KR100268752B1

KR100268752B1 - 지방 아실-CoA : 지방 알코올 O-아실트란스페라제

Info

Publication number: KR100268752B1
Application number: KR1019940701722A
Authority: KR
Inventors: 조오지 멧츠 제임스; 데니스 라디자벌 카트린; 더블유. 라스너 마이클
Original assignee: 엘리자베스 라슨; 칼진 인코포레이티드; 로이드 쿠니모토
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2000-11-01
Also published as: WO1993010241A1; CN1078492A; CN1053218C; US5445947A; JPH07501221A; CA2123893A1; EP0572603A1; TW273573B

Abstract

본 발명에 의해 부분적으로 정제된 지방 아실-CoA : 지방 알코올 아실 트랜스페라제(왁스 합성효소)가 제공되는데, 이 단백질은 지방 알코올 및 지방 아실 기질로 부터 왁스 애스테르가 형성되는데 활성을 보인다. 특히 관심있는 것은 외관상 분자량이 약 57kD인 호호바 배의 왁스 합성효소이다. 또한 왁스 합성효소 단백질로 부터 얻을 수 있는 아미노산 및 핵산 서열들과, 왁스 에스테르를 생성할 수 있는 유전적으로 교환이 일어난 (transgenic) 숙주세포를 제공하기 위하여 상기 서열들을 사용하는 방법도 본 발명에서 다루어진다.

Description

[발명의 명칭]

지방 아실-CoA : 지방 알코올 O-아실트란스페라제

[기술분야]

본 발명은 효소, 효소를 정제하고 수득하기 위한 방법, 이에 관련된 아미노산 및 핵산 서열, 및 이들을 유전 공학 분야에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.

[서론]

[배경]

식물 유전 공학 기법의 발전을 통해서, 다양한 식물 종을 형질전환시키고 재생시켜서 신규하고 바람직한 특성을 갖는 식물을 제공하는 것이 가능하다. 이러한 식물 유전공학 기법에 대하여 관심있는 한 분야는 식물 조직에서 유용한 생성물을 생성시키는 것이다. 이러한 적용은 원하는 생성물을 생성시키는 식물을 생성시키기 위하여 형질전환에 사용하기 위한 다양한 DNA구성 및 핵산 서열의 이용을 필요로 한다. 예를 들어, 식물 작용성 프로모터는 전체 식물 또는 선택된 식물 조직에서 일어나는 유전자 서열의 적절한 발현을 위해 필요하다. 또한, 선택성 마아커 서열도 종종 형질 전환된 식물 물질을 확인하기 위하여 사용된다. 이러한 식물 프로모터 및 선택성 마아커는 신규한 식물을 얻는 데에 유용한 가치있는 수단을 제공한다.

이러한 유전 공학 기법을 포함하는 원하는 목적은 왁스 에스테르의 유용한 공급원을 갖는 농작물을 제공하는 능력이다. 왁스 에스테르는 약제, 화장품, 세제, 플라스틱류 및 윤활제를 포함하는 다양한 산업 적용에 필요하다. 이러한 생성물, 특히 긴 사슬 왁스 에스테르는 이전에는, 멸종 위기에 놓인 종인 향유 고래로부터, 또는 보다 최근에는 사막의 관목인 호호바로부터 얻어져 왔다. 그러나 이들 공급원 중 어느 것도 왁스 에스테르의 유용한 공급을 제공하지 못하였다. 따라서, 그런 화합물의 신뢰성 있는 공급원을 얻기 위해서는, 생성물의 성장, 수확 및 추출의 견지에서 쉽게 조작되는 농작물의 형질전환이 바람직하다.

그러나, 이러한 형질전환된 식물을 얻기 위해서는, 원하는 왁스 에스테르 생성물의 생합성에 관여하는 유전자가 먼저 얻어져야 한다. 왁스 에스테르 생성은 2가지 이상의 효소 활성, 즉, 지방 아실 환원효소 및 지방 아실 : 지방 알코을 아실 전이 효소, 또는 왁스 합성 효소의 작용의 결과이다. 이러한 효소, 및 지방 아실 환원효소의 집중적인 분석 및 정제를 포함한 예비 연구는 이들 단백질이 막과 연관되어 있음을 나타내지만, 왁스 생합성에서 지방 아실 : 지방 알코올 결찰 반응에 관여하는 효소에 대해서는 명확한 특성 확인이 이루어지지 않고 있다. 그러므로, 효소적 활성을 코드화하는 유전자 서열이 얻어질 수 있도록, 이러한 효소의 추가의 연구, 및 궁극적으로는 정제가 필요하다.

그러므로, 정제 프로토콜을 연구하여, 왁스 합성 효소 단백질을 얻을수 있고, 아미노산 서열을 결정할 수 있고/있거나 왁스 합성효소에 특이적인 항체를 얻을 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 라이브러리 스크리닝, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 면역학적 기술이 사용되어 왁스 합성 효소 단백질을 발현시키는 클론을 확인할 수 있다. 이 방법으로 얻어진 클론은 왁스 합성효소 활성에 상응하는 핵산 서열이 확인되도록 분석될 수 있다. 그 다음, 왁스 합성효소 핵산 서열은 숙주 세포에서 왁스 에스테르를 생성시키기 위하여, 유전자 교환 숙주 세포에 대해 고유하거나 재조합 기술에 의해 공급되는 지방 아실 환원효소 단백질과 함께 사용될 수 있다.

[관계 문헌]

발생되는 호호바의 배로 부터의 세포 유리 균등물은 아실-CoA 지방 알코올 아실 전이효소 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 이러한 활성은 시차 원심분리시에 형성되는 부유하는 왁스 패드와 관련된 것이다 [참조 : Pollard et al. (1979) supra ; Wu. et at. (1981) supra].

지방 아실-SCoA 트랜스아실라아제 활성을 가지고 있는 유글레나 그라실리스(Englena gracilis)로부터 얻어지는 다중효소 복합체의 가용성은 월드너(Wilner)와 할릭크(Hallick)에 의해 보고되어 있다 [참조 : Abstract from The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting, April 22-24, 1990, Las Cruces, NM.].

호호바 아실-CoA : 알코올 트랜스아실라아제 단백질의 10회 정제는 푸쉬니크(Pushnik) 등에 의해 보고되어 있다 [참조 . Abstract from The Southwest Consortium fourth Annual Meeting February 7, 1989, Riverside, Ca.].

[도면의 간단한 설명]

제1도는 cDNA 서열로부터 결정되는 바와 같은, 호호바 지방 아실 환원효소의 핵산 서열 및 번역된 아미노산 서열을 도시한 도면이다.

제2도는 호호바 왁스 합성효소 cDNA 클론의 핵산 서열 및 번역된 아미노산 서열을 도시한 도면이다.

[발명의 요약]

본 발명에 의해, 부분적으로 정제된 지방 아실-CoA : 지방 알코올 O-아실 전이효소 단백질이 제공되는데, 이 단백질은 지방 알코올 및 지방 아실 기질로부터 왁스 에스테르를 생성시키는 데에 활성이다. 이 지방 아실-CoA : 지방 알코올 O-아실 전이효소 단백질은 또한 본원에서“왁스 합성효소”로서 언급된다. 본 발명의 왁스 합성효소는 아실-CoA 및 아실-ACP를 포함한 다양한 지방 아실 및 지방 알코올 기질을 사용할 때 활성일 수 있다. 주어진 왁스 합성효소가 특정 사슬 길이를 갖는 아실 및 알코올 기질에 대해 우선적일 수 있거나 광범위한 탄소 사슬 길이를 갖는 아실 및 알코올 기질을 사용할 때에도 활성일 수 있지만, 이들 기질의 탄소 사슬 길이는 변할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 왁스 합성효소는, 다른 아실 또는 알코을 기질이 시험되고 추가의 활성도 발견될 수 있지만, 탄소수 12 내지 24개의 사슬 길이를 갖는 아실 및 알코올 기질에 대해 활성을 가지며, 이 탄소 사슬 길이는 x가 6 내지 12인 식“C_2X”로 표시 될 수 있다. 또한, 본 발명의 왁스 합성효소 단백질이 얻어지면, 하기에 상세하게 설명되는 바와 같이 추가의 조작이 가능해진다. 이들 조작은 다른 관련된 왁스 합성효소의 생성 또는 발견을 유도할 수 있다.

이와 같이, 제1양태에서, 본 발명은 왁스 합성효소 활성을 나타내는 단백질 제조물에 관한 것이며, 종자 식물 단백질 제조물에 의해 예시된다. 이러한 제조물은 마이크로솜 막 제조물을 생성시키기 위한 호호바 배의 분별화, 이러한 막 제조물로부터의 왁스 합성효소 단백질의 가용화, 및 크로마토그래피 방법에 의한 추가의 정제에 의해 제조된다. 호호바 왁스 합성효소는 본원에서, 포화 또는 불포화(탄소들 사이에 하나 이상의 이중 결합을 함유함)될 수 있는 광범위한 아실 및 알코올 기질을 수용하는 것으로 입증되었다. 호호바 왁스 합성 효소의 활성은 엔자임 노멘클래치(Enzyme Nomenlature, 1984)에서 E.C. 2.3.1.75 로 표시되며, 제안된 명칭은“긴사슬 알코올 지방-아실 전이효소”이다.

이들 방법에 의하여, 외관상 분자량이 약 57kD인 왁스 합성효소 단백질을 함유하는 부분적으로 정제된 단백질 제조물이 수득된다. 이와 같이, 종자-식물 공급원으로부터의 정제를 통하여 왁스 합성효소 단백질을 수득하는 방법, 및 이들 왁스 합성효소 단백질의 아미노산 서열을 수득하기 위한 방법이 제공된다.

또한, 다른 유기체로부터의 왁스 합성효소 단백질이 본원에 기술된 방법에 의해 제공된다. 예를 들어, 아시네토박터(Acinetobaoter) 왁스 합성효소의 부분적으로 정제된 제조물이 수득되며, 여기에서 왁스 합성효소 활성은 대략 45kD의 펩티드 밴드와 관련되는 것으로 발견되었다. 유사하게는, 유글레나 그라실리스로부터의 단백질 제조물이 제공되며, 여기에서는 41kD 펩티드가 왁스 합성효소 활성과 관련된다.

본 발명의 상이한 양태에서, 본 발명의 왁스 합성효소와 관련된 핵산 서열이 고려된다. 본 발명의 왁스 합성효소 단백질의 아미노산 서열로부터 상기 핵산 서열을 확인되고 수득할 수 있는 방법이 기술된다. 또한, 다른 왁스 합성효소 서열들의 분리를 위해서, 뿐만 아니라 왁스 합성효소 핵산 서열의 전사 및/또는 숙주 세포에서의 왁스 합성효소 단백질의 발현을 위한 재조합 구성 물에서 구조 유전자 서열의 사용이 기술되어 있다. 5′및 3′비코드화 영역의 사용과 같은, 왁스 합성효소 단백질과 관련된 다른 핵산 서열의 사용이 또한 고려된다.

본 발명의 다른 양태에서는, 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 왁스 합성효소 서열을 코드화하는 재조합 구성물을 함유하는 세포가 고려된다. 특히, 브라시카(Brassica) 식물의 배에 있는 세포와 같은, 호호바 왁스 합성 효소의 바람직한 아실-CoA 기질을 함유하는 세포가 고려된다.

또한, 본 발명의 재조합 구성물로부터의 발현의 결과로서 본 발명의 왁스 합성효소 단백질을 함유하는 세포가 고려되며, 숙주 세포에서 왁스 합성효소를 생성시키는 방법이 제공된다. 따라서, 숙주 세포에서의 상기 단백질의 발현의 결과로서 회수된 왁스 합성효소 단백질이 또한 본 발명에서 고려된다.

또한, 본 발명의 왁스 합성효소가 왁스 합성효소의 지방 아실 및 지방 알코올 기질을 함유하는 숙주 세포에서 왁스 에스테르를 생성시키는 데에 응용될 수 있음이 인지될 수 있다. 그러한 숙주 세포는 천연으로 존재하거나, 지방 아실 환원효소를 코드화하는 핵산 구성물에 의한 형질전환에 의해 수득될 수 있다. 지방 아실 환원효소, 또는“환원효소”는 지방 아실 그룹을 상응하는 알코올로 환원시키는 것을 촉매하는 데에 활성이다. 본원에 참고문헌으로 인용된 공동 계류중인 미합중국 특허출원 제 07/659,975 및 07/767,251호는 이러한 환원효소 단백질에 관한 것이다. 이러한 정보는 또한 공개된 PCT 특허출원 WO 92/14816호 기재되어 있다. 또한, 환원효소 단백질의 바람직한 공급원이기도 한 왁스 합성효소 단백질의 다른 공급원이 상기 공보에 기재되어 있다.

특히, 본 발명의 이러한 양태에서는, 본원에 기재된 호호바 왁스 합성 효소의 바람직한 알코올 기질을 함유하는 식물세포가 고려된다. 이러한 알코올 기질을 식물 세포에 제공하는 방법이 고려되며, 여기에서 상기 세포는 지방 아실 환원효소 핵산 서열을 코드화하는 재조합 핵산 구성물에 의해 형질전환된다. 따라서, 정상적으로는 왁스 합성효소에 의해 사용되는 유의할 만한 양의 알코올 기질을 함유하지 않는 식물 숙주는 알코을이 생성될 정도로 환원효소 구성물에 의해 형질전환된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포에 존재하는 지방 아실기는 또한 왁스 에스테르의 합성에서 왁스 합성효소에 의해 이용되는 지방 알코올 기질의 공급원을 제공할 것이다. 왁스 합성효소 및 환원효소 단백질의 특이성에 따라, 이러한 방식으로 다양한 바람직한 왁스 에스테르 생성물을 생성시키는 식물 세포가 수득될 수 있음이 인지된다. 이러한 생성물은 지방 알코올 및 지방 아실기의 사슬 길이 및 포화도에 따라 상이한 성질들을 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 생성된왁스 에스테르 생성물은 숙주 세포로부터 회수되고, 또한 본 발명에서 고려된다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 지방 아실-CoA : 지방 알코올 아실 전이효소는 왁스 에스테르를 생성시키기 위해 지방 아실기에 의한 지방 알코올의 에스테르화를 촉매하는 데에 활성인, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편과 같은 아미노산의 임의의 서열이다. 본 발명의 아실-CoA : 알코올 아실 전이효소는 또한 하기에서“왁스 합성효소”로서 언급된다.

