JPH08506490A - 植物中の改変リノレン酸及びリノール酸含量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リノレン酸含量の高い又は低い形質転換植物を開示する。リノール酸デサチュラーゼ遺伝子を発現する植物も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物中の改変リノレン酸及びリノール酸含量 これは、１９９３年２月５日に出願された米国特許出願第０８／０１４，４３ １号の継続出願である１９９３年１１月２２日出願の米国特許出願第０８／１５ ６，５５１号の一部継続出願である。本発明は、一般的には、遺伝子工学で製造 した植物に関する。特定的には、リノレン酸及びリノール酸含量が天然の植物と 比べて変化している、遺伝子工学で製造した植物及び種子に関する。背景 多くの作物類は、所期の用途に理想的には適していない脂肪酸組成の種子油を 生成する。一般的な品種改良方法の適用は、場合によっては突然変異誘発と結び 付いて、種子油の脂肪酸組成が所望通りに変化した幾種類かの植物の新しい変種 を誕生させた。代表的な例は、アブラナの低エルカ酸変種の開発である（Ｓｔｅ ｆａｎｓｓｏｎ １９８３）。類似の努力によって、ダイズ油（Ｗｉｌｃｏｘ及 びＣａｖｉｎｓ １９８５；Ｇｒａｅｆら １９８８）、ヒマワリ油（Ｆｉｃｋ １９８９）及びアマニ油（Ｇｒｅｅｎ及びＭａｒｓｈａｌ １９８４）の炭素 数１８ポリ不飽和脂 肪酸含量の低下も実現された。 種子の脂質の脂肪酸組成の遺伝子学的変化の大部分には、正常な脂肪酸代謝を 崩壊させ種子の貯蔵脂質中の中間脂肪酸生成物の蓄積を誘起する遺伝子の対立遺 伝子の存在が関与していると思われる（Ｄｏｗｎｅｙ １９８７）。しかしなが ら、このようなアプローチは生来限定されているため、他の多くの所望の種子油 脂肪酸組成変化には、遺伝子工学的手法を直接使用する必要があり得る。 α−リノレン酸（１８：３^△9,12,15）は、３個のシス二重結合を９〜１０、 １２〜１３及び１５〜１６位炭素に有する炭素数１８の脂肪酸である。この脂肪 酸は、高等植物の細胞に細胞膜の一成分として含まれている。この脂肪酸はまた 、種子のような貯蔵器官にも存在し、そこではオイルボディーと呼ばれる。この オイルボディーは、半単位膜（ｈａｌｆ−ｕｎｉｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）と考え られる電子密度の高い構造体によって結合されており、細胞の細胞質環境中に分 散されている。細胞膜の一成分として存在する時のリノレン酸は通常、ジアシル −グリセロ脂質のグリセロール部分のｓｎ−１又はｓｎ−２位置にエステル化さ れている。これに対し、オイルボディー中に存在する 時のリノレン酸は通常、トリアシルグリセロ脂質（ＴＡＧ）のｓｎ−１、ｓｎ− ２又はｓｎ−３位置にエステル化されている。 リノレン酸は酸化し易いため、ペイント及びワニスにおいて広く使用されてい る。この油の主要供給源はアマの種子である。これに対し、ダイズの種子のリノ レン酸含量はペイント及びワニス工業で使用できる程十分ではない。従って、ダ イズのような植物のリノレン酸含量を増加させれば、ダイズ油をペイント及びワ ニス工業で使用することが可能になる。 一方、食用油及び食品では、リノレン酸含量が高いことは望ましくない。リノ レン酸は調理の間不安定であり、速く酸化する。酸化生成物は最終製品の風味を 低下させる。リノレン酸含量が２％以下であるような低リノレン酸のナタネ油又 はダイズ油は食用油として使用するのに理想的であろう。 リノレン酸はまた、重要な植物生長調節物質であるジャスモン酸の生合成にお ける前駆体である。リノレン酸は、リポキシゲナーゼにより炭素鎖に酸素を導入 し、次いで脱水、還元及び数回のβ−酸化を行うことによりジャスモン 酸に変換される（Ｖｉｃｋ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ）１９８４）。ジャスモン酸 の活性は、病原体防御応答の誘起という観点で測定されてきた。植物の病原体防 御は、遊離リノレン酸を植物に適用することによって誘起することもできる（Ｆ ａｒｍｅｒ及びＲｙａｎ、１９９２）。 遊離リノレン酸がジャスモン酸に関連した効果を発揮する能力を説明するため に、あるモデルが提案された（Ｆａｒｍｅｒ及びＲｙａｎ、１９９２）。リノレ ン酸からジャスモン酸への変換に必要な総ての酵素活性は細胞中に構成要素とし て存在し、ジャスモン酸の生成における律速段階は遊離リノレン酸の利用性（ａ ｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）であると仮定されている。遊離リノレン酸の生成経路 として考えられるものの一つは、形質膜中のリパーゼの活性による経路である。 外因性ジャスモン酸は、傷害よりも強力に防御応答を活性化することができる 。これは、傷がジャスモン酸の大量産生を支えるのに十分な遊離リノレン酸を生 成することができないことを示唆する。リパーゼの活性又はリパーゼの適当な基 質の利用性は傷害時の律速であり得る。従って、形質膜のリノレン酸含量の増加 は植物の「シグナル形質導 入」に良い影響を及ぼし得、その結果環境及び病原体ストレスに対する防護力が 高まり得る。 リノレン酸、並びにオレイン酸及びリノール酸は、生鮮食品又は調理した食品 の芳香に寄与する揮発性カルボニル化合物の重要な構成成分であると共にその前 駆体でもある。トマトの果皮の主な脂肪酸はオレイン酸、リノール酸及びリノレ ン酸である。リノール酸及びリノレン酸の含量は果実の熟成に伴って低下し、そ の結果炭素数４〜６のアルデヒド及びケトンが多数生成される。木で熟したトマ トには、スーパーマーケットのトマト又は冷蔵庫に貯蔵されているトマトと比べ て、一つの特定代謝物シス−３−ヘキサノールがより多く含まれていることが判 明した。従って、新鮮な果実及び野菜の「芳香（ａｒｏｍａ）」は、酵素リポキ シゲナーゼの、従って揮発性「芳香」化合物を生成するヒドロペルオキシド開裂 酵素の重要な基質であるリノレン酸及びリノール酸の含量を調節することにより 「変える」ことができると考えられる。 以上の説明から明らかなように、植物のリノレン酸含量を変えることができれ ば、それは望ましいことであろう。しかしながら、そのためには、何が植物のリ ノレン酸生成 を制御するのかを突き止める必要がある。 放射化学トレーサー検査の結果得られた多くの実験的事実は、α−リノレン酸 がリノール酸（１８：２^△9,12）の不飽和化によって合成されることを明らかに した（Ｈａｒｗｏｏｄ １９８８に概説）。しかしながら、不飽和化の実際の基 質は不明である。 ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの標識検査は、リノレン酸合成に二つの 異なる経路が存在し得ることを示唆している（Ｂｒｏｗｓｅ及びＳｏｍｅｒｖｉ ｌｌｅ、１９９１）。第一の可能な経路は、ホスファチジルコリンのｓｎ−２位 置にエステル化したリノール酸が不飽和化の基質となる小胞体中に存在すると考 えられる。しかしながら、これらの事実は、別の脂質にエステル化したリノール 酸も基質であり得るという可能性を排除するものではない。 リノール酸不飽和化の第二の可能な経路は、モノガラクトシルジアシルグリセ ロールにエステル化したリノール酸及び恐らくは別のプラスチド脂質が不飽和化 の基質であると示唆している確証のあるプラスチド中に存在する。 リノール酸の不飽和化に関与する酵素に関する直接的情報は比較的少ない。低 レベルの酵素活性が、成長中のアマ ニ種子（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｓｉｔａｔｕｍ）に由来するミクロソーム膜調製物中 に検出され（Ｂｒｏｗｓｅ及びＳｌａｃｋ、１９８１）、その後、穏やかに溶解 した葉緑体の調製物中にも検出された（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＨｅｉｎｚ、１９９ ０ａ，ｂ）。該酵素の全般的特徴は、この種の別の酵素に関して得られる情報か ら推測し得る。 特徴が最もよく解明されているデサチュラーゼは、脊椎動物の肝臓に由来する ステアロイル−補酵素Ａ（ＣｏＡ）デサチュラーゼである（Ｈｏｌｌｏｗａｙ、 １９８３に概説）。この酵素は、非ヘム鉄を含む膜内在性タンパク質であること が判明した。デサチュラーゼ反応には脂肪アシル−ＣｏＡ、分子状酵素、及び別 の膜タンパク質である還元シトクロムｂ５が必要とされる。ｉｎ ｖｉｖｏでは 、還元シトクロムｂ５は、フラビン含有膜タンパク質であるシトクロムｂ５レダ クターゼの活性を介して、ＮＡＤＨからの還元当量のトランスファーにより産生 される。 特徴が最もよく解明されている植物由来デサチュラーゼはステアロイル−ＡＣ Ｐデサチュラーゼである（ＭｃＫｅｏｎ及びＳｔｕｍｐｆ、１９８２；Ｓｈａｎ ｋｌｉｎ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、１９９１）。この酵素も、分子状 酸素と高ポテンシャル還元剤とを必要とする。しかしながら、動物の酵素と異な り、このデサチュラーゼは、ＣｏＡではなくアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）に エステル化した脂肪酸に優先的に作用する可溶性プラスチドタンパク質である。 この酵素は、還元フェレドキシンを中間電子供与体として利用する点でも動物の 酵素と異なる。 別の植物デサチュラーゼは膜タンパク質であると思われる。数種類の植物に由 来するミクロソームΔ１２オレイン酸デサチュラーゼが、数種類の植物に由来す る膜調製物中でアッセイされた（Ｈａｒｗｏｏｄ、１９８８）。動物由来のステ アロイル−ＣｏＡデサチュラーゼと同様に、この酵素は、分子状酸素と、電子供 与体としての還元シトクロムｂ５とを必要とする（Ｋｅａｒｎｓら、１９９１） 。しかしながら基質は、ＣｏＡエステルではなく、リン脂質にエステル化したオ レイン酸であると思われる。 リノレン酸の製造に関与する活性の供給源又は由来源は殆ど不明である。しか しながら、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｆａｄ３突然変異体の 特性分析により、リノレン酸の量がリノール酸デサチュラーゼ活性の量に関連し ているという事実が判明した（Ｌｅｍｉｅｕｘら、 １９９０）。前記突然変異体は、種子脂質の貯蔵油中及び種々の組織の膜脂質中 のリノレン酸が種々の度合いで不足している。この突然変異体はまた、リノール 酸の量が増加していた。これは、該突然変異体が、リノール酸をリノレン酸に変 換するデサチュラーゼの活性に欠けていることを示すものであると解釈できる。 このデサチュラーゼの活性が、正常な環境下でのリノレン酸合成の律速であり 得ることを示唆する別の事実も存在する。これは、野生型とｆａｄ３突然変異体 とを交配して形成したヘテロ接合植物（即ちｆａｄ３＋／ｆａｄ−）における脂 肪酸組成に対する影響を測定することにより発見された。正常ｆａｄ３遺伝子産 物のコピーを、野生型に通常見られるように２個ではなく１個有するこれらのＦ １植物では、リノレン酸の量が、いずれかの親に含まれる量のほぼ中間に等しか った。これは、リノレン酸の量が、機能的ｆａｄ３遺伝子産物の量に比例するこ とを示唆するものである（Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９０）。 しかしながらこれらの結果は、ｆａｄ３遺伝子産物の性質、又は突然変異体内 で観察された効果が欠失タンパク質に起因するデサチュラーゼタンパク質量もし くはデサチュ ラーゼ活性の低下に関連しているか否かに光を与えるものではない。 また、植物ミクロソーム由来のリノール酸デサチュラーゼについて確かなこと は全く知られていない。前述のように、ミクロソームデサチュラーゼについては 、これらのデサチュラーゼがおそらくは還元シトクロムｂ５を中間電子供与体と して使用し、おそらくはＣｏＡ又はＡＣＰエステルではなく脂質を基質として利 用すること以外は殆ど知られていない。 また、植物生物学の他の多くの観点から見て、脂質代謝の生化学及び調節に関 する特異的情報がないため、１個又は数個の遺伝子の導入がいかにして種子脂質 合成を変えるかという予測が困難である。 脂質代謝の重要な酵素の多くが膜結合酵素であって含量が低いという事実から も別の問題が生じる。そのため、これらの酵素を植物性供給源から可溶化し精製 する試みはこれまで成功しなかった。発明の概要 本発明は、植物のリノール酸及びリノレン酸組成を変えるために、又は別の植 物リノール酸デサチュラーゼを単離 するために使用できるリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする構造コード配 列（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を提供する。本 発明は、植物のリノレン酸もしくはリノール酸又はその両方の含量を制御するた めに構造コード配列を発現することができる植物も提供する。本発明は、植物の リノール酸及びリノレン酸含量を制御する方法も提供する。本発明は、植物の細 胞及び組織中のリノール酸デサチュラーゼ酵素活性がリノレン酸生合成の制御段 階であることも立証する。 本発明は、二つの有利な特徴、即ち種々の作物類の構造脂質又は貯蔵油中のα −リノレン酸含量が多い及び少ないという特徴を植物に与える操作にも関する。 これらの目的を達成するために、本発明はその側面の一つで、リノレン酸含量 の高い遺伝学的に形質転換した植物を提供する。この植物は、組換え二本鎖ＤＮ Ａ分子を含み、該分子が（ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプ ロモーターを含み、該プロモーターが（ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性を コードするＲＮＡ配列を生成させる構造コード配列と、（ｉｉｉ）植物細胞中で 機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化を促進す る３’非翻訳領域とに操作可能に結合している。 本発明は別の側面で、リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換した植物を提 供する。この植物は、組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が（ｉ）植物細胞 中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プロモーターが（ ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少なく とも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配列 と、（ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニ ル化を促進する３’非翻訳領域とに操作可能に結合している。 本発明は別の側面で、リノレン酸含量の高い又は低い遺伝学的に形質転換した 植物を形成する方法を提供する。本発明は更に別の側面で、組換え二本鎖ＤＮＡ 分子と、組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む植物細胞とを提供する。図面の簡単な説明 第１図は、リノール酸デサチュラーゼ遺伝子が存在するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ ｔｈａｌｉａｎａの染色体２領域の遺伝地図と、ゲノムのこの領域を有する 酵母人工染色体のアイデンティティとを示している。 第２図は、Ｂ．ｎａｐｕｓリノール酸デサチュラーゼｃＤＮＡ（ｆａｄ３）を 含むＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴに挿入することによって 得たプラスミドｐＢＮＤＥＳ３の構造を示している。 第３図は、Ｂ．ｎａｐｕｓに由来するリノール酸デサチュラーゼｃＤＮＡ（ｆ ａｄ３）のヌクレオチド配列（配列番号：１）及び推定アミノ酸配列（配列番号 ：２）を示している。 第４図は、Ｂ．ｎａｐｕｓに由来する一つのリノール酸デサチュラーゼｃＤＮ Ａ（ｆａｄ３）及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓに由来するｄｅｓＡ遺伝子の推 定アミノ酸配列の比較を示している。同じ残基は実線の枠で示した。保存置換は 点線の枠で示した。 第５図は、二元（ｂｉｎａｒｙ）ＴｉプラスミドベクターｐＢＩ１２１を示し ている。 第６図は、リノール酸デサチュラーゼｃＤＮＡ（ｆａｄ３）をｐＢＩ１２１に 挿入することによって構築した二元ＴｉプラスミドｐＴｉＤＥＳ３を示している 。 第７図は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１３８０４の地図を示している。 第８図は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１３８０５の地図を示している。 第９図は、対照及び本発明の形質転換カノラ種子の油含量を示している。 第１０図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のリノール酸デサチュラーゼｃＤＮ Ａ（ｆａｄＤ）のヌクレオチド配列（配列番号：９）を示している。 第１１図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のリノール酸デサチュラーゼｃＤＮ Ａ（ｆａｄＤ）の推定アミノ酸配列（配列番号：１０）を示している。 第１２図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のリノール酸デサチュラーゼｃＤＮ Ａ（ｆａｄＥ）のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示している。 第１３図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のリノール酸デサチュラーゼｃＤＮ Ａ（ｆａｄＥ）の推定アミノ酸配列（配列番号：１２）を示している。発明の詳細な説明 リノレン酸又はリノール酸含量を変えた本発明の遺伝学的形質転換植物は、本 明細書に記載の二本鎖ＤＮＡ分子を発現することによって得られる。 二本鎖ＤＮＡの発現には、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの一つの鎖か らのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写と、その後の核内のｍＲＮＡ一次 転写プロセシングとが関与する。前記プロセシングでは、ポリアデニレートヌク レオチドをＲＮＡの３’末端に付加する３’非翻訳領域が使用される。プロモーター ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれるＤＮＡ領域に よって調節される。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼをシグナルを与え る塩基配列を含み、ＤＮＡと結合させ、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型として使用しなが らｍＲＮＡの転写を開始させて、対応する相補ＲＮＡ鎖を作る。 公知のプロモーター、又は植物細胞中でＲＮＡを転写させることが判明したプ ロモーターは、いずれも本発明で使用し得る。本発明で有用なプロモーターには 、植物細胞中で機能してＲＮＡ配列の形成を誘起するあらゆるプロモーターが包 含される。植物細胞中で活性を示し、ＲＮＡ配列を形成することができる多数の プロモーターが文献に記載されている。その中には、ノパリンシンターゼ（ＮＯ Ｓ） 及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（腫瘍菌ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓの腫瘍誘発プラスミドに担持されたプロモーター）、カウリモウイルス（ｃ ａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス （ＣａＭＶ）１９Ｓ、３５Ｓ、及びゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ−プロ モーター、リブロース−１，５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブ ユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、極めて豊富な植物ポリペプチド）に由来する光 誘導プロモーター、並びにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモータ ー等がある。