JPH06500234A - 植物の脂肪酸シンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４７、前記植物シンターゼタンパク質は短いアシル−ＡＣＰ担体タンパク質の脂 肪酸に対する優先的活性に要求される、請求の範囲第４５項に記載の細胞。 ４８、植物シンターゼタンパク質の生産を可能とする条件下に、請求項３２〜３ ４のいずれかに記載の構成体からなる宿主細胞またはその子孫を成長させること からなる、宿主細胞またはその子孫の中で植物シンターゼタンパク質を生産する 方法。 ４９、前記宿主細胞は植物細胞であり、そして前記構成体は前記植物細胞のゲノ ムの中に組み込まれる、請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５０、前記植物細胞はｉｎ　ｖｉｖｏである、請求の範囲第４９項に記載の方法 。 ５１、請求の範囲第４８項に従い生産された植物シンターゼタンパク質からなる 宿主細胞。 ５２、前記宿主細胞は植物の宿主細胞であり、そして前記構成体は前記植物細胞 のゲノムの中に組み込まれている、請求の範囲第５１項に記載の細胞。 ５３、植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列を転写を可能とする条件 下に、そのゲノムの中にＤＮＡ構成体を組み込んで有する植物細胞を成長させる ことからなり、前記構成体は、転写の５゜−３°の方向において、前記宿主細胞 の中で機能的な転写調節領域および植物シンターゼタンパク質をエンコードする 配列からなる、植物細胞の中で脂肪酸の組成を修飾する方法。 ５４、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列はアンチセンス配列 である、請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５５、前記植物シンターゼタンパク質はシンターゼ因子Ｂである、請求の範囲第 ５４項に記載の方法。 ５６、前記構成体は、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列に対 して直ぐ５°の宿主細胞の中で機能的な翻訳調節領域および前記配列に対して３ ′の転写／翻訳停止調節領域をさらに含み、そして前記植物シンターゼタンパク 質をエンコードする配列はセンス配列である、請求の範囲第５３項に記載の方法 。 ５７、前記植物細胞は菜種の胚の植物細胞である、請求の範囲第５３項に記載の 方法。 ５８、請求の範囲第５３〜５７項のいずれかに記載の方法に従い生産された修飾 された遊離脂肪酸の組成を有する植物細胞。 ５９、胚細胞のゲノムの中に組み換えＤＮＡ配列を組み込んで有する植物を、調 節要素の活性を促進する条件下に、成長させて種子を生産し、ここで前記組み換 えＤＮＡ配列は脂質の蓄積の間に種子の中で機能的な調節要素の転写のコントロ ール下に植物シンターゼタンパク譬をエンコードする配列の少なくとも一部分を 含んでなり、そして前記種子を収穫する、ことからなる方法に従い生産された、 天然の脂肪酸の組成を有する種子に比較して修飾された脂肪酸の組成を有する植 物の種子。 ６０、前記植物はブラシカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）である、 請求の範囲第５９項に記載の種子。 ６１、前記種子は菜種である、請求の範囲第５９項に記載の種子。 ６２、植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列を転写を可能とする条件 下に、そのゲノムの中にＤＮＡ構成体を組み込んで有する植物細胞を成長させる ことからなり、前記構成体は、転写の５゜−３′の方向において、前記宿主細胞 の中で機能的な転写調節領域および植物シンターゼタンパク質をエンコードする 配列からなる、菜種の作物植物から生産されたトリグリセリドの脂肪酸の組成を 修飾する方法。 ６３、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列はアンチセンス配列 である、請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４、前記構成体は、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列に対 して直ぐ５゛の宿主細胞の中で機能的な翻訳調節領域および前記配列に対して３ ′の転写／翻訳停止調節領域をさらに含み、そして前記植物シンターゼタンパク 質をエンコードする配列はセンス配列である、請求の範囲第６２項に記載の方法 。 ６５、前記植物細胞は菜種の胚の植物細胞である、請求の範囲第６２項に記載の 方法。 ６６、請求の範囲第６２〜６５項のいずれかに記載の方法に従い生産されたトリ グリセリドの修飾された脂肪酸の組成を有する植物細胞。 ６７、前記作物の植物は、菜種、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クツエア（ｃｕｐ ｈｅａ）　、ダイズ、ナンキンマメ、ココナツ、ギネアアブラナヤシおよびトウ モロコシから成る群より選択される、請求の範囲第６２〜６３項のいずれかに記 載の方法。 ６８、請求の範囲第５８〜６０項のいずれかに記載の方法に従い生産された種子 から分離された植物の種子の油。 ６９、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の油からなる請求の範囲第６８項に記載の 油。 明細書 のね　シン　−ゼ この出願は、１９９０年８月１５日提出の米国特許出願第０７１５６８，４９３ 号の一部継続出願、および１９９１年６月２６日提出の米国特許出願第０７／７ ２１，７６１号の一部継続出願である。 又皿Ω豆！ 本発明は、植物の中の脂肪酸の合成に関係するシンターゼ酵素、タンパク質調製 物、アミノ酸およびそれに関係する核酸配列、およびこのような組成物のために 使用する方法に関する。 １人 植物の油は種々の工業および食物の用途において使用される。生合成および天然 の植物源から油組成物を得るための新規な植物油および／または改良された手段 が要求されている。意図する油の使用に依存して、種々の異なる脂肪酸組成物が 望まれる。 例えば、このような場合において、油／種子粉１末の比が高い脂肪種子を得るこ とはコストを低くして所望の油を得るために有用であろう。これは高い価値の油 止産物に典型的であろう、ある場合において、油／種子粉末の比が低い脂肪種子 を得ることはカロリー含量を低くするために有用であろう。他の用途において、 不飽和脂肪酸の百分率が高い食用植物油は心臓血管の健康の理由で望まれる。そ して、二者択一的に、高い飽和の熱帯地方の油、例えば、ヤシおよびココナツの ための適度な代替物は、また、種々の工業的および食物の応用において使用され るであろう。 このような油および／または修飾された脂肪酸の組成物を得るための１つの手段 は、植物の遺伝子操作であると考えられる。しかしながら、植物を遺伝子操作す るために、遺伝学的物質を植物の中に安定な遺伝可能な方法で転移する手段を所 定位置にもたなくてはならない、さらに、所望の表現型の結果を生成することが できる核酸配列、このような配列の正しい適用を指令することができる調節領域 などをもたなくてはならない、その上、所望の表現型を生成するためは、反応成 分の根が変調または変化する程度に植物の脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の通路が 修飾されることが要求されるであろう。 高等植物は普通の代謝通路を経て脂肪酸を合成するように思われる０種子を発育 させるとき、トリグリセリドに結合する脂肪酸はそれ以上の発芽のためにエネル ギー源として貯蔵され、ＦＡＳ通路はプロプラスチドの中に位置する。第１段階 は、酵素のアセチル−ＣｏＡ　：ＡＣＰ　トランスアシラーゼ（＾ＴＡ）により 触媒される、アセチル−ＣｏＡおよびＡＣＰからのアシル−ＡＣＰ　（アセチル 担体タンパク質）の形成である。アシル−ＡＣＰを１６−および１８−炭素の脂 肪酸への伸長は、次の順序の反応のサイクルの作用を包含する：マロニルーＡＣ Ｐからの２炭素単位と縮合してβ−ケトアシル−ＡＣＰを形成する反応（β−ケ トアシル−ＡＣＰ試験）、ケト−官能基のアルコールへの還元反応（β−ケトア シル−ＡＣＰリダクターゼ）、エノイル−ＡＣＰへの脱水反応（β−ヒドロキシ アシル−＾ＣＰデヒドラーゼ）、および最終のエノイル−ＡＣＰを還元して伸長 した飽和アシル−ＡＣＰを形成する反応（エノイル−ＡＣＰ　リダクターゼ）、 β−ケトアシル−ＡＣＰ　シンターゼＩはバルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：　Ｏ ）までの伸長を触媒するが、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩはステアロ イル−ＡＣＰ（Ｃ１８：　Ｏ）への最終の伸長を触媒する。貯蔵トリグリセリド の中に見いだされる普通の植物の不飽和脂肪酸、例えば、オレイン酸、リノール 酸およびα−リノール酸は、可溶性ブラスチドΔ−９デサチュラーゼ（また、「 ステアオリルーＡＣＰデサチュラーゼとしばしば呼ばれる）により触媒される反 応における、オレイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：　１　）を形成するステアロイル−Ａ ＣＰの脱飽和から生ずる。還元されたフェレドキシが電子のコドナーとして働く 脱飽和のために分子状酸素か要求される。引き続いて、追加の脱飽和が膜結合し たΔ−１２デサチュラーゼおよびΔ−１５デサチュラーゼの作用により実施され る。こうして、これらの「デサチュラーゼ」は、それぞれ、１飽和または多飽和 の脂肪酸をつくる。 第３のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、非常に短いアシル−ＡＣＰに対し て活性の特異性を有するＳ、　ｏ　１ｅｒａｃｅａの葉において報告された。こ のアセトアシル−ＡＣＰシンターゼまは［β−ケトアシル−八ＣＰ　Ｊシンター ゼ活性Ｉはアシル−ＡＣＰよりアセチル−ＣｏＡに対する好みを有する、Ｊａｗ ｏｒｓｋｔ、　Ｊ、Ｇ、ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ、　（１９８９）　９０　： 　４１−４４゜この酵素はＡＴＡＯ代わりにＦＡＳを開始する別の通路であるこ とができることが仮定された。 ＦＡＳにおいて表現型の結果を生成できる核酸配列が得られると、脂肪酸をグリ セロールの主鎖の中に組み込んで油を生成することは種々の障害にさらされ、こ れらの障害は次のものを包含するが、これらに限定されない：問題の代謝因子の 同定、有用な反応速度論的性質をもつタンパクを源の選抜または特性決定、問題 のタンパク質をそのアミノ酸の配列決定を可能とするレベルに精製すること、ア ミノ酸配列のデータを利用して、所望のＤＮＡ配列を回復するためにプローブと して使用することができる核酸配列を得ること、および生ずる植物の構成、形質 転換および分析。 こうして、酵素標的の同定および脂肪酸の組成を修飾することができるこのよう な酵素標的の核酸配列のための有用な植物源が必要とされる。理想的には、酵素 標的は単独でまたは他の核酸配列と組み合わせてｌまたは２以上の応用に対して 、油の生産の増加／減少、脂肪酸プールにおける飽和／不飽和脂肪酸の比、およ び／または脂肪酸プールへの修飾の結果として新規な油組成物に関して補正され るであろう。いったん１または２以上の酵素標的が同定されそして定量されると 、タンパク質の量および精製のプロトコルが配列決定のために要求される。究極 的には、表現型の修飾を提供するために必要な要素を有する有用な核酸の構成体 およびこのようなう構成体を含有する植物が必要とされる。 皿Ｉ■呈皐ｌ畿皿 第１図は、５μＭのセルレニンによるＡＣＰ　−１１和クロマトグラフイーから のシンターゼ活性の第１ピークにおけるシンターゼ活性の不活性化の時間経過を 示す、実験の開始において、Ｃ１６：　０−ＡＣＰを使用する活性はＣＩＯ：　 ０−ＡＣＰを使用するときのほぼ２倍であり、試料の中のＩＩ型シンターゼの濃 縮を示す。このグラフが示すように、ＩＩ型シンターゼを表すＣ１６：　０−Ａ ＣＰを使用する活性はセルレニンに対して事実上不活性であるが、ＣＩＯ：　０ −ＡＣＰを使用する活性は１０分後日０重量％より大きい活性が阻害される。　 ＣＩＯ：　０−ＡＣＰを使用する残留活性は、多分、ＣＩＯ：　０−ＡＣＰの基 質をもつ試料におけるＴＩ型シンターゼの低い活性である（Ｃ１６：　０−ＡＣ Ｐを使用する活性のほぼ１０％）；これが意味するように、■型シンターゼはこ のセルレニン濃度で１５分までに完全に不活性化される。（太い点＆Ｉ）。 第２図は、ｃＤＮＡクローンの中に発見された順序でで列挙した、トウゴマ（Ｒ ，ｃｏａ＋ｍｕｎｉｓ）の５０ｋＤのβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼのタン パク質からのペプチドの部分的アシル−ＡＣＰシンターゼを提供する、各断片は 、５０ｋＤのタンパク質をトリプシンまたはエンドプロテイナーゼｇｌｕｃで消 化して生ずる、）ＩＰＬＣ精製して得られたアシル−ＡＣＰシンターゼを表す。 Ｆｌは未消化の５０ｋＤのタンパク質から得られるアミノ末端のタンパク質の配 列を示す。下のケースのＸは配列のサイクルを表し、ここでアミノ酸残基を同定 することができなかった。２つのアミノ酸をもつ位置は、示した位置に配列の明 瞭な差をもつ２つのほぼ同一のペプチドを表し、５０ｋＤの小さい不均一性を示 唆する。 第３図は、トウゴ？　（Ｒ，ｃｏａ＋ｍｕｎｉｓ）の４６ｋＤのβ−ケトアシル −ＡＣＰシンターゼのタンパク質からのペプチドの部分的アミノ酸配列を提供す る。　ＫＲで標識した各断片は、４６ｋＤのタンパク質をトリプシンで消化して 生ずるＨＰＬＣした分画から得られたアミノ酸配列を表す。未消化の４６ｋＤの タンパク質から得られたアミノ末端のタンパク質の配列を、また、示す（ＮＹ） 、ｒｘＪは第２図において定義した通りである。 第４図は、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンタ ーゼの５０ｋＤのペプチドＫＲ４およびＫＲ１６からのＰＣＲにおいて有用なオ リゴヌクレオチドのプライマーを提供する。プライマーは１つの向きでのみ示さ れている。シンターゼタンパク質の中のペプチドＫＲ４およびＫＲ１６の順序は 知られていないので、両者の向きにおけるオリゴヌクレオチドを使用した。 第５図は、５０ｋＤのトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のシンターゼの因子Ｂ の遺伝子のｃＤＮＡおよび翻訳されたアミノ酸配列を提供する。第５Ａ図は、予 備的ｃＤＮＡ配列および、ｃＤＮ＾クローン、ｐＣＧＮ２７６５　（２−８）か ら誘導され、５０ｋＤのシンターゼタンパク質をエンコードする、対応する翻訳 ペプチドを提供する。　ｃＤＮＡは、仮定したトランシフトペプチドの配列（ア ミノ酸１−４２）およびこの成熟タンパク質をエンコードする配列の両者を包含 する。第５Ｂ図は、追加の３′未翻訳配列をもつ２−８配列を提供する。 第６図は、５０ｋＤのタンパク質の配列と他の既知のシンターゼの配列とのアミ ノ酸配列の比較を提供する。第６Ａ図は、Ｅ、ｃｏｌｉからのＦａｂＢシンター ゼをもつ５０ｋＤのクローンの翻訳されたアミノ酸配列の配列相同性を示す、上 の線は５０ｋＤのシンターゼタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの遊離翻訳さ れたアミノ酸配列であり、そして下の線はＦａｂＢによりエンコードされるＥ、 ｃｏｌｉのシンターゼの翻訳されたアミノ酸配列である。第６Ｂ図は、ストレプ トミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ）からポリケチドの合成のｒＯＲＦ− ＩＪをもつ５０ｋＤのクローンの翻訳されたアミノ酸配列のタンパク質配列の相 同性を示す、上の線は０ＲＦ−１の翻訳されたアミノ酸配列であり、そして下の 線は５０ｋＤのシンターゼタンパク質をエンコードするｃＤＮＡからの翻訳され たアミノ酸配列である。 第７図は、はぼ２ｋｂのＢｃｅ４のゲノムの配列を提供する。 第８図は、ｃＯＮＡＤＮＡ配列Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓのデサチュラーゼから 誘導された対応する翻訳ペプチド配列を提供する。ｃＤＮＡは、ブラスチドのト ランシットペプチドの配列（アミノ酸１−３３）およびこの成熟タンパク質をエ ンコードする配列の両者を包含する。 第９図は、ブラシカ・カンペストオイス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒ ｉｓ）のデサチュラーゼの予備的部分的ｃＤＮ＾配列を提供する。第４Ａ図は、 クローンの５末端からの１．６ｋｂのクローン、ｐＣＧＮ３２３５、の部分的Ｄ ＮＡ配列を表す。第４Ｂ図は、クローンの５末端からの１．２ｋｂのクローン、 ｐＣＧＮ３２３６、の部分的ＤＮＡ配列を表す、２つのブラシカ・カンベストオ イス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のデサチュラーゼのクローン の３′末端からの最初の配列は、ｐ３６がｐＣＧＮ３２３５と同一の遺伝子から の短いクローンであることを示す。 第１０図は、ｃＤＮ＾およびトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の４６ｋＤのシ ンターゼの因子Ａの遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列を提供する。 第１１図は、ｃＤＮＡおよびブラシカ　（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）のシンターゼの 因子Ｂの遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列を提供する。第１１Ａ図は、ｐＣＧＮ ３２４８のｃＤＮＡのインサートの配列を提供する。 第１１Ｂ図は、クローン４Ａの配列を提供する。 第１２図は、シンターゼのアミノ酸配列の比較を提供する。ｒ　ＲＣ４６ｊは、 トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の因子Ａの遺伝子の翻訳された アミノ酸配列の一部分である。　ｒＲｃ５０Ｊは、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎ ｉｓ）のシンターゼの因子Ｂ遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列の一部分である。 ｒ　Ｂｅ２ＯＪは、ｐＣＧＮ３２４８のブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）の因子 Ｂ遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列の一部分である。　ｒｆａｂＢＪは、Ｅ、ｃ ｏｌｉのシンターゼＩの遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列を表す（Ｋａｕｐｐ− ４ｎｅｒら、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏ５５ｕｎ　（１９８８）　５３ 　：　３５７−３７０）。 主恩Ω！Ｗ 本発明によれば、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、以後また「シンターゼ」 と呼ぶ、に関係する組成物および使用方法はが提供される。また、生物学的に活 性な植物のシンターゼに関係する方法およびアミノ酸の組成および核酸配列は興 味あるものである。 とくに、比較的高い回転（比活性）を有するシンターゼタンパク質の調製物は、 種々のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの応用における使用に重要である 。ことに、シンターゼ■および／またはシンターゼＩＩを有するタンパク質調製 物を以後考える。シンターゼ活性は、長いアシル−ＡＣＰおよび短いアシル−Ａ ＣＰに対する優先的活性により区別される。短い鎖長のアシル−ＡＣＰに対して 優先的活性を有するタンパク質調製物はシンターゼ■型である。長い鎖長のアシ ル−ＡＣＰに対して優先的活性を有するシンターゼはシンターゼＩＩ型である。 トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏ＋＊ｍｕｎｉｓ）から得られたシンターゼは特 別に重要である。 宿主細胞の中のシンターゼの生物学的活性をエンコードする核酸配列を核酸の構 成において使用して、重鎮の中に存在する相対量、ことに宿主細胞が植物の宿主 細胞であるとき、シンターゼＩ型およびシンターゼＩＩ型の相対量を変調するこ とができる。シンターゼは宿主細胞の中で収穫のために、あるいはシンターゼと その基質との間の接触を実施する手段として生成することができる。宿主細胞は 原核生物および／または真核生物を包含する。シンターゼをエンコードする構成 体を含有する植物の宿主細胞、ならびに修飾されたレベルの１種または２種以上 のシンターゼタンパク質を含有する植物および細胞が、また、提供される。 本発明によれば、Ｃ２〜Ｃ１６の鎖長を有するアシル−ＡＣＰとマロニル−ＡＣ Ｐとの間の縮合反応を触媒する方法は、アシル−ＡＣＰおよびマロニル−ＡＣＰ の基質をトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から得られたシンターゼと、反応成 分の縮合を可能とする条件下に、接触させることによって実施される。この反応 はトウゴマ（Ｒ，ｃｏ＋＊ｍｕｎｉｓ）のシンターゼを使用するが、トウゴマ（ Ｒ，ｃｏｓｎｕｎｉｓ）の細胞の外側で起こすことができる０種々の技術を使用 して、この反応はをｉｎ　ｖｉｔｒｏで、あるいは他の植物細胞の中でｉｎ　ｖ ｉｖｏで実施することができる０例えば、そのゲノムの中に発現構成体を組み込 んで有する植物を成長させることができ、ここで発現構成体は、転写の５°−３ ′の方向において、植物の発現可能なプロモーター、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｓ＋ ｕｎｉｘ）から得ることができるシンターゼをエンコードするＤＮＡ配列および 転写停止領域を有する。シンターゼの単独および互いとの組み合わせの変調は重 要である。植物の中の発現のために、肝組織の中で優先約に転写および翻訳を指 令することができるプロモーターを使用して、シンターゼの発現を調節すること は望ましくはことがある。 さらに、植物細胞の中で同様によく内因性シンターゼの表現を減少するように、 核酸の構成体を設計することができる。１つの例は、少なくとも常態でその酵素 を生産する植物細胞の中で発現することができるプロモーターのコントロール下 に、アンチセンスのシンターゼ配列を使用するすることである。 さらに、シンターゼの発現を、脂肪酸の合成に関係する他の酵素、ことに中立鎖 のチオエステラーゼ、デサチュラーゼ、ことにΔ−９デサチェラーゼなどをエン コードする、他の導入された配列の発現と、同調させることができる。このよう な因子をエンコードする核酸の構成体は互いに最も異なることがあるであろう。 タンパク質の汚染物質を実質的に含有しない、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｕ−ｎｉｓ ）から得られたシンターゼ調製物を記載する。シンターゼ■型の活性を実証する トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓｍｕｎｔｓ）のシンターゼ調製物、およびシンターゼ活性 型の活性を実証するものを得ることができる。１６μ１モル／分／ｍｇタンパク 質および１．７μモル／分／ｓ＋ｇタンパク質までの酵素の比活性が、それぞれ 、シンターゼ■型およびシンターゼ活性型のタンパク質について観測された。こ のような活性を表すタンパク質またはタンパク質調製物は、単独であるいは組み 合わせて、脂肪酸合成の基質と接触させて、シンターゼの縮合反応を推進するこ とができる０種々の調製物に相当するアミノ酸および核酸の配列を推定し、そし て他の相同的に関係するシンターゼを得るために使用することができる。 主恩色毘監髪脱里 本発明の植物のシンターゼは、植物の宿主細胞の中で０２〜Ｃ１６の鎖長を有す るアシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡとマロニル−ＡＣＰとの間の縮合反応を 触媒する能力を実証する、天然および合成源から全体または一部分が誘導された にかかわらず、アミノ酸、ポリペプチド、ペプチドの断片または他のタンパク質 調製物の任意の配列を包含する。植物のシンターゼは、植物の宿主細胞の中で、 すなわち、ｉｎ　ｖｉｖｏで、あるいは植物細胞様環境の中で、すなわち、１ｎ ｖｉｔｒｏで、シンターゼの反応を触媒することができるであろう。典型的には 、植物のシンターゼは天然の植物源から全体または一部分で誘導されるであろう 。 さらに、他の源、例えば、バクテリアまたは下等植物からのシンターゼは、また 、植物において有用であり、そして本発明においてシンターゼと考えることがで きる０例えば、ｆａｂＢ遺伝子によりエンコードされる［！、ｃｏｌｉのシンタ ーゼタンパク質は、ここにおいて、植物のシンターゼタンパク質に対する相同性 を有することが示された。 シンターゼ！は短い炭素鎖、０８〜Ｃ１４、を有するアシル−ＡＣＰに対する優 先的活性を実証する；シンターゼＩＩは長い炭素鎖、ＣＩＡＣ１６、を有するア シル−＾ＣＰに対する優先的活性を実証する。シンターゼＩＩＩは、非常に短い 炭素鎖、０２〜Ｃｂ、を有するアシル−ＣｏＡに対する優先的活性を実証する。 シンターゼＩＩＩ型活性を包含する、他の植物のシンターゼをまた本発明により 応用することができる。シンターゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩの間の鎖は、また、セ ルレニンを使用する阻害により観察される。セルレニンに対して、シンターゼ■ は最も感受性であり、シンターゼＩＩは感受性が低く、そしてシンターゼＩＩＩ は感受性が最も低い、これらの結果から理解することができるように、シンター ゼＩＩはいくつかのシンターゼＩ型活性を有する。 シンターゼは、修飾されたアミノ酸配列、例えば、突然変異した、切頭し、増加 したなどの配列、ならびに部分的または完全に人工的に合成されたこのような配 列を包含する。シンターゼおよびシンターゼをエンコードする核酸配列は、例え ば、植物の抽出物の部分的または均質な精製、タンパク質のモデル化、核酸のプ ローブ、抗体の調製物、または配列の比較により得ることができる。いったん精 製されたシンターゼが得られると、他の植物のシンターゼはトウゴマ（Ｒ，ｃｏ ａ＋ｍｕｎｉｓ）のシンターゼに対して特異的な抗体を植物のシンターゼと、抗 原：抗体の免疫複合体の形成に対して誘導的である条件下に、接触させ、そして それに対して反応性の植物のシンターゼを回収することによって得るためにそれ を使用することができる。 いったんシンターゼをエンコードする核酸配列が得られると、それはさらにスク リーニングするためのプローブにおいて使用することができるか、あるいは宿主 細胞、ことに植物の宿主細胞における転写および転写および翻訳のための構成体 を遺伝子操作するとき使用することができる。 シンターゼをエンコードする核酸配列および問題の異種核酸配列を含有する組み 換え構成体を調製することができる。異種とは、シンターゼの配列に接合して天 然に見いだされない配列を意味する。 それゆえ、任意の修飾されたシンターゼに接合した配列は野生型配列ではない、 他の例は、異なる植物の宿主のゲノムの中に組み込まれた、１つの植物源からの シンターゼを包含する。 構成体は原核生物または真核生物の中でシンターゼを合成するように設計するこ とができる。植物細胞の中のシンターゼの発現の増加または植物細胞の中で観察 される内因性シンターゼの量の減少は、特別に興味あることである。そのうえ、 植物の宿主のゲノムの中への組み込みのための核酸の構成体において、シンター ゼは転写の方向に関して「センス」または「アンチセンス」の向きで見いだすこ とができる。こうして、核酸は生物学的に活性なシンターゼをエンコードするす ることができるか、あるいは内因性の植物のシンターゼの生産を阻害するために シンターゼをエンコードする配列に対して相補的な配列であることができる。植 物の宿主細胞の中でセンス配列を転写および翻訳することによって、植物のＦＡ Ｓ複合体に有効なシンターゼの量は増加される。植物の宿主細胞の中でアンチセ ンス配列を転写または転写および翻訳することによって、植物のＦＡＳに有効な シンターゼの量は減少される。理想的には、アンチセンス配列は内因性配列に対 して高度に相同性である。ＦＡＳに対して有効なシンターゼの量を減少する他の 方法、例えば、リボザイムまたは本発明の範圀内であるシンターゼの発現を事実 減少する作用をするセンス配列を含有する構成体で形質転換した植物細胞のスク リーニングを使用することができる。他のＭ４Ｑの方法を当業者は適用すること ができる。 シンターゼは、単独でまたは組み合わせで、使用して、所望の結果に依存して脂 肪酸の合成の伸長縮合反応を触媒することができる。 例えば、速度に影響を及ぼすシンターゼ活性はシンターゼＩ型、シンターゼ活性 型、シンターゼ調製物型またはこれらの酵素の組み合わせに帰することができる 。 こうして、シンターゼＩの過剰の発現は脂肪酸の収率、および／またはこの系に おいて見いだされるパルミチン酸（Ｃ１６：Ｏ）の比率を増加する働きをするこ とができるであろう、あるいは、いくつかの脂肪酸の伸長工程において重要な酵 素として、還元性内因性シンターゼ１は効率よく脂肪酸の低い収率を提供するで あろう、脂肪酸の伸長通路における最後の酵素として、シンターゼＩＩは脂肪酸 の生産を増加するためあ重要な因子であることができる。ＦＡＳへのシンターゼ ＩＩの利用可能性の増加は、事実、反応の前進速度を「推進」し、そして長鎖の 脂肪酸のより大きいプールを生ずることができる。 引き続いて、１８個の炭素をもつ脂肪酸の量の増加は、究極的に、トリグリセリ ドの生産を増加することができる。同様の方法において、シンターゼＩＩの減少 はこれらのメカニズムの一方または双方を減少する働きをすることができる。シ ンターゼＩＩは最終の伸長段階を触媒するので、それは所望の効果をつくるため に他のシンターゼ因子からの支持を必要とすることがある。とくに、シンターゼ ■とシンターゼＩＮとの組み合わせた存在はオレイン脂肪酸の高い組成の発生お よび／またはトリグリセリドの生産の増加について考えられる。 さらに、バルミチン酸塩の生産は、さらに、シンターゼＩの生産の増加と内因性 シンターゼＩＩの減少の組み合わせにより増強することができる。こうして、種 々のシンターゼ因子を同様な方法で組み合わせて所望の効果を達成することがで きる。 細胞または植物を生産するシンターゼの使用のための他の応用を、また、見いだ すことができる０例えば、植物のシンターゼについて選択的な潜在的な除草剤を スクリーニングにより得て、環境的に安全な除草剤の生成物を提供することがで きる。ことにバクテリアの系は植物のシンターゼＩＩに同等の酵素をもたないこ とにおいて、このようなシンターゼＩＩに基づく除草剤のスクリーニングのため にとくに有用な系であることができる。シンターゼは、また、葉緑体のリゼイト と組み合わせて使用して、生産を増強するおよび／またはｉｎ　ｖｉｔｒｏで調 製された脂肪酸の組成を修飾することができる。シンターゼは、また、植物およ びバクテリアの中の脂肪酸の形成のメカニズムを研究するために使用することが できる。これらは応用のために、構成的プロモーターは最良の用途を見いだすこ とができる。 宿主細胞の中で問題の核酸配列の転写および翻訳を提供する要素を含有する構成 体は「発現カセット」である。宿主に依存して、調節領域は変化し、ウィルス、 プラスミドまたは染色体などからの構造遺伝子からの領域を包含する。原核生物 または真核生物の微生物、とくに単細胞の宿主の中の発現のために、広範な種類 の構成体または調節可能なプロモーターを使用することができる。記載された翻 訳開始領域の中には、バクテリアまたは酵母菌、例えば、Ｅ、ｅｏｌｉ、枯草菌 （Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒ ｏ−ｗａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の領域が存在し、遺伝子、例えば、 β−ガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ−１ａｃ　（ｔａｃ）　、ｔ ｒｐＥなどを包含する。 植物細胞の中のシンターゼの発現のための発現力セントは、転写の５′−３′の 方向において、植物細胞の中で機能的な転写および翻訳開始のコントロール調節 領域（また、「プロモーター」として知られている）、シンターゼをエンコード する核酸配列、および転写停止領域を包含する。デサチュラーゼの構造遺伝子の 広範な種類の構成的またはｔｓｍ可能な、例えば、誘導可能な転写を提供する、 多数の翻訳開始領域は利用可能である。植物のために使用される翻訳開始領域の 中には、カリフラワーのモザイク病ウィルス（３５３゜１９３）に関連するこの ような領域、および構造遺伝子、例えば、ツバリンシンターゼまたはマンノバイ ンシンターゼまたはナピンおよびＡＣＰプロモーターなどがある。このような構 造遺伝子に相当する転写／翻訳翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンに対して 直ぐ５゜上流に見いだされる。こうして、意図する用途に依存して、異なるプロ モーターが必要となることがある。 本発明において、種子の組織の中で、とくに種子の油の形成の初期の段階におい て、シンターゼを優先的に発現することができるプロモーターはとくに重要であ る０種子の脂肪酸／油の組成の選択的修飾は他の植物組織への潜在的悪影響を減 少するであろう。このような種子特異的プロモーターの例は、次のものを包含す る：ナビンまたは種子のＡＣＰ遺伝子、例えば、欧州特許（ＥＰ）第０２５５３ ７８号（１９８８年２月３日発行）に記載されているもの、デサチュラーゼ、例 えば、Ｔｈｏａ＋ｐｓｏｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（１ ９９１）　、　８８　：　２５７８−２５８２）　、同時係属米国特許出願筒４ ９４．１０６号およびその中の第８図および第９図に記載されているもの、また はＢｅｅ−４遺伝子、例えば、同時係属米国特許出願筒４９４，７２２号および その中の第７図に記載されているものの直ぐ５゛上流の領域。あるいは、植物の シンターゼの構造遺伝子に関連する５”調節領域、すなわち、植物のシンターゼ の構造遺伝子に対して直ぐ５゛上流の領域および／または植物のシンターゼの構 造遺伝子に対して直ぐ３′下流に見いだされる転写停止領域の使用はしばしば必 要であることがある。一般に、プロモーターは所定の応用を変化することがある 、それらの発現のプロフィルに基づいて選択することができる。 アンチセンスの向きにおいて見いだされる配列は、少なくともシンターゼをエン コードする配列の転写を提供するカセットにおいて見いだすことができる。アン チセンスとは、問題の配列に対して相補的な配列をエンコードする、転写の５’ 　−３’　の方向における、ＤＮＡ配列を意味する。