전형적으로 아실-CoA : 알코올 아실 전이효소로서 언급되지만, 본 발명의 왁스 합성효소는 지방 아실-CoA 및 지방 아실-ACP 분자를 포함하는 다양한 아실 기질에 대한 활성이 증명될 수 있다. 또한, 왁스 합성효소에 의한 작용의 대상이 되는 아실 및 알코올 기질은 둘 모두, 왁스 합성효소가 특정 분자에 대해 우선적인 활성이 있을 수 있지만, 변동 탄소 사슬 길이 및 포화도를 가질 수 있다.

많은 상이한 유기체가 알코올 및 아실 기질로부터 왁스 에스테르를 생성시키고, 본 발명의 왁스 합성효소 단백질의 바람직한 공급원이다. 예를들어, 식물은 표피, 또는 각피 왁스[Kolattukudy (1980) in The Biochemistry of Plants (Stumpf, P.K. and Conn, E.E., eds.) Vol. 4, p. 571-645]를 생성시키고, 사막의 관목인 호호바는 종자 저장 왁스[Ohlrogge et al., Lipids (1978)13 : 203-210]를 생성시킨다. 왁스 합성은 또한 아시네토박터[Fixter et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132 . 3147-3157] 및 마이크로 코쿠스[Lloyd(1987) Microbios 52 : 29-37]과 같은 다양한 박테리아종에서, 그리고 단세포 유기체인 유글레나[Khan and Kolattukudy(1975) Arch. Biochem. Biophys. 170 : 400-408]에 의해 관찰되었다. 또한, 왁스 생성 및 왁스 합성효소 활성은 소과 동물 마이봄선(meibomian gland)[Kolattukudy et al.(1986) J. Lipid Res. 27 : 404-411], 조류 꽁지부분 선(gland) 및 다양한 곤충 및 해양 유기체로부터의 마이크로솜 제조물에서 보고되었다. 결과적으로, 다양한 성질을 가질 많은 상이한 왁스 에스테르는 본 발명의 왁스 합성효소에 의해 제조될 수 있고, 효소의 활성 및 생성된 왁스 에스테르의 유형은 이용할 수 있는 기질 및 관심있는 특정 왁스 합성효소의 기질 특이성에 좌우될 수 있다.

에스테르화 반응에 사용하기 위한 왁스 합성효소 단백질의 신뢰성 있는 공급원을 얻기 위해, 왁스 합성효소와 관련된 핵산 서열을 분리하여, 이들 서열이 왁스 합성효소의 생성을 위해 숙주 세포 내로 클로닝될 수 있게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 왁스 합성효소 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 대장균 세포에서의 발현을 위한 인자 내로 클로닝시켜서 왁스 합성효소 단백질의 용이한 공급원을 제공할 수 있다. 이렇게 제조된 왁스 합성효소 단백질은 또한, 다양한 공급원, 특히 식물로부터 관련된 왁스 합성효소 단백질의 확인 및 정제에 사용하기 위해 왁스 합성효소 단백질에 대한 항체를 유발시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 왁스 합성효소 단백질의 추가의 연구는 자리 특이적 돌연변이 반응을 유도하여, 이것의 측매적 특성을 더욱 특징화하고 개선시키거나, 이것의 지방 알코올 또는 지방 아실 기질 특이성을 변경시킬 수 있다. 기질 특이성이 변경된 왁스 합성효소는 다른 FAS 효소들과 함께 응용될 수 있다.

본 발명 이전에, 왁스 합성효소 단백질의 아미노산 서열은 공지되지 않았다. 따라서, 왁스 합성효소와 관련된 핵산 서열을 얻기 위해, 먼저 이용할 수 있는 공급원으로부터 단백질을 정제하고, 최소한 부분적인 아미노산 서열을 결정하여, 왁스 합성효소 핵산 서열의 분리에 유용한 적절한 프로브를 제조할 수 있게 하는 것이 필요하였다.

사막의 관목인 시몬드시아 키넨시스(Simmondsia Chinensis)(호호바)가 추천된 왁스 합성효소 단백질의 공급원으로서 확인되었다. 초기의 연구는 호호바 왁스 합성효소가 사실상 통합 막 단백질이고 소수성임을 나타내었다. 일반적으로, 막 관련 단백질은 이들이 용해될 때, 즉 이들이 정상적으로 작용하는 막 환경으로부터 분리될 때에 효소 활성을 상실하는 경향이 있기 때문에 정제하기가 어렬다. 통합 막 단백질을 용해시키기 위해 사용된 기술은 적합한 막 분획 제조물에 계면활성제 또는 유기 용매를 첨가하는 것을 포함한다. 원하는 단백질이 여전히 특정 효소 검정법을 사용하여 측정될 수 있는 작용 활성을 보유하는 것을 가정하여, 침전, 이온 교환, 겔 여과 및 친화성 크로마토그래피와 같은 추가의 통상적인 정제 기술이 이용될 수 있다.

전형적으로, 용해된 막 단백질을 얻기 위한 제1단계로서, 왁스 합성효소 활성을 포함하는 마이크로솜 막 제조물이 바람직하다. 표준 마이크로솜 막 제조물은 세포-유리 균등물(CFH)의 시차 원심분리를 이용하여, 전체 세포, 핵 및 가용성 단백질을 함유하지 않는 막 분획을 수득한다 : [참조 ; Moore et al. (1987) Biological Membranes ; A Practical Approach, pp.37-72, eds. Finalay and Evans.]. 오일 종자(oilseeds)를 사용하면, 초기 원심분리 단계는 전형적으로 펠릿, 상등액 및 유동하는 지방 패드를 생성시키고, 마이크로솜 막은 상등액의 추가의 원심분리에 의해 회수될 수 있다.

공동 계류중인 미합중국 특허 출원 제 07/659,975 (1991.2.22. 출원)에는, 호호바에서의 왁스 에스테르의 형성에 수반되는 또 다른 효소인 지방 아실 환원효소와 관련된 효소 활성이 양호하게 회수되는 호호바 막 분획을 수득하는 방법이 기술되어 있다. 이 방법은 또한, 하기 실시예에 상세하게 설명되는 바와 같이 왁스 합성효소 활성을 갖는 막 분획을 제공한다. 다른 방법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 유사한 막 제조물을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 제조물에서 왁스 합성효소 활성을 검정하기 위한 방법이 실시예 1에 기술되어 있다.

추가의 효소 특성화 및 정제에 대한 중요한 단계는, 천연 지질 이중층 막 환경으로부터 분리되지만 실질적 양의 측정가능한 왁스 합성효소 활성을 보유하는 가용화된 왁스 합성효소 단백질을 수득하는 단계이다. 지질 이중층으로부터의 통합 막 단백질의 제거는, 일부 경우에는 유기 용매도 사용될 수 있지만, 수용액 중의 양쪽 친화성 계면활성제를 사용하여 수행하는 것이 전형적이다. 막 단백질의 가용화를 위한 잠은 상이한 계면활성제 및 방법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 문헌[Neugebauer, Methods Enzymol. (1990) 182:239-253 and Hjelmiland, Methods Enzymol. (1990)182:253-264]에 개시되어 있다.

종종, 막 단백질을 가용화시키기 위해 사용되는 계면활성제는 원하는 단백질의 효소 활성을 억제하는 것으로 발견되었다. 수가지 계면활성제가 공동 계류 중인 미합중국 특허 제 07/659,975호에서 호호바로부터의 지방 아실 환원효소의 정제에 유용한 것으로 입증된 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸-암모니오]-1-프로판술포네이트)를 포함하여, 호호바 왁스 합성효소의 가용화에 대해 시험되었다. 이들 계면활성제는 모두 왁스 합성효소 활성을 억제하는 것으로 발견되었다. CMC 보다 높은 농도에서 CHAPS에 의한 강한 억제가 관찰되기는 하였지만, L-포스파티딜 콜린과 같은 인지질을 첨가하고, CHAPS농도를 0.75%로부터 0.3%로, 즉 CMC보다 낮은 농도로 조절하면, 왁스 합성효소 활성의 일부가 재구성된다. 왁스 합성효소 활성의 재구성에 대한 일차 요건은, 왁스 합성효소 단백질이 인지질 소포 내로 혼입되도록, 계면활성제의 제거 또는 희석 동안 인지질을 존재시키는 것이다. 이것은 인지질의 첨가를 필요로 하지 않는 호호바 환원효소 활성의 재구성에 대해 개발된 프로토콜과는 상이하다. 그러므로, 왁스 합성효소 제조물 중에 마이크로솜성 막 분획으로부터의 인지질과 같은 인지질이 존재하는 경우에는, 활성은 단순히 계면활성제의 제거 또는 희석에 의하여 검출될 수 있다. 그러나, 추가로 정제된 왁스 합성효소 제조물에서, 인지질이 첨가되어 활성을 검출해야 한다. 고수준, 즉 약 2% (w/v) 보다 높은 농도의 인지질이 사용되는 경우에는, 왁스 합성효소 활성은 가용화를 위해 사용된 계면활성제의 간단한 희석에 의해 회복될 수 있다. 가용화된 왁스 합성효소 제조물에서 왁스 합성효소 활성을 재구성하고 검정하는 방법은 실시예 1에 기술되어 있다.

계면활성제 CHAPS를 사용하여 호호바 왁스 합성효소 활성을 가용화시키는 프로토콜은 실시예 4에 기술되어 있다. 마이크로솜 막 제조물로부터 약 15% 수율의 왁스 합성 효소 활성이 얻어진다. 유사하게는, 다른 계면활성제에 의한 명백한 왁스 합성효소 억제의 가역성에 대한 연구는, 호호바 또는 다른 추천된 왁스 합성효소의 가용화에 대한 다른 유용한 계면활성제를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 마이크로솜 막 제조물로부터 가용화되는 왁스 합성효소 활성의 비율이 낮기 때문에, 가용화 형태로 얻어진 왁스 합성효소의 비율을 증가시키기 위한 기술이 개발될 수 있다. 그러나, 기재된 방법에 의해 얻어진 가용화원 확스 합성효소의 비율은 하기 기술되는 바와 같이, 왁스 합성효소를 추가로 정제시키고, 특징화시키고 및 서열화시키기에 충분하다.

가용화된 왁스 합성효소 단백질이 얻어지면, 기질 특이성, 보조인자 요건 및 가능한 활성 억제에 대해 효소를 특징화시키기 위한 추가의 실험이 수행될 수 있음을 알 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 호호바 왁스 합성효소가 아실-ACP 및 아실-CoA 분자를 포함하는 광범위한 아실 기질을 갖는 것으로 발견되었다. 또한, 아실 및 지방 알코올 기질은 탄소 사슬 길이와 관련하여 광범위한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 활성은 C12 내지 C24의 탄소 사슬 길이를 갖는 기질을 사용하여 시험되었고, 그 결과 모두 효소에 의해 이용되는 것으로 나타났다. 또한, 활성은 변동 불포화도를 갖는 지방 아실 및 지방 알코올에 의해 나타났다.

본 발명의 왁스 합성효소의 추가의 특징화를 위해 매우 유용한 것으로 입증된 방법은 왁스 합성효소 단백질을 특이적으로 표지화시키는 방법이다. 예를 들어, 왁스 합성효소 활성을 갖는 막 제조들이, 약 57kD의 겉보기 분자 질량의 방사성 표지화 펩티드 밴드가 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동(PAGE) 및 후속 자동방사선사진에 의해 검출될 수 있도록, 왁스 합성효소의 기질인 방사성 표지화 팔미토일-CoA와 인큐베이션될 수 있는 것으로 발견되었다. 또한, 더 이상 효소 활성을 나타내지 않는 용해된 왁스 합성효소 단백질은, 추가의 정제 단계를 통해 왁스 합성효소 단백질을 포획하기 위한 편리한 방법을 제공하도록 유사하게 표지화될 수 있다. 이러한 표지화 과정의 상세한 설명은 실시예 2에 기술되어 있다.

그러므로, 본 발명의 왁스 합성효소 활성을 포함하는 제조물은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 후속적인 염색, 또는 팔미토일-CoA를 이용한 방사성 표지화, 및 계속해서 SDS PAGE 및 후속 자동방사성 사진과 같은 추가의 기술로 처리될 수 있다. 이러한 방식으로, 약 57 kD 단백질이 이들 제조물 중에 제공되며, 이 단백질의 염색 강도는 왁스 함성효소 활성의 수준에 상응하는 것으로 입증되었다. 팔미토일-CoA 방사성 표지화가 수행되는 경우에, SDS PAGE 및 자동방사성사진은 표지된 밴드가 왁스 합성효소 활성을 트랙킹함을 확인해 준다. 57 kD펩티드 밴드가 크기 배제, 친화성 및 반응성 염료 크로마토그래피로부터의 분획중의 왁스 합성효소 활성을 트랙킹함을 증명해주는 실험들이 하기 실시예에 기술되어 있다.

또한, 크로마토그래피 기술은 식물왁스 합성효소의 풍부한 제조물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 한가지 정제 단계는 본 발명에 사용되는 사바크론 블루(Cibacron Blue) F3GA (Blue A)와 같은 고정된 반응성 염료 매트릭스 상에서의 크로마토그래피를 포함한다. 호호바 왁스 합성효소 활성은 약 0.4M NaCl을 함유하는 완충액 중에 로딩될 때에 이러한 칼럼에 결합하는 반면, 약 85% 이상의 다른 단백질은 후속 세척 과정을 통하거나 이 과정에서 제거된다. 공동 계류 중인 미합중국 특허 출원 제 07/767,251호에 기술된 바와 같이, 환원효소 활성은 또한 이러한 조건하에서 컬럼 A에 결합한다. 본원에서는 Blue A 칼럼에 로딩된 왁스 합성 효소 활성의 약 20%가 용리에 의해 회수될 수 있음이 입증되었다. 이 왁스 합성효소 활성의 소부분은 1.0M NaCl 완충 세척액으로 용리되는 데, 이는 또한 상기 칼럼으로부터 회수된 왁스 합성효소 활성의 대부분을 함유한다. 회수되는 왁스 환원 효소 활성의 대부분은 1.5M NaCl 완충 세척액에 의한 용리에 의해 얻어지며, 이는 또한 환원효소 활성의 소부분을 함유한다. 그러므로, 회수가능한 왁스 합성효소 활성의 대부분은, 57 kD 왁스 합성효소과는 상이한 제조물 중에 존재하는 주요 단백질이 56 및 54kD 환원효소 단백질이지만, 대부분의 환원효소 단백질로부터 분리된다.