これらのプロモーターは総て、植物中で発現される様々なＤＮＡ構 築体の形成に使用されてきた。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３号（Ｒ ｏｇｅｒｓら、Ｍｏｎｓａｎｔｏ）参照。 プロモーターは、植物及び植物ウイルスといった様々な供給源から得られる。 プロモーターは、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子のような植物遺伝子から単離したま まのような存在形態で使用でき、又は増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの場合のように、効果を改善すべく改質し得る。 当業者には明らかなように、リノレン酸含量を所望通りに変えるのに必要なリ ノール酸デサチュラーゼの量は、植物の種類に応じて変化し得る。また、極端な リノール酸デサチュラーゼ活性が植物にとって有害であり得る可能性もある。従 って、好ましい実施態様では、所望の組織発現能力と大体のプロモーター強度と を有するプロモーターを選択し、標的組織中で所望のリノール酸デサチュラーゼ 活性を生起させる形質転換体を選択することにより、プロモーター機能を最適化 する必要がある。 形質転換体プールからのこのような選択は、植物中での異種構造遺伝子の発現 にルーチン的に使用される。なぜなら、植物ゲノム内の遺伝子挿入部位に起因し て、同じ異種遺伝子を含む形質転換体の間に差異が存在するからである（一般に 「位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ）」と称される）。 好ましい実施態様では、二本鎖ＤＮＡ分子で使用されるプロモーターは、リノ レン酸含量の増加又は低下が望まれる組織、例えば植物の種子中で、比較的高度 の発現を有するものでなければならない。カノラの場合は、この意味で特に好ま しいプロモーターは、後述の実施例で詳述する種 子特異的プロモーターである。 別の好ましい実施態様では、本発明の二本鎖ＤＮＡ分子の発現に使用されるプ ロモーターは、植物の組織の全体又は大部分でＤＮＡ分子を発現する構成プロモ ーターであり得る。しかしながら、この実施態様のために選択するプロモーター は、植物の健康、生長及び発育にとって有害なレベルで発現を生起させるような ものであってはならない。 β−コングリシニン（７Ｓタンパク質としてもし知られている）はダイズの主 な貯蔵タンパク質の一つである（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｍｅｉｎｋｅら、 １９８１）。この研究の側面の一つでリノール酸デサチュラーゼ遺伝子の発現に 使用する７Ｓ（β−コングリシン）α’−サブユニットプロモーターは、活性が 高く且つ種子特異的であることが判明した（Ｄｏｙｌｅら、１９８６及びＢｅａ ｃｈｙら、１９８５）。β−コングリシニンのβ−サブユニットは、内因性プロ モーターを用いて、トランスジェニックペチュニア及びタバコの種子内で発現さ れた。これは、該プロモーターが別の植物で種子特異的に機能することを意味す る（Ｂｒａｙら、１９８７）。β−コングリシニンのプロモーターは本発明で使 用し得る。このプロモーターを 使用すればＤＮＡ分子が種子中で特異的に発現され得、その結果種子のリノレン 酸含量が変化し得る。 更に、内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモーターを本発明で使用する こともできる。これらのプロモーターは、葉、種子又は果実のような特定組織中 でリノール酸デサチュラーゼ遺伝子を発現するために有用なものでなければなら ない。種子特異的発現又は種子増強発現を示すプロモーターは他にも多く知られ ており、油蓄積細胞である種子中で発現される可能性がある。非限定的具体例と して、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター及びアシル担体タンパク質プロモータ ーは、アンチセンス発現による種子油の改質に使用されてきた（Ｋｎｕｔｓｏｎ ら、１９９２）。 根組織のリノレン酸含量は、根で発現されるプロモーターの後ろでリノール酸 デサチュラーゼ遺伝子を発現させることにより増加させることができる。酸キチ ナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｓａｍａｃら、１９９０）は、根組織中 で機能することが知られており、根組織中でリノール酸デサチュラーゼを発現す るのに使用し得る。根組織中での発現は、同定されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータ ーの根特異的サブドメインを用いて達成することもできる（Ｂ ｅｎｆｅｙら、１９８９）。葉組織のリノレン酸含量は、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプ ロモーター又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターのような 葉活性プロモーターを用いてリノール酸デサチュラーゼ遺伝子を発現することに より増加させ得る。 果実のリノレン酸含量は、果実中で機能するプロモーターの後ろでリノレン酸 デサチュラーゼ遺伝子を発現することにより増加させることができる。この種の プロモーターは、果実の全ての発育段階で発現され得るか、又は特定の段階、特 に果実熟成段階に限定され得る。 本発明のＤＮＡ構築体によって形成されたＲＮＡは、５’非翻訳リーダー配列 も含み得る。この配列は、遺伝子を発現するために選択したプロモーターから誘 導でき、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるために特異的に修飾し得る。５’非翻訳領 域は、ウイルスＲＮＡ、適当な真核遺伝子、又は合成遺伝子配列から得ることも できる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列に伴う５’非翻訳配列から誘 導される後述の実施例に記載の構築体には限定されない。非翻訳リーダー配列は むしろ、関係のないプロモーター又は前述のようなコード配列から誘導し得る。リノール酸デサチュラーゼ構造コード配列 リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列の形成を誘起する構造 コード配列は、本明細書が開示する配列、又は本明細書が開示する配列を用いて 得ることができる任意の配列、又は本明細書が開示する方法を用いて単離するこ とができる任意の配列であり得る。 構造コード配列は、本発明が開示する構造コード配列の一部、又はこれに由来 するものでもあり得る。リノール酸デサチュラーゼの活性部分は、本明細書が開 示する構造コード配列の一部だけを用いて形成することも可能である。 構造コード配列は、藻類、細菌又は植物といった種々の供給源から得ることが できる。本発明では、植物から得た構造コード配列を使用するのが好ましい。 本発明以前には、リノール酸デサチュラーゼ構造コード配列の特性は事実上全 く不明であったため、構造コード配列を単離するために本発明で使用する方法は 、地図ベースのクローニングの概念を基礎とした。地図ベースのクローニングの 本質的概念は、構造コード配列の遺伝地図位置に関する情報を用いて構造コード 配列を取り巻く染色体領域を単離し、次いで単離ＤＮＡを用いて構造コード配列 中の 突然変異を相補うことにある。この手法は、いずれの植物遺伝子の単離でも、こ れまで報告されたことはない。 リノール酸デサチュラーゼの地図ベースクローニングを実行するために、葉又 は種子の脂肪酸組成が変化している個々の植物について、突然変異誘発植物集団 からランダムに選択した個体をスクリーニングすることにより、リノール酸デサ チュラーゼ活性を欠失しているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ ．）の突然変異体を単離した（Ｂｒｏｗｓｅら、１９８５；Ｌｅｍｉｅｕｘら、 １９９０）。何千もの植物を脂肪酸組成の変化についてスクリーニングすること により、葉及び種子の脂質中のリノレン酸含量が低下した突然変異体、及び増加 した突然変異体を単離した。生理学的及び遺伝学的分析の結果、これらの突然変 異体は三つの相補グループｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥに分類されることが 判明した。 ｆａｄ３突然変異体は、種子及び根のリノレン酸含量は著しく低下しているが 、葉のリノレン酸含量はほぼ正常であった。この効果は、ｆａｄ３遺伝子座が、 「真核経路（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）」と称する小胞体内の脂 質生合成経路によって形成された脂質上のリノ レン酸へのリノール酸不飽和化に関与するミクロソームデサチュラーゼをコード することを示すものとして解釈された（Ｌｅｍｉｅｕｘら、１９９０）。この経 路は、種子及び根のような非緑色組織での脂質合成に主として関与し、葉及び他 の緑色組織では二次的役割を果たす。従って、ｆａｄ３遺伝子中の突然変異は、 葉の脂質の不飽和化にはあまり作用しないと考えられる。 ｆａｄ３突然変異体と異なり、ｆａｄＤ突然変異体は根及び種子の脂肪酸組成 はほぼ正常であるが、葉の脂質中のリノレン酸含量が大幅に低下しており、これ に対応してリノール酸の量が増加していた（Ｂｒｏｗｓｅら、１９８６）。従っ てこの突然変異体は、緑色組織中の脂質合成に主として関与する原核経路に由来 するリノール酸デサチュラーゼ欠失突然変異体に期待される特性を有していた。 ｆａｄＤ突然変異体の希有な特性は、約２２℃以上の温度で生長した時はリノ ール酸含量が極めて少ないが、約１８℃以下の温度で生長した時はほぼ正常な脂 肪酸組成を有することにあった（ＭｃＣｏｕｒｔら、１９８７）。幾つかの独立 して単離した突然変異体の総てが温度条件表現型（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃ ｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐ ｈｅｎｏｔｙｐｅ）を生起する可能性は極めて低かったため、第二のデサチュラ ーゼが緑色組織中でのリノール酸からリノレン酸への不飽和化に一役かっている に違いないと結論された。そこで、ｆａｄＤ突然変異体をエチルメタンスルホネ ートで再度突然変異誘発にかけ（ｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ）、自己受精させ て（ｓｅｌｆ−ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ）、突然変異誘発植物の分離集団を形成し （Ｍ２世代と称する）、この集団を、低温で緑色組織中のリノレン酸を欠失して いる突然変異体についてスクリーニングした。この特性を有する突然変異体を単 離し、この効果に関与する突然変異をｆａｄＥ遺伝子座と名付けた（Ｓｏｍｅｒ ｖｉｌｌｅ及びＢｒｏｗｓｅ、未公開）。カノラからのリノール酸デサチュラーゼ遺伝子の単離 後述の実施例を用いて、ｆａｄ３領域から構造コード配列を単離した。ここで 説明する方法を、ｆａｄＤ又はｆａｄＥ領域の単離に使用することもできた。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの遺伝地図のｆａｄ３突然変異の大体の位置を突き止 めるために、ｆａｄ３突然変異体系ＢＬ１と、複合的にマークした突然変異体系 Ｗ１との間で有性交配種を形成した（Ｈｕｇｌｙら、１９９１）。この 交配種に由来するＦ１ハイブリドを自己受精させ、得られたＦ２植物を分離遺伝 標識形質（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）及び脂肪 酸組成変化の両方について調べた。この分析の結果、ｆａｄ３突然変異はマーカ ーｅｒｅｃｔａの近傍の染色体２上に存在することが判明した。ＲＦＬＰマッピ ングによってより正確な地図位置を得るために、ｆａｄ３突然変異体系ＢＬ１と 、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＮｉｅｄｅｒｚｅｎｚ品種との間で第二の有性交配 種を形成した。Ｆ１子孫を自己受精させてＦ２世代を形成した。完全に広がった ロゼットを形成するために、１３７個のＦ２植物を２２℃で３週間生長させ（１ ００μＥ／ｍ²／ｓ）、ＤＮＡを調製するために数枚の葉（植物当たり総重量０ ．２〜０．５ｇ）を各植物から採取した。 前記葉を液体窒素で冷凍し、乳鉢及び乳棒を用いてドライアイス上で粉砕した 。各試料ごとに冷凍粉末をマイクロフュージュ管にトランスファーし、同量の２ Ｘ ＣＴＡＢ緩衝液（２％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ ）、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ Ｎａ Ｃｌ、１％ポリビニルポ リピロリドン（ＰＶＰ）４０，０００）を加えた。これらの管を室温で５分間放 置して粉末を解凍した。該ホモジェネートをクロロホルム−イソアミルアルコー ル（２４：１、ｖ／ｖ）混合物で１回抽出し、１／１０ｖｏｌの１０ＸＣＡＴＢ （１０％ＣＡＴＢ、０．７Ｍ ＮａＣｌ）緩衝液を水相に加え、これを同量のク ロロホルムイソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）で再抽出した。水相を新 しいマイクロフュージュ管にトランスファーし、１．５倍容のＣＴＡＢ沈殿緩衝 液（１％ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を 加えた。ＤＮＡを４℃で１２時間沈殿させ、遠心分離（１０，０００ｇで５分間 ）によって回収した。ＤＮＡを１００μ１の１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ及び１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａに再懸濁し、５０℃で３０分間インキュベートした。２．２倍容のエタノール を加え氷上で２０分間インキュベートすることによりＤＮＡを沈殿させた。遠心 分離でＤＮＡを回収し、ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄し、真 空下で３分間乾燥し、１０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＤＮＡを使用するまで− ２０℃で貯蔵した。 １３７個の植物を成熟するまで生長させ、種子を個々に回収した。各植物のｆ ａｄ３表現型を調べるために、各Ｆ２植物に由来する１０個の種子の脂肪酸組成 をＢｒｏｗｓｅらの方法（１９８６）で測定した。各種子を１ｍｌのメタノール 中１Ｎ ＨＣｌ中で８０℃でインキュベートした。管を室温に冷却し、１ｍｌの ０．９％ＮａＣｌ＋０．３ｍｌのヘキサンを加えた。管をかき回して撹拌し、相 を遠心分離（３００×ｇで５分間）で分離した。ヘキサン相を貯蔵し、窒素流下 で蒸発させ、脂肪酸メチルエステルを５０μｌヘキサンに溶解した。アリコート （２μｌ）をガスクロマトグラフ上に注入し、脂肪酸メチルエステルを分離し、 文献（Ｂｒｏｗｓｅら、１９８６）に記載のように水素炎イオン化によって定量 した。 次いで、適当な濃度の１ＸＫＧＢ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、 ５単位の制限エンドヌクレアーゼ及び１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを用いて、ＤＮ Ａ試料（１μｇ）を適当な制限酵素（マーカー＃２２０の場合はＥｃｏＲ１、マ ーカーＡＳＡ２の場合はＢｇ１２）で切断した。各試料の量は１０μｌであり、 インキュベーションは３７℃で４時間実施した。フラグメントをアガロースゲル 電気 泳動（１Ｘ ＴＡＥ緩衝液中０．８％アガロース、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８ ９）で分離し、製造業者の指示に従いアルカリトランスファー法を用いてナイロ ンフィルター（ｈｙｂｏｎｄＮ＋）にトランスファーした。ナイロンフィルター を、染色体２上のｆａｄ３遺伝子座のほぼ近傍で予めマッピングした既知のＲＦ ＬＰマーカーに対応する放射性標識ＤＮＡフラグメント（Ｓａｍｂｒｏｃｋら、 １９８９）でプローブした（Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ、１９８４）。Ｒ ＦＬＰマーカー２２０（Ｃｈａｎｇら、１９８８）及びＡＳＡ２はｆａｄ３遺伝 子座の近くにマッピングされることが判明した。組換え体のパターンの分析の結 果（表１）、ＡＳＡ２及び２２０は両方ともｆａｄ３遺伝子座の同一側で、それ ぞれ０．４及び２．２センチモルガン（ｃＭ）の距離をおいて位置していた。 表１は、ｆａｄ３遺伝子座をマッピングするために使用したＦ２植物の遺伝子 型を示している。ＬはＬａｎｄｓｂｅｒｇ（ｆａｄ３突然変異体のバックグラウ ンド）を表し、ＮはＮｉｅｄｅｒｚｅｎｚを表し、Ｈはヘテロ接合体（ｈｅｔｅ ｒｏｚｙｇｏｕｓ）を表す。合計１３７個のＦ２植物を分析した。ｆａｄ３と２ ２０又はＡＳＡ２との間の組換え植物の数はそれぞれ６及び１であった。 ｆａｄ３遺伝子座を含む染色体の領域を単離するために、ＲＦＬＰマーカー２ ２０及びＡＳＡ２をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、幾つかの酵 母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーをスクリーニングした（Ｇｒｉｌｌ及びＳ ｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、１９９１；Ｗａｒｄ及びＪｅｎ、１９９０）。ＹＡＣフィ ルターはＧｒｉｌｌ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ（１９９１）に従って製造した。 ライブラリーは、ＳＣ−−（合成完全培地からドリプトファン及びウラシルを除 いたもの；Ｓｈｅｒｍａｎら、１９８６）のペトリ皿上に配置したナイロンフィ ルター上に複製した。細胞を３０℃で１２時間増殖させ、フィルターを、１Ｍソ ルビトール、５０ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で飽和したＷｈ ａｔｍａｎ ３ＭＭ紙上に１５分間 トランスファーした。 次いで、１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍｇ／ｍｌリチカーゼ （Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で飽和したＷｈａｔｍａｎ紙 上でフィルターを３０℃で１２時間インキュベートすることにより、細胞の細胞 壁をリチカーゼで消化した。次いでフィルターを、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５ Ｍ ＮａＣｌで飽和したＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ紙上に１５分間トランスファー し、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、で１５分間中和し、２ＸＳＳＣ（ＳＳＣ は１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で手早く濯い だ。フィルターを乾燥させ、真空炉に８０℃で１時間トランスファーした。その 後フィルターを、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）に従い、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って³²Ｐで標識したプローブとハイブリダイズさ せた。 ラムダソーブ（ｌａｍｂｄａｓｏｒｂ）法（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍ ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて１００ｍｌの液体培養溶解物からＲＦＬＰプロー ブ２２０のＤＮＡを調製した。ＡＳＡ２をコードするｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ３で 元のプラスミド（ｐＫＮ１４０Ｃ、Ｄｒ．Ｇ．