,92 0 28,95 0 0,02 0 0,95 0,52 0,02 0,41 0,16 5538-10-1 4,44 0,19 3,5 68,42 0 19,51 0 1,32 0 1,14 0,45 0,02 0,31 0,16 -2 4,57 0,21 3,07 66,08 0 21,99 0,01 1,36 0 1,12 0,41 0,02 0,31 0,16 -3 4,63 0,21 3,48 67,43 0 20,27 0,01 1,32 0 1,12 0,46 0,02 0,21 0,08 -4 4,69 0,19 3,22 64,62 0 23,16 0 1,35 0 1,08 0,46 0,02 0,33 0,2 -5 4,58 0,2 3,4 68,75 0 20,17 0,01 0,02 0 1,1 0,45 0,02 0,34 0,17 -8 4,55 0,21 0 73,55 0,05 14,91 2,76 1,21 0,07 1,24 0,51 0,02 0,19 0 -9 4,58 0,21 3,28 66,19 0 21,55 0 1,35 0 1,12 0,43 0,02 0,33 0,16 -10 4,52 0,2 3,4 68,37 0 19,33 0,01 1,3 0 1,13 0,46 0,02 0,35 0,18 55 ΡΕ1086236

Foram efectuados cruzamentos entre linhas trans-génicas 5544 de Brassica que produziam GLA e variedades convencionais de canola não transformada. Foram realizados cruzamentos entre linhas 5544 com Quantum, Eagle, e Ebony.

Foram analisadas meias sementes F1 para o conteúdo em SDA e foram cultivadas plantas seleccionadas e permitiu-se auto-polinização para a produção de sementes F2. A análise GC-FAME de ambas as amostras de sementes isoladas e meias-sementes de tais cruzamentos revelou a acumulação de níveis significativos de SDA (Tabela 6) . A análise de meias-semente de 5544-LP108-6-16 com a variedade de canola Eagle produziu um nível de aproximadamente 6,3% de SDA. A análise de sementes F2 de um cruzamento de 5444-LP108-12-1 com a variedade de canola Ebony produziu níveis de SDA tão elevados quanto cerca de 7,4% de SDA. ΡΕ1086236 - 56 -

Tabela 6 1D da Estirpe 16:0 16:1 18:0 18:1 8:2 C69 18:2 C912 18:3 C6912 18:3 C91215 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 (SP30035-46x5544-LP30108-6-16) 6,34 0,84 1,9 4,7 0 14,81 56,73 3,78 6,29 2,12 0,66 0,59 1,04 (SP30035-46x5544- LP30108-6-16) 10,18 1,43 4,23 4,34 0 15,96 48,78 3,79 5,51 2,65 0,72 0,77 1,32 (SP30035-46x5544- LP30108-6-16) 4,81 0,45 2,53 12,2 0 21,61 46,74 4,83 4,11 0,98 0,79 0,4 0,43 (SP30035-46x5544- LP30108-6-16) 4,74 0,48 3,33 16,06 0 20,68 43,02 4,82 3,73 1,25 0,7 0,33 0,75 (SP30035-46x5544- LP30108-6-16) 6,02 0,53 1,25 17,29 0 27,34 33,97 7,52 3,41 0,85 0,77 0,27 0,59 (SP30035-46x5544- LP30108-6-16) 3,68 0,13 1,99 19,75 0,09 22,75 39,98 5,76 3,41 0,8 0,87 0,27 0,44 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 8,92 0,96 1,64 14,61 0 18,69 36,98 7,44 7,43 1,01 0,49 0,49 0,95 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 9,02 0,89 1,88 10,69 0 16,73 43,39 6,8 6,76 1,05 0,57 0,75 1,07 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 7,76 0,59 1,86 8,15 0 16,04 52,24 4,65 5,3 1,04 0,59 0,69 0,83 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 9,21 0,87 2,23 17,44 0 18,77 36,87 6,79 5,05 0,84 0,64 0,31 0,71 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 5,76 0,31 M 20,38 0 24,36 29,94 10,9 4,41 0,69 0,78 0,23 0,48 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 4,03 0,22 1,3 16,87 0 19,3 46,67 5,33 4,17 0,53 0,75 0,35 0,37 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 4,66 0,29 4,47 18,09 0,05 19,07 41,92 5,06 3,47 1,13 0,73 0,35 0,57 (SP30052-7x5544- LP30108-12-1) 4,91 0,26 3,13 18,16 0 18,53 43,99 4,64 3,43 1,01 0,79 0,37 0,66 57 ΡΕ1086236

Exemplo 6 (Exemplo Referência)

Produção de A6,9 18:2 no Óleo de Canola

No Exemplo 5 foi descrita a construção de pCGN5538 concebido para expressar a Δ6 dessaturase de M. alpina em sementes de canola transgénica. A Tabela 4 desse exemplo apresentou exemplos de análises de sementes isoladas de 6 eventos transgénicos independentes. Foram produzidas quantidades significativas de GLA, para além do ácido gordo Δ-6,9 18:2.