블루 A 크로마토그래피에 이은 왁스 합성효소 단백질의 추가의 연구는 왁스 합성효소 단백질이 상기 칼럼 상에서 응집될 수 있음을 제시한다. 예를 들어, 슈퍼로스12(Pharmacia)상에서의 왁스 합성효소 활성을 갖는 블루 A 분획의 크기 배제 크로마토그래피는 칼럼의 공극 분획(약 5백만 달톤의 배제 한계) 중에서의 왁스 합성효소 활성의 대부분을 용출시키며, 이는 왁스 합성 효소가 응집된 형태로 존재함을 나타낸다. 중요하게는, 왁스 합성효소 활성의 소부분(약 5%)이 보유된 분획에서 검출되며, 이 피크 활성의 크기는 단백질 표준 물질과 비교할 때 약 55kD인 것으로 평가된다. 이것은 57 kD의 표지된 밴드가 왁스 합성효소인 추가의 증거를 제공하며, 또한 왁스 합성 효소 활성은 단일 폴리펩티드에 의해 제공됨을 증명해준다.

이러한 표지화 및 정제 기술을 사용하면, 호호바 왁스 합성효소 단백질은 실질적으로 정제된 단백질 제조물로서 회수될 수 있으며, 아미노산 서열이 얻어질 수 있다. 유사하게는, 왁스 합성효소의 지방 알코올 기질의 소수성으로 인해, 다른 왁스 합성효소가 또한 이들의 천연 세포 중의 막과 결합되는 것으로 예측될 수 있으며, 따라서 또한 호호바 왁스 합성효소에 대하여 본원에서 기재된 정제 기술이 또한 다른 왁스 합성효소 단백질의 정제된 제조물의 회수에 유용할 수 있다.

예를 들어, 유글레나 그라실리스는 지방 아실-CoA 환원효소 및 지방 아실-CoA 알코올 트랜스아실라아제, 또는 왁스 합성효소의 효소적 작용을 통하여 왁스를 생성시킨다. 전형적으로, 탄소수 24 내지 32개의 왁스가 상기 유기체에서 검출된다. 호호바에 대해 상기 기술된 바와 같이, 유글레나 왁스 합성효소는 CHAPS/NaCl 용액을 사용하여 용해될 수 있으며, 부분적으로 정제된 왁스 합성효소 제조물은 블루 A 크로마토그래피에 의해 얻어진다. 이러한 방식으로, 왁스 합성효소 활성과 관련된 41 kD 펩티드 밴드가 확인된다.

메카니즘은 잘 규명되지 않았지만, 아시네토박터 종이 또한 왁스 에스테르 조성물을 생성시키는 것으로 공지되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 지방 아실-CoA 알코올 트란스아실라아제, 또는 왁스 합성효소 활성이 아시네토박터 종에서 검출된다. 왁스 합성효소 활성은 CHAPS/NaCl 중에 용해되고, 블루 A 칼럼 크로마로그래피에 의해 부화되며, 크기 배체 크로마토그래피와 같은 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 이들 방법에 의하여, 왁스 합성효소 활성과 관련된 약 45 kD 펩티드 밴드가 부분적으로 정제된 제조물 중에서 얻어진다.

이들 왁스 합성효소 단백질의 소수성이 정제에 문제가 되긴 하지만, 실질적으로 정제된 단백질의 회수는 다양한 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 연속적인 용리 전기영동 과정을 이용하는 정제용 전기영동 장치가 블루 A 칼럼으로부터 얻어진 57 kD 왁스 합성효소 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법으로, 액체 용액 중에서 실질적으로 순수한 형태로 왁스 합성효소 단백질을 함유하는 겔 분힐이 확인될 수 있다. 그다음, 왁스 합성효소 단백질 샘플이 필요에 따라 투석되고, 농축되어 아미노산 서열화 기술을 위한 유용한 단백질 공급원을 제공한다.

대안적으로, 폴리아크릴아미드 겔이 작동되어 단백질이 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF)와 같은 막 지지체에 전달될 수 있다. 왁스 합성효소가 다른 단백질을 실제로 함유하지 않도록, 왁스 합성효소 단백질을 함유하는 이들 막의 부분들이 얻어진다. 왁스 합성효소 단백질은 막으로부터 제거되고, 아미노산 서열이 결정되도록 추가로 정제될 수 있다. 본 발명의 왁스 합성효소 단백질가 니트로셀룰로오스 막에 거의 전달되지 않기 때문에, PVDF가 서열화 방법에 바람직하다.

그러므로, 왁스 합성효소의 아미노산 서열은 전 단백질부터 N-말단 아미노산 영역을 서열화시키거나, 화학 물질인 브롬화 시아노겐에 의해 절단하거나, 대안적으로 프로테아제를 사용하는 효소적 분열에 의해 원하는 단백질의 단편을 제조함으로써 결정될 수 있다. 유용할 수 있는 프로테아제의 예로는 트립신, 및 엔도프로테이나제 lysC, gluC, AspN 및 argC가 있다. 상기 방법으로 얻어진 왁스 합성효소 펩티드를 당업자에게 공지된 방법으로 정제되고 서열화될 수 있다. 이들 펩티드 서열은 PCR 방법과 cDNA 및 게놈 라이브러리 스크리닝을 포함하는 유전자 단리 기술에 사용될 수 있다.

또한, E. coli 내에서의 단밸질의 발현과 같은, 왁스 합성효소의 동일성을 확인하기 위한 다른 실험이 바람직할 수 있다. 왁스 합성효소는 이러한 세포 중의 지방 아실 또는 지방 알코올 기질에 작용하여, 다양한 분석방법에 의해 검출할 수 이는 왁스 에스테르를 생성시킬 수 있다. 숙주 세포가 왁스 합성효소의 알코올 기질을 함유하지 않는 경우, 활성은 세포 추출물을 검정함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 왁스 합성효소 단백질은 왁스 합성효소 핵산 서열 열 시판용 번역 키트(kit)를 사용하여 생체외에 번역에 의해 제조될 수 있다. 막 삽입이 활성에 결정적인 경우에는, 활성 왁스 합성효소 단백질을 얻기 일해 생체의 번역 샘플에 마이크로솜 막 제조물을 첨가하는 것이 필요할 수 있다. 다른 시험 방법은 추천된 단백질에 특이적인 항체가 제조되고 단백질 제조물에서 왁스 합성효소 활성을 억제하는 것으로 밝혀진 면역학적 검정 방법을 포함한다.

그러므로, 왁스 합성효소 활성과 관련된 단백질에 대해 결정된 아미노산 서열을 사용하여 핵산 서열을 단리시켜서 왁스 합성효소 단백질의 동일성을 확인하고, 숙주 세포, 즉 원핵 세포 또는 진핵세포에서 서열의 전사 및/또는 단백질의 발현을 제공하는 것이 바람직하다.

왁스 합성효소는 막에 결합된 단백질이기 때문에, 활성을 입증하기 위해 식물 세포내에서 추천된 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 위해 일과성(transient) 발현을 위한 식물 조직의 전기 영동 또는 총격 방법이 유용할 수 있다. 궁극적으로, 상기 효소에 의해 인식되는 기질을 생성시키는 식물 내에서의 안정한 식물 발현이 바람직하다. 왁스 합성효소 서열에 의한 형질전환을 위해 표적화된 식물이 천연적으로 상기 효소의 지방 알코올 및 지방 아실 에스테르 기질을 함유하지 않는 경우, 식물 추출물이 제조되고 왁스 합성효소의 기질을 추출물에 첨가하여 확스 합성효소 활성에 대해 검정을 실시할 수 있다. 식물 숙주를 왁스 합성효소 서열에 의해 형질 전환시키기 위한 방법 및 구성물을 하기에 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 핵산은 게놈 DNA 또는 cDNA이며, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 단리되거나, 단리된 식물 DNA로부터 직접 단리될 수 있다. 일단 단백질을 정제시키고/거나 단백질의 아미노산 서열을 얻은 후에 유전자 서열을 얻는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.

예를 들어, 항체는 단리된 단백질까지 상승되고 발현 라이브러리를 스크리닝시키기 위해 사용되어, 식물체 왁스 합성효소 단백질 또는 이것의 항원 단편을 생성시키는 콜론을 확인할 수 있다. 다른 방법으로는, 올리고누클레오티드를 아미노산 서열로부터 합성하고, 핵산 서열의 단리에 사용할 수 있다. 올리고누클레오티드는 PCR에서 핵산 단편을 생성시킨 후에, cDNA또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 유용할 수 있다. 다른 접근 방법에 있어서, 올리고누클레오티드는 노던 블로팅 또는 서던 블로팅을 분석하기 위해 직접 사용되어, 상기 올리고누플레오티드를 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 할 수 있는 유용한 프로브 및 혼성화 조건을 확인할 수 있다.

본 발명의 왁스 합성효소 핵산 서열은 호호바(jojoba) 왁스 합성효소 단백질에 상응하는 서열, 및 호호바 단백질 또는 핵산 서열로부터 얻을 수 있는 서열을 포함한다.“상응하는”은, 호호바 왁스 합성효소 단백질 또는 이것의 일부를 코드화하는 핵산 서열, 즉 DNA 또는 RNA, 호호바 배(embryo)에서 왁스 합성효소의 전사 또는 전사 및 번역(발현)을 담당하는 상기 코드화 서열에 대해 5′또는 3′에서 발견되는 조절 서열, cDNA중에 존재하지 않는 인트론 서열, 및 소포체 막 내로의 삽입을 위해서는 필요하지만 성숙 왁스 합성효소 효소에서는 발견되지 않는 전구체 왁스 합성효소 단백질의 임의의 리더 또는 시그날 펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다.

호호바 서열이나 단백질로부터“얻을 수 있는”서열은 호호바 왁스 합성효소 아미노산 서열로부터 합성할 수 있거나, 대안적으로 다른 유기체에서 확인할 수 있고, 호호바 왁스 합성효소 핵산 서열 또는 호호바 왁스 합성 효소 단백질에 대항하여 제조된 항체를 프로브로서 사용하여 단리시킬 수 있는 원하는 왁스 합성효소 단백질과 관련된 임의의 핵산 서열을 의미한다. 상기 방법으로, 상기의 다른 왁스 합성효소의 서열이 추가의 공급원으로부터 왁스 합성효소 단백질과 관련된 핵산 서열을 단리시키기 위해 유사하게 사용될 수 있다.

핵산 서열을 단리시키기 위해, cDNA 또는 게놈 라이브러리는 당업자들에게 널리 공지된 플라스미드 또는 바이러스 벡터 및 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 원하는 서열을 스크리닝하는 데에 사용할 수 있는 유용한 핵산 혼성화 및 면역학적 방법이 또한 당업자들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 매니아티스(Maniatis) 등의 문헌 [Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York].

전형적으로, 핵산 프로브의 사용으로부터 얻을 수 있는 서열은, 표적 서열과 관심있는 왁스 합성효소를 코드화하는 주어진 서열 사이의 60-70% 서열 동일성을 나타낼 것이다. 그러나, 서열 동일성이 50-60% 정도로 작은 긴 서열이 얻어질 수도 있다. 핵산 프로브는 핵산 서열의 긴 단편일 수도 있고, 또한 더 짧은 올리고누클레오티드 프로브일 수도 있다. 더 긴 핵산 단편(100 bp 보다 큰)을 프로브로서 사용할 경우에는, 프로브로서 사용된 서 열로부터 편차가 20-50% (즉, 서열 동질성이 50-80%)인 표적 샘플로부터 서열을 얻기위해 보다 낮은 정밀도로 스크리닝할 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브는 왁스 합성효소를 코드화하는 전체 핵산 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 누클레오티드가 약 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상, 더욱 바람직하게는 약 20개 이상이어야 한다. 더 짧은 영역이 더 긴 영역에 상반 되도록 사용되는 경우에는 더욱 고도의 서열 동질성이 바람직하다. 그러므로, 아미노산 서열 동질성이 높은 효소 활성 부위를 확인하여, 동종 유전자를 검출하도록 올리고누플레오티드 프로브를 설계하는 것이 바람직할 수 있다.

관련된 유전자가 주어진 서열과의 혼성화에 의해 단리될 수 있는 지를 결정하기 위해, 다른 방법을 사용할 수도 있지만, 서열은 전형적으로 방사능을 이용하여 서열을 표지화되어 검출이 가능해질 수 있다. 표지화된 프로브는 혼성화 용액에 첨가되고, 바람직한 핵산, 즉 노던 블롯 또는 서던 블롯(원하는 동질성 공급원을 스크리닝하기 위해)을 함유하고 있는 필터, 또는 스크리닝하려는 cDNA 또는 게놈 클론을 함유하는 필터로 인큐베이션된다. 혼성화 및 세척 조건은 관심있는 서열에 대한 프로브의 혼성화를 최적화하기 위해 변할 수 있다. 보다 낮은 온도와 보다 높은 염 농도는 관계가 더 먼 서열들(낮은 엄격성)의 혼성화를 가능하게 해준다. 엄격성이 낮은 조건하에서 배경 혼성화 작용이 문제점인 경우, 온도는 혼성화 단계 또는 세척단계에서 상스하고/거나 염 농도가 저하되어 특정 혼성화 서열의 검출을 개선 시킨다. 혼성화 및 세척 온도는 벨쯔(Beltz) 등의 문헌 [Methods in Enzymology (1983) 100:266-285]에 기술된 바와 같이 프로브의 추정된 융점을 기초로 조절될 수 있다.

유용한 프로브와 적합한 혼성화 및 세척 조건이 상기 기술된 바와 같이 확인되면, cDNA또는 게놈 라이브러리는 표지화 서열 및 최적 조건을 사용하여 스크리닝된다. 라이브러리는 먼저 고형 세균 배지에 플레이팅되고, DNA는 적당한 막, 일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 나일론 필터 까지 승승된다. 그 다음, 이들 필터는 표지화원 프로브와 혼성화되고, 상기 기술된 바와 같이 세척되어 관련 서열을 함유하는 콜론이 확인된다.

면역학적 스크리닝을 위해, 호호바 왁스 합성효소에 대한 항체는 토끼 또는 마우스(또는 다른 적당한 작은 포유동물)에 정제된 단백질을 주입시켜서 제조될 수 있다. 항체의 제조 방법은 당업자들에게 널리 공지되어 있으며, 항체를 전문적으로 제조하는 회사들로부터 구입할 수도 있다. 전형적으로는 다클론 항체가 유전자 단리에 더욱 유용하지만, 단클론 항체 또는 다클론 항체가 생성될 수 있다.