Ｆ ｉｎｋ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ から入手）から切除し、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴのＨｉｎｄ３部位にクローニン グした。次いで、プラスミドＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従い塩 化セシウム勾配で精製し、Ｈｉｎｄ３で消化し、ＤＮＡ挿入物をＳａｍｂｒｏｏ ｋら（１９８９）に従いエレクトロエリューション（ｅｌｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏ ｎ）で２回ゲル精製した。 ライブラリーをプローブするために、ＲＦＬＰ２２０由来の完全ＤＮＡをハイ ブリダイゼーションプローブとして使用した。これに対し、ＡＳＡ２のＤＮＡ挿 入物のみをプローブとして使用した。ＲＦＬＰプローブ２２０はＹＡＣ ＥＧ４ Ｅ８及びＥＧ９Ｄ１２にハイブリダイズした。プローブＡＳＡ２はＹＡＣ ＥＷ １５Ｇ１、ＥＷ１５Ｂ４及びＥＷ７Ｄ１１にハイブリダイズした。 これらのＹＡＣがＲＦＬＰ２２０とＡＳＡ２との間に全てのＤＮＡを含んでい るかどうかを調べるために、ＥＧ４Ｅ８及びＥＷ１５Ｇ１中の挿入物の末端に由 来するＤＮＡの小領域を逆ＰＣＲによって調製した（Ｇｒｉｌｌ及びＳｏｍｅｒ ｖｉｌｌｅ，１９９１）。そのために、ＤＮＡを 適当なＹＡＣクローンから調製した。クローン（単集落）をＳＣ−−液体培養で 飽和まで増殖させ、これらの培養物１ｍｌを用いて４０ｍｌの液体培養物（ＳＣ −−培地中）を接種し、これを３０℃で１６時間増殖させた。細胞を遠心分離に よって回収し、１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄し、２００μ ｌの１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、 ｐＨ５．８、２ｍＭ β−メルカプトエタノール及び２ｍｇ／ｍｌリチカーゼに 再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。 次いで、３５０μｌの２ＸＣＴＡＢ緩衝液を加え、ＤＮＡを前述のように精製 した。各クローンのＤＮＡ（５μｇ）をＨｉｎｃＩＩ、ＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＶ及 びＲｓａＩで別個に消化した（１ＸＫＧＢ緩衝液中、３７℃で４時間、最終量５ ０μｌ）。６５℃で１５分間加熱することにより反応を停止させ、ｐＨ８のＴＥ で飽和した１倍容のフェノールで１回抽出し、次いで１倍容のクロロホルム−イ ソアミルアルコール混合物（２４：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で抽出した。ＤＮＡを エタノール沈殿によって回収し、無菌蒸留水に再懸濁した。３００ｎｇのＤＮＡ を用いて最終量５０ μｌで連結反応を実施した。反応は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ ０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、１．２ｍＭ ＡＴＰ中で、１Ｕのリガー ゼを用いて、２０℃で２時間生起させ、６８℃で３０分間加熱することにより停 止させた。 ＰＣＲ反応は下記のように実施した：使用した緩衝液は製造業者に指示された ものであるが、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ酵素の場合は例外であって、この場合 は反応混合物に更に１．４ｍＭのＭｇＣｌ₂（最終濃度２．９ｍＭ Ｍｇ）を加 えた。ｄＮＴＰ最終濃度は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ酵素を使用した時が１２ ５μＭ、他の由来源からのＴａｑポリメラーゼを使用した時が２００μＭであっ た。いずれの場合も、各オリゴヌクレオチドを１００ｎｇ使用した。最終量は１ ００μｌであった。生成物が得られなかった時は、同じ条件で、但しホルムアミ ドを最終濃度３％で加えて反応を再度実施した。 オリゴヌクレオチドＥＧ１（ＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＡＴＧＧＡＣＧ ＡＴＡ）（配列番号３）及びＥＧ２（ＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＴＣＧＡＣＴ ＡＣＧＣＧＡＴＣ）（配列番号４）を用いて、ＥｃｏＲＶ及びＲｓａＩ 消化物の連結反応生成物から左末端を増幅した。 オリゴヌクレオチドＥＧ３（ＣＣＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＧＧＡＡＴ） （配列番号５）及びＥＧ４（ＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＴＡＡ Ｇ）（配列番号６）を用いて、ＥＧライブラリーから得たクローンの右末端を、 ＡｌｕＩ及びＨｉｎｃＩＩ消化物の連結反応生成物から増幅した。 前述と同じサイクル条件で、但しアニーリング温度は５０℃に低下させて、オ リゴヌクレオチドＨ１（ＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＴＡＡＧＧＧＡＧ）（配列番号７ ）及びＨ２（ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＡＣ）（配列番号８）を用いて、 ＥＷ ＹＡＣライブラリーから得たクローンの右末端を増幅した。 反応終了後、各混合物５０μｌをアガロースゲル上で電気泳動させて、プライ マーから増幅生成物を分離した。増幅バンドを含むアガロース部分をゲルから切 除し、１ｍｌの蒸留水に溶解した。溶解したアガロース片５μｌを再増幅させる と、大量の生成物を製造することができた。次いで、ＰＣＲ生成物をエレクトロ エリューション又はＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）を用いて精製し、幾つ かの 酵素によって制限された単離ＹＡＣ ＤＮＡを含むフィルターをプローブするた めのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ＥＷ１５Ｇ１の右末端か ら形成したプローブはＥＧ４Ｅ８にハイブリダイズし、ＥＧ４Ｅ８の右末端から 形成したプローブはＥＷ１５Ｇ１にハイブリダイズした。従って、ＹＡＣ ＥＧ ４Ｅ８及びＥＷ１５Ｇ１は、ＲＦＬＰ２２０とＡＳＡ２との間の染色体の領域に 全てのＤＮＡを含んでいると結論された。 ＹＡＣクローンの大きさは、フィールド反転（ｆｉｅｌｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏ ｎ）電気泳動（ＣＨＥＦ，Ｖｏｌｌｒａｔｈ及びＤａｖｉｓ，１９８７）によっ て推定した。高分子量ＤＮＡは次の方法で製造した：ＹＡＣクローンを含む酵母 細胞を増殖させ、前述のＤＮＡ調製の場合のようにリチカーゼで処理した。次い でスフェロプラストを同量の１Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％低融 点アガロースに３７℃で再懸濁した。該混合物を、氷上に設置した型（Ｂｉｏｒ ａｄ）内に注入し、アガロースを硬化させた。 得られたプラグを、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ９、１％ラウリルサルコシン、 １ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中、 ５０℃で１２時間インキュベートした。これらのプラグを５０ｍＭ ＥＤＴＡ中 で２回洗浄し、使用するまで４℃で貯蔵した。ＣＨＥＦゲルを、１ＸＴＢＥ中、 ２００Ｖ、切替え間隔２０秒で、１６時間処理した。操作中、緩衝液の温度は１ ４℃に維持した。ＹＡＣの大きさを、ラムダラダー（ｌａｍｂｄａ ｌａｄｄｅ ｒ）及び酵母染色体との比較によって調べた。結果は次の通りであった：ＥＧ４ Ｅ８、９０ｋｂ；ＥＧ９Ｄ１２、１９０ｋｂ；ＥＷ１５Ｇ１、９０ｋｂ；ＥＷ１ ５Ｂ４、７０ｋｂ；ＥＷ７Ｄ１１、１２５ｋｂ。これらの大きさから、物理的距 離と遺伝学的距離との間の対応をほぼ決定することができた。２２０とＡＳＡ２ との間の距離は、二つのＹＡＣ、ＥＧ４Ｅ８及びＥＷ１５Ｇ１の大きさの合計で ある１８０ｋｂを超え得ない。対応する遺伝学的距離は１．７ｃＭであるため、 この特定の交配種（ｃｒｏｓｓ）及びこの特定のゲノム領域では、１ｃＭの値が １００ｋｂに近いことがほぼ推定できた。即ち、ｆａｄ３遺伝地図はＡＳＡ２か ら０．４ｃＭしか離れていないのであるから、対応する物理的距離は４０ｋｂに 近いことになる。従って我々は、ｆａｄ３が、ＡＳＡ２とハイブリダイズする最 大のＹＡＣであるＹＡＣ ＥＷ７Ｄ１１ 上に存在する確率が高いと結論した。第１図参照。 ＹＡＣ ＥＷ７Ｄ１１がｆａｄ３遺伝子を担持する可能性を検査するために、 該ＹＡＣを用いて、カノラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）の発育中の 種子から形成したｃＤＮＡライブラリーをプローブした。該ＹＡＣはＡｒａｂｉ ｄｏｐｓｉｓから単離したものではあるが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びＢ．ｎ ａｐｕｓが両方ともＣｒｕｃｉｆｅｒａｅ科に属するという事実によって、我々 は、これら２種類の植物種に由来する相同遺伝子がヌクレオチド配列レベルで十 分な同一性を有し、従ってＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子がＢ．ｎａｐｕｓ遺伝 子にハイブリダイズするであろうと推測した。我々はまた、ステアロイル−ＡＣ Ｐデサチュラーゼと化学的に類似した反応を触媒するという理由で、該ＹＡＣが 発育中の種子中で類似のやや高いレベルで発現されるであろうと推測した（Ｓｈ ａｎｋｌｉｎ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９１）。ＥＷ７Ｄ１１はゲノム全 体の約０．２％しか占めていなかったため、我々は、ＥＷ７Ｄ１１がやや多めに 発現される遺伝子（即ち、ｍＲＮＡがｍＲＮＡ全体の０．１〜０．０１％を占め る遺伝子）を約２個しか含まないと予想した。 ＹＡＣ ＥＷ７Ｄ１１のＤＮＡは次のように単離した：前述のようにＹＡＣ ＥＷ７Ｄ１１を含んでいる酵母細胞から高分子量ＤＮＡを調製し、幾つかの分取 用低融点アガロースＣＨＥＦゲルを１ＸＴＢＣ緩衝液（ＥＤＴＡをＣＤＴＡに換 えた以外はＴＢＥと同じ）中で処理した。ＹＡＣを含んでいる部分をゲルから切 除し、プールした。３個の切片を６５℃で溶融し、ＴＥで飽和した同量のフェノ ールで抽出した。水相を貯蔵し、イソブチルアルコールで繰り返し抽出して０． ５ｍｌまで減量した。残留アガロースを数回のフェノール抽出によって除去し、 その後クロロホルム−イソアミルアルコール抽出を２回行った。担体としての線 状アクリルアミド２μｇ＋５Ｍ ＮａＣｌ １０μｌと１．１ｍｌのエタノール とを加えてＤＮＡを沈殿させ、０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡペレ ットを遠心分離によって回収し、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥し、５０ μｌの蒸留水に再懸濁した。ＤＮＡ（５０ｎｇ）を放射性標識し、λｇｔ１１中 のｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに使用した。 ニトロセルロースフィルターをＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９）に記載 のように処理した。フィルターは二 つ組で使用し、良好なシグナルを得るためにフィルムを５〜７日間露出した。こ の方法でスクリーニングした２００，０００個のプラークのうち３１個がＥＷ７ Ｄ１１にハイブリダイズした。ストリンジェント条件で交差ハイブリダイゼーシ ョンにより検査した結果、これら３１個のクローンのうち１７個が互いに相同で あった。これら１７個のクローン中の挿入物の大きさを推定し、最大のｃＤＮＡ を有するクローンを更に分析すべく貯蔵した。このファージの小規模調製物をラ ムダソーブ法を用いて調製し、挿入物をＥｃｏＲＩでの制限によって切除した。 この挿入物を、ＥｃｏＲＩで線状化したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＴ ＩＩに連結し、 得られた連結反応混合物を用いて大腸菌株ＤＨ５αを形質転換した。 これらの組換えクローンのうちの一つをｐＢＮＤＥＳ３と名付け（第２図）、 配列決定のために貯蔵した。配列は、シーケナーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）酵素 （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を製造業者 の指示通りに使用して、両方の鎖の上で決定した。ｐＢＮＤＥＳ３の挿入物のヌ クレオチド配列を第３図に示す。ヌクレオチド配列中の最大の読取り枠の推定ア ミノ酸 配列も第３図に示す。 ＦＡＳＴＡプログラム（Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎ、１９８５）を用い て、クローンｐＢＮＤＥＳ３中の３８３アミノ酸読取り枠の推定アミノ酸配列と 、ＧｅｎＢａｎｋリリース７０中の既知の配列との比較を行った。この分析の結 果、ｐＢＮＤＥＳ３由来の配列は、先に特徴分析したラン色細菌Ｓｙｎｅｃｈｏ ｃｙｓｔｉｓ由来のデサチュラーゼ遺伝子に対して大きな相同を示す領域を有す ることが判明した（第４図）（Ｗａｄａら，１９９０）。これは、クローンｐＢ ＮＤＥＳ３が、おそらくはｆａｄ３構造コード配列生成物であるデサチュラーゼ をコードすることを示唆する事実であると考えられた。これはその後、遺伝学的 補足実験で確認された。 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でｃＤＮＡを植物形質転換ベクターｐＢ Ｉ１２１（第５図）中にクローニングして、ｐＴｉＤＥＳ３（第６図）を構築し た。Ｒｉプラスミドも有する腫瘍菌ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株中にプラスミドｐ ＴｉＤＥＳ３を導入し、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及びｆａｄ３突然変異体 の両方からトランスジェニック根腫瘍（ｒｏｏｔｙ ｔｕｍｏｒ）を形成するた めに使 用した。ｐＴｉＤＥＳ３の存在を確認するために、トランスジェニック組織を抗 生物質耐性に関して選択した。次いで脂肪酸メチルエステルを製造し、この組織 中で形成された脂肪酸プロフィルを確認するためにガスクロマトグラフィーで検 査した。リノレン酸含量は増加していた。これは、ｐＴｉＤＥＳ３上のｃＤＮＡ がｆａｄ３突然変異を相補い得ることを意味する。後述の実施例１で詳述するこ れらの結果は、リノール酸デサチュラーゼをコードするというｃＤＮＡのアイデ ンティティを確認するものである。 植物の構造コード配列の単離は、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子 発現操作のためのツールを当業者に与えてくれる。アンチセンスＲＮＡ技術は、 標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入をベー スとする（Ｂｉｒｄ及びＲａｙ、１９９１に概説）。その結果得られる表現型は 、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。アンチセンス効果を得るの に十分な遺伝子分量は、多くのフラグメント又はこれらの組合わがより効果的と 思われるという点で、可変である。ｃＤＮＡ又はゲノムクローンのいずれかから 単離したリノール酸デサチュラーゼの構造コード配列は、種々の分量で、リノ ール酸デサチュラーゼ含量を低下させることにより植物中のリノレン酸含量を低 下させることができると思われる。アンチセンス配向のリノール酸デサチュラー ゼ構造コード配列の使用例は実施例２で説明する。ポリアデニル化シグナル 本発明の二本鎖ＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物細胞中で機能してＲＮＡ 配列の３’末端へのポリアデニル化を促進する領域を含む。この種の領域は総て 本発明の範囲内で使用できる。適当な３’領域の具体例としては、（１）腫瘍菌 の腫瘍誘発（Ｔｉ、ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミド遺伝子、例えば ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む３’転写 非翻訳領域、並びに（２）ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子及びリブロース−１，５ −ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小サブユ ニットのような植物遺伝子の３’領域が挙げられる。好ましい３’領域の一例は 、後述の実施例で詳述するＮＯＳ遺伝子由来の領域である。植物の形質転換／再生 本発明の二本鎖ＤＮＡ分子を含むように形質転換できる植物はいずれも本発明 の範囲内に包含される。本発明の実 施によってリノレン酸含量を増加又は減少することができる好ましい植物の非限 定的具体例としては、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、コメ 、ラッカセイ、カノラ、アブラナ、オオムギ、モロコシ、ダイズ、アマ、トマト 、アーモンド、カシュー及びクルミが挙げられる。 機能的植物リノール酸デサチュラーゼ遺伝子を含む本発明の二本鎖ＤＮＡ分子 は、任意の適当な方法によって植物のゲノム中に挿入できる。適当な植物形質転 換ベクターとしては、腫瘍菌ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来す るもの、並びに例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂｅｖ ａｎ（１９８４）、Ｋｌｅｅ（１９８５）及びＥＰＯ公開第１２０，５１６号（ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔら）によって開示されているものが挙げられる。腫瘍 菌のＴｉ又は根誘導（ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ、Ｒｉ）プラスミドに由来す る植物形質転換ベクター以外に、別の方法を用いて本発明のＤＮＡ構築物を植物 細胞中に挿入することもできる。これらの方法は、例えば、リポソームの使用、 電気穿孔法、遊離ＤＮＡの取込みを増加させる化学物質、マイクロプロジェクテ ィル衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅ ｎｔ）を介する遊離ＤＮＡの送達、並びに細菌、ウイルス又は花粉を用いる形質 転換を含み得る。 単子葉植物中でのリノール酸デサチュラーゼ遺伝子の発現に適したプラスミド 発現ベクターは次のものからなる：脂質貯蔵組織中での発現に関して特異的な又 は強化された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）プロモーター、及び３’ポリアデニル化配列 、例えばノパリンシンターゼ３’配列（ＮＯＳ３’；Ｆｒａｌｅｙら、１９８３ ）。この発現カセットは、大量のＤＮＡの生成に適した高コピーレプリコン上で 組み立てられ得る。 双子葉植物の形質転換に使用するための特に有用な腫瘍菌ベースの植物形質転 換ベクターは、プラスミドベクターｐＭＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．， １９８７）である。プラスミドｐＭＯＮ５３０（第７図参照）は、ｐＭＯＮ３１ ６の２．３ｋｂ ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ． Ｇ．，１９８７）をｐＭＯＮ５２６中にトランンスファーすることによって製造 したｐＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５２６は、ＳｍａＩ部 位がＸｍａＩでの消化と、クレノウポリメラーゼでの処理と、連結反応とによっ て除去された単純 なｐＭＯＮ５０５誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５３Ｏは、ｐＭＯＮ５０５ 及びＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ発現カセットの特性を総て保持しており、プロモー ターとポリアデニル化シグナルとの間にＳｍａＩの非反復開裂部位を含む。 