JPH09505739A

JPH09505739A - 脂肪アシル−ＣｏＡ代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする核酸配列

Info

Publication number: JPH09505739A
Application number: JP7515714A
Authority: JP
Inventors: ジョージメッツ，ジェームス; デニスラーディザバル，キャスリン; ダブリュ．ラッセナー，マイケル
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 1997-06-10
Also published as: WO1995015387A3; US5679881A; WO1995015387A2; CA2177598A1; EP0731840A1

Abstract

(57)【要約】本発明によれば、植物β−ケトアシル−CoA シンターゼ縮合酵素が提供され、ここでこの酵素は前記植物の損なわれていない細胞を有さず、そしてひじょうに長い鎖の脂肪酸分子の生成を触媒することができる。核酸配列及び縮合酵素コード配列とは天然において関連していない異種DNA 配列を含んで成る構造体にも向けられており、そしてこれは宿主細胞において植物の縮合酵素コード配列の転写を少なくとも付与する。この態様においては、ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子が植物細胞において生成される。植物細胞においてひじょうに長い鎖の脂肪酸分子の組成を変性する方法が包含されている。

Description

【発明の詳細な説明】脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする核酸配列技術分野本発明は、酵素、そのような酵素を精製し、そして得るための方法、それに関連するアミノ酸及び核酸配列、及び遺伝子工学用途へのそのような組成物の使用方法に関する。背景植物遺伝子工学技法の進歩により、新規で且つ所望する特徴を有する植物を得るために種々の植物種を形質転換しそして再生することは可能である。そのような植物遺伝子工学技法のための興味ある１つの分野は、植物組織において価値ある生成物の生成である。そのような適用は、所望する生成物を生成する植物を生ぜしめるために形質転換出来事に使用のための種々のDNA 構成体及び核酸配列の使用を必要とする。たとえば、植物機能プロモーターは、遺伝子配列の適切な発現のために必要とされ、そのような発現は完全な植物又は選択された植物組織のいづれかにおいて存在する。さらに、選択マーカー配列がしばしば、形質転換された植物材料を同定するために使用される。そのような植物プロモーター及び選択マーカは、新規植物を得るために有用である価値ある道具である。そのような遺伝子工学技法を包含する１つの所望する目的は、便利なワックスエステル源を有する収穫植物を供給する能力である。ワックスエステルは、種々の産業用途、たとえば医薬、化粧品、洗浄剤、プラスチック及び滑剤に必要とされる。そのような生成物、特に長鎖のワックスエステルは、危機に面している種であるマッコウクジラから又はつい最近は、砂漠の灌木であるホホバからこれまで入手して来た。それらの源はいづれも、ワックスエステルの便利な供給を提供しない。ホホバはまた、その種子油においてひじょうに長い脂肪酸(VLCFA)を合成する植物でもある。VLCFA は、18個以上の長さの鎖長を有する脂肪酸である。VLCFA は、多くの植物種のクチクラ“ワックス”に及びいくつかの植物種の種子油に見出される。野生型ブラシカ（Brassica）植物は、それらの種子油にVLCFA を含む。カノラ（Canola）は、その種子油からVLCFA を排除するように育生されたナタネ種子である。VLCFA への脂肪酸の延長に関与する酵素（“エロンガーゼ”酵素）は、それらが膜関与されているので、生化学レベルで特徴づけることは困難であった（Harwood，JL，“Fatty acid metabolism”，Annual rev．of Plant Phy siol．and Plant Mol．Biol．（1988）39：101-38）；（von Wettstein-Knowles ，PM，“Waxes，cytin，and suberin”in ed．Moore，TS，Lipid Metabolism in Plants(1993)，CRC Press，Ann Arbor，127-166ページ）。いくつかのグループがそれらのエロンガーゼ酵素のいくつかを一部精製することを試みたけれども、それらの酵素の１つ又はその対応する遺伝子のクローニングの完全な精製に関するデータは存在しない（von Wettstein-Knowles，PM，（1993）前記；van de Lo o，FJ，Fox，BG，and Somerville C．“Unusual fatty acids”in ed．Moore，T S，Lipid Metabolism in Plants，（1993）CRC Press Ann Arbor，91-126ページ）。細胞質エロンガーゼ酵素システムによる脂肪酸延長のための可能な機構は、クロロプラスト脂肪酸合成に関して見られる機構に類似する一連の段階、すなわち４段階反応による（Stumpf and Pollard （1983）前記；van de Loo et al．(1993)前記）。その第１段階は、マロニルCo A とオレイルCoA との間のβ−ケトアシル−CoA シンターゼによる縮合反応である。次に、β−ケトアシル−CoA レダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoA デヒドラターゼ、及びエノイル−CoA レダクターゼ酵素が連続的に作用し、２つの炭素原子により延長された、アシル−CoA 分子が生成される。信頼できる源のひじょうに長い鎖の脂肪酸分子、たとえばワックスエステル又はVLCFA を得るためには、生成物の増殖、収穫及び抽出に関して容易に操作される収穫植物の形質転換が所望される。そのような形質転換された植物を得るためには、所望するVLCFA 又はワックスエステル生成物の生合成を担当する遺伝子がまず、得られるべきである。ワックスエステルの生成は、脂肪アシルCoA 代謝の少なくとも２種の酵素活性、すなわち脂肪アシルレダクターゼ及び脂肪アシル：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ、又はワックスシンターゼの作用に起因する。そのような酵素、及び脂肪アシルレダクターゼの広範な分析及び精製による予備研究は、それらのタンパク質が膜に関与しているが、しかしながらワックス生合成における脂肪アシル：脂肪アルコール連結反応を担当する酵素は十分にまだ特徴づけられていないことを示唆する。従って、追加の研究及び究極的には、この酵素の精製は、その酵素活性をコードする遺伝子配列が得られるためには必要とされる。従って、ワックスシンターゼタンパク質が得られ、そしてアミノ酸配列が決定され、そして／又はワックスシンターゼに対して特異的な抗体が得られる、精製手段を考案することが所望される。この態様においては、ライブラリースクリーニング、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)又は免疫学的な技法を用いて、ワックスシンターゼタンパク質を発現するクローンを同定することができる。この態様で得られたクローンは、ワックスシンターゼ活性に対応する核酸配列が同定されるように分析され得る。そのワックスシンターゼ核酸配列は次に、宿主細胞におけるワックスエステルの生成のために、トランスゲニック宿主細胞に生来の又は組換え技法により供給される、脂肪アシルレダクターゼタンパク質と共に利用され得る。ひじょうに長い鎖の脂肪酸の形成に関与する酵素に対する遺伝子を有することがまた所望される。そのような遺伝子は、実質的にいづれかの種のトランスゲニック植物においての前記遺伝子の過度発現（overexpression）により油性種子に長鎖の脂肪酸を高めるために使用され得る。その遺伝子はまた、他の分類群、たとえばVLCFAを生成する、ブラシカ（Brassica）、アラビドプシス(Arabidopsis) 、クラムベ（Crambe）、ナスツリチアム（Nasturtium）、及びリムナンテス（Li mnanthes）からの遺伝子をクローン化する手段として他の種からの相同クローンを単離するために低い緊縮性のハイブリダイゼーションにおいてプローブとしても使用され得る。次に、それらの得られた遺伝子は、実質的にいづれかの種のトランスゲニック植物においてVLCFA の量を高めるためにそれらの遺伝子が単離され又は過度発現される種においてVLCFA のレベルを減じるためにアンチセンス実験において使用され得る。さらに、この酵素をコードする相同のブラシカ遺伝子からのDNA は、高エルカ酸ナタネ種子（HEAR）及びカノラ及び他の油性種子収穫物の育成を助けるために分子マーカーを開発するための植物育成用道具として使用され得る。そのような技法は、分子プローブとしての遺伝子自体の使用又は植物育成プログラムにPCR に基づくスクリーニング技法を使用できるようにPCR プライマーを構築するためへのそのDNA 配列の使用を包含する。最後に、植物上皮細胞における遺伝子の過度発現がクチクラの蓄積を高め、それによって、対照植物よりもトランスゲニック植物の日照り及びストレス耐性も高める。関連文献成長しているホホバの胚からの細胞フリー均質物は、アシル−CoA 脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ活性を有することが報告されている。その活性は、示差遠心分離に基づいて形成された浮遊性ワックスパッドに関連している（Po llard et al．（1979）前記；Wu et al．(1981)前記）。脂肪アシル−SCoAトランスアシラーゼ活性を有するユグレナグラシリス（Eugl ena grocilis）からの多酵素複合体の溶解がWildner and Hallick により報告されている（The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting，April 22-24，19 90，Las Cruces，NM．からの抜粋）。ホホバアシル−CoA ：アルコールトランスアシラーゼタンパク質の10倍の精製がPushnik et al.により報告されている（The Southwest Consortium Fourth An nual Meeting，February 7，1989，Riverside，Ca.の抜粋）。ホホバアシル−CoA ：アルコールトランスアシラーゼ活性についてのアッセイがGarner et al．により報告されている（Analytical Biochemistry（1992）207 ：335-340）。 HEAR及びカノラ植物からの発育している種子の抽出物は、VLCFA中へのオレイルCoA を延長するそれらの能力において異なっていることが見出されており、ここでHEARは延長を触媒することができるが、しかしカノラ抽出物はできない（St umpf，PK and Pollard MR，“Pathways of futty acid biosynthesis in higher plants with particular reference to developing rapeseed”，High and Low E rucic Acid Rapeseed Oils（1983）Acudemic Press Canada，131-141ページ）。図面の簡単な説明図１：そのcDNA配列から決定される場合、ホホバ脂肪アシルレダクターゼの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列が図１に示されている。図２：脂肪アシル−CoA 代謝cDNAクローンに関与するホホバ植物の細胞質タンパク質の予備核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列が示されている。図３：pCGN7614の配列により表わされる場合、２番目の種類のホホバクローンの核酸及び翻訳されたアミノ酸配列が示される。図４：オレオシン発現カセットの核酸配列が示される。図５：LEAR品種(212)からのブラシカ縮合酵素クローン、CE15の核酸配列が示されている。図６：212ブラシカ品種からのCE20の核酸配列が示される。図７：ブラシカのレストン品種（HEAR）のCE20クラスの核酸配列が示されている。図８：アラビドプシスの縮合酵素クローン、CE15の核酸配列が示されている。図９：アラビドプシスの縮合酵素クローン、CE17の核酸配列が示されている。図10：アラビドプシスの縮合酵素クローン、CE19の核酸配列が示されている。図11：ルナリア(Lunaria)の縮合酵素クローン、LUN CE8 の一部の核酸配列が示されている。図12：LUN CE8 によるプロービングにより得られる、ルナリアの縮合酵素クローン、Lunaria １の核酸配列が示されている。図13：LUN CE8 から得られた第２のルナリアの縮合酵素クローン、Lunaria ５の核酸配列が示される。図14：LUN CE8 からの第３のルナリアの縮合酵素クローン、Lunaria 27の核酸配列が示される。図15：PCR により得られたナスツリチアムの縮合酵素クローンの核酸配列が示される。発明の要約本発明によれば、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードするDNA 配列が提供される。そのような配列は、ひじょうに長い鎖のワックス脂肪酸関連生成物、たとえば宿主細胞中のワックスエステル及びひじょうに長い鎖の脂肪酸の組成を変えるための方法への使用のために所望される。１つの観点においては、本発明のタンパク質は、脂肪アシル−CoA ：脂肪アルコールＯ−アシルトランスフェラーゼ活性を示し、そのような活性が本明細書において“ワックスシンターゼ”として言及されている。第２の観点においては、このタンパク質は、ひじょうに長い脂肪酸の形成に関与する延長反応のために必要とされる。従って、たとえば、前記タンパク質はＣ 20脂肪酸を形成するためにＣ18脂肪アシルCoA 分子の延長を付与し、そしてまた、さらに長い鎖の脂肪酸を形成するためにＣ20脂肪酸の延長を付与する。たぶんその延長活性はこのタンパク質のβ−ケトアシル−CoA シンターゼ活性の結果であろうが、但し、本明細書に提供されるタンパク質は、β−ケトアシル−CoA シンターゼの発現のために必要とされる調節機能を有し又はアシル−CoA 延長に関与されることが知られている他の活性、たとえばβ−ケトアシル−CoA レダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−CoA デヒドラターゼ、又はエノイル−CoA レダクターゼ活性の１つを提供する可能性も存在する。いづれにせよ、このタンパク質の脂肪アシルCoA 延長観点は、“エロンガーゼ（elongase）”活性として本明細書で言及されている。本発明のDNA 配列は、ホホバの胚cDNAライブラリーから得られた配列により例示されている。いくつかの関連するホホバの配列が発見されており、そして本明細書の図２及び３に与えられている。本発明の異なった観点においては、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する例示された植物細胞質タンパク質に関連する他のタンパク質に関与する核酸配列が考慮される。そのような配列が本発明のアミノ酸配列及び核酸配列から同定され、そして得られる方法が記載されている。他の植物種からの脂肪アシル−CoA 代謝に、並びにそのような配列によりコードされるタンパク質の宿主細胞における転写及び／又は発現のための組換え構造体に関与する類似する細胞質タンパク質をコードする配列の単離のためへの構造遺伝子配列の使用が記載されている。前記タンパク質をコードする配列に関連する他の核酸配列の使用、たとえば５′及び３′ 非コード領域の使用もまた考慮される。本発明のさらに異なった観点においては、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質のためのセンス及びアンチセンス配列をコードする組換え構造体を含む細胞が考慮される。特に、ホホバタンパク質の好ましい長さの鎖のアシル−CoA 基質を含む細胞、たとえばブラシカ植物のアシル−CoA が考慮される。さらに、宿主細胞において脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質を生成する方法が提供される。従って、宿主細胞におけるそのような発現の結果として回収される脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質がまた、本発明において考慮される。さらに、本発明の配列は、ワックスシンターゼの脂肪アシル及び脂肪アルコール基質を含むそのような宿主細胞におけるワックスエステルの生成に適用できることが理解され得る。そのような宿主細胞は、天然において存在し、又は脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸構造体による形質転換により得られる。脂肪アシルレダクターゼ又は“レダクターゼ”は、脂肪アシル基のその対応するアルコールへの還元を触媒することにおいて活性的である。同時継続出願であるアメリカ特許出願第07／659,975 号(2／22／91に出願された)、第07／767,251 号(9 ／27／91に出願された)、及び第07／920,430 号(7／31／92に出願された)(引用によりこれらは本明細書に組込まれる)は、そのようなレダクターゼタンパク質に向けられている。この情報はまた、公開されたPCT 特許出願WO92／14816 にも提供されている。さらに、ワックスシンターゼタンパク質の他の源（また、レダクターゼタンパク質の所望する源でもある）が記載されている。これに関して、本明細書に記載されるホホバのワックスシンターゼ活性の好ましいアルコール基質を含む植物細胞は、脂肪アシルレダクターゼ核酸配列をコードする組換え核酸構成物による形質転換により調製され得る。本明細書において考慮される追加の方法は、宿主細胞における、ひじょうに長い鎖の脂肪酸の生成、又はそのような脂肪酸の量の修飾を包含する。ひじょうに長い鎖の脂肪酸の高められた生成は、本明細書に記載されるDNA 配列の発現により得られる。他方、そのような配列を含むアンチセンス構造体は、標的の宿主生物におけるひじょうに長い鎖の脂肪酸の含有率を減じるために使用され得る。特に、そのようなセンス及びアンチセンス方法は植物種子油における脂肪酸プロフィールの変性に向けられ、そして所望する脂肪酸組成を有する新規の植物種子油をもたらすことができる。発明の詳細な記載本発明の核酸配列は、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする。そのようなタンパク質は、ひじょうに長い鎖の脂肪酸の生成を担当する“エロンガーゼ”活性、及びワックスエステルを生成するために脂肪アシル基による脂肪アルコールのエステル化を付与する“ワックスシンターゼ”活性を提供する、アミノ酸のいづれかの配列、たとえばタンパク質、ポリペプチド又はペプチドフラグメントを含む。本発明の脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質は、種々のアシル基質、たとえば脂肪アシル−CoA 脂肪アルコール及び脂肪アシル−ACP 分子に対しての活性を示すことができる。さらに、ワックスシンターゼにより作用せしめられるアシル及びアルコールの両基質は、種々の炭素鎖の長さ及び飽和の程度を有するが、但し、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質は一定の分子に対してのみ好ましい活性を示すことができる。多くの異なった、生物は、ひじょうに長い鎖の脂肪アシル−CoA 分子に由来する生成物を含み、そして本発明の脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の所望する源であり得る。たとえば、植物は、上皮、又はクチクラワックスを生成し(Kolattukudy(1980)，The Biochemistry of Plants（Stumpf，P.K ．and Conn，E.E.，eds.）vol.4，571-645ページ)、そして砂漠の灌木であるホホバは種子貯蔵ワックスを生成する(Ohlrogge et al．(Lipids（1978）13：203- 210)。そのようなワックスは、脂肪アルコール分子と長鎖又はひじょうに長い鎖のアシル−CoA 分子との、ワックスシンターゼにより触媒された組合せの結果である。ワックス合成がまた、種々の種の細菌、アシネトバクター(Acinetobacter)(Fixter et al．（1986）J．Gen．Micr obiol．132：3147-3157)及びマイクロコーカス(Micrococcus)(Lloyel（1987）Mi crobius 52:29-37)、並びに単細胞生物、たとえばユーグレナ(Euglena)(Khan an d Kolattukudy（1975）Arch．Biochem．Biophys．170：400-408)に観察されている。さらに、ワックスの生成及びワックスシンターゼ活性が、ウシマイボーム腺 (Kolattukudy et al．（1986）J．Lipid Res．27：404-411)、鳥類の尾腺、及び種々の昆虫及び海洋生物からのミクロソーム調製物に報告されている。従って、種々の性質を有する多くの異なったワックスエステルが、本発明の脂肪アシル− CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質のワックスシンターゼ活性により生成され、そして生成されるワックスエステルのタイプは対象の特定のタンパク質の利用できる基質又は基質特異性に依存する。