Foram regeneradas e crescidas na estufa um total de 29 plantas transgénicas independentes transformadas com pCGN5538 da cultivar LP004 de pouco linolénico. A Tabela 7 apresenta a composição de ácidos gordos de grupos de 20 sementes de sementes T2 de cada evento. Sete das linhas possuíam mais do que 2% do Δ-6,9 18:2 nos grupos de sementes. Para a identificação e selecção plantas com elevadas quantidades de Δ-6,9 18:2 para a produção de gerações subsequentes, foi realizada a análise de meias-sementes . As sementes foram germinadas durante a noite em escuridão a 30 graus em papel de filtro embebido em água. O cotiledónio externo foi excisado para análise por GC e o resto da semente germinada foi plantado em solo. Com base nos resultados de análise de ácidos gordos, foram seleccionadas e cultivadas na estufa plantas T2 para a produção de sementes T3. O ciclo de selecção foi repetido; foram analisados grupos de sementes T3 para Δ-6,9 18:2. As 58 ΡΕ1086236 meias-sementes T3 foram dissecadas e analisadas, e as plantas T3 seleccionadas foram crescidas na estufa para a produção de sementes T4. Foram analisados grupos de sementes T4 para a composição em ácidos gordos. A Tabela 6 sumariza os resultados deste processo para linhas derivadas de um dos eventos transgénicos originais, 5538-LP004-25. Os níveis de Δ-6,9 18:2 foram deste modo mantidos durante 3 gerações.

Para maximizar a quantidade de Δ-6,9 18:2 que se pode produzir, a construção pCGN5538 pode ser introduzida numa variedade de canola com elevado ácido oleico quer por transformação ou cruzamento. Uma variedade com elevado oleico pode ser obtida por mutação, co-supressâo, supressão ou anti-sentido das Δ12 e Δ15 dessaturases ou outros co-factores necessários. ΡΕ1086236 - 59 -