바람직한 식물 종을 스크리닝하기 위해, 웨스턴 블롯 방법이 수행되어, 호호바 왁스 합성효소에 대한 항체와 교차 반응을 하는 관련된 단백질이 원하는 식물 종의 미정제 추출물 내에 존재하는 지를 측정한다. 이러한 측정은 막, 일반적으로 니트로셀룰로오스 막 위에 식물 추출 단백질을 고정시킨 후, 전기 영동시키고 및 항체와 함께 인큐베이션시킴으로써 수행된다. 항체의 방사성 표지화 방법과 제2항체/효소 콘주게이트 시스템을 포함하여, 니트로셀룰로오스 필터 상에서 항체/단백질 복합체를 검출하기 위한 많은 상이한 시스템이 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 시스템 중 일부는 오버펠더(Oberfelder)의 문헌 [Focus (1989) BRL/Life Technologies, Inc. 11:1-5]에 기술되어 있다. 만일 초기의 실험에서 관련 단백질을 검출하는 것이 실패하다면, 다른 검출 시스템 및 차단제(blocking agenl)가 사용될 수 있다. 교차반응성이 관찰되는 경우에는, 원하는 식물 종을 나타내는 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써, 관련 단백질을 코드화하는 유전자가 단리될 수 있다. 발현 라이브러리는 매니아티스 등(상기 참조)이 개시한 바와 같이 λgt11을 포함한 다양한 시판용 벡터로 구성할 수 있다.

DNA 혼성화 방법 또는 면역학적 스크리닝 기술을 사용하여 상기 기술한 바와 같이 확인된 클론은 정제되고, DNA는 공지된 기술을 사용하여 단리되고 분석된다. 이러한 방식으로, 클론이 관련된 왁스 합성효소 단백질을 코드화한다는 것이 입증되었다. 다른 왁스 합성 효소는 호호바 왁스 합성효소를 사용한 것과 동일한 방법으로“새로운”왁스 합성효소를 사용하여 얻을 수 있다.

당업자는 본 발명의 왁스 합성효소 핵산 서열이 부위 특이적 돌연변이 또는 PCR의 표준 기술을 사용하여 변형될 수 있거나, 서열의 변형이 합성 핵산 서열을 생성시키는 데에서 수행될 수도 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 이러한 변형된 서열은 또한 본 발명의 왁스 합성효소 핵산 서열로 여겨진다. 예를 들어, 핵산 서열이 동일한 아미노산 서열을 코드화하도록 코돈 중의 워블(wobble) 위치를 변화시킬 수 있거나, 대안적으로, 코돈은 보존적 아미노산 치환이 일어나도록 변형될 수 있다. 이중 어느 경우에도, 펩티드나 단백질이 원하는 효소활성을 유지하므로, 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.

본 발명의 왁스 합성효소의 핵산 서열은 게놈 DNA, cDNA, mRNA로 부터 유도된 DNA 또는 RNA 서열이거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수도 있다. 유전자 서열은, 예를 들어 적당한 공급원으로부터 게놈 DNA를 단리시키고, 증폭시키고, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 관심있는 서열을 클로닝함으로써 클로닝될 수 있다. 대안적으로, 유전자 서열은 특히 식물에 바람직한 서열을 제공하는 것이 바람직한 경우에 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 그러므로, 원하는 구조 유전자의 전부 또는 일부(왁스 합성효소 단백질을 코드화하는 유전자 부분)를 선택된 숙주에 의해 바람직한 코돈을 이용하여 합성할 수 있다. 숙주에 바람직한 코돈은 예를 들어 원하는 숙주 종에서 발현된 단백질에서 가장 빈번하게 사용된 코돈으로부터 결정할 수 있다.

왁스 합성효소 단백질과 관련된 핵산 서열은 많은 용도를 가질 것이다. 예를 들어, 프로브로 사용할 수 있거나 숙주 세포 내에서 왁스 합성효소 단백질의 발현을 제공할 재조합 구성물이 제조될 수 있다.

예정된 용도에 따라, 상기 구성물을 전체 왁스 합성효소 또는 이것의 일부를 코드화하는 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 활성 부위와 같은 왁스 합성효소의 결정적인 영역이 확인될 수 있다. 따라서, 원하는 왁스 합성효소 활성에 필요한 아미노산을 코드화하는 왁스 합성효소 서열의 일부만을 함유하는 또다른 구성몰이 제조될 수 있다.

본 발명의 왁스 합성효소 서열의 발현에 유용한 계로는, E. coli, 효모 세포 및 식물 세포와 같은 원핵 세포가 있으며, 유관속 식물 및 무관속식물 세포가 바람직하다. 이러한 방식에서, 왁스 합성효소 단백질은 왁스 합성효소 단백질의 반응 특성에 대한 특이적 변이의 효과를 분석하기 위한 코드화 서열의 부위 특이적 변이유발과 같은 연구를 수행하도록 생성될 수 있다.

본 발명의 왁스 합성효소를 코드화하는 DNA 서열은 여러가지 경로로 외부 DNA 서열과 합쳐질 수 있다.“외인성”DNA 서열은 왁스 합성효소 서열에 결합되어 있는 천연적으로 발견되지 않은 동일한 유기체로부터의 DNA 서열을 포함하는, 왁스 합성효소 서열에 결합되어 있는 천연적으로 발견되지 않는 모든 DNA 서열을 의미한다. 왁스 합성효소 코드화 서열를 이용한 센스 및 안티센스 구성물 모두가 고려되며, 여기에서 센스 서열은 숙주세포에서의 왁스 합성효소의 발현에 사용될 수 있고, 안티센스 서열은 표적 유기체에 의해 천연적으로 생성되는 동종 왁스 합성효소 단백질의 내인성 수준을 저하시키는 데에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 왁스 합성효소 유전자 서열은 조절 또는 막 표적화 서열과 같은 왁스 합성효소와 정상적으로 관련된 서열의 일부 또는 전부와 함께 외인성 숙주 내에서 사용할 수 있다.

그 성분 부분에서, 왁스 합성효소를 코드화하는 DNA 서열은 5′로부터 3′로의 전사 방향으로, 숙주 세포 내에서의 전사 또는 번역을 촉진시킬 수 있는 전사 개시 조절 영역, 왁스 합성효소를 코드화하는 핵산서열 및 전사 종료 영역을 갖는 재조합 구성물 중에 합쳐진다. 숙주에 따라, 조절 영역은 변할 수 있고, 바이러스, 플라스미드 또는 염색체 유전자 등으로부터의 영역을 포함할 수 있다. 원핵 또는 진핵 미생물, 특히 단세포 숙주에서의 발현을 위해, 광범위한 구성 또는 조절성 프로모터가 사용될 수 있다. 미생물에서의 발현은 식물 효소의 준비된 공급원을 제공할 수 있다. 기술된 전사 개시영역으로는, β-갈락토시다아제, T7 중합효소, 트립토판 E 등과 같은 유전자를 포함하는, E. coli, 바실루스 섭틸리스, 사카로미세스 세레비시아와 같은 박테리아 및 효모 숙주가 있다.

대부분의 경우, 재조합 구성물은 왁스 합성효소 유전자를 발현시켜서 작용성 왁스 합성효소 단백질을 생성시키는 식물에서 작용하는 조절 영역을 포함할 것이다. 식물 왁스 합성효소 또는 이것의 기능적 단편을 코드화하는 개방 리딩 프레임은 이것의 5′말단에서 왁스 합성효소 구조 유전자의 5′상류에서 천연적으로 발견되는 야생형 서열과 같은 전사 개시 조절영역에 결합될 것이다. 구조 유전자 서열의 광범위한 구성적 또는 조절가능한, 예를 들어 유도할 수 있는 서열을 제공하는 천연 식물 유전자로부터의 다수의 다른 프로모터 영역이 이용될 수 있다.

천연 식물 유전자로부터의 서열 이외에, 노팔린(nopaline) 합성효소(Nos), 만노핀(Mannopine) 합성효소(Mas) 또는 옥토핀(0ctopine) 합성효소(Ocs) 유전자와 관련된 영역을 포함하는, 아그로박테리움 유전자와 관련된 조절 영역과 같은 다른 서열이 식물에서의 구조 유전자 발현을 제공할 수 있다. 또한, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 및 19S 영역과 같은 바이러스 유전자의 발현을 조절하는 영역이 유용하다. 본원에 사용되는 바와 같은“구조적”이라는 표현은 유전자가 모든 세포 유형에서 동일한 수준으로 발현되지만, 양에 있어서 약간의 변동이 종종 검출될 수 있더라도, 유전자가 다양한 세포 유형에서 발현된다는 것을 반드시 제시하는 것은 아니다. 나핀(napin), 종자 또는 잎의 ACP, RUBISCO의 작은 하위 단위체 등으로부터의 영역과 같은 다른 유용한 전사 개시영역이 우선적으로, 특정 조직에서 또는 특정 조건하에서 전사를 제공한다.

식물 숙주에서 왁스 합성효소 단백질의 발현이 바람직한 양태에서, 완전 식물 왁스 합성효소 유전자의 일부 또는 전부의 사용이 바람직할 수 있으며, 즉, 구조 유전자 서열 및 3′하류 비코드화 영역과 함께 5′상류 비코드화 영역(프로모터)이 사용될 수 있다. 관심있는 식물 숙주의 본래의 프로모터 또는 변형된 프로모터와 같은 상이한 프로모터, 즉 하나의 유전자 공급원으로부터 유래된 전사 개시 영역 및 하나의 다른 유전자 공급원으로부터 유래된 번역 개시 영역을 갖는 프로모터, 또는 이중 355 CaMV 프로모터와 같은 향상된 프로모터가 바람직한 경우에는, 표준 기술을 이용하여 서열들을 함께 결합시킬 수 있다.

식물에서 왁스 합성효소 발현을 제공하는 DNA 구성물을 광범위한 식물, 특히 브라시카(Brassica)와 같이 왁스 합성효소의 지방 아실-CoA 기질을 생성시키는 식물에 사용될 수 있다. 관심의 대상이 되는 다른 식물은 중간 사슬 또는 긴 사슬 지방 아실 분자와 같은 원하는 지방 아실 기질을 생성시키며, 평지씨(canola varieties), 해바라기, 잇꽃, 목화, 쿠피아(Cuphea), 대두, 땅콩, 코코넛 및 오일 팜 및 옥수수를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.

왁스 합성효소의 지방 알코올 기질에 대하여, 물론 소량의 상기 기질이 합성효소에 이용될 수도 있지만, 호호바와는 달리 종자 식물은 다량의 지방 알코올을 생성시키는 것으로 알려지지는 않았다. 따라서, 본 발명의 왁스 합성효소 구성불과 관련하여, 숙주세포에 존재하는 지방 아실 분자로부터 지방 알코올을 생성시킬 수 있는 표적 숙주 세포를 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 식물 지방 아실 환원효소, 및 식물 세포에서 환원효소의 발현을 제공하는 방법은 공동 계류중인 미합중국 특허 출원 제 07/767,251호에 기술되어 있다. 호호바 환원효소의 핵산 서열 및 번역된 아미노산 서열은 제1도에 도시하였다. 그러므로, 숙주 식물세포에 왁스 합성효소 및 환원효소 단백질 모두를 제공함으로써, 지방 알코올과 지방 아실 기질로부터 왁스 에스테르가 생성될 수 있다.

호호바 환원효소 이외에, 다른 유기체로부터의 환원효소가 본 발명의 왁스 합성효소와 관련하여 유용할 수 있다. 환원효소의 다른 가능한 공급원으로는, 유글레나, 아시네토박터, 마이크로코커스, 특정 곤충류 및 해양 유기체, 및 소의 마이봄선 또는 조류의 미지선과 같은 왁스 에스테르를 함유하는 것으로 알려진 포유동물 또는 조류의 분화된 조직이 있다. 다른 가능한 공급원은 지방 알코을 또는, 왁스 합성효소가 존재하는 경우에는 왁스 에스테르를 생성시킬 수 있는 이들의 능력에 의해 확인할 수 있다.

왁스 합성효소 및 환원효소 서열은 동일한 형질전환 과정에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 왁스 합성효소 구성물을 갖는 것과 환원효소 구성물을 갖는 것의 2개의 상이한 유전자 교환 식물계가 여러 구성물에 의한 형질 전환에 의해 생성될 수 있다. 이들 식물계는 공지된 식물 육종 기술을 사용하여 교배되어 왁스에스테르 생성물의 생성을 위한 왁스 합성효소 및 환원 효소 함유하는 식물을 제공할 수 있다.

왁스 에스테르 생성을 유도하는 응용에 대해, 종자의 성숙 과정에서 조절된 유전자로부터 얻어진 5′상류 비코드화 영역, 특히 ACP 및 나핀 조절 영역으로부터 유래된 영역과 같은 식물체 배아 조직에서 우선적으로 발현되는 영역이 바람직하다. 종자의 조직에서 우선적인 발현을 제공하는 전사 개시 영역, 즉 다른 식물 부분에서는 검출할 수 없는 전사 개시 영역이, 왁스 에스테르 생성으로 다른 식물 부분에서의 유전자 생성물의 임의의 방해 또는 악영향을 최소화시키는 데에 바람직한 것으로 간주된다. 또한, 이러한 식물의 종자가 수확될 수 있고, 상기 종자의 지질 보유량이 회복되어 왁스 에스테르의 준비된 공급원을 제공한다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 왁스 합성효소 구성물에 의해 형질 전환이 되지않고 종자 지질 보유체의 한 성분으로서 왁스 에스테르를 생성시키는 것으로 공지되지 않은 지방 종자 식물에서 신규한 종자 생성물이 생성될 수 있다.

이러한“종자 특이적 프로모터”는 발명의 명칭이“초기 종자 단계에서 우선적으로 발현되는 신규한 서열 및 이와 관련된 방법(Novel Sequences Preferentially Expressed In Early Seed Development and Methods Related Thereto)”인, 1988년 1월 25일자 출원된 미합중국 특허 출원 제 07/147,781호(현재 1981년 8월 8일자 출원된 제 07/742,834호), 및 1990년 3월 16일자 출원된 미합중국 특허 출원 제 07/494,722호의 설명에 따라 얻어지고 사용될 수 있다.

조절 전사 말단 영역이 또한 본 발명의 재조합 구성 물에서 제공될 수 있다. 전사 말단 영역은 식물의 왁스 합성효소를 코드화하는 DNA 서열, 또는 상이한 유전자 공급원으로부터 유래된 편리한 전사 말단 영역, 특히 천연적으로 전사 개시 영역과 관련된 전사 말단 영역에 의해 제공될 수 있다. 전사 말단 영역은 말단 영역이 유도되는 구조 유전자에 대해 서열 3′를 약 0.5kb이상, 바람직하게는 약 1-3 kb함유할 것이다.