従って、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質に関連する核酸配列が、酵素の生成及びその活性の追加の研究のために宿主細胞中にクローン化され得る。たとえば、タンパク質の容易な源を提供するためにＥ．コリにおける発現のためのベクター中に核酸コード配列をクローン化することができる。そのようにして生成されたタンパク質はまた、種々の源、特に植物からの関連するタンパク質の同定及び精製への使用のための抗体を生ぜしめるために使用され得る。さらに、タンパク質の追加の研究は、その触媒性質をさらに特徴づけそして改良するために又はその脂肪アルコール又は脂肪アシル基質特異性を変えるために部位特異的変異誘発反応に誘導することができる。そのような変更された基質特異性を有する脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質は、他の FAS 酵素と一緒に適用できる。本発明の前、ワックスシンターゼがタンパク質のアミノ酸配列は知られていなかった。従って、ワックスシンターゼに関連する核酸配列を得るためには、ワックスシンターゼ核酸配列の単離のために有用な適切なプローブが調製され得るように、利用できる源からタンパク質をまず精製し、そして少なくとも一部のアミノ酸配列を決定することが必要であった。砂漠の灌木であるシモンドシアキネンシス(Simmondsia chinensis)(ホホバ)は、本明細書に例示されるコード配列の源である。しかしながら、関連するタンパク質は、他の源の生物から同定され得、そしてその対応するコード配列が得られる。たとえば、ユーグレナグラシリス（Euglena gracilis）は、脂肪アシル−CoA レダクターゼ及び脂肪アシル−CoA アルコールトランスアシラーゼ、又はワックスシンターゼの酵素作用を通してワックスを生成する。典型的には、24〜32の範囲の炭素鎖長を有するワックスがこの生物において検出されている。このユーグレナのワックスシンターゼ酵素は CHAPS／NaCl溶液を用いて溶解され得、そして部分的に精製されたワックスシンターゼ調製物がブルーＡクロマトグラフィーにより得られる。この態様においては、ワックスシンターゼ活性に関連する41kDペプチドバンドが同定される。アシネトバクター(Acinetobacter)種はまた、そのメカニズムは十分には定義されていないけれども、ワックスエステル組成物を生成することが知られている。本明細書に記載される場合、脂肪アシル−CoA アルコールトランスアシラーゼ又はワックスシンターゼ活性がアシネトバクター種に検出される。ワックスシンターゼ活性は、CHAPS／NaClに溶解され、ブルーＡカラムクロマトグラフィーにより富化され、そしてサイズ排除クロマトグラフィーのような技法を用いてさらに精製され得る。これらの方法によれば、ワックスシンターゼ活性に関連する約45kDのペプチドバンドが、部分的に精製された調製物に得られる。さらに、ひじょうに長い鎖の脂肪酸の生成のために必要とされる脂肪アシル− CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質はまた、種々の源、特に植物源に見出され得る。植物においては、18個までの炭素原子の鎖長の脂肪酸は、脂肪酸シンターゼ(FAS)によりクロロプラストロにおいて合成され、ここでいくつかの酵素のシステムがアシルキャリヤータンパク質(ACP)の脂肪酸チオエステルを、２個の炭素原子増分で延長せしめる。18個の鎖長に達した後、チオエステル結合がチオエステラーゼにより切断され、そして脂肪酸が、それがアシル−CoA のような補酵素Ａ(CoA)チオエステルとして利用される細胞質に輸送される。追加の延長は、それが生じる場合、小胞体膜関連組の延長酵素により触媒される。ひじょうに長い鎖の脂肪酸（18個の炭素原子よりも長いそれらの脂肪酸）は、多くの植物種のクチクラ“ワックス”に見出され、そしていくつかの植物種の種子油に見出される。VLCFA への脂肪酸の延長に関連する酵素は膜関連している（Harwood 19 88，von Wettstein-Knowles 1993）。所望する“エロンガーゼ”活性を含む植物は、アラビドプシス、クラムベ、ナスツリチアム及びリムナンテンを包含する。従って、そのようなエロンガーゼ活性を担当するタンパク質が精製され、そしてその対応するコード配列が同定される。他方、そのような配列は、本明細書に提供されるホホバコード配列へのハイブリダイゼーションにより得られる。本発明のタンパク質の疎水性質は精製に対する挑戦を表わすけれども、実質的に精製されたタンパク質の回収は種々の方法を用いて達成され得る。たとえば、ホホバのワックスシンターゼタンパク質の精製が記載されている公開されたPCT 出願WO93／10241 を参照のこと。従って、本発明の脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞、たとえば原生又は真生動物細胞におけるタンパク質の配列の転写及び／又はそのタンパク質の発現を提供するために使用され得る。究極的には、この酵素により認識される基質を生成する植物における安定した植物発現が所望される。ワックスシンターゼ配列による形質転換のために標的化された植物は天然においては酵素の脂肪アルコール及び／又は脂肪アシルエステル基質を含まないけれども、植物抽出物は、その抽出物への基質の添加により活性のために調製され、そしてアッセイされ得る。植物宿主の形質転換のための構造体及び方法は下記に詳細に論ぜられている。次の例により詳細に論ぜられるように、初期実験に提供される核酸配列の発現は、高められたワックスシンターゼ活性をもたらした。しかしながら、この結果は、追加のＥ．コリ発現実験においては観察されなかった。植物においては、例示された配列（例８に記載される構造体pCGN7626）の発現は、カノラタイプのブラシカにおけるひじょうに長い鎖の脂肪酸の生成、及び形質転換されたアラビドプシス植物におけるひじょうに長い鎖の脂肪酸プロフィールの変性（例11）をもたらした。本発明の核酸はゲノム性又はcDNAであり得、そしてcDNA又はゲノムライブラリーから、又は単離された植物DNA から直接的に単離され得る。タンパク質が精製され、そして／又はそのタンパク質のアミノ酸配列が得られた後、遺伝子配列を得るための方法は当業者に知られている。たとえば、抗体が単離されたタンパク質に対して生ぜしめられ、そして発現ライブラリーをスクリーンするために使用され得、従って、脂肪アシル−CoA 代謝シンターゼタンパク質又はその抗原性フラグメントに関与する植物細胞質タンパク質を生成するクローンを同定する。他方、オリゴヌクレオチドがアミノ酸配列から合成され、そして核酸配列の単離に使用され得る。そのオリゴヌクレオチドは、核酸フラグメントを生成するためにPCR において有用であり、これは次に、cDNA又はゲノムライブラリーをスクリーンするために使用され得る。異なったアプローチにおいては、オリゴヌクレオチドが、有用なプローブを同定するためにノーザンサウザンブロットの分析に直接的に使用され得、そしてハイブリダイゼーション条件下で、それらのオリゴヌクレオチドがcD NA又はゲノムライブラリーをスクリーンするために使用され得る。本発明の核酸配列は、脂肪アシル−CoA 代謝に関与するホホバ植物細胞質タンパク質に対応する配列、及びホホバのタンパク質又は核酸配列から得られる配列を包含する。“対応する”とは、DNA 又はRNA のいづれかの核酸配列、たとえば脂肪アシル−CoA 代謝タンパク質又はその一部に関与するホホバ植物細胞質タンパク質をコードする配列、ホホバ胚においてタンパク質の転写、又は転写及び翻訳（発現）を指図する前記コード配列に対して５′又は３′で見出される調節配列、cDNAに存在しないイントロン配列、及び小胞体膜中への挿入のために必要とされるが、しかし脂肪アシル−CoA 代謝に関与する成熟植物細胞質タンパク質には見出されない前駆体タンパク質のいづれかのリーダー又はシグナルペプチドをコードする配列を意味する。ホホバの配列又はタンパク質から“得られる”配列とは、ホホバのアミノ酸配列から合成され得、又は他方、異なった生物において同定され得、そして脂肪アシル−CoA 代謝に関与するホホバ植物細胞質タンパク質に対して調製されたホホバ核酸配列又は抗体をプローブとして用いることにより単離され得る、脂肪アシル−CoA 代謝タンパク質に関与する所望の植物細胞質タンパク質に関連するいづれかの核酸配列を意図している。この態様においては、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する他の植物細胞質タンパク質の配列が追加の源からのそのようなタンパク質に関連する核酸配列を単離するために同様に使用され得ることが見出され得る。核酸配列の単離のためには、cDNA又はゲノムライブラリーが、当業者に良く知られているプラスミド又はウィルスベクター及び技法を用いて調製され得る。所望する配列のためのスクリーニングに使用され得る有用な核酸ハイブリダイゼーション及び免疫学的方法は、当業者に良く知られており、そしてたとえば、Mani atis，et al.，（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition（ 1989）Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）により提供されている。典型的には、核酸プローブの使用から入手できる配列は、標的配列と対象のワックスシンターゼ酵素をコードする与えられた配列との間で60〜70％の配列の同一性を示すであろう。しかしながら、50〜60％の配列の同一性を有する長い配列もまた得られる。その核酸プローブは核酸配列の長いフラグメントであり得、又は短いオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る。より長い核酸フラグメントプローブとして使用される場合（約 100bp以上のフラグメント）、プローブとして使用される配列からの20〜50％の偏差（すなわち50〜80％の配列相同性）を有する、標的サンプルからの配列を得るために低い緊縮下でスクリーンできる。オリゴヌクレオチドプローブはワックスシンターゼ酵素をコードする完全な核酸配列よりも相当に短かいが、しかし少なくとも約10個、好ましくは少なくとも約15個、及びより好ましくは少なくとも約20個のヌクレオチドであるべきである。高い程度の配列同一性は、より短い領域がより長い領域に対立するものとして使用される場合に所望される。従って、アミノ酸配列の同一性が相同遺伝子を検出するためにオリゴヌクレオチドプローブを構築するために高い酵素活性部位を同定することが所望される。関連する遺伝子が一定の配列によるハイブリダイゼーションにより単離され得るかいづれかを決定するために、配列は、他の方法も利用できるけれども、放射能を用いての検出を可能にするためにラベルされる。ラベルされたプローブはハイブリダイゼーション溶液に添加され、そして所望する核酸を含むフィルター（相同性について所望する源をスクリーンするためにノーザン又はサザンブロットのいづれか）、又はスクリーンされるべきcDNA又はゲノムクローンを含むフィルターと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、対象の配列へのプローブのハイブリダイゼーションを最適化するために変えられ得る。低温及び高塩濃度は、より明確に関連する配列のハイブリダイゼーションを可能にする（低い緊縮）。バックグラウンドハイブリダイゼーションが低い緊縮下で問題である場合、温度がハイブリダイゼーション又は洗浄段階のいづれかにおいて高められ、そして／又は塩含有率が特定のハイブリダイズする配列の検出を改良するために低められ得る。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、Belt z，et al．(Methods in Enzymology（1983）100：266-285)に論ぜられるように、プローブの推定された溶融温度に基づいて調節され得る。上記で同定された有用なプローブ及び適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、cDNA又はゲノムライブラリーが、ラベルされた配列及び最適化された条件を用いてスクリーンされる。ライブラリーがまず、固体寒天培地上にプレートされ、そしてDNA が適切な膜、通常、ニトロセルロース又はナイロンフィルターに持ち上げられる。次にそれらのフィルターがラベルされたプローブによりハイブリダイズされ、そして上記のように洗浄され、関連する配列を含むクローンが同定される。免疫学的スクリーニングのためには、ホホバタンパク質に対する抗体は、精製されたタンパク質によりウサギ又はマウス（又は他の適切な小哺乳類）を注射することによって調製され得る。抗体を調製するための方法は当業者に良く知られており、そして抗体生成を専門に行なう人々も利用できる。モノクローナル又はポリクローナル抗体のいづれかが生成され得るが、但し、典型的にはポリクローナル抗体が遺伝子単離のためにはより有用である。所望する植物種をスクリーンするためには、ウェスターン分析が行なわれ、関連するタンパク質が、脂肪アシル−CoA 代謝に関与するホホバ植物細胞質タンパク質に対する抗体と交差反応する、所望する植物種の粗抽出物に存在することが決定される。これは、電気泳動に続いて、膜、通常ニトロセルロース上への植物抽出物のタンパク質の同定化及び抗体とのインキュベーションにより達成される。ニトロセルロースフィルター上の抗体／タンパク質複合体の検出のためには、多くの異なったシステム、たとえば抗体及び第２抗体／酵素接合体システムの放射性ラベリング法が利用できる。利用できるシステムのいくつかは、Oberfelder (Focus（1989）BRL／Life Technologies，Inc．11：1-5)により記載されている。初期実験が関連するタンパク質の検出に失敗する場合、他の検出システム及びブロッキング剤が利用され得る。交差反応性が観察される場合、関連するタンパク質をコードする遺伝子が、所望する植物種を表わす発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。発現ライブラリーは、種々の市販のベクター、たとえばMoniatis ，et al．（前記）に記載されているようなラムダgt11に構築され得る。 DNA ハイブリダイゼーション又は免疫学的スクリーニング技法を用いて上記のようにして同定されたクローンは次に精製され、そしてそのDNA が同定され、そして既知の技法を用いて分析される。この態様においては、クローンが関連するタンパク質をコードすることが実証される。脂肪アシル−CoA 代謝に関与する他の植物細胞質タンパク質は、ホホバの配列が使用される同じ態様で“新規”配列の使用により得られる。本発明の核酸配列が部位特異的変異誘発又はPCR の標準技法を用いて変性され得、又は配列の変性が合成核酸配列の生成において達成され得ることは当業者により認識されるであろう。そのような変性された配列はまた、本発明においても考慮される。たとえば、コドンにおけるwobble位は、核酸配列が同じアミノ酸配列をコードするように変更され得、又は他方、コドンは保存性アミノ置換がもたらされるように変更され得る。いづれの場合においても、ペプチド又はタンパク質は所望する酵素活性を維持し、そして従って、本発明の一部として考慮される。本発明の核酸配列は、ゲノムDNA，cDNA，mRNA に由来するDNA 又はRNA 配列であり、又は全体又は一部合成され得る。遺伝子配列は、適切な源からゲノムDNA を単離し、そしてポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いて対象の配列を増幅し、そしてクローニングすることによってクローン化され得る。他方、遺伝子配列は、特に植物−選択性配列を提供することが所望される場合、完全に又は一部合成され得る。従って、所望する構造遺伝子（タンパク質をコードする遺伝子の部分）のすべて又は一部は、選択された宿主により好まれるコドンを用いて合成され得る。所望する宿主に発現されるタンパク質に最も頻繁に使用されるコドンからの宿主−選択性コドンが決定され得る。脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質に関連する核酸配列は使用されるであろう。たとえば、宿主細胞におけるタンパク質の発現のためにプローブとして使用され得、又はその発現を提供するであろう組換え構造体が調製され得る。意図される使用に依存して、その構造体は、完全なタンパク質をコードする配列又はその一部を含むことができる。たとえばタンパク質の臨界領域、たとえば活性部位は同定され得る。従って、所望する活性のために必要なアミノ酸をコードする配列の一部のみを含む追加の構造体が調製され得る。さらに、cD NA配列の一部が転写されている、発現の阻害のためのアンチセンス構造体が使用され得る。本発明の配列の発現のための有用なシステムは、原生動物細胞、たとえば、Ｅ．コリ、酵母細胞及び植物細胞を包含し、維管束植物及び非維管束植物の両者の細胞が所望する宿主である。この態様においては、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質が、追加の研究、たとえばタンパク質の反応性質に対する特異的な変異誘発の効果を分析するためのコード配列の部位特異的変異誘発を可能にするために生成され得る。本発明の脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする DNA 配列が種々の手段で外来性DNA 配列と共に組合され得る。“外来性”DNA 配列とは、脂肪アシル−CoA 代謝配列に関与する植物細胞質タンパク質に天然においては結合されない同じ生物からのDNA 配列を包含する、脂肪アシル−CoA 代謝配列に関与する植物細胞質タンパク質に天然においては結合することが見出されていないいづれかのDNA 配列である。コード配列を利用するセンス及びアンチセンスの両構造体が考慮され、ここでは、センス配列が宿主細胞における脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の発現のために使用され得、そしてアンチセンス配列が標的生物により天然において生成されるタンパク質の内因性レベルを低めるために使用され得る。さらに、本発明の遺伝子配列は、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質に通常、関連している配列、たとえば調節又は膜標的化配列のすべて又は一部と一緒に外来性宿主に使用され得る。その成分部分においては、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードするDNA 配列が、転写の５′から３′方向に、宿主細胞において転写及び翻訳を促進できる転写開始制御領域、タンパク質コード配列及び転写終結領域を有する組換え構造体に組合される。宿主に依存して、調節領域は変化し、そしてウィルスからの領域、プラスミド又は染色体遺伝子、又は同様のものを含むことができる。原生又は真核微生物、特に単細胞宿主における発現に関しては、広範囲の種類の構成又は調節可能なプロモーターが使用され得る。微生物における発現は、植物酵素の容易な源を供給することができる。記載されて来た転写開始領域中には、遺伝子、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、Ｔ７ポメラーゼ、トリプトファンＥ及び同様のものを包含する、細菌及び酵母宿主、たとえばＥ．コリ、Ｂ．サブチリス(B．subtitis)、サッカロミセスセレビシアエ（Sacchromyce s cerevisiae）からの領域が存在する。大部分、組換え構造体は、機能的なタンパク質又は相補的なRNA をそれぞれ生成するために、センス又はアンチセンスのいづれかの配向で、脂肪アシル−CoA 代謝遺伝子に関与する植物細胞質タンパク質の転写を提供する植物において機能的な調節領域を含むであろう。タンパク質発現のためには、植物タンパク質又はその機能的なフラグメントをコードする読み取り枠が、その５′末端で、転写開始領域、たとえば例示されたホホバの上流の５′で天然において見出される野生型配列に結合されるであろう。広範囲の種類の構成又は調節可能な、たとえば構造遺伝子配列の誘発可能な発現を提供する、生来の植物遺伝子からの多くの他のプロモーター領域が利用できる。生来の植物遺伝子からの配列の他に、他の配列、たとえばアグロバクテリウム遺伝子に関連する調節領域、たとえばナパリンシンターゼ(Nos)、マンノピンシンターゼ(Mas)、又はオクトピンシンターゼ(Ocs)遺伝子に関連する領域が、植物における構成遺伝子の発現を提供することができる。ウィルス遺伝子の発現を制御する領域、たとえばカリフラワーモザイクウィルス（CaMr）の35Ｓ及び19Ｓ領域がまた有用である。本明細書で使用される場合、用語、“構成”とは、すべての細胞型において同じレベルで、遺伝子が発現されるが、しかしその遺伝子は、多くの変動がしばしば検出されるが、広範囲の細胞型において発現されることを必ずしも示唆していない。他の有用な転写開始領域、たとえばナピン、種子又は葉のACP，RUBISCOの小サブユニット、及び同様のものからのものが、一定の組織において又は一定の増殖条件下で転写を選択的に提供する。脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の発現が植物宿主において所望される態様においては、完全な植物遺伝子のすべて又は一部が所望され、すなわち構造遺伝子配列と一緒に５′上流の非コード領域（プロモーター）及び３′下流の非コード領域が使用され得る。