「アンチセンス配列」は植 物の宿主に対して固有の植物のシンターゼの遺伝子に対して相補的であることが 好ましい０種子の発育の間にすべての貯蔵組織において高いレベルの転写の開始 を引き起こす植物の宿主の中で、発現することができる任意のプロモーターは十 分である０種子特異的ポリメラーゼは適切であることがある。 さらに、次の配列の発現またはアンチセンスと同調して問題の１または２以上の 配列の転写または転写および翻訳を提供することができる：シンターゼの配列、 例えば、植物のデサチュラーゼをエンコードする配列、例えば、同時係属米国特 許出願筒４９４．１０６号および譲渡されていない米国特許出願、１９９０年８ 月１３日発行、発明の名称「植物のデサチュラーゼ−組成物および使用」に記載 されているもの、種子または葉のアシル担体のタンパク質、例えば、同時係属米 国特許出願筒４３７．７６４号、中位鎖の植物のチオエステラーゼ、例えば、Ｐ ｏ１ｌａｒｄら（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　（１９９１） 　２８４　：　３０６　３１２）および同時係属米国特許出願筒５１４，０３０ 号に記載されているもの、をエンコードする配列、または植物脂質に影響を与え て、植物油の量および／または組成を変更することができる酵素をエンコードす る他の配列、シンターゼ酵素に関して前述の使用法および関係する配列および組 成物を決定する手段は、これらの酵素に同様によく適用することができる。 デサチュラーゼのセンス配列およびシンターゼのセンス配列をエンコードする核 酸を宿主細胞のゲノムの中に組み込むことができる。 植物のデサチュラーゼは、第１の二重のバンドの脂肪酸−ＡＣＰ部分、ことにΔ −９デサチュラーゼの中への挿入を触媒することができる任意の酵素を包含する 。このような組み合わせは、不飽和脂肪酸の生産を変更し、こうして植物の宿主 細胞の中の両者の酵素の発現のとき、有意に低級または高級の飽和脂肪酸に導く ように設計することができる。デサチュラーゼは長鎖の脂肪酸のアシル−＾ｃＰ 、シンターゼＩＩ活性の生ずる生産物、に作用するので、種々の応用が可能であ る。ｖｉ和鎖をほとんどあるいは完全にもたない脂肪酸の生産のためのシンター ゼＩＩおよびΔ−９デサチュラーゼの両者の生産の増大の組み合わせは、重要で ある。また、シンターゼＴＩの生産の増加および高いステアレート（Ｃ１８：　 Ｏ）の脂肪酸組成物の生産のためのデサチュラーゼの生産の減少を提供すること ができることは、重要である。飽和／不飽和の脂肪酸の修飾プールを、生ずるト リグリセリドの組成に反映することができる。異なる実施態様において、シンタ ーゼ、例えば、シンターゼＩの発現の増加を、中位鎖の植物のチオエステラーゼ と組み合わせることは、適切であることがある。 中位鎖の植物のチオエステラーゼ、１または２以上の（Ｃ８〜Ｃ１４）のアシル −ＡＣＰ基質に対する優先的ヒドロラーゼ活性を有することができる酵素を含有 する植物は、中位鎖の脂肪酸、ことにラウレート（Ｃ１２：　Ｏ）の生産につい て考えられる。１または２以上のシンターゼのレベルの増加と組み合わせて、こ れらの作用を増大することができる。 問題の１より多い核酸配列の組み合わせた作用のために形質転換された植物を提 供しようとするとき、典型的には別々の核酸の構成体が各々のために提供される であろう。構成体は、前述したように、転写または転写および翻訳の調節コント ロール領域を含有する。当業者は、シンターゼの発現またはアンチセンスの構成 体に関して記載した上の原理に一致して、最終生産物に対して適当な所望のタイ ミングおよび組織の特異性を提供するために、調節配列を決定することができる であろう。２またはそれ以上の構成体を使用すべきとき、それらの両者がシンタ ーゼの配列に関係するか、あるいはシンターゼの配列および植物脂質に影響を与 えることができる酵素をエンコードする配列に関係するするかどうかにかかわら ず、各カセットの中に異なる配列を使用して、配列の間の自発的相同性の再組み 合わせを減少することが望ましい。構成体は宿主細胞の中に同一であるか、ある いは異なる方法により導入することができ、これらの方法は、生ずる生産物がそ のゲノムの中に組み込まれた両者の特性を有する植物であるかぎり、伝統的な植 物の品種改良方法によりトランスジェニック植物を交雑することによって、この ような特性を導入することを包含する。 植物、例えば、ブルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｕｓ） 、またはより好ましくはトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から得ることができ るタンパク質調製物から単離された、よりすぐれた反応速度論的性質を有するよ うに思われるシンターゼは特別に重要である。表１に示すように、スピナシア・ オレラセア（Ｓｐｔｎａｃｉａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）からの粗製の抽出物に比較 して、飽和油のレベルが低い葉およびある植物は、シンターゼＩＩ活性の顕著に 高い合計の活性／ｇの新鮮な重量を示す；計算した比活性はまた高い。 表■ 々の　１　）′の　の　のシン　−ゼＩＩの圭孟」］Ｊしく社）１値 Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ葉　７，１５　６．６１　０．９６２　Ｌ４．ＯＢ、ｎａ ｐｕｓ種子　７．６２　６．５８　０．８６４　２２．ＯＲ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ 胚乳　２１．０　３４６．０　１６．５　Ｌ５．７Ｐ、ａｍｙｇｄａｌｕｓ　胚 　８．０？　６２．３　７．７３　２２．４１スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏ ｌｅｒａｃｅａ）の葉の抽出物をＳｈｉ−ｍａｋａｔａおよび５ｔｕａｐｆ、Ｐ ＮＡＳ　７９：５８０８−５８１２　（１９８３）に従い調製した。残りの試料 は、５０−Ｈのリン酸カリウムおよび２ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７，５ 、を含有する緩衝液の２体積と混合した粉砕した組織から調製しく２ｍｇ／ｇの 新鮮な組織）、その上澄み液を遠心後に集めた。タンパク質はブランドフォード （Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９７６）　７２ ：　２４８−２５４）により測定した。シンターゼＩＩを実施例２に記載するよ うに変化する濃度のバルミトイル−ＡＣＰを使用して測定した。 試験は、また、基質に対する粗製の抽出物の感受性を比較した。マロニル−ＡＣ Ｐは、粗製の抽出物の中のマロニルトランスアシラーゼの存在のために、添加し た八〇Ｐに対して比例するであろうと仮定した。結果は、種の間におけるバルミ トイル−ＡＣＰについてのＫｍまたはＡＣＰ／マロニル−ＡＣＰに対して感受性 の非常にわずかの差を示した。他の類似の植物源を同様な試験により決定するこ とができる。 粗製の抽出物の中の飽和脂肪の例外的に低いレベル（く１％）およびシンターゼ ＩＩ酵素の高い活性は、好ましい酵素源の例としてトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎ ｉｓ）を示す品質である。−次の花序または花の穂により生産されるトウゴマ（ Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の種子は特別に重要である。なぜなら、それは、二次ま たは三次の花序（二次の穂）から分岐する粗製の抽出物より、通常高い油含量お よび高いシンターゼＩＩの比活性を有するからである。トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍ ｕｎｉｓ）の組織を使用するときの主要な困難は、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎ ｉｓ）の種子のりシンの毒性である。リシンは、下にいっそう詳述するように、 シンターゼの精製の間に抽出物から除去される。また、種子が収穫される段階は ｍ織の中に存在するりシンの量に影響を及ぼす。 「初期の」種子は非常に小さい不透明のコア、優勢な半透明の組織、および非常 に低いレベルのタンパク質およびシンターゼＩＩ活性を有する。「プライム（Ｐ ｔｉｍｅ）　Ｊ種子の組織は、開花後約２１〜２８日に見いだされ、中央の不透 明な白色のコアを有し、このコアは蓄積した種子の油を含有し、半透明の白色＆ １１織により取り囲まれている。 種子の被膜はちょうど硬化しそして白色から紫色−褐色に変わり始めている。半 透明の組織は徐々に消失し、そして不透明のコアは成熟の間に増加する。表ＩＩ に示すように、−次の花の穂からの「プライム」組織は最高のシンターゼＩＩの 比活性を有する：これらはシンターゼＴＩの主な源である。より成熟した「後期 の」種子は高いシンターゼＩＩ活性を示し続けるが、リジンの蓄積の大きい増加 は比活性を希釈する。改良されたりシンの除去法では、より古い種子は同様によ い好ましい源であることを証明することができる。 表ＩＩ トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓ＋ｗｕｎｉｓ）の−次および二次の花の穂への発育状　料 　比活性（μｍ１／ｍｇタンパク質）１個々のトウゴ７　（Ｒ，ｃｏｍｗｕｎｉ ｓ）の種子を初期（Ａ、Ｂ、Ｇ。 Ｈ）、プライム（Ｃ，Ｄ、Ｉ）または後期（Ｅ、Ｆ、ＪＳＫ）として識別した。 種子Ａ−Ｆは一次の穂がらであり、そして種子Ｇ−Ｆは二次の穂からであった０ 種子からの各胚乳組織を２体積（置１／ｇ新鮮な重量）の４０μＭのリン酸カリ ウム、２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）　、１ｓ＋ＨのナトリウムＥＤＴＡ、　 ２　ｓＭのＤＴＴ。 ｐＨ７，５の中で乳棒でマイクロ遠心機管内で粉砕した。ホモジネートを１１． ６００Ｘｇで１５分間遠心して清浄にした。上澄み液をブランドフォード（Ｂｒ ａｄｆｏｒｄ）法（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９７６）　７２　：２ ４８−２５４）によりタンパク質について測定し、そしてシンターゼＩＩ活性に ついて実施例２に記載されているようにして測定した。 実施例においてより完全に証明するように、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓ＋ｍｕ−ｎｉ ｓ）からのシンターゼｌおよびＩＩの抽出および精製は硫酸アンモニラムの分別 （ｐＨ７，５）により実施し、次いで上澄み液を硫酸アンモニウムで飽和してシ ンターゼを沈澱させた。シンターゼ活性含有する沈澱物を反応性グリーン１９ア ガロース（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｇｒｅｅｎ−１９＾ｇａｒｏｓｅ）にｂｒさせる 。グリーン１９アガロースに結合した活性含有するカラムを調製し、そしてシン ターゼ活性を高い塩の洗浄液の中に溶離する。 ピーク活性の分画に関連するタンパク質を部分的に脱塩し、次いで＾ｃｐ−セフ ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のカラムに吸収させ、そして１００〜２５０ｗ １Ｍのリン酸カリウム緩衝液の勾配で溶離する。　ＡＣＰカラムは、また、約５ ０ｋＤの分子量を示した主要な汚染物質を包含するいくつかのタンパク質を除去 する。シンターゼ活性について測定した分画は、主としてシンターゼＩＩ型を有 するが、また多少のシンターゼ■型活性含有する主要なピークがまず溶離するこ と、そして主要なピーク後に溶離する分画が主としてシンターゼ■型の活性含有 することを示す。 ＳＯ３−ＰＡＧＥ分析に適用したとき、シンターゼＩＩ型の活性を有する主要な ピークからの分画は２つの主要なピーク、すなわち、約４６ｋＤにおける１つお よび約５０ｋＤにおける第２のピーク含有することが示される。シンターゼ活性 活性は、５０ｋＤおよび４６ｋＤのバンドの両者合作するタンパク質調製物から 離れて、観察されなかった。５０および１６ｋＤのバンドの間の関係は、セルレ ニンのアッセイおよびＥ、ｃｏｌｉの発現の研究を包含する、それ以上の研究下 にある。２次元のゲルの分析は、５０ｋＤのバンドを少なくとも２つのスポット に分離する。 主要なピーク後にｉ９離される分画は、主にシンターゼ夏活性を含有し、そして 約５０ｋＤに１つの明確なバンドを示す。モノクローナル抗体を使用する試験は 、２つの分画からの５０ｋＤのタンパク質が非常に類似することを示す、追加の ピークは、これらのタンパク質を生化学的にさらに特性決定する途上にある。 ＳＯ５−ＰＡＧＥにおいて得られたわずかのバンドが与えられると、対応するア ミノ酸および／またはそれに対する核酸の配列を得ようとする直ちの努力は、こ の分野において知られている方法により可能である。このような配列から、シン ターゼ活性はコントロールされた系、例えば、生殖細胞の中の発現で、あるいは アンチセンス核酸断片などの転写の効果の観察によりさらに確証することができ る。 精製されたタンパク質調製物に相当する断片のアミノ酸配列は、プロテアーゼ、 例えば、トリプシンによる消化、および生ずるペプチド断片の配列決定により得 ることができる。５０ｋＤのタンパク質から誘導されたペプチド断片のアミノ酸 配列は第２図に示されており、そして４６ｋＤのから誘導されたペプチド断片の アミノ酸配列は第３図に示されている（第４図は、ペプチド断片のアミノ酸配列 の「逆翻訳」により、オリゴヌクレオチドを設計するために使用した５０ｋＤの ペプチドのペプチドの配列を示す）、より長いＤＮＡ配列を得るために鋳型とし てトウゴマ（Ｒ，ｃｏ■−ｕｎｉｓ）の胚乳のＤＮＡを使用するポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）において使用するために、ＤＮＡ配列を選択する０次いで、得 られるＰＣＲ発生した配列を、標識されたプローブとして、トウゴマ（Ｒ，ｃｏ ■−ｕｎｉｓ）の胚乳のｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡのライブラリーのスクリ ーニングにおいて使用する。このようにして、ＳＯ５−ＰＡＧＥ上に見られたト ウゴマ（Ｒ，ｃｏ−■ｕｎｉｓ）のタンパク質に相当する全長のクローンを必要 に応じて得ることができる。第５図は、この方法において得られた５０ｋＤのタ ンパク質に相当するＤＮＡ配列である。他の植物のシンターゼの遺伝子は、シン ターゼｃＤＮＡから誘導されたプローブで、他の植物源からのｃＤＮＡまたはゲ ノムのライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。 第６Ａ図および第６Ｂ図において、５０ｋＤのシンターゼタンパク質をエンコー ドする単離されたｃＤＮＡのクローンおよび２つの他の既知のシンターゼタンパ ク質から翻訳されたアミノ酸配列を比較する配列を表す、　ＦａｂＢ、第６Ａ図 における生殖細胞の中のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをエンコードする遺 伝子と比較すると、ＦａｂＢタンパク質のアミノ酸、ことに活性部位付近におい て、アミノ酸２１９−２２３の広範な同一の相同性が存在することが示される。 ５０ｋＤのの翻訳されたアミノ酸配列は、また、第６Ｂ図に示すように、０ＲＦ −１によりエンコードされる、ストレプトミセス・グラウセセンス（Ｓｔｒｅｐ ｔｏ＋５ｙｃｅｓ　ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）の中のポリケチドシンターゼタン パク質に対して有意の同一の相同性を有する。 本発明のＤＮＡ配列はゲノムまたはｃＤＮＡの配列を含むことができる。 ｃＤＮＡ配列は、処理前の配列、例えば、トランシットペプチドの配列を含むか 、あるいは含まないことができる。トランシットペプチドの配列はタンパク質を 所定のオルガネラに供給し、そしてオルガネラの中に入るときアミノ酸部分から 切断されて、「成熟」タンパク質（または酵素）を解放する。シンターゼはブラ スチドのオルガネラのＦＡＳ通路の一部分、例えば、葉緑体、プロブラスチドな どであるので、トランシフトペプチドは１または２以上のタンパク質を基質に向 けるために要求されることがある。ブラスチド転移源からのトランシットペプチ ドの配列、例えば、ＡＣＰ、ことに種子のＡＣＰ。 植物のデサチュラーゼからのもの、あるいはそれぞれのシンターゼと自然に関連 する天然の配列からのものを使用することができる。 植物のシンターゼの完全なゲノムの配列は、下にいっそう詳述するように、ゲノ ムのライブラリーをプローブでスクリーニングし、そしてそれに対してハイブリ ダイゼーションする配列を単離することによって得ることができる。シンターゼ に対して直ちに５°の調節配列、転写および翻訳開始領域、および３′の転写お よび翻訳停止領域を取得し、そしてシンターゼの構造遺伝子を使用しであるいは 使用しないで用いることができる。 他のシンターゼおよび／またはシンターゼの核酸配列は、ここにおいて提供され るアミノ酸配列およびＤＮＡ配列から得ることができる。「得ることができる」 は、生物学的に活性なシンターゼを提供するために十分な１または２以上の天然 の配列と類似する配列を有する、植物のシンターゼを言及する。当業者は容易に 認識するように、抗体調製物、核酸のプローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）などを調 製し、そして他の源からシンターゼおよび／またはシンターゼの核酸配列をスク リーニングおよび回収するために使用することができる。こうして、トウゴマ（ Ｒ，ｃｏｍｓ＋ｕｎｉｓ）のシンターゼＩまたはＩＩに相同的に関係するか、あ るいはそれからの誘導体である配列は本発明から得ることができると考えられる 。 「相同的に関係する」は、天然の配列に比較して、同一であるか、あるいは保存 的に置換された核酸配列を包含する。典型的には、相同的に関係する配列は、存 在しうる欠失を除外して、トウゴマ（Ｒ。 ｃｏｍｍｕｎｔｓ）のシンターゼと問題の所定の植物のシンターゼとの間の、少 なくとも約６０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７０％の相同性を示す であろう、相同性は配列の情報、核酸またはアミノ酸の比較するか、あるいはハ イブリダイゼーション反応により決定される。 プローブは全体の配列かなり短いことができるが、少なくとも約１０、好ましく は少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも２０などの核酸の長さであるべ きである０問題のポリペプチドをエンコードする遺伝子の全長までの、より長い オリゴヌクレオチドはまた有用である。　ＤＮＡおよびＩＩＮＡの両者を使用す ることができる。 問題の植物源から調製されたゲノムのライブラリーを、トウゴマ（Ｒ，ｃｏ−− ｕｎｉｓ）のシンターゼのｃＤＮＡから保存された配列でブロービングして、相 同的に関係する配列を同定することができる。全体のトウゴマ（Ｒ，ｃｏｇｅｍ ｕｎｉｓ）　シンターゼｃＤＮＡは、短いプローブの配列が同定されない場合、 使用することができる。次いで、陽性のクローンをｉ！ＩＩ限酵素の消化および ／または配列決定により分析する。この一般的方法において、１または２以上の 配列を同定して、両者の解読領域、ならびにこのような植物源からのシンターゼ 遺伝子の転写調節要素を得ることができる。問題の他の植物源から調製されたｃ ＤＮＡのライブラリーを同様によくスクリーニングして、このような植物源から のシンターゼ遺伝子を得ることができる。 使用において、プローブを典型的には検出可能な方法出（例えば、３　Ｒｐ　４ １５％またはビチオニル化したヌクレオチドで）標識し、そして遺伝子をその中 で探す植物源からの一本Ｍ　ＤＮＡまたはＲＮＡとインキユベーシッンするが、 非標識オリゴヌクレオチドはまた有用である。 ハイブリダイゼーションは、典型的には、ニトロセルロース紙またはナイロン膜 を使用して、−末鎖または二本鎖（ハイブリダイゼーションした）ＤＮＡまたは ＤＮＡ／ＲＮＡが分離された後、標識により検出される。オリゴヌクレオチドと ともに使用するために適当なハイブリダイゼーション技術は、この分野において よく知られている。こうして、植物のシンターゼ遺伝子は、任意の便利な植物か ら種々の技術により単離することができる。他の脂肪種子の植物、例えば、Ｃ， ｔｉｎｃｅｏｒｉｕｓの種子、菜種、ワタ、トウモロコシ、ダイスの子葉、ホホ バのす・ン・ン、ココナ・ン、ナンキンマメ、ギネアアフ゛ラヤシなどから得ら れた発育する種子からのシンターゼの植物遺伝子、ならびに伝統的でない油源、 例えば、スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａ−ｃｅａ）の葉緑体、アボカ ドの中果皮、クツエア（Ｃｕｐｈｅａ）　、カリフォルニア・ペイ　（Ｃａｌｉ ｆｏｒｎｉａ　Ｂａｙ）およびエウグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒ ａｃｉｌｌｉｓ）から得られたシンターゼの植物遺伝子は適当である。クツエア （Ｃｕｐｈｅａ）から得られたシンターゼ、ことにシンターゼＩは中位鎖の脂肪 酸に対する特殊化された活性を示すことができる。このようなシンターゼは植物 の中位鎖のチオエステラーゼと組み合わせて使用するために特別に重要であるこ とがある。 いったん所望の植物のシンターゼの配列が得られると、それを種々の方法で操作 することができる。配列が非解読フランキング領域を含む場合、フランキング領 域をリセクシタン（ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ）　、突然変異誘発などにかけることが できる。こうして、トランジション、トランスバージラン、欠失、および挿入を 天然に産出する配列について実施することができる。さらに、配列のすべてまた は一部分を合成することができ、ここで１または２以上のコドンを修飾して修飾 されたアミノ酸配列を得るか、あるいは１または２以上のコドンの突然変異を導 入して便利な制限部位を得るか、あるいは他の目的で構成体または発現を含める ことができる。構造遺伝子をさらに合成のアダプター、リンカ−を使用してｌま たは２以上の制限部位を導入することなどすることによって修飾することができ る０発現のために、植物のシンターゼまたはその機能的断片をコードするオーブ ンリーディングフレームを転写開始調節コントロール領域に対して５゛末端に接 合することができる。ある場合において、例えば、アンチセンスの向きにシンタ ーゼをエンコードする核酸配列により植物のシンターゼを修飾場合において、転 写開始領域または転写／翻訳開始領域を使用することができる。シンターゼタン パク質の発現を植物の宿主の中で望む場合、転写／翻訳開始調節領域が必要とさ れる。さらに、修飾されたプロモーター、すなわち、１つの遺伝子源から誘導さ れた転写開始領域および異なる遺伝子源翻訳開始領域を有するプロモーターある いは増強されたプロモーター、例えば、二重の３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターを いくつかの応用のために使用することができる。 前述したように、種子の成熟の間に調整された遺伝子、とくに植物の胚ｍ織の中 で発現されたものから得られる５°上流の非解読領域、例えば、ＡＣＰ−および ナピンー誘導転写開始コントロール領域はとくに重要である。このような調節領 域は脂質の蓄積の間に活性であり、したがって植物のデサチュラーゼの生産およ び／または脂肪酸組成の修飾を変更するためのより大きいコントロールおよび／ または有効性についての可能性を提供する。種子組織の中で優先的に発現される 、すなわち、他の植物の部分において検出できない、転写開始領域はことに重要 である。この目的で、ブラシカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａｓｐｅｓｔｒｉｓ ）の種子から単離されそしてｒＢｃｇ４−４Ｊと表示されるアシル担体タンパク 質の転写開始領域、およびブラシカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａｗ＋ｐｅｓｔ ｒｉｓ）の種子から単離されそしてｒＢｃｅ−４Ｊと表示される未知の機能を有 する遺伝子は、また、実質的に重要である。 簡単に述べると、Ｂｃｅ４は未熟の肝組織の中に開花期（開花）後少なくとも１ １日程度に早期に、ピーク後約６〜８日または開花期後１７〜１９日に見いださ れ、そして開花期後３５日に検出不可能となる。 Ｂｃｅ４遺伝子の発現のタイミングは、種子組織における脂質の蓄積のそれに密 接に従う、　Ｂｃｅ４は種子の肝組織において主として検出され、そして少ない 程度に種子の被膜の中に見いだされる。Ｂｃｅ４は試験した他の植物＆［Ｉ織、 根、茎および葉の中に検出されなかった。 Ｂｃｅ４の転写開始領域は少なくともｌｋｂおよびより好ましくは約５〜約７． ５ｋｂのＢｃｅ４の構造遺伝子に対して直ぐ５′上流の配列含有するであろう。 ＢａＨ２−４のＡＣＰのメツセージはＢｃｅ４のそれに類似する発現のプロフィ ルを表し、したがって、また種子組織の中の脂質の蓄積に相当する。　ＢａＨ２ −４は種子の被膜の中に見いだされず、そして、ＢａＨ２−４の５′非解読配列 を使用して本発明の植物のΔ−９デサチュラーゼの転写または転写および翻訳を 調節するとき、Ｂｃｅ−４に比較して、発現のレベルにおいて多少の差を示すこ とがある。 ナビン１−２のメツセージは初期の種子の発育において見いだされ、こうして、 また調節領域を提供し、これらの調節領域は問題の所望のＤＮＡ配列、例えば、 脂質の蓄積の間の本発明の植物のデサチュラーゼのＤＮＡ配列の優先的転写の調 節を提供することができる。 ナビンは発育するブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）の胚の中で合成された貯蔵タ ンパク質の２つのクラスの１つであり　（Ｂｈａｔｔｙら、Ｃａｎ　Ｊ、Ｂｉｏ −ｃｈｅｍ、　（１９６８）　４６　：　１１９１　１１９７）そしてブラシカ 　（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のゲノムの中に再導入されるとき、組織特異的発現を指 令するために使用されてきている（Ｒａｄｋｅら、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅ ｎｅｔ、（１９８８）　７５：　６８５−６９４）。 調節転写停止領域に関係すると、これらは植物のシンターゼをエンコードするＤ ＮＡ配列または異なる遺伝子源から誘導された便利な転写停止領域、ことに転写 開始領域天然に関連する転写停止領域により提供されることができる。典型的に は、転写停止領域は少なくとも約１ｋｂ、好ましくは約３ｋｂの停止領域が誘導 される構造遺伝子に対して３゛の配列含有するであろう。 ＤＮＡ構成体を発生させるとき、構成体またはそれらの断片の種々の成分を、通 常、バクテリアの宿主、例えば、［！、ｃｏｌｉの中で複製することができる便 利なりローニングベクターの中に挿入する。文献に記載されてきている多数のベ クターが存在する。各クローニング後、プラスミドは単離し、そしてそれ以上の 操作、例えば、制限、新しい断片の挿入、結合、欠失、挿入、リセクシッンなど にかけて、所望の配列の成分を要求通りにつくることができる。いったん構成体 が完成すると、それを次いで宿主細胞の形質転換の方法に従うそれ以上の操作の ために適当なベクターに転移することができる。 通常、宿主の中の発現に必要な調節領域を有しそして形質転換された細胞の選抜 を提供する構造遺伝子を、ＤＮＡ構成体とともに含める。この遺伝子は、細胞障 害性因子、例えば、抗生物質、重金属、毒素などに対する耐性、両栄養性宿主に プロトトロピーを提供する相補性、ウィルスの免疫性などを提供することができ る。発現構成体またはその成分が導入される異なる宿主種の数に依存して、■ま たは２以上のマーカーを使用することができ、ここで選抜のために異なる条件を 異なる宿主について使用する。 ＤＮＡ構成体を植物の宿主の中に導入する方法は、本発明にとって臨界的ではな い。効率よい形質転換を提供する任意の方法を使用することができる。植物細胞 の形質転換のための種々の方法は、Ｔｉ　−またはＲｉ−プラスミド、マイクロ インジェクション、エレクトロボレイシタン、リポソームの融合、ＤＮＡの衝撃 などの使用を包含する。 多くの場合において、Ｔ−ＤＮＡにより一方の側または両側で境界された構成体 、とくに左および右の境界、とくに右の境界をもつ構成体を準備することは望ま しいであろう、これは、構成体がアグロバクテリウム・°ンメファシェンス（Ａ 、ｔｕｓｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ、ｒｈ ｉｚｏｇｅｎｅｓ）の形質転換の１つのモードとして使用するとき、とくに有用 であるが、Ｔ−ＤＮＡの境界は形質転換の他のモードとともに使用することがで きる。 癌腫１１（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ）を植物細胞の形質転換のために使用す るとき、癌１１１！ｒ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主の中に存在するＴ− ［ＩＮＡまたはＴｉ−またはＲｉ−プラスミドを使用する相同組み換えのための 癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋）宿主の中に導入することができるベク ターを使用して０Ｍｌみ換えのためのＴ−ＤＮＡ含有するＴｉ−またはＲｉ−プ ラスミドはアームド（ａｒｍｅｄ）　（ゴール（ｇａｌｌ）の形成を引き起こす ことができる）またはディスアームド（ｄｉｓａｒ■ｅｄ）　（ゴールの形成を 引き起こすことができない）であることができ、形質転換された癌腫菌（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）宿主の中にｖｉｒ遺伝子が存在するかぎり、いずれも許 容可能である。アームドブラスミドは正常の植物細胞とゴールとの混合物を与え ることができる。 植物細胞の形質転換のためのベヒクルとして癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉ ｕ■）を使用する好ましい方法は、広い宿主範囲の複製系、少なくとも１つのＴ −ＤＮＡの境界および問題の１または２以上のＤＮＡ配列を有するベクターを使 用する。普通に使用されるベクターはｐＲＫ２およびその誘導体を包含する。参 照、例えば、Ｄｉｔｔａら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ。 （１９８０）　７７　：　７３４７−７３５１および欧州特許出［（ＥＰＡ）第 ０１２０５１５号、これらの開示をここに引用によって加える。通常、ベクター はオピン、腫瘍遺伝子およびシｉｒ−遺伝子を含有しない０発現構成体およびＴ −ＤＮＡとともに、形質転換された癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｗ）およ び形質転換された植物細胞の選抜を可能とする１または２以上のマーカーが含ま れるであろう。ある数のマーカー、例えば、クロランフェニコール、アミノグリ コシドＧ４１８、ヒグロマイシンなどに対する耐性が植物細胞とともに使用する ために開発されてきている。使用する特定のマーカーは本発明にとって必須では なく、１つまたは他のマーカーは特定の宿主および構成方法に依存して好ましい 。 ベクターは、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞の中に転移するために機能的なりｔｒ−遺伝 子を有する癌腫ｉ１ｉ　（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の中への形質転換によ り、問題のＤＮＡを植物細胞の中に導入するために使用される０次いで、広い宿 主範囲のベクターの構成体含有する癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕ＋ｗ） は、複製および通常の発現が起こる条件下に植物の宿主細胞の中に所望のＤＮＡ が転移されるために適当な条件下に、植物細胞を感染するために使用される。ま た、これは通常マーカーの転移を含み、こうして二本鎖のＤＮＡ含有する細胞を 容易に選抜することができる。 広範な種類の植物生命、とくに植物油の生産に関係する植物生命とともに発現構 成体を使用するすることができる。これらの植物は、次のものを包含するが、こ れらに限定されない：菜種、ナンキンマメ、ヒマワリ、Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕ ｓ、ワタ、クツエア（Ｃｕｐｈｅａ）　、ダイズ、およびトウモロコシまたはヤ シ。 癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用する植物細胞の形質転換のために 、外植体を組み合わせ、そして形質転換された癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）とともに形質転換のために十分な時間の間インキュベートし、バクテリア を殺し、そして植物細胞を適当な選択的培地の中で培養することができる。いっ たんカルスが形成すると、苗条の形成を既知の方法に従い適当な植物ホルモンの 使用により促進し、そして苗条を植物の再生のために板形成培地に移すことがで きる。次いで、植物を種子に成長させ、そして種子を使用して反復的再生を推定 しそして植物油を単離することができる。 さらに、本発明に従い生産されたシンターゼ■またはＩ夏は、他の源からの植物 のシンターゼを検出するアッセイのための抗体の調製において使用することがで きる。植物のシンターゼは、また、葉緑体のリゼイトと組み合わせて使用して、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏで調製される脂肪酸の生産を増強しおよび／または組成を修飾 することができる。植物のシンターゼは、また、植物およびバクテリアにおける 脂肪酸の形成のメカニズムの研究のために使用することができる。 本発明を全体的に記載したが、以下の実施例を参照することによって本発明はい っそう容易に理解されるであろう、これらの実施例は例示を目的とし、そして本 発明を限定することを意図しない。 大施± 材料 反応性グリーン１９アガロース（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｇｒｅｅｎ−１９Ａｇａｒ ｏｓｅ）、ボンセアウ（Ｐｏｎｃｅａｕ）　Ｓ、炭酸アンモニウム、ホウ水素化 ナトリウム（ＮａＢＨａ）　、マロニルＣｏＡ　、遊離脂肪酸、β−メルカプト エタノール、およびプロテアーゼ阻害剤のアミノカプロン酸、ロイペプチン、ペ プスタチン、およびフッ化フェニルメチルスルホニルを包含する、商業的に入手 可能な生物学的化学物質およびクロマトグラフィーの材料はシグマ（Ｓｉｇｍａ ）　（ミゾリー州セントルイス）から入手する。 ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂはファーマシア（ Ｐｈａｒ＊ａ−ｃｉａ）　にュージャージイ州ピスカタウエイ）から購入する。 