DNA 발현 구성물을 숙주 세포내에 도입시키 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 중요하게는, 본 발명은 쌍자엽 종과 단자엽 종에 동등하게 적용될 수 있고, 새롭고/거나 개선된 형질전환 및 재생 기술에 쉽게 적용될 것이다.

재조합 구성물을 발현시키는데 있어서는, 구성물 또는 이것의 단편의 다양한 성분이 박테리아 숙주, 예를 들어 E. coli에서 복제될 수 있는 유용한 클로닝 벡터내에 삽입되는 것이 통상적일 것이다. 관계 문헌에는 다수의 벡터들이 개시되어 있다. 각각의 클로닝 후에, 플라스미드는 단리되고, 원하는 서열의 성분이 제조되도록, 제한, 새로운 단편의 삽입, 결찰, 결실, 삽입, 절제 등과 같은 조작이 추가로 수행될 수 있다. 일단 구성물이 완성되면, 숙주세포의 형질전환 방법에 따라 추가의 조작을 위해 적합한 벡터로 전달된다.

정상적으로, 재조합 구성물에는, 숙주 세포에서의 발현을 위한 필요한 조절 영역을 갖고 형질전환 세포의 선택을 제공하는 구조 유전자가 포함될 것이다. 상기 유전자는 세포독성제, 예를 들어 항생제, 중금속, 독소 등에 대한 내성, 영양 요구성 숙주에 기본 유기 영양을 제공하는 보완작용, 바이러스 면역성 등을 제공한다. 유사하게는, GUS와 같이 색변화에 의해 확인할 수 있는 화합물, 또는 루시페라제와 같은 발광 물질을 생성시키는 효소를 코드화하는 유전자가 유용하다. 상이한 숙주 종의 수에 따라, 발현 구성물 또는 이것의 성분들이 도입되되며, 상이한 숙주에 대해 상이한 선택 조건이 사용되는 경우에 하나 이상의 마커가 사용될 수 있다.

왁스 합성효소 서열의 전사를 제공하는 서열 이외에, 본 발명의 DNA 구성물론 또한 추가의 유전자(들)의 발현을 제공할 수 있으며, 단백질 생성물은 왁스 합성효소와 함께 작용하여 유용한 최종 생성물을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 형질전환된 숙주에서 왁스 에스테르가 생성될 수 있도록 왁스 합성효소 및 지방 아실 환원효소의 발현을 제공하는 DNA 구성물이 본 발명에서 고려된다. 또한, 탄소 사슬 길이 및 포화도가 변동되는 상이한 왁스 에스테르의 생성이 바람직하며, 이는 사슬 길이가 변하는 지방 알코올 또는 지방 아실 기질을 갖는 숙주 식물을 형질전환 시킴으로써 제공될 수 있다. 이러한 식물은, 예를 들어 공개된 국제 특허 출원 PCT WO 91/16421호에 기술된 방법에 의해 제공될 수 있으며, 이 특허 문헌에는 다양한 티오에스테라제 유전자, 및 이 유전자를 사용하여 형질 전환된 식물 숙주에서 사슬 길이가 변하는 지방 아실 기질을 생성시키는 방법이 기술되어 있다.

또한, 지방종자 식물 숙주에서 왁스 에스테르의 제조를 최적화시키기 위해, 상기 식물의 종자에서 정상적으로 생성되는 트리아실글리세라이드 오일의 생성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 달성하는 한가지 방법은, 상기 공정에 대하여 결정적인 유전자를 안티센스화시키는 것이지만, 왁스 에스테르의 생성에 대해서는 반드시 필요하지는 않다. 이러한 유전자 표적으로는, 디아실글리세를 아실트랜스퍼라제, 및 트리아실글리세를의 합성을 촉매하는 다른 효소가 있다. 부가적으로, 호호바 또는 다른 다양한 왁스 생성 유기체로부터 단리될 수 있는 것과 같이, 영양원으로서의 왁스 에스테르를 분해시키는 데에 사용할 수 있는 효소를 지방종자 식물에 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법으로, 종자 식물 숙주에서의 왁스 에스테르의 최대 생성이 달성될 수 있다.

본원에 기술된 방법으로 생성되는 왁스 에스테르는, 호호바로부터 왁스를 추출하는 기술을 사용하거나, 다양한 지방종자 곡물로부터 오일 생성물을 얻는 데에 사용된 여러가지 생성 방법에 의해서 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 왁스는 제약, 화장품, 세제, 플라스틱 및 윤활제를 포함하는 많은 산업에서 응용될 수 있다. 이러한 응용은 왁스 에스테르 성분의 사슬 길이 및 포화도에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 각각의 탄소 사슬 중에 이중 결합을 갖는 긴 사슬 왁스는 실온에서는 액체인 반면, 포화된 탄소 사슬 성분을 갖는 왁스는 특히 포화된 탄소 사슬이 더 긴 탄소 사슬인 경우에 실온에서 고체이다.

형질전환 방법은 본 발명에 있어서 결정적이지는 않으며; 식물 형질전환의 다양한 방법이 현재 이용될 수 있다. 곡물을 형질전환시키는 데에 더욱 새로운 방법이 사용될 수 있으므로, 이들 방법들이 이하에서는 직접 적용될 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움에 천연적으로 잘 감염되는 많은 식물 종은 아그로박테리움 중개 형질전환의 3부 또는 2부 벡터 방법을 통해 성공적으로 형질전환될 수 제다. 핵산 서열을 숙주 식물 세포에 전달하는 데에 유용한 다른 서열은 식물 병원성 바이러스 또는 식물 전위 요소로부터 유도될 수 있다. 또한, 미량 주사, DNA 입자 층격법, 전기 영동 등의 기술이 개발되어 다양한 단자엽 또는 쌍자엽 식물 종의 형질전환을 가능하게 해주었다.

아그로박테리움을 식물 형질전환에 이용할 경우에는, T-DNA에 의해 한쪽 또는 양쪽 말단에, 특히 좌측 및 우측 경계 영역에, 더욱 상세하게는 최소한 우측 경계 영역에 인접하는 바람직한 핵산 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이들 경계 영역은 다른 형질전환 방법을 사용할 경우에도 유용할 수 있다.

아그로박테리움 또는 리조게네스 서열을 식물 형질전환용으로 사용하는 경우에, 숙주에 존재하는 Ti-플라스미드 또는 Ri- 플라스미드상의 T-DNA와의 동종 재조합을 위한 아그로박테리움 숙주 내에 도입시킬 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 재조합용으로 T-DNA를 함유하는 Ti-플라스미드 또는 Ri-플라스미드는 아암(arm)이 형성될 수 있거나(흑(gall) 형성을 유발시킬 수 있음), 아암이 형성되지 않을 수도 있으며(혹을 형성할 수 없음), DNA를 식물 숙주 세포에 전달하는 데에 필요한 수행 인자를 코드화하는 vit 유전자의 기능적 보완이 형질전환된 아그로박테리움 숙주에 존재하는 한은, 상기의 아암이 형성되지 않은 플라스미드가 허용될 수 있다. 아암이 형성된 아그로박테리움 계통을 사용하면, 정상 식물 세포의 혼합물이 형성될 수 있으며, 이들 세포 중 일부는 바람직한 핵산 서열을 함유하고, 식물 세포는 종양 형성 유전자의 존재로 인해 혹을 형성시킬 수 있다. 정상 유전자 교환 식물이 얻어질 수 있도록, 원하는 핵산 서열을 함유하지만 종양 유전자가 결여된 세포가 상기 혼합물로부터 선택될 수 있다.

아그로박테리움을 숙주 식물 세포의 형질전환용 비히클로서 사용하는 바람직한 방법에 있어서, T-DNA 경계 영역(들)에 인접하는 발현 또는 전사 구성물을 E. coli 및 아그로박테리움에서 복제될 수 있는 광범위한 숙주 범위 벡터 내에 삽입될 것이며, 이러한 광범위한 숙주 범위 벡터는 관계 문헌 상에 기술되어 있다. pRK2 또는 이것의 유도체가 통상적으로 사용된다 : [참조예 : 본원에 참고문헌으로 인용된, 디타(Ditta)등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77 : 7347-7351] 및 EPA 0 120 515호]. 대안적으로, 식물 세포에서 발현시키려는 서열을 별도의 복제 서열을 함유하는 벡터내에 삽입시킬 수 있으며, 상기 별도의 서열 중의 하나는 E. coli에서 벡터를 안정시키고, 나머지 하나는 아그로박테리움에서 벡터를 안정시키며[참조예 : McBride and Summefelt (Plant Mol. Biol. (1990) 14 : 269-276], 여기에서 pRiHRl[Jouanin et al., Mol. Gen. Genet (1985) 201:370-374] 복제원이 이용되어, 숙주 아그로박테리움 세포에서 식물 발현 벡터의 안정성을 더해준다.

아그로박테리움에서 복제할 수 있는, 상기 기술된 바와 같은 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 플라스미드의 재조합은 필요하지 않고, 숙주 아그로박테리움 vir 영역은 T-DNA 인접 서열을 식물 숙주 세포에 전달하기 위해 필요한 수행 인자를 공급할 수 있다. 브라시카 세포의 형질전환을 위해서, 아그로박테리움 형질전환 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법 중 한가지는, 예를 들어 라드케(Radke) 등의 문헌 [Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694]에 의해 기술되어 있다.

본 발명은 지금까지 일반적인 사항에 관하여 설명되었지만, 하기의 실시예와 관련하여 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시를 위해 포함된 것이고, 다른식으로 규정하지 않는 한은 본 발명을 제한 하지는 않는다.

[실시예]

[실시예 1]

[왁스 합성효소 검정]

본 실시예는 마이크로솜 막 제조물 또는 용해된 단백질 제조물에서의 왁스 합성효소 활성을 검정하기 위한 방법을 설명하는 것이다.

A. 방사성 표지 물질

왁스 합성효소 검정에 일반적으로 사용되는 기질인 [1-l4C]팔미토일-CoA를 아머샴(Amersham)(Arlington Heights, IL, U.S.A.)으로부터 입수하였다. 사슬 길이에 대한 상세한 연구를 수행하기 위해, 다른 사슬 길이 기질을 합성하였다. 칼륨 [¹⁴C] 시안화물을 상응하는 알코을 메실레이트와 반응시킨 후, 알코올 니트릴을 유리 지방산으로 염기 가수분해시켜서, 긴사슬(1-¹⁴C) 지방산(비활성 51-56 Ci/몰), 즉 11-시스-에이코세노산, 13-시스-도코세노산 및 15-시스-테트라코세노산을 제조하였다. 유리 지방산을 에테르성 디아조메탄에 의해 지방산 메틸 에스테르로 전환시키고, 정제용 질산은 얇은층 크로마토그래피(TLC)에 의해 정제하였다. 지방산 메틸 에스테르를 역으로 유리 지방산으로 가수분해시켰다. 방사성 화학 약품 순도를 3가지 TLC 방법, 즉 규정 상 실리카 TLC, 질산은 TLC 및 Cl8 역상 TLC에 의해 평가한다. 이들 방법에 의해 측정된 방사성 화학약품 순도는 92-98%이었다. 긴사슬 [1-¹⁴C] 아실-CoA를 상응하는 [1-¹⁴C] 유리 지방산으로부터 영(Young) 및 리넨(Lynen)의 방법[J. Bio. Chem. (1969) 244:377]에 의해, 비활성이 10Ci/mole이 되도록 제조하였다. [1-¹⁴C]헥사데칸알을 플레쳐(Pletcher) 및 테이트(Taye)의 방법[Tet. Lett. (1978) 1601-1602]의 미규모 변형에 따라[1-¹⁴C]헥사데칸-1-올의 중크롬산염 산화에 의해 제조하였다. 생성물을 정제 실리카 TLC에 의해 정제한 후, 사용할 때까지 -70℃에서 헥산 용액으로서 저장하였다.

B. 마이크로솜 막 제조물에서의 왁스 합성효소 활성에 대한 검정

마이크로솜 막 제조물에서의 왁스 합성효소 활성을, 40μM [1-¹⁴C]아실-CoA(통상적으로 팔미토일-CoA, 비활성 : 5.1-5.6 mCi/mmol) 및 200μM 올레일 알코올을 검정하려는 샘플로 총부피를 0.25㎖로 하여 인큐베이션시켜서 측정하였다. 인큐베이션 혼합물은 또한 20%w/v 글리세를, 1mM DTT 및 0.5M NaCl을 함유하며, 이 흔합물을 25mM HEPES(4-[2-히드록시에틸]-1-피페라진에탄술폰산)로 완충시켰다. HEPES는 pH 7.5로 조절한 1M 원액으로부터 첨가하였다.

기질 혼합물을 사용 직전에 올레일 알코올을 첨가하여 유리 바이알에서 제조하고, 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션은 30℃에서 1시간 동안 수행하였다. 검정은 검정 튜브를 얼음 위에 놓고, 즉시 0.25㎖의 이소프로판올 : 아세트산(4:1 v/v)을 첨가함으로써 종결시켰다. 비표지 왁스 에스테르(0.1mg) 밀 올레일 알코을(0.1mg)을 담체로서 첨가하였다. [¹⁴C] 지질을 하라(Hara) 및 라딘(Radin)의 소규모 프로토콜[Anal. Biochem. (1978) 90:420]에 의해 추출하였다. 4㎖의 헥산/이소프로판올(3:2, v/v)을 종결된 검정 생성물에 첨가하였다. 샘플을 와동시키고, 2㎖의 황산 나트륨 수용액(6.6% w/v)을 첨가한 후, 샘플을 다시 와동시켰다.

C. 용해된 왁스 합성효소 활성의 검정

용해된 왁스 합성효소 활성을 검정하기 위해서는, 단백질의 재구성이 필요하다. 재구성은 인지질(Sigma P-3644, 약 40% L-포스파티딜콜린)을 0.75% CHAPS-용해된 샘플에 2.5mg/㎖의 농도로 첨가한 후, 계면활성제를 CMC 보다 0.3% 낮게 희석시킴으로써 달성하였다. 윤성의 재구성은 인지질 소포 내로의 왁스 합성효소의 혼입을 기초로 한 것으로 추정된다. 재구성 후에 검출된 왁스 합성효소 활성의 양은 많은 인자(예를 들어 인지질 대 단백질의 비율 및 왁스 합성 효소 단백질(예를 들어 응집 또는 분산된)의 물리적 상태에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 인지된다.