異なったプロモーター、たとえば対象の植物宿主に生来のプロモーター又は変性されたプロモーター、すなわち１つの遺伝子源に由来する転写開始領域及び異なった遺伝子源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーター又は増強されたプロモーター、たとえば二重35Ｓ CaMV プロモーターが所望される場合、その配列は標準技法を用いて一緒に連結され得る。さらに、高く発現された植物遺伝子からの５′未翻訳領域は、本明細書に記載されるタンパク質の高められた発現を提供するために有用である。植物における発現を提供するDNA 構造体は、広範囲の種類の植物生命体、特に脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の脂肪アシル−CoA 基質を生成する植物、たとえばブラシカと共に使用され得る。他の興味ある植物は、所望する脂肪アシル基質、たとえば中ぐらい又は長い鎖の脂肪アシル分子を生成し、そしてナタネ種子（カノラ品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿花、クフェア（ Cuphea）、ダイズ、落花生、ココヤシの実及びヤシ油、及びトウモロコシを含有するが、但しこれだけには限定されない。エステル生成のための脂肪アルコール基質に関しては、ホホバ以外の種子植物は多量の脂肪アルコールを生成することは知られていないが、但し少量のこの基質は、ワックスシンターゼ酵素に利用でき得る。従って、本発明の構造体と一緒に、宿主細胞に存在する脂肪アシル分子から脂肪アルコールを生成する能力を有する標的の宿主細胞を提供することが所望される。たとえば、植物脂肪アシルレダクターゼ及び植物細胞においてのそのレダクターゼ酵素の発現のための方法は、同時継続出願USSN07／767,251 に記載されている。ホホバレダクターゼの核酸配列及び翻訳されたアミノ酸配列は図１に与えられている。従って、宿主植物細胞にワックスシンターゼ及びレダクターゼ活性の両者を付与することによって、ワックスエステルが脂肪アルコール及び脂肪アシル基質から生成され得る。ホホバレダクターゼの他に、他の生物からのレダクターゼ酵素は、本発明のワックスシンターゼと一緒に有用である。レダクターゼ酵素の他の可能性ある源は、ユーグレナ(Euglena)、アシネトバクター(Acinetobocter)、ミクロコカス（Mi crococus）、一定の昆虫及び海洋生物、及びワックスエステルを含むことが知られている特殊化された哺乳類又は鳥類組織、たとえばウシマイボーム腺又は鳥類の尾腺を包含する。レダクターゼタンパク質の他の可能性ある源は、脂肪アルコールを生成するそれらの能力、又はワックスシンターゼがまた存在する場合、ワックスエステルを生成する能力により同定され得る。ワックスシンターゼ活性をコードする配列及びレダクターゼ配列は、同じ形質転換出来事の間に提供され得、又は他方、２種の異なったトランスゲニック植物系、すなわち１つはワックスシンターゼ構造体を有し、そして他はレダクターゼ構造体を有する植物系が種々の構造体による形質転換により生成され得る。それらの植物系は次に、ワックスエステル生成物の生成のためのワックスシンターゼ及びレダクターゼ含有植物を提供するために既知の植物繁殖技法を用いて交差され得る。ワックスエステル生成を導びく用途のためには、種子の成熟の間に調節された遺伝子から得られた５′上流の非コード領域、特に植物胚組織において選択的に発現されたもの、たとえばACP 、オレオシン(Lee and Huang（1991）Plant Phys iol．96：1395-1397)及びナピン調節領域に由来する領域が所望される。種子組織において好ましい発現を提供する、すなわち他の植物部位において検出できない転写開始領域は、他の植物部位において遺伝子生成物の破壊的又は悪影響を最少にするためにワックスエステル生成のために所望されると思われる。さらに、そのような植物の種子が収穫され、そしてそれらの種子の脂質保存体が、ワックスエステルの容易な源を提供するために回収され得る。従って、新規の種子生成物は、本明細書に記載されるようにワックスシンターゼ構造体による不在の形質転換がそれらの種子脂質保存体の成分としてワックスエステルを生成することが知られていない種子油植物において生成され得る。同様に、種子プロモーターは、VLCFA 生成又はVLCFA の阻害が所望される場合に所望される。この態様においては、VLCFA のレベルが種々の植物種において変性され得る。そのような“種子特異的プロモーター”は、“Nuvel Sequences Pr eferentsally Expressed In Early Seed Development and Methods Related The reto”の標題を有する、1990年３月16日に出願されたU.S.通し番号07／494,722 号及び1988年１月25日に出願されたU.S.通し番号07／147,781 号（現在、1981年８月８日に出願されたU.S.通し番号07／742,834 号）の教授に従って得られ、そして使用され得る。さらに、植物遺伝子、たとえばホホバタンパク質が発現される場合、形質転換された植物種、たとえばアラビバプシス又はブラシカにおいてのホホバ遺伝子の発現のために、コード配列に存在する５′及び３′調節領域及びいづれかのイントロンを含む完全な植物遺伝子を用いることが所望される。調節転写終結領域が同様に本発明の組換え構造体に提供され得る。転写終結領域は、脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードするDNA 配列又は異なった遺伝子源に由来する便利な転写終結領域、特に転写開始領域と天然において関連している転写終結領域により提供され得る。その転写開始領域は、その終結領域が由来する構造遺伝子側の３′配列の少なくとも約 0.5kb、好ましくは約１〜３kbを含むであろう。追加の植物遺伝子領域は、植物組織における発現を最適化するために使用され得る。たとえば、高く発現された遺伝子の５′未翻訳領域、たとえばDNA コード配列の５′側に挿入された、RuBP−カルボキシラーゼの小サブユニット(SSU)の領域は、高められた翻訳効能を提供できる。SSU リーダータンパク質コード領域の部分（たとえば少なくとも６個のアミノ酸をコードする部分）はまた、そのような構造体に使用され得る。さらに、植物プラスチドオルガネラへの標的が所望される用途に関しては、SSU 又は他の核コードクロロプラストタンパク質からのトランジットペプチドコード配列が、ワックスシンターゼ及びレダクターゼ配列と一緒に使用され得る。宿主細胞中へのDNA 発現構造体の導入のための方法に依存して、他のDNA 配列が必要とされる。重要なことは、本発明は双子葉類及び単子葉類種に同様に適用でき、そして新規及び／又は改良された形質転換及び再生技法に容易に適用できるであろう。組換え構造体を開発することにおいては、その構造体又はそのフラグメントの種々の成分が、細菌宿主、たとえばＥ．コリにおいて複製できる便利なクローニングベクター中に通常挿入されるであろう。文献に記載されている種々のベクターが存在する。個々のクローニングの後、プラスミドが単離され、そして追加の操作、たとえば制限、新規フラグメントの挿入、連結、欠失、挿入、再切断、等にゆだねられ、所望する配列の成分が製造される。構造体が完結された後すぐに、それは、宿主細胞の形質転換の態様に従っての追加の操作のために適切なベクターにトランスファーされ得る。通常、組換え構造体は、宿主における発現のための必要な調節領域を有し、そして形質転換細胞の選択を提供する構造遺伝子を含むであろう。前記遺伝子は、細胞毒性剤、たとえば抗生物質、重金属、毒素、等に対する耐性、栄養要求宿主に原栄養性を付与する相補性、ウィルス免疫性又は同様のものを提供することができる。同様に、色の変化、たとえばGUS 、又はルミネセンス、たとえばルシフェラーゼにより同定できる化合物の生成を付与する、酵素コードの遺伝子が有用である。発現構造体又はその成分が導入される、異なった宿主種の数に依存して、１又は複数のマーカーが使用され、ここでは選択のための異なった条件が異なった宿主のために使用される。本発明の脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする配列の転写を提供する配列の他に、本発明のDNA 構造体はまた、追加の遺伝子の発現を提供し、このタンパク質生成物は価値ある最終生成物を生成するために本明細書に記載されるタンパク質と一緒に作用することができる。たとえば、上記のように、ワックスエステルが形質転換された宿主に生成されるように、ワックスシンターゼ活性及び脂肪アシルレダクターゼの発現を付与するDNA 構造体が本発明において考慮される。さらに、種々の炭素鎖長及び飽和の程度を有する異なったワックスエステルの生成が所望され、そして種々の鎖長の脂肪アルコール又は脂肪アシル基質を有する宿主植物を形質転換することによって付与され得る。そのような植物は、たとえば種々のチオエステラーゼ遺伝子及び形質転換された植物宿主において種々の鎖長を有する脂肪アシル基質を生成するためにそのような遺伝子を用いる方法を記載している、公開された国際特許出願番号PCT WO91／ 16421 に記載される方法により提供され得る。さらに、種子油植物宿主においてのワックスエステルの生成を最適化するためには、そのような植物の種子に通常生成されるトリグリセリド油の生成を低めることが所望される。これを達成するための１つの方法は、この方法に臨界である遺伝子をアンチセンス化することであるが、しかしワックスエステルの生成のためには必要ではない。そのような遺伝子標的物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及びトリグリセロールの合成を触媒する他の酵素を包含する。さらに、栄養源としてワックスエステルを分解するために使用され得、たとえばホホバ又は種々の他のワックス生成生物から単離され得る酵素を有する種子油植物を提供することが所望される。この態様においては、種子植物宿主におけるワックスエステルの最大の生成が達成され得る。本明細書に記載される方法で生成されたワックスエステルは、ホホバからワックス抽出のための技法を用いて、又は種々の種子油収穫物から油生成物を得るために使用される種々の生成法により収穫され得る。このようにして得られたワックスは、多くの産業、たとえば医薬、化粧、洗剤、プラスチック及び滑剤産業に適用できる。適用は、ワックスエステル成分の鎖長及び飽和の程度に依存して変化するであろう。たとえば個々の炭素鎖に二重結合を有する長い鎖のワックスは室温で液体であるが、しかし飽和炭素成分を有するワックスは、特にその飽和された炭素鎖が長い炭素鎖である場合、室温で固体である。エロンガーゼ活性に関する用途においては、ホホバ遺伝子が、実質的にいづれかの種のトランスゲニック植物における遺伝子の過度発現により種子油における脂肪酸の鎖長を延長するために使用され得；前記遺伝子はまた、VLCFA を生成する他の種からの相同クローンを単離するために低い緊縮性のハイブリダイゼーションにおいてプローブとしても使用され得る。次に、それらの誘導された遺伝子は、それらが単離された種において、又は十分な遺伝子相同性が存在する他の植物種においてVLCFA のレベルを減じるためのアンチセンス実験に使用され得る。他方、それらの遺伝子は、トランスゲニック植物においてVLCFA の量を高めるために過度発現され得る。さらに、この酵素をコードする相同のブラシカ遺伝子からのDNA は、HEAR、及びカノラ及び他の種子油収穫物の育成を助ける分子マーカーを開発するための植物育成道具として使用され得る。そのような技法は、分子プローブとしてその遺伝子自体を用いること、又は植物育成プログラムにPCR に基づくスクリーニング技法を用いるためのPCR プライマーを構築するためにそのDNA 配列を用いることを包含する。さらに、植物上皮細胞における遺伝子の過度発現はクチクラの蓄積を高め、それによって対照の植物よりもトランスゲニック植物の日照り及びストレスに対する耐性を高める。形質転換の方法は本発明において臨界ではなく；植物形質転換の種々の方法が現在利用できる。より新しい方法が収穫物を形質転換するために利用できるので、それらは直接的に適用され得る。たとえば、アグロバクテリウム(Agrobacteri um)感染に対して天然において敏感な多くの植物種は、アグロバクテリウム介在形質転換の三元又は二元ベクター方法により都合良く形質転換され得る。宿主植物細胞に核酸配列のトランスファーを付与するのに有用な他の配列は、植物病原性ウィルス又は植物転移因子から誘導され得る。さらに、種々の単子葉及び双子葉植物種の形質転換を可能にする、マイクロインジェクション、DNA 種子衝撃、エレクトロポレーションの技法が開発されて来た。アグロバクテリウムが植物形質転換のために利用される場合、T-DNA により一端又は両端、特に左及び右のボーダー領域及びより特定には、少なくとも右のボーダー領域上で隣接している所望する核酸配列を有することが所望される。それらのボーダー領域はまた、形質転換の他の方法が使用される場合にも有用である。アグロバクテリウム又はリゾゲネス（Rhizogemes）の配列が植物形質転換のために利用される場合、宿主に存在するTi又はRiプラスミド上でのT-DNA による相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入され得るベクターが使用され得る。組換えのためのT-DNA を含むTi−プラスミドは、武装され得（ガル形成を引き起こすことができる）、又は武装解除され得（ガル形成を引き起こすことができない）、後者は植物宿主細胞へのDNA のトランスファーのために必要なトランス位作用（ trans-acting）因子を有する、vir 遺伝子の機能的な補体が形質転換されたアグロバクテリウム宿主に存在する限り許容できる。武装されたアグロバクテリウム株の使用が通常の植物細胞の混合物をもたらし、そのいくつかは所望する核酸配列を含み、そして植物細胞は腫瘍形成遺伝子の存在によりガル形成できる。所望する核酸配列を含むが、しかし腫瘍遺伝子を欠いている細胞が、通常のトランスゲニック植物が得られるように混合物から選択され得る。アグロバクテリウムが宿主植物細胞を形質転換するためのビークルとして使用される好ましい方法においては、T-DNA ボーダー領域により隣接される発現又は転写構造体は、Ｅ．コリ及びアグロバクテリウムにおいて複製できる広い宿主範囲のベクター中に挿入され、ここで前記広い宿主範囲のベクターは文献に記載されている。pPK2又はその誘導体が通常使用される。たとえば、Ditta，et al.，( Proc．Nat．Acad．Sci.，U.S.A．（1980）77：7347-7351)及びEPA 0 120513を参照のこと。他方、別々の複製配列を含むベクター中に植物細胞において発現されるべき配列を挿入することができ、前記配列の１つはＥ．コリにおいてベクターを安定化し、そして他はアグロバクテリウムにおいてベクターを安定化する。たとえばMcBride and Summerfelt(Plant Mol．Biol．（1990）14：269-276)を参照のこと。ここでは、pRiHRI(Jouanin，et al.，Mol．Gem．Genet．（1985）201： 370-374)が使用され、複製の起点が利用され、そして宿主アグロバクテリウム細胞における植物発現ベクターの付加された安定性を提供する。アグロバクテリウムにおいて複製できる上記のようなベクターの使用が好ましい。この態様においては、プラスミドの組換えは必要とされず、そして宿主アグロバクテリウムのvir 領域が植物宿主細胞へのT-DNA 隣接の配列のトランスファーのために必要とされるトランス位作用因子を供給できる。１つのそのような方法は、たとえばRadke et al．(Theor．Appl．Genet．（1988）75： 685-694)により記載されている。本発明は一般的に現在、記載されているが、次の例により一層容易に理解されるであろう。それらの例は、例示目的であって、特にことわらない限り、本発明と限定するものではない。例例１−ワックスシンターゼアッセイミクロソーム膜調製物又は溶解されたタンパク質調製物におけるワックスシンターゼ活性のためのアッセイ方法が記載される。Ａ．放射性ラベルされた材料ワックスシンターゼアッセイに一般的に使用される基質、すなわち〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA を、Amersham(Arlington Heights，IL)から購入した。他の鎖長の基質を合成し、鎖長特異性研究を行なった。長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕脂肪酸（ 51〜56Ci／モルの比活性）、すなわち11−シス−エイコサン酸、13−シス−ドコサン酸、及び15−シス−テトラコサン酸を、〔¹⁴Ｃ〕シアン化カリウムとその対応するアルコールメシレートとの反応、続く遊離脂肪酸へのアルコールニトリルの塩基加水分解により調製する。遊離脂肪酸をそれらのメチルエステルにエーテル性ジアゾメタンにより転換し、そして分離用硝酸銀薄層クロマトグラフィー(T LC)により精製する。脂肪酸メチルエステルを、遊離脂肪酸に加水分解する。放射化学純度を次の３種のTLC 法により評価する：通常の相シリカTLC、硝酸銀TL C 及びＣ18逆相TLC。それらの方法により測定される放射化学純度は92〜98％であった。長鎖〔１−¹⁴Ｃ〕アシル−CoAsをその対応する〔１−¹⁴Ｃ〕遊離脂肪酸からYoung and Lynen(J．Bio．Chem.(1969)244：377)の方法により調製する（その比活性は10Ci／モルである）。〔１−¹⁴Ｃ〕ヘキサデカナールを、Pletcher a nd Tate（Tet．Lett．（1978）1601-1602）の方法の微小規模変性に従って〔１ −¹⁴Ｃ〕ヘキサデカン−１−オールの重クロム酸塩酸化により調製する。生成物を分離用シリカTLC により精製し、そして使用まで−70℃でヘキサン溶液として貯蔵した。Ｂ．ミクロソーム膜調製物におけるワックスシンターゼ活性についてのアッセイミクロソーム膜調製物におけるワックスシンターゼ活性を、40μＭの〔１−¹⁴ Ｃ〕アシル−CoA(通常、パルミトイル−CoA 、比活性 5.1〜5.6mCi／ｍモル）及び 200μＭのエレイルアルコールと0.25mlの合計体積でアッセイされるべきサンプルとのインキュベーションにより測定する。そのインキュベーション混合物はまた、20％ｗ／ｖのグリセロール、１mMのDTT，0.5ＭのNaClを含み、そして25mM のHEPES(４−〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピペラジンエタン−スルホン酸) により緩衝化されている。ここで及びこの後に言及されるHEPES は、pH7.5 に調整された１Ｍの原液から添加される。基質混合物をガラスバイアルに調製し、そしてオレイルアルコールが使用のすぐ前で添加され、そしてサンプルに添加する。インキュベーションは30℃で１時間、行なう。アッセイは、氷上にアッセイ管を置き、そしてすぐに、0.25mlのイソプロパノール：酢酸（４：１ｖ／ｖ）を添加することにより停止される。ラベルされていないワックスエステル(0.1mg)及びオレイルアルコール(0.1mg)をキャリヤーとして添加する。〔¹⁴Ｃ〕脂質を、Hara and Radin(Anal ．Biochem．（1978）：90：420)の小規模法により抽出する。４mlのヘキサン／イソプロパノール（３：２，ｖ／ｖ）を、前記停止されたアッセイに添加する。サンプルを振盪し、２mlの硫酸ナトリウム水溶液（6.6％ｗ／ｖ）を添加し、そしてサンプルを再び振盪する。Ｃ．溶解されたワックスシンターゼ活性についてのアッセイ溶解されたワックスシンターゼ活性をアッセイするためには、タンパク質の再構成が必要とされる。再構成は、リン脂質（Sigma P-3644、約40％のＬ−ホスファチジルコリン）の0.75％CHAPS −溶解されたサンプルへの 0.2mg／mlの濃度での添加、続く、CMC 以下の 0.3％への界面活性剤により希釈により達成される。活性の再構成は、リン脂質小胞中へのワックスシンターゼの組込みに基づかれて推定される。再構成の度に検出されるワックスシンターゼ活性の量は、多くの要因(たとえばリン脂質：タンパク質の比及びワックスシンターゼタンパク質の物理的な状態(たとえば凝集又は分散）)により影響されることが理解される。Ｄ．アッセイ生成物の分析ミクロソーム膜調製物ワックスシンターゼアッセイ又は溶解されたワックスシンターゼアッセイのいづれかの生成物を分析するために、２種の手段が開発された。“広範なアッセイ”として下に記載される１つの手段は、より時間がかかるが、しかしより高い定量結果をもたらす。“敏速なアッセイ”として下に記載される他の手段はまた、ワックスシンターゼ活性の測定を提供し、より敏速で便利ではあるが、しかし低い定量結果をもたらす。１．広範な分析：硫酸ナトリウムの添加及びサンプルの振盪に続いて、上部の有機相を除去し、そして低部の水性相を４mlのヘキサン／イソプロパノール（７：２ｖ／ｖ）により洗浄する。有機相をプールし、そして窒素下で蒸発乾燥せしめる。脂質残留物を小量のヘキサンに再懸濁し、そしてアリコートを液体シンチレーションカウントにより放射能についてアッセイする。サンプルの残りをラベルされた種類のTLC 分析のために使用し、そしてそれにより、生成された合計ワックスの測定を与える。脂質種類の分析のためには、サンプルをシリカTLC プレートに適用し、そしてプレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（80：20：１ｖ／ｖ／ｖ／）において進行せしめる。脂質種類、大部分ワックスエステル、遊離脂肪酸、脂肪アルコール及び起点での極性脂質間での放射能の分布を、AMBIS 放射性分析イメージングシステム（AMBIS System Inc.，San Diego，CA）を用いて測定する。必要なら、個々の脂質種類を、追加の分析のためにTLC プレートから回収する。メタノール中で進行される、Ｃ18プレートを用いての逆相TLC システムがまた、分析のために使用された。