トリプシンおよびエンドプロテイナーゼｇｌｕｃを包含するタンパク質分解酵素 は、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａ ｎｎｈｅｉｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｔｃａｌｓ）（インジアナ州インジアナポリス） から入手した配列決定等級の酵素である。ポリフッ化ビニリデン（ＦＶＤＦ）は インボピロン（Ｉｗｗｏｂｉｌｏｎ）　−Ｐ　（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）　、マサチェセフツ州ペンドフォード）である、　ＩＩＰＬｃ等級のアセトニ トリルはＢｕｒｄｉｃｋおよびＪａｃｓｏｎ　（ミシガン州ムスケゴ）から入手 する。氷酢酸および母系のを包含する有機溶媒はＪ、Ｔ、Ｂａｋｅｒにュージャ ージイ州フィリプスバーグ）から入手する。テトラヒドロフラン、ジメチルフェ ニルチオ尿素（ＤＭＰＴυ）、およびＨＰＬＣ等級のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）はアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ） （カリフォルニア州フォスターシティ）から入手する；アプライド・バイオシス テムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ＋ｓ）　４７７Ａ配列決定装置（ 下を参照）は、また、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓ−ｔｅｓ＋ｓ）　（ＡＢＩ）から入手する＠　ｌ４Ｃ−マロニル補酵素、 （９，１０（ｎ）−３Ｈ〕オレイン酸（１０ｍＣｉ／■−ｏ１）　、およびデカ ン酸は、二ニー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｒ＋ｄ　 Ｎｕｃｌｅａｒ）（ＮＥＮ（Ｄｕｐｏｎ）、マサチュセノツ州ポスト）から入手 する。〔３Ｈ〕−ヨード酢酸はアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｓ）　（イリノイ 州アーリントンハイ゛ン）から人手する。 実施例１、ＦＡＳ分析 この実施例において、部分的に精製されたβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼお よび／またはΔ−９デサチュラーゼを細胞不含抽出物の中のＦＡＳ系に添加する 効果を記載する。 Ａ、之ｌ叉二叉立災駅 １１スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のシンターゼ１１の 精製 １、　１　アッセイ。シンターゼＩＩ活性を実施例２に記載されているように放 射線測定的に検出する。 １．２　°精製。β−ケトアシル−ＡＣＰのシンターゼＩＩを、５ｈｉａａ−ｋ ａ　ｔａおよびＳｔｕｍｐｆ　（ＰＮＡＳ　（１９８２）　７９　：　５８０８ −５８１２）に従い、次の変化を加えて、スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅ ｒａｃｅａ）の葉から部分的に精製する。 セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　５３００フアーマシア（Ｐｈａｒａ＋ａ ｃｉａ）カラムは、２．５０■Ｘ　１００ｃｍであり、そして流速は１８ｍ１／ 時である。シンターゼＩおよびＩｌｃは単一のピークにおける同時溶離物を活性 化する。 アフィ　（Ａｆｆｉ）−ゲルのブルー−アガロースカラム（パイオーラド（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ）　、カリフォルリニアすリッチモンド）は１．５ｃｍＸ１４ｃｍで あり、そして流速は１０ｍ１／時である。シンターゼＩＩ活性は溶離のために３ ００＋Ｈのリン酸塩を必要とする。 ワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）　にュージャージイ州りリフトン）ｐＨセルロ ースリン酸塩カラム、１．５０謹×１４ｃ慣、を、９ｍｌ／時で使用する。 ５０ｍＭのリン酸カリウムにおけるリン酸塩として、Ｓｈｉｍａｋａｔａおよび Ｓｔｕｍｐｆ　（前掲）が報告したように、リン酸塩の塩濃度はカラムの緩衝液 および適用した試料の両者において１０ｍＭに減少する。シンターゼＩ活性は１ ０ｍＭのリン酸カリウムにおいてさえ細胞に吸着せず、モして貫流の中に回収さ れる。シンターゼＩＴ活性は１００ｍＭのリン酸塩において段階的に溶離される 。 １．３　比活性。１単位の活性は、１μＭのβ−ケトアシル−ＡＣＰ縮合生成物 ／分の形成に要求されるタンパク質の量として定義する。 これは、アッセイ条件下に３７℃においてβ−ケトアシル−ＡＣＰ　／分の中に 、（２−１Ｃ）−マロニル−ＣＯ＾とじて供給された、１μＭの〔２−ＩＯ３− マロネートの組み込みとして測定する。シンターセ■■活性の回収は３０ｇのス ピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉から１６４ｍＵであり、比 活性は３１．６ｍ１Ｊ／■ｇタンパク質であった。活性の回収率は３５％であっ た。タンパク質はブラッドフォード（Ｂｒａｄ−ｆｏｒｄ）法（Ａｎａｌｙｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７６）　７２　：　２４８　２５４）により測定する 。 ２、基質の特異性 部分的に精製したスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のシン ターゼＩＩは、デカノイル−ＡＣＰを使用するより、バルミトイル−ＡＣＰの基 質を使用して１２倍いっそう活性である。観測されたデカノイル−ＡＣＰ活性の 少量がシンターゼＩＩがらのものであることを示すために、活性をセルレニン、 すなわち、シンターゼＩ活性の不可逆的阻害剤、に対する感受性について試験す る。シンターゼＩ活性はセルロースリン酸塩に吸着しないので、そのカラムがら の貫流中の活性をセルロースリン酸塩からのシンターゼＩＩ活性のピークと比較 する。各酵素源を５ｍＭのセルレニンと室温において１５分間インキエヘー　ジ ョンシタ後、アシル−ＡＣＰの基質の各で測定する。セルレニンとのインキエベ ーシタン後、デカノイル−ＡＣＰ活性はセルロースリン酸塩の貫流の分画におい て９９％減少し、そしてシンターゼＩＩの分画において６９％のみ減少する。シ ンターゼＩＩ分画におけるバルミトイル−ＡＣＰ活性はセルレニンの処理により 阻害されない。 ３、細胞不含抽出物の調製 ブラシカ・ナブス　（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）を温室の中で１６時間の 光同期下に７６°Ｆ（日中）から６０°Ｆ（夜）の範囲の温度において成長させ る。莢を花成後２４〜２４日に集める。種子を莢から取り出し、液体窒素の中で 凍結し、そして乳鉢と乳棒で粉砕する。粉末を２体積（２＋＋ｌ／ｇ新鮮な重量 ）の５（１ｗＭのリン酸カリウム、２ｍＭのジチオスレイトール合作する緩衝液 ｐＨ７，５で粉砕する。試料を渦形成により１分間混合し、そして１０，０ＯＯ Ｘ　ｇで１５分間遠心して清浄にする。可溶性タンパク質をブラッドフォード（ Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（前掲）により測定する。清浄にしたホモジネートを。ス ピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉から、Ｓｈｉｍａｋａｔａ およびＳｔｕｍｐｆ　（１９８２、前掲）のプロトコルに従い、１０，０００に おける遠心を含むによりつくる。 抽出物を、実施例２に記載するように、内因性β−ケトアシル−ＡＣＰｎｏシン ターゼＩＩ活性について測定する。スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃ ｅａ）の葉の抽出物の中のシンターゼＩＩ活性は２８２ｃｒＵ／ｍｇタンパク質 であった。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の発育する種子の抽出物の中のシンタ ーゼＩＩ活性は１２００μＵ／ｍｇタンパク質であった。 ４、脂肪酸シンターゼ反応 ＦＡＳ反応は、２５０μ夏の体積で、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ　−ＮＨ，ＯＨ緩 衝液、ｐＨ８，０，２ｍＭのジチオスレイトール、４００μＭの各ＮＡＤＨおよ びＮＡＤＰＨｌｌｏ、４μＭのＡＣＰ、　１２ｇＭのアセチル補酵素Ａ、５μＭ の（２−１４Ｇ）マロニル補酵素Ａ　（ＮＥＮ、比活性５５Ｃｉ　１モル）、３ ００μｇのブラシカ。 ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の種子またはスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒ ａ〜ｃｅａ）の葉の細胞不含抽出物からのタンパク質、および変化する量の部分 的に精製したシンターゼＩＩを含む。 スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉からの部分的に精製した シンターゼＩＩをスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のＰＡ Ｓ反応混合物に１．２および３倍過剰で、そしてブラシカ（Ｂｒａｓ−ｓｉｃａ ）の種子のＦＡＳ反応混合物に０．２．０．４および２倍過剰で添加する。反応 を３３℃において１０分間インキュベーションし、そして１μｌのヘキサン−イ ソプロパツール（３：２、Ｖ　：　Ｖ）および６６７μｌの６．６７％（Ｗ／Ｖ ）からの硫酸ナトリウムの添加により停止させる。相を渦形成により３０秒間混 合し、そして４，５ＯＯＸｇで１分間遠心することによって分離する。ヘキサン −イソプロパツール層を吸引により除去し、そして試料を再抽出する。ヘキサン −イソプロパツール抽出液を一緒にし、そしてアクアゾル（Ａｑａｓｏｌ）　（ ＮＥＮ）中でベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　（カリフォルニア州フラートン） 　ＬＳ液体シンチレーションカウンターにより計数する。 ５、検出 ヘキサン−イソプロパツールを抽出液から窒素ガスの流れ下に蒸発させ、そして 脂質を２００μｌのメタノール中で１００μＭの水酸化カリウムｄｅ８０℃にお いて３０分間鹸化する。鹸化した脂質を室温に冷却し、そしてｐＨ８，５におい てメタノール中のＩＮ塩酸でフェノールフタレインの終点に滴定する。メタノー ルを窒素ガスの流れ下に蒸発させる。各試料の中のフェナシルエステルを、１０ ０μｌのｐ−ブロモフェナシル−８（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）　、イリノイ州 ロックフォード）および３００μｌのアセトニトリルと８０℃において３０分間 インキュベーションする。試料を室温に冷却し、４０．ｕｌのＨＰＬＣ等級の水 を添加し、この溶液を４．５ＯＯＸｇで５分間遠心することによって清浄にする 。上澄み液を、水中の８０％のアセトニトリルの中で平衡化したウルトラスフェ ア（Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）　ＯＤＳ逆相ＨＰＬＣカラム（５ミクロンの粒子 サイズ、４．６ａｎＸ２５−曽；ベックマン（Ｂｅｃｋａａｎ）　、カリフオル ニア州フラートン）上に注入する。脂肪酸のフェナシルエステルを水中の８０％ のアセトニトリル中で１鵬ｌ／分で１０分間溶離し、次いで水中の８０〜１００ ％のアセトニトリルの１分の勾配で溶離し、そして最後に１００％のアセトニト リルで１９分間溶離する。エステルの溶離を紫外線の吸収および放射能によりモ ニターする。 スピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉およびブラシカ（Ｂｒａ ｓｓｉｅａ）の発育する種子の両者において、ＦＡＳ系へのシンターゼＴＩの添 加量を増加すると、パルミチン酸の中の放射能は減少し、対応してステアリン酸 の中で検出可能な放射能は増加する。下表において、バルミチン酸塩およびステ アリン酸塩の中の放射能を脂肪酸の中で回収された合計の放射能の百分率として 表す。 表ＩＩＩ スピナシア・オレラセア（Ｓ、　ｏ　１ｅｒａｃｅａ）の葉およびブラシカ・ナ ブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の発育する種子の細胞不含抽出物中の脂肪酸の新規の合 成へのスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のβ−ケトアシル −ＡＣＰシンターゼの効果Ｂ、シンターゼＩＩおよびデサチュラーゼのｌ、スピ ナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のシンターゼＩＩの精製 β−ケトアシル−ＡＣＰのシンターゼ［１を、前述したようにして、スピナシア ・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉から部分的に精製する。 セルロースリン酸塩のカラムからのシンターゼＩＩ活性をセトリプレブ（Ｃｅｎ ｔｒｉｐｒｅｐ）　３０（アミコン・コーポレイシタン（ＡＩＩｉｃｏｎ　Ｃｏ ｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ）　、マサチュセッツ州ダンバース）の中で濃縮する。− ７０℃において貯蔵の間、酵素は活性を損失する。この実験を実施したとき、ｔ Ｉ製物は１０．４μＵ／ｍｇタンパク質の比活性活性を有し、そして濃度は４ｈ Ｕ／ｍｌであった。タンパク質をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）（前掲 ）のマイクロ法によりバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）のタンパク質アフセイ色素試 薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｄｙｅ　Ｒｅｇｅｎｔ）を使用して測定する 。 １単位の活性は、３７℃における還元された生成物の中への１ＭＭの（２−”Ｃ ）マロネートの組み込み７分と定義する。 ２　、Ｃ，ｔｔｎｃｔｏｒｉｕｓの種子のΔ−９デサチュラーゼの精製２．１　 基質。次の工程の各々において、酵素の存在は（９，１０（ｎ）−’Ｈ）ステア ロイル−ＡＣＰ　（これは合成された（９．１０　（ｎ）−３Ｈ〕ステアリン酸 （合成は下に記載する）からＲｏｃｋＳＧａｒｗｉｎおよびＣｒｏｎａｎ　（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　（１９８１）　７２：　３９７ 　４０３）の酵素的合成手順により調製および精製する）からのトリチウムの酵 素触媒の解放を測定することによって輻射線測定的に検出する。 （９，１０（ｎ）−”Ｈ）ステアリン酸は、［９，１０（ｎ）　’Ｈ）オレイン 酸をヒドラジン塩酸塩で、本質的にＪｏｈｎｓｏｎおよびＧｕｒｒ（Ｌｉｐｄｓ 　（１９７１）　６　ニア８　８４）により記載されているようにして還元する ことによって合成する。５．５％ｇの非標識オレイン酸を補充した、（９，１０ （ｎ）　−３Ｈ）オレイン酸（２１Ｉｃｉ）を、２．ｆｆのアセトニトリル中に 溶解し、４０μ！の氷酢酸で酸性にし、そして５５℃に加熱する。還元を１００ μｍの６０％（Ｗ／Ｗ）ヒドラジン塩酸塩で開始する；酵素を混合物を通して連 続的に泡立てて通人する。各時間後、アセトニトリルを添加して体積を２ｍｌに 戻し、そして追加の１００μｌのヒドラジン塩酸塩を添加する。５時間の終わり に、この反応を２ＭのＨＣＩの添加により停止する。反応生成物を３層３ｍｌの アリコートの石油エーテルで抽出し、そして−緒にしたエーテルを水で洗浄し、 硫酸ナトリウムで乾燥し、そして蒸発乾固する。乾燥した反応生成物を１．０ｍ ｌのアセトニトリルの中に再び溶解し、そして−２０℃において貯蔵する。１５ μｌのアリコートの中の脂肪酸生成物の分布はフェナシルエステルの調製により 決定し、次いでこれをメタノール：水：　：９５：　５　（ｖ／ｖ）で展開する Ｃ−１８逆相プレートの薄層クロマトグラフィーにより分析する０通常、（９， １０（ｎ）　−３Ｈ）ステアリン酸への還元は９０％より大きく、少量の未反応 のオレイン酸が残ることがある０分析を使用してステアリン酸塩として存在する 合計の放射能の分画を確立し、これにより酵素のアッセイにおいて正確な基質の 濃度を決定する。 ２．２７フセイ、このアッセイは１５０μＩの水、５＋＊ｌのジチオスレイトー ル（１００ｍＭ、新しく調製した水）、ｌＯμｌのウシ血清アルブミン（水中の １０ｍｇ／ｓｌ）　、Ｌ５ｐ　１のＮＡＤＰＨ（２５ｍＭ、０．１Ｍのトリジ７ −ＨＣｌ　、ｐＨ８，２中で新しく調製した）、２５μＩのスピナシア・オレラ セア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）のフェレドキシン（水中の２層ｇ／ｍｌのシグマ （Ｓｉｇｍａ）　ＩＩＩ型）、３．ｃｒｌのＮＡＤＰＨ：フェレドキシンオキシ ドリダクターゼ（２，５車イ立／ｍｌ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から）、および１ μｌのウシ肝臓カタラーゼ）を混合することによって実施する；室温において１ ０分後、この混合物を２５０μｌの１．４−ビペラジンジエタンスルホン酸ナト リウム（０，１Ｍ、　ｐＨ６，０）を含有する１３　Ｘ　１０（ｌａ＋ｓ＋のね じ込みキャップの試験管に添加する。最後に、測定すべき１０μｌの試料を添加 し、そしてこの反応を３０μｌの基質、（９，１０（ｎ）　−３Ｈ）ステアロイ ル−ＡＣＰ　（１０ｍＣｉ／　＋ｕ＋ｏｌ、０．１Ｍの１．４−ピペラジンジエ タンスルホン酸ナトリウム中の１０ｇＭ、　ｐＨ５，８）を添加することによっ て開始する。キャンプで密閉した後、反応を１０分間２３℃で震盪しながら進行 させる。反応を１．２＋＊ｌの５．８％のトリクロロ酢酸の添加により停止し、 そして生ずる沈澱したアシル−ＡＣＰを遠心により取り出しす、デサチュラーゼ の反応により水性上澄み液の中に解放されたトリチウムを液体シンチレーション スペクトル測定により測定する。１単位の活性は、１ＭＭのステアロイル−ＡＣ Ｐをオレイル−ＡＣＰに転化するために、あるいは４μＭの３　）（７分を解放 するために要求される酵素の量として定義する。 ２．３　組織源　温室で成長した植物からの発育するカルタムス・チンクトリウ ス（Ｃａｒｔｈａａ＋ｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）の種を、花成 後１６〜１８日の間に収穫し、液体窒素の中で凍結し、そして抽出するまで一７ ０℃において貯蔵する。 ２．４　アセトンの粉末の抽出　はぼ５０ｇの凍結したカルタムス・チンクトリ ウス（Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）の種子を液体窒素の中で粉砕し、そして篩が けして大きい種子被膜片を除去して微細な胚粉末する。 粉末をビューヒナ−漏斗上で、すべての黄色の色が濾液から存在しなくなるまで 、アセトンで洗浄する０次いで粉末を空気乾燥し、そして後述するようにさらに 処理するか、あるいは酵素活性を損失しないで一７０℃において少なくとも１年 凍結して貯蔵することができる。乾燥したアセトンの粉末を秤量し、そしてその 重量の１０倍の２０５Ｍのリン酸カリウムｐｎ６．ａで粉砕する；次いでこの混 合物を１２．０００×ｇで２０分間遠心し、そして１層のミラクロス（Ｍｉｒａ ｃｌｏｔｈ）　（カルパイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｓ＋）　、カリフォルニ ア州うジョラ）を通してデカンチージョンする。 ２．５　イオン交換クロマトグラフィー　次いでアセトン粉末抽出物を、２０− Ｍのリン酸カリウムｐｉ（６，８と平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（ワ ットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　ＤＨ−５２）　（１，５Ｘ１２ｅｓ）に適用する 。 通過する緩衝液および１力ラム体積（２０ｍｌ）の緩衝液の洗浄液をプールする 。 ２．６　親和クロマトグラフィー　デサチュラーゼの精製のための親和性マトリ ックスを、高度に精製したＥ、ｃｏｌｉのＡＣＰをＣＮＢｒ活性化セファロース （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ））　と反応させるこ とによって調製する。ＡＣＰ　（１２０ｍｇ）を１＋＊Ｍのジチオスレイトール で氷上で３０分間処理して還元し、次いで０．１Ｍの重炭酸ナトリウムで平衡化 したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１０（ファーマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ））で脱塩する０次いで、処理したＡＣＰ（２０ｍｌ、　６　ｍｇ／ ＋＊ｌ）を０．１Ｍの重炭酸ナトリウムｐＨ７，０の中で膨潤した２０ｍ　ｌの ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂと混合し、そして この混合物を４℃において１日間放置する０次いでこの混合物を遠心し、１回０ ．１Ｍの重炭酸ナトリウムｐ）１７．０で洗浄し、次いで４０ｍ１の０．１Ｍの グリシンｐＨ８，０で４時間室温において処理して未反応の部位をブロックする 。次いでゲルを交互する５０−１の体積の０．１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４，０ 中の０．５ＭのＮａＣ１、および０．１Ｍの重炭酸ナトリウムｐＨ６，５中の０ ．５ＭのＮａＣ１で５サイクルの間洗浄して、共有結合しないリガンドを除去す る。ゲルをカラム（１，５Ｘ　１１．２ｃ＋ｓ）の中に負荷し、そして２０５Ｍ のリン酸カリウムｐｕｅ、ｓの中で平衡化する。 ＤＥ　−５２カラムからの一緒にした分画をこのカラムに適用し、引き続いてこ れを１力ラム体積（２０Ｉｌ＋）の平衡化緩衝液で洗浄し、次いで２．５力ラム 体積（５ｋｌ）の３００Ｍのリン酸カリウムｐＨ６，８で洗浄する０分画をＢＣ Ａタンパク質アッセイ試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（ ピアース　（Ｐｉｅｒｃｅ）　、イリノイ州ロックフォード）を使用してタンパ ク質について測定し、すべての外来のタンパク質が溶離されたことを確認する。 活性Δ−９デサチュラーゼをカラムから６００＋＊Ｍのリン酸カリウムｐ）１６ ．８で溶離する。活性の分画をプールし、そしてアミコン（Ａｓｉｃｏｎ）　８ ４００の攪拌した圧力セルを使用して濃縮する。 タンパク質調製物は０．１３１μＵ／ｓ＋ｇタンパク質の比活性を有し、そして 濃度は３．１５ｍ［Ｉ／曽ｌであった。デサチュラーゼの活性は極めて不安定で あり、デサチュラーゼの精製における最終の工程の直後に実験を進行することを 必要とする。 ３、細胞不含抽出物の調製 細胞不含抽出物は、実施例ＩＡに記載するように、ブラシカ・ナブス（Ｂ、ｎａ ｐｕｓ）の種子から調製する。可溶性タンパク質を、ブランドフォード（Ｂｒａ ｄｆｏｒｄ）　（前掲）のマイクロ法によりバイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のタ ンパク質アッセイ色素試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｄｙｅ　Ｒｅｇｅｎ ｔ）を使用して測定する。ブラシカ・ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の抽出物を、実 施例２に記載するように、内因性β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ活性に ついて、そして前述したように、内因性ステアロイルデサチュラーゼ活性につい て測定する。ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の発育する種子の抽出物において、 シンターゼＩＩ活性を１２８０μＵ／Ｂであった；デサチュラーゼ活性は１３１ μＵ／ｍｇタンパク質であった。 ４、脂肪酸シンターゼ反応 ＦＡＳ反応は、２５０μｌの体積で、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ　−ＮＨ１ＯＨ緩 衝液ｐＨ８，０，２ｍＭのジチオスレイトール、４００μＭの各ＮＡＤＩ（およ びＮＡＤＰＨｌｌｏ、４μＭのＡＣＰ、１２μＭのアセチル補酵素Ａ、５μＭの （２−１４Ｃ）マロニル補酵素Ａ　（ＮＥＮ、比活性５５Ｃｉ１モル）、１５０ μｇの細胞不含抽出物からのブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の発育する種子、お よびスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）の葉のシンターゼＩＩお よび／またはカルタムス・チンクトリウス（Ｃ，Ｌｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）の種子 のデサチュラーゼを含む。 スピナシア・オレラセア（Ｓ、　ｏ　１ｅｒａｃｅａ）の葉からの部分的に精製 したβ−ケトアシル−ＡＣＰのシンターゼｒｒを、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ）の種子のＦＡＳ反応混合物に２．８および１２．６倍の過剰で添加する。部分 的に精製したステアロイルを２．１および９．３倍過剰で添加する。 外因性シンターゼまたはデサチュラーゼとの反応は、その代わり、等しい体積の シンターゼまたはデサチュラーゼの緩衝液を含有する。 反応を３３℃において１０分間インキエヘーショタン、そして１ｍｌのヘキサン −イソプロパツール（３：２、ｖ　：　ｖ）および６６７μｌの６．６７％（Ｗ ／Ｖ）からの硫酸ナトリウムの添加により停止させる。 相を渦形成により３０秒間混合し、そして４５００Ｘｇで１分間遠心することに よって分離する。ヘキサン−イソプロパツール層を吸引により除去し、そして試 料を再抽出する。ヘキサン−イソプロパツール抽出液を一緒にし、そしてアクア ゾル（Ａｑａｓｏｌ）　（ＮＥＮ）中でベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ＬＳ７ ８００液体シンチレーションカウンターにより計数する。 ５、検出 ヘキサン−イソプロパツールを抽出液から窒素ガスの流れ下に蒸発させ、そして 脂質を２００μｌのメタノール中で１００μＭの水酸化カリウムｄｅ８０℃にお いて３０分間鹸化する。鹸化した脂質を室温に冷却し、そしてｐＨ８，５におい てメタノール中のＩＮ塩酸でフェノールフタレインの終点に滴定する。メタノー ルを窒素ガスの流れ下に莫発させる。各試料の中のフェナシルエステルを、１０ ０μｌのｐ−ブロモフェナシル−８（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）　、イリノイ州 ロックフォード）および１００μｌのアセトニトリルと８０℃において３０分間 インキユベーソッンする。試料を室温に冷却し、そしてこの溶液を４　、５００ ×ｇで５分間遠心することによって清浄にする。上澄み液を、水中の８２％のア 七ト二トリルの中で平衡化したウルトラスフェア（ｔｌｌｔｒａ−ｓｐｈｅｒｅ ）　ＯＤＳ逆相ＨＰＬＣカラム（５ミクロンの粒子サイズ、４．６１１＋＊　Ｘ 　２５ｃｍ）　（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　、カリフォルニア州フラート ン）上に注入する。脂肪酸のフェナシルエステルを水中の８２％のアセトニトリ ル中で２ｍｌ／分で１００分間溶離し、次いで１００％のア七ト二トリルで２５ 分間溶離する。エステルの溶離を紫外線の吸収および放射能によりモニターする 。 下表に示すように、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｔｃａ）　ＦＡＳ系に添加するスピナ シア・オレラセア（Ｓ、　ｏ　１ｅｒａｃｅａ）の葉のシンターゼＩＩの物質を 増加すると、バルミチン酸の中の放射能の量は減少し、ステアリン酸の中の放射 能は対応して増加する。カルタムス・チンクトリウス（Ｃ。 ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）の種子のデサチュラーゼの量が増加すると、放射能の量 は測定した飽和脂肪酸（パルミチン酸およびステアリン酸）において減少し、オ レイン酸の中に組み込まれた放射能の量は対応して増加する。最大の体積のデサ チュラーゼをブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のＦＡＳに添加するとき、脂肪酸の 中への１４Ｃ−マロニル補酵素Ａの組み込みは減少する。この効果は、多分、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏのＦＡＳ系を妨害し、したがって添加することができる外因性デ サチュラーゼの量を制限する、デサチュラーゼ緩衝液の成分のためである。 表ＩＶ ブラシカ・ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の発育する種子の細胞不含抽出物により脂 質中への目Ｃマロニル補酵素Ａの組み込みへのスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏ ｌｅｒａｃｅａ）の葉のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＨおよびカルタムス ・チンクトリウス（Ｃ。 ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）の種子のステアロイルデサチェラーゼの効果０　０　２ ０．７２６ ０　２、１　２０．９７１ ０　９．３　１０，２５３ ２．８　０　２０，７８７ ２．８　２．１　２１，３２９ ２．８　９．３　９，６２９ １２．６　０　１９，６５０ １２．６　２．１　１９．４０９ １２．６　９．３　１０，７３６ 下表において、個々の脂肪酸の中の放射能は脂肪酸の中に回収された合計の放射 能の百分率として表されている。値は１つの実験内の二重反復試験のシンターゼ の平均である。複製はこの表に列挙する最後の２つの実験条件について有効では ない。 表■ ブラシカ・ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）の発育する種子の細胞不合抽出物中の新規 に合成された脂肪酸の分布へのスピナシア・オレラセア（Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ ）の葉のβ−ケトアシル−＾ＣＰシンターゼＩＩおよびカルタムス・チンクトリ ウス（Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）　（７）Δ−９デサチュラーゼの効果 ０　０　１２．２±０．４　４７．３±１．２　３６．０±０．８０　２．１　 １１．２±０．６　４０．３±１．０　４５．４±０．４０　９．３　１７．４ ±１．３　２５．６±３．５　５５．６±３．６２．８　０　６．４±０．３　 ６５．６±２．０　１８．７±１．３２．８　２．１　５．９±０．１　６４． ７±０．１　２４．８±０．３２．８　９．３　１１．５±０．３　５０．２± １．１　３０．７±２．０１２．６　０　７．１±０．２　７５．７±０．１　 ６．６±０．７１２．６　２．１　６．２　７７．５　１０．９１２．６　９． ３　９．６　６４．８　１２．４実施例２　シンターゼ活性のアッセイ この実施例において、シンターゼ活性の検出に使用したアッセイを記載する。シ ンターゼ活性の存在を、Ｇａｒｗｉｎら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。 （１９８０）　２５５：　１１９４９−１１９５６）の方法の変法により、（２ −１４Ｃ）マロニル−ＡＣＰのシンターゼ触媒縮合をデカノイル−八ＣＰ　（Ｃ １０−ＡＣＰ）またはヘキサデカノイル−ＡＣＰ（Ｃ１２−八ＣＰ）またはβ− ケトオクタデカノイル−ＡＣＰ　（Ｃ１８−ＡＣＰ）で測定することによって、 放射能的に検出する。生成物を抽出のためにそれらの１，３−ジオールの形態に 還元した後、シンチレーションカウンティングにより組み込みを決定する。 シンターゼのアッセイは、０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６，８）　、１．。 ５ｍＭのＥＤＴＡ、３．１ｗＭのβ−メルカプトエタノール、ｌＯμ単位のマロ ニル−ＣｏＡ−八ＣＰ　）ランスアシラーゼ（ＭＴＡ）　（下に記載するＥ、ｃ ｏｌｉから精製）、５０ＡＩＭのＡＣＰ　（下に記載するＥ、ｃｏｌｉから精製 ）、１００／ＪＭの（２−１４Ｃ）マロニル−ＣｏＡ　（２０Ｃｉ　１モル）　 、６０ｍＭのＣ１６−ＡＣＰまたはＣｌ０−ＡＣＰ　、　５％のグリセロールお よび酵素を２０μ！の合計の反応体積で含有する。 最大の活性のために、ＩＩＴＡおよびＡＣＰを、酵素のアッセイの前に、０．４ μｌの５０＋ｗＭのＥＤＴＡ、０．６μｌの２０μｌのβ−メルカプトエタノー ル、２μｌのＩＭのリン酸カリウム、および１．１２μｍのＨ，Ｏの中で１μｌ の１−門のＡＣＰおよび０．０８μｌのＭＴＡ　（１２９μＵ／曽ｌ）を３７℃ において１５分間インキエベーショタンることによって還元する０次いでこの溶 液を２μｌのＩＭのリン酸カリウム、１．３μｌの１−門のマロニル−ＣｏＡお よび４μｌの〔２−ＩＣ〕マロニル−ＣｏＡ（４７，８Ｃ４１モル）を含有する ７、３μｌの溶液に添加し、そして混合した溶液を室温において２〜５分間イン キエベーシッンしてＭＴＡを平衡に到達させる。　Ｃ１６−ＡＣＰまたはＣ１０ −ＡＣＰのアシル−ＡＣＰを２．５μｍの合計の体積で上の溶液に添加し、そし て試料を３７℃で配置する。 反応をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　、２０％のグリセロール（Ｖ／Ｖ ）、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０−Ｍのβ−メルカプトエタノールの中の５μＭ の酵素の添加により開始する。 反応を１５分後日、１Ｍのリン酸カリウム、０．４Ｍの塩化カリウム、３０％の テトラヒドロフランおよび５−ｇ／霞ＩのＮａＢＨａを含有する４００μｌの還 元剤の添加により停止させ、ここでＮａＢＨａは使用直前に添加する。管を渦形 成して還元剤の添加後よく混合し、次いで３７℃において少なくとも３０分間（ そして３時間まで）インキュベーションする＊　０．４ｍｌのトルエンを添加し 、そして試料を再び渦形成して混合する。試料を１０秒間マイクロ遠心機で遠心 して相を分離する。３００ｐｌのトルエン層（上の相）を５ｍｌのアクアゾル（ Ａｑｕａｚｏｌ）　（ＮＥＮリサーチ・プロダクツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏ ｄｕｃｔｓ）（Ｄｕｐｏｎ）　、マサチヱセノツ州ボストン）に添加し、そして （２−”Ｃ）マロニル−ＣｏＡの組み込みをシンチレーションカウンティングに より決定する。 Ｂ、二二土工虞分互皿製 ｌ　、　Ｅ、ｃｏｌｉからのアシル担体タンパク質の精製１．