D. 검정 생성물의 분석

마이크로솜 막 제조물 왁스 합성효소 검정 또는 용해된 왁스 합성효소 검정의 생성물을 분석하기 위해서, 2가지 프로토콜이 개발되었다. 하기에서“광범위 검정(extensive assay)”으로서 기재되는 한 가지 프로토콜은 더 많은 시간이 소모되지만, 보다 고도의 정량적 결과를 산출한다. 하기에서“신속 검정(quick assay)”으로서 기재되는 다른 한가지 프로토콜은 보다 빠르고, 편리하지만, 덜 정량적인 왁스 합성효소 활성의 측정을 제공한다.

1. 광범위 분석 : 황산나트륨을 첨가하고 샘플을 와동시킨 후, 상부 유기상을 제거하고, 하부의 수성상을 4㎖의 헥산/이소프로판올(7:2 v/v)로 세척하였다. 유기상을 푸울링시키고, 질소하에 증발 건조시켰다. 액체 잔류물을 소량의 헥산에 재현탁시키고, 일정 분취액을 취하여 액체 섬과 계측에 의해 방사능에 대해 검정하였다. 샘플의 나머지는 표지된 클라스의 TLC 분석을 위해 사용할 수 있고, 따라서 생성된 전체 왁스에 대한 측정을 제공한다.

지질류의 분석을 위해서 샘플을 실리카 TLC 플레이트에 도포시키고, 이 플레이트를 헥산/디에틸 에테르/아세트산(80:20:1 v/v/v) 중에 전개시켰다. 지질류, 대부분의 왁스 에스테르, 유리 지방산, 지방 알코올, 및 기시점에 있는 극성 지질 사이의 방사능의 분포를 AMBIS 방사성 분석 영상화 시스템(AMBIS Systmes Inc., San Diego, CA)을 사용하여 측정하였다. 필요에 따라 각각의 지질류를 추가의 분석을 위해 TLC플레이트로부터 회수할 수 있었다. 메탄올 중에 전개시킨 Cl8 플레이트를 사용하는 역상 TLG 시스템을 또한 분석을 위해 사용하였다.

2. 신속 분석 : 황산 나트륨을 첨가하고 샘플을 와동시킨 후, 공지된 비율의 유기상을 제거하고, 액체 섬광 계측을 통해 계측하였다. 이러한 계산을 사용하여 유기상 중의 총 계측값을 평가하였다. 유기상의 나머지 부분 제거하고, 질소하에 건조시키고, 헥산 중에 재용해시킨 후, TLC플레이트 상에 스폿팅하고, 상세한 검정을 위해 설명한 바와 같이 전개시키고 스캐닝시켰다. 이러한 방식으로, 왁스 내로 흔입되는 총 계측값의 백분율을 측정하였다.

[실시예 2]

[왁스 합성효소 단백질을 방사성 표지화하는 방법]

방사성 표지된 [1-¹⁴C]팔미토일-CoA(Amersham)를 용해된 형태 또는 마이크로솜 막 분획 형태의 왁스 합성효소 제조물에 40㎖의 단백질 샘플에 대해 5㎕의 표지의 비율로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 추가의 처리 전에 실온에서 15분 이상 동안 인큐베이션하였다. SDS-PAGE 분석을 위해, 샘플을 SDS 샘플 완층액으로 직접 처리하고, 겔 위에 로딩하여 전기영동시켰다.

[실시예 3]

[왁스 합성효소 활성을 특징화시키기 위한 위한 추가의 연구]

A. 종자 발생 및 왁스 합성효소 활성 프로필

배 발생을 미국 캘리포니아주 데이비스에서 5가지 식물에 대해 2년 동안의 여름에 걸쳐 연구하였다. 배의 초기 및 건조 중량은 약 80일째부터 약 130일째까지 매우 꾸준한 비율로 증가하는 것으로 관찰되었다. 지질을 추출한 결과, 배의 초기 중량이 약 300mg 에 도달하였을 때(약 80일째), 지질 중량 대 건조 중량 비는 50%의 최대 수준에 도달하는 것으로 나타났다.

왁스 합성효소 활성을 실시예 1에서 설명한 바와같이 발생중인 배에서 측정하였다. 호호바 종자 껍질이 억제 인자(들)의 공급원인 것으로 측정 되었기 때문에, 배를 -70℃에서 저장하는 동안 액체 질소 중에서 냉동시키기 전에 제거하였다.

세포 유리 균질물 또는 막 분획 중에서 측정하여 왁스 합성효소 활성에 대한 발생 프로필은 개화 후 약 110-115일에 피크인 활성의 큰 유도를 나타내었다. 효소학적 연구를 위한 배를 개화 후 약 90일 내지 110일에 수득하였으며, 이 기간 동안에 왁스 합성효소 활성은 높았고, 지질 침착이 최대 수준에 도달하지 않았으며, 종자 껍질이 쉽게 제거되었다. 왁스 합성효소 활성의 증가의 가장 높은 비율은 개화후 약 80일 내지 90일에 나타났다. cDNA 라이브러리 구성을 위한 배는, 왁스 합성효소 단백질의 합성속도가 최대일 때인 개화후 약 80일 내지 90일에 획득되었다. 따라서, 왁스 합성효소를 코드화하는 mRNA의 수준도 이 단계에서 최대일 것으로 여겨진다.

B. 기질 특이성

탄소 사슬 길이 및 불포화도가 변동된 아실-CoA 및 알코을 기질을 왁스 합성효소 활성을 갖는 마이크로솜 막 분획에 첨가하여 호호바 왁스 합성 효소에 의해 인지되는 기질 범위를 측정하였다. 왁스 합성효소 활성은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 측정하였으며, 아실 특이성은 80μM의 아실-CoA 기질 및 100μM의 방사성 표지된 올레일 알코올을 사용하여 측정하였다. 알코올 특이성은 100μM의 알코올 기질과 40μM의 방사성 표지된 에이코세노일-CoA를 사용하여 측정하였다. 이들 실험의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 결과는 호호바 왁스 합성효소가 광범위한 지방 아실-CoA 및 지방 알코올 기질을 사용함을 증명해준다.

또한, 다양한 아실-티오에스테르 기질에 대한 왁스 합성효소 활성을 아실 기질로서 팔미토일-CoA, 팔미토일-ACP 및 N-아세틸-S-팔미토일 시스테아민을 사용하여 유사하게 시험하였다. 아실-CoA 기질의 사용으로 가장 큰 활성이 관찰되었다. 아실-ACP의 사용으로는 유의할만한 활성(아실-CoA를 사용했을 때의 약 10%)이 관찰되었으며, N-아세틸-S-팔미토일 시스테아민 기질의 사용으로는 활성을 검출할 수 없었다.

C. 활성의 이펙터

다양한 술피드릴 제제를 왁스 합성효소 활성에 대한 이들의 효과에 대해 스크리닝하였다. 유기 수은 화합물이 활성을 강하게 억제하는 것으로 나타났다. 요오도아세트아미드 및 N-에틸말레아미드는 효과가 훨썬 더 작았다. 파라-히드록시머큐리벤조에이트에 의한 억제가 관찰되었지만, 이 억제는 후속되는 DTT의 첨가에 역전될 수 있다. 이들 결과는 파라-히드록시머큐리 벤조에이트에 의한 억제가 필수 술피드릴기의 차단을 포함함을 증명해준다.

D. 크기 배제 크로마토그래피

칼럼(1.5㎝×46㎝)을 세파크릴-200(Pharmacia, 크기 범위 : 5,000-250,000 달톤)으로 충전시키고, 0.5M NaCl을 함유하는 컬럼 완층제(25mM HEPES, 20% 글리세롤, 0.75% CHAPS, 1mM EDTA)으로 평형화시켰다. 블루 A 컬럼(실시예 4C 참조)으로부터의 단일 1.5M NaCl 용리액으로 부터의 약 2㎖의 푸울링된 농축물을 로딩(loading)시키고, 칼럼을 0.5㎖/분으로 작동시켰다. 용리된 분획을 실시예 1에 기술된 재구성 프로토콜을 따라 왁스 합성효소 활성에 대해 검정하였다. 왁스 합성효소 변성은 공극 분획에서 시작하여 나머지 작동 기간에 걸쳐 감소해가는 넓은 피크로서 나타났다. 왁스 합성효소 활성을 갖는 분획의 일부를 1-¹⁴C 16:0-CoA(0.0178μM)로 15분 동안 실온에서 처리하였다. SDS를 2%까지 첨가하고 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 전기영동 후에, 겔을 프로블롯트(Problott)(Applied Biosystems ; Foster City, CA)에 블롯팅하고, 건조된 블롯 막을 자동 방사선 사진에 의해 분석하였다. 대안적으로, 블롯을 자동 주사 시스템(AMBIS ; San Diego, CA)을 사용하여 방사능에 대해 주사할 수도 있다. 이러한 방식으로, 57kD 방사성 표지된 밴드가 분석된 분획 중의 왁스 합성효소 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.

왁스 합성효소 활성과 관련된 단백질을 제2 크기 배제 매트릭스 상에서의 크로마토그래피에 의하여 추가로 특징화시켰다. 왁스 합성효소 활성을 함유하는 블루 A 컬럼으로부터의 10배 농축된 1.5M NaCl용리액의 분획(100㎕)(1.0M NaCl용리 단계후)을 슈퍼로스 12 HR 10/30 컬럼(Pharmacia ; Piscataway, NJ) 상에서 크로마토그래피하고, 분자량 표준 물질(MW GF-70 및 MWGF-1000 ; Sigma)을 사용하여 보정된 칼럼 상에서 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)에 의해 분석하였다. 활성 검정은 용리된 분획에 대해 수행하였다. 회수된 왁스 합성효소 활성의 53%가 공극 분획에서 발견되지만, 쉽게 검출할 수 있는 활성은 보정 곡선에 따라 약 55kd에서 용리되는 것으로 발견되었다. 이들 데이타는 활성 천연 왁스 합성효소 단백질의 최소 크기가 표지된 밴드의 57kD 크기와 매우 유사하여, 왁스 합성효소 활성이 단일 폴리펩티드에 의해 제공된다는 증거를 제공함을 제시하는 것이다. 공극 분할에서 관찰된 왁스 합성효소 활성의 분획은 아마도 효소의 응집된 형태일 것이다.

E. 팔미토일-CoA 아가로오스 크로마토그래피

컬럼(1.0×3㎝)을 16:0-CoA 아가로오스(Sigma P-5257)로 층전시키고, 0.2M NaCl을 함유하는 컬럼 완층액(실시예 1, D 참조)으로 평형화시켰다. 블루 A 컬럼의 1.5M NaCl 세척물로부터의 약 4㎖의 푸울링된 농축물을 해동시키고, 0.2M NaCl 컬럼 완층액 중에 평형 화되어 있는 PD-10(Pharmacia) 탈염 칼럼 위로 농축물을 통과시킴으로써 염농도를 감소시켰다. 염농도가 감소된 샘플(5㎖)을 0.15㎖/분의 유속으로 16:0 CoA 아가로오스 컬럼상에 로딩시켰다. 컬럼을 0.5M NaCl 컬럼 완층액으로 세척한 후, 1.5M NaCl 컬럼 완충액으로 세척하였다. 일부 왁스 합성효소 활성이 컬럼을 통해 흐르거나 0.5M NaCl 세척에 의해 제거되지만, 회수된 활성의 대부분(로딩된 활성의 21%)은 1.5M NaCl 용리 피크에서 회수되었다.

왁스 합성효소 활성을 나타내는 분획 부분을 실시예 2에서 설명한 바와 같이 [¹⁴C]팔미토일-CoA로 방사성 표지화시키고, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동[Laemmli, Nature(1970) 227:680-685]에 의해 분석하였다. 다시, 약 57kD 방사성 표지된 단백질 밴드가 왁스 합성효소 활성을 갖는 것으로 관찰되었다.

[실시예 4]

[호호바 왁스 합성효소의 정제]

왁스 합성효소 활성을 갖는 호호바 막 제조물의 분리, 왁스 합성효소 활성의 용해 및 왁스 합성효소 단백질의 추가의 정제에 대해 사용할 수 있는 방법을 설명한다.

A. 마이크로솜 막 제조물

배의 수분 함량(40-70%)을 측정함에 의해 평가되는 바와 같이, 발화 후 약 90일 내지 110일에 호호바 배를 수득하였다. 바깥 껍질과 종자 껍질을 제거하고, 떡잎을 신속하게 액체 질소 중에서 냉동시켜서 나중에 사용하기 위하여 -70℃에서 보관하였다. 초기 단백질 제조를 위해, 냉동된 배를 액체 질소 온도에서 강 모르타르 및 막자로 분쇄시킴으로써 분말로 만든다. 전형적인 실험에서 70g의 배를 처리하였다.

분말을 70g의 배에 대해 용액 280㎖의 비율로 하기 고농도 염용액에 첨가하였다 : 3M NaCl, 0.3M 수크로오스, 100mM HEPES, 2mM DTT, 및 프로테아제 억제제, 1mM EDTA, 0.7㎍/㎖ 류펩틴, 0.5㎍/㎖ 펩스타틴 및 17㎍/㎖ PMSF. 세포 유리 균등물(CFH)을 분말화된 배를 조직 균등기(Kinematica, Switzerland : 모델 PT 10/35)를 사용하여 약 30초 동안 완충액 중에 분산시킨 후, 미라클로쓰(Miradoth , CalBio Chem, Lajolla, CA)의 3개의 층을 통하여 여과시켜서 형성시켰다. 여과물을 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리시켰다.

생성된 샘플은 펠릿, 상층액 및 유동 지방 패드로 구성된다. 지방 패드를 제거하고 상층액 분획을 모아서, 1M NaCl, 100mM HEPES, 2mM DTI 및 0,5M EDTA를 함유하는 용액에 대하여 밤새 투석하였다(이때, 완층 용액을 3회 교체함다). 투석물을 200,000×g 에서 1½ 시간 동안 원심분리시켜서 펠릿, 즉 DP2를 수득하였다. 펠릿을 원래의 CFH 부피의 1/20 부피로 25mM HEPES 및 10% 글리세롤에 현탁시켜서 마이크로솜 막 제조물을 수득하였다.

활성을 실시예 1에서 설명한 바와 같이 검정하였다. 왁스 합성효소 활성의 회수율은 세포 유리 균등물 중의 원래의 활성의 34%로 평가되었다. 상기 제조물에서의 왁스 합성효소 활성은 -70℃에서 보관할 때 안정하다.