２．敏速なアッセイ：硫酸ナトリウムの添加及びサンプルの振盪に続いて、既知の％の有機相を除去し、そして液体シンチレーションカウントにより計数する。この計算は有機相における合計の計数を評価するために使用される。もう１つの部分の有機相を除去し、窒素下で乾燥し、ヘキサンに再溶解し、そしてTLC プレート上にスポットし、そして前記詳細されたアッセイのために記載のようにしてスキャンする。この態様においては、ワックス中に組込まれる合計の計数の％が決定される。例２−ワックスシンターゼタンパク質の放射性ラベリング放射性ラベルされた〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA（Amersham）を、５μｌのラベル：40μｌのタンパク質サンプルの比で、溶解されているか又はミクロソーム膜画分でのワックスシンターゼ調製物に添加する。サンプルを室温で少なくとも15分間、追加の処理の前、インキュベートする。SDS-PAGE分析のために、サンプルを直接的にSDS サンプル緩衝液により処理し、そして電気泳動のためにゲル上に負荷する。例３−ワックスシンターゼ活性を特徴づけるためのさらなる研究Ａ．種子成長及びワックスシンターゼ活性フロフィール胚の成長を、Davis，CA で５種の植物に対して２シーズンの夏じゅう調べる。胚及び乾量は約80〜約 130日でかなり一定した割合で上昇することが見出された。脂質抽出は、胚が約 300mgに達した場合（約80日で）、脂質の質量：乾量の割合は、50％の最大レベルに達することを示す。ワックスシンターゼ活性を、例２に記載しているようにして、成長する胚において測定する。ホホバ種子の種皮は阻害因子の源であることが決定されたので、その種皮を除去し、その後、−70℃での貯蔵のために液体窒素において胚を凍結した。細胞フリーホモジネート又は膜画分のいづれかにおいて測定される場合、ワックスシンターゼ活性についての発育プロフィールは、薊形成後、約 110〜115 日でピークである活性の大きな誘発を示唆する。酵素等研究のための胚を、葯形成の後、約90〜100 日で収穫し、ワックスシンターゼ活性が多い場合、脂質沈殿は最大レベルに達しておらず、そして種皮は容易に除去される。ワックスシンターゼ活性の上昇の最高速度が、葯形成後、80〜90日で見られる。cDNAライブラリー構成のための胚を、葯形成後、約80〜90日で収穫し、この時、ワックスシンターゼタンパク質の合成速度がたぶん最大であろう。従って、ワックスシンターゼをコードするmDNAのレベルは、この段階で最大であると推定される。Ｂ．基質特異性種々の炭素鎖長及び飽和の程度を有するアシル−CoA 及びアルコール基質を、ワックスシンターゼ活性を有するミクロソーム膜画分に添加し、ホホバワックスシンターゼにより認識される基質の範囲を決定した。ワックスシンターゼ活性を例１に記載のようにして測定し、そしてアシル特異性は80μＭのアシル−CoA 基質及び 100μＭの放射性ラベルされたオレイルアルコールを用いて測定された。アルコール特異性は、100μＭアルコール基質及び40 μＭの放射性ラベルされたエイコセノイル−CoA を用いて測定された。それらの実験の結果は下記表１に示される。上記結果は、ホホバワックスシンターゼが広範囲の脂肪アシル−CoA 及び脂肪アルコール基質を利用することを示す。さらに、種々のアシル−チオエステル基質に対するワックスシンターゼ活性を同様に、アシル基質としてパルミトイル−CoA、パルミトイル−ACP 及びＮ−アセチル−Ｓ−パルミトイルシステアミンを用いて試験した。最大の活性が、アシル−CoA 基質により観察された。有意な活性（アシル−CoA による活性の約10％）がアシル−ACP により観察されたが、しかしＮ−アセチル−Ｓ−パルミトイルシステアミン基質による活性は検出されなかった。Ｃ．活性のエフェクター種々のスルフヒドリル剤を、ワックスシンターゼ活性に対するそれらの活性についてスクリーンした。有機水銀化合物は、活性を強く阻害することを示された。ヨードアセトアミド及びＮ−エチルマレアミドはほとんど効果的ではなかった。パラ−ヒドロキシメルクリベンゾエートによる阻害は観察されたが、しかしこの阻害はDTT の続く添加により逆転された。それらの結果は、パラ−ヒドロキシメルクリベンゾエートによる阻害が必須のスルフヒドリル基のブロッキングを包含することを示す。Ｄ．サイズ排除クロマトグラフィーカラム(1.5cm×46cm)を、5000〜250,00ドルトンのサイズ範囲のSephacryl-200 （Pharmacia）により充填し、そして 0.5ＭのNaClを含むカラム緩衝液（25mMのH EPES，20％のグリセロール、0.75％のCHAPS，１mMのEDTA）により平衡化した。B lue Aカラム（例４Ｃを参照のこと）からの一回の 1.5ＭのNaCl溶出からのプールされた濃縮物約２mlを負荷し、そしてカラムを 0.5ml／分で実施した。溶出された画分を、例１に記載される再構成手段に従ってワックスシンターゼ活性についてアッセイする。ワックスシンターゼ活性は、ボイド画分で開始し、そして試験の残りを通して低下する広いピークとして見なされる。ワックスシンターゼ活性を有する画分の一部を、１−¹⁴Ｃ16：0-CoA（0.0178μＭ）により室温で15分間、処理する。SDS を添加し、２％にし、そしてサンプルをSDS-PAGEゲル上に負荷する。電気泳動に続いて、ゲルをProblott(Applied Biosystems；Foster City ，CA)にブロットし、そして乾燥されたブロット膜をオートラジオグラフィーにより分析する。他方、ブロットを、自動スキャンシステム(AMBIS：San Diego，C A)を用いて、放射能についてスキャンする。この態様においては、ワックスシンターゼ活性を有する57kDの放射性ラベルされたバンドが分析された画分において存在することが観察される。ワックスシンターゼ活性に関連するタンパク質をさらに、第２のサイズ排除マトリックス上でのクロマトグラフィーにより特徴づける。ワックスシンター活性を含むBlue Aカラム(1.0ＭのNaCl溶出段階に続く）からの10倍に濃縮された 1.5 ＭのNaCl溶出画分(100μｌ)を、SuperoseにHR10／30カラム(Pharmacia；Piscata way，NJ)上でクロマトグラフィー処理し、そして分子量標準(MW GF-70及びMW GF -1000；Sigma)により検量されたカラム上でFast Protein Liquid Chromatograph y（FPLC）により分析する。活性アッセイは、溶出された画分に対して行なわれる。回収されたワックスシンターゼ活性のほとんど53％がボイド画分に見出されるが、しかし容易に検出できる活性は検量曲線に従って、ほぼ55kdで溶出することが見出される。それらのデータは、生来の活性ワックスシンターゼタンパク質の最小サイズがラベルされたバンドの57kDサイズにひじょうに類似し、従って、ワックスシンターゼ活性が単一のポリペプチドにより付与される証拠を提供することを示唆する。ボイド画分に観察されるワックスシンターゼ活性の部分は、たぶん、酵素の凝集された形である。Ｅ．パルミトイル−CoA アガロースクロマトグラフィーカラム(1.0×３cm)を、16：0-CoA アガロース（Sigma P-5297）により充填し、そして 0.2ＭのNaClを含むカラム緩衝液（例１のＤを参照のこと）により平衡化する。Ble Aカラムの1.5ＭのNaCl洗浄からのプールされた濃縮物約４mlを融解し、そして 0.2ＭのNaClカラム緩衝液により平衡化されたPD-10（Pharmacia）脱塩カラム上への濃縮物の通過により塩濃度を減じる。減じられた塩サンプル（５ ml）を、16：0 CoA アガロースカラム上に0.15ml／分の流速で負荷する。カラムを 0.5ＭのNaClカラム緩衝液により洗浄し、そして次に、 1.5ＭのNaClカラム緩衝液により洗浄する。いくらかのワックスシンターゼ活性はカラムを通して流れ、又は 0.5ＭのNaCl洗浄により除去されるが、回収された活性の大部分（負荷された活性の21％）が 1.5ＭのNaCl溶出ピークにおいて回収される。ワックスシンターゼ活性を示す画分の一部を、例２に記載されているようにして〔¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA により放射性ラベルし、そしてSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Laemmli，Nature（1970）227：680-685)により分析する。再び、ワックスシンターゼ活性を有する、約57kDの放射性ラベルされたタンパク質バンドが観察される。例４−ホホバワックスシンターゼの精製ワックスシンターゼ活性を有するホホバ膜調製物の単離、ワックスシンターゼタンパク質の溶解及びワックスシンターゼタンパク質のさらなる精製のために使用され得る方法は記載される。Ａ．ミクロソーム膜調製物ホホバの胚を、その胚の水含有率（45〜70％）を測定することによって評価されるように、開花の後、約90〜110 日で収穫する。外部殼及び種膜を除去し、そして子葉も液体窒素中ですばやく凍結し、そして後での使用のために−70℃で貯蔵する。初期タンパク質調製物に関しては、凍結された胚を鋼製乳鉢及び乳棒により液体窒素温度でたたいて粉末にする。典型的な実験においては、70ｇの胚が加工される。前記粉末が、胚70ｇ当たり 280mlの溶液の割合で、次の高塩溶液に添加する：３ＭのNaCl， 0.3Ｍのスクロース、 100mMのHEPES ，２mMのDTT 、及びプロテアーゼインヒビター、１mMのEDTA， 0.7μｇ／mlのロイペプチン、 0.5μｇ／mlのペプスタチン及び17μｇ／ mlのPMSF。細胞フリーホモジネート(CFH)を、前記粉末化された胚を緩衝液中で組織ホモナイザー(Kinematica，Switzerland；モデルPT10／35)により約30秒間、分散し、そして次に、三層のMiracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)を通して濾過することによって形成する。濾液を、 100,000xgで１時間、遠心分離する。得られたサンプルは、ペレット、上清液及び浮遊性脂肪パッドから成る。その脂肪パッドを除去し、そして上清液画分を集め、そして１ＭのNaCl， 100mMのHE PES ，２mMのDTT 及び 0.5ＭのEDTAを含む溶液に対して一晩透析する（緩衝溶液の３回の取替えを伴う）。透析物を 200,000xgで 1.5時間、遠心分離し、ペレットDP２を得る。そのペレットを、25mMのHEPES 及び10％のグリセロールに、元の CFH 体積の１／20で懸濁し、ミクロソーム膜調製物を得る。活性を例１に記載しているようにしてアッセイする。ワックスシンターゼ活性の回収率を、細胞フリーホモジネートにおける元の活性の34％で評価する。この調製物におけるワックスシンターゼ活性は、−70℃で貯蔵される場合、安定している。Ｂ．ワックスシンターゼタンパク質の溶解 CHAPS(３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ〕−１−プロパンスルホネート)及びNaClを、ミクロソーム膜調製物に添加し、それぞれ２％及び 0.5Ｍの最終濃度を得る。サンプルを氷上で約１時間インキュベートし、そして次に25mMのHEPES ，20％のグリセロール、 0.5ＭのNaClにより希釈し、0.75 ％にCHAPS 濃度を低める。次に、サンプルを 200,000xgで１時間、遠心分離し、そして上清液を回収し、そして例１．Ｃに記載のようにしてワックスシンターゼ活性についてアッセイする。典型的には、ミクロソーム膜調製物からの11％のワックスシンターゼ活性が上清液画分に回収される。溶解されたワックスシンターゼ活性は、−70℃で貯蔵される場合、安定している。Ｃ．Blue Aカラムクロマトグラフィー Blue A(Cibacron Blue F3GA；Amicon Division，W.R．Grace & Co.)により充填された、約30mlの層体積を有するカラム(2.5×８cm)を調製し、そしてそのカラムを、 0.4ＭのNaClを含むカラム緩衝液（25mMのHEPES ，20％のグリセロール、0.75％のCHAPS，１mMのEDTA）により平衡化する。溶解されたワックスシンターゼ調製物を、カラム緩衝液（25mMのHEPES ，20％のグリセロール、0.75％のCH APS ，１mMのEDTA）の添加により 0.4ＭのNaClに希釈し、そしてBlue Aカラムに負荷する。カラムを、タンパク質がカラムを通して流れる緩衝液に検出されなくなるまで (280nmでの吸光度により測定される場合)、 0.5ＭのNaClを含むカラム緩衝液により洗浄する。94％以上のワックスシンターゼ活性がカラムに結合し、そして83 ％以上の他のタンパク質が通過する。典型的には、負荷されたワックスシンターゼ活性の約20％が溶出により回収される。 1.0ＭのNaClを含むカラム緩衝液により、回収された活性（17％）の一部が溶出し、そして回収された活性の約75％が 1.5ＭのNaClカラム緩衝液による 150mlの洗浄液に広いピークとして溶出する。 1.5Ｍの洗浄液の５ml画分を集め、そして例１に記載のようにしてワックスシンターゼ活性についてアッセイする。ワックスシンターゼ活性を含む画分をプールし、そしてAmicon撹拌細胞単位及びYM30膜を用いて10倍に濃縮する。その濃縮されたワックスシンターゼ調製物を、−70℃で貯蔵する。Ｄ．サイズ排除カラムクロマトグラフィー Blue A上でのクロマトグラフィー処理から集められた画分においては、脂肪アルコール及びアシル−CoA からのワックスエステルの形成を担当するアシル−トランスフェラーゼ酵素活性が、β−ケトアシル−CoA シンターゼの測定できる活性と共に同時溶出する。β−ケトアシル −CoA シンターゼ活性をこのワックスシンターゼ活性から、Ｓ100 セファロースを用いてのサイズ排除クロマトグラフィーにより分離できる。サイズ排除クロマトグラフィーのための好ましいカラム緩衝液は、 1.0％をCHAPS を含んで成る。なぜならば、0.75％のCHAPS で、酵素は凝集し、すなわちそれ自体及び他のタンパク質に付着する傾向があるからである。 1.0％のCHAPS に調整されたカラム緩衝液の使用は、Ｓ100 上でのワックスシンターゼ活性のβ−ケトアシル−CoA シンターゼタンパク質からの明白な分離を可能にし、ここでワックスシンターゼが保持され、そしてβ−ケトアシル−CoA シンターゼは排除される。大部分のワックスシンターゼ活性が、 57kDaの分子質量を有するピークとして、Ｓ100 サイズカラムから溶出する。0.75％のCHAPS で、合計のアッセイ可能なワックスシンターゼ活性のわずかな部分のみが 57kDaで見出され、そして残りはボイド及び保持された画分上で分布した。ワックスシンターゼはまた、放射性ラベルされたタンパク質、すなわち14Ｃ− パルミトイル−CoA と共にインキュベートすることにより上記方法によりラベルされているワックスシンターゼタンパク質のSDS ゲルに基づいて、約57kDa の推定分子質量を有する。そのラベルされたバンドは、サイズ排除カラムから集められた画分においてワックスシンターゼ活性を示し、そしてβ−ケトアシル−CoA シンターゼ活性はＳ100 カラムにより完全に排除される。 Blue Aカラム画分からの最も有力な 57kDaタンパクとして、β−ケトアシル− CoA シンターゼはSDS PAGEから除かれたバンドからアミノ酸配列決定され得る。ワックスシンターゼ活性はSDS PAGEにより単離され、そしてＳ100 上に保持される画分から類似する方法によりクローン化され得る。Ｅ．SDS PAGE分析Ｓ100 又は活性Blue Aカラム画分からのサンプルを、SDS PAGEサンプル緩衝液（１×緩衝液＝２％のSDS，30mMのDTT，0.001％のブロモフェノールブルー）により希釈し、そしてNOVEX（San Diego，CA）からの12％トリス／グリシンのプレキャストゲル上での電気泳動により分析する。ゲルを 150Ｖの一定した電圧で約 1.5時間、作動する。タンパク質を、銀染色(Blum et al.，Electrophoresis（1 987）８：93-99)により検出する。ゲルの注意した試験は、約57kDの１つのポリペプチドを含む、数種類のみのポリペプチドを表わし、ここで種々の画分における染色強度がそれらの画分に検出されるワックスシンターゼ活性の量と相互関係している。さらに、放射性ラベルされた〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA が、SD S PAGE分析の前、タンパク質調製物に添加される場合、そのゲルのオートラジオグラフィーは、57kDのラベルされたバンドがそれらの画分におけるワックスシンターゼ活性を示すことを現わす。他のタンパク質、たとえば同時継続出願USSN07 ／767,251 に記載される56及び54kDレダクターゼタンパク質もまた、この調製物に存在する。Ｆ．連続相溶出ワックスシンターゼタンパク質を、SDS-PAGE装置、Model491 Prep Cell（Bio- Red Laboratories，Inc.，Richmond，CA）を用いて、製造業者の教授に従って、アミノ酸配列決定のために単離する。Blue Aカラムの 1.5ＭNaCl溶出からのワックスシンターゼ活性の一部（15ml）を、Centricon 30（Amicon Division，W.R． Grace & Co.，Beuerly，MA）により10倍に濃縮し、そしてPharmacia PD-10 脱塩カラム上でカラム緩衝液により脱塩する。サンプルを２％SDS 及び少量のブロモフェノールブルトラッキング染料により処理し、そしてPrep Cell 装置において 12％アクリルアミド試験ゲル20ml上での４％アクリルアミドスタッキングゲル５ml上に負荷する。サンプルを10Ｗで電気泳動し、そしてタンパク質を、それがゲルから溶出するにつれて、Prep Cell により連続して集める。次に、溶出されたタンパク質を、画分コレクターにより 7 .5〜10mlの画分で集める。興味ある部分における個々の画分１ml（ワックスシンターゼタンパク質の推定される57kDサイズに基づかれる）、Centricon30 により 40μｌに濃縮し、そして２％SDS により処理する。サンプルを12％アクリルアミドミニーゲル(Norex)上に入れ、そして銀により染色する。ワックスシンターゼの回収を最適化するための連続した相溶出方法に対する種々の変更が有用である。そのような変更は、ゲルのゲル体積におけるアクリルアミドの百分率の調節、及びゲルに適用されるワックスシンターゼの量に対する調節を包含する。たとえば、より多くの量のワックスシンターゼタンパク質を単離するためには、Blue A カラム画分は、多量、すなわち20〜55mlのアクリルアミドゲルに、ゲル20ml当たり約１mgのタンパク質の濃度で適用され得る。そのようなゲルから溶出されたタンパク質画分は次に、高められたバンド分離のために10〜15％のグラジエントアクリルアミドゲルに適用され得る。個々の画分のタンパク質含有率を眼により評価し、そしてワックスシンターゼタンパク質を含む画分をプールし、そしてアミノ酸配列決定のために濃縮する。集められるワックスシンターゼ酵素の量を最大にするためには、56kDのレダクターゼタンパク質バンドをまた含む画分が、プールされた調製物に含まれる。レダクターゼタンパク質の配列は知られているので（図１を参照のこと）、プールされた調製物におけるワックスシンターゼタンパク質のさらなる精製は、アミノ酸配列決定技法の適用の前、必要ではない（例５を参照のこと）。Ｇ．膜へのタンパク質のブロット他方、ワックスシンターゼタンパク質を、SDS-PAGEに続いて、PVDF膜、たとえばImmobilon-P(Millipore；Bedford，MA)又はProBlott(Applied Biosystems；Fo ster City，CA)のいづれかにトランスファーすることによりアミノ酸配列決定のためにさらに単離する。ニトロセルロースへのトランスファーもまた有用であるけれども、初期研究は、このタンパク質の疎水性質のために、ニトロセルロース膜への劣ったトランスファーを示す。PVDF膜、たとえばProBlott及びImmobilon- P は、使用されるアミノ酸配列決定技法に依存して、異なった方法に好ましくは使用される。たとえば、ProBlottへのトランスファーが、Ｎ−末端配列決定法のために有用であり、そして臭化シアン消化からのペプチドの生成のためには、Im mobilon-Pが好ましい。１．ニトロセルロースへのブロット：タンパク質がニトロセルロースにエレクトロブロットされる場合、そのブロット時間は、緩衝液、たとえば25mMのトリス、 192mMのグリシン及び５〜20％のメタノールにおいて典型的には１〜５時間である。エレクトロブロットに続いて、膜を、酢酸中、 0.1％（ｗ／ｖ）のPoncea n S により２分間染色し、そして0.1％（ｖ／ｖ）の酢酸の２〜３日の交換により（それぞれ２分間）、脱色する。次に、それらの膜を加熱密閉されたプラスチック製バッグに−20℃で湿ったまま貯蔵する。時間が許すなら、ブロットを凍結しないで、消化のためにすぐに使用し、上記のようにしてアミノ酸配列の決定のためのペプチドを創造することができる。２．PVDFへのブロット：タンパク質がImmobilon P PUDFにエレクトロブロットされる場合、そのブロット時間は、緩衝液、たとえば20％（ｖ／ｖ）メタトル中、25mMのトリス／ 192mMのグリシンにおいては一般的に約１〜２時間である。PVDFへのエレクトロブロットに続いて、膜は50％（ｖ／ｖ）メタノール／10％（ｖ／ｖ）酢酸中、 0.1％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーにより５分間、染色し、そして50％（ｖ／ｖ）メタノール／10％（ｖ／ｖ）酢酸の２〜３回の変換により（それぞれ２分間）脱色する。