１ＡＣＰについて のアッセイ　八ＣＰのアッセイは、４０μｌの体積で、１００ｄのトリス−ＨＣ ｌ　、ｐｕｓ、ｏ、１％のトリトンＸ−１００（（Ｗ／Ｖ）（ベーリンガー・マ ンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏｅｈｒｉ−ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、インジアナ州インジアナポリス）、２鵬阿のジ チオスレイトール、５ｍＭのアデノシン三リン酸、２０ｍＭのＭｇＣ１！、３０ ０ｍＭのＬｉＣ１，３３，５μＭの（１−”Ｃ）パルミチン酸（ＮＥＮリチーチ ・プロダクツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｄｕｐｏｎ）　、マサ チュセフツ州ボストン、比活性５６Ｃｉ１モル）　、３２ｍυのアシル−ＡＣＰ シンターゼ（下に記載するように精製した）、および５μｌの測定すべきＡＣＰ 源を含む。各アッセイ管を遠心してすべての液体を管の底に集め、次いで３７℃ において３時間遠心する。各アッセイ管から、４０μｍの体積のうちの３０μｌ を１−の濾紙片上に滴下し、鉛筆で番号を付し、そして真直ぐのピンで懸垂する 。フィルターを少なくとも４５分間空気乾燥し、次いでクロロホルム：メタノー ル：酢酸（３：６：１、ｖ　：　ｖ　：　ｖ）の中で１５ｍ１／フイルターの比 でビーカー内で攪拌しながら２回洗浄する。フィルターをシンチレーションバイ アルの中に入れ、そしてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ＬＳ３８０１液体シン チレーシッンカウンター（Ｂａｃｋ■ａｎｓカリフォルニア州フラートン）の中 の５ｍｌのアクアゾル（Ａｑｕａｚｏｌ）中で計数する。 １対１の化学量論的量をＡＣＰと１　１−Ｃパルミチン酸塩の間で仮定し、生成 物のＩＣ−バルミトイル−ＡＣＰはフィルターに結合し、そして遊離脂肪酸を有 機溶媒の中に洗浄して入れる。 １．２４ＣＰの抽出および精製　アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）をＥ、ｃｏｌ ｉ菌株に−１２からＲｏｃｋおよびＣｒｏｎａｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｓ＋ｏｌ。 （１９８１）７１：　３４１−３５１）の方法の変法により精製する。Ｅ、ｃｏ ｌｉはグレイン・プロセシング・コーポレーション（Ｇｒａｉｎ　Ｐｒｏｃｅｓ ｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ）（アイオア州ムカチン）から凍結した後 期の対数期の細胞として入手することができる。１ｋｇの［！、ｃｏｌｉ　Ｋ　 −１２の包装された凍結細胞を４℃において一夜融解する。室温においてｃＫゐ １リツトルの脱イオン水、５００■ｇのリゾチームにワトリの卵白から、シグマ （Ｓｉｇｍａ））、およびＩＭのトリス−ＨＣｌを含有する２００ｍ１の溶菌緩 衝液、ＩＭのグリシン、２５０−ＭのナトリウムＥ［ｌＴＡ、ｐＨ８，０と一緒 にする。これを室温においてウニトン（Ｗｈｅａｔｏｎ）オーバーヘッド型撹拌 機により攪拌する。２時間後、５ｇのトリトンＸ−１００を添加し、そして攪拌 をさらに１時間続ける。懸濁液をさらに６リツトルのワーリング（Ｗａｒｉｎｇ ）　ＣＯ６型商用ブレンダーの中でブレンドすることによって均質にする。ホモ ジネートの攪拌を再開し、そして２リツトルのイソプロパツールを分液漏斗から 細い流れで２０分かけて添加して、直ちの混合を保証する。 イソプロパツールの添加直後に、ホモジネートを１０，０ＯＯＸ　ｇで室温にお いて３０分間遠心することによって清浄にする。上澄み液のｐＨを氷酢酸で６． ５にし、そしてこれを１０μｍＭのビス〔２−ヒドロキシエチルコイミノトリス 〔ヒドロキシメチルコメタン塩酸塩（ビス−トリス−ＨＣＩ）　（シグマ（Ｓｉ ｇｍａ）、ミゾリー州セントルイス）ｐ）１６．５中のワットマン（１ｊｈａｔ ａ＋ａｎ）　ＤＥ５２（ｌｌｈａｔｍａｎ、ニュージャーシイ州りリフトン）の ４４抛ｌの５０％のスラリーと一緒にする。沈澱物を沈降させ、そして上澄み液 をＤＥ５２とできるだけ急速に一緒にして、引き続く工程におけるフィルターお よびカラムのの詰まりを防止することが重要である。　ＤＥ５２のスラリーを一 夜または少な（とも１時間室温において攪拌し、そして焼結ガラスのフィルター で濾過する。フィルターの漏斗の中のＤＥ５２を２００ｍ１の１０ａ＋Ｈのビス −トリス−ＨＣｌ　、２ｓ＋ＭのＤＴＴ、０．１％（Ｗ／Ｖ）のトリトンＸ−１ ００で５回洗浄し、そして２００ｍ１の１０ｍＭのビス−トリス−ＨＣｌ　、２ ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのＬｉＣ１で４回洗浄する。それを２００ｍ１の最後 の洗浄緩衝液の中に再懸濁させ、そして４．８ｃｓＸ４０ｃｍＯカラムの中に注 ぐ。貫流を大量に集める。　ＡＣＰを２−１ｉ分で１０ｍＭのビス−トリス−Ｈ Ｃｌ　、２■門のＤＴＴ、６００ｍＭのＬｉＣ１で溶離する；６−１の分画を集 める。 放射線測定のアッセイにより、八ＣＰの分画が、また、黄色の汚染物質を含有す ることが決定された後、ＡＣＰ分画をプールのためにそれらの黄色により選抜す る０分画を遠心びんの中にプールし、そして氷上で攪拌しながら、八〇Ｐを５０ ％の水冷したトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終濃度の５％のＴＣＡに清々添加す ることによって沈澱させる。 タンパク質を１０，０００ｘ　ｇで４℃において３０分間遠心することによって 急速に沈降させる。 沈澱物を１０醜ｌの脱イオン水の中に懸濁させ、そして５００μｌのアリコート のＩＭのトリス塩基の添加により、各添加後、手で保持する粉砕ガラスホモジナ イザーの中でホモジナイゼイシッンして可溶化する。　ｐＨ１，０において、溶 液は透明となる０体積を脱イオン水で５０＋ｓｌにし、そして汚染するタンパク 質を２６．１５ｇ　（８０％の飽和）の固体の硫酸アンモニアを氷上で４５分か けて攪拌しながら添加することによって沈澱させる。攪拌を氷上で１時間の間続 け、そしてタンパク質を２３，７ＯＯＸｇで４５分間遠心することによって沈降 させる。前述したように、ＡＣＰをトランスアシラーゼで沈澱させて１ｌｌｉｌ Ｌそして最終の体積を５ｍ１以下に保持しながら、トリス塩基で再可溶化する。 この溶液を２０，０００ｘｇで４℃において２０分間遠心することによって清浄 にする。ＡＣＰの典型的な収量はＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２の１ｋｇの包装した細 胞から８０〜１００ｓ＋ｇである。 ２、Ｅ、ｃｏｌｉカラのマロニル補酵素Ａニアシル担体タンパク質ノドランスア シラーゼ（門ＴＡ）の精製 ２．１？ｌＴＡのアッセイ　ＭＴＡ活性を、室温においてＡｌｂｅｒｔｓら（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９６９）　１４　：　５３　５６ ）のアッセイの変法により測定する。１００μｌの反応混合物は、１００−門の リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６，５，１００μＭのＡＣＰ、１００μＭのマロニル 補酵素Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１０ｎＣ４の（２−１４Ｃ）マロニル補酵 素Ａ（比活性４３．ＩＣ１１モル、ＮＥＮ）、２ｎ＋Ｍのβ−メルカプトエタノ ールおよび酵素を１０μｍの中に含む、ＡＣＰを等しい体積の２０−Ｍのβ−メ ルカプトエタノールと１５分間インキュベーションした後、酵素を排除した反応 混合物の残部に添加する。反応を酵素の添加により開始し、２３℃において４分 間インキュベーションし、そして４００μｌの水冷５％の過塩素（Ｖ／Ｖ）酸の 添加により停止させる。反応を少なくとも２０分間氷上に保持する。沈澱物をミ リボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　ＨＡ、ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　ａｍ マニホールド上の０．４５ミクロンのフィルター（Ｍ　ｉ　Ｉ　ｌ　１ｐｏｒｅ 、マサチュセフツ州ベフドフォード）上に集める。各アッセイ管からの沈澱物を フィルター上で３回５＋＋＋１の水冷５％（Ｖ／Ｖ）の過塩素酸で洗浄する。フ ィルターを５ｍｌの中和または乾燥しないアクアゾル（Ａｑｕａｚｏｌ）　（Ｎ ＥＮ）上に落下させ、そしてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ＬＳ３８０１液体 シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｓａｎ、カリフォルニア州フラートン） で計数する。１単位のＭＴＡ活性は、１μＭの酸可溶性マネロートの酸沈澱可能 なマロネートへの転化７分と定義する。タンパク質の決定は、ブラッドフォード （Ｂｒａｄｆｏｒｄ）のマイクロ法（Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　（１ ９７６）　７２　：　２４８　２５４）により、ノイイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ）のタンパク質アッセイ色素試薬（ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ　Ｄｙｅ　Ｒｅ ｇｅｎｔ）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州すッチモンド）を使用して実 施する。 ２．２？ＩＴＡの抽出および精製　ＭＴ＾は、１ｌｂｅｒｔｓら（Ｍｅｔｈｏｄ ｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９６９）　１４　：　５３　５６）の方法の変法 により、Ｅ、Ｃ０１ｉから精製する。すべての工程は４℃において実施する。分 画をプロトコルの工程の間に４℃において一夜日常的に貯蔵する。グレイン・プ ロセシング・コーポレーション（Ｇｒａｉｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ）（アイオア州ムカチン）から利用可能なＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　− １２の包装された凍結細胞（２０ｇ　）を−夜融解し、次いで１抛Ｈのトリス− ＨＣｌ　、　１１のナトリウムＨＤＴＡおよび１０ｍＭのβ−メルカプトエタノ ールｐＨ７，５を含有する２０ｍ１の緩衝液Ａの中に懸濁させる。細胞をフレン チ・プレフシュアー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）（ア メリカ・インスツルメント・カンパニー（ＡＩｌｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔ　Ｃａ５ｐａｎｙ）　、マリイランド州シルバースプリング）に１６．０ ＯＯｐｓｉにおいて２回通過させることによって崩壊させる。破壊した細胞を４ ０ｍ１の緩衝液Ａで希釈し、そして粒子を１６，０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心す ることによって沈降させる。 上澄み液を緩衝液Ａ中の２０％の溶液（Ｗ／ｖ）からのストレプトマイシン硫酸 （シグマ（Ｓｉｇｍａ））と６０ｍｇのストレプトマイシン硫酸／ｓ＋１の最終 濃度について一緒にする。沈澱物を直ちに１７．５００ｘ　ｇで１５分間遠心す ることによって沈降させる。上澄み液を３体積の緩衝液Ｂ（これは１０ｍＭのリ ン酸カリウム、１ｍＭのナトリウム［！ＤＴＡおよび１０１のβ−メルカプトエ タノールを含有する、ｐＨ７，０）で希釈し、そして緩衝液Ｂの中で平衡化した ＤＥＡＥファースト−フロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）（ファーマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）　、ニュージャーシイ州ピスカタウエイ）の４．８ｃｍＸ１１ｃｍ のカラムに３６０ｍ１／時で適用する。このカラムを２ベッド体積の７５ｇＭの ＬｉＣ１を含有する緩衝液Ｂで洗浄する。　？ｌＴＡ活性をｌベッド体積の勾配 の７５〜２５０＋ｓＭのＬｉＣ１を含有する緩衝液Ｂで溶離する。約２４０ｓ＋ ＩのＬｉＣ１において、ピークのＭＴＡ活性を含有する分画をプールし、そして ？ＩＴＡを含有しないタンパク質を固体の硫酸アンモニウムの添加（２９，５ｇ 　／　１００■１）により沈澱させる。この懸濁液を２０分間撹拌し、次いで１ ６，０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心することによって清浄にする。　？ｌＴＡ活性 を上澄み液への固体の硫酸アンモニウムの添加（１９，７ｇ　／　１００ｍ１） により沈澱させ、これを上のようにして攪拌しそして遠心により沈降させる。沈 澱物を、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのナトリウムＥＤＴＡおよびｌＯ＊ Ｍのβ−メルカプトエタノールを含有する１０−■の緩衝液Ｃ（ｐＨ７，０）で 懸濁させ、そしてセファデックス（Ｓａｐｈａｄｓｘ）　Ｇ　−１００（ファー マシア・インコーホレーテッド（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ　Ｉｎｃ、）　、ニュー ジャーシイ州ビス力タウェイ）の２．５ｃｍｘ４０ｃｍのカラムに適用する。タ ンパク質を６０ｍ１／時で溶離する。ピークのＭＴＡ活性を含有する分画をプー ルし、そして緩衝液Ｄ（これは１５〇−１のＬｉＣ１を含有する緩衝液Ｃである ）中のＤＥＡＥファースト−フロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）の２．５ｃｍＸ４． ７ｃｓＯカラムに６０ｍ１／時で適用する。このカラムを３ベッド体積の緩衝液 りで洗浄し、次いで４ベッド体積の１５０〜３００ｍＭのＬｉＣ１を含有する緩 衝液Ｃを適用する。　ＭＴＡ活性は、Ａｌｂｅｒｔｓら（前掲）が記載したよう に、ＬｉＣ１中よりむしろ１５０＋ｇＭのＬｉＣ１の洗浄液の中に溶離する。ピ ークのＭＴＡ活性を含有する分画をプールし、そしてタンパク質を硫酸アンモニ ウムの添加（６１，１ｇ／１００＋ｓｍ）により沈澱させる。この懸濁液を１時 間攪拌し、そして沈澱したＭＴＡ活性を１６，０ＯＯＸ　ｇで１時間遠心するこ とによって集める。 沈澱物を０．５ｍｌの緩衝液Ｃ中に溶解し、そして１リツトルの緩衝液Ｃに対し て一夜透析する。透析物をポリプロピレン管の中に一７０℃でアリコートとして 貯蔵する。 約３．７単位のＭＴＡ活性がこの方法により２０ｇの包装された細胞から生成さ れる。２．５Ｕ／■ｌの濃縮物として一７０℃において貯蔵するとき、ＭＴＡは その活性の１００％を少なくとも１８力月間保持する。β−ケトアシル−＾ＣＰ シンターゼのアッセイのために、それを１０＋ｗＭのβ−メルカプトエタノール を含有する」２０緩衝液」　（実施例３において下に記載する）の中に希釈する 。 ３、アシル−アシル担体タンパク質のシンターゼの精製アシル−ＡＣＰ　シンタ ーゼは、ＲｏｃｋおよびＣｒｏｎａｎ、　１９７９、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、　Ｖｏｌ、２５４、Ｎｏ、　１５　：　７１１６−７１２２の方法に 従い、次の変化を加えて、精製する。熱処理を排除する。ブルー−セファロース （Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）のカラムからの分画を、５ｍＭのトリス−Ｈ Ｃｌ　、ｐＨ８，０および２％（Ｗ／Ｖ）のトリトンＸ−１００の中で平衡化し たバイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ）　Ｐ　−６０Ｇ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォル ニア州すッチモンド）の２．４ｃｍｘ４０ｃｍＯカラムに２４０＋ｓｌ／時で適 用する。精製を通じて、タンパク質のレベルをピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）　（イ リノイ州ロフクフォード）からのマイクロＢＣＡタンパク質試薬（Ｍｉｃｒｏ　 ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅａ−ｇｅｎ　ｔ）で決定する。 非常に変動性であるが、アシル−ＡＣＰシンターゼの収量は１２５ｇのＥ、ｃｏ ｌｉ　Ｋ−１２の包装された細胞から約５５単位である。１単位の活性は、パル ミチン酸塩およびＡＣＰから１ナノモルのＣ１６：　Ｏ−ＡＣＰ／分を生成する ために要求されるタンパク質の量と定義する。４℃において貯蔵する間、沈澱物 が形成し、これは使用前に懸濁させなくてはならない。 ４、アシル−アシル担体タンパク質の合成および精製ＣＩＯ：　０−ＡＣＰおよ びＣ１６：０−＾ｃｐを酵素的に合成し、そしてＲｏｃｋら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９８１）　７２：　３９７　４０３）の手順により 精製する。β−ケトアシルシンターゼ■およびＵのアッセイのためのアシル−Ａ ＣＰ基賞基質射線標識を必要としないが、十分な１４ｃまたは３Ｈを含めて酵素 の合成後の精製をモニターすることができる。 アシル−ＡＣＰの収量をまたＲｏｃｋら（前掲）に記載されているフィルターの アッセイによりモニターする。合成反応は、ｌｏｍｌの体積で、４．８ｍＭのバ ルミチン酸およびデカン酸の遊離脂肪酸、８００．　ＯＯＯｃｐｍの（９，１０ −’Ｈ）パルミチン酸（ＮＥＮリサーチ・プロダクツ（ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏ ｄｕｃｔｓ）　（Ｄｕｐｏｎ）、マサチュセツツ州ボストン、比活性２８．５Ｃ ｉ　／　ｍＭ）またはｃｔ−”Ｃ）デカン酸（ＩＣＮバイオメディカルス・イン コーホレーテッド（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、）、カリフォルニア州 コスタメサ、比活性３．６Ｃｉ１モル）、１００ｍＭのトリス−１（ＣＩ　、、 ｐＨ８，０，５ｍＭのアデノシン５°−三リン酸、２ｍＭのジチオスレイトール 、２％のトリトンＸ−１００（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（ Ｂｏｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｒ＋ｈｅｉｓ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ） 　、インジアナ州インジアナポリス）、４００ｍＭのＬｉＣ１，１０ｍＭの−ｇ ｃ１ｇ、　１５５Ｍの＾ｃｐおよび３単位のアシル−ＡＣＰシンターゼを含む、 この混合物を３７℃において３時間インキエベーシッンし、そして室温において 約１５時間または一２０℃において精製するまで貯蔵することができる。 合成混合物からのアシル−ＡＣＰの精製は、Ｒｏｃｋら（前掲）の手順に従い次 の変化を加えて実施する。遊離脂肪酸はＯＨ−５２のカラムに結合しないことが 発見されたので、２−プロパツールを使用する洗浄は省略する。しかしながら、 平衡化緩衝液によりＤＢ　−５２を洗浄する体積を増加して、トリトンＸ−１０ ０の除去を保証する。オクチル−セファロース（Ｓｓρｈａｒｏｓｅ）　（ファ ーマシア・インコーホレーテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）　、ニュー ジャーシイ州ビスカタウェイ）のいくつかのロフトはアシル−八〇Ｐの吸着を可 能としない、したがって、試験のカラムは各折しいロフトの樹脂を使用して展開 する。はとんどの場合において、５０％の２−プロパツールがアシル−ＡＣＰの 完全な回収に要求される。第２　ＤＢ　−５２カラムを省略する；その代わり、 ５０％の２−プロパツール中のアシル−ＡＣＰを凍結乾燥によるか、あるいはス ピードバク−コンセントレータ−（ＳｐｅｅｄＶａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏ ｒ）（サバント・インスツルメンツ・インコーボレーテ・ノド（ＳａｖａｎｔＩ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）　、ニューヨーク州ヒツクスビレ）の中で乾 固し、そして脱イオン水で再構成する。基質を一７０℃において貯蔵する。 典型的な収量は１．７μＭのバルミトイル−ＡＣＰまたは０．５μＭのデカノイ ル−ＡＣＰである。 実施例３　シンターゼタンパク質の精製この実施例において、トウゴマ（Ｒｉｃ ｉｎｕｓ　ｃｏｍｓｕｎｉｓ）の発育する種子からのβ−ケトアシル−ＡＣＰシ ンターゼの精製を記載する。タンパク質の精製のすべての工程は４℃においてま たは氷上で実施する。リシン、すなわち、属性の種子のタンパク質が除去されて しまうまで、すべての工程はプローブボックスの中で、あるいは適当な予防手段 を使用して毒素への暴露を防止する。 Ａ、皿■ １、組織源 トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）を温室の中で次の条件下に成長 させる。 ：温度範囲は２２〜３２℃である。 ：照明は１６時間の日中の長さに設定する（補助の照明は高圧ナトリウムランプ である） ：肥料は散水により毎日６０ｐｐ園の窒素である発育する種子は開花後２１〜２ ８日に収穫する。胚乳を取り出し、そして液体窒素の中で凍結し、そしてシンタ ーゼ活性の精製のために使用するまで、−７０℃において１８力月まで貯蔵する 。 ２、精製緩衝液 β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの精製において使用した緩衝液は、ｐＨ７， ５であり、そして２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロール、１ｍＭのナトリウムＥＤＴ ＾、ｌｏｓＭのβ−メルカプトエタノール、および緩衝液の名称に表示されてい るミリモル濃度のリン酸カリウムである。例えば、ｒｚｏｍ衝液」は２０＋＊Ｍ のリン酸カリウムを含有する。例外は「ゼロ緩衝液」であり、これはリン酸カリ ウムのみを欠如し、そしてほぼ５のｐＨを有する。 ３．２００ｇのバッチの凍結組織をオステライザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｅｒ）ブレ ングーで１５秒間トップスピードで４００ｍ　ｌの４０緩衝液の中でホモジナイ ゼイシッンし、この４０Ｉｌ衝液は、また、次のプロテアーゼ阻害剤を含有する ：１−のアミノカプロン酸、１μＭのロイペプチン、１μＭのペプスタチンおよ び１００μＭのフン化フェニルメチルスルホニル、ブレンディングを１５秒に限 定して多すぎる種子の脂質の解放を防止し、これは存在する場合引き続く硫酸ア ンモニウムの分別を妨害する。粗製のホモジネートを１６．０００Ｘ　ｇで１時 間遠心することによって洗浄する。上澄み液、分画Ａ、は、可溶化されたβ−ケ トアシル−ＡＣＰのシンターゼ活性を含有する。 Ｂ−Ｐ　アンモニウムの　１ 分画Ａをチーズクロスおよびミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）　（カルバイオ ケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｓ）　、カリフォルニア州うジッラ）を通してデカン テーションし、そして硫酸アンモニウム（４０，４ｇ　／　１００ＩＩりととも に１時間攪拌する。沈澱したタンパク質を１６，０ＯＯｘ　ｇで１時間遠心する ことによって沈降させる。β−ケトアシル−ＡＣＰのシンターゼ活性を含有する 上澄み液、分画Ｂ、を、硫酸アンモニウム（１３，４ｇ　／１００ｍ１）ととも に１時間撹拌し、そしてタンパク質を１６，０００ｘ　ｇで１時間遠心すること によって沈降させる。この硫酸アンモニウムの沈澱物、分画Ｄ、を、最小体積の ｒ２０１１衝液」の中に懸濁させ、そして−７０℃において貯蔵する。 分ｉｌＤを「２０緩衝液」で１６５０ｍ１の最終体積に希釈する。次いで、分画 りをｒ２０！ｌ衝液」の中で前以て平衡化した２００ｍ１（包装されたベッド体 積）の反応性グリーン１９アガロース（Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｇｒｅｅｎ−１９Ａ ｇａｒｏｓｅ）　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　ミゾリー州セントルイス）と−緒に する。 グリーン１９アガロースを焼結ガラスのフィルターで濾過し、そして２００ｍ１ の「５０緩衝液」で洗浄する。洗浄したグリーン１９アガロースを追加の１７５ ■１のｒｓｏｍ衝液」の中に懸濁させ、そして４．８ｃ＋ｍＸ３０ｃｍのカラム の中に注ぐ、最後の「５０緩衝液」がグリーン１９アガロースのベッドの上部に 到達するまで、アガロースを２００ｍ１／時で詰める０次いでシンターゼ活性を ｒ　２５０１１衝液」で溶離する。シンターゼ活性は最初の１００■ｌのｒ　２ ５０１１衝液」の中に溶離する９分画を一２０℃において精製の次の工程まで貯 蔵する。 Ｄｌ　＾ｃｐ−クロマトグーフィー 高度に精製されたＥ、ｃｏｌｉのＡＣＰをＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐ ｈａ−ｒｏｓｅ）　４　Ｂと、ＭｃＫｅｏｎおよび５ｔｕｓ＋ｐ（Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｓｍ、　２５７：　１２１４１−１２１４７）の手順の変更により後述す るように反応させることによって、シンターゼ活性の精製のためのマトリックス を調製する。 １、マトリックスの調製 １４１ｓ＋ｇのＥ、ｃｏｌｉのＡＣＰを４０−■の体積で３体積の１リツトルの １０〇−阿のＮａＨＣＯ，、ＧＩＨ６，Ｏｌに対してスペクトレイバー（Ｐｅｃ ｔｒａｐｏｒ）　＃　７の透析管（分子量のカットオフ−２０００）内で２４時 間の間透析する。 １ミリモルのジチオスレイトールを第２緩衝液の供給の中にのみ、合計３時間の 間、含める。１００諺ｌの１ｍＭのＩＩｃＩを、２５０ｍ１の０ポリプロピレン の遠心びんの中の６．０ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ）に添加する。これを高速で１５分間室温において、「ブラッド・ロティター（ Ｒｕｇｇｅｄ　Ｒｏｔａｔｏｒ）　Ｊ　（クラフト・アパラタス・インコーレー テッド（Ｋｒａｆｔ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ、　Ｉｎｃ、）、−３−−ヨーク州ミ ネオラ）フェリスーホイール型ミキサーで混合する。生ずるスラリーをコンテス 　（Ｋｏｎｔｅｓ）　にュージャージイ州バインランド）２．５ｃｍｘ２０ｃｍ Ｏカラムの中に注ぎ、そして１．１リツトルの１ｗＭのＨＣＩで２５０ｍ１／時 で室温において最初の２時間洗浄し、次いで４℃において乾燥する。次いで、Ｃ ＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を６０輪１の焼結ガラスのフ ィルターの中で５回２０ｍ　ｌの１００ｍＭのＮａＨＣＯｓ、ｐＨ６，０、で洗 浄し、次いで５回２０ａ＋　１の１００ｍＭのＮａＨＣｏｌ、ｐＨ７，０、で洗 浄する。 次いで、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を４０＋ｗｌの１ ００＋ｗＭのＮａＨＣＯｓ、ｐＨ７，０、の中に再懸濁させ、そしてきれいな２ ５０ｍ１のポリプロピレンの遠心びんに移す、透析したＡＣＰをＣＮＢｒ活性化 セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のスラリーに添加し、そしてこの懸濁液を 「ブラッド・ロティター（Ｉｉｕｇｇｅｄ　Ｒｏｔａｔｏｒ）　Ｊミキサーで４ ℃において２４時間混合して、ＡＣＰをＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）にカンブリングさせる。ＡＣＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅ）を４℃において１１００Ｘで６分間遠心（ベックマン（ＢｅｃｋｍａｎＧＰ テーブルトップの揺動バケツの遠心機内で８０Ｏｒｐｍ）することによって沈降 させる。上澄み液を取り出し、そしてアッセイのために取って置＜　、　５０＋ ｗｌのＩＭのエタノールアミンｐＨ８，０をＡＣＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）に添加し、そして４℃において「ブラッド・ロティター（Ｒｕｇｇｅ ｄ　Ｒｏｔａ−ｔｏｒ）　Ｊ上で１６時間混合して、未使用の結合部位をブロッ クする。 ２、カラムの充填 ＡＣＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ゲルを２．５ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ のカラムの中に注ぎ、そして１００ｍ１の５００ａ＋ＭのＮａＣｌを含有する１ ００ｍＭのＮａＨＣＯ：＋、ｐＨ７，０、で洗浄し、次いでさらに１００ｍ１の ５００５ＭのＮａＣｌを含有する１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４，０、で 洗浄する。交互する結合を使用するこの洗浄を３回反復する。次いでゲルを２０ ０１の重炭酸ナトリウムで洗浄し、そして最後に２００ｍ１の「２０緩衝液Ｊ　 ＋０．０２％のアジ化ナトリウムで洗浄する。このゲルをこの緩衝液の中にさら に使用するまで放置する。結合しない分画をタンパク質についてブラッドフォー ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）　（Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、（１９７６） 　７２：　２４８　２５４）の方法により測定し、そしてＡＣＰの１３４ｍｇが ２５ｍ１の（：ＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合したこ とが計算された。タンパク質の試料の適用前に、ＡＣＰ−セファロース（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅ）を２．５ｃ＋ｗ　ｘ　ｌＱｃｍのカラムの中に詰め、そして２５ ０■Ｈの「２０緩衝液」で洗浄する。詰めたベッドの最終体積は２５−■である 。 ３、試料の調製 グリーン１９アガロースのクロマトグラフィーからのシンターゼ活性をもつ分画 を、ＰＨ１０膜をもつアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　８４００の攪拌した圧力セル 装置（Ａｍｉｃｏｎ、マサチェセフッ州ダンバース）の中で一緒にする。空にし た分画管を等しい体積の「ゼロ緩衝液」ですすぎ、そしてすすぎ液をプールした 分画に添加する。濃縮物の体積がもとの溶液の体積の１０％になるまで、窒素ガ スで圧力を加える０次いで圧力を解放し、そして攪拌を追加の５分間続ける。ベ ックマン（Ｂｅｃｋｓ＋ａｎ）の導電度メーターで測定して、導電度がｒ　１０ １１衝液」のそれに到達するまで、濃縮物を「ゼロ緩衝液」で希釈する。 ４、グリーン１９アガロースからの分画のクロマトグラフィーシンターゼ活性を 含有する希釈した試料をＡＣＰ−セファロースのカラム上に１００ｓｌ　７時の 流速で負荷し、そしてこのカラムを１ベッド体積のｒ２０１を衝液」で洗浄する 。貫流およびｒ２０１１衝液」の洗浄液を大量に集め、そして６＋Ｉの分画を溶 離の間に集める。タンパク質を２５ｍ１／’時で５ベッド体積のｒ　ｉｏｏｍ衝 液」で溶離し、次いでＩＯ・＼ノド体積の勾配の「２５０緩衝液」で溶離する。 勾配後、合計７２の分画が集められるまで、カラムを追加のｒ　５ｏｏｎ衝液」 でで洗浄する。このカラムを１０ベッド体積のｒ　５００！１衝液」で洗浄し、 次いで１０ベンド体積の「２０緩衝液」で洗浄することによって再生する。使用 していないとき、カラムを保存剤として０．０２％のアジ化ナトリウムを含有す る「２０緩衝液」の中に貯蔵する。 ５１、シンターゼ活性についての分画のアッセイ分画をＣ１６−ＡＣＰおよびＣ １０−ＡＣＰの縮合活性について測定した。 Ｃ１６−ＡＣＰの縮合活性の主要なピークは分画３２〜４４において溶離した。 　Ｃ１Ｏ−ＡＣＰの活性の一部分はＣ１６−ＡＣＰの縮合活性とともに溶離する が、Ｃ１０−ＡＣＰの大部分はＣ１６−ＡＣＰのピーク後に溶離し、時には初期 のピークに対する広い肩として溶離した。 Ｅ、５Ｏ５−ＰＡＧＥ　およびペプチドの　層ＡＣＰＣモーァロースのカラムの 分画を、ドデシル硫酸ナトリウム中のポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤ Ｓ　−ＰＡＧＥ）によりＬａｅ＋＋＋＊Ｉ　１（Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　 ２２７　：　６８０−６８５）の方法の変法に従い分析する０分割ゲルは、標準 の０．２６７％の代わりにわずかに０．２％のビス−アクリルアミドを含有する 。パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　（カリフォルニア州すッチモンド）のプロ ティーン（Ｐｒｏｔｅａｎ）　ＩＩミニ−ゲルのユニットを２００　Ｖで使用す る。トラッキングの色素がゲルの端に到達するまで電流を流し、次いでさらに１ ０分間流す、これは２つの主要なペプチドのバンドの分離をよりよくする。シン ターゼ活性の第１ピークの分画は、Ｃ１６−ＡＣＰの縮合活性の大部分を含有し 、はぼ等しい銀染色強度をもつ４６ｋＤおよび５０ｋＤの両者のバンドを含有す る。Ｃｌ０−ＡＣＰの縮合活性のほとんどは、Ｃ１６−＾ｃｐの縮合活性後に溶 離し、いっそうかすかに染色する５０ｋＤのバンドに関連する。記載したように 、シンターゼの分画を集め、濃縮および脱塩し、そしてタンパク質をＳＯ５−Ｐ ＡＧＥ電気泳動により大量に分離する。２００ｇの新鮮な重量の胚の種子組織か ら、はぼ５０μｇの各４６ｋＤおよび５０ｋＤのタンパク質が回収される。 Ｆ、簾１孟二ヱ沙 精製の各工程におけるタンパク質の回収およびシンターゼ活性をＦ表に表す。 却ｌ Ｒ９ωｍａｗ　ｉ　ｓのβ−ケトアシル−虹シンターゼＩの精製１ＬＭＭＩＡｌ ｉの５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルからの大まかな推定表Ｖｌ！ Ｒ９ω−ｕｎｉｓのβ−ケトアシル−虹シンターゼＩＩの［ロース １、ゲル電気泳動 ＡＣＰ−セファロースのカラムからの物質を、実施例３Ｅに前述したように調製 した、１．５ｍｍの厚さのＳＤＳ還元した架橋体のミニ−ポリアクリルアミドゲ ルに適用する。ゲルを展開する一夜前に、分割ゲルを注ぐ；スタフキングゲルを 同じ日に注ぐ、各＾ＣＰＣモーァロースのカラムのプールは、４０〜６０μｇの タンパク質を含有する。タンパク質を各１０であろう、の２つのゲルの間で分割 し、各レーンは２〜３μｇのタンパク質を含有する。ゲルを実施例３Ｅに前述し たように展開する。