Tabela 7

Composição em Ácidos Gordos de Grupos de 20 Sementes de Sementes T2 de pCGN5538 Δ6,9 Δ6,9, 12 M, 12,15 MO 5538- LP004 12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:2 18:3 18:3 18:4 20:0 20:1 20:2 22:0 22:2 N° evento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 31 0,02 0,06 4,07 0,07 0 59,4 5,4 10,07 15,93 1,2 0,6 0,98 1,16 0,0 0,44 0,03 29 0,01 0,05 3,81 0,14 0 60,7 4,53 10,9 14,77 1,03 0,55 1,09 1,26 0,0 0,46 0,02 19 0,02 0,07 4,27 0,13 0 62,9 4,17 10,03 13,14 1,02 0,59 1,18 1,25 0,0 0,53 0,02 14 0 0 5,29 0,24 3,8 49,1 1,02 23,44 11,21 2,26 0,34 1,45 0,93 0,0 0,76 0 22 0,02 0,05 3,87 0,09 0 64,1 2,59 12,57 11,18 1,27 0,6 1,18 1,08 0,1 0,56 0 9 0,01 0,06 4,57 0,16 0 62,9 3,4 12,05 11,15 1,27 0,6 1,28 1,18 0,0 0,56 0,01 25 0,01 0,06 4,17 0,14 0 62,4 2,49 14,42 11,03 1,2 0,46 1,18 1,15 0,0 0,53 0,01 15 0,01 0,05 3,94 0,14 0 65,2 2,08 12,77 10,9 1,04 0,43 1,1 1,24 0,0 0,48 0,01 18 0 0,06 5,34 0,29 0 58,4 1,42 18,19 10,53 U 0,49 1,2 1 0,0 0,58 0,02 20 0,01 0,04 1,95 0Λ 0 65,6 1,31 13,83 10,22 1,09 0,39 1,06 1,3 0,0 0,46 0,01 7 0,02 0,07 4,04 0,11 0 6,21 0,92 18,12 8,72 1,77 0,35 1,26 1,19 0,0 0,58 0 11 0,01 0,06 4,23 0,17 0 62,9 1,6 17,19 8,58 1,48 0,38 1,16 1,03 0,0 0,49 0,01 27 0,02 0 3,99 0.14 0 65,3 0,64 17,85 7,89 1,36 0,31 1,08 1,21 0,0 0 0 2 0,01 0,05 4,02 0,14 0 66,4 1,2 15,74 7,58 1,22 0,32 1,06 1,19 0,0 0,45 0 ΡΕ1086236 - 60 - (continuação) N° evento 0. 0. 0 0 0 0 0 0 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 0 0 0 0. 0. 28 0,01 0,04 3,77 0,11 0 67,5 0,79 15,56 7,58 1,12 0,28 0,97 1,23 0,0 0,44 0 3 0,04 0,05 3,96 0,12 0 68,5 1,81 13,23 7,44 1,1 0,35 1,12 1,21 0,0 0,46 0,01 21 0,01 0,05 3,74 0,1 0 66,9 1,16 15,9 6,97 1,35 0,28 1,15 1,27 0,0 0,52 0 5 0,01 0,04 3,81 0,12 0 69,1 0,74 14,58 6,95 1,14 0,28 1,06 1,18 0,0 0,45 0 6 0 0 2,84 0 3,06 62,5 1,55 18,44 6,94 1,21 0,39 1,04 1,33 0,1 0 0 4 0,01 0,05 3,88 0,11 0 66,9 0,64 16,21 6,89 1,52 0,31 1,09 1,21 0,0 0,5 0 30 0,01 0,04 3,89 0,12 0 68,6 0,72 15,58 6,47 1,17 0,23 1,03 1,07 0,0 0,46 0 16 0,02 0,05 3,75 0,13 0 70,4 0,91 13,56 6,39 1,13 0,28 1,04 1,2 0,0 0,44 0,01 26 0,01 0 3,77 0,12 0 67,6 0 21,08 3,61 1,37 0,13 0,96 1,16 0,0 0 0 23 0 0 4,92 0,22 0 65,2 0 22,23 3 1,79 0,11 1,28 1,11 0,0 0 0 24 0,01 0 3,84 0,13 0 68,4 0,36 21 2,09 1,53 0,08 1,06 1,27 0,0 0 0 10 0,01 0 3,74 0,11 0 70,4 0 20,82 0,65 1,3 0,03 1,05 1,18 0,0 0,46 0 12 0,01 0 3,83 0,12 0 69,9 0 21,61 0,34 1,34 0 1,06 1,12 0,0 0,47 0 17 0,01 0 0 0,13 0 72,6 0 23,03 0,24 1,51 0 1,18 1,21 0,0 0 0 8 0,01 0 4,54 0,2 0 64,9 0 25,65 0,22 1,94 0 1,38 1,01 0,0 0 0 13 0,01 0 399 0,16 0 65,8 0 25,9 0 1,58 0 1,17 1,16 0,0 0 0 controlo LP004 0,01 0,04 3,46 0,09 0 69,9 0 21,95 0 1,37 0,01 0,9 1,25 0,0 0,42 0 ΡΕ1086236 - 61 -

Tabela 7

Grupo T2 Grupo T3 Selecção T3 Grupo T4 ID da Estirpe Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 Δ6,9,12 18:3 5538-LP004-25 2,49 11,03 5538-LP004-25-3 9,1 11,92 5538-LP004-25-3-31 13,61 7,82 11,02 9,41 5538-LP004-25-3-30 6,51 7,93 10,27 8,7 5538-LP004-25-3-29 13,35 11,23 9,42 10,5 5538-LP004-25-3-28 9,92 24,1 9,37 10,19 5538-LP004-25-3-25 5,3 30,34 7,95 11,34 5538-LP004-25-2 3,87 11,08 5538-LP004-25-2-29 13,63 7,41 9,6 11,07 5538-LP004-25-2-27 5,02 22,04 6,95 9,61 5538-LP004-25-2-26 1,21 GO . r-. 4,31 7,45 ΡΕ1086236 - 62 - (continuação)

Grupo T2 Grupo T3 Selecção T3 Grupo T4 ID da Estirpe Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 GLA Δ6,9 18:2 Δ6,9,12 18:3 5538-LP004-25-2-25 5,83 34,16 8,77 11,58 5538-LP004-25-13 110,53 11,19 5538-LP004-25-13-27 14,65 11,46 7,86 10,49 5538-LP004-25-13-26 11,18 13,04 9,33 10,01 5538-LP004-25-13-25 4,18 36,78 1,2 12,22 5538-LP004-25-1 3,05 11,16 5538-LP004-25-1-41 0 0 0,01 0,04 5538-LP004-25-1-28 3,43 oo 4,63 6,53 5538-LP004-25-1-27 5,52 20,13 8,35 11,21 5538-LP004-25-1-26 0,1 25,12 5,52 8,59 5538-LP004-25-1-25 6,5 31,83 9,85 10,88 ΡΕ1086236 63

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Calgene LLC

<120> Ácidos Gordos Poliinsaturados em Plantas <130> 17256/00/WO <140> PCT/US 99/13559 <141> 1999-06-10 <150> 60/089, 043 <151> 1998-06-12 <16 0 > 12 <170> FastSEQ Versão 4.0 for Windows