B. 왁스 합성효소 단백질의 용해

CHAPS (3-[(3-콜라미도프로필)-디메틸-암모니오]-1-프로판술포네이트) 및 NaCl을 마이크로솜 막 제조물에 첨가하여, 최종 농도가 각각 2% 및 0.5M이 되도록 하였다. 샘플을 얼음 상에서 약 1시간 동안 인큐베이션시킨후, 25mM HEPES, 20% 글리세롤 및 0.5M NaCl로 희석시켜 CHAPS 농도를 0.75%로 저하시켰다. 그 후에, 샘플을 200,000×g에서 1시간 동안 원심분리시키고, 상층액을 회수하고, 실시예 1C에서 설명된 바와 같이 왁스 합성효소 활성에 대해 검정하였다. 전형적으로, 마이크로솜 막 제조물로부터 왁스 합성효소 활성의 11%가 상층액 분획에서 회수되었다. 용해된 왁스 합성효소 활성은 -70℃에서 보관할 때 안정하다.

C. 블루 A컬럼 크로마토그래피

블루 A(Cibacron Blue F3GA ; Amicon Division, W.R. Grace ＆ Co.)를 함유하는 약 3㎖의 층부피를 갖는 컬럼(2.5×8㎝)을 준비하고, 칼럼을 0.4M NaCl을 함유하는 컬럼 완층액(25mM HEPES, 20% 글리세롤, 0.75% CHAPS, 1mM EDTA)으로 평형화시켰다. 용해된 왁스 합성효소 제조물을 칼럼 완충액(25mM HEPES, 20% 글리세롤, 0.75% CHAPS, 1mM EDTA)의 첨가에 의해 0.4M NaCl 까지 희석시키고, 블루 A칼럼 상에 로딩시켰다.

칼럼을 통하여 흐르는 완층액에서 단백질이 검출되지 않을 때까지 (280nm에서의 흡수도에 의해 측정함), 칼럼을 0.5M NaCl을 함유하는 칼럼 완층액으로 세척하였다. 94% 보다 높은 왁스 합성효소 활성이 칼럼에 결합하는 한편, 83% 보다 높은 다른 단백질이 칼럼을 통과하였다. 전형적으로, 약 20%의 로딩된 왁스 합성효소 활성이 용리에 의해 회수되었다. 회수된 활성의 일부(17%)를 1.0M NaCl 칼럼 완층 세척액에 의해 용리시키면서, 회수된 활성의 약 75%는 1.5M NaCl 칼럼 완층액을 갖는 150㎖ 세척액 중에서 넓은 피크로서 용리시켰다. 1.5M 세척의 5㎖ 분획을 모아서, 실시예 1에서 설명한 바와 같이 왁스 합성효소 활성에 대해 검정하였다. 왁스 합성 효소 활성을 함유하는 분획을 푸울링시키고, 아미콘 교반 셀 유닛 열 YM3O 막을 사용하여 10배 농축시켰다. 농축된 왁스 합성효소 제조물을 -70℃에서 보관할 수 있었다.

D. SDS PAGE 분석

활성 블루 A컬럼 분획으로부터의 샘플을 SDS PAGE 샘플 완충액(1×완충액=2% SDS, 30mM DTT, 0.001% 브로모페놀 블루) 중에서 희석시키고, NOVEX(San Diego, CA)사의 12% 트리스/글리신 프레캐스트 겔 상에서의 전기영동에 의해 분석하였다. 겔을 150V의 일정한 전압에서 약 1.5 시간동안 작동시켰다. 단백질을 은 염색[Blum et al., ElectropHoresis (1987) 8:83-99]에 의해 검출하였다. 겔을 신중하게 시험한 결과, 약 57kD를 포함하여 단지 소수의 폴리펩티드가 나타나며, 이것의 다양한 분획에서의 염색 정도는 그들 분획에서 검출된 왁스 합성효소 활성의 양과 상관될 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 방사성 표지된 [1-¹⁴C]팔미토일-CoA를 SDS PAGE 분석 전에 단백질 제조물에 첨가하는 경우, 겔의 자동방사선 사진은 57kD 표지화 밴드가 이들 분획 중의 왁스 합성효소 활성을 갖는 것으로 나타났다. 공동계류중인 미합중국 특허 출원 제 07/767,251호에 기재된 56 및 54kD 환원효소 단백질을 포함하는 다른 단백질이 또한 제조물에 존재하였다.

E. 연속 상 용리

왁스 합성효소 단백질을 제조업자의 지시에 따라 SDS-PAGE 장치, 모델 491 Prep 셀(Bio-Rad Laboratories, , Inc., Richmond, CA)을 사용한 아미노산 서열화를 위해 분리시켰다. 블루 A 칼럼의 1.5M NaCl 용리로부터 얻어지는 왁스 합성효소 활성의 일부(15㎖)를 센트리콘 30(Cenlricon 30)(Amicon Division, W.R. Grace ＆ Co. ; Beverly, MA)에서 10배로 농축시키고, 파마시아 PD-10 탈염 칼럼 상에서 칼럼 완층액으로 탈염시켰다. 샘플을 2% SDS 및 소량의 브로모페놀 블루 추적 염료로 처리하고, Prep 셀 장치에서 20㎖의 12% 아크릴아미드 작동 겔 상에 5㎖의 4% 아크릴아미드 스택킹 겔 상에 로딩시켰다. 샘플을 l0W에서 전기영동시키고, 단백질을 겔로 부터 용리됨에 따라 Prep 셀에 의해 연속적으로 수집하였다. 용리된 단백질을 분별 수집기에 의해 7.5-l0㎖ 분획으로 수집하였다. 관심있는 영역 중의에 있는 각각의 분획 1㎖(왁스 합성효소 단백질의 평가된 57kD 크기를 기초로 함)을 센트리콘 30에서 40㎕로 농축시키고, 2% SDS로 처리하였다. 샘플을 12% 아크릴아미드 미니-겔(Novex) 상에서 작동시키고, 은으로 염색하였다. 왁스 합성 효소 회수를 최적화시키기 위하여 연속 상 용리 과정을 다양하게 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 그러한 변형으로는, 겔의 겔부피 중의 아크릴아미드 백분율의 조정, 및 겔에 적용되는 왁스 합성효소의 양에 대한 조정이 있다. 예를 들어, 더 점은 양의 왁스 합성효소 단백질을 분리하기 위해, 블루 A 컬럼 분획을 더 큰 부피인 20-55㎖의 아크릴아미드 겔에, 겔 20㎖당 단백질 1mg의 농도로 적용할 수 있다. 이러한 겔로부터 용리된 단백질 분획은 증가된 밴드 분리를 위해 10-15% 구배 아크릴아미드 겔에 적용될 수 있다.

각각의 분획의 단백질 함량을 육안으로 평가하고, 왁스 합성효소 단백질을 함유하는 분획을 푸울링시키고, 아미노산 서열화를 위해 농축시켰다. 수집된 왁스 합성 효소의 양을 최대화시키기 위해, 56kD의 환원효소 단백질을 또한 함유하는 분획을 푸울링된 제조물에 포함시켰다. 환원효소 단백질의 서열은 공지되어 있기 때문에(제1도 참조), 푸울링된 제조물 중의 왁스 합성효소 단백질에 추가의 정제는 아미노산 서열화 기술을 적용하기 전에는 필요하지 않다 (실시예 5 참조).

G. 막에 대한 단백질의 블롯팅

대안적으로, 왁스 합성효소 단백질은 SDS PAGE 후에 임모빌론-P(ImmDbilon-P)(Millipore ; Bedford, MA) 또는 프로블롯트(ProBlott)(Applied Biosystems ; Foster City, CA)중 어느 하나의 PVDF 막에 전달시킴으로써 아미노산 서열화를 위해 분리할 수 있다. 니트로셀를로오스에 대한 전달이 유용할 수도 있지만, 초기의 연구는 상기 단백질의 소수성으로 인해 니트로셀룰로오스 막에 전달이 잘 되지않음을 제시하였다. 프로블롯트 및 임모빌론-P와 같은 PVDF 막은 사용려는 아미노산 서열화 기술에 따라, 상이한 방법에서 우선적으로 사용된다. 예를 들어, 프로블롯트로의 전달은 N-말단 서열화 방법에 유용하고, 시아노겐 브롬화물 절단으로부터 펩티드를 생성시키기 위해서는 임모빌론-P가 바람직하다.

1. 니트로셀룰로오스에 대한 블롯팅 : 단백질이 니트로셀룰로오스에 전기블롯팅되는 경우에, 블롯팅 시간은 5-20% 메탄올 중의 25mM Tris, 192mM 글리신과 같은 완충액 중에서 1 내지 5시간이다. 전기블롯팅 후에, 막을 1%(v/v) 아세트산 중의 0.1%(w/v) 폰소우(Ponceau) S로 2분 동안 염색하고, 2 내지 3회 교체한 0.1% (v/v) 아세트산 중에서 탈색시키며, 이때 각각의 교체에는 2분이 소요된다. 그다음, 이들 막을 열밀봉된 플라스틱 백에 -20℃에서 습윤 상태로 보관하였다. 시간이 허락된다면, 블롯을 냉동시키지 않고, 하기 설명되는 바와 같이 아미노산 서열의 측정을 위한 펩티드를 생성시키기 위해 절단에 즉시 사용한다.

2. PVDF에 대한 블롯팅 : 단백질이 임모빌론 P PVDF에 전기블롯팅 되는 경우에, 블롯팅 시간은 20%(v/v) 메탄올 중의 25mM Tris/192mM 글리신과 같은 완충액 중에서 일반적으로 약 1 내지 2시간이다. PVDF에 대한 전기블롯팅 후에, 막을 50%(v/v) 메탄올/10%(v/v) 아세트산 중의 0.1%(w/v) 쿠마씨(Coomassie) 블루 중에서 5분 동안 염색하고, 2 내지 3회 교체한 50%(v/v) 메탄올/10%(v/v) 아세트산 중에서 탈색시키며, 이때 각각의 교체에 대해 2분이 소요된다. 그다음, PVDF 막을 30분 동안 공기 건조시킨 후, 열 밀봉 플라스틱 백에 -20℃에서 건조 상태로 보관하였다. 프로블롯과 같은 PVDF 막에 블롯팅된 단백질은 온전한 단백질의 N-말단 서열을 측정하기 위해 직접 사용할 수 있다. 프로블롯에 대해 단백질을 전기블롯팅하기 위한 프로토콜은 하기 실시예 5A에서 설명된다.

[실시예 5]

[아미노산 서열의 측정]

본 실시예에서는, 왁스 합성효소 활성과 관련된 식물 단백질의 아미노산 서열을 측정하기 위한 방법이 기술된다.

A. 단백질의 브롬화 시아노겐 절단 및 펩티드의 분리

브롬화 시아노겐 절단을 프로메가 인코포레이티드(Promega, InC., Madison, Wl, U.S.A.)로부터의 프로브-디자인 펩티드 분리 시스템 기술 매뉴얼(Probe-Design Pelide Separation System Technical Manual)에 기재된 방법을 사용하여 관심있는 단백질을 대상으로 수행하였다. 정제된 액체 샘플에서 이용할 수 없는 경우에는, 왁스 합성효소 단백질을 상술한 바와 같은 PVDF 막에 블롯팅시켰다. PVDF블롯으로부터의 정제된 왁스 합성효소 단백질 또는 왁스 합성효소 밴드를 70%(v/v) 포름산 중의 브롬화 시아노겐의 용액에 넣고, 실온에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 후에, 브롬화 시아노겐 용액을 제거하고, 푸울링시키고, 연속 질소 기류하에 리액티-뱁(Reacti-Vap) 증발기(Pierce, Reckford, IL)를 사용하여 건조시켰다. PVDF로부터의 브롬화 시아노겐 펩티드의 추가의 용리를 70%(v/v) 이소프로판올, 0.2%(v/v) 트리플루오로아세트산, 0.1mM 리신 및 0.1mM 티오글리콜산과 같은 펩티드 용리 용매를 사용하여 수행하여 완전한 제거를 보장하였다. 그다음, 용리 용매를 제거하고 건조된 브롬화 시아노겐 용액을 함유하는 튜브에 첨가하고, 상술한 바와 같이 건조시켰다. 새로운 용리 용매를 사용하여 용리 과정을 반복할 수 있다. 다음에, HPLC 등급의 물 50㎕를 건조된 펩티드에 첨가하고, 물을 스피드-바크(Speed-Vac)(Savant, Inc., Farmingdale, NY)에서의 증발에 의해 물을 제거하였다.

브롬화 시아노겐 절단에 의해 생성된 펩티드를 셰거(Schaegger) 및 폰 야코브(von Jagow)의 문헌[Anal, Biochem. (1987) 166:368-379]에 기술된 것과 유사한 Tris/트리신 SDS-PAGE 시스템을 사용하여 분리하였다. 겔을 125-150 볼트의 일정한 전압에서 약 1시간 동안 작동시키거나, 추적용 염료가 겔의 바닥 가장자리 밖으로 이동하기 시작할 때까지 작동시켰다. 겔을 전달 완충액(125mM Tris, 50mM 글리신, 10%(v/v) 메탄올) 중에 15 내지 30분동안 담근 후에 전달시킨다. 겔을 2시간동안 50볼트의 일정한 전압에서 프로블롯트 서열화 막(applied Biosystems, Foster City, CA)에 블롯팅시켰다. 막을 쿠마씨 블루(50%(v/v) 메탄올/l0%(v/v) 아세트산 중의 0.1%)로 염색시키고, 57%(v/v) 메탄올/10%(v/v) 아세트산 중에서 3×2분 동안 탈색시켰다. 막을 30 내지 45분 동안 공기 건조시킨 후에, -20℃에서 건조상태로 보관하였다.

프로블롯트에 블롯팅된 펩티드는 폴리브렌이 코팅된 유리 섬유 필터를 첨가하지 않고도 단백질 서열화기의 서열화 카트리지에 직접 로딩될 수 있다. 펩티드는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제공하는 약간 변형된 반응 사이클, BLOT-1을 사용하여 서열화시켰다. 또한, 용액 S3(염화 부틸)을 S1 및 S2(n-헵탄 및 에틸 아세테이트)의 50:50혼합물로 교체하였다. 프로블롯트에 블롯팅된 샘플을 서열화할 때는 언제나 이들 2가지 변형을 사용한다.

B. 프로테아제 절단 및 펩티드의 분리

액체 용액 중에 제공된 정제된 왁스 합성효소 단백질 또는 니트로셀룰로오스에 블롯팅된 왁스 합성효소 단백질을 프로테아제로 절단시켜서 서열화를 위한 펩티드를 수득하였다. 사용된 방법은 문헌[Aebersold, et at., PNAS (1987) 84:6970]의 방법이다.