電気泳動後、ゲルをバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のミニ ・トランス−プロット（Ｍｉｎｔ　Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ）モジュール（Ｂｉｏ −Ｒａｄ。 カリフォルニア州すッチモンド）の中にアセンブリングし、そしてタンパク質を ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）の膜にエレクトロブ ロッティングする。 ２、ニトロセルロースへのエレクトロブロッティングタンパク質をニトロセルロ ースへエレクトロプロフチインクスルとき、ブロッティング時間は１時間であり 、そして使用する緩衝液は２０％のメタノール中の２５ｄのトリス、１９２１の グリシンである。 ニトロセルロースへのエレクトロブロッティング後、膜を１％（Ｖ／Ｖ）酢酸中 の０．１％（Ｗ／Ｖ）ボンセラ（Ｐｏｎｃｅａｕ）　Ｓの中で２分間染色し、そ して各交換について２分で、０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸の２〜３回の交換で脱染色 する０次いで、ニトロセルロースの膜を一２０℃においてヒートシールいたプラ スチックのバッグの中に湿潤貯蔵する。本来、ニトロセルロースの膜を１％の酢 酸の中で脱染色し、次いで貯蔵前にＨＰＬＣ等級の水ですすぐ。しかしながら、 染色されたバンドは中性のｐｔｌにおいて急速に色あせるので、脱染色溶液を０ ．１％の酢酸に変え、そして膜をまたこの溶液の中に湿潤貯蔵する。 時間が許す場合、プロットを凍結しないで、消化のために直ちに使用して、後述 するようにアミノ酸配列の検出のために使用する。 ３、ＰＶＤＦへのプロッティング タンパク質をＰＶＤＦにエレクトロブロッティングするとき、プロッティング時 間は３０分であり、そして使用する緩衝液は１０％（Ｖ／Ｖ）のメタノール中の １２５■ｉのトリス１５０ｍＭのグリシンである。　ＰＶＤＰへのエレクトロブ ロッティング後、膜を５０％（Ｖ／Ｖ）のメタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸 中の０．１％（Ｖ／Ｖ）のクーマフシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｔｅ　Ｂｌｕｅ ）の中で５分間染色し、そして各交換について２分で、５０％（Ｖ／Ｖ）のメタ ノール／１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸の２〜３回の交換で脱染色する０次いで、ｐｖ ｏｐ膜を３０分間空気乾燥し、ついでヒートシールしたプラスチックのバッグの 中で一２０℃において乾燥貯蔵する。　ＰＶＤＦにプロッティングしたタンパク 質を直接使用して、完全なタンパク質のＮ−末端の配列を決定する。 実施例４　アミノ酸配列の決定 この実施例において、植物のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼのアミノ酸配列 を決定する方法を記載する。 Ａ、肚 ニトロセルロースヘプロッテイングしたタンパク質をプロテアーゼで消化して、 配列決定のためのペプチドを得る。使用する方法は、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら（Ｐ ＮＡＳ　（１９８７）　８４　：　６９７０）の方法である。４６ｋＤおよび５ ０ｋＤの両者のタンパク質のバンド、およびまた、対照として使用すべき等しい 量のブランクのニトロセルロースをニトロセルロースの膜から切り取り、ｌＸ２ １ｍ１１の大きさの片に細かく切り、そしてＨＰＬＣ等級の水で数回洗浄してポ ンセラ（Ｐｏｎｃｅａｕ）　Ｓを除去する。プ占フトが凍結している場合、ボン セラ（Ｐｏｎｃｅａｕ）　Ｓは常に除去可能であるわけではないが、染色の存在 は明らかに消化手順への作用をもたない、この洗浄後、０．５％の酢酸中の１． ０〜１．２ｍｌの０．５％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ　−４０、アルドリ ッヒ　（Ａｌｄｒｉｃｈ）　、ライスコンシン州ミルウォーキー）を膜の片に添 加し、そしてこの混合物を３７℃において３０分間インキュベーションする。Ｐ ＶＰ　−４０は、プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼ消化により解放され たペプチドに結合するであろうニトロセルロース上の部位をブロックするために 必要である。　ＰＶＰ−４０による処理後、膜の片を１．０ｍｌのＨＰＬＣ等級 の水で数回すすいで過剰のＰＶＰ　−４０を除去する。次いで、片をトリプシン 消化緩衝液、１００＋＊Ｍの炭酸ナトリウムｐＨ８，２、あるいはｇｌｕｃｉｉ 衝液、２５５Ｍの炭酸アンモニウム／１−ＭのＥＤＴＡ、ｐ）１７．８、の中に 懸濁させる。アセトニトリルを消化混合物に５％（ｖ／ｖ）の濃度に添加する。 プロテアーゼ、トリプソンまたはエンドプロテイナーゼｇｌｕｃを消化緩衝液の 中で希釈し、そして消化混合物に１：１０（Ｗ／Ｗ）のプロテアーゼ／タンパク 質の比で添加する。消化混合物の最終体積は１００μｌである。トリプシン消化 物を３７℃にお０てインキュベージランし、そしてエンドプロテイナーゼｇｌｕ ｃ消化物を室温においてインキュベージランする。 Ｂ、と１エヱ至立鳳 一夜のインキュページせンの後、消化反応を１０μｌの１０％（Ｖ／Ｖ）のトリ フルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加により停止する。消化混合物をニトロセルロース 片から除去し、ニトロセルロース片を１〜５×１００βｌの体積のｏ、ｏｓ％（ ｖ／ｖ）のＴＰＡで洗浄し、そしてこれらの体積をスピード−バク（Ｓｐｅｅｄ −Ｖａｃ）　（サバント（Ｓａｖａｎｔ）　；ニューヨーク州ファーミングデイ ル）の中で１００μ！より小さい体積に濃縮する。次いで、これらの濃縮物、を アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　（ カリフォルニア州フォスターシティ）１３０型高性能液体クロマトグラフィーの 中に設置されたＶｙｄａｃ逆相タン、＜り質およびペプチドＣ１８カラム（２， １鍵■Ｘ　Ｌｏｏｍｍ）の上に注入する。ペプチドの溶離に使用した移動相は、 次の通りであった。ｍ衝液Ａ：０．１ｍＭのリン酸ナトリウム、ＰＨ２，２；緩 衝液Ｓ：Ｏ，ｔ■−のリン酸ナトリウム中の７０％のアセトニトリル、ｐＨ２， ２，２時間にわたる１０〜５５％の緩衝液Ｂ、５分にわたる５５〜７５％の緩衝 液Ｂ、および１５分間の７５％の緩衝液Ｂイソクラティックの３段階の勾配を５ ０μｌ／分の流速で使用する。ペプチドを２１４ｎ−で検出し、手により集め、 次いで一２０℃において貯蔵する。 初期の消化実験において、ＰＶＰ　−４０は不完全に除去され、そして５０％の 緩衝液Ｂで広いピークとして溶離された。非常にわずかのペプチドがこれらの実 験から回収された。ＰＶＰ　−４０のピークを集め、次いで等しい体積のクロロ ホルムで処理してＰＶＰ　−４０を抽出した。 次いで、水性物質をアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ− ｓｙｓｔｅｍｓ）のＨＰＬＣに、上のようにして、再び適用したが、ただしこの 場合において緩衝液Ａは０．１％のＴＦＡであり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中 の０．１％のＴＦＡであり、そして使用したカラムはアプライド・ハイオシステ ムス（八ｐρ１ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州）ｔスター シティ）の逆相スフエリ（Ｓｐｅｒｔ）　５ＲＰ１８カラム（１＋＋ｍｘ５０＋ ｓ＋ｅ）であった。勾配および流速は上の通りでありそして、同一方法において 、ピークを集め、濃縮し、そして貯蔵した。 後期の消化実験において、ＰＶＰ　−４０は完全に除去され、そしてクロロホル ムの抽出は不必要であった。ＰＶＰ　−４０を完全に除去するために、ニトロセ ルロース片を多数体積の水（８ｘ４＋＊１）で洗浄し、分光光度計で２１４ｎｍ における吸収を検査する。また、ＰＶＰ　−４０の処理および洗浄後まで、バン ドを小さい片に切断しない場合、ｐｖｐ　−４０はいっそう容易に除去される。 これらの２つの変更はＰＶＰ　−４０を使用する妨害の問題を排除する。 Ｃ、シス−イン　の−およびアルキルヒ消化したタンパク質をβ−メルカプトエ タノールで還元し、そして３Ｈ標識したヨード酢酸でアルキル化することができ 、この方法はペプチドを配列決定するとき、システィン残基の同定を改良する。 β−メルカプトエタノールを新しく消化したタンパク質に試料の中のスルフヒド リル基の仮定された濃度を越えた２０：１のモル比で添加し、そしてペプチドを 室温において３０分間インキュベーションする０次いで３Ｈ標識したヨード酢酸 をβ−メルカプトエタノールの濃度の１．１倍の濃度で添加し、そしてペプチド を暗所で（はくでカバーして）室温において６０分間インキュベーションする。 アルキル化を停止するために、さらにβ−メルカプトエタノールをペプチドの還 元に使用した濃度の１／１０の濃度で添加する。次いで１０μｌの１０％のＴＦ Ａを通常のように添加して、プロテアーゼのそれ以上の作用を停止させる。これ は還元／アルキル化の前に添加することはできない。なぜなら、これらの反応は 消化混合物の中に存在する塩基性のｐＨの条件下に最良に働くからである。次い で、還元／アルキル化されたタンパク質を、前述したように、ＨＰＬＣによるペ プチドの分離の前に、スピード−バク（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）の中で濃縮する。 Ｄ、タンパク　およびペプチドのＮ−　ｒの　１゛すべての配列決定は、アプラ イド・バイオシステムス（ＡＩ）Ｉ）ｔｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　４７７ Ａ型パルスト−液相タンパク質配列決定装置でエドマ（Ｅｄｍａｎ）消化により 実施する；配列決定装置により生成されたフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ） アミノ酸を、オンラインのアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅ＋ｍｓ）　１２ＯＡ型ＰＴＨアナライザーにより分析する。デー タを集め、そして配列決定装置のオンボードコンピューターにおよび、また、Ｐ Ｅ　ＮＥＬＳＯＮ，　Ｉｎｃ．（カリフォルリニア州キュベーチノ）からのＡＣ ＣＥＣＣ＊ＣＨＲＯＨを使用するディジタル・ミクロヴアクス（Ｄｉｇｉｔａｌ 　Ｍｉｃｒｏｖａｘ）に記憶させる．配列のデータをチャートレコーダー（これ はＰＴＡアナライザーからのインプットを受け取る）から読み取り、そして配列 決定装置のオンボードのコンピューターシステムから得られた定量的データを使 用して確証する。すべての配列のデータは、２人のオペレーターにより、データ 分析システムの助けにより独立に読み取られる。 ＨＰＬＣからピークとして得られたペプチドの試料について、試料をポリブレン （Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）　コーティングされたガラス繊維のフィルター（アプラ イド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　、カリフ ォルニア州フォスターシティ）（これはは配列決定装置における３つのブレーサ イクルにかけられている）上に負荷する。還元およびアルキル化されたペプチド について、各引き続くサイクルからのＰＴＡ−アミノ酸生成物の一部分を液体シ ンチレーションカウンターで計数する。　ＰＶＤＦにエレクトロブロッティング されたタンパク質の試料について、問題のバンドを切り出し１、次いでポリブレ ン（Ｐｏｌｙ−ｂｒｅｎｅ）コーティングされたガラス繊維のフィルタ・−の上 に置き、上のようにしてブレーサイクルにかけ、そして反応カートリッジを製造 業者の規格に従い゛アセンブリングする。 少量の試料（５〜３０ピコモル）からタンパク質の配列を得るために、４７７＾ 変換サイクルおよび１２０Ａアナライザーは、Ｔｅｍｐｓ　ｔおよびＲｉｖｉｅ ｒｅ（Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｅｈｅａａ、　（１９８９）　１８３　：　２９ ０）に記載されている通りである。 トリプシンおよびｇｌｕｃの消化の工程から発生した断片を第２図および第３図 に表す、他のプロテアーゼを使用してシンターゼのタンパク質を消化することが でき、これのプロテアーゼは次のものを包含するが、これらに限定されない：　 １ｙｓｃおよびａｓｐＮ、個々の消化緩衝液の条件は異なることがあるが、消化 のプロトコル、ペプチドの分離、精製、および配列決定はトリプシンおよびｇｌ ｕｃを使用する消化について概説したものと実質的に同一である。あるいは、シ ンターゼは次のものを使用して化学的に消化することができる：臭化シアン（Ｇ ｒｏｓｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　［ｉｎｚｙｍｏｌ、　（１９６７）　１１　：　 ２３８−２５５またはＧｒｏｓｓおよび一１ｔｋｏｐ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｓ＋ 、Ｓｏｃ、　（１９６１）　８３　：　１５１０）　、ヒドロキシアミン（Ｂｏ ｒｎｓｔｅｉｎおよびＢａ１ｉａｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（ １９７７）　４７　：　１３２−７４５）、ヨードソ安息香酸（Ｉｎｇｌｉｓ、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ！ｎｚｙｍｏ１．　（１９８３）　９１：３２４−３３２ ）、または温和な酸（Ｆｏｎ　ｔａｎａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｗｏｌ、 （１９８３）９１：　３１１−３１７）、反復する参考文献に記載されているよ うに。 実施例５　シンターゼタンパク質を区別する方法この実施例において、シンター ゼタンパク質をセルレニンで選択的に標識する方法および原核生物の中でシンタ ーゼ活性を発現する方法を記載する。 Ａ、皇西士正弓りｌ１１：２ｉ １、セルレニンを使用するシンターゼ■およびＩＩの区別セルレニンはシンター ゼＩおよびＩＩの活性部位に結合することが示された。スピナシア・オレラセア （Ｓ、ｏｌｅｒａｃｅａ）において、５μＭの１度で、セルレニンはシンターゼ Ｉの活性部位と容易に反応するが、シンターゼＩＩと反応しない、しかしながら 、セルレニンは５０μＭ以上の濃度において両者のシンターゼ■およびＩＩと容 易に反応するであろう（ＳｈｉｍａｋａｔａおよびＳｔｕｍｐｆ、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 （１９８２）７９　：　５８０５−５８１２）。セルレニンは、第１図に示すよ うに、トウゴマ（Ｒ，ｃｏ■ａｕｎｔｓ）のシンターゼ■およびシンターゼＩＩ との同様の反応を示す、引き続（ゲル分析およびタンパク質の配列決定のための シンターゼ■およびシンターゼＩＩを示差的に標識して活性部位を決定するため に、３Ｈ−セルレニンをシンターゼ活性を含有する濃縮したポスト−ＡＣＰ−セ ファロース（実施例３）と２つの異なる３Ｈ−セルレニン濃度において反応させ る０次いで試料をＬａｅ■−１ｉのＳＯＳ　−ＰＡＧＥ上に展開し、そして３Ｈ −標識されたタンパク質の分子量をシンチレーションカウンティングにより決定 する。タンパク質および３Ｈ−標識の両者を含有する候補のバンドをエンドプロ テイナーゼｇｌｕｃで消化し、そしてペプチドをエドマン（Ｅｄ＋ｍａｎ）化学 により分離および配列決定する。 ２、放射線標識したセルレニンの調製 〔３Ｈ〕−セルレニン（比活性”　５８５Ｃｉ１モル）　ヲ、非標ｆｆｉセルレ ニン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））から、アマ−ジャム（Ａ＋＋ｅｒｓｈａｍ）　（ イリノイ州アーリントンハイツ）のトリチウム標識つけ装置により調製する。こ の物質をＨＰＬＣにより精製する。 ３、シンターゼＩの標識つけ ねじ込みキャンプのマイクロ遠心管の中に１．０Ｌｌｌの５μＭの溶液（５ナノ モル）をつくるために必要な３Ｈ−セルレニン溶液（メタノール中）の要求され る量を測定することによって、３Ｈ−セルレニンを準備する。次いでメタノール を窒素ガスの流れ下に蒸発させ、ジエチルエーテルでチェーシングしてメタノー ルの完全な蒸発を保証する。管にキャップをし、そして乾燥した３Ｈ−セルレニ ンを使用するまで氷上に貯蔵する（下を参照）。 ４６ｋＤおよび５０ｋＤの両者のタンパク質を含有するＡＣＰ−セファロースｎ ｏｒビーク１」からの物質をプールし、そしてＰＭＩＯの４３１１Ｉｌの膜をも つアミコン（Ａ＋５ｉｃｏｎ）の攪拌した圧力セルの中で濃縮する。濃縮物をセ ルの中で「ゼロ」緩衝液（実施例３Ａ、２に記載する）で希釈し、そして再濃縮 してこの物質を脱塩する。この物質をほぼ２０−Ｈのリン酸塩濃度に濃縮する。 プールした分画の最初の濃度は６０〜６６ｍ１であり、そして最終の濃縮物の体 積は１．０ＩＩｌ以下であり、これは４０倍またはそれより大きい濃縮を表す。 濃縮した脱塩物質をアミコン（Ａｓｉｃｏｎ）　ｆｊｌ拌セ小セル３Ｈ−セルレ ニンを含有するマイクロ遠心管へ取り出し、そしてｒ２０Ｊｌｔ衝液（実施例３ Ａ、２）を１ｍｌの最終体積に添加する。この混合物を３７℃において２０分間 インキュベーションして、シンターゼ■と完全に反応させる。 ４、シンターゼＩＩの標識つけ シンターゼ■およびシンターゼＩＩの混合物の中でシンターゼＨを３Ｈ−セルレ ニンで！Ｉｍつけするために、シンターゼＩをまｆ非標識セルレニンでブロック しなくてはならない、５ナノモルの非標識セルレニンを３Ｈ−セルレニンについ て前述したように調製する。 ３Ｈ−セルレニンは上のようにして調製するが、ただしより大きい濃度を使用し てシンターゼＩＩへの結合を保証する。 濃縮された酵素を上のようにして調製し、そしてまず５μＭの非標識セルレニン と３７℃において２０分間反応させて、３Ｈ−セルレニンとの引き続く反応から シンターゼＩをプロ・ツクする。この反応後、試料をより高い濃度の３Ｈ−セル レニンを含有する第２管の中に入れ、そして３７℃において６０分間反応させる 。この手順の残部は前述した通りである。 ５、候補のタンパク質のを含有するのゲル分析ＬａｅｍｍｌｉのＳＯ５−ＰＡＧ Ｅ法は、再びゲルのために還元した架橋体の処方を使用する、実施例３Ｅに記載 されている通りである。ゲルの厚さは０．７５ｍｍである。ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ からのバンドを切除し、そしてシンチレーションカウンティングにより分析して 、標識されたノくンドの分子量を決定し、そして標識されたセグメントのアミノ 酸配列を決定する。 ６、配列の決定 タンパク質を、実施例４に記載されている方法により、次の変化を加えて、エン ドプロテイナーゼｇｌｕｃを消化する。消化は溶液の中で実施し、したがって、 ニトロセルロースからのペプチドの回収を容易にするために前の消化物に添加し た５％のアセトニトリルを省略する。逆相ＨＰＬＣおよびペプチドの配列決定は 実施例４に記載されている通りである。 Ｂ、Ｌ並旦皇髪里 １　、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるβ−ケトアシル−ＡＣＰのシンターゼ活性の発現の ためのプラスミドは、１または２以上の！！、ｃｏｌｉの発現ベクターを使用し て構成することができる。これらの発現ベクターは、次のものを包含する：　ｐ Ｕｃ１２０、反対の向きに挿入された１ａｃＳＩ域およびｌａｃペプチドのＡＴ ＧにＮｃｏ　１部位をもつ、ｐＵｃ１１８（ＶｉｅｒｉａおよびＭｅｓｓ　ｉｎ ｇ、門ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９８７）　１５３　：　３ −１１）に基づ（Ｅ、ｃｏｌｉの発現ベクター（Ｖｉｅｒｉａ、　Ｊ、ＰｈＤ、 Ｔｈｅｓｉｓ、ミネソタ大学、１９８Ｂ）　、使用することができる他の発現ベ クターは、次のものを包含するが、これらに限定されないｉ　ｐＥＴ系ヘクター 、とくにｐＥ７８Ｃ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌ、　（１９９０）、ＤＪ、Ｇｏｅｄｅ１編、Ｖｏｌ、１８５）、これはＴ７Ｒ Ｎ＾ポリメラーゼプロモーターを使用する、およびｐＫＫ２２３ヘクターファー マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、これはｔｒｐ　−１ａ（ｔａｃ）バクテリア のプロモーターを利用する。　ｐＵｃ１２０発現系を使用する５０ｋＤのタン） ｉり質に関連するシンターゼ活性のＥ、ｃｏｌｉの発現の１例を下に記載する。 ２、シンターゼの発現のための構成体 シンターゼ活性に関連する５０ｋＤのタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの領 域を含有する断片（実施例６）を、商業的に入手可能なリンカ−１制限エンドヌ クレアーゼおよびリガーゼを使用して、ｐυＣｌ２Ｏの中にサブクローニングす ることができる。サブクローニングした領域は、成熟タンパク質の解読領域、お よびまた可能ならば５′および３°−非解読配列、トランシフトペプチド配列、 およびポリ　（Ａ）テイルを含むであろう、シンターゼの配列は、それらが５゛ −３”の向きにおいてｌａｃ転写および翻訳シグナルと整列するように、挿入さ れる。生ずるプラスミドを、分析のために、Ｅ、ｃｏｌｉの適当な菌株に形質転 換することができる。 ４６ｋＤのタンパク質のためのｃＤＮＡクローンを含有する（実施例６）か、あ るいは４６ｋＤおよび５０ｋＤの両者のタンパク質のためのｃＤＮＡを含有する 構成体を、前述の手順およびベクターを使用してつることができる。 ３　、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるシンターゼ活性の発現ｐｔｌｃ１２０を含有するＥ 、ｃｏｌｔの単一のコロニーまたはｐｌＪｃ１２０の中のシンターゼの構成体を 、３００ｍｇ／　１のペニシリンを含有するＥＣＬＢブロスの中で培養する＊　 ｌａｃプロモーターを１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発する。細胞を３７℃に おいて一夜（１８時間）成長させる。ｐＵｃ１２０を含有するＥＣＬＢ　（ｆｉ 発および未誘発）またはｐＵｃ１２０の中のシンターゼ構成体の一夜の培養物を 遠心して、細胞を沈澱させる。沈澱した細胞を緩衝液の中に再懸濁させ、そして フレンチプレスの中で１６．０００ｐｓｉで破壊する。破壊した細胞の混合物を 遠心し、そして各上澄み液の一部分をＧ−２５セフアデフクス（Ｓｅｐｈａｄｅ ｘ）ゲル濾過遠心カラム（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｗ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　、平衡化 緩衝液に適用する。カーフ４を遠心し、そして流出液を集め、そしてシンターゼ のアッセイにおし）で酵素源として使用する。シンターゼ活性を実施例２に記載 するように測定する。セルレニンを、また、シンターゼ活性と反応させて、実施 例５Ａに前述したように、シンターゼＩおよびシンターゼＩＩの活性を区別する 。 ４　、Ｅ、ｃｏｌｉＯ中のシンターゼタンパク質の検出１ｍｌのＩＰＴＧで誘発 した３００ｍｇ／　ｌのペニシリンを含有するＥＣＬＢＯ中で成長させた、ｐＵ ｃ１２０を含有する［！、ｃｏｌｉまたはｐＵｃ１２０の中のシンターゼ構成体 の一夜の培養物の抽出物を、次のようにして、調製する。３７℃において震盪成 長させた一夜の培養物を、１．５ｍｌのエノペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） 管の中で遠心することによって沈澱させる。 沈澱物をＳＯＳ試料緩衝液（０，０５Ｍのトリス−ＨＣｌ　、ｐ）１６．８．１ ％のＳＯ５，５％のβ−メルカプトエタノール、１０％のグリセロールおよびｏ 、ｏｏｓ％のブロモフェノールブルー）の中に再懸濁させ、そして１０分間沸騰 させる。試料を１０％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させる（Ｌａｅｍ ｓｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２７　：　６８０）。ゲルを０．０５ ％のり一マ−）シー−ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｓ＋ａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌ ｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）　。 ２５％のイソプロパツールおよび１０％の酢酸の中で染色し、そして１０％の酢 酸および１０％のイソプロパツールの中で脱染色する。シンターゼタンパク質に 相当するバンドは、ｐＵｃ１２０の中に挿入されたシンターゼ構成体を含有する 細胞の中で生産されたＥ、ｃｏｌｉのタンパク質を、挿入をもたないｐＵｃ１２ ０ヘクターを含有するものと比較することによって検出することができる。 ５、Ｔ７プロモーターを使用するＥ、ｃｏｌｉＯ中のシンターゼ活性の発現 Ｔ７プロモーターのコントロール下にＥ、ｃｏｌｉの中で５０ｋＤのトウゴマ（ Ｒ，ｃｏｍ＋ｗｕｎｉｓ）のシンターゼタンパク質を発するための構成体を、次 のようにして調製する。エンドヌクレアーゼの制限部位ＢａｍＨＩおよびＮｄｅ 　［を特定するＩＩＮＡ配列を、５０ｋＤのシンターゼのｃＤＮＡクローン、ρ ＣＧＮ２７６５、の中にｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発により挿入する。この 配列は、成熟シンターゼタンパク質のアスパラギンのＮ−末端アミノ酸を特定す るＡＡＣコドンの直ぐ５′に挿入される。エンドヌクレアーゼ制限部位ＢａｍＨ ＩおよびＰｓｔＩを特定するＤＮＡ配列を、プロリンのＣ−末端のアミノ酸を特 定するＣＣＣコドンの後のＴＧＡ停止コドンの直ぐ３°の５０ｋＤのシンターゼ のｃＤＮＡクローンの中に挿入する。 生ずるプラスミドはｐＣＧＮ２７７３である。成熟した５０ｋＤのシンターゼタ ンパク質のための解読配列を含有するｐＣＧＮ２７７３の断片を、Ｎｄｅ　Ｉお よびＢａｍＨＩで消化し、そしてＮｄｅ　ＩおよびＢａｍＨＩ消化したｐＥＴ３ ＾、７７　Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、前掲）の中に結合す ることによってサブクローニングする。生ずるプラスミドはｐＣＧＮ２７７５で ある。 Ｅ、ｃｏｌｉの中の４６ｋＤのトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍ＋ｍｕｎｉｓ）のシンター ゼタンパク質の発現のための同様な構成体を、次のようにして調製する。エンド ヌクレアーゼ制限部位Ｂａａ＋ＨＩおよびＮｄｅ　＋を特定する［１ｌｉＡ配列 を、４６ｋＤのシンターゼのｃＤＮＡクローン、ｌ−ａの中にｉｎ　ｖｉｔｒｏ の突然変異誘発により挿入する。この配列は、成熟シンターゼタンパク質のＮ− 末端のアミノ酸と前に同定された（第３図）リジンのアミノ末端に対して直ぐに 位置する、アスパラギンを特定するＡＡＴコドンのｉｌぐ５’　に挿入される。 エンドヌクレアーゼ制限部位Ｂａ５ｉＨＩおよびＰｓｌＩを特定するＤＮＡ配列 を、リジンのＣ−末端のアミノ酸を特定するＴＴＣコドンの後のＴＧＡ停止コド ンの直ぐ３゛　の４６ｋＤのシンターゼのｃＤＮＡクローンの中に挿入する。生 ずるプラスミドはｐＣＧＮ２７７４である。成熟した４６ｋＤのシンターゼタン パク質のための解読配列を含有するｐＣＧＮ２７７４の断片を、Ｎｄｅ　Ｉおよ びＢａｍＨＩで消化し、そしてＮｄｅ　＋およびＢａｍＨＩで消化したＥ、ｃｏ ｌｉの発現ベクターｐＥ７３Ａの中に結合することによってサブクローニングす る。生ずるプラスミドはｐＣＧＮ２７７６である。Ｔ７プロモーターおよびｐＣ ＧＮ２７７６からの成熟した４６ｋＤのシンターゼタンパク質のための解読配列 を、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌｌｌで消化しくＥｃｏＲＶおよびＢｇｌｌＩ制限部 位はおんとのｐＨ’Ｔ３Ａベクターにより供給される）そしてＢａｍＨＩおよび ＥｃｏＲＶで消化したクローニングベクターｐＡｃＹｃ１８４の中に結合するこ とによって、４６ｋＤのシンターゼの発現のための第２構成体を構成する。生ず るプラスミドはｐＣＧＮ２７７７である。 さらに、同一のＴ７プロモータープロモーターのコントロール下の４６ｋＤおよ び５０ｋＤの両者のシンターゼタンパク質の発現のための構成体を、次のように して構成する。ｐＣＧＮ２７７３の５０ｋＤの解読領域をＢａｍＨＩで消化して つくり、そしてＢａｍＨＩ消化したｐＣＧＮ２７７６の中に結合する。これは５ ０ｋＤの解読配列を４６ｋＤの解読配列の直ぐ３′に挿入し、そしてｐＣＧＮ２ ７７８を生ずる。 ４６ｋＤおよび５０ｋＤの構成体をＥ、ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１　（Ｓｔｕｄｉｅ ｒら、前掲）の中に形質転換する。培養物を一夜成長させ、そして細胞を遠心に より収穫する。沈澱した細胞を２０−門のリン酸カリウム緩衝液の中にもとの体 積のほぼ１／２０に再懸濁させ、そしてフレンチプレス装置を使用して破壊する 。破壊した細胞の試料をほぼ１２，０ＯＯｘ　ｇで回転して細胞の破片を除去し 、ぞして生ずる懸濁液を４０％のグリセロールの中に希釈し、そして実施例２に 記載するように、このアッセイにおいて基質として放射線標識したＣ１６　：　 ０−ＡＣＰを使用して、シンターゼＨ活性について測定する。これらのアッセイ の結果を表νＩＩＩに表す。 表Ｖｌｌｌ 旦、ｃｏｌｉ　の　のシンターゼ活性 ｐＣＧＮ２７７５　５０ｋＤ　２．４ ｐＣＧＮ２７７６　４６ｋＤ　２．８ ｐＣＧＮ２７７８　４６ｋＤ　＋　５０にロ　４．２ｐＡｃＹｃ１８４　１・７ ｐＣＧＮ２７７７　４６ｋＤ　２．２ ｐＡｃＹｃ１８４　＋　ｐＣＧＮ２７７５　５０ｋＤ　２．２ρＣＧＮ２７７７ 　＋　ｐＣＧＮ２７７５　４６ｋＤ　＋　５０ｋＤ　５．２上の結果が証明する ように、４６ｋＤおよび５０ｋＤの両者のタンパク質、ここでそれぞれ「シンタ ーゼ因子Ａ」および「シンターゼ因子Ｂ」と呼ぶ、がシンターゼＩＩ型の活性に 要求される。これはタンパク質の精製のデータと一致し、主として４６ｋＤおよ び５０ｋＤの両者のタンパク質を含有するＡＣＰ−セファロースのカラムの因子 におけるシンターゼＩＩ型の活性を示す（実施例３Ｆ）。 シンターゼタンパク質の存在についてのＥ、ｃｏｌｉ抽出物の分析は、ｐＣＧＮ ２７７６で形質転換された細胞の中のほぼ２％の合計のタンパク質、ｐＣＧＮ２ ７７５細胞の中のシンターゼ因子Ｂのレベルの大まかに５０倍、からなることを 示す、さらに、第１２図に示すように、Ｅ、ｃｏｌｉのシンターゼタンパク質は 、植物のシンターゼの因子ＡおよびＢのタンパク質とアミノ酸しヘルにおいてか なりの相同性を共有する。 シンターゼの構成体を含有するＥ、ｅｏｌｉ細胞およびこれらの構成体を欠如す る対照細胞の追加の分析を実施して、これらの細胞の脂肪酸の組成を決定する。 脂質を沈澱した［ｉ、ｅｏｌｉ細胞から抽出し、そして脂肪酸をメタナリシスお よびＧＣ（気体−液体クロマトグラフィー）により、本質的にＢｒｏｗｓｅら（ Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　（１９８６）　１５２　：　１４１−１ ４５）に記載されているように分析する。結果を表ＩＸに示す。 表ＩＸ ノ　−　れたＥ、ｃｏｌｉの　の　の ％　％　％　％ １２１　３．５　３．５　３．５　３．５ｉ４：ｏ　５　５　３　３ １６：０　２７　２８　２１　２１ ｔｓ：１２２　２３　１０　１２ Ｃｙｃ１７　２　２　２　１．５ ｔａ：ｏ　ｏ、ｓ　０．５　５　６ ｔｓ：ｔ　３７　３７　５１　４９ １８：２　３　３　２　３ １８：３　０．５　０．５　０．５　０．５２０：Ｏｏ、ｓ　０．５ ２０：１　ｔｒ　２　１．５ 上の結果が証明するように、Ｅ、ｃｏｌｉの中のＣ１８脂肪酸の百分率は、植物 のシンターゼ因子Ｂの存在または不存在において、Ｅ、ｃｏｌｉの中の植物シン ターゼ因子Ａの発現のとき増加する。Ｅ、ｃｏｌｉ上の実験におけるように、細 胞を３７℃の代わりに３０℃において成長させるとき、Ｅ、ｃｏｌｉの脂質への なおより大きい効果が観察される。こうして、シンターゼＩＩ型は、より長い鎖 の脂肪酸の増加により証明されるように、宿主細胞の中の因子Ａタンパク質の発 現により増加することができる。しかしながら、破壊された細胞において、シン ターゼＩＴ型活性の増加はシンターゼ因子Ａおよびシンターゼ因子Ｂの両者の構 成体で形質転換された細胞からの抽出物においてのみ検出可能であル（表ＶＩＩ Ｉ）　、これらの結果が示すように、シンターゼ因子Ａはシンターゼ遺伝子性に 対する長い脂肪酸の基質の特異性を寄与する成分であり、そして因子Ｂは、宿主 細胞の中に存在するシンターゼ因子に依存して、要求されるか、あるいは要求さ れないことがある。 実施例６　シンターゼ遺伝子の単離 この実施例において、Ａ　１ｅｘａｎｄｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、（１９８７）１５４　：　４ｌ−６４）に記載されている方法を使用 する、ｃＤＮへのライブラリーの調製、およびシンターゼｃＤＮＡについてのｃ ＤＮ＾ライブラリーのスクリーニングを記載する。 Ａ、）ラボ７　（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のｃＤＮＡライプーリーのｅＤＮＡラ イブラリーは、開花後はぼ１４〜２１後に集めた種子からのトウゴマ（Ｒ，ｃｏ ｗａ＋ｕｎｉｓ）の未熟の胚乳から単離したポリ　（Ａ）　＋ＲＮＡから構成す ることができる０合計のＲＮＡを、Ｈａｌｔｉｎｇら、（Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８５）　１３　：　８０１９−８０３３）により 記載されている方法により、１０ｇのトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の未熟 のの胚乳組織がら単離する。０．２５ｇのシグマ・セル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｅ１ｌ ）　５０のセルロースのカラムで多ＩＩ類を除去することによって、合計のＲＮ Ａをさらに精製する。 ＲＮＡをカラム上に１ｍｌの負荷緩衝液（２０ｗＭのトリス−ＩＣＩ　、ｐＨ７ ，５，０，５ＭのＮＨ＃ＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の５ＤＳ）の中で負 荷し、負荷緩衝液で溶離し、そして５００．ｃＩｌの分画を集める。エタノール を試料に添加してＲＮＡを沈澱させる。試料を遠心し、そして沈澱物を無菌の蒸 留水の中に再懸濁し、そして生ずるＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（分子クロー ニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　 Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９Ｂ２））により記載されてい るように、オリゴ（ｄＴ）−セルロースのクロマトグラフィーに２回かけてポリ 　（Ａ）　＋ＲＮＡをＩｍする。 