ベクターｐＭＯＮ５Ｏ５は、Ｔｉプラスミド相同領域ＬＩＨがミニＲＫ２プラ スミドｐＴＪＳ７５（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ及びＨｅｌｉｎｓｋｉ、１９８ ５）の３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｍａＩセグメントに置換された、ｐＭＯ Ｎ２００の誘導体である（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．、１９８７）。前記セグメン トは、ＲＫ２複製起点ｏｒｉＶと、三親交配法（ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ ｍ ａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて腫瘍菌に接合するためのトランンス ファー起点ｏｒｉＴとを含む（Ｈｏｒｓｃｈ及びＫｌｅｅ、１９８６）。プラス ミドｐＭＯＮ５０５は、所望のＤＮＡフラグメントを挿入するための合成マルチ リンカー（ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｋｅｒ）、植物細胞のカナマイシン耐性のための キメラＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ’／ＮＯＳ遺伝子、大腸菌及びＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ中の選択のためのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決 定因子、形質転換体及び子孫遺伝の検査を容易にするための完全ノパリンシンタ ーゼ、並びに大腸菌中での大量のベクターの製造を容易にするｐＢＲ３２２複製 起点を含めて、ｐＭＯＮ２００の重要得な特徴を総て保持する。プラスミドｐＭ ＯＮ５０５は、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−ＤＮＡの右末端に由来する単一Ｔ− ＤＮＡボーダーを含む。サザン分析の結果、プラスミドｐＭＯＮ５０５及びこれ を有する任意のＤＮＡが植物ゲノム中に組込まれている、即ちプラスミド全体が 植物ゲノム中に挿入されたＴ−ＤＮＡであることが判明した。組込まれたＤＮＡ の一方の末端は右方ボーダー配列とノパリンシンターゼ遺伝子との間に位置し、 他方の末端は前記ボーダー配列とｐＢＲ３２２配列との間に存在する。 リノール酸デサチュラーゼ遺伝子を含む細胞（又はプロトプラスト）が適当数 得られたら、細胞（又はプロトプラスト）を完全植物（ｗｈｏｌｅ ｐｌａｎｔ ）に再生する。再生ステップの方法の選択は決定的に重要なものではなく、Ｌｅ ｇｕｍｉｎｏｓａｅ（アルファルフア、ダイズ、クローバー等）、Ｕｍｂｅｌｌ ｉｆｒａｅ（ニンジン、セロリ、パースニップ）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ（キャ ベツ、ラデイ ッシュ、アブラナ等）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ（メロン及びキュウリ）、 Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（コムギ、コメ、トウモロコシ等）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ （ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）及び種々の花作物に由来する宿主に ついては適当なプロトコルが使用可能である。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏ（１９ ８４）、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ（１９８９）、Ｆｒｏｍｍ（１９９０）、Ｖａｓｉ ｌ及びＶａｓｉｌ（１９９０）参照。リノール酸デサチュラーゼの使用 本発明は、植物又は植物組織の油含量の任意の調節（増加、減少又は単なる変 化）に使用し得る。リノレン酸は、植物細胞の幾つかの膜の重要な成分である。 好ましい方法の一つは、植物の温度感受性を改善するために植物の油含量を調 節することからなる。例えば、リノレン酸に欠けている植物は低温での適応度が 低い（Ｈｕｇｌｙ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９２）。また、植物組織中の リノール酸含量が高いことは、高等植物の耐凍結性の要因の一つであるとされて きた（Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓら、１９９０及びその中の参考文献）。好ましい実施 態様では、リノール酸デサチュラーゼ構造コード配列の発現に よって、高等植物を低い環境温度に耐えられるように遺伝学的に改質することが できる。ｐＴｉＤＥＳ３での形質転換は、この遺伝子の構成的発現によってリノ レン酸含量が増加し得ることを立証している。作物の低温又は凍結による損傷は 、適当なプロモーターを用いて植物組織又は生殖組織中で前記遺伝子を発現させ ることにより克服し得る。 ポリ不飽和脂肪酸であるリノレン酸は、酸化速度が速いために、ペイント及び ワニス工業でも広く使用されている。アマ種子はこの油の主要供給源である。ア ブラナ又はダイズの該脂肪酸の含量を高くすれば、これらの供給源に由来する植 物油をアマニ（アマ）油の代わりに使用できるようになるであろう。種子組織中 でのリノール酸デサチュラーゼ構造コード配列の発現は、貯蔵油のリノレン酸の 比率を高めることができる。 リノレン酸はまた、重要な植物生長調節物質であるジャスモン酸の生合成にお ける前駆体でもある。リノレン酸は、リポキシゲナーゼによって酸素を炭素鎖に 導入、次いで脱水、還元及び数回のβ−酸化を行うことによりジャスモン酸に変 換される（Ｖｉｃｋ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ、１９８４）。ジャスモン酸の活性 は、病原体防御応答を誘起す る能力として測定されてきた。遊離リノレン酸を植物に適用することにより、植 物の病原体防御を誘起することもできる（Ｆａｒｍｅｒ及びＲｙａｎ、１９９２ ）。遊離リノレン酸がジャスモン酸に関連した効果を発揮する能力を説明するた めに、あるモデルが提案された（Ｆａｒｍｅｒ及びＲｙａｎ、１９９２）。リノ レン酸からジャスモン酸への変換に必要な総ての酵素活性は細胞中に構造的に存 在し、ジャスモン酸の生成における律速段階は遊離リノレン酸の利用性であると 仮定されている。遊離リノレン酸は、形質膜中のリパーゼの活性によって生成さ れる可能性もある。 外因性ジャスモン酸は、損傷よりも強力に防御応答を活性化することができる ことも観察された。これは、損傷がジャスモン酸の大量産生を支えるのに十分な 遊離リノレン酸を生成することがてきないことを示唆する。リパーゼの活性又は リパーゼの適当な基質の利用性は、損傷時の律速であり得る。使用可能な基質を 増量し、形質膜のリノレン酸含量を増加させれば、ジャスモン酸の生成を促進す ることによって、病原体に応答する植物の能力を高めることが可能である。リノ ール酸デサチュラーゼ構造コード配列の発現は、植物細胞の形質膜中のリノレン 酸のモル％を増加 させることができ、従ってジャスモン酸シグナル経路を促進することができる。 我々の意図は、根及び葉の組織のリノレン含量が高い植物を病原体耐性について 評価することにある。 また、食用油のリノレン酸含量が高いことは望ましくない。リノレン酸は調理 の間不安定であり、酸化し易い。酸化生成物は最終製品の風味を低下させる。リ ノレン酸含量が約３％以下、好ましくは２％以下のナタネ油又はダイズ油は食用 油として使用するのに理想的である。これらの油のリノレン酸含量は、リノール 酸デサチュラーゼの構造コード配列のアンチセンスの発現によって低下させるこ とが可能である。 総ての高等植物はリノレン酸を有し、従ってリノール酸デサチュラーゼの遺伝 子を含んでいる。ある植物種から単離した遺伝子を使用して別の植物種から相同 遺伝子を単離した例は多くあるため、当業者には明らかなように、ここに示す結 果は、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｆａｄ３遺伝子の使用、又はＢ．ｎａｐｕｓの脂肪酸組 成を調節するための遺伝子の使用のみに固有のものではない。明らかに、多くの 生体に由来するリノール酸デサチュラーゼは植物におけるリノ レン酸の生合成及び蓄積を高めるのに使用し得、他の任意の高等植物又は藻類に 由来する酵素はリノール酸デサチュラーゼ遺伝子の供給源として使用し得る。例 えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を含むＹＡＣを用いてＢ．ｎａｐｕｓ遺伝 子を単離したのであるから、ｐＢＮＤＥＳ３中の挿入物を、別の植物種からの対 応する完全長遺伝子を単離するためのゲノムライブラリープローブとして使用し 得ることは明らかである。また、この遺伝子の配列に含まれている情報が、別の 脂質デサチュラーゼ遺伝子をクローニングするのに有用であることも考えられる 。 センス配向でのリノール酸デサチュラーゼの発現は、リノレン酸含量の低い植 物の単離を可能にし得る。これは、同時抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）メ カニズムによって達成し得る（Ｂｉｒｄ及びＲａｙ，１９９１）。同時抑制の分 子メカニズムは現時点では余り解明されていないが、植物ゲノム中に存在する対 立遺伝子と同一の又は極めて相同の遺伝子で植物を形質転換した時に生起する。 植物中のキメラ遺伝子の発現によって、キメラ遺伝子及び内因性遺伝子の両方に 由来する遺伝子産物を減少させることができる例も幾つか存在する。リノレン酸 含量の低下という結果 がリノール酸デサチュラーゼ構造コード配列の発現の直接的結果であり、形質転 換植物のリノレン酸活性に相関するものであろうことは、当業者に認識されよう 。 植物細胞中のリノレン酸含量は、植物リノール酸デサチュラーゼ遺伝子の上流 調節エレメントと相互作用する転写因子をコードする遺伝子を単離することによ って調節することもできる。植物細胞中でのこれら転写因子の発現の促進は、リ ノール酸デサチュラーゼ遺伝子の発現に作用し得る。これらの条件下では、メカ ニズムは異なるが、リノール酸デサチュラーゼ酵素の活性の対応する増減によっ てリノレン酸含量が増減する。転写因子の単離方法は既に開示されている（Ｋａ ｔａｇｉｒｉ、１９８９）。 以下の実施例は、本発明の実施方法をより明らかにするためのものであり、本 発明の範囲を限定すると解釈すべきものではない。当業者には明らかなように、 ここに記載の方法及び遺伝子は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変形 、切頭等が可能である。実施例１ リノレン酸を増加させるためのｆａｄ３遺伝子の発現 ｐＢＮＤＥＳ３中のｃＤＮＡ挿入物がリノール酸デサチュ ラーゼをコードするという想定を確認するために、野生型及びｆａｄ３突然変異 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの両方をｃＤＮＡ挿入物を含むように形質転換した。植 物細胞中でリノール酸デサチュラーゼ構造コード配列（以後「ｆａｄ３遺伝子」 と称する）を発現するために、プラスミドｐＢＮＤＥＳ３をＸｈｏＩで消化し、 末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで充填した（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋら、１９８９）。次いでｃＤＮＡ挿入物をＳａｃＩでの消化によって切除し、 バイナリーＴｉプラスミドベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）のＳａｃＩ及びＳｍａＩ部位に連結して、ＧＵＳ読取り枠を 置換した。連結反応は１００ｎｇの挿入物及びベクターと１単位のＴ４ ＤＮＡ リガーゼとを用いて、２０μｌで、１６℃で１２時間実施した。連結反応混合物 を用いてコンピテントＤＨ５α大腸菌細胞（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に従 い塩化カルシウム法で製造）を形質転換し、形質転換体を、５０μｇ／μｌのカ ナマイシンを入れたＬブロスプレート上で選択した。組換えクローンのアルカリ 性ミニプレパレーション（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を正確な制限パタ ーンについて分析した。これらのプラス ミドのうちの一つ、ｐＴｉＤＥＳ３を更に別の実験に使用した。 このプラミドを、Ｒｉプラスミドを有するＡａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｒ１０００中に電気穿孔法で導入した（Ｍｅｒｓｅｒｅ ａｕ及びＰａｚｏｕｒの方法、１９９０）。形質転換した細菌をカナマイシンＬ Ｂプレート上で、３０℃で２日間にわたり選択した。幾つかの組換え細菌のＤＮ Ａミニプレパレーションを作成し、前述のように分析して構築体の存在を確認し た。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの野生型及びｆａｄ３突然変異体の若い開花茎を、１ ０％市販漂白剤、０．０２％トリトンＸ１００中で３０分間殺菌し、開花茎を含 む２ｃｍの外植片にＲ１０００（ｐＴｉＤＥＳ３）を感染させた。この操作は、 ５０μｇ／ｍｌカナマイシンを加えたＬＢ培地中の単集落から増殖させた適当な Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一夜培養物一滴の中に切断端部を浸漬することに よって実施した。 感染した茎を固体ＭＳＯ培地（Ｇｉｂｃｏ ＭＳ塩＋Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ビ タミン、３％蔗糖及び０．８％寒天）で２日間培養した。この時点で、細菌を殺 すために２００ μｇ／ｍｌのセホタキシムを加えたＭＳＯ培地に茎セグメントを５日間トランス ファーした。約２週間後、茎外植片の細胞中へのＲｉプラスミドの部分のトラン スファーの結果として、大部分の茎外植片が根腫瘍（ｒｏｏｔｙ ｔｕｍｏｒ） を発生した。バイナリーＴｉプラスミドｐＴｉＤＥＳ３をも受容した根腫瘍を同 定するために、各処理に由来する約２４個の根腫瘍を、５０μｇ／ｍｌのカナマ イシンを含むＭＳＯ培地にトランスファーし、バイナリーＴｉプラスミドで同時 形質転換したこれらの根の生長について選択した。培地には、細菌の増殖を防止 するために２００μｇ／ｍｌのセホタキシムも加えた。更に２週間の増殖期間後 、根から脂肪酸メチルエステルを調製して（前述の方法）、ガスクロマトグラフ ィーで分析した。これらの分析の結果を表２に示す。 表２は、トランスジェニック根の脂肪酸組成を示している。ベクター（ｐＢＩ １２１）又はプラスミドｐＴｉＤＥＳ３を有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｒ１０００を野生型又はｆａｄ３突然変異体に感染させることによって得たトラ ンスジェニック根を、カナマイシン（５０ｇ／ｍｌ）の存在下で３週間増殖させ て、これらのプラスミドのうちの一つで同時形質転換した根を同定した。根の脂 肪酸組成を前述のように測定した（Ｂｒｏｗｓｅら、１９８６）。表２で使用し た略号は下記の通りである：１６：０、パルミチン酸；１６：１、パルミトレイ ン酸；１８：０、ステアリン酸；１８：１、オレイン酸；１８：２、リノール酸 ；１８：３、リノレン酸。表示した値は平均値±ＳＤ（ｎ＝１２）である。 これらの結果から明らかなように、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はｆａｄ ３突然変異体におけるｐＢＩ１２１を含む根腫瘍の発生により、脂肪酸組成が、 ｐＢＩ１２１を含まない野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はｆａｄ３突然変異体 と比べて変化することはなかった。これに対し、ｆａｄ３突然変異体をプラスミ ドｐＴｉＤＥＳ３で形質転換すると、リノレン酸含量が大幅に増加した。ｐＢＩ １２ １で形質転換したｆａｄ３突然変異体のリノレン酸含量が６．７＋／−０．７％ であるのに対し、ｐＴｉＤＥＳ３が存在する場合には、脂肪酸の４２．１％がリ ノレン酸として蓄積された。このリノレン酸含量の増加に伴い、リノール酸含量 が対応する程度だけ減少した。従って、ｆａｄ３遺伝子がリノール酸デサチュラ ーゼをコードすることは明白である。ｆａｄ３遺伝子を野生型組織に導入した場 合もやはりリノレン酸の蓄積が大幅に増加し、これに対応してリノール酸が減少 した（表２）。このように、これらの結果は、植物組織のリノール酸含量がリノ ール酸デサチュラーゼの高度の発現によって増加し得ることを明らかにしている 。この実施態様では、ｆａｄ３遺伝子が、ｐＢＩ１２１上に担持された構成的高 レベルＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写制御下におかれた。これらの結果は、 このプロモーターからの発現が、ｆａｄ３遺伝子の発現レベルを、内因性ｆａｄ ３プロモーターからの発現によって通常達成されるレベルより高くすることを意 味する。ここに示した結果は、ｆａｄ３遺伝子が、リノレン酸含量を増加させる ための高等植物の遺伝学的改質において極めて有用であることを明らかにしてい る。実施例２ リノレン酸含量を低下させるためのｆａｄ３遺伝子のアンチセンス発現 遺伝子工学的手法によってリノール酸デサチュラーゼ活性を低下させるために 、ｐＢＮＤＥＳ３のｃＤＮＡ挿入物をアンチセンス方位で植物発現カセット中に クローニングした。ｐＢＮＤＥＳ３の９５９ｂｐ ＢｇｌＩＩ制限フラグメント をアンチセンス発現ベクターで使用した。このフラグメントは、ｃＤＮＡの開始 メチオニンコドンの１５２ヌクレオチド下流から、コード領域のＣ末端の近傍に 位置する第二のＢｇｌＩＩ制限部位までのフラグメントである。このフラグメン トからコード領域の１８９個のヌクレオチドを除去した。ｆａｄ３遺伝子フラグ メントを用いて三重連結反応を実施し、二つの別個の植物発現カセットを構築し た。 種子特異的発現カセットは、ｐＢＮＤＥＳ３のＢｇｌIIフラグメントをアンチ センス方位でβ−コングリシニンのα’サブユニットのダイズプロモーター（７ Ｓプロモーター）の後ろに挿入することにより構築した。ｐＭＯＮ５２９に由来 する７Ｓプロモーターを含む９７５ｂＰのＨｉｎ ｄＩＩＩ〜ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＢｇｌＩＩで３７℃で３０分間消化し、 次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えることにより製造した。反応を２０分間生起させ、次 いでＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１）精製システムを用いて線状化ＤＮＡ を精製した。次いでＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ノパリンシンターゼ３ ’領域とｐＵＣベクターバックボーンとを含むｐＭＯＮ９９９由来のフラグメン トを、ＢａｍＨＩでの消化及びＣＩＡＰでの処理によって製造した。ＤＮＡをＧ ｅｎｅＣｌｅａｎ処理によって精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＢＮＤＥ Ｓ３フラグメントをＢｇｌＩＩでの消化によって製造した。これら三つのフラグ メントをアガロースゲル電気泳動及びＧｅｎｅＣｌｅａｎ処理によって精製した 。５０〜２００ｎｇの精製フラグメントを室温で１時間連結させ、次いで大腸菌 株ＪＭ１０１中に形質転換した。得られた形質転換体コロニーを用いて、プラス ミド形成及び制限消化分析を行なった。ＢｇｌＩＩ及びＮｃｏＩでの二重消化を 用いて、アンチセンス方位でｆａｄ３遺伝子を含む形質転換体のスクリーニング を行った。一つのクローンを適正な ものとしてｐＭＯＮ１３８０１と名付けた。 第二の発現カセットは、植物中のアンチセンスメッセージの構成的発現を可能 にすべく構築した。