次に、PVDF膜を30分間、空気乾燥し、そして次に、加熱密封されたプラスチック製バッグにー 20℃で乾いたまま貯蔵する。PVDF膜、たとえばProBlottにブロットされるタンパク質を直接的に用い、損なわれていないタンパク質のＮ−末端配列を決定する。 ProBlottへのタンパク質のエレクトロブロットするための手段は、例５Ａに記載されている。例５−アミノ酸配列の決定この例においては、ワックスシンターゼ活性に関連する植物タンパク質のアミノ酸配列の決定法が記載される。Ａ．タンパク質の臭化シアン分解及びペプチドの分離臭化シアン分解を、Promega，Inc．（Madison，WI）からのProbe-Design Pept ide Separation System Technical Manual に記載される方法を用いて興味あるタンパク質に対して行なう。ワックスシンターゼタンパク質を、精製された液体サンプルとして入手できない場合、上記のようにしてPVDF膜にブロットする。そのPVDFブロットからの精製されたワックスシンターゼタンパク質又はワックスシンターゼバンドを、70％（ｖ／ｖ）蟻酸中、臭化シアンの溶液に配置し、そして室温で一晩インキュベートする。このインキュベーションに続いて、臭化シアン溶液を除去し、プールし、そしてReacti-Vap Evoporator（Pierce，Rockford，I L）を用いて連続窒素流れ下で乾燥せしめる。PVDFからの臭化シアンペプチドのさらなる溶出が、ペプチド溶出溶媒、たとえば70％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、 0.2％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸、 0.1mMのリシン及び 0.1mMのチオグリコール酸を用いて行なわれ、完全な除去が確かめられる。次に、その溶出溶媒を除去し、そして乾燥された臭化シアン溶液を含む塩に添加し、そして上記のようにして乾燥せしめる。その溶出工程を、新鮮な溶出溶媒によりくり返す。HPLCグレードの水50μｌを次に、前記乾燥されたペプチドに添加し、そして水をSpeed-Vac（Sarant，Inc.，Farmingdale，NY）における蒸発により除去する。臭化シアン分解により生成されたペプチドを、Schagger and Von Jagow(Anal ．Biochem．（1987）166：368-379）により記載されるシステムに類似するトリス／トリシンSDS-PAGEシステムを用いて分離する。ゲルを、 125〜150 ボルトの一定電圧で約１時間、又はトラッキング染料がゲルの底の端を流出し始めるまで、作動する。ゲルを、トランスファーする前、トランスファー緩衝液(125mMのトリス、50mMのグリシン、10％（ｖ／ｖ）のメタノール）に、15〜30分間ソークする。ゲルを、50ボルトの一定電圧で２時間、ProBlott配列決定膜(Applied Biosy stems，Foster City，CA)にブロットする。膜をクーマシーブルー（50％（ｖ／ｖ）メタノール／10％（ｖ／ｖ）酢酸において 0.1％）により染色し、そして50 ％（ｖ／ｖ）メタノール／10％（ｖ／ｖ）酢酸により３×２分間、脱色する。膜を、−20℃での貯蔵の前、30〜45分間、空気乾燥する。 ProBlott上にブロットされたペプチドを、Polybrene −被覆のガラス繊維フィルターの付加を伴わないで、タンパク質スクエンサーのスクエンサーカートリッジに直接的に負荷できる。ペプチドを、Applied Biosystem により供給されるBL OT-1のわずかに変性された反応サイクルを用いて配列決定する。また、溶液Ｓ３（塩化ブチル）を、Ｓ１及びＳ２（ｎ−ヘプタン及び酢酸エチル）の50：50混合物により変換する。それらの２つの変性は、ProBlottにブロットされるサンプルが配列決定される場合いつでも用いられる。Ｂ．プロテアーゼ消化及びペプチドの分離液体溶液に提供される精製されたワックスシンターゼタンパク質又はニトロセルロースにブロットされたワックスシンターゼタンパク質を、配列決定のためのペプチドを得るために、プロテアーゼによる消化にゆだねる。この使用される方法は、Aebersold，et al．（PNAS（1987）84：6970）の方法である。ニトロセルロース上に提供されるタンパク質に関しては、ワックスシンターゼタンパク質のバンド及びまた、対照として使用されるニトロセルロース上での等量のブランクを、ニトロセルロース膜から切り、そしてPonceau S を除去するためにHPLCグレードの水により数回洗浄する。この洗浄に続いて、 0.5％酢酸中、 0.5％ポリビニルピロリドン(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)1.0mlを前記膜断片に添加し、そしてこの混合物を37℃で30分間インキュベートする。PVP-40を完全に除去するために、ニトロセルロース断片を、HPLCグレードの水（８×５ml ）により洗浄し、スペクトロメーター上で 214nmで前記洗浄物の吸光度を調べる。また、PVP-40は、バンドがPVP-40処理及び洗浄まで、小さな断片に切断されなければ、より容易に除去される。溶液中の又はニトロセルロース断片上のタンパク質を、適切な消化緩衝液、たとえばトリプシン消化緩衝液、pH8.2 の 100mMの炭酸水素ナトリウム緩衝液又はエンドプロテイナーゼglu C 緩衝液、25mMの炭酸アンモニウム／１mMのEDTA(pH7 .8)に懸濁する。アセトニトリルを消化混合物に添加し、５〜10％（ｖ／ｖ）の濃度にする。プロテアーゼを消化緩衝液に希釈し、そして消化混合物に、典型的には、１：10（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ：タンパク質の比で添加する。消化物を 18〜24時間インキュベートする。たとえば、トリプシン消化物は37℃でインキュベートされ、そしてエンドプロテイナーゼglu C 消化物は室温でインキュベートされる。同様に、他のプロテアーゼ、たとえばlys C 及びasp N が、ワックスシンターゼタンパク質を消化するために使用され得る。個々の消化緩衝条件は異なるけれども、消化、ペプチド分離、精製及び配列決定のための手段は、トリプシン及びglu C による消化のために記載される手段と実質的に同じである。一晩のインキュベーションに続いて、消化反応を、10％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸(TFA)10μｌ又は100％TFA １μｌの添加により停止する。タンパク質がニトロセルロース上に供給される場合、そのニトロセルロース断片を、５〜10％のアセトニトリルを含む消化緩衝液 100μｌにより１〜５回洗浄し、そしてそれらの体積を、Speed-Vac を用いて、100μｌ以下の体積に濃縮する。消化に起因するペプチドを、Applied Biosystems(Fuster City，CA)のモデル 130の高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）に設置されたVydac 逆相Ｃ18カラム(2.1mm×100mm)上で分離する。ペプチドを溶出するために使用される移動相は次のものである：緩衝液Ａ： 0.1mMのリン酸ナトリウム、pH2.2 。２時間にわたっての10〜55％緩衝液Ｂ，５分間にわたっての55〜75％緩衝液Ｂ及び15分間にわたっての75％の同等緩衝液Ｂの50μｌ／分の流速での３段階グラジエントを使用する。ペプチドを 214nmで検出し、手動的に集め、そして次に、−20℃で貯蔵する。ワックスシンターゼタンパク質の疎水性質のために、酵素消化緩衝液への界面活性剤の添加が有用である。たとえば、ホホバのワックスシンターゼを含む、上記の連続相溶出方法からの画分は、100mMのNaHCO₃／ 1.0％のCHAPS においてCen tricon30 により 110μｌの最終体積に濃縮される。 100mMのNaHCO₃／ 1.0％のC HAPS ５μｌ中、トリプシン２μｇがタンパク質溶液に添加され、そしてその混合物は37℃で一晩インキュベートされ、そしてトリフルオロ酢酸(TFA)の添加により消化を停止すく。サンプルを、軽く遠心分離し、そしてペプチドをVydac Ｃ 18カラム上で分離し、そして上記のようにして溶出する。この方法においては、 CHAPS は、40〜50％の緩衝液Ｂで溶出し、そしてこの領域におけるペプチドのピークを不明瞭にする。一次分離が複雑なペプチドパターンを生成する場合、たとえば過剰のタンパク質が使用され、又は汚染物（たとえばホホバレダクターゼタンパク質）が存在する場合、ペプチドのピークは、同じカラムを用いて（但し、異なったグラジエントシステム）、さらにクロマトグラフィー処理され得る、上記ホホバワックスシンターゼ調製物に関しては、親水性ピークが、60分間の０〜40％緩衝液Ｂ，35分間の40〜75％緩衝液Ｂ及び10分間の75〜100％緩衝液Ｂのグラジエントを用いて分離された。疎水性ピークは、40分間の０〜40％緩衝液Ｂ，60分間の40〜80％緩衝液Ｂ及び10分間の80〜 100％緩衝液Ｂを用いて分離された。それらの分離のためには、緩衝液Ａは 0.1％TFA であり、そして緩衝液Ｂはアセトニトリル中、 0 .1％TFA である。Ｃ．タンパク質及びペプチドのＮ−末端配列決定すべての配列決定は、Applied Biosystems 477A Pulsed-Liquid Phase Protei n Sequencer 上でのEdman 分解により行ない；スクエンサーにより生成されるフェニルチオビタントイン(PTH)アミノ酸はオンラインのApplied Biosystems 120A PTA アナライザーにより分析される。データを集め、そしてApple Macintosh のためのApplied Biosystemsモデル610Aデータ分析システムを用いて、及びまた、PE NELSON，Inc．からのACCESS⁴CHROMソフトウェアを用いてのDigital Microv ax(Capeotino，CA)上に貯蔵する。配列データは、PT H Analyzerからの入力を受けるチャートレコーダーから読み取られ、そしてモデル 610Ａソフトウェアから得られた定量のデータを用いて確かめられる。すべての配列データは、データ分析システムの助けを伴って、２つのオペレーターにより独立して読み取られる。 HPLCのピークオフとして得られたペプチドサンプルに関しては、サンプルを、スクエンサーにおける３回のプレーサイクルにゆだねられている、Polybrene 被覆ガラス繊維フィルター(Applied Biosystems，Foster City，CA)上に負荷する。還元され、そしてアルキル化されたペプチドに関しては、個々のスクエンサーのサイクルからの PTH−アミノ酸生成物材料の一部を、液体シンチレーションカウンターで計数する。Immobilon-P にエレクトロブロットされたタンパク質サンプルに関しては、興味あるバンドが切断され、そして次に、上記のようにプレーサイクルされた、Polybrene 被覆のガラス繊維フィルター上に配置し、そして反応カートリッジを製造業者の規格に従って集める。ProBlottにエレクトロブロットされたタンパク質サンプルに関しては、ガラス繊維フィルターは必要とされない。小量のサンプル（５〜30ｐモル）からタンパク質配列を得るためには、Tempst and Riviere(Anal．Biochem．（1989）183：290)により記載されているようにして、 477Ａコンバージョンサイクル及び 120Ａアナライザーを用いる。上記のようにしてトリプシン消化により得られたホホバペプチドのアミノ酸配列が、下記表２に与えれらる。前記アミノ酸配列は、１文字コードを用いて表わされている。“Ｘ”は、アミノ酸が同定されていない位置を表わし、そして小文字により表わされるアミノ酸は、低い程度の信頼を伴って同定された残基を表わす。例６−追加のワックスシンターゼ及びレダクターゼの精製Ａ．他の生物からのワックスシンターゼの部分的に精製された調製物を得るためへのホホバワックスシンターゼ溶解及び精製方法の適応が記載されている。アシネトバクターアシネトバクターカルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)株BD413（ ATCC #33305）の細胞をECLB（Ｅ．コリのルリアブイヨン）上で増殖せしめ、対数増殖期で集め、そしてHepes，pH7.5，0.1ＭのNaCl、１mMのDTT 及びプロテアーゼインヒビターを含む緩衝液により洗浄する。洗浄された細胞を新鮮な緩衝液に再懸濁し、そしてFrench圧力セル（約16,000p.s.i で２回通す）を通すことにより破壊する。破壊されなかった細胞を、5000xgでの10分間の遠心分離により除去し、そして膜を、100,000xg での１時間の遠心分離により集める。その膜ペレットを、貯蔵緩衝液（25mMのHepes，pH7.5，10％（ｗ／ｖ）のグリセロール）中で均質化する。ワックスシンターゼ活性を、基質として〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA 及び18：１アルコールを用いて、例１Ｂにおいてホホバ酵素について記載されるアッセイ条件を用いて、それらの膜において検出する。ワックスシンターゼ活性を、例１Ｂにおいてホホバ酵素について記載されるようにして、 0.5ＭのNaClの存在下で２％CHAPS と共に前記膜のインキュベーションにより溶解する。その活性の可溶化は、200,000ｇで１時間の遠心分離の後、その上清液画分におけるワックスシンターゼ酵素活性の検出により、及びサイズ排除クロマトグラフィー（すなわち、その活性が対称ピークとして、保持された画分におけるカラムから溶出する）により示される。溶解された酵素の活性は、 CHAPS 濃度の約 0.3％（すなわちそのCMC 以下）の濃度への単純な希釈により検出される。リン脂質小胞中への酵素の組込みは、溶解された活性を検出するためには必要とされない。精製に関しては、溶解されたアシネトバクターワックスシンターゼ活性が、ホホバアシル−CoA レダクターゼに関して記載される方法に類似するクロマトグラフィー精製法にゆだねられる。可溶性タンパク質調製物を、低塩条件下で（0.75 ％のCHAPS 、10％のグリセロール、25mMのHepes 、pH7.5 を含むカラム緩衝液において 150mMのNaCl）、Blue Aアガロースカラムに負荷し、そしてカラム緩衝液中、 1.0ＭのNaClを用いて、カラムから溶離する。 Superoseに（Pharmacia；Piscataway，NJ）媒体上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、生来の酵素のサイズの評価を得、そして候補体ポリペプチドの同定を助けることができる。同一の条件下でクロマトグラフィー処理された分子質量標準との比較は、生来のワックスシンターゼ活性のために約46kDの評価を生ぜしめる。 45kD，58kD及び64kDの見掛分子質量を有する３種のポリペプチドバンド（ワックスシンターゼ活性を有する）を同定した。45kDのポリペプチド、すなわちワックスシンターゼのための最強の候補体のＮ−末端配列は、XDIAIIGSGsAGLAQaxilkda g として決定され、ここでアミノ酸のための１文字コードが使用され、“Ｘ”はアミノ酸が同定されていない位置を表わし、そして小文字で表わされるアミノ酸は、より低い信頼性を伴って同定された残基を表わす。さらに、アシネトバクターワックスシンターゼタンパク質のトリプシンペプチドの配列は、QQFTVWXNASEP S として同定される。ユーグレナユーグレナグラシリス株Ｚ(ATCC No.12716)を、適度に振盪しながら、26℃で、暗室において従属栄養的に増殖せしめる(Tani et al．（1987）Agric．Biol． Chem．51：225-230)。細胞を集め、そして25mMの Bis-Tris-Propane，pH7.0，0. 25ＭのNaCl及び１mMのEDTAを含む緩衝液により洗浄する。洗浄された細胞を新鮮な緩衝液に再懸濁し、そしてFrench圧力セル（約16,000p.s.i で２回通す）を通すことにより破壊する。破壊されなかった細胞、細胞残骸及び核を、20,000xgでの20分間の遠心分離により除去し、そしてミクロソーム膜を、200,000xg での１時間の遠心分離により集める。その膜ペレットを、貯蔵緩衝液（25mMの Bis-Tri s-Propane，pH7.0，0.25ＭのNaCl，10％（ｗ／ｖ）のグリセロール及び１mMのED TA）中で均質化する。ワックスシンターゼ活性を、ホホバ酵素に関して記載しているようなアッセイ条件を用いてそれらの膜において検出する。放射性ラベルされた基質は、ホホバの例に関してと同じであるが(すなわち、〔１−¹⁴Ｃ〕パルミトイル−CoA)、しかしながら、18：１よりもむしろ16：０がアルコールアクセプターとして使用され、そしてBis-Tris-Propane緩衝液(pH7.0)が用いられる。ユーグレナワックスシンターゼ活性を、 0.5ＭのNaClの存在下で２％CHAPS と共に前記膜のインキュベーションにより溶解する。タンパク質の可溶化は、 200 ,000xgでの１時間の遠心分離の後、その上清液画分における酵素活性の検出により示される。溶解された酵素の活性は、CHAPS 濃度の約 0.3％（すなわち、その CMC 以下）の濃度への希釈により検出される。リン脂質小胞中への酵素の組込みは、溶解されたホホバワックスシンターゼについての場合のように必要とされない。部分的精製に関しては、溶解されたユーグレナワックスシンターゼ活性が、Bl ue Aアガロース媒体上でのクロマトグラフィー分離にゆだねられる。カラムを、 25mMの Bis-Tris-Propane，pH7.0，20％（ｗ／ｖ）のグリセロール、0.75％のCH APS 及び１mMのEDTAを含むカラム緩衝液における 0.1ＭのNaClにより平衡化する。溶解されたワックスシンターゼ活性を含むサンプルを、 0.1ＭのNaClに希釈し、そして１×７cmのカラム（5.5ml の層体積）上に負荷する。カラムを平衡緩衝液により洗浄し、そしてカラム緩衝液において、線状NaClグラジエント（0.1Ｍ〜 1.0ＭのNaCl）にゆだねる。ワックスシンターゼ活性を、塩グラジエントの最後の半分で広いピークとして溶出する。カラム画分のSDS-PAGE分析は、カラムから溶出する活性のポリペプチド複雑性が負荷された材料に関してひじょうに減じられることを示す。約41kDの見掛分子質量を有するポリペプチドは、カラム画分におけるワックスシンターゼ活性を示すことが観察された。ホホバ及びアシネトバクターに関して記載されるような追加の精製技法が、約41kDのペプチドとワックスシンターゼ活性との関連性を確証するために行なわれる。ユーグレナにおけるワックスシンターゼ活性のさらなる分析のために、サイズ排除クロマトグラフィ処理を次のように行なった。ミクロソーム膜調製物を、暗室で、従属栄養性液体培地（Tani et al.,前記）上で増殖されたユーグレナ細胞から得た。ワックスシンターゼ活性を、緩衝溶液（25mMの Bis-Tri s，pH7.0，１mMのEDTA及び10％（ｗ／ｖ）のグリセロール）中、２％（ｗ／ｖ）のCHAPS 及び 500mMのNaClにより前記膜を氷上で１時間、処理することによって溶解した。CHAPS を0.75％に及びNaClを 200mMに希釈緩衝液の添加により希釈した後、サンプルを約 200,000xgで 1.5時間、遠心分離した。上清液画分を、 200 mMのNaClを含むカラム緩衝液（25mMの Bis-Tris，pH7.0，１mMのEDTAN、10％のグリセロール、0.75％の（HAPS）により前もって平衡化されたBlue A染料カラム上に負荷した。そのカラムを、 200mMのNaClを含むカラム緩衝液により、流出液のＡ280 がプレロード値に戻るまで洗浄した。カラムに結合したワックスシンターゼ活性を、カラム緩衝液におけるNaCl濃度を 1.5Ｍに高めることによって開放した。1.5ＭのNaCl（約20mlの組合された体積）により放されるワックスシンターゼ活性を含むBlue Aカラムからの画分をプールし、そして限外濾過（YM30膜を備えたAmicon圧力セル）を通して約30倍に濃縮した。Blue Aカラムからのその濃縮された材料を、Superoseに媒体(Pharmacia)上でのサイズ排除クロマトグラフィーによる分離のためのサンプルとして使用した。約200μｌのサンプルを、 0.5ＭのNaClを含むカラム緩衝液により予備平衡化された Superose 12カラム（HR10／30）上に負荷し、そして 0.1ml／分の流速で進行せしめた。ワックスシンターゼ活性は、平らなピークとしてカラムから溶出した。ワックスシンターゼ活性の溶出体積と分子質量標準タンパク質の溶出プロフィールとの比較は、酵素の見掛分子質量が 166kDである評価を生んだ。ワックスシンターゼ活性を含む画分を、 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて銀染色により分析した。種々の画分のポリペプチドプロフィールの予備分析は、 100kD又はそれ以上の分子質量を有するいづれかのタンパク質を示し、そしてこの染色強度は、活性プロフィールと適合するように思えた。ワックスシンターゼポリペプチドは、銀染色ゲル上で容易に検出できない、サンプル混合物におけるマイナーな成分として存在する。他方、酵素は、SDS-PAGEの間、関連するサブユニットから構成され得る。Ｂ．ホホバレダクターゼ；たとえば図１に提供される配列によりコードされるものの他に、他の源からのレダクターゼタンパク質はまた、本発明のワックスシンターゼタンパク質と一緒に使用するために所望される。そのようなタンパク質は、アルコール及びアシル基質からワックスエステルを生成することが知られている生物から同定され、そして得られる。