商用クローニングヘクターブルースクライブ（Ｂｌｕｓｃｒｉｂｅ）　Ｍ　１３ −（ストラタジーン・クローニング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　５ｙｓｔｅ＋ｍｓ）；カリフォルニア州すンジエゴ）から誘導された、プラス ミドのクローニングベクターｐｃＧＮ１７０３を次のようにしてつくる。ブルー スクライプ（Ｂｌｕｓｃｒｉｂｅ）　Ｍ１３−をＢａｍＨＩで消化し、ヤエナリ のエンドヌクレアーゼで処理し、そして平滑末端結合により変更してＢａａＨＩ 処理したプラスミドｐｃＧＮ１７００をつくる。ρＣＧＮ１７００をＥｃｏＲＴ および５ｓｔｌ（隣接する制限部位）で消化し、そして配列５°ＣＧＧＡＴＣＣ ＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡ　３”および５°ＡＡＴＴＴ ＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴ　３　 ’　を有する合成相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングする。これらの配列 を挿入してＥｃｏＲ１部位を排除し、Ｂａ５Ｈ１部位をブルースクライブ（Ｂｌ ｕｓｃｒｉｂｅ）の中に存在する５ｓｔＩ（また、時にはここにおいてｒｓａｃ ｌＪと呼ぶ）部位の反対側に動かし、そして新しい制限部位Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｘｂ ａ　Ｉ　、＾ｐａｌ、Ｓｅａ　Ｉを含める。生ずるプラスミドｐｃＧＮ１７０２ をＨｉｎｄｒｌＩで消化し、そしてクレノー酵素で平滑末端とする；直線のＤＮ ＡをＰｖｕＩＩで部分的に消化し、そして希薄溶液の中で７４ＤＮＡリガ一ゼ結 合する。欠失されたｌａｃプロモーター領域を有する形質転換体を選抜しくｐｃ ＧＮ１７０３）そしてプラスミドのクローニングベクターとして使用する。 簡単に述べると、ｃＤＮＡ合成のためのクローニング法は次の通りである。プラ スミドのクローニングベクターを５ＳｔＩで消化し、そしてホモポリマーのＴ− テイルを末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して生ずる３ ゛　−オーパーツ１ング粘着末端上で発生させる。テイルブラスミドをオリゴ（ ｄ＾）−セルロースのクロマトグラフィーにより未消化またはアンティルトのプ ラスミドから分離する。生ずるベクターは、それらのポリ　（Ａ）トラクトによ りベクターのプラスミドのいずれかの末端に共有結合した一ＲＮＡからのｃＤＮ Ａの第１鎖の合成のためのプライムとして働く。ｃＤＮＡ　−５ＲＮＡ　−ベク ターの複合体を末端のトランスフェラーゼでデオキシグアノシン三リン酸で処理 して、ｃＤＮＡｉ［の末端にＧ−テイルを発生させる。 Ｂａ＠８１部位に隣接する余分のｃＤＮＡ−ｗＲＮＡの複合体をＢａ５ｌｌ　Ｉ 消化により除去し、一方の端にＢａ＊ＨＩ粘着末端を有し、そして他方にＧ−テ イルをもつｃＤＮＡ　−ｓ＋ＲＮ＾−ベクターの複合体を残す。この複合体をア ニーリングした合成環化リンカ−５’　−ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴ ＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’および３　’　−ＧＣＧＣＣＧＧＣ ＧＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡ−５“　（これはＢａａ＋ＨＩの粘着末端およびＣ− テイルの末端を有する）を使用して環化する。結合および修復後、円形の複合体 をＥ、ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α（ＢＲＬ　；マリイランド州ガイスバーグ）の中に 形質転換してｃＤＮＡライブラリーを発生させる。トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎ ｉｓ）の未熟の胚乳のｃＤＮ＾ＤＮＡは、はぼ１０００塩基対の平均のｃＤＮＡ インサートをもつ、はぼ２Ｘ１０’のクローンを含有する。 Ｂ、５０ｋＤのシン　−ゼ　ンパク　に　るトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｗｕｎｉｓ） のｃＤＮＡクローンの゛ １、プローブの生成 １．１　ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ（：Ｒ）。低いコドンの同義性のＫＨ２およ びにＲ１６をもつ５０ｋＤのシンターゼのアミノ酸配列（実施例３）からの２つ のペプチドからのアミノ酸配列を、植物の５０ｋＤのシンターゼｃＤＮ＾のため のプローブの生成のために選択する。４組の混合したオリゴヌクレオチドを、に Ｒ４配列について、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１ ９８５）　２３０　：　１３５０　１３５４　；　０ｓｔｅ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｉ−ｑｕｅｓ　（１９８８）　６　：　１６２−１６７）における前進プライ マーおよび逆プライマーとして使用するために設計しそして合成し、そしてにＲ １６配列について、２組の混合したオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応 における前進プライマーおよび逆プライマーとして使用するために設計しそして 合計する。すべてのオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ＋ｓ）　３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置で合成する 。 ＫＲ４オリゴヌクレオチド群は１２８の重複を有し、そしてＨｉｎｄｌｌｌ（前 進プライマー）またはＥｃｏＲＩ　（逆プライマー）のためのフランキング制限 部位と一緒に２０塩基の解読配列を含有する。ＫＨ１６は３８４の重複を有し、 そして旧ｎｄＩＩＩ（前進プライマー）またはＥｃｏＲＩ　（逆プライマー）の ためのフランキング制限部位と一緒に２３塩基の解読配列を含有する。ＫＨ２お 前進プライマーおよびＫＨ１６の逆プライマーを第４図に示す。 ＫＲ４オリゴヌクレオチド群は、シンターゼタンパク質の中のにＲ４およびＫＨ １６のペプチドの両者の可能な向きを説明するために２つのみのポリメラーゼ連 鎖反応が要求されるように、組み合わせる。鋳型としてｃＤＮＡライブラリーの ＤＮＡおよびプライマーとして前進プライマーおよび逆プライマーの可能な２つ の組み合わせを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応をパーキン・エルマー／セツス ＤＮ＾サーマル・サイクラ−（Ｐｅｒｋｔｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ 　Ｔｈｅｒｉ＋ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）（：２ネチカソト州ノーウオーク）により 実施する（サーモサイクルのファイル１分９４℃、２分４２℃、２分４２℃から ７２℃の上昇、３分７２℃、１５サイクル、次いで段階のサイクルのファイル、 段階の上昇なし、１分９４℃、２分４２℃、３分７２℃、７２℃の段階で増加す る１５秒の伸長、１０サイクル、および最後に７２℃の伸長）。 １．２ＰＣＲ生成物の分析 １、　２．　１　サブクローニング、ＫＨ２の前進プライマーおよびＫＨ１６の 逆プライマーの反応の２８３ｂｐの生成物をゲル精製し、旧ｎ＋ＨＩＩおよびＥ ｃｏＲｌで消化し、そしてエタノール沈澱させる。生ずる流速をｐｃＧＮ２０１ ５、ブルースクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のＫＳ＋（スＩ・ラタジーン （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、カリフォルニア州うジョラ）のクロランフェニコ ール耐性バージョン、の中にサブクローニングする。 １、　２．　２　ｐｃＧＮ２０１５の構成、　ｐｃＧＮ２０１５はｐＣＧＮ５６ ５をＨｈａ　Ｉで消化し、そしてクロランフェニコール耐性遺伝子を含有する断 片を切除し、ヤエナリのヌクレアーゼの使用により平滑末端とし、そしてブルー スクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）に３＋　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ ａｇｅ−ｎｅ）　、カリフォルニア州うジョラ）のＥｃｏＲＶ部位の中に挿入し てｐｃＧＮ２００８をつくる。ｐＣＧＮ５６５はｐＬＩｃ１２−ｃｍ（Ｋ、Ｂｕ ｃｋｌｅｙ　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、ｐｈｉＸ１７４溶菌遺伝子の調節および 発現、カリフォルニア大学、サンジエゴ、１９８５）に基づくクローニングベク ターであるが、ｐＵｃ１８リンカ−を含有する　（Ｙａｎｆｃｓｈ−Ｐｅｒｒｏ ｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）５３　：　１０３−１１９）。 ｐｃＧＮ２００８のクロランフェニコール耐性遺伝子はＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎ ｄＩＩＩ消化により除去される。クレノー酵素で処理して末端を平滑とした後、 断片をＤｒａ　Ｉ消化したブルースクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にＳ＋ に結合する。クロランフェニコール耐性と置換したアンピシリン耐性Ｄｒａ　Ｉ 断片を有するクローニングを選択し、そしてｐｃＧＮ２０１５と命名する。 １．２．３２つのクローンＡＧ　−１８およびＡＧ　−３２のミニ調製物のＤＮ Ａ　（Ｍａｉａｔｉｓら、前掲）を、サンガージデオキシ配列決定（Ｓａｎｇｅ ｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７７）　７４　 ：　５４６３　５４６７）によりＲ１３の汎用プライマーおよび逆プライマーを 使用して配列決定した。クローンは同一のＤＮＡ配列を有することが示された。 ＤＮＡ配列の翻訳は、９１アミノ酸残基内に５つの５０ｋＤのシンターゼタンＸ り質（７８アミノ酸残基）を含有するアミノ酸配列を生ずる。翻訳されたアミノ 酸配列は、ｆａｂＢによりエンコードされるＥ、ｃｏｌｉのβ−ケトアシル−Ａ ＣＰシンターゼＩ遺伝子（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎら、ＣａｒｌＳｂｅｒｇ　Ｒｅｓ 、Ｃｏ＋ｕ＋ｕｎ。 （１９８Ｂ）　５３：　３５７−３７０）、および他のβ−ケトアシルシンター ゼ（Ｂｉｂｂら、ＥＭＢＯＪ、（１９８９）　８　：　２７２７−２７３６）に 対する相同性を有する。 １．３　プローブの精製。ＡＧ　−３２の中の２８３ｂｐのインサートを、鋳型 としてミニ調製物のＤＮＡおよびプライマーとして前述のにＲ４およびにＲ１６ オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅した。生ずる断片をｃＤＮＡラ イブラリーのスクリーニングにおいてプローブとして使用するためにゲル精製し た。 ２、ライブラリーのスクリーン トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の未熟の胚乳のｃＤＮＡバンクを、全体のｃ ＤＮＡをＮａ目で消化しそしてＮｏｔｌで消化したラムダｇｔ２２　ＤＮＡに結 合することによって、クローニングベクターのラムダｇｔ２２　（ストラタジー ン・クローニング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ ）　；カリフォルニア州すンジエゴ）の中に動かす。生ずるライブラリーの力価 はほぼ１．５Ｘ　１０’ｐｆｕ／ｍｌであった０次いで、ライブラリーを巳。 ｃｏｌｉシンターゼＹ１０９０　（Ｙｏｕｎｇ、、Ｒ，Ａ、およびＤａｃｉｓ、 　ＲＪ、、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８３）８０　：　１１９４）上に ほぼ１５，０００プラ一ク／１５０ｓｍＮＺＹ　（ｒＮＺＹＭＪはＭａｉａｔｉ ｓら、前掲、において定義されている）寒天プレートの密度でプレートして、ス クリーニングのための６０．０００を越えるプラークを得る。ＮＥＮコロニープ ラークスクリーンのフィルターを使用して、前辺て切断したフィルターをプレー ト上にほぼ２分間横たえ、次いでそれらを剥がすことによって、重複のリフトを プラークから取る。フィルターを変性溶液（１，５ＭのＮａＣｌ、０，５ＭのＮ ｌ（，０）１）の上に浮かばせ、フィルターを中和溶液（１，５ＭのＮａＣ１， ０，５Ｍのトリス−ＨＣｌ　５ｐＨ８，０）に２分間移し、次いで２ＸＳＳＣ（ Ｉ　Ｘ５ＳＣ−０，５ＭのＮａＣ１；　０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）に ３分間移し、次いで空気乾燥することによって、ファージのＤＮＡを固定化する 。フィルターを４２℃において５０％のホルムアミド、１０×デンハルト（Ｄｅ ｎｈａｒｄｔ）溶液、５　ｘＳＳＣ、Ｏ，１％のＳＯＳ、５ｍＨのｌｌ：ＤＴＡ 、および０．１ｓ＋ｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡから成るハイブリダイゼ ーション緩衝液の中で予備ハイブリダイゼーションする。フィルターを４２℃に おいて同一の緩衝液の中で！！ｐ４Ｉ識した（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のランダムプライニドＤＮＡ標識つけキ ット）前述のＡＧ　−３２インサートを添加して、−夜ハイブリダイゼーシッン する。フィルターを順次に５５℃においてＩ　Ｘ５ＳＣ、０，１％のＳＤＳ中で ２５分間、０．５ＸＳＳＣ、０，１％のＳＯＳ中で２５分間、そして最後に０． ｌＸ５ＳＣ、０，１％のＳＯ３中で２５分間洗浄する。フィルターをＸ線フィル ムに一７０℃においてデュポン・クロネフクス（ＤｕｐｏｎｔＣｒｏｎｅｘ）増 強スクリーンを使用して４８時間の間露出する。 ３、クローンの分析 クローンをＡＧ　−３２の３　ｚ　Ｐ　４１　！！　したＤＮＡとハイブリダイ ゼーションさせ、そしてプラーク精製した。ファージのＤＮＡを、Ｇｒｏｓｓｂ ｅｒｇｅｒ（ＭＡＲ（１９８７）　１５　：　６７３７）により記載されている ように次の変化を加えて、精製したクローンから調製する。プロテイナーゼに処 理を、１０％のＳＯ８の添加および室温における１０分間のインキユベーション により置換する。回収されたファージのＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、低い濃度に おいて再結合し、そしてＥ、ｃｏｌｉ　ｍｍ２９４（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、Ｍ ｏｌ。 Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　１６６：　５５７−５８０）細胞の中に形質転換し て、ｐｃＧＮ１７０３の中にｃＤＮＡインサートを含有するプラスミドを回収す る。最も長いクローンのｐＣＧＮ２７７４　（１−３）のｃＤＮＡインサートの 一次のヌクレオチド配列は、そのクローンが遺伝子のための全体の解読配列を含 有しないことを示す。 ４、より長いクローンについてのスクリーニングより長いｃＤＮＡクローンは、 このクローンのもっとも遠い５°配列からのオリゴヌクレオチドをもつトウゴマ （Ｒ，ｃｏｍｓｕｎｉｓ）のｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーニングすることに よって得ることができる。 ｃＤＮＡクローンρＣＧＮ２７６４のヌクレオチド２４−４６に対して相補的で ある、配列５°ＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＴＣＡ　３°から成 る、２３塩基のオリゴヌクレオチド＃　２２７２を合成した。ラムダｇ　ｔ２２ の中のトウゴマ（Ｒ，ｃｏｓｍｕｎｉｓ）の胚のｃＤＮＡライブラリーからのｔ ｏｏ、ｏｏｏより大きいクローンを、前述したように、ｔ！、ｃｏ１ｉシンター ゼＹ１０９０の中で２０，０００プラーク／　１５０ｓ＋ｍＮＺＹプレートの密 度にプレートする。ファージを、前述したように、ＮＥＮコロニー／プラークの スクリーンフィルター上にリフトする。　ＢＲＬの５×緩衝液およびＴ＄キナー ゼを使用してオリゴヌクレオチド＃　２２７２を５末端標識つけすることによっ て、ハイブリダイゼーションのためのプローブを調製する。フィルターを予備ハ イブリダイゼーションし、そして３７℃においてプローブとハイブリダイゼーシ ョンさせ、そしてＢｅｒｅｎ　ｔら：　Ｂｔｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８ ５）　３　：　２０８−２２０）の方法に従い洗浄してバンクグラウンドハイブ リダイゼーションを除去する。フィルターをＸ線フィルムにデュポン・クロネッ クス（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ）増強スクリーンを使用して一７０℃におい て露出する。 １２クローンをオリゴヌクレオチドのプローブへのハイブリダイゼーションによ り検出しそして、前述したように、プラーク精製しそしてｐｃＧＮ１７０３プラ スミドとして回収する。クローンの各々からのミニ調製物のＤＮＡ（Ｍａｎｉａ ｔｉｓら、前掲）を、制限消化およびアガロースゲルの電気泳動により分析する 。最も長いクローンｐＣＧＮ２７６５　（２−８）の完全なりＮＡ配列を第５図 に表す、　Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７７）　７４　：　５４６３　５４６７）のジデオキシヌ クレオチド連鎖停止法により、セクエナーゼ・バージョン（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ 　Ｖｅｒｓｉｏｎ）　２酵素くユナイテッド、ファージ・バイオケミカル・コー ポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔ、ｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ ｒｐ、）　、オ）＼イオ州りレブランド）をもつ、７−ゾアザーｄＧＴＰ試薬キ ットを使用して、ＤＮＡ配列を決定する。配列のデータを分子のプログラムのＧ ｅｌおよびＳＥＱのインテリジェネティックス（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃ ｓ）を使用して分析する。 Ｃ０観肚勿■２ヱｌ；ゼ　ンバク　につい　のトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｓｕ−ｎｉ ｓ）のｃＤＮＡりｏ−＞二ＩＪ１ １、プローブの生成 １、　１　４６ｋＤのタンパク質に対してｃＤＮＡのクローンについてのスクリ ーニングに使用すべきプローブは、５０ｋＤのタンパク質に対するｃＤＮＡの単 離について前述した手順に従い、オリゴヌクレオチドから４６ｋＤのペプチド配 列へのＰＣＲにより調製することができる。４６ｋＤのタンパク質のＮ−末端の ペプチドのアミノ酸配列から誘導された配列、ＫＨＰＬＭにＱＲＲνＶＶＴＧ？ ＩＧＶ　（オリゴの設計のために使用した配列には下線が引かれている）を、４ つのポリメラーゼ連鎖反応において前進プライマーとして使用する。これらの反 応のための逆プライマーは、４６ｋＤのペプチドＫＲ２から誘導されたＤＮＡ配 列、ＥＥＶＮＹＩＮＡＸＡＴＳＴＰＡＧＤＬ。 およびＫＲ３、ＶＦＮＤＡＩＥＡＬＴである。前進プライマーは１２８の重複を 有し、そしてフランキング旧ｎｄｒＩＩ制限部位（ＡＡＧＣＴＴ）と−緒に２０ 塩基の解読配列を含有する。逆プライマーは１２８（にＲ２）および６４（にＲ ３）の重複を有し、そしてＥｃｏＲＩ制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を特定するフラ ンキング配列と一緒に２０塩基の解読配列を含有する。これらの制限部位はＰＣ Ｒから生ずる生成物をクローニングするとき有用である。反応はパーキン・エル マー／セツスＤＮＡサーマル・サイクラ−（ＰｅｒｋｉｎＥ１ｍｅｒ／Ｇｅｔｕ ｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）（コネチカット州ノーウオーク） により実施する　（段階のサイクルのファイル１分９４℃、３分５０℃、３分７ ２℃、１５サイクル、次いで段階のサイクルのファイル、１分９４℃、２分４２ ℃、３分７２℃、７２℃の段階で増加する１５秒の伸長、１０サイクル、および 最後に７２℃の伸長）、前進プライマーとして、ＮＴＥＲＭ−Ｂ１５°ＴＴＴＡ ＡＧＣＴＴＡＡＰＣＡＱＣＣＮＣＴＮＡＴＧＡＡＰＣＡ　３’　、および逆プラ イマーとして、ＫＲ２−Ａ　、　５　’　ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＰＡＴＰＴＡ ＰＴＴＮＡＣＱＴＣＱＴＣ３゜またはＫＲ３−Ａ、５’　ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧ ＣＱＴＣＴＡＴＮＧＣＰＴＣＰＴＴＰＡＡ　３’　（ここでＮ＝Ａ、Ｇ、Ｃまた はＴ、Ｑ＝ＣまたはＴ、そしてＰ−ＡまたはＧ）を使用するＰＣＲは、それぞれ 、優勢の約９００ｂｐおよび約３００ｂｐのバンドを生成した。 １．２ＰＣＲ生成物の分析。ＰＣ！？生成物のＤＮＡを含有するニトロセルロー スのフィルターをサザンプロット技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）により調製 した。　４６ｋＤのＮ−末端配列Ｋ）ＩＰＬＭ）［ＱＲ１？ＶＶＶＴＧＭＧＶか ら調製した合成オリゴヌクレオチド、Ｎｔｅｒｍｌｌ、５　’　ＡＣＮＣＣＣＡ ＴＮＣＣＮＧＴ　３　’で、フィルターをブロービングした。　Ｎｔｅｒｍｌｌ は、反応において前進プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドと異なるＮ −末端配列の部分から誘導する。フィルターの予備ハイブリダイゼーション、ハ イブリダイゼーションおよび洗浄はＢｅｒｎｅｔら（前掲）に従い、のみを有意 な変化はハイブリダイゼーションおよび予備ハイブリダイゼーションに使用した 温度であり、これは２５℃であった。前述したようにＰＣＲにより生成した両者 の約９００ｂ、および約３３０ｂｐのバンドは、このオリゴヌクレオチドにハイ ブリダイゼーシヨンする。約３３０ｂＰのバンドが４６ｋＤのタンパク質のため のｃＤＮＡに対して特異的な生成物であるというそれ以上の証拠は、前述のＰＣ ＲをＮ　ｔｅｒ亀−ＢおよびにＲ３−Ａオリゴヌクレオチドで反復するが、鋳型 としてＮｔｅｒｍ−１３／ＫＲ２−Ａ　ＰＣＲからの生成物を使用することによ って得られる。 約３３０ｂｐのバンドは優勢な生成物として再び得られる。約３３０ｈｐのＰＣ Ｒ生成物を、前述したよ・）に、旧ｎｄｌｌ！およびＥｃｏＲ［で消化し、そし てｐｃＧＮ２０１５の中にサブクローニングする。前述したように、ミニ調製物 のＤＮＡを調製し、そして約３３０ｂｐの断片を含有するクローンのＤＮＡ配列 を決定する。 １．３１０−ブの精製。約３３０ｂｌ）のＰｃｔ？生成物を、ｃＤＮＡライブラ リーのスクリーニングにおいてプローブとして使用するために、ゲル精製する。 ２、ライブラリーのスクリーン 前述のトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の胚のｃＤＮＡを、５０ｋＤのシンタ ーゼに対するｃＤＮＡＯ単離において前述した手順を使用して、４６ｋＤのシン ターゼタンパク質に対するｃＤＮＡについてスクリーニングすることができる。 前述の約３３０ｂｐのＤＮＡ断片を、ランドンプライムド標識っけキット　（ベ ーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ））を使用 して３２Ｐ標識っけする。ラムダｇ　ｔ２２の中の６０，０００より大きいクロ ーンをほぼ１５，０００／１５０ｍｍＮＺＹプレートの密度でプレートしそして 、前述したように、ＮＥＮコロニー／プラークスクリーンフィルター上にリフト する。プローブとしてＡＧ　−３２断片を使用する５０ｋＤのタンパク質に対す るｃＤＮＡについてのスクリーニングについて前述したように、クローンを予備 ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄により、約３３０ ｂｐのＰＣＲ断片へのハイブリダイゼーションにより検出する。クローンをプラ ーク精製し、ラムダＤＮＡを単離しそして、前述したように、クローンをｐｃＧ Ｎ１７０３の中のインサートをもつプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉのクロー ンとして回収する。 前述したように、クローンのＤＮＡ配列を決定する。 ３、ＤＮＡ配列の分析 トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の４６ｋ［＋のシンターゼ（シンターゼ因子 Ａ）ｃＤＮＡクローン、１−ＩＡ、のＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列 を第１０図に表す。成熟タンパク質の開始部位を、ヌクレオチド３６５−３６７ によりエンコードされるリジン残基として仮に同定される。 ３つの可能な翻訳開始ＡＴＧコドンは、１１６．５７または１４のアミノ酸を有 するトランジットペプチドを説明し、成熟タンパク質の開始の配列５”の中に存 在する。可能な翻訳開始コドンの各々において開始する、４６ｋＤのシンターゼ の単離された植物の原形質体の中へのエレクトロボレイシランを実施して、　４ ６ｋＤのシンターゼタンパク質の翻訳開始のために使用されたコドンを同定する 。５０ｋＤおよび４６ｋＤのシンターゼタンパク質のペプチドの配列の分析にお いて観察されるように、４６ｋＤおよび５０ｋＤのシンターゼのｃＤＮＡの翻訳 されたアミノ酸配列は、成熟タンパク質の広範な相同性を証明する。 Ｄ、　の　か゛のシン　−ゼ゛　−の １、フ′ラシカ・カンペストオイス　（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のｃｌｌＮ Ａライフ゛ラリ−の構成 開花後１７〜１９日に収穫した種子から得られた５ｇのブラシカ・カンベストオ イス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）　ｃｖ、Ｒ５００の胚から、完全なＲＮＡを 単離する。　ＲＮＡを２５−１の４Ｍのグアニジンチオシアネートの緩衝液の中 で、Ｃｏ１ｂｅｒｔら（ＰＮＡＳ　（１９８３）　８０　：　２２４８−２２５ ２）により記載されているように、抽出する。沈澱物を６ｍｌのＩ　ＸＴＥ（Ｉ ＯｍＭのトリス／１ｍＭのＨＤＴＡ、　ｐＨ８）の中に再懸濁させ、酢酸カリウ ムを０．０５Ｍの濃度に添加し、そして１／２体積のエタノールを添加すること によって、多［１！をＲＮＡ試料から除去する。試料を氷上に６０分間配置し、 そして３ＯＯＸｇで１０分間遠心する。酢酸ナトリウムを０．３Ｍの濃度に添加 し、次いで２体積のエタノールを添加することによって、ＲＮＡを上澄み液から 沈澱させる。ＲＮＡを試料から１２，０ＯＯＸ　ｇで１ｏ分間遠心して回収し、 そして収量を紫外線の分光光度測定により計算する。 ２ｍ１ｇの合計のＩＩＮＡを、実施例６Ａに記載するように、多Ｉｉ類の除去に よりさらに精製する。生ずるＲＮＡを、また実施例６Ａに記載するように、ポリ 　（Ａ）　＋ＲＮＡについて濃縮する。 ブラシカ・カンベストオイス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の開 花後１７〜１９日の胚のｃＤＮＡライブラリーを、実施例６Ａに記載するように 、プラスミドヘクタ−ｐｃＧＮ１７０３の中で５μｇのポリ　（Ａ）　＋ＲＮＡ を使用して構成する。他の源からのｃＤＮＡライブラリーを同様に調製すること ができる。 ２、ゲノムのライブラリーの構成 ゲノムのライブラリーを、種々の植物源からのＤＮＡがら、商業的に入手可能な ベクターおよび発表されたＤＮＡの単離、分別、およびクローニングの手順を使 用して構成することができる０例えば、ブラシカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａ ｍｐｅｓｔｒｉｓ）のゲノムのライブラリーシ １２２０８）ように思われる単離されたＤＮＡを使用して構成することができ、 これをＢａｍＨＩで消化し、シｇ糖の勾配で分別しくＭａｎｉａｔｉｓら、前掲 ）、そしてラムダファージのベクターＬａｍｂｄａＧｅ＊ｍ−１１（プロメタ　 （Ｐｒｏ＠ｅｇａ）　；ウィスコンシン州マジソ）の中にＭａｎｉａｔｉｓら（ 前掲）のクローニング手順を使用してクローニングする。 ３　、ｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリーのスクリーニングｅＤＮＡおよびゲ ノムのライブラリーを、シンターゼのｃＤＮＡおよびゲノムのクローンについて 、それぞれ、発表されたハイブリダイゼーション技術を使用してスクリーニング することができる。スクリーニング技術は、放射線標識したオリゴヌクレオチド および長いＤＮＡ断片を使用するライブラリーのスクリーニングについて前述し た。 ライブラリーのスクリーニングのためにプローブは、ＰＣＨによるか、あるいは ここにおいて提供されるシンターゼのクローンの配列から調製することができる 。シンターゼの配列から調製されたオリゴヌクレオチド、ならびに全体のシンタ ーゼのクローンまでの、長いＤＮＡ断片を使用することができる。 例えば、前述のブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の胚 のｃＤＮＡライブラリー、シンターゼの因子Ｂのタンパク質をエンコードするｃ ＤＮＡクローンについて、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の５０ｋＤのシン ターゼの因子ＢのｃＤＮＡ　（ｐＣＧＮ２７６４）をプローブとして使用してス クリーニングする。全体のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ消 化したラムダｇｔｌｏに結合することによって、ｃＤＮＡライブラリーをラムダ ｇｔｌｏクローニングベクターの中に、ｃＤＮＡライブラリーをサブクローニン グする。クローンを適当なＥ、ｃｏｌｉ宿主の中にプレートし、そして生ずるプ ラークをリフトしてナイロン膜のフィルターを二重に作成する。フィルターを４ ２℃において一夜予備ハイプリダイゼーシジンする（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲 ）、トウゴマ（Ｒ，ｃｏ＋ｕｉｕｎｔｓ）のｃＤＮＡのクローンｐＣＧＮ２７６ ４のほぼ５ｏｏｂｐの断片を、Ｎｅｏ　Ｉを使用する消化および生ずる断片のゲ ル精製により調製する。この断片をニック翻訳により放射線標識しく”Ｐ）そし て４２℃における一夜のハイブリダイゼーションのために重合したフィルターに 添加する。 相同性のクローンの検出のために、ハイブリダイゼーションしたフィルターを２ ×１５分間４２℃において２　ｘＳＳＣ、０，１％のＳＤＳの中で洗浄し、そし てオートラジオグラフィーにかける。１０クローンがトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｓｕ ｎｉｓ）の５０ｋＤのクローンに対して相同性であるとして同定され、そしてそ れらをプラーク精製により単離する。ファージのＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲＩで 消化し、そしてｅＤＮＡをｐｃＧＮ１７０３のクローニングベクターの中のプラ スミドのクローンとして回収される。 ｌＯクローンのＤＮＡ配列の分析は、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓｓｕｎｉｓ）の５０ ｋ［ｌのシンターゼの因子Ｂのクローンに対する相同性を有するブラシカ（Ｂｒ ａｓｓｉｃａ）のシンターゼのクローンの２つのクラスが回収され、各クラスは １０クローンのうちの５つにより表される。　ｐＣＧＮ３２４ＢのＤＮＡおよび 翻訳されたアミノ酸配列、最も長いクローンは第１１Ａ図に表されている。ブラ シカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のシンターゼのクローン の第２クラスの１構成員である、４へのＤＮＡおよび翻訳されたアミノ酸配列を 第１１Ｂ図に表す。配列はＤＮＡの解読領域においてほぼ９４％の相同性であり 、そして翻訳されたアミノ酸配列はほぼ９９％の相同性である。ｐｃＧＮ３２４ ８の成熟解読配列および翻訳されたアミノ酸配列を、トウゴマ（Ｒ，ｃｏ＋ｕ＋ ｕｎｉｓ）のシンターゼの因子ＢのｃＤＮＡ、２−８、の成熟解読領域の核酸お よび翻訳されたアミノ酸配列と比較すると、核酸レベルにおけるほぼ８０％の相 同性およびアミノ酸レベルにおけるほぼ９０％の相同性を示す。 ブラシカ　（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のシンターゼの因子Ｂ　（７）ｃＤＮＡ、　ｐ ＣＧＮ３２４８、は、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓｕ＋ｕｎｉｓ）の因子Ｂのクローン 、２−８、の翻訳されたアミノ酸配列に対する比較、および成熟タンパク質の解 読領域のＡＴＧ開始コドン５゛の欠如に基づいて、全長のクローンであると思わ れない、さらに、４Ａの配列のクラスの全長のクローンは初期のスクリーンにお いて回収されなかった。全長のクローンは、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓ） のクローンについて前述したように、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーを５ °のオリゴヌクレオチドでスクリーニングするか、あるいはＰＣＲ技術を使用す ることによって単離される。 ブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）のシンターゼの因子ＢのｃＤＮＡの単離と同様 に、ブラシカ　（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）のシンターゼの因子Ａをエンコードする １または２以上のクローンを、プローブとしてトウゴマ（Ｒ，ｃｏｍｍｕ−ｎｆ ｓ）の４６ｋＤのシンターゼｃＤＮ＾（１−ＬＡ）配列を使用して、ブラシカ・ カンペストオイス（Ｂ、ｃａｓｐｅｓｔｒｉｓ）の胚のｃＤＮ＾ライブラリーか ら単離される。 関係する因子Ｂ　（５０ｋＤ）と反対にシンターゼの因子Ａ　（４６ｋＤ）の配 列に対して特異的なプローブを生成するために、ＰＣＲアプローチを利用するこ とができる。