強化した３５Ｓプロモーターを含むフラグメントを、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩでの制限消化と、その後の前述のＣＩＡＰ処理とによっ てｐＭＯＮ９９９から製造した。アガロースゲル電気泳動とＧｅｎｅＣｌｅａｎ 処理とによって適正な大きさのフラグメントを得た。この構築では、前述のよう に精製したＢｇｌＩＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントとｐＢＮＤＥＳ３ のＢｇｌＩＩフラグメントとを使用した。連結、形質転換及びクローンのスクリ ーニングは前述のように実施した。一つのクローンを適正なものとしてｐＭＯＮ １３８０２と名付けた。 ｐＭＯＮ１３８０１及びｐＭＯＮ１３８０２のどちらでも、プロモーター、ｆ ａｄ３遺伝子及びＮｏｓ３’領域はＮｏｔＩ制限フラグメント上で単離できる。 次いでこれらのフラグメントをベクターｐＭＯＮ１７２２７のＮｏｔＩ部位に挿 入して、グリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）選択可能植物形質転換ベクター を構築することができる。ベクターＤＮＡは、ＮｏｔＩでの消化とその後のＣＩ ＡＰ 処理とによって製造する。ｆａｄ３含有フラグメントは、ＮｏｔＩでの消化、ア ガロースゲル電気泳動及びＧｅｎｅＣｌｅａｎでの精製によって製造する。連結 反応は、約１００ｎｇのベクターと２００ｎｇの挿入ＤＮＡとを用いて、室温で １．５時間実施する。大腸菌株ＬＥ３９２中への形質転換後、ｆａｄ３発現カセ ットを含むクローンを同定すべく、形質転換体を制限消化によってスクリーニン グした。ｆａｄ３カセットからの転写が選択可能マーカーからの転写と同じ方向 にあるクローンを適正とみなし、ｐＭＯＮ１３８０４（ＦＭＶ／ＣＰ４／Ｅ９、 ７Ｓ／アンチｆａｄ３／ＮＯＳ）（第８図）及びｐＭＯＮ１３８０５（ＦＭＶ／ ＣＰ４／Ｅ９、Ｅ３５Ｓ／アンチｆａｄ３／ＮＯＳ）（第９図）と名付けた。 カノラ細胞（ｃａｎｏｌａ ｃｅｌｌ）を形質転換するための準備で、ｐＭＯ Ｎ１３８０４及びｐＭＯＮ１３８０５を、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３と の三親交配により、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩ中に交配した。 形質転換によって製造した植物に由来する種子を、脂肪酸プロフィルの変化に ついて分析した。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）を種子組織から調製し、 毛管ガスクロ マトグラフィーで分析した（Ｂｒｏｗｓｅら、１９８６）。植物の最初のスクリ ーニングでは、個々の植物からの６個の種子を一緒にプールした。これらの種子 を粉砕し、ＦＡＭＥＳ抽出物を形成した。対照植物、選択可能マーカー（ｐＭＯ Ｎ１７２２７）のみで形質転換した植物も同じ方法で分析した。プールした種子 試料に関する最初のスクリーンから、リノレン酸含量の低下を示した系統が幾つ か同定された。リノレン酸含量の低い系統を、個々の種子に由来する脂肪酸プロ フィルを決定することによって再分析した。候補系統及び選択した対照植物から 、４〜２０個の個々の種子を分析した。ＦＡＭＥＳ分析の結果は第９図にまとめ て示す。 第９図は、トランスジェニック系統１３８０４−５１の２０個の種子の脂肪酸 含量を対照種子と比較してモル％で示している。パネルＡはオレイン酸、パネル Ｂはリノール酸、パネルＣはリノレン酸を示している。 第９図のデータは、リノール酸デサチュラーゼのアンチセンス発現が、その結 果得られた種子組織の脂肪酸プロフィルを大きく変えたことを示している。リノ レン酸の比率は、種子組織中の総脂肪酸の２％よりやや多いレベルに減少し た。リノール酸の比率はやや減少し、驚くべきことに、種子中のオレイン酸の比 率は約７０％に増加した。これは、作物植物の脂肪酸プロフィルの操作にｆａｄ ３遺伝子の使用を適用できることを示すものである。 種子組織全体から抽出したＦＡＭＥＳの脂肪酸プロフィルの変化が種子油フラ クションに反映されることを立証するために、ｆａｄ３アンチセンス植物の種子 に由来するトリグリセリドの特徴を調べた。１０個の種子をプールし、２ｍｌの メタノール：クロロホルム：水（４：２：１）中で粉砕することにより、総脂質 抽出物を調製した。このホモジェネートを２０分間静置し、次いで残渣をペレッ ト化し、廃棄した。上清に４００μｌのクロロホルム：メタノール：（２：１） と、６４０μｌのクロロホルムと、７４０μｌの水とを加え、撹拌した。遠心分 離によって相を分離し、クロロホルム相を回収し、窒素下で乾燥した。試料を１ ００μｌのクロロホルムに再懸濁し、１０μｌを分離用シリカゲルＧ薄層クロマ トグラフィープレートに適用した。二つの同じプレートを用意し、そのうちの一 つを展開後に焼き、他方のプレート上での分析すべきスポットのアラインメント 及び位置決めを可能にした。プレートを石油 エーテル：ジエチルエーテル：酢酸（９０：１０：１）中で３回展開させた。一 方のプレートに５０％硫酸を噴霧し、脂質の検出を可能にすべく炉内で９０℃で 加熱した。トリグリセリドフラクションは、購入した脂質標準（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ｃａｔ＃１７８−１３）と共にプレート上で同時移動 （ｃｏｍｉｇｒａｔｉｎｇ）するものとして同定された。焼いたプレートを同一 プレートに対してアラインメントし、トリグリセリドフラクションをプレートか ら掻き取った。前述と同じ手順でＧＣ分析用ＦＡＭＥＳ抽出物を製造すべく脂肪 酸をトランスエステル化した。トリグリセリドフラクションの脂肪酸プロフィル は表３に示す。このプロフィルは、このフラクションのリノレン酸含量が低下し ていることを示している。 表３は、対照及びトランスジェニック系統に由来するトリグリセリドフラクシ ョンの脂肪酸のモル％を比較している。これらの結果は、ｆａｄ３遺伝子を用い て植物の貯蔵油中のリノレン酸含量を低下させることができることを明らかに示 している。この遺伝子は、種子貯蔵油から誘導される生成物を改善すべく種子貯 蔵油の脂肪酸プロフィルを操作するためのツールを提供する。 この実施例２の驚くべき結果は、アンチセンスｆａｄ３遺伝子がオレイン酸含 量に及ぼす作用である。遺伝子のアンチセンス発現が内因性遺伝子の活性に作用 を及ぼす正確なメカニズムは不明であるが、このメカニズムは明らかにセンス遺 伝子産物とアンチセンス遺伝子産物との相同の関数である。前述の実験結果に基 づいて考えれば、使用したｆａｄ３遺伝子アンチセンスメッセージ部分が、一つ 以上のオレイン酸デサチュラーゼの活性を与える遺伝子に対してある程度の相同 を有すると推測してもおかしくはないであろう。従って、前記発明の別の利点は 、リノール酸デサチュラーゼアンチセンスメッセージの発現がオレイン酸デサチ ュラーゼ活性に作用し得る可能性があるという点にある。 アンチセンスｆａｄ３植物のオレイン酸デサチュラーゼ活性が低いという予期 しなかった特徴は、アンチセンス植物及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆａｄ３突 然変異体の脂肪酸プロフィルを比較すれば最も明白である。ｆａｄ３突然変異体 植物のリノール酸含量は、リノール酸デサチュラーゼ活性を突然変異によって消 失した時に増加した。これは、オレイン酸デサチュラーゼの活性が、リノール酸 デサチュラーゼ活性の損失又はリノール酸の蓄積によって大きく左右されなかっ たことを意味する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｆａｄ３突然変異体では、リノレ ン酸含量が低下した時にリノール酸含量が増加した。しかしながら、アンチセン スｆａｄ３植物では異なるパターンが生起した。リノレン酸比率の低下を示した 植物では、リノール酸比率の対応する増加はなく、しばしば低下が見られる。ア ンチセンスｆａｄ３植物ではオレイン酸比率の増加が見られる。これは、これら の植物ではオレイン酸デサチュラーゼ活性が低下していることを示すものであろ う。ｆａｄ３突然変異及びｆａｄ３アンチセンス発現が脂肪酸プロフィルに及ぼ す作用は同等ではない。これは、リノール酸デサチュラーゼのアンチセンス発現 が、植物中のオレイン酸デサチュラ ーゼ活性を低下させることができることを意味する。実施例３ ダイズのリノレン酸含量の調節 Ｂ．ｎａｐｕｓ由来のｆａｄ３遺伝子の単離は、対応する遺伝子又はｃＤＮＡ を別の植物種から単離するためのツールを当業者に供給する。ある植物種に由来 する遺伝子を用いて別の植物種から相同遺伝子を単離した例は多く存在する。リ ノレン酸含量の調節によって改善することができた植物の一つはダイズである。 ダイズ油は典型的には、油中の脂肪酸の７〜９％の割合でリノレン酸を含む。 この含量は望ましいものではない。なぜなら、加熱時の不安定性を促進し、最終 製品の風味を低下させるからである。リノレン酸含量は、ダイズｆａｄ３遺伝子 又はｃＤＮＡを発育中の種子内でアンチセンス方位で発現させることにより減少 させることができる。この実施例では、ダイズからｆａｄ３ ｃＤＮＡを単離す る方法の一つを説明する。しかしながら、遺伝子の一部又は全部をアンチセンス 発現することによってリノール酸デサチュラーゼ活性を低下させるためにも使用 し得る類似の方法を、ゲノムクローンの単離に使用することもできる。 Ｂ．ｎａｐｕｓ由来のｆａｄ３遺伝子を、ダイズｍＲＮＡから構築したｃＤＮ Ａライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用する。種子中の リノレン酸を減少させるために使用するｃＤＮＡを単離するために、ｍＲＮＡの 単離に使用する最適組織は発育中の種子である。しかしながら、ｃＤＮＡライブ ラリーの構築及び分析に使用できる方法及びベクターの選択には柔軟性がある（ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ｃＤＮＡライブラリーの構築の手順は、クロ ーニング材料の製造業者、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のような実験手 引きから得られる。ダイズから適当なｆａｄ３ ｃＤＮＡを構築したら、Ｂ．ｎ ａｐｕｓ由来のｆａｄ３ ｃＤＮＡの全部又は一部を標識し、ライブラリーのプ ローブとして使用する。ＤＮＡフラグメントは、放射性又は非放射性スクリーニ ング処理用に標識し得る。ライブラリーは適当なストリンジェント条件下でスク リーニングする。条件は、Ｂ．ｎａｐｕｓ及びダイズのｆａｄ３遺伝子の間の相 同度に応じて決定する。プローブ陽性クローンを標準的方法でプラーク精製し、 制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特徴を調べた。クローンは、配 列分析から得たデータに基づいて、又 は植物中での発現により、ダイズｆａｄ３であると結論される。 クローンの全体又は一部をアンチセンス方位でプロモーター配列の下流に配置 する。適当なプロモーターとしては、種子特異的プロモーター、例えば７Ｓ（β −コングリシニン）α’−サブユニットプロモーター、又は組織特異性がより低 いプロモーター、例えばＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが挙げられる。転写の終 結と、ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加とを生起さ せるために、適当な３’非翻訳領域をアンチセンスｃＤＮＡの下流に配置する。 次いでこの発現カセットを、選択可能な又は評価可能な（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マ ーカー遺伝子と組合わせ、遊離ＤＮＡ送達（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９９０）又 はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをベースとする植物形質転換方法（Ｈｉｎｃｈｅ ｅら、１９８８）によってダイズ細胞を形質転換する。回収した植物の種子を発 育させ、成熟した種子を前述の手順によるＦＡＭＥＳの製造に使用する。ＦＡＭ ＥＳ抽出物をガスクロマトグラフィーで分析して、種子中のリノレン酸含量が低 下した植物系統を同定する。 前記方法に替わる方法の非限定的具体例としては、ライブラリーをスクリーニ ングするためのプローブとしての縮重オリゴヌクレオチドの使用が挙げられる。 縮重オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝コードの縮重が制限されているｆａｄ ３アミノ酸配列の短いセグメントを選択するか、又はＢ．ｎａｐｕｓのｆａｄ３ 遺伝子と別の公知のリノール酸デサチュラーゼ、例えばラン色細菌Ｓｙｎｅｃｈ ｏｃｙｓｔｉｓ由来のデサチュラーゼとの間に高度に保存されていると思われる 配列を選択することによって最適に設計される。オリゴヌクレオチドは、標識し てダイズｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに使用し得る。あるいは、縮重 オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅によりダイズｃＤＮＡの一部又は全部を単離 するためのプライマーとして使用することもできる。 類似の方法を用いて、相同遺伝子を別の植物種から単離することもできる。リ ノレン酸含量の調節によって改善し得る別の好ましい植物種はアマである。アマ 油は典型的には、油中の脂肪酸の４５〜６５％の割合でリノレン酸を含む。この 含量は望ましいものではない。なぜなら、加熱時の不安定性を促進し、最終製品 の風味を低下させるからで ある。実施例４ リノレン酸含量を低下させるためのｆａｄ３のセンス発現 ｆａｄ３遺伝子のクローニングは、同時抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ）メカニズムを介してリノレン酸含量を低下させるためのツールも提供する。同 時抑制の分子メカニズムは、植物ゲノム中に存在する対立遺伝子と同一か又は極 めて相同の遺伝子で植物を形質転換した時に生起する（Ｂｉｒｄ及びＲａｙ、１ ９９１）。植物中のキメラ遺伝子の発現によって、キメラ遺伝子及び内因性遺伝 子の両方に由来する遺伝子産物を減少させることができる例は幾つか存在する。 従って、Ｂ．ｎａｐｕｓのｆａｄ３遺伝子産物は、単離したｆａｄ３ ｃＤＮＡ の全部又は一部でＢ．ｎａｐｕｓを形質転換することにより減少させ得る。結果 として得られる植物は、キメラ遺伝子が発現された組織のリノール酸デサチュラ ーゼ活性が低下している。リノール酸デサチュラーゼ活性の低下の表現型は、リ ノレン酸含量の低下である。同時抑制のメカニズムは、ｆａｄ３遺伝子がクロー ニングされる任意の植物種に適用し得、該植物種はｆａｄ３でセンス方位で形質 転換される。 同時抑制メカニズムによってリノレン酸含量を低下させるために、植物形質転 換構築体をセンス方位でｆａｄ３遺伝子又はｃＤＮＡを用いて組み立てる。クロ ーンの全体又は一部をセンス方位でプロモーター配列の下流に配置する。適当な プロモーターとしては、種子特異的プロモーター、例えば７Ｓ（β−コングリシ ニン）α’−サブユニットプロモーター、又は組織特異性がより低いプロモータ ー、例えばＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターが挙げられる。転写の終結と、ＲＮＡ 配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加とを生起させるために、 適当な３’非翻訳領域をｆａｄ３遺伝子の下流に配置する。次いで、この発現カ セットを選択可能マーカー遺伝子と組合わせ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをベ ースとする植物形質転換方法によってＢ．ｎａｐｕｓ細胞を形質転換する。回収 した植物の種子を発育させ、成熟した種子を用いてＦＡＭＥＳを製造し、これを ガスクロマトグラフィーで分析して、種子中のリノレン酸含量が低下した植物系 統同定する。実施例５ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの葉緑体デルタ１５デサチュラーゼの単離 制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを用いてｆａｄ３ｃＤＮＡ挿入物から９５ ９ｂｐのフラグメントを切除し、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（ １９８３）に従って放射性標識した。このフラグメントを用いて、前述のように （実施例１）、但しハイブリダイゼーション温度を５２℃にして、Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｃＤＮＡライブラリーをプローブした。幾 つかのｃＤＮＡクローンは陽性であり、そのうちの一つ（ｐＶＡ１）を更に特徴 分析した。このクローンの推定アミノ酸配列は、Ｎ末端以外の部分がｆａｄ３に 対して高度の相同を示した。ｃＤＮＡ挿入物をＴｉベクターｐＢＩ１２１中の３ ５Ｓプロモーターの制御下におき、得られた構築物ｐＢＩＶＳ１２をＡｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｃ５８ｐＧＶ３１０１）中に電気穿孔法で導入した。この細 菌を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ突然変異体ｆａｄＤを形質転換した。形質 転換のために、植物を光強度１００／μＥ／ｃｍ^-2、温度２２℃で、早熟種子の 発生（ｂｏｌｔｉ １０ｍｍ）を除去し、植物に前記細菌の一夜培養物を一滴接種した。同じ操作を ７日後に繰り返した。 次いで、植物の種子を発育させた。５０ｐｇ／ｍｌカナマイシンを入れたＭＳ Ｏプレート上に種子をプレーティングして（１５０ｍｍペトリ皿当たり２５００ 個の種子）、構築物を組込んだ植物を選択した。形質転換植物が一つ得られた。 その葉の脂肪酸をガスクロマトグラフイーで分析した（表４）。得られた結果は 、ｐＢＩＶＳ１２構築体が、ｆａｄＤ突然変異体のリノレン酸及びヘキサデカト リエン酸の含量を、野生型と同じか又はそれより高いレベルまで回復させること ができることを示している。これは、ｐＶＡ１２がｆａｄＤ遺伝子をコードする ことを意味する。 表４は、ｆａｄＤ突然変異体の相補性を示している。脂肪酸はＢｒｏｗｓｅら の方法（１９８６）でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉から抽出し、ガスクロマトグ ラフイーによって定量した（モル％）。ＷＴはコロンビア野生型を意味する。実施例６ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの第二の葉緑体デルタ１５デサチュラーゼの単離 制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを用いてｃＤＮＡ挿入物から９５９ｂｐの フラグメントを切除し、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３ ）に従って放射性標識した。このフラグメントを用いて、正確に前述のように（ 実施例５）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のｃＤＮＡライブラリーをプローブした 。得られた幾つかの陽性クローンのうち、ｃＤＮＡ ｐＶＡ３の特徴を更に調べ た。このクローンの推定アミノ酸配列は、ｆａｄ３及びｆａｄＤに対してそれぞ れ７１．８％及び７９．５％の相同を示した。Ｎ末端は葉緑体トランジットペプ チド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）に類似していた。これは、このタンパ ク質が葉緑体に局在しているらしいことを意味する。 ｆａｄ３及びｆａｄＤに対する高度の相同は、このタンパク質がデルタ１５デサ チュラーゼでもあることを示唆する。ｆａｄ３及びｆａｄＤ以外に、デルタ１５ 不飽和化を制御することが知られている唯一の遺伝子座は、温度誘導デルタ１５ デサチュラーゼを制御するｆａｄＥ遺伝子座である。従って、クローンｐＶＡ３ ４に含まれているｃＤＮＡはｆａｄＥ遺伝子座に対応すると考えられる。実施例７ 植物オレイン酸デサチュラーゼに対するリノール酸デサチュラーゼの相同 リノール酸デサチュラーゼ遺伝子は、タンパク質が不飽和脂肪酸前駆体の不飽 和化を酵素的に実施する、最初に単離された植物デサチュラーゼである。リノー ル酸デサチュラーゼが実施する反応、及びそれが使用する補因子は、オレイン酸 デサチュラーゼ反応の場合と極めて類似していると考えられる。