たとえば、NADH−依存性脂肪アシル−CoA レダクターゼ活性は、ユーグレナ・グラシリスから単離されたミクロソーム膜から得られる。ミクロソーム膜を単離するために使用され得る方法は、たとえば公開されたPCT 特許出願WO92／14816( 1992年２月21日に出願された出願番号 PCT／US92／03164)に記載されている。そのレダクターゼ活性は、ホホバレダクターゼ及びワックスシンターゼのために使用されるのと同じアプローチを用いてそれらの膜から溶解される。膜を、25mMの Bis-Tris，pH6.9，250mMのNaCl、10％グリセロール及び１mMのEDTAから成る緩衝溶液において、種々の量の界面活性剤、CHAPS と共に氷上で１時間インキュベートする。次に、サンプルを 200,000xgで１時間、遠心分離し、そして上清液及びペレット画分を、基質として放射性ラベルされたパルミトイル−CoA 及びNADHを用いてNADH−依存性レダクターゼ活性についてアッセイする。レダクターゼ活性についての便利なアッセイは、PCT 特許出願WO92／14 816 に記載されている。膜と0.3，0.5又は 0.7％（ｗ／ｖ）のCHAPS とのインキュベーションは、上清液画分におけるレダクターゼ活性の保持をもたらし、これは別記酵素の可溶化の表示である。CHAPS がインキュベーョン及び遠心分離の間、排除される場合、レダクターゼ活性のすべては、ペレット画分に見出される。すべてのサンプルを、インキュベーションの間、存在するCHAPS を希釈するために、アッセイの前、同じ緩衝溶液において10倍に希釈する。CMC(約 0.5％（ｗ／ｖ）以上のレベルでのアッセイにおけるCHAPS の存在は、酵素活性の阻害をもたらす。２％までのCHAPS におけるレダクターゼ活性の安定性は、緩衝溶液におけるグリセロール溶液を20％に高めることによって改良され得る。レダクターゼ活性は、CMC 以下にCHAPS を希釈することによって回収される。例７−核酸配列の単離 cDNAライブラリー又はゲノムDNA からの核酸配列の単離が記載されている。Ａ．ホホバcDNAライブラリーの構成 Jackson and Larkin（Plant Physiol．（1976）57：5-10）により始めに記載され、そしてGoldberg et al．（Developmental Biol．（1981）83：201-217）により変性されたような、ポリリボソーム単離法を用いて、葯形成後80〜90日で集められたホホバ胚から、RNAを単離する。この方法においては、すべての段階は、特にことわらない限り、４℃で実施される。10ｇの組織を、Waringブレンダーにより、液体窒素中で、その組織が細かな粉末になるまで、粉砕する。液体窒素が蒸発した後、 170mlの抽出緩衝液(200mMのトリス、pH9.0，160mMの KCl、25 mMのEDTA、70mMのMgCl₂ 、１％のTriton X-100、 0.5％のナトリウムデオキシコレート、１mMのスペルミジン、10mMのβ−メルカプトエタノール及び 500mMのスクロース)を添加し、そして組織を約２分間、均質化する。そのホモジネートを、無菌のミラクロス(miracloth)を通して濾過し、そして12,000xgで20分間、遠心分離する。上清液を 500mlの無菌フラスコ中にデカントし、そして１／19体積の20％界面活性剤溶液（20％ Brij 35，20％ Tween 40， 20％ Noidet D-40 w/v）を室温で添加する。その溶液を適度な速度で、４℃で30分間、撹拌し、そして次に、その上清液を12,000xgで30分間、遠心分離する。約30mlの上清液を無菌のTi60遠心分離管中にアリコートし、そして40mMのトリス、pH9.0 ，５mMのEGTA、 200mMのKCl 、30mMのMgCl₂ 、 1.8Ｍのスクロース、５mMのβ−メルカプトエタノールを含む溶液７mlを積層する。管の上部に抽出緩衝液を充填し、そしてTi60ローターにより、60,000rpm で４時間、４℃で回転せしめる。遠心分離に続いて、上清液を吸い出し、そして 0.5mlの再懸濁緩衝液（ 40mMのトリス、pH9.0 ，５mMのEGTA、 200mMのKCl 、30mMのMgCl₂、５mMのβ− メルカプトエタノール）を個々の管に添加する。管を氷上に10分間、配置し、その後、ペレットを十分に再懸濁し、そしてプールする。次に、上清液を120xgで 10分間、遠心分離し、不溶性材料を除去する。20mMのトリス、pH7.6，200mMのED TA、２％のＮ−ラウリル−サルコシネート中、自己消化された１mg／mlのプロテイナーゼＫの溶液１体積を前記上清液に添加し、そしてその混合物を室温で30分間インキュベートする。 RNA を、酢酸ナトリウム１／10体積及びエタノール２体積を添加することによって沈殿せしめる。−20℃で数時間後、RNA を12,000xgで30分間、４℃での遠心分離によりペレット化する。ペレットをTE緩衝液（10mMのトリス、１mMのEDTA） 10mlに再懸濁し、そして等体積のトリス(pH7.5)及び飽和されたフェノールにより抽出する。相を、10,000xgで４℃で20分間の遠心分離により分離する。水性相を除き、そして有機相を１体積のTE緩衝液により再抽出する。次に水性相をプールし、そして１体積のクロロホルムにより抽出する。相を再び、遠心分離により分離し、そして水性相を、前記のようにしてエタノール沈殿し、ポリリボソーム RNA を得る。ポリリボソームRNA 調製物における多糖類汚染物を、高塩緩衝液(0.5ＭのNaCl 、20mMのトリス、pH7.5 ，１mMのEDTA、 0.1％のSDS)によりセルロースカラム(S igma-cell 50)上でRNA を処理することにより除去する。汚染物はカラムに結合し、そしてRNA を溶出液に集める。溶出液画分をプールし、そしてRNA をエタノール沈殿せしめる。次に、沈殿された合計のRNA を再懸濁し、そしてオリゴｄ（Ｔ）セルロースカラムに適用し、ポリアデニル化されたRNA を単離する。ポリアデニル化されたRNA を用いて、市販のクローニングベクターBluescribe M13-(Stratagane Cloning Systems；San Diego，（A）に由来し、そして次のようにして製造される、プラスミドクローニングベクターpCGN1703にcDNAライブラリーを構築する。BLuescribe M13−のポリリンカーを、BamHＩによる消化、亜エンドヌクレアーゼによる処理、及びブラント末端連結により変性し、BamHＩ−欠失プラスミド、pCGN1700を創造する。pCGN1700をEcoRＩ及びSstＩ（隣接する制限部位）により消化し、そしてBamHＩ， PstＩ， XbaＩ， ApaＩ及び SmaＩ，AA TTの５′オーバーハング及びTCGAの３′オーバーハングのための制限部位を有する合成リンカーによりアニールする。pCGN1700中への前記リンカーの挿入は、Ec oRＩ部位を排除し、Bluescribeに見出される SstＩ部位（また、時々、“ SacＩ ”としても言及される）を再び創造し、そしてリンカー上に含まれる新しい制限部位を付加する。得られるプラスミドpCGN1702をHindIIIにより消化し、そしてクレノウ酵素によりブラント末端化し；線状DNA をPvuIIにより一部消化し、そして希釈溶液においてT4 DNAワックスシンターゼにより連結する。欠失されるlac プロモーター領域を有する形質転換体を選択し（pCGN1703）、そしてプラスミドクローニングベクターとして使用する。手短に言えば、cDNA合成のためのクローニング法は、次の通りである。プラスミドクローニングベクターを、 SstＩにより消化し、そしてホモポリマーＴ−末端を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、得られた３′−オーバーハング付着端上に生成する。末端化されたプラスミドを、消化されていないか又は末端化されていないプラスミドから、オリゴ（dA）−セルロースクロマトグラフィーにより分離する。得られるベクターは、ベクタープラスミドのいづれかの末端に共有結合されるcDNAの第１鎖の合成のためのプライマーとして作用する。cDNA−mRNA−ベクター複合体を、デオキシグアノシントリホスフェートの存在下でターミナルトランスフェラーゼにより処理し、cDNA鎖の末端でＧ−末端を生成する。BamHＩ部位に隣接する特別のcDNA−mRNA複合体をBamHＩ消化により除去し、１−端でBamHＩ付着端及び他端でＧ−末端を有するcDNA−mR NA−ベクター複合体を生成する。この複合体を、５′BamHＩ付着端、制限酵素 N otＩ、EcoRＩ及び SstＩのための認識配列及び３′Ｃ−末端を有する、アニールされた合成環化リンカーを用いて環状化する。連結及び修復に続いて、環状複合体をＥ．コリ株DH５α(BRL，Gaithersburg，MD)中に形質転換し、cDNAライブラリーを生成する。ホホバ胚のcDNAバンクは、約 500塩基対の平均cDNA挿入体サイズを有する約 1.5×10⁶ 個のクローンを含む。さらに、ホホバのポリアデニル化されたRNA を用いて、クローニングベクター λ ZAPII／EcoRＩ(Stratagene，San Diego，CA)にcDNAライブラリーを構築する。ライブラリーを、製造業者により供給されるような手段、DNA 及び細菌株を用いて構築する。クローンを、製造業者の推薦に従って、Gigapack Gold パッケージング抽出物（Stratagene）を用いてパッケージする。この態様で構築されたcDNAライブラリーは、約 400塩基対の平均 cDNA挿入体サイズを有する約１×10⁶ 個のクローンを含む。Ｂ．ポリメラーゼ鎖反応アミノ酸配列情報を用いて、核酸配列を、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)により得る。選択されたペプチドフラグメントのアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを合成する。タンパク質におけるフラグメントの順位が知られている場合、たとえばペプチドの１つがＮ−末端からであり、又は選択されたペプチドが１つの長いペプチドフラグメントを含む場合、わずか１つのオリゴヌクレオチドプライマーが個々の選択されたペプチドのために必要とされる。Ｎ−末端ペプチドのためのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち前者プライマー（forward primer）は、ペプチドのためのコード配列を含む。Ｃ−末端ペプチドのためのオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち逆方向プライマーは、選択されたペプチドのためのコード配列に対して相補的である。他方、選択されたペプチドの順位が知られていない場合、２種のオリゴヌクレオチドプライマーが個々のペプチドのために必要とされ、ここで１つは選択されたアミノ酸配列をコードし、そして他の１つは選択されたアミノ酸配列に対して相補的である。いづれかの配列決定されたペプチドがオリゴヌクレオチドの構築のために選択され得るが、但し、より所望するペプチドは、コドンの最少数によりコードされるアミノ酸、たとえばメチオニン、トリプトファン、システイン及び４個よりも少ないコドンによりコードされる他のアミノ酸を含むものである。従って、オリゴヌクレオチドが選択されたペプチドのためにすべての可能な配列の混合物である場合、劣化オリゴヌクレオチドの数は低い。 PCR は、当業者に良く知られている技法を用いてそれらのオリゴヌクレオチドプライマーにより行なわれる。ホホバ核酸配列、たとえば逆転写されたcDNA、上記のcDNAライブラリーから単離されたDNA 又はゲノムDNA は、それらの反応において鋳型として使用される。この態様においては、DNA のセグメントが生成される。同様に、アシネトバクターDNA のセグメントは、例６Ａに記載されるＮ−末端及びトリプシン消化ペプチドにオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR 反応から得られる。PCR 生成物は、所望するワックスシンターゼフラグメント付与するそれらの反応を選択するためにゲル電気泳動技法により分析される。Ｃ．配列のためのスクリーニングライブラリー PCR により得られたDNA フラグメントを標識化し、そして上記cDNAライブラリーからクローンをスクリーンするためのプローブとして使用する。DNA ライブラリースクリーニング技法は当業者に知られており、そしてたとえば、Maniatis e t al．(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition（1989）Col d Spring Harbor Laboratory Press)により記載されている。この態様においては、核酸配列について分析され得、そして種々の宿主、たとえば原生及び真核宿主における脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の発現のために使用され得る核酸配列が得られる。約1500個のヌクレオチドのホホバcDNAクローンがこの態様で得られる。表２に提供されるペプチドフラグメントとの比較は、翻訳された配列においてそれらの個々のペプチドの存在を示す（但し、SQ1129を除く）。ホホバ胚RNA のノーザン分析は、mRNAが長さ約２kbであることを示唆する。追加の核酸配列が、追加のPC R 技法、たとえば５′RACE（Frohman et al.，Proc．Nat．Acad．Sci.（1988）8 5 ：8998-9002）を用いて得られる。他方、追加の配列が、cDNAライブラリーの再スクリーニングにより又はゲノムDNA から得られる。ホホバ遺伝子の予備DNA 配列が図２に示される。追加クローンのさらなるDNA 配列分析は、このホホバタンパク質をコードする少なくとも２種のcDNAが存在することを示唆する。pCGN1703 における完全なコード領域を含むプラスミドを、ATG 開始コドンの約８個のヌクレオチド５′側に SalＩ部位を含むように構築し、そしてpCGN7614と称する。pC GN7614の完全なDNA 配列は図３に示されている。図２及び３における配列に示されるように、２つの種類のcDNA間の主な差異は、図２のアミノ酸23及び24のための６個のヌクレオチドコード配列の存在（図２）又は不在（図３）である。Ｄ．Ｅ．コリにおいてのワックスシンターゼ活性の発現 pCGN7614からの遺伝子を、次のようにしてＥ．コリ発現ベクターのpDR540(Pha rmacia)のTac プロモーターの制御下に置く。pCGN7614のDNA を SalＩ部位で消化し、そしてその末端をDNA ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント及びヌクレオチドTTP 及びdCTPを用いて一部、フィルインする。pDR540ベクターを、BamHＩにより消化し、そしてdGTP及びdATPにより前記末端を一部フィルインすることによって調製する。pCGN7614からの 1.8kbフラグメント及び消化されたpDR540ベクターを、低い溶融温度のアガロースを用いてゲル精製し、そしてT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結する。Ｅ．コリプロモーターに対してセンス配向にコード配列を含むコロニーをpCGN7620と命名し、そしてアンチセンス配向に遺伝子を含むコロニーを、pCGN7621と命名する。ワックスシンターゼ活性についてアッセイするために、pCGN7620及びpCGN7621 の培養物50mlを液体培地において対数相増殖期に増殖し、そしてIPTGを添加し、１mMの濃度にすることにより２時間、誘発する。細胞を遠心分離により収穫し、そしてホホバ抽出物について記載されているようにして、ワックスシンターゼ活性についてのアッセイにゆだねる。TLC 分析は、pCGN7620からの細胞抽出物がワックスエステルの合成を指図し、そして pCGN7621からの対照の抽出物がワックスエステルの合成を指図しないことを示す。それらの収穫された細胞におけるワックスシンターゼアッセイは、第２アッセイにより実証されたが、しかしながら、レダクターゼ構造体により形質転換されたＥ．コリ細胞におけるワックスシンターゼ活性を生成する試みは、好結果をもたらすものではなかった。例８−植物発現のための構造体植物細胞において脂肪アシル−CoA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質の発現及び植物細胞におけるレダクターゼ配列の発現を提供する構造体を次のようにして調製する。Ａ．発現カセット種子組織において選択的に発現される遺伝子からの５′及び３′調節領域を含む発現カセットを、たとえばWO92／03564 に記載されているように、ナピン、 B ce４及びACP 遺伝子から調製する。たとえば、ナピン発現カセットを次のようにして調製する。ワックスシンターゼ又はレダクターゼ遺伝子構造体の発現のために使用され得るナピン発現カセット、すなわちpCGN1808は、Kridl et al．(Seed Science Research（1991）１：2 09-219)(引用により本明細書に組込まれる)により記載されている。他方、pCGN1808を、二元ベクター、たとえばpCGN1557（McBride and Summerfe lt、前記）への、耐抗生物質マーカーではなく発現配列のみの移動を可能にするフランキング制限部位を含むように変性する。 KpnＩ， NotＩ、及びHindIII制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドをアニールし、そして１つのHindIII部位のみが回収されるように、pCGN1808のユニークHindIII部位で連結する。得られたプラスミドpCGN3 200は、配列分析により確かめられるように、ナピン３′−調節配列の３′末端でユニークなHindIII， NotＩ及びKpn 制限部位を含む。ナピン発現カセットの大部分を、HindIII及び SacＩによる消化及びHIndIII及び SacＩ消化されたpIC19R（Marsh，et al．（1984）Gene 32：481-485）への連結によりpCGN3200からサブクローン化、pCGN3212を製造する。ナピンプロモーター領域の末端５′−配列を、鋳型としてのpCGN3200及び SacＩ部位を両端に有する２つのプライマーの使用、及びナピン５′−プロモーター、及びpCGN1808構造体からのpCGN3200のpUC 主鎖の使用によるPCR により再構成する。前進プライマーは、 ClaＩ，HindIII， NotＩ及び KpnＩ制限部位、及びナピン５′−配列のヌクレオチド 408−423(EcoRＶ部位から)を含み、そして逆方向プライマーは５ ′−プロモーターにおけるユニーク SacＩ部位を含むナピン配列 718−739 に対する補体を含む。PCR を、製造業者の規格に従って、Perkin Elmer／Cetus のサーモサイクラーを用いて行なった。PCR フラグメントを、PUC（Vieiraand Messi ng（1982）Gene 19：259-268）中にブラント末端化されたフラグメントとしてサブクローン化し、そしてHincIIにより消化し、pCGN3217を得る。ナピン挿入体を通してのpCGN3217の配列は、不適切なヌクレオチドがPCR により導入されなかったことを確証する。pCGN3217におけるナピン５′−配列を、 ClaＩ及び SacＩによる消化及び ClaＩ及び SacＩにより消化されたpCGN3212への連結によりナピン発現カセットの残りに連結する。その得られた発現カセットpCGN3221をHindIII により消化し、そしてナピン発現カセットをゲル精製し、そしてHindIIIにより消化されたpIC20H（Marsh、前記）に連結する。最終発現カセットは、アンピシリン耐性バックグラウンドに、pCGN1808に見出されるような、実質的に同一の 1.725ナピン５′及び 1.265ナピン３′調節配列を含むpCGN3223である。その調節領域を、HindIII， NotＩ及び KpnＩ制限部位によりフランキングし、そしてユニーク SalＩ， BglI I， PstＩ及び XhoＩクローニング部位は５′及び３′非コード領域間に位置している。同様に、オレオシン遺伝子からの５′及び３′領域の制御下での転写調節のための配列のクローニングのためのカセットを調製する。ブラシカナパスのオレオシン遺伝子の配列は、Lee and Huang（Plant Phys．（1991）96：1395-1397）により報告されている。公開された配列のプライマーをPCR反応に使用し、ブラシカナパスcv.Westarからのオレオシン遺伝子の５′及び３′調節領域を得る。２種のPCR 反応を行なう。１つはオレオシン遺伝子のためのATG 開始コドンの上流に約 950個のヌクレオチドを増幅し、そして他の１つはオレオシン遺伝子のためのTAA 停止コドンの下流に（前記コドンも含む）約 600bpのヌクレオチドを増幅する。PCR 生成物を、製造業者の方法に従ってプラスミドベクターpAMP1（BRL）中にクローン化し、オレオシン５′フランキング領域を含むプラスミドpCGN7629 及び３′フランキング領域を含むpCGN7630を得る。PCR プライマーは、発現カセットと共に前記５′及び３′フランキング領域をクローニングするための便利な制限部位を含んだ。pCGN7629からの５′フランキング領域を含む PstＩフラグメントを、 PstＩにより消化されたpCGN7630中にクローン化し、プラスミドpCGN76 34を得る。完全なオレオシン発現カセットを含む、pCGN7634からのBssHII(NewEn gland BioLabs)フラグメントを、BssHIIにより消化された pBCSK＋(Stratagene) 中にクローン化し、プラスミドpCGN7636にオレオシンカセットを付与した。