トウゴマ（Ｒ，ｃｏａ＋ｍｕｎｉｓ）の４６ｋＤのヌクレオチド配 列に対して特異的な２つのオリゴヌクレオチドのプライマーを、保存されたシン ターゼタンパク質の配列から合成する；５′（前進）プライマーは第１２図のＲ Ｃ４６配列のアミノ酸２９１−３００をエンコードするヌクレオチド配列に相当 する２９ｂｐのオリゴヌクレオチドであり、そして３°　（逆）プライマーは第 １２図のＲＣ４６配列のアミノ酸３９６−４０４をエンコードするヌクレオチド 配列に対して相補的である２６ｂｐのオリゴヌクレオチドである。上の２９ｂｐ および２６ｂｐのプライマーをＰＣＲにおいて使用して、鋳型としてブラシカ・ カンベストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のｃＤＮ＾ライブラリーからの ［ｌＮＡを使用して３４０ｂｐのシンターゼ断片を生成する。ブラシカ・カンペ ストオイス（Ｂ、ｃａ−ρｅｓｔｒｉｓ）のシンターゼの因子Ｂのクローンの相 同性のために、ＰＣＲ発生した断片は、また、因子Ｂの配列を含有する推定され た。ブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａ■ｐｅｓｔｒｉｓ）およびブラシカ （Ｂｒａｓｓｉｃａ）の両者の因子Ｂの配列の中のこの領域における２つのＤｄ ｅ　Ｉ部位およびトウゴマ（Ｒ，ｃｏ園■ｕｎｉｓ）のシンターゼの因子Ａの配 列の中のこれらの部位の欠如を利用して、ＰＣＲ生成物をＤｄｅ　Ｉで消化する 。この消化は、３４０ｂｐのシンターゼの因子Ａの配列、および消化されたシン ターゼの因子Ｂの配列を表す、はぼ２７０および７０塩基対の２つの小さい断片 を生ずる。 因子Ａおよび因子Ｂの配列が相同性でない領域である、第１２図のＲＣ４６配列 のアミノ酸３７６−３８２をエンコードするヌクレオチド配列に対して相補的な ２１ｂｐのオリゴヌクレオナトのプローブを使用して、生ずるＤＮ＾をサザンプ ロット分析すると、３４０ｂｐの断片がＲＣ４６プローブに対して相同性でない が、より小さいシンターゼの因子Ｂの断片は相同性でないことが確証される。　 ３４０ｂｐの因子Ａ特異的な断片をゲノム精製し、放射線標識つけし、そして前 述したように、ブラシカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の胚 のｃＤＮＡをスクリーニングするために使用する。ブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃ ａ）の因子Ａのための３４の候補が同定され、そして３２が前述の２９ｂｐ（５ ″）および２１ｂｐ（３°）プライマーを使用するＰＣＲにより、シンターゼの 因子Ａを表すとして確証された。 ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のシンターゼの因子へのクローンの間で晟も長い クローンを同定するために、５゛末端のクローニング部位付近のｐｃＧＮ１７０ ３ベクターに対して特異的な前進プライマー、および第１２図のＲＣ４６配列の アミノ酸３８−４６をエンコードするヌクレオチド配列に対して相補的な２６ｂ ｐの合成オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲを実施する。ブラシカ　（Ｂｒ ａｓｓ　１ｃａ）のシンターゼの因子Ａのクローンのうちの６つは、ＰＣＲから 明確なバンドを生じ、そしてそれ以上のプラーク精製および配列の分析のために 選択した。 実施Ｎ７　植物の中のシンターゼ構成体この実施例において、植物の形質転換の ために適当なトウゴマ（Ｒ。 ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のシンターゼの１または２以上の遺伝子を含有する構成体を 記載する。 Ａ−見叉立土二上 種子の発育の間に優先的に発現された遺伝子の５゛　−上流配列および３′　− 下流配列を利用する発現カセットは、適当な発現のパターンをもつ遺伝子の単離 されたＤＮＡ配列がら構成することができる。 ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）における種子の発育の間に発現される遺伝子の例 は、ナピン遺伝子、１−２、およびＡＣＰ遺伝子、８ｃｇ４−４、両者は欧州特 許公開ＥＰ第０２５５３７８号に記載さいている、および後述するように、Ｂｃ ｅ４遺伝子である。ナピン遺伝子は、貯蔵タンパク質を活性的に生産する未熟の 胚の中で優先的に発現される、種子の貯蔵タンパク質をエンコードする。ＡＣＰ 遺伝子は、発育する胚の中の脂肪酸の合成における組み込みの因子でありかつ脂 肪酸の合成の間に優先的に発現されるタンパク質をエンコードする。Ｂｃｅ４は 機能が未知のタンパク質を生産する遺伝子であり、このタンパク質は胚の発育に おいて初期に、開花後約１５〜１９日に、優先的に発現され、そしてまた開花後 １１日程度に早く検出可能である。Ｂｃｅ−４の配列は第７図に示されている。 ５°および３゛の調節配列はブラシカ・カンペストオイス　（Ｂ、ｃａｗｐｅｓ ｔｒｉｓ）のゲノムのライブラリーから得ることができ、これは実施例６Ｂに記 載するように構成することができる。 これらの遺伝子の発現をコントロールするＤＮＡ配列は単離することができ、そ して５′および３°の調節領域の十分な部分を、これらの配列の間に挿入された シンターゼ遺伝子が種子の発育において初期に優先的に発現される組み合わせル 、この発現パターンはシンターゼ遺伝子が脂肪酸の合成に影響を与えることがで きるようにし、この合成は、また、種子の発育の初期において起こる０例えば、 Ｂｃｅ４−４のＡＣＰ遺伝子の５゛配列を含有する１、４５ｋｂのＸｈｏ　Ｉ断 片および３゛配列を含有する１、５ｋｂのＳｓｔ　Ｉ　／Ｂｇｌｌｌ断片を、種 々の利用可能なりＮＡ操作技術を使用して、ＡＣＰの発現カセットにおいて組み 合わせることができる。同様に、ｌ−２ナビン遺伝子のＥｃｏＲＶ部位から開始 コドンの直ぐ前までのほぼ１．７２５ｋｂの５゛配列、およびＴＡＧ停止コドン をほぼ１８塩基過ぎたＸｈｏ　１部位から３　’　ＨｔｎｄｌＩｒ部位までのは １．２５ｋｂのの３゛配列を含をする、ナピン発現カセットを：４製することが できる。　Ｂｃｅ４の発現カセットは、上流のＰｓｔ１部位ン部位へ戸Ｇ開始コ ドンの直ぐ前までのほぼ７．４ｋｂの５’　ＤＮＡ配列を、ＴＡＡ停止コドンの 直ぐ後から３“　Ｐｓｔ１部位までのほぼ１．９ｋｂの３゜配列と組み合わせる ことによって作ることができる。 変化をこれらの発現カセットにおいてなすことができ、このような変化の例は５ ′および３“の配列の量を増加または減少すること、１つの遺伝子の５′配列を 異なる遺伝子の３′配列と組み合わせること（例えば、ナビンの１．３ｋｂの５ ′配列をＡＣＰのＢｅｇ４−４の１．５ｋｂの３′配列とともに発現カセットに おいて使用すること）、あるいは他の入手可能の配列を使用することであり、た だしそれらの変化が種子の発育の間に適当な時間に挿入されたシンターゼ遺伝子 の発現を許す発現カセ７）を生ずることを条件とする。 １、ナビンの種子に特異的な発現カセットナビン１−２の廊墾佳賎影欠隻１カセ ットブラシカ・カンベストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のナビン遺伝子 から得ることができる５゛上流の配列および３°下流の配列を利用して発現カセ ットを、次のようにして構成することができる。 ５°上流の配列を含有するナピン１−２の２．７ｋｂのＸｈｏ　Ｉ断片（参照、 欧州特許（ＥＰ）第０２５５３７８号、１９８８年２月３日発行、の第２図）を ｐＣＧＮ７８９（通常のポリリンカーが制限消化部位ＥｃｏＲＩ、５ａｌｌ、Ｂ ｇｌｌｌ、Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｂａｗｌ　Ｉ　％ＨｉｎｄｌＩＩを エンコードする合成ポリリンカーと置換された、ｐＵＣに基づくベクター）の中 にサブクローニングし、そしてｐｃＧＮ９４０を生成する。ｐｃＧＮ９４０のナ ピン解読領域の大部分を５ａｌｌで消化して欠失させ、そして再結合してｐｃＧ Ｎ１８００を形成する。ｐｃＧＮ１８００からの一本鎖ＤＮＡを、合成オリゴヌ クレオチドを使用するｉｌ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発反応（Ａｄｅｌ−ａｎら 、ＯＮ＾（１９８３）　２　：　１８３−１９３）において使用し、これはナビ ン遺伝子のプロモーター領域とＡＴＧ開始コドンとの間の接合部にＥｃｏＲＶお よびＮｅｏ　Ｉ制限部位を挿入した。適当な突然変異体を、突然変異誘発および 配列の分析のために使用したオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーシヨンに より同定し、そしてｐｃＧＮ１８０１と命名した。 １．７ｋｂのプロモーターの断片を、ｐｃＧＮ１８０１から、ＥｃｏＲＶを使用 する部分的消化およびＥｃｏＲＩで切断したｐＣＧＮ７８６　（ｐＣＧＮ５６６ 　（実施例６Ｂ、１に記載するｐＣＧＮ５６５と反対の向きのポリリンカー）ク ロランフェニコールに基づくベクター、これは通常のポリリンカーの代わりに前 述の合成リンカ−をもつ）への結合によりサブクローニングし、そしてＤＮＡポ リメラーゼＩのクレノー断片でフィルインすることによって平滑末端としてｐｃ ＧＮ１８０２をつくった。 ３′下流の配列を含有するナピン１−２の２．１ｋｂのシンターゼ■断片をｐＣ ＧＮ７８９　（前述の）の中にサブクローニングし、そしてｐｃＧＮ８４１が得 られる。　ｐｃＧＮ９４１をＸｈｏ　Ｉおよび旧ｎｄｌＩＩで消化し、そして生 ずるほぼ１．６ｋｂのナビンの３′配列をＸｈｏ　ｌ−ＨｌｎｄＩＩＩで消化し たｐｃＧＮ１８０２の中に挿入して、ｐｃＧＮ１８０３を生成する。その自然の 向きに対して反対の向きに挿入された３２６ヌクレオチドの旧ｎｄＩＩＩ断片を 除去するために、ｐｃＧＮ１８０３の中の２つのＨｉｎｄｌＩＩ部位が存在する という事実の結果として、ｐｃＧＮ１８０３を旧ｎｄｌＩＩで消化し、そして再 結合する。再結合後、ここでもとの１．６ナビンの３′配列の１．２５ｋｂのの みを含有するクローンを選抜する。このクローンのｐｃＧＮ１８０８はナピン１ −２の発現カセットであり、そして１．７２５ｋｂのナピンのプロモーター配列 および１．２６５ｋｂの中間の独特クローニング部位５ａｌｔ、Ｂｇｌ　Ｉ　、 Ｐｓｔ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉをもつナピンの３′配列を含有する。 ビン１−２のＣＧＮ３２２３の　カセートあるいは、ｐｃＧＮ１８０８は、抗生 物質耐性マーカーではなく、発現配列のみをバイナリ−ベクター、例えば、ｐｃ ＧＮ１５５７へ動かすことができるようにするフランキング制限部位を含有する ように、修飾することができる（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｉ＊ｅｒｆｅｌｔ ）。Ｋｐｎ　Ｉ　５Ｎｏｔ　Ｉおよび旧ｎｄｌｌ［の制限部位を含有する合成オ リゴヌクレオナトをアニーリングし、そしてｐｃＧＮ１８０８の独特旧ｎｄｌ１ １部位で結合し、こうして１つのＨ４ｎｄｌｌｒ部位のみが回収されるようにす る。生ずるプラスミドのｐｃＧＮ３２００は、配列の分析により確証されるよう に、独特旧ｎｄｌｌｌ。 Ｎｏｔｌおよびにｐｎｌ制限部位をナビンの３°−ｍ節配列の３°末端にを含有 する。 ナピンの発現カセットの大部分は、ｐｃＧＮ３２００から、ＨｉｎｄＩＩＩおよ びＳａｃ　Ｉを使用する消化および旧ｎｄＩＩｒおよびＳａｃ　Ｉ消化したｐｌ ｃ１１９Ｒ（Ｍａｒｓｈら（１９８４）　Ｇｅｎｅ３２：　４８１−４８５）へ の結合によりサブクローニングしてｐｃＧＮ３２１２をつくる。鋳型としてｐｃ ＧＮ３２００およびＳａｃ　Ｉをフランキングする２つのプライマーを使用する Ｐｃｔ？、およびナビンの５°　−プロモーターおよびｐｃＧＮ１８０８からの ｐｃＧＮ３２００のｐＵＣ主鎖の接合により、ナビンのプロモーター領域の極端 の５′−配列を再構成する。前進プライマーはＣ１ａ　Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎ ｏｔｌおよびＫｐｎ　Ｉ制限部位ならびにナビンの５′　−配列のヌクレオチド ４０８−４２３　（ＥｃｏＲＶ部位から）を含有し、そして逆プライマーは５′ 　−プロモーターの中に独特Ｓａｃ　１部位を含むナピンの配列７１８−７３９ に対する相補性を含有する。　ＰＣＲは製造業者の規格に従いパーキン・エルマ ー／センスのサーマル・サイクラ−を使用して実施した。ＰＣＲ断片を平滑末端 の断片としてｐＵＣ８（ＶｉｅｔｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ　（１９８２）Ｇｅ ｎｅ１９　：　２５９−２６８）の中にサブクローニングし、そしてＨｉｎｃｌ ｌｌで消化してｐｃＧＮ３２１７を得る。　ｐｃＧＮ３２１７の配列はナピンの インサートを横切って、不適切なヌクレオチドがＰＣＲにより導入されなかった ことを評価する。ρＣＧＮ３２１７の中のナビンの５−配列を、発現カセットの 残部に、Ｃ１ａｌおよびＳａｃ　Ｉを使用する消化およびＣ１ａ　ＩおよびＳａ ｃ　Ｉで消化したｐｃＧＮ３２１２への結合により結合する。生ずる発現カセッ トのｐｃＧＮ３２２１をＨｉｎｄｒｌＩで消化し、そしてナビンの発現配列をゲ ル精製し、そしてＨｉｎｄｌｌｌで消化したｐＩＣ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈ、前掲） に結合する。最終の発現カセットはｐＣＧＮ３２２３であり、これは、アンピシ リン耐性バックグラウンドの中に、ｐｃＧＮ１８０８におし１て見む）だされる のと本質的に同一の１．７２５のナピン５°および１．２６５の３°調節配列を 含有する。ｉ１１節領域を旧ｎｄ［ＩＩ、ＮｏｔｌおよびＫｐｎ　Ｉ制限部位で フランキングし、そして独特５ａｉｌ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩおよびＸｈｏ　１ クロ一ニング部位を５゛および３°の非解読領域の間に位置させる。 ２、Ｂｃｅ４発現カセット 種子特異的発現のための発現カセットを、また、Ｂｅｅ４遺伝子配列、例えば、 第７図に表されているものから構成することができる。 Ｂｃｅ４遺伝子の調節配列を有するゲノムのクローンを、プローブとしてＢｃｅ ４配列を使用して、ブラシカ・カンペストオイス（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅ ｓｔｒｉｓ）のゲノムのライブラリーから単離することができる。 例えば、はぼ２０ｋＤのＢｇｌ　Ｉ断片を単離し、そしてＰＩＣＩと表示する。 クローンＰＩＣＩのほぼ２０ｋＤののインサートをＢｇｌｌ消化により解放し、 そしてバイナリ−ベクターｐｃＧＮ１５４７　（下を参照）のＢｇｌ　１部位の 中に揮大して、ｐｃＧＮ１８５３を生成する。　Ｂｃｅ４遺伝子を含有するｐｃ ＧＮ１８５３のＰｓｔｌ断片をｐＵｃｌＢ　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら（１９８３ ）前掲）のＰｓｔＩ部位の中に挿入して、ｐｃＧＮ１８５７を生成する。プラス ミドｐｃＧＮ１８５７をＡＴＣＣ、マリイランド州ロフクビレ、に１９９０年３ 月９日に、受は入れ番号６８２５１で受託された。　Ｂｃｅ４遺伝子を含有する ｐｃＧＮ１８５７のＣ１ａ　Ｉ断片をＣ１ａＩ消化したブルースクリプト（Ｂｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ）　ＫＳ＋　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、 カリフォルニア州うジ式う）の中に結合して、ｐｃＧＮ１８６４を生成する。− 末鎖ＤＮＡをρＣＧＮ１８６４から作り、そしてＡｄｅｌｗａｎら（ＯＮ＾（１ ９８３）　２　：　１８３−１９３）により記載されているようにｉｎ　ｖｉｔ ｒｏの突然変異誘発により、翻訳された開始および停止コドンのＢｃｅ４配列５ °および３°に対する相同性を有しかつ制限消化部位をコードするオリゴヌクレ オチドを使用して変更する。生ずるプラスミドのｐｃＧＮ１８６６は、Ｂｃｅ４ 開始コドンに対して直ぐ５°にＸｈｏ　ＩおよびＢａ５ｉｎ　Ｉ部位（ＢＣＥ４ ５Ｐから）およびＢｃｅ４停止コドンに対して直ぐ３゛にＢａｍＨＩおよびＳｅ ａ　Ｉ部位（ＢＣＥ４３Ｐ）を含有する。突然変異誘発した配列を含有するｐｃ ＧＮ１８６６のＣ１ａ　Ｉ断片を、ｐｃＧＮ２０１６のＣ１ａ　１部位（後述す る）のＣ１ａ　１部位の中に挿入して、ｐｃＧＮ１８６６ｃを生成する。　ｐｃ ＧＮ１８６６ｃのＣ１ａ　Ｉ断片を使用して、ｐｃＧＮ１８６７　（後述する） の対応する野生型Ｃ１ａ　Ｉ断片を置換して、ｐｃＧＮ１８６Ｂを生成する。 ｐｃＧＮ１８６８をＢａｍＨ１で消化し、そしてプラスミドを再環化させてｐｃ ＧＮ１８７０を生成することによって、Ｂｃｅ４解読配列を除去する。　Ｂｃｅ ４発現カセットのｐｃＧＮ１８７０は、７．４ｋｂの５゛調節配列およびクロー ニング部位、Ｘｈｏ　Ｉ　、Ｂａ＋ｓＨＩおよびＳ＋ｓａ　Ｉにより分離された Ｂｃｅ４のゲノムのクローンから誘導された１、９ｋｂの３゛調節配列を含有す る。 匹堕■虹 ｐＬＩｃ１８　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら（１９８３）前掲）のＢａｓ＋ＨＩおよ びＳｅａ　１部位を、Ｂａ５ＨＩ　−Ｓａｃ　ｌ消化およびプラスミドの再環化 により、末端を修復しないで、除去して、ｐｃＧ８１８６２を生成する。　Ｂｃ ｅ４遺伝子を含有するｐｃＧＮ１８６７のＰｓｔｌ断片をｐｃＧＮ１８６２のＰ ｓｔＩの中に挿入して、ｐｃＧＮ１８６７を生成する。 匹Ｕ刈■ ｐＬＩｃ１２−Ｃ＋１（Ｂｕｃｋｌｅｙ、、に、、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ％Ｕ ＣＳＤ、カリフォルニア州（１９８５））の多重クローニング部位をｐＵｃ１８ のそれらと置換して、ｐＣＧＮ５６５を生成する。クロランフェニコール耐性遺 伝子を含有する、ｐＣＧＮ５６５のＨｈａ　Ｉ断片を切除し、ヤエナリのヌクレ アーゼの使用により平滑末端とし、そしてブルースクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ）　ＫＳ　−（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、カリフォル ニア州うジッラ）のＥｃｏＲＶ部位の中に挿入して、ｐｃＧＮ２００Ｂをつくる 。　ｐｃＧＮ２００Ｂのクロランフェニコール耐性遺伝子を、ＥｃｏＲＩ−Ｈｔ ｎｄＩＩＩ消化により除去する。クレノー酵素で処理して末端を平滑末端とした 後、クロランフェニコール耐性遺伝子を有する断片をブルースクリプト（Ｂｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳ−のＤｒａ　１部位の中に挿入し、ブルースクリプト（Ｂ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にＳ−のアンピシリン耐性遺伝子を置換して、ｐｃＧＮ２ ０１６を生成する。 Ｂ１　の　のシン　−ゼ １、発現カセットの中にシンターゼ遺伝子の挿入単離したｃＤＮＡのクローンか らのシンターゼｃＤＮＡ配列を、発現カセットの中に、種々のＤＮＡ操作技術を 使用して、センスまたはアンチセンスの向きに挿入することができる０便利な制 限部位がシンターゼのクローンの中に存在する場合、それらを発現カセットの中 に、制限エンドヌクレアーゼを使用する消化および利用可能なりローニング部位 の１または２以上において消化したカセットの中への結合により、挿入すること ができる０便利な制限部位がクローンの中に存在しない場合、カセットまたは１ または２以上のシンターゼ遺伝子のＤＮＡを種々の方法で修飾して、１または２ 以上のシンターゼ遺伝子のカセットの中への促進することができる。　ＤＮＡを 修飾する方法の例は、ＰＣＨによる、合成リンカ−またはアダプターの場合、１ ｎｖＨｒｏの部位特異的突然変異誘発（Ａｄｅｌｓａｎら、前掲）、オーバーハ ング５°または３°末端のフィルインまたはカッティングバンク（ｃｕｔｔｉｎ ｇ　ｂａｃｋ）などを包含する。　ＤＮＡを操作するこれらおよび他の方法は当 業者によ（知られている。 例えば、トウゴマ（Ｒ，ｃｏｓ−ｕｎｉｓ）のシンターゼの因子ＡのｃＤＮＡ、 １−　Ｌ　Ａ、を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発により変更して、ｃＤＮ＾ ＤＮＡ−トの５°末端にＢａｍＨ１１１１１限部位、および翻訳停止コドンの直 ぐ３°にＸｈｏ　ＩおよびＳ＋ｗａ　［部位を挿入する。生ずる構成体のｐｃＧ Ｎ２７８１をＢａｗｌ　ｌおよびＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてＢｇｌｌｌおよび Ｘｈｏ　ｌ消化したｐＣＧＮ３２２３、前述のナピンの発現力セント、の中に結 合して、ｐｃｃＮ２７８５を生成する。 トウゴマ（Ｒ，ｃｏａｕ＋ｕｎｉｓ）のシンターゼの因子ＢのｃＤＮＡ、ｐＣＧ Ｎ２７６５（２−８）、を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発により変更して、 ｃＤＮＡインサートの５°末端にＢａ５ＨＩ制限部位、および翻訳停止コドンの 直ぐ３°にＸｈｏ　Ｉおよび５Ｉｌａ　１部位を挿入する。生ずる構成体のｐＣ ＧＮ２７８３をＢａｄＩおよびＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてＢｇｌＩＩおよびＸ ｈｏ　１消化したｐＣＧＮ３２２３、前述のナビンの発現カセット、の中に結合 して、ｐＣＧＮ２７８６を生成する。 同様に、アンチセンス配列の発現のためのシンターゼ構成体を調製することがで きる。例えば、ブラシカ・カンペストオイス（Ｂ。 ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のシンターゼの因子ＢのｃＤＮＡのクローンのｐＣＧＮ ３２４８を突然変異誘発して、Ｓｅａ　Ｉ、Ｂｇｌｌｌおよび５ａｌｌ制限部位 を翻訳停止シグナルのほぼ２００塩基３°に挿入して、ｐＣＧＮ３２５５を生成 する。 ｐＣＧＮ３２５５を、ｃＤＮＡの５′末端から中にほぼ１４０塩基に位置する因 子ＢのｃＤＮＡの内部のＳａｌ！部位において、および突然変異誘発により挿入 された３°　Ｂｇ１１１部位において消化する。生ずるシンターゼの因子Ｂのｃ ＤＮＡ断片をＢｇｌｌｌおよび５ａｌＩ消化したｐＣＧＮ３２２３、前述のナヒ ンの発現力セント、の中に結合して、アンチセンス構成体ρＣＧＮ３２５７を生 成する。こうして、ナピンのプロモーターからのブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ ）のシンターゼの因子Ｂの転写は、内因性のブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のシ ンターゼの因子Ｂの遺伝子のそれに対して相補的である■ＲＮ＾を生成する。 同様なブラシカ（Ｂｒａｓｓ　１ｃａ）のシンターゼの因子Ｂのアンチセンス構 成体を、Ｂｃｅ４発現カセットの中で調製する。　ｐＣＧＮ３２５５　（前述し た）をＳａｃ　Ｉで消化して、シンターゼの因子Ｂの遺伝子断片を生成する。こ の断片をＸｈｏ　ｌ消化したＢｅｅ４発現カセット、ｐｃＧＮ１８７０　（前述 した）の中に結合して、アンチセンス構成体ｐｃＧＮ３２６０を生成する。 ２、植物の形質転換のためのバイナリ−ベクター発現カセットの中のシンターゼ 遺伝子、５゛配列／シンターゼ／３”配列を含有する断片を、バイナリ−ベクタ ー、例えば、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｗ）の形質転換についてＭｃＢ ｒｉｄｅおよびＳｕ＋＊ｍｅｒｆｅｌｔ（Ｐｌ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９９０ ）　１４：　２６９−２７６）により記載されているものの中にクローニングす ることができる。他のバイナリ−ベクターはこの分野において知られておりそし て、また、シンターゼカセットのために使用することができる。 例えば、ナピンの発現カセットの中のアンチセンスのブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ ａ）シンターゼの因子Ｂの構成体、ｐＣＧＮ３２５７、を、Ａｓｐ７１８（Ｋｐ ｎ　Ｉと同一の認識配列）で消化し、そしてＡｓｐ７１８消化したｐｃＧＮ１５ ７８（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｗｍｅｒｆｅｌｔ、前掲）の中にクローニング して、バイナリ−構成体ｐＣＧＮ３２５９を生成する。ナピンの発現カセットの 中のアンチセンスのブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）シンターゼの因子Ｂの構成体 、ｐｃＧＮ３２６０、を、Ｐｓｔｌで消化し、そしてＰｓｔｌ消化したｐｃＧＮ １５７８（阿ｃＢｒｉｄｅおよびＳｕ＋ｇｎｅｒｆｅｌｔ、前掲）の中にクロー ニングして、バイナリ−構成体ｐｃＧＮ３２６１を生成する。 同様に、前述のトウゴマ（Ｒ，ｃｏｓ＋５ｕｎｉｓ）のシンターゼの因子Ａおよ びＢの構成体をｐｃＧＮ１５５７　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕ＊ｓ＋ｅｒｆｅ ｌ　ｔ、前掲）または同様な構成体の中に結合して、シンターゼ因子の発現カセ ットを使用する形質転換のためのバイナリ−ベクターを生成する。 発現カセットおよびシンターゼ遺伝子を含有するバイナリ−ベクターを、実施例 ９に記載するような植物の形質転換のためにＨｏ１ｓ−ｔｅｒｓら（Ｍｏ１．Ｇ ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９７８）　１６３　：　１８１　１８７）の方法によ り、アゲロバクｉ”リーブム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ ＋　ｔｕ＋１ｅｆａｅｉｅｎｓ）ρ１（株ＥＨＡＩＯｆ　（Ｈｏｏｄら、Ｊ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９１（６）　１６８　：　１２９１−１３０１）の中 に形質転換する。 ３、形質転換された植物の分析 形質転換されたブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）　ｅ ｖ。 Ｔａｂｉｎ植物は、実施例９にブラシカ・ナプス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）について記 載したように、バイナリ−ベクターのｐＣＧＮ３２５９を含有する癌腫面（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細胞と同時培養することによって得られる。生ずる 植物からの成熟した単一の種子の油の分析（Ｂｒｏｗｓｅら、前掲）は、ステア レート含量が減少した種子の油を明らかにし、こうしてシンターゼＩＩ型活性へ のシンターゼの因子Ｂの寄与を支持する。 ４、植物の形質転換の他の方法 前述のバイナリ−ベクターは、癌腫面（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ）仲介の植 物の形質転換法に有用である。他の植物の形質転換法、例えば、実施例９Ｂに記 載されているＤＮＡのボンバード技術、およびエレクトロポレイシタンを同様に よく使用することができる。 ５．１より多いシンターゼ遺伝子を含有する構成体１より多いシンターゼ遺伝子 は植物において最適な効果を得るため要求される場合、遺伝子を発育する種子の 中で優先的に発現される２つの異なるプロモーター、例えば、前述のナビン、Ａ ＣＰおよびＢｃθ４の調節下に発現し、そして植物の同一のバイナリ−ベクター の中に導入するか、あるいは同時に異なるバイナリ−ベクターの中に導入するこ とができる。ｌより多いバイナリ−ベクターの使用は、両者の遺伝子の選抜可能 とするために、追加の選抜可能なマーカーの使用を必要とするであろう。使用で きる選抜可能なマーカーの例は、次のものを包含する：カナマイシン耐性のため のｎｐｔｌｌ遺伝子、これは阿ｃＢｒｉｄｅおよびＳｕ＋ｓｍｅｒｆｅｌｔ　（ 前掲）のバイナリ−ベクターの中で使用される、ニトリラーゼ遺伝子、ｂｘｎ、 これは除草剤のブロモキシニルに対する耐性を付与する、Ｓｔ、ａｌｋｅｒら（ Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）２４２：　４１９−４２３）により記載されてい る、および抗生物質のヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（ｖａｎ　 ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎら、Ｐｌ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、（１９８５）　５　：　２９９−３０２）。他の選抜可能なマーカー はまた知られており、そして植物の形質転換のためにバイナリ−ベクターの中で 使用することができる。あるいは、順次に所望の遺伝子の１つを発現する植物を 第２の所望の遺伝子を含有する構成体で形質転換することによって、遺伝子を植 物の中に導入することができる。この方法ハ、また、第２遺伝子の選抜のために 異なる選抜可能なマーカーの使用を必要とするであろう。 形質転換された植物の中で１より多い遺伝子を発現する他の別法は、前述の方法 により、各々がシンターゼ遺伝子の１つを発現している異なる植物を生産するこ とである０両者の遺伝子を発現する植物は、戻し交雑または他の植物の品種改良 技術により得ることができる。 実施例８　シンターゼおよびデサチュラーゼで形質転換された植物この実施例に おいて、カルタムス・ランフトリウス（Ｃ，ｔｉｎｃｔｏ−ｒｉｕｓ）から単離 されたデサチュラーゼを含有する構成体を記載する。 カルタムス・ランフトリウス（Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）のデサチュラーゼの クローン、ｐＣＧＮ２７５４、の完全なｃＤＮＡ配列は第８図に表されている。 Ａ、ＡＣＰ　カセー　の　のデサチューゼ゛　−植物の形質転換に適当なバイナ リ−ベクターの中にカルタムス・ランフトリウス（Ｃ，ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ） のΔ−９デサチュラーゼを含有するＡＣＰの発現力セントの調製を記載する。 ブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のへ〇Ｐ遺伝子から 得ることができる５°　−上流の配列および３”　−下流の配列を利用する発現 力セントは、次のようにして構成することができる。 ５′　−上流の配列を含有するＢａＨ２−４の１．４５ｋｂのＸｈｏ　Ｉ断片を 、クローニング／配列決定のヘクタープルースクリプト　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ）＋　（ストラタジーン・クローニング系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇＳｙｓ−ｔｅｍｓ）　、カリフォルニア州すンジエゴ）の中にサブクロー ニングする。生ずる構成体のｐｃＧＮ１９４１をＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてク ロランフェニコール耐性ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｍ１３＋ ベクター、Ｘｈｏｌｔ’消化Ｌ　タｐＣＧＮ２０１５ニ結合すル、　ｐｃＧＮ２ ０１５は実施例６に記載されている。これはプラスミドの抗生ＩＩＩ質耐性ヲペ ニシリン耐性からクロランフェニコール耐性に変更する。クロランフェニコール 耐性のプラスミドはｐｃＧＮ１９５３である。 ＢａＨ２−４の３”　−配列は、Ｍ１３ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ）＋ベクターのＳｓ　ｔ　Ｉ　／　ＢａｔａＨＩ部位の中にクローニングされ た５ｓｔｌ／ＢｇｌｌＩ断片上に含有される。　ｐｃＧＮ１９４０はｉｎ　ｖｉ ｔｒｏの部位特異的突？８変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ　（１９８３） 　２　：　１８３−１９３）により合成オリコヌクＬ、ｆ　チ）”　５　’　− ＣＴ丁ＡＡＧＡＡＧＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＡＡ ＧＡＧ−３”を使用して修飾して、Ｓｓｔ［部位からのＡＣＰ遺伝子１８のため のリーディングフレームの停止コドンの直ぐ後にＳｅａ　ＩおよびＰｓｔ１部位 を挿入する。この修飾されたプラスミドρＣＧＮ１９５０がらの３°　−非解読 配列を、Ｐｓｌ−５■ａｌ断片として、ＰｓｔｌおよびＳｅａ　Ｉで切断したｐ ＣＧＮ１９５３の中に動かす、生ずるプラスミドｐｃＧＮ１９７７は独特制限部 位ＥｃｏＲＶ　、　ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩをもつ発現カセットがらなり、こ れらの独特制限部位はこれらのＡＣＰ遺伝子領域の調節下に発現すべき遺伝子の クローニングのための１．４５ｋｂの５°および１．５ｋｂの３゛−非解読配列 の間に存在することができる。 ｐＣＧＮ２７５４からのデサチュラーゼのｃＤＮＡ配列を、次のようにして、Ａ ＣＰ発現力セフトｐｃＧＮ１９７７の中に挿入する。ｐｔＧＮｚｙｓ４を旧ｎｄ ｌｌＩ（開始コドンから１６０ヌクレオチド上流に位置する）およびポリ　（Ａ ）テイルの外側のポリリンカーの中の位置するＡｓｐ７１８で消化する。デサチ ュラーゼのための解読領域を含有する断片をＤＮＡポリメラーゼＩを使用して平 滑末端とし、そしてＥｃｏＲＶで消化したｐｃＧＮ１９７７に結合した。　ＡＣ Ｐプロモーターに関してセンスの向きにデサチュラーゼの配列を含有するクロー ンを選択し、そしてｐｃＧＮ１８９５と呼ぶ。ｐＣＧＮ１８９５の発現配列ＡＣ Ｐ　５°／デサチユラーゼ／ＡＣＰ３°を含有する断片を、癌腫面（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ）のためのバイナリ−ベクターｐｃＧＮ１５５７（後述する） の中に、＾５ｐ７１８を使用する消化および＾５ｐ７１８およびＸｂａ　１で消 化したｐｃＧＮ１５５７への結合によりクローニングする。 生ずるバイナリ−ベクターをｐｃＧＮ１８９８と呼ぶ。 Ｂ、アンチセンス　の　の−゛サチェーーゼアンチセンス構成体の転写のための カセットは、実施例７に記載する種子優先的発現カセットを包含するが、これら に限定されない。 アンチセンス構成体を下に記載し、これは生成される＠ＲＮＡ１ｉが内因性デサ チュラーゼ遺伝子のそれに対して相補的であるように、ブラシカ・カンペストオ イス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のデサチュラーゼのｃＤＮＡクローンを転写 の５°−３°の向きにおいて構成的に転写できるようにする。 ■、ブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のデサチュラー ゼのｃＤＮＡの単離 デサチュラーゼのためのｃＤＮＡクローンを、実施例６Ｄ、１に記載するフ゛ラ シカ・カンペストオイス　（Ｂ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）のｃＤＮ＾ＤＮＡラリ ーからｊｌｉＨする。