<210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <220> <223> Oligonucleótido Sintético <400> 1 cuacuacuac uactgcagac aatggtcgct cattcctcag a 41

<210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 2 caucaucauc augcggccgc ttacttggcc tttgcctt 38

<210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 3 tcgacctgca ggaagcttgc ggccgcggat cc 32

<210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 4 tcgaggatcc gcggccgcaa gcttcctgca gg 32 <210> 5 ΡΕ1086236 64

<211> 40 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética < 4 0 0 > 5 cuacuacuac uagagctcag cgatggttgt tgctatggac 40

<210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 6 caucaucauc augaattctt aattgatttt agatttg 37

<210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 7 cuacuacuac uactcgagca agatgggaac ggaccaagg 39

<210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 8 caucaucauc auctcgagct actcttcctt gggacggag 39

<210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 9 47 40 cuacuacuac uatctagact cgagaccatg gctgctgctc cagtgtg

<210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <40 0> 10 caucaucauc auaggcctcg agttactgcg ccttacccat

<210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Sintético OligoArtificial Sequência <40 0> 11 cuacuacuac uaggatccat ggcacctccc aacact 36 ΡΕ1086236 65

<210 > 12 <211> 41 <212> DNA <213> Sequência OligoArtificial Sintética <400> 12 caucaucauc auggtacctc gagttacttc ttgaaaaaga

Lisboa, 29 de Novembro de 2007

Claims (19)

1. ΡΕ1086236 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção ácido estearidónico numa semente vegetal, compreendendo o referido método a cultura de uma planta que possui integrado no seu genoma uma primeira construção de DNA que compreende, na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente vegetal, uma sequência de DNA que codifica uma delta-seis dessaturase, e uma região de terminação da transcrição funcional numa célula vegetal, e uma segunda construção que compreende na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente vegetal, e uma sequência de DNA que codifica uma delta 15-dessaturase e a cultura da referida planta sob condições em que a referida delta-seis dessaturase e a referida delta 15-dessaturase são expressas.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida planta possui uma terceira construção integrada no genoma, em que a referida terceira construção possui na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente vegetal, e uma sequência DNA que codifica uma delta 12 dessaturase.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a referida sequência que codifica a delta-seis dessaturase pertence ao género Mortierella. 2 ΡΕ1086236
4. 4. Método da reivindicação 1, em que o promotor da primeira construção de DNA é um promotor da napina.
5. 5. Método da reivindicação 1, em que o promotor da primeira construção de DNA provém da região de iniciação da transcrição de uma subunidade da fracção 7S da β-con-glicinina de soja.
6. 6. Método da reivindicação 1, em que o referido método compreende ainda a extracção de óleo da referida semente vegetal.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que o referido óleo compreende cerca de 5 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico.
8. 8. Método da reivindicação 6, em que o referido óleo compreende cerca de 10 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico.
9. 9. Método da reivindicação 6, em que o referido óleo compreende cerca de 15 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico.
10. 10. Método da reivindicação 6, em que o referido óleo compreende cerca de 20 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico.
11. 11. Método da reivindicação 6, em que o referido 3 ΡΕ1086236 óleo compreende cerca de 25 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico.
12. 12. Planta transgénica ou sua semente que possui integrada no seu genoma uma primeira construção de DNA que compreende, na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente vegetal, uma sequência de DNA que codifica uma delta-seis dessaturase, e uma região de terminação da transcrição funcional numa célula vegetal, e uma segunda construção que compreende na direcção de transcrição 5' para 3', um promotor funcional numa célula de semente vegetal, e uma sequência de DNA que codifica uma delta 15-dessaturase, que possui a capacidade de expressão de delta-seis dessaturase e delta 15-dessaturase e de produção de óleo de sementes contendo ácido estearidónico.
13. 13. Semente da planta da reivindicação 12 que compreende cerca de 5 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como um componente dos ácidos gordos totais que se encontram no óleo da semente.
14. 14. Semente da reivindicação 13 que compreende cerca de 10 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como componente do referido óleo da semente.
15. 15. Semente da reivindicação 13 que compreende cerca de 15 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como componente do referido óleo da semente. 4 ΡΕ1086236
16. 16. Semente da reivindicação 13 que compreende cerca de 20 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como componente do referido óleo da semente.
17. 17. Semente da reivindicação 13 que compreende cerca de 25 por cento em peso ou mais de ácido estearidónico como componente do referido óleo da semente.
18. 18. Óleo da semente obtido a partir de semente das reivindicações 13 a 17.
19. 19. Tecido de semente vegetal de uma planta transgénica da reivindicação 12 que compreende um óleo da semente como definido nas reivindicações 13 a 17. Lisboa, 29 de Novembro de2007