pCGN 7636におけるオレオシンカセットの配列は図４に与えられている。そのオレオシンカセットは、BssHII， KpnＩ及び XbaＩ制限部位によりフランキングされ、そして５′及び３′オレオシン領域間に興味あるワックスシンターゼ、レダクターゼ又は他のDNA 配列を挿入するための SalＩ，BamHＩ及び PstＩ部位を含む。前記遺伝子配列をそのようなカセット中に挿入し、植物形質転換法のための発現構造体を付与する。たとえば、そのような構造体を、下記のようにして、アグロバクテリウム介在の形質転換のために二元ベクター中に挿入する。Ｂ．植物形質転換のための構造体プラスミドpCGN7614を AflIIIにより消化し、そして AflIII付着端に BclＩ部位を付加するためにアダプターにより連結し、続いて SalＩ及び BclＩにより消化する。脂肪アシル−CoA 代謝遺伝子に関与する植物細胞質タンパク質を含むフラグメントをゲル精製し、そして SalＩ／BamHＩにより消化されたpCGN3223、すなわちナピンカセット中にクローン化する。ナピンカセットにセンス配向で脂肪アシル−CoA 代謝遺伝子に関与する植物細胞質タンパク質を含むその得られたプラスミドを、pCGN7624と命名する。pCGN7624から単離されたDNA をAsp718（Kpn Ｉアイソジゾマー）により消化し、そして脂肪アシル−CoA 代謝融合遺伝子に関与するナピン／植物細胞質タンパク質を、Asp718により消化された二元ベクター pCGN1578（McBride and Summerfelt、前記）中にクローン化する。pCGN7626と命名されたその得られた二元ベクターをアグロバクテリウム株EHA101中に形質転換し、そしてアラビドプシス及びナタネ種子外植体の形質転換のために使用する。追加の二元ベクターを、pCGN1578，pCGN1559及びMcBride et al.（前記）により記載される他のベクターから、次のような制限消化部位：Asp718／ AscＩ／ P acＩ／ XbaＩ／BamHＩ／ SwaＩ／Sse838 7（PstＩ）／HindIIIを含むリンカー領域によるpCGN1578及びpCGN1559リンカー領域の置換により調製する。これは、pCGN1578PASS又はpCGN1559PASS、及び同様にして命名される他の変性されたベクターをもたらす。 AscＩ， PacＩ， SwaＩ及び Sse8387は８−塩基の制限認識部位を有する。それらの酵素はNew England BioLabs から入手でき(AscＩ及び PacＩ)、 SwaＩはBoehringer Manheimから、そしてSse8387 はTakara(Japan)から入手できる。Ｃ．植物形質転換のためのレダクターゼ構造体ナピン遺伝子からの５′及び３′調節領域を用いての植物細胞におけるレダクターゼの発現のための構造体が調製される。 pCGN7571と命名されたレダクターゼcDNA（上記のpCGN1703ベクターにおける）を SphＩにより消化し（塩基1594−1599での３′末翻訳配列の部位）、そして S alＩリンカーをこの部位で挿入する。得られたプラスミドをBamHＩ及び SalＩにより消化し、そしてレダクターゼcDNAを含むフラグメントをゲル精製し、そして BglII／ XhoＩにより消化されたpCGN3223中にクローン化し、pCGN7585をもたらす。ナピン５′／レダクターゼ／ナピン３′構造体を含むpCGN7585のHindIIIフラグメントを、HindIIIにより消化されたpCGN1578（McBride and Sammerfelt、前記）中にクローン化し、植物形質転換のための二元ベクターpCGN7586を得る。ナピンプロモーターの発現下でホホバレダクターゼ遺伝子をまた含む植物形質転換構造体pCGN7589を次のようにして調製する。pCGN7571をインビトロ変異誘発し、レダクターゼコード配列の最初のATG で NdeＩ部位及び NdeＩ部位のすぐ上流に BglII部位を導入する。BamHＩリンカーを前記レダクターゼコード領域の下流の SphＩ部位中に導入する。1.5kbの BglII−BamHＩフラグメントをゲル精製し、そして BglII−BamHＩにより消化されたpCGN3686（下記参照のこと）中にクローン化し、pCGN7582を得る。 pCGN3686は、 Bluescript KS＋(Stratagene Cloning System；San Diego，CA )に由来するクローニングベクターであるが、しかしクロラムフェニコール耐性遺伝子及び変性されたリンカー領域を有する。クロラムフェルコール耐性遺伝子、すなわちpCGN565 の源は、PUC12-cm(K．Buckleg Ph．D．Thesis，Regulation and expression of the phi x174 lysis gene，Urinersity of California，San Diego，1985)に基づくクローニングベクターであるが、しかしPUC18 リンカー（Yanisch-Perron，et al.，Gene（1985）53：103-119）を含む。pCGN565 を Hh aＩにより消化し、そしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を切り出し、亜ヌクレアーゼの使用によりブラント末端化し、そしてBluescript KS-(Stratagene：L a Jolla，CA)のEcoRＶ部位中に挿入し、pCGN2008を創造する。pCGN2008のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、EcoRＩ／HindIII消化により除く。末端をブラント化するためにクレノウ酵素による処理の後、そのフラグメントを、 DraＩにより消化された Bluescript KS＋に連結する。クロラムフェニコール耐性により置換されたアンピシリン耐性を含む DraＩフラグメントを有するクローンを選択し、そしてpCGN2015と命名する。pCGN2015のリンカー領域を変性し、pCGN3686を付与し、これは次の制限消化部位をlacZリンカー領域において５′から３′方向に含む： PstＩ， BglII， XhoＩ，HincII， SalＩ，HindIII，EcoRＶ，EcoRＩ， PstＩ， SmaＩ，BamHＩ， SpeＩ， XbaＩ、及び SacＩ。 XhoＩリンカーを、pCGN7582の XbaＩ部位で挿入する。レダクターゼ遺伝子を含む BglII− XhoＩフラグメントを単離し、そして BglII− XhoＩにより消化されたpCGN3223中にクローン化する。ホホバ遺伝子からの５′未翻訳リーダー配列を欠いている、その得られるプラスミドをpCGN7802と命名する。pCGN7802からのナピン／レダクターゼフラグメントをHi ndIIIにより切り出し、そしてHindIIIにより消化されたpCGN1578中にクローン化し、pCGN7589を付与する。追加のナピン／レダクターゼ構造体を次のようにして調製する。レダクターゼ cDNA，pCGN7571（図１）を変異誘発し、ATG 開始コドン（この部位は５′からAT G 方向に８個の塩基対を含む）に及びTAA 翻訳停止コドンのすぐ３′側に SalＩ部位を挿入し、pCGN7631をもたらす。pCGN7631を SalＩにより消化し、そしてレダクターゼコード配列を含む約 1.5kbのフラグメントを、 SalＩ／ XhoＩにより消化されたナピンカセットpCGN3223中にクローン化する。センス配向にレダクターゼ配列を含むその得られたプラスミドをpCGN7640と命名する。pCGN7640をHind IIIにより消化し、そしてオレオシン／レダクターゼ構造体を含むフラグメントを、HindIIIにより消化された二元ベクターpCGN1559PASS中にクローン化し、二元構造体pCGN7642を付与する。オレオシン調節領域の制御下でのレダクターゼの発現のための構造体を次のようにして調製する。レダクターゼコード配列を、 SalＩによるpCGN7631の消化及び SalＩにより消化されたpCGN7636、すなわちオレオシンカセット中への連結により得る。センス配向に前記レダクターゼ配列を含むその得られたプラスミドを pCGN7641と命名する。pCGN7641を XbaＩにより消化し、そしてオレオシン／レダクターゼ構造体を含むフラグメントを、 XbaＩにより消化された二元ベクターpC GN1559PASS中にクローン化し、二元構造体pCGN7643を得る。二元ベクター構造体を、Halsters et al．（Mol．Gen．Genet．（1978）163： 181-187）の方法により、たとえばEHA101株（Hood et al.，J．Bacteriol（1986）168：1291-1301）のアグロバクテリウム細胞中に形質転換し、そして下記のようにして植物形質転換法に使用する。例９−植物形質転換法表現型の変化をもたらすために配列の転写、又は転写及び翻訳を得るために植物宿主のゲノム中に対象のDNA 配列を挿入する種々の方法が開発されて来た。ブラシカ形質転換高エルカ酸、たとえばクチクラReston、又はカノラ型の品種のブラシカナパスの種子を、95％エタノールに２分間、飽和し、数滴のTween20 を含む次亜塩素酸ナトリウムの 1.0％溶液において45分間、表面殺菌し、そして無菌の蒸留水により３度すすぐ。次に、種子を、ピリオドキシン（50μｇ／ｌ、ニコチン酸（50μ ｇ／ｌ）、グリシン(200μｇ／ｌ)及び 0.6％Phytagar(Gibco)(pH5.8)により補充された、Murashigo 最少有機培地（Gibco；Grand Island，NY）の１／10濃縮物を含むMagenta 箱に入れる。種子をPercivalチャンバー中で22℃で発芽せしめる。ここでは、約65μアインシュタイン／ｍ²・秒（μEm^-2・Ｓ^-1）の強さの螢光及び赤色光による16時間の光期間を伴う。胚軸を、５〜７日の実生から切除し、長さ約４mmの断片に切り、そして育成プレート(Horsch et al.，Sciomco（1985）227：1229-1231)上に置く。育成プレートは、約30mlのMS塩基材(Carolina Biological，Burlington，NC)， 100mg/ｌのイソシトール、 1.3mg／ｌのチアミン−HCl 、 200mgのKH₂PO₄及び３％スクロース、２，４−Ｄ(1.0mg／ｌ)，0.6％ v/v Phytagar を含むペトリ皿(100×25ml) 上に 1.0mlのタバコ懸濁培養物をプレートすることにより、使用の１日前に調製され、そしてそれはオートクレーブ処理する前、 5.8のpHに調節される（MA 0/1/0培地）。無菌のフィルター紙ディスク(Whatmon 3mm)を、使用の前、育成層の上部に配置する。タバコ懸濁培養物を、２，４−Ｄ (0.2mg／ｌ)、Kinetin(0.1mg／ｌ)を含む育成プレートについて記載されているように、100mlの新鮮なMS培地中に10mlの培養物を週１回トランスファーすることにより継代培養する。育成細胞が使用されない実験においては、胚軸外植体を切除し、そしてMS 0/1/0培地の上部のフィルター紙ディスコ上に置く。すべての胚軸外植体は、30μEM^-2秒^-165μEM^-2秒^-1の強さの連続した光下で、24時間22℃ で育成プレート上でプレインキュベートされる。所望する遺伝子構造体を有する二元ベクターを含むＡ．ツメファシエンス株EH A101の単一のコロニーを、５mlのMG/Lブイヨンにトランスファーし、そして30℃ で一晩増殖せしめる。胚軸外植体を、１×10⁸ 個の細菌／mlに希釈された細菌を含むMG/Lブイヨン７〜12mlに含浸し、そして10〜25分後、育成プレート上に置く。１ｌのMG/Lブイヨンは、５ｇのマンニトール、１ｇのＬ−グルタミン酸又は1. 15ｇのグルタミン酸ナトリウム、0.25ｇのKH₂PO₄、0.10ｇのNaCl、0.10ｇのMgSO₄ -7H₂O、１mgのビオチン、５ｇのトリプトン及び 2.5ｇの酵素抽出物を含み、そしてそのブイヨンはpH7.0 に調節されている。アグロバクテリウムとの48時間の同時インキュベーションの後、胚軸外植体を、フィルター殺菌されたカルベニシリン（500mg／ｌ、オートクレーブ処理の後に添加される）及びカナマイシンスルフェート（Boehringes Mannheim；Indianapolis，IN）を25mg/ｌの濃度で含むＢ５ 0/1/0カルス誘発培地に移す。 65μEM^-2秒^-1の連続した光での培養の３〜７日後、カルス組織が切断面上に見え、そして胚軸外植体を苗条誘発培地B5BZ（３mg／ｌのベンジルアミノプリン、１mg／ｌのゼアチン、１％スクロース、 0.6％Phytagapに補充された、Ｂ５塩及びビタミン、及びpH5.8 に調節されている）に移す。この培地はまた、カルベニシリン(500mg／ｌ)及びカナマイシンフルフェート（25mg／ｌ）を含む。胚軸外植体を、新鮮な苗条誘発培地上で２週ごとに継代培養する。苗条は、１〜３カ月後、胚軸カルスから再生する。少なくとも１cmの高さの若い苗条をカルスから切除し、そしてＢ５塩及びビタミン、１％スクロース、カルベニシリン(300mg／ｌ)、カナマイシンスルフェート（50mg／ｌ）及び 0.6％ w/ v Phytagar を含む培地上に置く。２〜４週後、緑のまま存続する苗条をその基部で切り、そして根誘発培地（Ｂ５塩及びビタミン、１％スクロース、２mg／ｌのインドール酪酸、50mg／ｌのカナマイシンスルフェート及び 0.6％のPhytagar ）を含むMagenta 箱に移す。緑の根をもつ苗条を、チオエステラーゼ活性について試験する。アラビドプシス形質転換アラビドプシスタリアナのトランスゲニック植物を、Valverkans et al.，(Pr oc．Nat．Acad．Sci.（1988）85: 5536-5540)により記載されるようなアグロバクテリウム介在形質転換により得る。構造体を、Holsters et al．（Mol．Gen． Genet．（1978）163：181-187）の方法により、アグロバクテリウム細胞、たとえばEHA101株（Hood et al.，J．Bacteriol（1986）168：1291-1301）中で形質転換する。ラッカセイの形質転換対象のDNA 配列を、粒子衝撃により植物ゲノム中に、プロモーター領域、対象の遺伝子及び終結領域を少なくとも含んで成る発現カセットして導入する。手短に言えば、 0.5mM〜３mMのサイズのタングステン又は全粒子を、発現カセットのDNA により被覆する。このDNA は、水性混合物又は乾燥 DNA／粒子沈殿物の形で存在する。衝撃のための標的として使用される組織は、子葉外植体、苗条分裂組織、未熟の小葉又は葯の形で存在できる。DNA 被覆粒子による組織の衝撃は、Biolistics （TM）粒子ガン(Dupont；Wilmington，DE)を用いて行なわれ得る。粒子は、銃口から１〜14cmの種々の距離で銃に配置される。衝撃を与えられるべき組織は、停止プレートの下に配置され；試験は20cmまでの距離で組織に対して行なわれる。放出の瞬間、組織はナイロンネット又はナトロンネットと10mM〜300mM の範囲のメッシュとの組合せにより保護される。衝撃に続いて、植物を、Atreya，et al.，（Plant Science Letters（1984）3 4：379-383）の方法に従って再生する。手短に言えば、胚軸組織又は子葉セグメントをMS培地(Murashige and Skoug，Physio-Plant．（1962）15：473)(子葉セグメントのためにはMS＋2.0 mg／ｌの６−ベンジルアデニン(BA))に配置し、そして暗室において１週間25±２℃でインキュベートし、そして続いて、連続した自己螢光(6.8ｗ／cm² )下に移す。培養の10日目で、苗を無菌の土壌を含むポットに移し、陰に３〜５日間維持し、そして最後に、温室に移す。推定上のトランスゲニック苗条は根をつける。植物ゲノム中への外因性DNA の組込みは、当業者に知られている種々の方法により確かめられ得る。例10−ワックス生成についての形質転換された植物の分析形質転換された植物からの種子又は他の植物材料を、例１に記載されるワックスシンターゼアッセイ法を用いてワックス活性について分析する。レダクターゼ及びワックスシンターゼ構造体の両者を有する植物をまた、ワックス生成を測定するためにアッセイする。そのような植物は、上記のようなアグロバクテリウム形質転換法により調製され得る。両方の所望する遺伝子構造体を有する植物を、レダクターゼ及びワックスシンターゼ構造体による同時形質転換により、又はワックスシンターゼ及びレダクターゼ構造体を単一の植物形質転換二元ベクター上に組合すことによって調製できる。さらに、ワックスシンターゼ発現植物又はレダクターゼ発現植物の、他の所望する遺伝子配列をコードする構造体による再形質転換はまた、そのようなレダクターゼ及びワックスシンターゼ発現植物を供給するために使用され得る。他方、本明細書に記載される方法により生成されるレダクターゼ発現植物は、同様にして生成されたワックスシンターゼ発現植物と交配され得る。この態様においては、植物の育成の既知方法を用いて、レダクターゼ及びワックスシンターゼ発現トランスゲニック植物を提供できる。そのような植物は、Taniet al.(前記)により記載されるように、ワックスエステルからのTAG の分離により、ワックスエステルの存在についてアッセイされ得る。GC分析法を用いて、Pina et al.(Lipids(1987)22(5)：358-361)に記載されるようにして、その得られたワックスをさらに分析することができる。上記結果は、脂肪アルコール及び脂肪アシル基質からのワックスエステルの形成において活性的である、一部精製されたワックスシンターゼタンパク質を得る能力を示している。ワックスシンターゼタンパク質及びそのアミノ酸配列を得るための方法が提供されている。さらに、アミノ酸配列から得られるワックスシンターゼ核酸配列もまた提供されている。それらの核酸配列は、種々の用途に使用される、ワックスシンターゼタンパク質の宿主細胞における発現及び／又はその配列の転写を提供するために操作され得る。そのような用途は、ワックスシンターゼが、宿主細胞に生来である脂肪アルコール基質の源を有する宿主細胞に用いられる場合、又はワックスシンターゼが、脂肪アシル基質からのアルコールの形成において活性的である脂肪アシルレダクターゼタンパク質をコードする組換え構造体の使用により供給される場合、ワックスエステル化合物の生成を包含する。例11−VLCFA 生成に関しての形質転換された植物の分析形質転換された植物からの種子を、脂肪酸含有率についてガスクロマトグラフィー（GC）により分析する。次の表は、百分率に基づいての脂肪酸の分解を提供し、これは二元ベクターpCGN7626（例８）により形質転換された植物における、変性されたVLCFA 生成を示している。ホホバCEにより形質転換されたLEAR植物からのＴ３種子油の分析は、種子油の 7.8％までが24：１であることを示す。対照に良く見られるが、HEARであるRest on植物は典型的には、わづか約１％又はそれ以下の24：１を有する。それらのデータは、pCGN7626によりコードきれる脂肪アシル−coA 代謝に関与する植物細胞質タンパク質がいくつかの植物種からの種子油の脂肪酸組成を著しく変えることができることを明白に示している。VLCFA を蓄積しない植物においては、pCGN7626は、有意な量のVLCFA の蓄積を引き起こす。VLCFA を蓄積する植物においては、pCGN7626は、より長いVLCFA への脂肪酸組成の変更を引き起こす。本明細書に開示されるホホバタンパク質配列についてのタンパク質データベースを調べる場合、大きな領域の相同性が、ホホバコードタンパク質とスチルベン、レゼルバトロール及びカルコンシンターゼとの間に見出された。スチルベン、レゼルバトロール及びカルコンシンターゼはお互いひじょうに類似しており、それらは、１つの基質としてのマロニルCoA と共に、２種のCoA チオエステル間の複数の縮合反応を触媒する。その縮合反応は、細胞質膜結合のエロンガーゼ酵素についての提案された縮合反応に類似しており、ここで両者の場合、酵素は次の２種の生成物を形成するために２つのCoA チオエステル分子の縮合を触媒する： β−ケトアシル−CoA チオエステル及び二酸化炭素。ホホバ遺伝子とカルコンシンターゼとの間の相同領域は、カルコンシンターゼ活性部位を含む(Lanz et al. “Site-directed mutagenesis of reservatrol and chalcone synthase，too ke y enzymes in different plant specific pathways”(1991)J.Biol．Chem.,266 ：9971-6)。この活性部位は、酵素−脂肪酸中間体を形成することに関与していると推定される。相同性はまた、ホホバタンパク質とKSA IIIとの間にも検出された。KSA IIIは、CoA チオエステルのACP チオエステルへの縮合を触媒し、β−ケトアシル−AC P チオエステルをもたらす可溶性酵素である。二酸化炭素分子はこの反応において放される。結論的ではないが、それらの注目される相同性は、ホホバ酵素がβ−ケトアシル−CoA シンターゼ活性を有するかも知れないことを示唆する。例12−β−ケト−アシル−CoA シンターゼアッセイの分析Ａ．β−ケト−アシル−CoA シンターゼの活性を、次の方法に従って植物において直接的にアッセイする。成長している種子を、授粉後に収穫し、そして−70℃で凍結する。ブラシカナパスに関しては、種子は授粉後29日で収穫される。適当の数の種子を融解し、そして50mMのHepes-NaOH，pH7.5 、２mMのEDTA、 250mMのNacl、５mMのｂ−メルカプトエタノールの溶液１mlにおいて均質化する（ブラシカナパスに関しては、アッセイ当たり20個の種子）。そのホモジネートを、15,000×ｇで10分間、遠心分離し、そして油層を捨てる。上清液画分を集め、そして 200,000×ｇで１時間、再び遠心分離する。