２つのクローン、ｐＣＧＮ３２３５およびｐＣＧＮ３２３ ６の部分的ＤＮＡ配列を、それぞれ、第９Ａ図および第９Ｂ図に表されている。 これらのクローンの３゛領域の初期ＤＮＡ配列の分析は、ｐＣＧＮ３２３５およ びｐｃＧＮ３２３６が同一遺伝子のｃＤＮＡクローンであることを示す。 ｐＣＧＮ３２３６はｐｃＧＮ３２３５より短いクローンであり、そしてρＣＧＮ ３２３５はブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｓｐｅｓｔｒｉｓ）のデサチ ュラーゼ遺伝子の全体の解読領域を含有するように思われる。 ２、バイナリ−ベクターの構成 バイナリ−ベクターｐｃＧＮ１５５９（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｓｅｒｆｅ ｌｔ、　Ｐｌ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、　（１９９０）　１４　：　２６９−２７６）のＫｐｎ　Ｉ　、Ｂａ ｍＨＩおよびＸｂａ　Ｉ部位をＡｓｐ７１Ｂ／　Ｘｂａ　Ｉ消化により除去し、 次いで末端を平滑末端とし、そして再環化ｐＣＧＮ６７を生成する。３５Ｓプロ モーター−ｔ■１３”カセットを含有するｐＣＧＮ９８６の１．８４ｋｂのＰｓ ｔ　Ｉ　／ＨｉｎｄｌＩＩ断片を、Ｐｓｔｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＣＧＮ ６７の中に挿入してｐｃＧＮ２９１を生成する。 ３５３プロモーター−を耐３°の発現カセットのｐＣＧＮ９８６は、カリフラワ ーのモザイク病ウィルス３５　Ｓ　（ＣａＭＶ３５）のプロモーターおよびそれ らの間に多重制限部位をもつＴ−ＤＮＡのｔ■１３°　−領域を含有する。ＧＩ ＣＧＮ９８６を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび異なる３“領域、ＣａＭＶ ｊｌ域ＶＩ３°末端を含有する他のカセット、ｐｃＧＮ２０６から誘導する。　 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、ＡｌｕＩ断片（ｂｐ７１４４−７７３４）　（ Ｃａｒｄ−ｎｅｒ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　９　： ２８７１−２８８８）　として、Ｍ１３ｓｐ７（Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８１）　９　：　３０９　３２１）のＨａｅｌＩ部 位の中にクローニングしてＣ６１４をつくる。　Ｃ６１４のｆ！ｃｏＲＥ消化は ３５３プロモーターを含有するＣ６１４からのＥｃｏＲＩ断片を含有し、これを ｐＵＣ８（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１ ９　：　２５９）のＥｃｏＲ１部位の中にクローニングしてρＣＧＮ１４７を生 成する。 プロモーター領域、選抜可能なマーカー（２つのＡＴＧをもっＫＡＮ）および３ °領域を含有するｐｃＧＮ１４８ａを、ｐＣＧＮ５２８をＢｇｌｌｌで消化し、 そしてｐｃＧＮ１４７からのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩプロモーター断片を挿入す ることによって調製する。この断片を、ＢｇｌｌＩ部位がρＣＧＮ５２８のカナ マイシン遺伝子に近接するように、ｐＣＧＮ５２８のＢｇｌＩＩ部位の中ニクロ ーニングする。 この構成体のｐＣＧＮ５２Ｂのために使用したシャトルベクターを次のようにし てつくる：カナマイシン遺伝子を収容するＴｎ５を含有するプラスミド（Ｊｏｒ ｇｅｎｓｏｎら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９）　１７？　＝　 ６５）をＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｇ）Ｉ　Ｉで消化し、そしてカナマイシン遺伝子 を含有するＨｉｎｄｌＩＩ　−ＢａｍＨＩ断片をｐＡｃＹｃ１８４　（Ｃｂａｎ ｇおよびＣｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌ、　（１９７８）　１３４　 ：　１１４１−１１５６）のテトラサイクリン遺伝子の中の旧ｎｄｌｌｌ−Ｂａ ｍＨＩの中に挿入することによって、９０ＧＮ５２５を作る。 Ｓ■ａＩ部位の中に挿入されたＸｈｏ　Ｉリンカ−で修飾された、ｐＴｉＡ６（ Ｔｈｏａａｓｈｏｗら、Ｃｅ１ｌ　（１９８０）　１９：　７２９−７３９）の Ｂａ５ＨＩ断片１９を、ｐｃＧＮ５２５の中に挿入することによって、９ＣＧＮ ５２６を作った。　ｐｃＧＮ５２６から小さいＸｈｏ　Ｉ断片をＸｈｏ　Ｉで消 化しそして再結合することによって、ｐＣＧＮ５２Ｂを得る。 ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩからのＢａｗｌ　Ｉ−カナマイシン遺伝子断片をｐｃＧＮ １４８ａのＢａｍＨ１部位の中にクローニングすることによって、ｐｃＧＮ１４ ９ａを作る。 ｐＭＢ９ＫａｎＸＸＩはｐＵＣ４に変異型（ＶｉａｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ 、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）１９：　２５９−２６８）であり、この変異型はＸ ｈｏ　Ｔ部位を欠如するが、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋）における 効率よい選抜を可能とするＴａ２０５からの機能的カナマイシンを含有する。 ｐｃＧＮ１４９ａを旧ｎｄｌｌ！およびＢａｍ＋ＨＩで消化し、そしてＨｉｎｄ ｌｌｌおよびＢａｗｌ　Ｉで消化したｐＵＣ８に結合してｐｃＧＮ１６９を生成 する。これは↑ｎ９０３カナマイシンマーカーを除去する。　ｐＣＧＮ５６５（ 実施例６に記載する）およびｐｃＧＮ１６９０両者をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓ ｔＩで消化し、そして結合してｐｃＧＮ２０３を形成し、これはＣａｌ’１Ｖ３ ５ＳおよびＴｎ５のカナマイシン遺伝子の５°末端の一部分（Ｐｓｔ１部位まで 、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら、（１９７９）、前掲）を含有するプラスミドである。 ３′−調節領域をｐｃＧＮ２０４、すなわち、ｐＵｃｌＢの中にクローニングさ れたＶＩ３″領域を含有するＣａＭＶのＥｃｏＲ［断片（ｂｐ４０８　６１５０ ）（Ｙａｎｉｓｈｃ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ　（１９８５）　３３：　１０ ３−１１９）からのｐＣＧＮ２０３に、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＰｓｔｌを使用す る消化および結合により付加する。生ずるカセットのｐｃＧＮ２０６はｐＣＧＮ ９８６の構成のための基礎である。 ｐＴｔＡ６ｎｏＴ　−ＤＮＡのｔ耐３°　−配列をＢａｍ１９のＴ−［ＩＮＡ断 片（ＴｈｏＩｌｌａ−ｓｈｏ−ら、（１９８０）前掲）からＢａｍ＋ＨＩ　−Ｅ ｃｏＲＩ断片（ヌクレオチド９０６２−１２，８２３、Ｂａｋｅｒら、Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．８ｉｏ１．（１９８２）　２　：　３３５　３５０におけるように 番号を付す）サブクローニングし、そしてＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片と して複製のｐＡＣＹＣ１８４（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ　（１９８７）、前 掲）由来およびＢａ＋ｓ）Ｉ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片としてゲンタマイシン耐 性マーカー（プラスミドｐＬＢ４１から）　、Ｄ、Ｆｉｇｕｒｓｋｉから入手し た）と組み合わせて、ｐ（：ＧＮ４１７を生成する。 ｐｃＧＮ４１７（Ｂａｍ１９断片のヌクレオチド１１，２０７）の独ｖＦＳ＋ｗ ａＩ部位をリンカ−を使用してＳａｃ　１部位に変化させ、そしてＢａ５ＨＩ　 −Ｓａｃ　１断片をｐＣＧＮ５６５の中にサブクローニングしてｐｃＧＮ９１７ を得る。 ｐｃＧＮ９７１のＢａｍｔ（１部位をリンカ−を使用してＥｃｏＲ１部位に変化 させる。生ずるｔｓ１３’　調節配列を含有するＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ　Ｉ断片 をｐｃＧＮ２０６にＥｃｏＲＩおよびＳａｃ　Ｔで消化することによって接合し て、ｐＣＧＮ９７５を生成する。Ｔｎ５のカナマイシン耐性遺伝子の小さい部分 を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの３′末端から、５ａｌｌおよびＢｇｌＩＩで 消化し、末端を平滑末端とし、そして５ａｌｌリンカ−と結合させることによっ て欠失する。最後の発現カセットのｐＣＧＮ９８６はＣａＭν３５Ｓプロモータ ー、次いで５ａｌｌ部位、Ｘｂａ　１部位、ＢａｍＨＩ　５ＳＩｌａ　Ｉ　、　 Ｋｐｎ　ｒおよびｔ−１３°領域（Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチド１１２０７−９０ ２３）を含有する。 ３、デサチュラーゼ配列の挿入 ブラシカ・カンペストオイス（Ｂ、ｃａｍｐｅｓ　ｔｒｉｓ）のデサチュラーゼ のｃＤＮＡクローンからの１．６ｋｂのＸｂａ　Ｉ断片（これはデサチュラーゼ のＤＮＡを含有する）を、ｐｃＧＮ２９１のＸｂａ　１部位の中に、アンチセン スの向きで挿入してｐＣＧＮ３２３４を生成する。デサチュラーゼの構成体を所 望の植物の宿主の中に、適当な方法、例えば、実施例９に記載されている方法を 使用して形質転換する。 Ｃ１の　のシン　−ゼおよび−゛サチユーーゼ実施例７に記載されているような シンターゼ構成体およびデサチュラーゼ構成体、例えば、前述のものの両者を含 有する植物は、任意の適当な形質転換法、例えば、実施例９に記載されている方 法を使用して調製することができる。構成体は、普通のバイナリ−ベクターの中 で、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を植物の形質転換のために使用する とき、−緒にするか、あるいは異なる選抜可能なマーカーを使用して異なるバイ ナリ−ベクター上において同時に植物の中に導入することができる。また、シン ターゼおよびデサチュラーゼの構成体を含有する植物は、所望の配列の一方を含 有る植物を他方の所望の配列を含有する構成で再形質転換することによって調製 することができる。 形質転換された植物の中で１より多いシンターゼ遺伝子およびデサチュラーゼ遺 伝子を発現する他の方法は、前述の方法により、異なる植物（それらの各々は所 望の遺伝子の１つを発現している）を生産することである。すべての所望の遺伝 子を発現する植物は、戻し交雑または他の植物の品種改良の技術により得ること ができる。 実施例９　植物の形質転換 この実施例において、癌腫菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ）仲介の植物の形質 転換を記載し、そしてブラシカ・ナブス（Ｂ、ｎａｐｕｓ）を例示する。また、 ＤＮＡのボンバードの植物の形質転換を記載し、そしてナンキンマメの形質転換 を例示する。 Ａ、ブ、ｉ２左二づ′プス（Ｂ、ｎ　ｕｓ）　（Ｄ　Ｊｉ転遺ブランカ・ナブス （Ｂ、ｎａｐｕｓ）　ｃν、Ｄｅｌｔａの種子を９５％のエタノールの中で２分 間ソーキングし、１滴のツイーン２０を含有する次亜塩素酸ナトリウムの１．０ ％の溶液の中で４５分間表面滅菌し、そして無菌の蒸留水の中で３回すすぐ０次 いで、種子をマゼンタ（Ｍａｇｅｎ　ｔａ）ボックスの中で、ピリドキシン（５ ０ｇｇ／ｌ）、ニコチンｆｌ！（５０ｇｇ／ｌ）、グリシン（２００μｇ／ｌ） および０．６％のフィテイガー（Ｐｈｙｔａｇａｒ）　（ギブコ　（Ｇｉｂｃｏ ））を補充した１　／１０１度のムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅ）最小有機培 地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））　ｐＨ５，８でプレートする。 種子を培養室内で２２℃においてほぼ６５μアインシュタイン／平方メートル／ 秒（μＥｍ−”　Ｓ−’）の強度の冷たい蛍光および赤色の光を使用する１６時 間の光同期で発芽させる。 胚軸を７日後の実生から切除し、はぼ４ｍｓ＋の長さの片に切断し、そしてフィ ーダープレート（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）上でプレートする。 フィーダープレートは、使用の１日前に、１．０１のタバコの懸濁培養物をベト リブレート（１００Ｘ　２５ｍ５）上にプレートすることによって調製し、ここ でベトリブレートは約３０−１のＭＳ塩の塩基（カロリナ・バイオロジカル（Ｃ ａｒｏｌｉｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ））、１００ｓ＋ｇ／　１のイノシトー ル、１．３−ｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌ、２００ｍｇのＫＨｉｐ島および３％の シｇ糖、２　、　４−　Ｄ　（１，０ｍｇ／　Ｉ　）、０．６％のフィティガー （Ｐｈｙｔａ−ｇａｒ）を含有し、そしてｐＨをオートクレーブ処理（ＭＳ　Ｏ ／　１　／　Ｏ培地）前に５．８に調節する。無菌の濾紙のディスク　（ワット マン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ｍｓ）を、使用前に、フィーダ一層の上部に配置する 。タバコの懸濁培養物を、ｌｏｓ＋１の培養物を１００ａ＋１の新鮮なＭＳ培地 （２，４−Ｄ（０，２ｍｇ／　１　）　、カイネチン（０，１ｍｇ／　ｌ　）を 有するフィーダープレートについて前述した）の中に移すことによって毎週継代 培養する。 すべての胚軸の外植体をフィーダープレートの上で２２℃において強度３０μＥ ｍ−”　Ｓ−’〜６５の連続的光の中で２４時間予備インキエベーンヨタンる。 バイナリ−プラスミドを含有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌＩｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　シンターゼＥＨＡＩＯＩ の単一のコロニーを５ｍｌのＭＧ／Ｌブロスに移し、そして３０℃において一夜 成長させる。１リツトル当たり、？ＩＧ／Ｌフ゛ロスは５ｇのマンニトール、１ ｇのし一グルタミン酸または１．１５ｇのグルタミン酸ナトリウム、０．２５　 ｇのにｔｌｚＰＯｎ、０．１０ｇのＮａＣ１，，０，１０ｇのＭｇ５Ｏ＊　Ｈ７ ＨｚＯ１ｌ＋ｓｇのビオチン、５ｇのトリプトン、および２．５ｇの酵母エキス を含有し、そしてプロスをｐＨ１，０に調節する。胚軸の外植体をバクテリアを １×１０＠バクテリア／ｍｌに希釈した７〜１２ｍ１のＭＧ／Ｌプロスの中に浸 漬しそして１０〜２０分後、フィーダープレート上に配置する。癌腫面（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と４８時間同時にインキュベーションした後、胚軸の外 植体をＢ５０／Ｉ１０力ルス誘発培地に移し、この培地は濾紙滅菌したカルベニ シリン（５００ｍｇ／　ｌ　、オートクレーブ処理後添加した）および硫酸カナ マイシン（ベーリンガー・マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ））を２５ｍｇ／　１の濃度で含有する。 ６５μＥＩｌづｓ−１〜７５μＦｉｇ−”　Ｓ−’の連続的光の中の培養の３〜 ７日後、カルスの組織は切断した表面上に見ることができ、そして胚軸の外植体 をシュート誘発培地、８５ＢＺ　（Ｂ　Ｓ塩類およびビタミン類、３ｍｇ／ｌの ベンジルアミノプリン、ｌａｇ／ｌのゼアチン、１％のシ＝ｌ＄１．０．６％の フィテイガー（Ｐｈｙｔａｇａｒ）を補充しそしてｐＨを５．８に調節した）に 移す、この培地は、また、カルベニシリン（５００ｓ＋ｇ／　１　）および硫酸 カナマイシン（２５ｍｇ／　ｌ　）を含有する。胚軸の外植体を新鮮なシュート 誘発培地上に２週毎に継代培養する。 シュートは、１〜３力月後、胚軸のカルスから再生する。少なくともｌｃ−の高 さの緑色のシュートをカルスから切断し、そしてＢ５塩類およびビタミン類、１ ％のシーＪｔ１Ｍ、カルベニシリン（３００ｍｇ／　１　）、硫酸カナマイシン （５０ｍｇ／　ｌ　）および０．６％のフイテイガ−（Ｐｈｙｔａ−ｇａｒ）を 含有する培地上に配置し、そして種子の発芽について記載した条件で培養室の中 に配置する。２〜４週後、緑色のままであるシュートを基部で切断し、そして根 誘発培地（ＢＳ塩類およびビタミン類、１％のショ糖、１ｍｇ／ｌのインドール 酪酸、５０ｍｇ／　ｌの硫酸カナマイシンおよび０．６％のフイテイガー（Ｐｈ ｙｔａｇａｒ））を含有するマゼンタ（Ｍａｇｅｎ　ｔａ）ボックスに移す。緑 色の５ｈｔＮＰＴ　ＩＩ活性について試験する。 Ｂ１ナンキンマメの　−１ 少なくともプロモーター領域、問題の遺伝子、および停止領域からなる問題のＤ ＮＡ配列を、欧州特許出願第３３２８５５号および同時継続出１１ＵＳＳＮＯ７ ／２２５．３３２号、１９８８年７月２７日提出に記載されているように、粒子 のボンバードにより植物のゲノムの中に導入することができる。 簡単に述べると、０．５μＭ〜３μＭの大きさのタングステンまたは金の粒子を 発現カセットのＤＮＡで被覆する。このＤＮＡは乾燥ＤＮＡ／粒子の沈澱物の水 性混合物であることができる。 ボンバードの標的として使用する組織は、子葉の外植体、シュートの分裂組織、 未熟の葉または朽からのものであることができる。 組織とＤＮ＾被覆した粒子とのボンバードは、バイオリスチフス（Ｂｉｏｌｉｓ ｔｉｃｓ魔）粒子のガン（デュポン（Ｄｕｐｏｎ）　、デラウアア州つィルミン トン）を使用して実施する０粒子をバレルの中にバレルの口から１ｃ−〜１４ｃ ｍの可変距離で配置する。ボンバードすべき組織を停止板の下に配置する；試験 は組織について２０ｃｍまでの距離で実施する。放電の瞬間において、組織をナ イロンネットまたはナイロンネットと１０＋＋ｒＩ〜３００ｍＭの範囲のメツシ ュとの組み合わせにより保護する。 ボンバード後、植物をＡｔｒｅｙａら（Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌａｔｔ ｅｒｓ　（１９８４）３４：　３７９−３８３）の方法に従い再生することがで きる。簡単に述べると、胚の軸あ組織または子葉のセグメントをＭＳ培地（Ｍｕ ｒａｓｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、　Ｐｈｙｓｉｏ、Ｐｌａｎｔ、（１９６２）　 １５　：　４７３）　（ＭＳ＋２．０＋ｓｇ、の６−ベンジルアデニン（ＢＡ） 　、子葉のセグメントについて）上に配置し、そして暗所で１週間２５±２℃に おいてインキュベーションし、そして引き続いて連続的な白色の蛍光（６，８／ ｍ）に移す、培養の第１０日に、苗を無菌の土を含有するポットに移し、日陰に ３〜５日間保持し、そして最後に温室へ動かす。 推定上のトランスジェニックシュートは根を形成する。植物のゲノムの中への外 因性ＤＮＡの組み込みは、種々の当業者に知られている方法によって確証するこ とができる。 上の結果は、シンターゼ活性、ことにシンターゼＩまたはシンターゼＩＩをもつ タンパク質調製物を調製し、このようなタンパク質調製物に関係するＤＮＡ配列 を単離し、そしてそれらを操作する能力を証明する。このようにして、生産、こ とに分化した細胞の生産物、または植物のシンターゼの阻害を可能とする、転写 の構成体および発現カセットの生成することができる。こうして、特定の植物の 表現型を修飾することができる。 精製されたトウゴマ（Ｒ，ｅｏｍｓｕｎｉｓ）のシンターゼが得られ、そしてこ れを使用して核酸配列が得られる。そのタンパク質または配列から、他の植物の シンターゼを得ることができる。 この明細書において述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する 技術水準を示す、刊行物および特許出願は、個々の刊行物および特許出願が引用 によって加えることを特別にかつ個々に示すのと同一の程度に、ここにおいて引 用によって加える。 前述の発明は理解を明瞭にする目的で例示および実施例により多少詳細に記載し たが、明らかなようにある種の変化および変更を添付する請求の範囲ないで実施 することができる。 Ｆｌ：　ＮＴＴＩＳＡＰＫＫＲ セルレニン時間経過 セルレニンと共にブレインキュベーション時間、分ＦＩＧ、！ ＫＲＩ：　５ＦＳＴＤＧＷＩ／ＡＰＫ ｎ　へ　−〇　〇 ａ）　的　へ　色　の マ　の　ψ　ψ　さ Φ　ｏ　ｏ　Φ　ｌＪ）　さ　ｉ　へ　！　い　い　のＮ　Ｆ’ｌ　Ｆ’ｌ　Ｎ Ｏ）　（り　ＣＤ　Ｑ）　？　９　９　Ｆ＋へ　へ　へ　へ　へ　へ　ヘ　〜　 ｌ’＋　＋’ｌ’ｌ　ｍ　ｍ手続補正書（方式） 平成　夕年　３月ノ５″″日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、長い鎖長のアシル−ＡＣＰに比較して短い鎖長のアシル−ＡＣＰに対して優 先的活性を有するトウゴマ（Ｒ．Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から得ることができる、植 物のβ−ケトアシルシンターゼのタンパク質調製物。 ２、少なくとも１５μモル／分／ｍｇタンパク質の比活性を有する、請求の範囲 第１項に記載のタンパク質調製物。 ３、短い鎖長のアシル−ＡＣＰに比較して長い鎖長のアシル−ＡＣＰに対して優 先的活性を有する、植物のβ−ケトアシルシンターゼのタンパク質調製物。 ４、少なくとも１．７μモル／分／ｍｇタンパク質の比活性を有する、請求の範 囲第３項に記載のタンパク質調製物／５、前記調製はトウゴマ（Ｒ．ｃｏｍｍｕ ｎｉｓ）から得ることができる、請求の範囲第３項に記載のタンパク質調製物。 ６、工程： ａ、トウゴマ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の未熟の胚乳のホモジネートを約４０重 量％／体積の硫酸アンモニウム溶液で分別し、そして上澄み液を回収し、 ｂ、工程（ａ）に比較して高く、活性シンターゼタンパク質を有するタンパク質 を沈澱させるために十分な濃度の、硫酸アンモニウムと、前記上澄み液を接触さ せ、 ｃ、工程（ｂ）において回収された沈澱物を再懸濁させ、そして生ずる溶液を反 応性グリーン１９アガロース（ＲｅａｃｔｉｖｅＧｒｅｅｎ−１９Ａｇａｒｏｓ ｅ）のクロマトグラフィーにかけ、そして高い塩の洗浄液中のシンターゼ活性を 有するタンパク質を溶離し、ｄ、工程（ｃ）から調製した部分的に脱塩されたタ ンパク質の分画をＡＣＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム上に吸収 させ、ｅ、植物のシンターゼ活性を有する分画を１００〜２５０ｍＭのリン酸カ リウム緩衝液の勾配で溶離ずる、 からなる方法に従い調製された、植物のβ−ケトアシルシンターゼのタンパク質 調製物。 ７、工程（ｅ）から溶離された最初の主要な分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に適用 し、そして約５０ｋＤおよび４６ｋＤの少なくとも２つの主要なバンドを観察す る工程をさらに含む、請求の範囲第６項に記載のタンパク質調製物。 ８、前記５０ｋＤのタンパク質調製物は第６図に示すアミノ酸配列からなる、請 求項７に記載のタンパク質調製物。 ９、工程（ｅ）からの後期の主要な分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に適用し、そし て約５０ｋＤの少なくとも１つのバンドを観察する工程をさらに含む、請求の範 囲第６項に記載のタンパク質調製物。 １０、請求の範囲第７項に記載の５０ｋＤのタンパク質の少なくとも一部分をエ ンコードするｃＤＮＡ配列。 １１、請求の範囲第７項に記載の４６ｋＤのタンパク質の少なくとも一部分をエ ンコードするｃＤＮＡ配列。 １２、請求の範囲第９項に記載の５０ｋＤのタンパク質の少なくとも一部分をエ ンコードするｃＤＮＡ配列。 １３、異種配列に接合した請求項１０〜１２のいずれかに記載のｃＤＮＡから得 ることができるβ−ケトアシルシンターゼをエンコードする核酸配列。 １４、請求項１０〜１２のいずれかに記載のｃＤＮＡから得ることができるβ− ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの少なくとも一部分をエンコードするｃＤＮＡ配 列。 １５、工程： Ｃ２〜Ｃ１６の鎖長を有するアシル−ＡＣＰおよびマロニル−ＡＣＰをトウゴマ （Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から得ることができるβ−ケトアシルシンターゼのタ ンパク質調製物と接触させ、ここで前記シンターゼは、前記アシル−ＡＣＰおよ びマロニル−ＡＣＰの縮合を可能とする条件下に、トウゴマ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎ ｉｓ）細胞に対してして外部に存在する、からなる前記アシル−ＡＣＰと前記マ ロニル−ＡＣＰとの縮合反応を触媒する方法。 １６、前記アシル−ＡＣＰはＣ２〜Ｃ１４の鎖長を有し、そして前記シンターゼ は長いアシル−ＡＣＰ脂肪酸に比較して短いアシル−ＡＣＰ脂肪酸に対して優先 的活性を有する、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７、前記アシル−ＡＣＰはＣ２〜Ｃ１６の鎖長を有し、そして前記シンターゼ は短いアシル−ＡＣＰ脂肪酸に比較して長いアシル−ＡＣＰ脂肪酸に対して優先 的活性を有する、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １８、前記接触をｉｎｖｉｔｒｏで実施する、請求の範囲第１５項に記載の方法 。 １９、前記接触をｉｎｖｉｏで実施する、請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２０、植物のシンターゼを発現することができる発現構成体をそのゲノムの中に 組み込んで有する植物細胞を成長させることをさらに含む、請求の範囲第１９項 に記載の方法。 ２１、植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列の少なくとも一部分から なる組み換えＤＮＡ構成体。 ２２、前記植物シンターゼタンパク質はシンターゼ因子Ａである、請求の範囲第 ２１項に記載の組み換えＤＮＡ構成体。 ２３、前記植物シンターゼタンパク質はシンターゼ因子Ｂである、請求の範囲第 ２１項に記載の組み換えＤＮＡ構成体。 ２４、生物学的に活性な植物シンターゼをエンコードする、請求の範囲第２１項 に記載の構成体。 ２５、前記配列を第２核酸配列に接合し、前記第２核酸配列は前記第１配列に自 然に接合されていない、請求の範囲第２１項に記載の構成体。 ２６、前記配列は標識に接合されている、請求項２１に記載の構成体。 ２７、前記配列は前躯体の植物シンターゼタンパク質をエンコードする、請求の 範囲第２１項に記載の構成体。 ２８、転写の５′→３′の方向において、宿主細胞の中で機能的である転写調節 領域および前記配列からなる、請求の範囲第２１項に記載の構成体。 ２９、前記配列はセンス配列である、請求の範囲第２８項に記載の構成体。 ３０、前記配列はアンチセンス配列である、請求の範囲第２８項に記載の構成体 。 ３１、前記配列に対して直ぐ５′の宿主細胞の中で機能的である翻訳調節領域お よび前記配列に対して３′の転写／翻訳停止調節領域をさらに含む、請求の範囲 第２８項に記載の構成体。 ３２、転写の５′→３′の方向において、宿主細胞の中で機能的な転写開始調節 領域、前記宿主細胞の中で機能的な翻訳開始調節領域、植物シンターゼタンパク 質をエンコードするＤＮＡセンス配列、および前記宿主細胞の中で機能的な転写 および翻訳停止調節領域からなり、ここで前記植物シンターゼタンパク質をエン コードする配列は前記調節領域のコントロール下にある、宿主細胞の中で植物シ ンターゼタンパク質を生産することができる発現カセットからなる、請求の範囲 第２１項に記載の構成体。 ３３、前記宿主細胞は植物細胞である、請求の範囲第３２項に記載の構成体。 ３４、前記転写開始領域は植物の種子の組織から得られる、請求の範囲第１１項 に記載の構成体。 ３５、前記植物シンターゼタンパク質は長いアシル−ＡＣＰ担体タンパク質の脂 肪酸に対する優先的活性に要求される、請求の範囲第２１項に記載の構成体。 ３６、前記植物シンターゼタンパク質は短いアシル−４ＣＰ担体タンパク賞の脂 肪酸に封ずる優先的活性に要求される、請求の範囲第２１項に記載の構成体。 ３７、前記トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびブラシカ（Ｂｒ ａｓｓｓｉｃａ）から得ることができる、請求の範囲第２１項に記載の構成体。 ３８、請求の範囲第２１〜２７項のいずれかに記載の植物シンターゼタンパク質 をエンコードする配列からなる宿主細胞。 ３９、前記細胞を植物細胞である、請求の範囲第３８項に記載の細胞。 ４０、第２組み換えＤＮＡ構成体は植物脂質に影響を与えることができる酵素を エンコードする植物の配列の一部分をさらに含む、請求の範囲第３９項に記載の 細胞。 ４１、前記酵素はデサチュラーゼまたはチオエステラーゼである、請求の範囲第 ４０項に記載の細胞。 ４２、前記植物細胞はｉｎｖｉｖｏである、請求の範囲第３９項に記載の細胞。 ４３、前記植物細胞はブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物細胞である、請求の 範囲第３９項に記載の細胞。 ４４、組み換えＤＨＡ配列から発現された植物シンターゼタンパク質からなるト ランスジェニック宿主細胞。 ４５、前記宿主細胞は植物細胞である、請求の範囲第４４項に記載の細胞。 ４６、前記植物シンターゼタンパク質は長いアシル−ＡＣＰ担体タンパク質の脂 肪酸に対する優先的活性に要求される、請求の範囲第４５項に記載の細胞。 ４７、前記植物シンターゼタンパク質は短いアシル−４ＣＰ担体タンパク質の脂 肪酸に対する優先的活性に要求される、請求の範囲第４５項に記載の細胞。 ４８、植物シンターゼタンパ質の生産を可能とする条件下に、請求項３２〜３４ のいずれかに記載の構成体からなる宿主細胞またはその子孫を成長させることか らなる、宿主細胞またはその子孫の中で植物シンターゼタンパク質を生産する方 法。 ４９、前記宿主細胞は植物細胞であり、そして前記構成体は前記植物細胞のゲノ ムの中に組み込まれる、請求の範囲第４８項に記載の方法。 ５０、前記植物細胞はｉｎｖｉｖｏである、請求の範囲第４９項に記載の方法。 ５１、請求の範囲第４８項に従い生産された植物シンターゼタンパク質からなる 宿主細胞。 ５２、前記宿主細胞は植物の宿主細胞であり、そして前記構成体は前記植物細胞 のゲノムの中に組み込まれている、請求の範囲第５１項に記載の細胞。 ５３、植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列を転写を可能とする条件 下に、そのゲノムの中にＤＮ構成体を組み込んで有する植物細胞を歳長させるこ とからなり、前記構成体は、転写の５′→３′の方向において、前記宿主細胞の 中で機能的な転写調節領域および植物シンターゼタンパク質をエンコードする配 列からなる、植物細胞の中で脂肪酸の組成を修飾する方法。 ５４、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列はアンチセンス配列 である、請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５５、前記植物シンターゼタンパク質はシンターゼ因子Ｂである、請求の範囲第 ５４項記載の方法。 ５６、前記構成体は、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列に対 して直ぐ５′の宿主細胞の中で機能的な翻訳調節領域および前記配列に対して３ ′の転写／翻訳停止調節領域をさらに含み、そして前記植物シンターゼタンパク 質をエンコードする配列はセンス配列である、請求の範囲第５３項に記載の方法 。 ５７、前記植物細胞は菜種の胚の植物細胞である、請求の範囲第５３項に記載の 方法。 ５８、請求の範囲第５３〜５７項のいずれかに記載の方法に従い生産された修飾 された遊離脂肪酸の組成を有する植物細胞。 ５９、胚細胞のゲノムの中に組み換えＤＮＡ配列を組み込んで有する植物を、調 節要素の活性を促進する条件下に、成長させて種子を生産し、ここで前記組み換 えＤＮＡ配列は脂質の蓄積の間に種子の中で機能的な調節要素の転写のコントロ ール下に植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列の少なくとも一部分を 含んでなり、そして前記種子を収穫する、ことからなる方法に従い生産された、 天然の脂肪酸の組成を有する種子に比較して佳節された脂肪酸の組成を有する植 物の種子。 ６０、前記植物はブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃｎａｐｕｓ）である、請求 の範囲第５９項に記載の種子。 ６１、前記種子は菜種である、請求の範囲第５９項に記載の種子。 ６２、植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列を転写を可能とする条件 下に、そのゲノムの中にＤＮＡ構成体を組み込んで有する植物細胞を成長させる ことからなり、前記構成体は、転写の５′→３′の方向において、前記宿主細胞 の中で機能的な転写調節領域および植物シンターゼタンパク質をエンコードする 配列からなる、菜種の作物植物から生産されたトリグリセリドの脂肪酸の組成を 修飾する方法。 ６３、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列はアンチセンス配列 である、請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４、前記構成体は、前記植物シンターゼタンパク質をエンコードする配列に対 して直ぐ５′の宿主細胞の中で機能的な翻訳調節領域および前記配列に対して３ ′の転写／翻訳停止調節領域をさらに含み、そして前記植物シンターゼタンパク 質をエンコードする配列はセンス配列である、請求の範囲第６２項に記載の方法 。 ６５、前記植物細胞は菜種の胚の植物細胞である、請求の範囲第６２項に記載の 方法。 ６６、請求の範囲第６２〜６５項のいずれかに記載の方法に従い生産されたトリ グリセリドの修飾された脂肪酸の組成を有する植物細胞。 ６７、前記作物の植物は、菜種、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クフエア（ｃｕｐ ｈｅａ）、ダイズ、ナンキンマメ、ココナツ、ギネアアブラナヤシおよびトウモ ロコシから成る群より選択される、請求の範囲第６２〜６３項のいずれかに記載 の方法。 ６８、請求の範囲第５８〜６０項のいずれかに記載の方法に従い生産された種子 から分離された植物の種子の油。 ６９、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の油からなる請求の範囲第６８項に記載の 油。