反応が類似して おり、基質が類似しており、且つおそらくは補因子も類似していると仮定すれば 、オレイン酸デサチュラーゼの遺伝子及びタンパク質は、リノール酸デサチュラ ーゼの遺伝子及びタンパク質に対して相同を有する可能性がある。これらの遺伝 子が互いに相同であ ることは、リノール酸デサチュラーゼメッセージのアンチセンス発現がオレイン 酸含量を増加させるという発見、即ちリノール酸デサチュラーゼとオレイン酸デ サチュラーゼとの間の相同を実験的に示す発見によって裏付けられる。これらの 事項は、リノール酸デサチュラーゼのタンパク質及び核酸配列が、別の脂質デサ チュラーゼ遺伝子、特にオレイン酸デサチュラーゼ遺伝子の単離に有用な情報を 提供することを示すものである。 ａ．データベース中での未知のｃＤＮＡ配列の同定 ランダムなｃＤＮＡ配列決定は多数の配列決定されたクローンを生成するが、 コードされたタンパク質の機能に関する情報は提供しない。既知のタンパク質に 対する相同は、配列決定されたｃＤＮＡ中のコードされたタンパク質機能を同定 するための最も速い方法である。しかしながら相同検査は、予め特徴が解明され ているタンパク質に対する相同が検出された時にのみ情報を提供する。いずれの 既知タンパク質に対しても相同ではないｃＤＮＡ配列は、機能不明のままである 。従って、配列と植物デサチュラーゼ遺伝子の突然変異を相補う能力とによりリ ノール酸デサチュラーゼを機能的に同定する結果は、ランダムｃＤＮＡクロー ンの機能及びアイデンティティを、リノール酸デサチュラーゼに対する相同によ って同定する方法を提供する。また、オレイン酸デサチュラーゼは、リノール酸 デサチュラーゼに対する相同によって同定される。 リノール酸デサチュラーゼｆａｄ３のタンパク質配列に対して相同のタンパク 質をコードする遺伝子に関するＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬパブリックデータベ ースのＴＦＡＳＴＡサーチは、リノール酸デサチュラーゼと、オレイン酸デサチ ュラーゼと思われる第二の種類の植物脂質デサチュラーゼとを両方とも同定した 。特に、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬに見いだされ且つＴ０４０９３及びＴ１２ ９５０であると同定された配列は、リノール酸デサチュラーゼに対してかなりの 相同を示すが、他のリノール酸デサチュラーゼよりは低い相同を示す。これらの 配列は、ｆａｄ３に対して３０％の相同を示し、ｆａｄ３リノール酸デサチュラ ーゼに対して５６％の類似性を示す（表５）。これらのｃＤＮＡの完全長クロー ンを標準的方法で得、植物遺伝子発現及び形質転換ベクター中に挿入し、ｆａｄ ２ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ突然変異体中に形質転換して、オレイン酸デサチュ ラーゼのアイデンティティを、リノール酸デサ チュラーゼに関する実施例で説明したように遺伝学的相補によって確認する。 ｂ．オレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡの単離 植物リノール酸デサチュラーゼのタンパク質配列は、オレイン酸デサチュラー ゼの単離に使用できる。リノール酸デサチュラーゼとＤｅｓＡオレイン酸デサチ ュラーゼとの間に保存された領域は機能的に重要であり、植物オレイン酸デサチ ュラーゼタンパク質中にも保存されている。これらの保存されたアミノ酸配列は 、植物オレイン酸デサチュ ラーゼの単離方法を提供する。ｆａｄＤ、ｆａｄＥ及びＤｅｓＡ中に保存されて いるリノール酸デサチュラーゼｆａｄ３の領域は幾つか存在する。共通アミノ酸 配列を表６に示す。４種類のタンパク質で総て同一であるアミノ酸は大文字で示 した。後述のように、保存領域内のアミノ酸配列をコードするように設計された オリゴヌクレオチドを用いて、植物のオレイン酸デサチュラーゼを同定し単離す る。 ｃ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからのｆａｄＣ（ｆａｄ６）遺 伝子の単離 ｆａｄＣ遺伝子（ｆａｄ６とも称する）は葉緑体オメガ−６デサチュラーゼを コードする。 Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のｆａｄ３遺伝子、並びにＡｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のｆａｄＤ及びｆａｄＥ遺伝子の推定アミノ酸 配列を、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ由来のＤｅｓＡ遺伝子と比較した（Ｎａｔ ｕｒｅ，３４７：２００，１９９０）。配列ＧＨＤＣＧＨが、これらのタンパク 質の最も高度に保存された領域を表すと決定された。そこで、配列ＧＨＤＣＧＨ に関する総ての可能なコドンを含む縮重オリゴマーを設計した。このオリゴマー は配列ＧＧＮＣＡＹＧＡＹＴＧＹＧＧＮＣＡを有する。 Ｄｒ．Ｒｏｎ Ｄａｖｉｓの実験室から入手したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔ ｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡファージライブラリー（ＰＮＡＳ，８８：１７３１− １７３５）を用いて、デサチュラーゼ遺伝子に関するスクリーニングを行った。 このライブラリーは、総ての地上植物部分に由来する材料を用いて形成されたも のである。 このライブラリーに由来する約１２０，０００個のファージを三つのプレート にプレーティングし、次いでハイボンドＮ＋を用いて各プレートから三つのフィ ルターを調製した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ 及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９、以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称する）。各プレートに由 来する二つのフィルターを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて（３２）Ｐ で末端標識した縮重共通オリゴマーを使用してプローブした。ハイブリダイゼー ションは、縮重共通オリゴマーを含むオリゴマーの融点の差を最小にするために 多量の塩化テトラメチルアンモニウムを含ませた溶液中で実施した。ハイブリダ イゼーション溶液の組成は次の通りである：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム 、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、０．５％乳。ハイブリダイゼーションは４４℃で一晩実施した。次いで フィルターを、６×ＳＳＣ＋０．１５ ％ＳＤＳで、１回２０分ずつ４回にわたり室温で洗浄した。次いでフィルターを 、４×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで室温で３０分間にわたり１回洗浄した。その後 フィルターを２日間フィルムに暴露した。 ファージが入っている各プレートから形成した第三組のフィルターを、既に同 定された三つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓデサチュラーゼ遺伝子、即ちｆａｄ３、 ｆａｄＤ及びｆａｄＥに由来するＤＮＡ配列を用いてプローブした。ｆａｄ３、 ｆａｄＤ及びｆａｄＥ遺伝子を（３２）Ｐで標識し、下記のハイブリダイゼーシ ョン溶液中で第三組のファージフィルターにハイブリダイズさせた：０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、２ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤ Ｓ、０．５％乳、１０％硫酸デキストラン、０．１％ピロリン酸ナトリウム。ハ イブリダイゼーションは６５℃で一晩実施した。フィルターを、２×ＳＳＣ＋０ ．１５％ＳＤＳで、１回３０分ずつ４回にわたり室温で洗浄し、更に１×ＳＳＣ ＋０．１％ＳＤＳで６５℃で４５分間洗浄した。次いでフィルターを約２時間フ ィルムに暴露した。 縮重共通オリゴマーでプローブした二組のフィルターは、 プレート当たり約６０個の陽性ファージ（即ち合計約１８０個の陽性ファージ） を示した。ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ遺伝子でプローブした第三組のフィ ルターから得られた結果は、共通オリゴマーにハイブリダイズしたファージのう ち、ｆａｄ３、ｆａｄＤ又はｆａｄＥ遺伝子を含むものの割合がかなり低いこと を明らかにした。 共通オリゴマーにはハイブリダイズしたが、ｆａｄ３、ｆａｄＤ又はｆａｄＥ 遺伝子にはハイブリダイズしなかったファージのうち、７６個をプラーク精製し た。これらの精製したファージを、プレート上の固体培地で増殖している細菌に スポットし、プラークを形成させた。次いで、これらのプレートから幾つかの二 つ組フィルターを形成した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。これらのフィルターのうちの 一つを前述のように共通オリゴマーでプローブした。第二のフィルターは、前述 のようにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｆａｄ３、ｆａｄＤ及び ｆａｄＥ遺伝子でプローブした。 ７６個のファージのうちのいずれが別のいずれのファージと同じｃＤＮＡ挿入 物を含んでいるかを調べるために、一部のフィルターを一部のファージに由来す るｃＤＮＡ挿 入物でプローブした。この実験を行うために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） を用いてｃＤＮＡ配列を単離すべくファージベクター中のｃＤＮＡクローニング 部位に隣接するＤＮＡに結合したオリゴマーを使用することにより、大部分のフ ァージに由来するｃＤＮＡ挿入物を単離した。これらのｃＤＮＡ配列を（３２） Ｐで標識し（ランダムヘキサマー標識）、下記の組成のハイブリダイゼーション 溶液を用いてフィルターにハイブリダイズさせた：３０％ホルムアミド、０．２ Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ％ＳＤＳ、０．５％乳、０．１％ピロリン酸ナントリウム。ハイブリダイゼーシ ョンは６５℃で１４時間実施した。フィルターを２×ＳＳＣ＋０．１５％ＳＤＳ で、一回１５分間で４回にわたり室温で洗浄し、次いでフィルムに暴露した。 ハイブリダイゼーション溶液のホルムアミドの高い濃度と、ハイブリダイゼー ションの高い温度との組合わせは、実質的に同一のＤＮＡ配列のみがハイブリダ イズするため、ほぼ同一の配列と弁別できることを意味した。どのファージが同 じ又は少なくとも極めて類似したｃＤＮＡ挿入物を含むかが決定されるまで、種 々のファージに由来するｃＤ ＮＡ挿入物を用いて数回のハイブリダイゼーションを実施した。これらの実験に 基づいて、我々は、７６個のファージの総てが四つのｃＤＮＡ挿入物のうちの一 つを含んでいると決定した。これら四つのｃＤＮＡの各々から配列データは得た 。これらのｃＤＮＡはいずれも、既知のデサチュラーゼ遺伝子に対して相同では なかった。従って、これら四つのｃＤＮＡの中に、デサチュラーゼをコードする ものはないと思われる。 共通オリゴマーにハイブリダイズしたファージの数はかなり多かったため（約 １８０個のファージが前述の最初のスクリーニングでハイブリダイズした）、最 初の実験では陽性ファージの総てを分析することはできなかった。そこで、共通 オリゴマーにハイブリダイズしたが、ｆａｄ３、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ遺伝子、又 は最初のスクリーニングで同定された四つの非デサチュラーゼコードクローンの うちの一つを含んでいないファージの同定を試みた。そのために、前述のライブ ラリーに由来する５００，０００〜１，０００，０００個のファージを１０個の プレートにプレーティングした。各プレートから三つのフィルターを形成した（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。これら３組のフィルターのうち ２組を、前述のように、（３２）Ｐ標識共通オリゴマーとハイブリダイズさせた 。但し、ハイブリダイゼーションは４４℃ではなく４２℃で実施した。第三組の フィルターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ遺伝 子に由来する（３２）Ｐ標識ＤＮＡ、並びに、初回のスクリーニングで共通オリ ゴマーにハイブリダイズするがデサチュラーゼをコードしないものであると同定 された四つのｃＤＮＡの各々に由来するＤＮＡとハイブリダイズさせた。第三組 のフィルターは、３０％ホルムアミド、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナ トリウム、ｐＨ７．７、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＡ、０．５％乳、０．１％ ピロリン酸ナトリウム中で６５℃でハイブリダイズさせた。これら３組のフィル ターはいずれも１２時間ハイブリダイズさせ、次いで２×ＳＳＣ＋０．１５％Ｓ ＤＳで室温で数回洗浄した。その後、フィルターをフィルムに暴露した。 各プレートに由来する約２００個のファージが共通オリゴマーにハイブリダイ ズした。これらのファージの５０〜６０％はｆａｄ３、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ、又 は最初のスクリーニングで同定された四つのクローンのうちの一つにもハイブリ ダイズした。共通オリゴマーにはハイブリダイズ したが、ｆａｄ３、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ、又は既に同定された四つのクローンの うちの一つにハイブリダイズしなかった約５８個のファージをプラーク精製した 。次いで、精製したファージを、ペトリ皿上の固体培地で増殖している細菌ロー ン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌａｗｎ）にスポットし、ファージにプラークを形成 させた。これらのプレートから幾つかのフィルターを調製し、新たに精製した種 々のファージに由来する（３２）Ｐ標識ｃＤＮＡ挿入物と前述のようにハイブリ ダイズさせた。この方法で、この２回目のスクリーニングで同定されたファージ の総てが八つの異なるｃＤＮＡ挿入物のうちの一つを含んでいることが判明した 。 八つのｃＤＮＡの各々から配列データを得た。一つのファージにだけ含まれて いたこれらのｃＤＮＡの一つは、ラン色細菌に由来する既知のデサチュラーゼ遺 伝子であるＤｅｓＡ遺伝子に対してある程度の配列類似性を有することが判明し た。このクローンから更に別の配列情報を得た。この別の配列は、ＤｅｓＡ遺伝 子に対して極めて大きい配列類似性を示した。これは、該クローンがデサチュラ ーゼ遺伝子を含んでいることを示すものである。前記クローンに 含まれていたｃＤＮＡの残りを配列決定し、別の既知のデサチュラーゼの配列と 比較した。この新しいデサチュラーゼは、ヌクレオチドレベルで、ＤｅｓＡに対 して５３．０％の同一性を示し、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｆａｄ３、Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ ｆａｄＤ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆａｄＥに対してそれぞれ４３． ９％、４５．６％及び４７．０％の同一性を示した。クローンに含まれていた遺 伝子は、ｆａｄ３、ｆａｄＤ又はｆａｄＥ（オメガ−３デサチュラーゼ）に対す る配列類似性よりＤｅｓＡ遺伝子（デルタ−１２デサチュラーゼ）に対する配列 類似性の方が遥かに大きいため、新しいデサチュラーゼはデルタ−１２（＝オメ ガ−６）デサチュラーゼであると推測された。 この別の配列データは、この新しいデサチュラーゼ遺伝子が、前述のデサチュ ラーゼ共通配列に対して１塩基対不正対合（ｏｎｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｍｉ ｓｍａｔｃｈ）のみを有する領域を含むことも明らかにした。この不正対合は、 新しいデサチュラーゼが、配列ＧＨＤＣＧＨではなく配列ＧＨＤＣＡＨを有する ことを意味する。 この遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含むクローンを単離し、完全に配列決定した。 この完全長ｃＤＮＡを、遺伝子が３ ５Ｓプロモーターの制御下で転写されるように植物形質転換ベクターｐＢＩＩ１ ２１にサブクローニングした。次いで、この構築物を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのｆａｄＣ突然変異体（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．９０ ：５２２−５２９，１９８９）の表現型を相補した。これは、該遺伝子が葉緑体 オメガ−６デサチュラーゼをコードすることを示すものである。 ｄ．提案されたｆａｄ２の単離 リノール酸デサチュラーゼ及びＤｅｓＡデサチュラーゼ中の最も高度に保存さ れたペプチド領域を、オレイン酸デサチュラーゼ中に保存されている可能性があ る領域として選択した。これら８個の保存領域を表６に示す。これらの領域は次 の事項に基づいて選択した：これらの領域は３個のリノール酸デサチュラーゼと ＤｅｓＡとの間に高度に保存された部分を有し、アミノ酸１０個分の領域に少な くとも４個の同一アミノ酸を含む。ある領域が保存領域であると同定されたら、 ｆａｄ３リノール酸デサチュラーゼ配列を相同源のアミノ酸配列として用いて、 オレイン酸デサチュラーゼを同定した。これは、ｆａｄ３及び非プラスチドオレ イン酸デサチュラーゼの両方が小胞体に局在していると 考えられ、類似のアミノ酸配列を含む可能性が極めて高いという理由による。 各保存部分内の幾つかのペプチド終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を、オレイン酸デ サチュラーゼ遺伝子を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブを後で設計す るための基礎として選択した。ペプチド終点は、５〜９アミノ酸の長さで選択し た。ペプチド終点は、保存（同一）アミノ酸で終わるように、そして通常は保存 アミノ酸で始まるように選択した。その根拠は、より大きい保存部分では幾つか のアミノ酸部分が他のものより高度に保存され、１５〜２７（５〜９アミノ酸） ヌクレオチドがＰＣＲにとって都合の良いプライマーサイズであり、ＰＣＲでは プライマーの３’末端が、オレイン酸デサチュラーゼ中に存在する可能性が最も 高い保存（同一）アミノ酸を有する標的に対合（ｍａｔｃｈ）することが重要で あるという点にある。これら２８個の「オレイン酸デサチュラーゼ」ペプチド標 的（表６）は、オレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡクローンを同定し単離するた めにオレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡ配列にハイブリダイズするように設計さ れた基本オリゴヌクレオチドである。 オリゴヌクレオチドを設計し、標的ペプチド領域をコードする遺伝子を単離す るために使用し得る方法は幾つか知られている。縮重オリゴヌクレオチドの設計 については、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅ ｌｆａｎｄ，ＪＪ Ｓｎｉｎｓｋｙ及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉ ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９０、及び Ｓａｎｘｘｘｘｘを参照されたい。オリゴヌクレオチドを使用する最も一般的な 二つのスクリーニング方法は、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及び特定 ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅である。ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ由来の遺伝子プ ローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で使用して、これらの ｃＤＮＡを同定し、オレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡクローンに関するスクリ ーニングで除去した。縮重オリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡライブラリーを スクリーニングする方法は、ｆａｄＣオレイン酸デサチュラーゼ遺伝子の単離を 明らかにする前記実施例で説明した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はカノラのよう な植物の、油の生合成で活性を示す未 熟植物種子、通常は受粉後２〜５週間、好ましくは受粉後約３〜４週間の種子を ｍＲＮＡ源として使用して、ｃＤＮＡを製造する。第一鎖ｃＤＮＡを単離ｍＲＮ Ａから製造し、溶液中、ストリンジェント条件下で、過剰量のビオチニル化ｆａ ｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥクローン化ｃＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイ ブリド及びビチオニル化核酸をストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）で除 去し、２回目の消去（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）を行って残留ｆａｄ３、ｆａ ｄＤ及びｆａｄＥ配列を除去する。溶液中に残留しているｃＤＮＡを用いてＰＣ Ｒ反応を実施する（後述の５’ＲＡＣＥの場合は、ポリＡ末端を第一鎖ｃＤＮＡ ３’末端に付加する）。） 多数の縮重オリゴヌクレオチドプローブを容易に評価することができる方法は 、縮重ＰＣＲである（前出のＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中のＣｏｍｐｔｏｎの 章並びにＬｅｅ及びＣａｓｋｅｙの章参照）。この方法では、標的ペプチド用の 全ての可能なコドン選択を包含するオリゴヌクレオチド縮重セットを合成する（ この種の縮重標的（表６）は、オレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡクローンを同 定し単離するためにオレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡ配列に ハイブリダイズさせるように設計した基礎オリゴヌクレオチドである）。 オリゴヌクレオチドを設計し、標的ペプチド領域をコードする遺伝子を単離す るために使用し得る方法は幾つか知られている。縮重オリゴヌクレオチドの設計 については、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅ ｌｆａｎｄ，ＪＪ Ｓｎｉｎｓｋｙ及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉ ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９０、及び Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。オリゴヌクレオチドを使用する最も一般的な 二つのスクリーニング方法は、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及び特定 ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅である。これらのｃＤＮＡを同定するためにｆａｄ３、ｆ ａｄＤ及びｆａｄＥ由来の遺伝子プローブをストリンジェントハイブリダイゼー ション条件下で使用し、オレイン酸デサチュラーゼｃＤＮＡクローンに関するス クリーニングで除去した。縮重オリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングする方法は、ｆａｄＣオレイン酸デサチュラーゼ遺伝子の単 離 を明らかにする前記実施例で説明した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はカノラのよ うな植物の油の生合成で活性を示す未熟植物種子、通常は受粉後１〜５週間、好 ましくは受粉後約２〜４週間の種子をｍＲＮＡ源として用いてｃＤＮＡを製造す る。第一鎖ｃＤＮＡを単離ｍＲＮＡから製造し、溶液中、ストリンジェント条件 下で、過剰量のビオチニル化ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥクローン化ｃＤＮ Ａにハイブリダイズさせる。ハイブリド及びビチオニル化核酸をストレパビジン で除去し、２回目の消去を行って残留ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ配列を除 去する。溶液中に残留しているｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を実施する。（後述 の５’ＲＡＣＥの場合は、ポリＡ末端を第一鎖ｃＤＮＡ３’末端に付加する。） 多数の縮重オリゴヌクレオチドプローブを容易に評価することができる方法は 、縮重ＰＣＲである（前出のＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中のＣｏｍｐｔｏｎの 章並びにＬｅｅ及びＣａｓｋｅｙの章参照）。この方法では、総ての可能なコド ンを含むオリゴヌクレオチド縮重セットを 表７は、８個の保存領域に由来する２８個のペプチト標的と、ペプチド配列に 由来する３０個の縮重オリゴヌクレオチドとを示している。より多くの縮重が生 起する場合は、デオキシイノシンを使用し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）且つ最後のコ ドンに最後のヌクレオチドを含ませないことによって、また二つの事例では二つ のサププールの使用により、縮重を５１６倍以下に維持した。表８は、設計した 各オリゴヌクレオチド配列毎の縮重の量と、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓオレイン酸 デサチュラーゼｆａｄ２（受託番号Ｌ２６２９６号）に対するオリゴヌクレオチ ドの相同の量とを示している。表８には、各プライマーの３’末端上の最後の１ ０個のヌクレオチドの相同度も示した。なぜなら、この領域はＰＣＲ条件下での アニーリング及び延長にとって最も重要なものだからである。３’プライマー領 域の１０／１０及び９／１０の相同対合（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍａｔｃｈ）の両 方、そしておそらくは８／１０の相同対合が有効なＰＣＲプライマーとして機能 すると推測された。ここで留意すべきこととして、オリゴヌクレオチドセットｌ ａ〜５ｂ（３’ＲＡＣＥ）では鎖方向がｍＲＮＡと同じであり、オリゴヌクレオ チドセット６ａ〜８ｅ（５’ＲＡＣＥ） では鎖方向がｍＲＮＡと逆である。４個のオリゴヌクレオチドが３’位置に１０ ／１０の相同を有し、６個のオリゴヌクレオチドが３’位置に９／１０の相同を 有し、１２個のオリゴヌクレオチドが３’位置に８／１０ヌクレオチドの相同を 有している。ペプチド２ａ、２ｃ、２ｄ、３ｃ、４ｂ、４ｄ、６ｂ、７ｃ、８ｃ 及び８ｄに対応するオリゴヌクレオチドは、最後の１０個のヌクレオチドの相同 が９０％以上であり、オレイン酸デサチュラーゼ遺伝子にアニーリングして、こ の遺伝子のプライマーとして機能する。これは、植物リノール酸デサチュラーゼ 及びＤｅｓＡの保存領域を、植物オレイン酸デサチュラーゼの同定及び単離に使 用することの有効性を立証するものである。 １回目ＰＣＲ生成物を、ビオチニル化ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥクロー ン化ｃＤＮＡを用いて２回の消去にかけ、ハイブリダイズするｆａｄ３、ｆｄＤ 及びｆａｄＥ配列をストレパビジンで除去する。このようにして消去処理したＤ ＮＡはｆａｄ２配列が大幅に増加し、ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ配列が欠 失している。これらの試料３０個をアガロースゲルにかけ、ブロッティングし、 これら３０個の試料に由来するプローブのプールとハイブリダ イズさせる。３０個の各ＰＣＲ試料の５個のプライマーからなるプールをランダ ムプライマーで標識し、３０個の試料のブロットにハイブリダイズさせて、合計 ６個のブロットを５個のプローブからなるプール６個とハイブリダイズさせる。 更に、ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥプローブのプールを二つ組ブロットにハ イブリダイズさせる。ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥには強くハイブリダイズ しないが、種々の試料から形成したプローブには交差ハイブリダイズするバンド は、ｆａｄ２である可能性が高い。なぜなら、ｆａｄ２は２回以上の独立したＰ ＣＲ反応で増幅される唯一のＤＮＡであると思われるからである。陽性ハイブリ ダイズレーン（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｈｉｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｌａｎｅ）は 、最初の反応と同じプラィマーを用いる５〜１０サイクルのＰＣＲにより増幅す る試料を同定する。ＰＣＲ生成物はプラスミドベクター中にクローニングする。 ブロット上の試料を認識する同一プローブを用いてライブラリーをスクリーニン グし、ハイブリダイジングクローンを同定する。陽性クローンを配列決定し、ｆ ａｄ３と相同ではあるが同一ではないことによりｆａｄ２クローンであると同定 し、後述のように更に特徴を調べる。 ｆａｄ２配列が１回のＰＣＲで同定に十分なほど増加しない場合には、２回目 のＰＣＲを実施する。ｆａｄ２の増幅が不十分であるために検出ができない場合 には、前述と同じ消去ＰＣＲ１回目試料上のプライマーと、同じスクリーニング とを用いてＰＣＲをもう１回実施すれば、ｆａｄ２が同定される。競合する非特 異的反応が多すぎる場合には、異なるプライマー組合わせを用いて２回目のＰＣ Ｒを実施すれば非特異的増幅が排除され、ｆａｄ２が増加する。ｆａｄ配列を更 に増加させるためには、前述の消去後の、３０個の最初のＰＣＲ試料（表７の各 オリゴヌクレオチド毎に１個）の各々を、最初の反応と異なるプライマー組合わ せを用いて２回目のＰＣＲ反応にかける。プライマーのうちの一つは、最初のＰ ＣＲ反応と同じ縮重オリゴヌクレオチドプライマーである。第二のプライマーは 、逆の部類に入る、表７の３０個のプライマーのうちの一つである。即ち、プラ イマー１ａ〜５ｂはプライマー６ａ〜８ｅに対する対合セット（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｅｔ）を構成する（プライマー１ａ〜５ｂはセンス方向にあり、プライマー ６ａ〜８ｅはアンチセンス方向にある）。例えば、最初にオリゴヌクレオチド１ ａを使用した場合には、これを二つ のプライマーのうちの一つとして再使用し、第二のプライマーとしては６ａ〜８ ｅオリゴヌクレオチドの各々を使用して、合計１１回の別個のＰＣＲ反応を行う 。合計すると、最初の反応３０回で、４１８回の第二サイクルＰＣＲ反応を実施 することになる。これは、ＰＣＲ技術で容易に取り扱える回数である。この第二 ＰＣＲサイクルは本質的に、消去ステップによって総てのリノール酸デサチュラ ーゼを除去した後の、「ネスト式（ｎｅｓｔｅｄ）」又は逐次的ＰＣＲ反応ステ ップを達成する。この操作は、増幅及び特異性を増加させる。ｆａｄ２を含む試 料の同定を前述のように実施し、４１８個の試料を２２個のフィルター上にドッ トブロットし、２０試料のプール２１個、並びにｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄ Ｅのプールでプローブする。この場合も、独立したプローブ試料と交差ハイブリ ダイズし且つｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥとはハイブリダイズしない試料は 総て、試料中にｆａｄ２を含む可能性がある。ｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ ハイブリダイゼーションが依然として存在している場合には、ビオチニル化／ス テパビジン消去をもう一度実施することによって除去されるはずである。陽性ハ イブリダイズ試料をゲルにかけ、バンドを ハイブリダイゼーションによって同定し、クローニング用に単離する。この第二 組のＰＣＲ反応は、予測可能な大きさのＰＣＲ生成物を生成する。なぜなら、プ ライマーが両方とも、大きさの変化がほとんど生起しないと予想されるコード領 域内に存在するからである。従って、ゲル上の予測された大きさのバンドの存在 は、特にこのようなゲルのブロットとｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥプローブ とのハイブリダイゼーションによって、そのバンドがｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆ ａｄＥ汚染に起因するものではないことが明らかにされた場合には、ｆａｄ２の 存在を示すことになる。大腸菌中に挿入物をクローニングした後、結果として生 じた、前記挿入物を含むプラスミドをハイブリダイゼーションによって同定する 。これを配列決定し、前述の実施例と同様に、リノール酸デサチュラーゼに対し て相同であるが同一ではないという事実によって、オレイン酸デサチュラーゼで あると同定する。これらのｃＤＮＡの完全長クローンを標準的方法で形成し、植 物遺伝子発現及び形質転換ベクターに挿入し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆａｄ ２突然変異体中に形質転換して、リノール酸デサチュラーゼに関する実施例で述 べたように、遺伝学的相補によりオレイ ン酸デサチュラーゼのアイデンティティを確認する。 このように、この植物オレイン酸デサチュラーゼ単離方法では、ペプチド領域 の総数が８であり、２８個のより小さいペプチド標的からなる。その結果、ＰＣ Ｒ増幅及びＰＣＲ生成物のスクリーニングで使用される３０個の縮重オリゴヌク レオチドのセットが得られる。妨害するｆａｄ３、ｆａｄＤ及びｆａｄＥ配列の 消去を幾つかの時点で使用する。必要であれば、一対の内部プライマーを用いて ２回目のＰＣＲ反応を実施すれば、増幅及び特異性が更に高まる。この方法は植 物のオレイン酸デサチュラーゼを同定し、単離クローンの配列が、前述のように 、植物リノール酸デサチュラーゼに対する相同によってそれらのアイデンティテ ィを確認する。このように、本明細書では、リノール酸デサチュラーゼに関する 情報に基づいて植物オレイン酸デサチュラーゼを単離する特定の方法を提供する 。本明細書に記載の実施例はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はカノラオレイン酸デサ チュラーゼに関するものであるが、本発明の方法はこれらの植物には限定されな い。なぜなら、オレイン酸デサチュラーゼはおそらく大部分の植物中に高度に保 存されているからである。従って、ある植物のオレイン酸デサチュ ラーゼが単離されれば、配列情報を用いて、直接的ハイブリダイゼーション又は 前述と類似の方法により、別の植物種から遺伝子を単離することができる。 本明細書で引用する下記の文献は、参考として本明細書に包含される。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１３５３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：８７．．１２３８ 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３８３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：４ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：５ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：６ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：７ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：８ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 配列番号：９ 配列の長さ：１６４５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２５．．１４６５ 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：４４６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：１５２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６１．．１３６８ 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：４３５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：１３ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１４ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１５ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１６ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１７ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１８ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：１９ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２０ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２１ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２２ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２３ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２４ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２５ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２６ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２７ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２８ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：２９ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３０ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 卜ポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３１ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３２ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３３ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３４ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３５ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３６ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３７ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３８ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：３９ 