次にペレットを１mlの均質化用緩衝液に再懸濁し、そして200,000×ｇで１時間、２度目の遠心分離を行なう。ペレットを 100mMのHepes-NaOH，pH7.5 、４mM のEDTA、10％（ｗ／ｖ）のグリセロール、２mMのｂ−メルカプトエタノールの溶液50μｌに再懸濁する。サンプル10μｌを、反応混合物カクテルに添加し、そして30℃で15分間インキュベートする。反応混合物中の成分の最終濃度は次の通りである：100mM のHepes-NaOH， pH7.5，１mMのｂ−メルカプトエタノール、 100 mMのオレイル−CoA 、44μM の〔２−¹⁴Ｃ〕マロニルCoA 、４mMのEDTA、及び５％（ｗ／ｖ）のグリセロール。反応を停止し、そしてβ−ケトアシル生成物を、0.1ＭのK₂HPO₄， 0.4ＭのKCl ，30％（ｖ／ｖ）のテトラヒドロフラン及び５mg／mlのNaBH₄ を含んで成る還元剤溶液 400μｌの添加によりジオールに還元した（使用のすぐ前で溶液に添加される）。その混合物を、37℃で30分間インキュベートする。中性脂質をサンプルから、トルエン 400μｌの添加により抽出する。有機相 100μｌに存在する放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定する。残るトルエン抽出物を集め、そしてシリカＧ TLCプレート上にスポットする。TLC プレートを、ジエチルエーテル：濃NH₄OH（100：１，ｖ／ｖ）において展開する。還元反応のジオール生成物の移動を、冷ジオール標準の使用により位置決定する。Ｂ．この方法を用いて、植物を、検出可能なβ−ケトアシルシンターゼ活性のレベル又はその欠失を決定するためにアッセイすることができる。たとえば、HE AR植物は高レベルのβ−ケトアシルシンターゼ活性を有するが、しかしカノラ植物は適切な酵素活性を示さない。このアッセイによれば、植物種又は品種は、β −ケトアシルシンターゼが活性についてスクリーンされ、変更されたVLCFA 生成を達成するために本発明の配列による形質転換のための候補体を決定され、又は関連する酵素のためのプローブによるスクリーニングにより候補体を決定される。このようなホホバcDNAコード配列は、高い及び低いエルカ酸のナタネ種子クチクラを分化する変異を補うと思われる。ホホバ遺伝子により形質転換されたトランスゲニック植物の表現型は、単一の酵素が20，22及び24個の炭素の脂肪酸の形成を触媒できることを示す。一次LEAR形質転換体からの種子油はまた、20：１脂肪酸よりも高レベルで22：１の脂肪酸を含む。これはまた、7626-212／86-2植物から分析された個々のＴ２種子の大多数において真実であった。最高のVLCFA 含有率を示す５個のＴ２種子はまた、20：１よりも高レベルの22：１を含む。これは、β−ケトアシル−CoA シンターゼがVLCFA の形成において速度限定段階であり、そして酵素活性が胚の生育を高めるにつれて、脂肪酸プロフィールはより長い鎖長の生成に変えられ得ることを示唆する。トランスゲニックHE AR植物の油における24：１脂肪酸の量の上昇及びVLCFA の量の付随する上昇を伴わないでの、トランスゲニックアラビドプシス植物における22：１の量の上昇は、HEAR及びアラビドプシスにおいてすでに富んでいる酵素活性の上昇よりもむしろ、ホホバ、アラビドプシス及びブラシカ酵素の基質特異性の差異の結果である。例13−他のβ−ケト−アシル−CoA シンターゼ活性β−ケトアシルCoA シンターゼと合致したサイズを有するスペロース上でクロマトグラフィー処理された前記活性シターゼは、２つの 138KDa サブユニットから構成されている。これは、その酵素がマルチマーとして活性的であるが、しかしその酵素はホモダイマー、ヘテロダイマー又は高い順序においてはマルチマーであり得ることを示唆する。その１つのサブユニットの質量は、SDS ゲル電気泳動によれば57KDa であり、そしてcDNA配列の翻訳からの理論的な質量の計算によれば59KDa であることが推定される。植物及び細菌FAS においての類似する可溶性酵素、すなわちβ−ケトアシル−ACP シンターゼは、約50KDa のサブユニットを有するダイマーとして活性的である。カルコン及びスチルベンシンターゼはまた、ダイマーとして活性的である。ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼサブユニットは、別個の59KDa タンパク質である。従って、ホホバにおける種子脂質FAE は、タイプＩFAS に見出される大きな多機能タンパク質により触媒されるよりもむしろ、タイプIIFAS に類似する別個の酵素活性を有する個々のポリペプチドから構成されている。ホホバ酵素はFAE におけるブラシカ変異誘発を補なうので、ブラシカFAE はたぶん、タイプＩシステムである。 dBEST データバンクを、BLAST ソフトウェアー（Altschulet al.,1990）を用いてNCBIでホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼDNA 配列について研究した。ホホバCE cDNA に相同の２種のアラビドプシスクローン（Genbank 受託番号Ｚ26 005，Locus 39823；及びgenbank 受託番号TO4090，Locus 315250）が検出された。 39823クローンは、ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼクローンと高い程度の相同性を示した。PCR プライマーは、アラビドプシスゲノムDNA からのこの配列をPCR 増幅し、そしてクローン化するように企画されている。mRNAは、このクローンと交差ハイブリダイズする、生育アラビドプシス又は生育ブラシカ種子のいづれにも検出されなかった。プローブはまた、相同配列がHEAR系とLEAR系との間での差異を伴って分離するかいづれかを決定するように企画されたRFLPプロットにハイブリダイズされた。低いハイブリダイゼーション緊縮下で、多過ぎる交差ハイブリダイズバンドが、HEAR系とLEAR系との間での多型現象を検出するために存在する。高いハイブリダイゼーション緊縮下で、前記バンドはHEAR表現型を伴って分離しなかった。関連酵素をコードするクローンを単離するために、ホホバβ−ケトアシル−Co A シンターゼ及びアラビドプシスlocus398293 のタンパク質配列を比較し、保存されたドメインを見出した。いくつかのペプチド配列が、ホホバβ−ケトアシル −CoA シンターゼ及びアラビドプシス相同398293の翻訳において同一であった。２種のペプチド：１）NITTLG（ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼのアミノ酸 389〜 394）及び２）SNCKFG（ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼのアミノ酸 525〜 532）はまた、398293の翻訳に存在した。変性オリゴヌクレオチドプライマーAAYATHACNACNYTNGG 及びSWRTTRCAYTTRAANCC は、それぞれのペプチドのセンス及びアンチセンス鎖をコードする。上記プライマーは、ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼcDNA及びアラビドプシス398293配列の両者からの約 430bpのDNA フラグメントをPCR 増幅せしめる。それらのプライマーは、それらの保存されたペプチドでほぼ同一のアミノ酸を共有する、他の組織及び他の種からの関連するタンパク質をコードするDNA 配列をPCR 増幅するために使用され得る。その変性オリゴヌクレオチドを用いる場合、若いアラビドプシスシリクエ(Arabidopsis silique)、HEAR及びLEAR RNAをRTP CR にゆだねた。予期されるサイズの目立ったバンドを、すべての３種のRNA から増幅した。１つのクローンはレストンPCR 反応から得られ、そして２つのクローンは 212／86反応から得られ、ここでそれらは、CE15及びCE20と命名された、２種のcDNAクローンを形成すると思われる。 212／86 CE15 クローンは、完全な CEタンパク質をコードした（図５）。それらのクローンから翻訳されたタンパク質配列は、お互いと98％以上の同一性を有する。そのクローンは、ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼと約50％の相同性を有する。そのタンパク質のＣ−末端部分は保存され、そしてcDNAは約70％の同一性を共有する。ブラシカの薬組織及び成長している種子組織から単離されたRNA のノーガン分析は、CE20が生成している種子において高く発現され、そして薬においてはひじょうに低いレベルで発現されることを示す。CE15は、薬においては高いレベルで、及び成長している種子においてはより低いレベルで発現される。従って、CE20クラスは、生長しているブラシカ種子においては脂肪酸延長に関与する活性縮合酵素であると思われる。元の 212／86 CE20 クローンは短く、そして開始メチオニンを含まなかった。CE15及びCE20プローブによりスクリーンされたHEARブラシカカンペストリスライブラリーは、良好でない品質のものであり、そして短いクローンのみを生成した。従って、５′RACEを用いて、 212／86及びRestonからのCE20c DN A の５′末端をクローン化した。５′Raceクローンの配列は、Reston(HEAR)及び 212／86(LEAR)の両者におけるCE20のコード領域が 212／86 CE20 クローンの５ ′末端を越えて３個のアミノ酸を延長したことを示した。次に、CE20プライマーを、完全な長さのCE20配列を得るために選択した。従って、CAUCAUCAUCAUGTCGACAAAATGACGTCCATTAACGTAAAG及びCUACUACUACUAGTCGACGGAT CCTATTTGGAAGCTTTGACATTGTTTAGを利用した。それらは、それぞれCE20のタンパク質コード領域の５′及び３′末端に対して相同である。それらのプライマーは、 212／86（図６）及びReston（図７）からのCE20 cDNA（RTPCRによる）の完全なコード領域をPCR 増幅するために使用された。配列を、Cloae Ampベクター(BRL) におけるPCR 生成物のクローニングを促進するプライマーの末端のためにさらに企画し、そして制限酵素部位を、トランスゲニックブラシカ植物におけるCE20のセンス及びアンチセンス発現のためにナピン発現カセット中へのCE20クローンの導入を可能にするために導入した。ブラシカクローンCE15及びCE20から推定されるタンパク質を、保存された検出できるタンパク質配列のいくつかの領域と共に、ホホバβ−ケトアシル−CoA シンターゼのタンパク質配列、及びアラビドプシス遺伝子座398293及び315250を一列に並べることができる。従って、センス及びアンチセンスプライマーの異なった対を用いて、PCR 増幅することができ、そして植物及び動物種の両者の、多くの異なった組織からの関連するβ−ケトアシル−CoA シンターゼをコードするDN A を単離することができる。表８からのそれらのプライマーは、ルナリアアヌア、(Lunariaannua)、トロパオエルマジス(Tropaoelu majus)（ナスツリチウム）の生長している種子、及びアラビドプシスタリアナの若いシリクエ種から単離されたRNA からのフラグメントをPCR(RTPCR)増幅するためにいろいろ使用された。最とも都合良く利用されたプライマーは、5381-CAUCAUCAUCAUGAATTCAAGCTTAARYTNBKNTAYCAYTA（ペプチド KL(L/G)YHYに対するセンスプライマー）及びCUACUACUACUAGGATCCGTCGACCCATNCCN CCNARRTT（ペプチドNLGGMGC に対するアンチセンスプライマー）であった。それらのプライマーは、ARAB CE15，ARABCE17及びARAB CE17(それぞれ図８，９及び1 0)と命名された、アラビドプシスからのエロンガーゼ縮合酵素の一部をコードする３種のクローンを生成するために使用された。ルナリアから、単一のクローン、すなわちLUN CE８（図11）が固定された。ルナリアはその種子油において高レベルの24：１脂肪酸を生成するので（30％まで）、ルナリアの生長している種子から単離されたRNA からのcDNAライブラリーが構成され、そしてLUN CE８がこのルナリアcDNAライブラリーをスリーンするために使用された。３種のクラスのcDNAクローン、ルナリア１、ルナリア５及びルナリア27（それぞれ図12，13及び14）を単離した。全クローンのうち、単離されたクローンの81 ％（26／32）がルナリア５に類似するクラスのものであった。残りのうち、クローンの16％（５／32）がルナリア１と命名された、PCR プローブ、LUN CE８に類似した。１つのクローン、ルナリア27はユニークであった。表９に見出されるように、ルナリア５は、ブラシカCE20クローンと約85％の相同性を共有する。ブラシカ種子発現cDNAとの高い程度の相同性、及び成長する種子組織における高い量のルナリア５cDNAは、ルナリア５が種子油脂肪酸延長において活性的であるcDNAであることを示唆する。最終的に、ナスツリチウム（Nasturtium）の部分的PCR クローンを、LUN CE８を単離するために使用されたのと同じプライマーを用いて得た。そのナスツリチウムクローン(NAST CE26)の配列は、図15に与えられている。異なった基質特異性を有する他の組織又は他の種からこの態様で得られたβ− ケトアシル−CoA シンターゼが、異なった鎖長の脂肪酸を有する変性された種子油を創造するために使用され得る。これは、植物分類群、たとえばルナリアから単離された酵素を包含し、これはその種子組織において有意な量の24：１脂肪酸を合成する。これはまた、24個以上の炭素の鎖長の脂肪酸を合成できるいづれかの植物種のクチクラワックス合成に関与する酵素を包含する。たとえば、ルナリア種子は、それらの種子油に30％まで24：１を含む。生長しているルナリア種子からの粗抽出物に対する縮合酵素アッセイは、その酵素が18：１から20：１，20：１から22：１及び22：１から24：１への延長で活性的であることを示す。それらのデータは、ルナリアの酵素がトランスゲニック植物において24：１を生成するのに有用であろうことを示唆する。実際、トランスゲニックブラシカにおいてのホホバ酵素の発現は、24：１から成る種子油の 7.8 ％までを有する植物をもたらした。ホホバ種子は単に、24：１として種子に油 4 .1％を生成する。上記のことは、トランスゲニック油の24：１含有率を高めるためのアプローチの最初の記載を表わしている。上記例はまた、表７のプライマーが種々の植物種から縮合酵素クローンを都合良く単離するために有用され得ることも示している。それらのオリゴヌクレオチドは、これまでクローン化されたことがない、その対応する脂肪酸シンターゼ動物遺伝子を単離するために特に有用である。β−ケトアシル−CoA シンターゼ発現はヒトのいくつかの脱髄神経系疾患、たとえば腺白質萎縮症(adenoleukodgstr ophy)，腺骨髄神経障害（adenomgelaneuropathy）及び多発性svlrtodid(Sargent and Coupland，1994)において抑制されるので、ヒト遺伝子は、ヒト遺伝子療法において有用であるかも知れない。同様に、22：１又は24：１に富む植物油は、それらの疾病のための有用な栄養治療剤であり得る。本明細書に引用されたすべての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が引用により組込まれることを特別に且つ個々に示されているかのように、引用により本明細書に組込まれる。前述の発明は本発明を理解するために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは、当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ラッセナー，マイケルダブリュ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，ファルコンアベニュ 721

Claims

【特許請求の範囲】１．植物種子細胞において24：１のひじょうに長い鎖の脂肪酸分子を生成するための方法であって、前記植物は、さもなければ、前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子５重量％以上を有する種子を生成することができず、下記段階：植物を、前記植物が発現生成物の存在下で、前記植物種子において長鎖の脂肪アシル−CoA 分子を生成する条件下で成長せしめる段階、ここで前記発現生成物は、前記長鎖の脂肪アシル−CoA 分子と前記発現生成物との間で接触をもたらすようにひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列の発現を指図するために調節要素に操作可能的に結合されたひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列であり、そして前記植物種子において前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子を、５重量％以上のレベルで生成する段階、を含んで成る方法。２．前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子が前記植物種子において７重量％以上のレベルで生成される請求の範囲第１項記載の方法。３．前記調節要素が植物種子の胚細胞において前記DNA 配列の好ましい発現を指図する請求の範囲第１項記載の方法。４．前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列がブラシカからの縮合酵素コード配列である請求の範囲第１項記載の方法。５．前記ブラシカのコード配列が縮合酵素のCE15クラスに対してである請求の範囲第４項記載の方法。６．前記ブラシカのコード配列が縮合酵素のCE20クラスに対してである請求の範囲第４項記載の方法。７．前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列がアラバドプシスからの縮合酵素コード配列である請求の範囲第１項記載の方法。８．前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列がナスツリチウムからの縮合酵素コード配列である請求の範囲第１項記載の方法。９．前記ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子−変更DNA 配列がルナリアからの縮合酵素コード配列である請求の範囲第１項記載の方法。 10．前記ルナリアのコード配列がルナリア５である請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記調節要素が植物種子の胚細胞において前記DNA 配列の選択的発現を指図する請求の範囲第１項記載の方法。 12．請求の範囲第１項記載の方法に従って生成されたひじょうに長い鎖の脂肪酸分子を含む植物種子。 13．請求の範囲第１項記載の方法に従って生成された植物種子。 14．VLCFA の与えられた割合から植物中のVLCFA の割合を低めるための方法であって；植物を、前記植物がβ−ケトアシル−CoA −減少DNA 配列の発現を指図するために調節要素に操作可能的に結合されたβ−ケトアシル−CoA −減少DNA 配列の存在下でVLCFA 及びβ−ケトアシル−CoA シンターゼを生成する条件下で成長せしめ、ここで前記DNA 配列が前記植物のβ−ケトアシル−CoA DNA 配列をコードし、そして前記DNA 配列の発現が前記植物細胞によるβ−ケトアシル−CoA シンターゼの生成の低下及び前記植物細胞により生成されるVLCFA の割合の低下をもたらすことを特徴とする方法。 15．前記調節要素が前記DNA 配列のアンチセンス転写を指図する請求の範囲第 14項記載の方法。 16．前記調節要素が植物種子の胚細胞において前記DNA 配列の選択的な発現を指図し、そして前記VLCFA 及びβ−ケトアシル−CoAが植物種子において生成される請求の範囲第14項記載の方法。 17．請求の範囲第９項記載の方法に従って生成された植物種子細胞。 18．縮合酵素をコードするDNA 配列及び別記コード配列とは天然において関連しない異種DNA 配列を含んで成る構造体であって、前記縮合酵素コード配列が、から成る群から選択された変性オリゴヌクレオチドプライマーにより、ひじょうに長い鎖の脂肪酸分子を生成できる生物から調製されたDNA ライブラリーをスクリーニングすることによって得られることを特徴とする構造体。を用いてのPCR 増幅の段階を含んで成る方法に従って単離され得る縮合酵素をコードする、単離された核酸配列。 20．請求の範囲第19項記載の核酸配列及び前記コード配列とは天然において関連しない異種DNA 配列を含んで成る構造体。 21．前記異種DNA 配列が植物種子の胚細胞において前記DNA 配列の選択的な発現を指図する調節要素を含んで成る請求の範囲第20項記載の構造体。 22．前記縮合酵素コード配列がブラシカからである請求の範囲第20項記載の構造体。 23．前記ブラシカのコード配列が縮合酵素のCE15クラスに対してである請求の範囲第22項記載の構造体。 24．前記ブラシカのコード配列が縮合酵素のCE20クラスに対してである請求の範囲第22項記載の構造体。 25．前記縮合酵素コード配列がアラバドプシスからである請求の範囲第20項記載の構造体。 26．前記縮合酵素コード配列がナスツリチウムからである請求の範囲第20項記載の構造体。 27．前記縮合酵素コード配列がルナリアからである請求の範囲第20項記載の構造体。 28．前記ルナリアのコード配列がルナリア５である請求の範囲第27記載の構造体。