配列の長さ：１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：４０ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：４１ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：４２ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列 配列番号：４３ 配列の長さ：７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４４ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４５ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４６ 配列の長さ：８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４７ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４８ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：４９ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５０ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５１ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５２ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５３ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５４ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５５ 配列の長さ：７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５６ 配列の長さ：９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５７ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５８ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：５９ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６０ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６１ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６２ 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６３ 配列の長さ：８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６４ 配列の長さ：７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６５ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６６ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６７ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６８ 配列の長さ：７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：６９ 配列の長さ：７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：７０ 配列の長さ：８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：７１ 配列の長さ：１６７０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４６．．１３０２ 配列 配列番号：７２ 配列の長さ：４１８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月９日 【補正内容】請求の範囲 １． リノレン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二本 鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列であって、配列番号：９及び配列番号：１１の中から選択した構造 コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物。 ２． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモータ ーである請求項１に記載の植物。 ３． リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二本 鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス 配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物。 ４． リノール酸デサチュラーゼ酵素が植物に由来するものである請求項３に記 載の植物。 ５． リノール酸デサチュラーゼ酵素が真菌、藻類又は細菌に由来するものであ る請求項３に記載の植物。 ６． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとったものである請求項３ に記載の植物。 ７． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項３ に記載の植物。 ８． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求項 ３に記載の植物。 ９． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモータ ーである請求項３に記載の植物。 １０． リノレン酸含量が約３％以下の遺伝学的に形質転換した植物であって、 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロ モーターを含み、該プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物。 １１． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二 本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のオレイン酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物。 １２． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二 本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロ モーターを含み、該プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物。 １３． リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。 １４． リノール酸デサチュラーゼ酵素が植物に由来するものである請求項１３ に記載の方法。 １５． リノール酸デサチュラーゼ酵素が真菌、藻類又は細菌に由来するもので ある請求項１３に記載の方法。 １６． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとったものである請求項 １３に記載の方法。 １７． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項 １３に記載の方法。 １８． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求 項１３に記載の方法。 １９． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモー ターである請求項１３に記載の植物。 ２０． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。 ２１． 配列中に（ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモー ターを含み、該プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ２２． 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む植物細胞であって、 前記組換え二本鎖分子が配列中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物細胞。 ２３． 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む遺伝学的に形質転換した植物であって、 前記組換え二本鎖ＤＮＡ分子が （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のオレイン酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記遺伝学的に形質転換した植物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ギブソン，スーザン・イルマ アメリカ合衆国、テキサス・77251、ヒユ ーストン、ライス・ユニバーシテイ、デパ ートメント・オブ・バイオケミストリー・ アンド・セルラー・バイオロジー（番地な し) (72)発明者 キシヨアー，ガネシユ・モーシー アメリカ合衆国、ミズーリ・63017、チエ スターフイールド、グラントレー・ドライ ブ・15354 (72)発明者 ラフ，トーマス・ジーン アメリカ合衆国、ミズーリ・63049、ハ イ・リツジ、ササフラス・レーン・5500 (72)発明者 ソマービル，クリストフアー・ローランド アメリカ合衆国、カリフオルニア・94301、 パロ・アルト、ヘイル・ストリート・480 (72)発明者 アロンデル，バンサン・ジヤン−マリー・ アルメル フランス国、エフ―75252・パリ・セデツ クス・05、プラス・ジユシウ、４、ユニベ ルシテ・ピエール・エ・マリー・キユリ ー、トワジイエーム・エタージユ、トウー ル・53、ラボラトウワール・ドウ・フイジ オロジ・セルレール・エ・モレキユレール

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． リノレン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二本 鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記リノレン酸含量の高い遺伝学的に形質転換し た植物。 ２． リノール酸デサチュラーゼ活性が植物に由来するものである請求項１に記 載の植物。 ３． リノール酸デサチュラーゼ活性が真菌、藻類又は細菌に由来するものであ る請求項１に記載の植物。 ４． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとったものである請求項１ に記載の植物。 ５． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項１ に記載の植物。 ６． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求項 １に記載の植物。 ７． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモータ ーである請求項１に記載の植物。 ８． リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二本 鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換し た植物。 ９． リノール酸デサチュラーゼ酵素が植物に由来するものである請求項８に記 載の植物。 １０． リノール酸デサチュラーゼ酵素が真菌、藻類又は細菌に由来するもので ある請求項８に記載の植物。 １１． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとっ たものである請求項８に記載の植物。 １２． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項 ８に記載の植物。 １３． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求 項８に記載の植物。 １４． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモー ターである請求項８に記載の植物。 １５． 改善された低温耐性を有する遺伝学的に形質転換した植物であって、組 換え二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記改善された低温耐性を有する遺伝学的に形質 転換した植物。 １６． 病原体に応答する能力が大きい遺伝学的に形質転換した植物であって、 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該 分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記病原体に応答する能力が大きい遺伝学的に形 質転換した植物。 １７． 遺伝学的に形質転換した植物から発生した種子であって、リノレン酸供 給源として使用するのに適したリノレン酸含量を有し、前記植物が組換え二本鎖 ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記遺伝学的に形質転換し た植物から発生した種子。 １８． 前記植物がダイズ及びアブラナの中から選択したものである請求項１７ に記載の種子。 １９． リノレン酸含量が約３％以下の遺伝学的に形質転換した植物であって、 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記リノレン酸含量が約３％以下の遺伝学的に形 質転換した植物。 ２０． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二 本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のオレイン酸デサチュラーゼ活性をコ ードする遺伝子の少なくとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列 を生成させるＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換し た植物。 ２１． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物であって、組換え二 本鎖ＤＮＡ分子を含み、該分子が、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換し た植物。 ２２． リノレン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を 生成させる構造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、リノレン酸含量の高い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。 ２３． リノール酸デサチュラーゼ酵素が植物に由来するものである請求項２２ に記載の方法。 ２４． リノール酸デサチュラーゼ酵素が真菌、藻類又は細菌に由来するもので ある請求項２２に記載の方法。 ２５． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとったものである請求項 ２２に記載の方法。 ２６． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項 ２２に記載の方法。 ２７． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求 項２２に記載の方法。 ２８． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモー ターである請求項２２に記載の植物。 ２９． リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、リノレン酸含量の低い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。 ３０． リノール酸デサチュラーゼ酵素が植物に由来するものである請求項２９ に記載の方法。 ３１． リノール酸デサチュラーゼ酵素が真菌、藻類又は細菌に由来するもので ある請求項２９に記載の方法。 ３２． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１からとったものである請求項 ２９に記載の方法。 ３３． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：９からとったものである請求項 ２９に記載の方法。 ３４． （ｉｉ）の構造コード配列が配列番号：１１からとったものである請求 項２９に記載の方法。 ３５． （ｉ）のプロモーターが内因性植物リノール酸デサチュラーゼプロモー ターである請求項２９に記載の植物。 ３６． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデ ニル化を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。 ３７． 配列中に（ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモー ターを含み、該プロモーターが、 （ｉｉ）リノール酸デサチュラーゼ活性をコードするＲＮＡ配列を生成させる構 造コード配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ３８． 配列中に（ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモー ターを含み、該プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ３９． 組換え二本鎖ＤＮＡ分子を含む植物細胞であって、前記組換え二本鎖分 子が配列中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、該プ ロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のリノール酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配 列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している、前記植物細胞。 ４０． オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転換した植物の製造方法であって 、 （ａ）植物細胞のゲノム中に、 （ｉ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列を生成させるプロモーターを含み、前記 プロモーターが、 （ｉｉ）前記植物中のオレイン酸デサチュラーゼ活性をコードする遺伝子の少な くとも一部分に対してアンチセンス 配向にあるＲＮＡ配列を生成させるＤＮＡ配列と、 （ｉｉｉ）植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化 を促進する３’非翻訳領域 とに操作可能に結合している組換え二本鎖ＤＮＡ分子を挿入し、 （ｂ）形質転換した植物細胞を得、 （ｃ）前記形質転換した植物細胞から、オレイン酸含量の高い遺伝学的に形質転 換した植物を再生する ことからなる前記方法。