니트로셀룰로오스 상에 제공된 단백질에 대해서는, 왁스 합성효소 단백질의 밴드, 및 또한 대조표준으로서 사용하려는 등량의 블랭크 니트로셀룰로오스를 니트로셀룰로오스 막으로부터 절단시키고, HPLC 등급의 물로 수회 세척하여 폰소우 S를 제거하였다. 이러한 세척 후에, 0.5% 아세트산 중의 0.5% 폴리비닐피롤리돈(PVP-40, Aldrich, milwaukee, WI) 0.1㎖를 막 조각에 첨가하고, 이 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. PVP-40을 완전히 제거하기 위해, 니트로셀룰로오스 조각을 수배 부피의 HPLC 등급의 물(8×5㎖)로 세척하여, 세척물의 흡수도를 분광기 상에서 214nm에서 체크하였다. 또한, 밴드가 PVP-40 처리 및 세척 후까지 작은 조각으로 절단되지 않는 경우에는 PVP-40을 보다 쉽게 제거할 수 있다.

용액 중의 단백질 또는 니트로셀룰로오스 조각 상의 단백질을 적절한 절단 완충액, 예를 들어 트립신 절단 완충액, 즉 pH 8.2의 100mM 중탄산나트륨, 또는 엔도 프로테이나제 GluC 완충액, 즉 pH 7.8의 25mM 탄산 암모늄/1mM EDTA에 현탁시켰다. 상기 절단 혼합물에 아세토니트릴을 5-10%(v/v) 농도로 첨가하였다. 프로테아제를 절단 완충액 중에서 희석시키고, 전달 혼합물에 전형적으로 1:10(w/w) 프로테아제 대 단백질의 비율로 첨가하였다. 절단물을 18-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 예를 들어, 트릴신 절단물은 37℃에서 인큐베이션시키고, 엔도프로테이나제 gluC 절단물은 실온에서 인큐베이션시켰다. 유사하게는, IysC 및 AspN을 포함하는 다른 프로테아제도 왁스 합성효소 단백질을 절단시키기 위해 사용될 수 있다. 개개의 절단 완충 조건은 상이할 수 있지만, 절단, 펩티드 분리, 정제 및 서열화를 위한 프로토콜을 실질적으로 트립신과 gluC로 절단시키기 위해 기술된 것과 동일하다.

밤새 인큐베이션시킨 후, 절단 반응을 10㎕의 10%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 1㎕의 100% TFA를 첨가하여 중단시켰다. 단백질이 니트로셀룰로오스 상에 제공되면, 니트로셀룰로오스 조각을 5-10% 아세토니트릴을 함유하는 절단 완충액 100㎕ 부피로 1 내지 5회 세척하며, 이들 부피를 Speed-Vac에서 100㎕ 미만의 부피로 농축시켰다.

절단으로부터 얻어지는 펩티드를 어플라이드 바이오시스템즈(Foster City, CA) 모델 130 고성능 액체 크로마토그래프(HPLG)에 설치된 Vydac 역상 Cl8 칼럼(2.1mm×100mm)에서 분리켰다. 펩티드를 용리시키기 위해 사용되는 이동상은 다음과 같다 : 완충액 A : 0.1mM 인산 나트륨, pH 2.2 ; 완충액 B : 0.1mM 인산나트륨 중의 70% 아세토니트릴, pH 2.2. 2시간에 걸친 10-55% 완충액 B, 5분에 걸친 55-75% 완충액 B 및 15분에 걸친 75% 완충액 B 이소크라틱의 3-단계 구배를 50㎕/분의 유속으로 사용하였다. 펩티드를 214nm에서 검출하였으며, 수동으로 수집한 후에 -20℃에서 보관하였다.

왁스 합성효소 단백질의 소수성으로 인하여, 효소 절단 완충액 중에 계면활성제를 첨가하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 호호바 왁스 합성 효소를 함유하는 상술된 연속상 용리 과정으로부터 얻어지는 분획을 100mM NaHCO₃/1.0% CHAPS 중의 센트리콘 30 중에서 최종 부피가 110㎕가 될 때까지 농축시켰다. 5㎕의 100mM Na HCO₃/1.0% CHAPS 중의 2㎕의 트립신을 단백질 용액에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후에, 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 절단을 중단시켰다. 샘플을 가볍게 원심분리시키고, 펩티드를 Vydac Cl8 칼럼에서 분리시키고, 상술한 바와 같이 용리시켰다. 이 과정에서, CHAPS는 약 40-53% 완충액 B에서 용리시켰으며, 이 영역에서 펩티드 피크가 불명료하였다.

과량의 단백질이 사용되었거나 불순물(예를 들어 호호바 환원효소 단백질)이 존재하는 경우와 같이, 1차 분리로 복합 펩티드 패턴이 나타나면, 펩티드 피크는 동일 칼럼을 사용하지만, 상이한 구배 시스템을 사용하여 추가로 크로마토그래프괼 수 있다. 상기 호호바 왁스 합성효소 제조물에 대해, 친수성 피크를 60분 동안의 0-40% 완충액 B, 35분 동안의 40-75% B 및 10분 동안의 75-100% B의 구배를 사용하여 분리시켰다. 소수성 피크는 40분 동안의 0-40% 완충액 B, 60분 동안의 40-80% B 및 10분 동안의 80-100% 완충액 B의 구배를 사용하여 분리시켰다. 이들 분리에 대해, 완충액 A는 0.1% TFA이고 완충액 B는 아세토니트릴중의 0.1% TFA이다.

C. 단백질 및 펩티드의 N-말단 서열화

모든 서열화를 어플라이드 바이오시스템즈 477A 펄스-액상 단백질 서열화기에서 에드만(Edman) 분해에 의해 수행하였으며; 서열화기에 의해 생성된 페닐티오히단토인(PTH) 아미노산은 온라인 어플라이드 바이오시스템즈 120A PTH 분석기에 의해 분석하였다. 데이타를 모으고, 애플 매킨토쉬(Apple Macintosh)에 대한 어플라이드 바이오시스템즈 모델 610A 데이타 분석 시스템을 사용하여 저장하고, 또한 피이 넬슨, 인코포레이티드(PE NELSON, Inc., Cupertino, CA)로부터의 ACCESS*CHROM 소프트웨어를 사용하여 디지탈 마이크로박스에 저장하였다. 서열 데이타를 PTH 분석기로부터 입력을 수신한 차트 기록기로부터 판독하며, 모델 610A 소프트웨어로부터 얻어진 정량 데이타를 사용하여 확인하였다. 모든 서열 데이타를 데이타 분석 시스템을 사용하여 2명의 작업자가 독립적으로 판독하였다.

HPLC의 피크 오프로서 얻어진 펩티드 샘플에 대해, 샘플을 서열화기에서 3회의 예비 주기를 거친 폴리브렌으로 코팅 유리 섬유 필터(Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에 로딩시켰다. 환원되고 알킬화된 펩티드에 대해, 각각의 서열화기 사이클로부터의 PTH-아미노산 생성 물질의 일부를 액체 섬광 계수기에서 계수하였다. 임모빌론-P에 전기블롯팅된 단백질 샘플에 대해, 관심있는 밴드를 절단한 후, 상술한 바와 같이 예비 순환된 폴리브렌 코팅 유리 섬유 필터 위에 놓고, 반응 카트리지를 제조업자의 지시에 따라 조립 하였다. 프로블롯트에 전기블롯팅된 단백질 샘플에 대해서는, 유리 섬유 필터가 필요하지 않다.

소량의 샘플(5-30 mol)로부터 단백질 서열을 얻기 위해서 템프스트(Tempst) 및 리비어(Riviere)의 문헌[Anal. Biochem. (1989) 183:290]에 의해 기술된 바와 같이 477A전환 사이클 및 120A분석기를 사용하였다.

상술된 바와 같이 트립신 절단에 의해 얻어진 호호바 왁스 합성효소 펩티드의 아미노산 서열을 하기의 표 2에 나타내었다.

[표 2]

왁스 합성효소 펩티드의 아미노산 서열을 하나의 문자 코드를 사용하여 나타내었다.“X”는 아미노산 서열을 확인할 수 없었던 위치를 나타내며, 소문자로 표시된 아미노산은 확인되었지만 신뢰도가 떨어지는 잔기를 나타내는 것이다.

[실시예 6]

[추가의 왁스 합성효소의 정제]

다른 유기체로부터 왁스 합성효소의 부분 정제 제조물을 얻기 위한 호호바 왁스 합성 효소 용해 및 정제 방법의 적합성을 기술한다.

A. 아시네토박터

아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacler calcDaceticus) 세포주 BD413(ATCC #33305)의 세포를 ECLB(대장균 루리아 브로쓰) 상에서 성장시키고, 로그 성장 단계 동안에 수집하고, Hepes, pH 7.5, 0.1M NaCl, 1mM DTT 및 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액으로 세척하였다. 세척한 세포를 새로운 완충액 중에 재현탁시키고, 프렌치 압력 셀을 통해 통과(약 16,000 p.s.i에서 2회 통과시킴)시킴으로써 파괴한다. 파괴되지 않은 세포를 5000×g에서 10분 동안 원심분리시켜서 제거하고, 막을 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 막 펠릿을 저장 완충액(25mM Hepes, pH 7.5, 10%(w/v) 글리세롤) 중에서 균등화시켰다. 실시예 1B에서 호호바 효소에 대해 기술된 검정 조건을 사용하고, 기질로서 [1-¹⁴C]팔미토일-CoA 및 18:1 알코올을 사용하여, 이들 막에서 왁스 합성효소 활성을 검출하였다.

왁스 합성효소 활성을 실시예 4B에 기술된 바와 같이, 막을 0.5M NaCl 존재하에 2% CHAPS와 인큐베이션시킴으로써 용해시켰다. 활성의 용해는 200,000g에서 1시간 동안 원심 분리한 후에 상층액 분획 중의 왁스 합성효소 활성을 검출함으로써, 그리고 크기 배제 크로마토그리피에 의해 증명된다 (즉, 활성은 대칭 피크로서 보유된 분획에서 컬럼으로부터 용리된다). 용해된 효소의 활성은 약 0.3%(즉, CMC 이하)로 CHAPS 농도를 단순히 희석시킴으로써 검출하였다. 인지질 소포 내로의 효소의 혼입은 용해된 활성을 검출하는 데에는 필요하지 않다.

정제를 위해, 용해된 아시네토박터 왁스 합성효소 활성을 호호바 아실-CoA 환원효소에 대해 기술된 것과 유사하게 크로마토그래피 정제시켰다. 가용성 단백질 제조물을 낮은 염농도 조건(0.75% CHAPS, 10% 글리세롤, 25mM Hepes, pH 7.5를 함유하는 칼럼 완충액 중의 150mM NaCl)하에서 블루 A 아가로오스 칼럼 상에 로딩시키고, 칼럼 완충액 중의 1.0M NaCl을 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다.

슈퍼로스 12(Pharmacia, Piscataway, NJ) 배지 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 천연 효소의 크기를 측정하고, 추천된 폴리펩티드의 확인에 이용하였다. 동일 조건하에서 크로마토그래프된 분자 질량 표준과 비교하면, 전연 왁스 합성효소 활성이 약 45kD인 것으로 측정되었다. 왁스 합성효소 활성을 갖는, 외관상 분자 질량이 45kD, 58kD 및 64kD인 3개의 폴리펩티드 밴드가 확인되었다. 왁스 합성효소에 대한 가장 유력하게 추천된 45kD 폴리펩티드의 N-말단 서열을 XDIAIIGSGsAGLAQaxilkdag로서 측정하였으며, 여기에서 아미노산에 대해 하나의 문자 코드를 사용하였으며,“X”는 아미노산을 확인할 수 없었던 위치를 나타내고, 소문자로 표시된 아미노산은 확인되었지만 신뢰도가 낮은 잔기들을 나타내는 것이다.

B. 유글레나

유글레나 그라실리스 세포주 Z(ATCC No. 12716)를 암실에서 약 26℃에서 적당히 진탕시키면서 유기 영양적으로 성장시킨다 [참조 : Tani et al., (1987) Agric. Biol. Chem. 51:225-230]. 세포를 수집하여 25mM Bis-Tris-프로판, pH 7.0, 0.25M NaCl 및 1mM EDTA를 함유하는 완충액 중에서 세척하였다. 세척된 세포를 새로운 완충액 중에 재현탁시키고, 프렌치 압력 셀을 통해 통과시킴(약 16,000 p.s.i.에서 2회 통과시킴)으로써 파괴시켰다. 파괴되지 않은 세포, 세포 파편 및 핵을 20,000×g에서 20분 동안 원심분리 시킴으로써 제거하고, 마이크로솜 막을 20,000×g에서 1시간 동안 원심분리에 의해 수집하였다. 막 펠릿을 저장 완충액(25mM Bis-Tris-프로판, pH 7.0, 0.25M NaCl, 10%(w/v) 글리세롤 및 1mM EDTA) 중에서 균등화시켰다. 왁스 합성효소 활성을 호호바 효소에 대해 설명된 바와 같은 검정 조건을 사용하여 막 중에서 검출하였다. 방사성 표지된 기질은 호호바 실시예(즉, [1-¹⁴C]팔미토일-CoA)에 대한 것과 동일하지만, 알코올 수용체로서 18:1 보다는 16:0을 사용하고, pH 7.0에서의 Bis-Tris-프로판 완충액을 사용하였다.

유글레나 왁스 합성효소 활성은 막을 0.5M NaCl의 존재하에서 2% CHAPS와 인큐베이션함으로써 가용화시켰다. 단백질의 용해는 1시간 동안 200,000×g에서의 원심분리 후에 상층액 분획에서 효소 활성을 검출함으로써 증명되었다. 용해된 효소의 활성을은 CHAPS 농도를 약 0.3%(즉, CMC 미만)로 희석시킴으로써 검출하였다. 용해된 호호바 왁스 합성효소에 대한 경우와 같이 인지질 소포 내에 효소를 혼입시키는 것은 필요하지 않다.

부분 정제를 위해, 용해된 유글레나 왁스 합성효소 활성을 블루 A 아가로오스 배지 상에서 크로마토그래피 분리시켰다. 칼럼을 25mM Bis-Tris-프로판, pH 7.0, 20%(w/v) 글리세롤, 0.75% CHAPS 및 1mM EDTA를 함유하는 칼럼 완충액 중에서 0.1M NaCl로 평형화시켰다. 용해된 왁스 합성효소 활성을 함유하는 샘플을 0.1M NaCl이 될때가지 희석시키고, 1×7㎝ 컬럼(5.5㎖ 층부피)상에 로딩시켰다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척하고, 칼럼 완충액 중에서 선형 NaCl 구배(0.1M 내지 1.0M NaCl)가 되게 한다. 왁스 합성효소 활성을 염 구배의 마지막 반에서 넓은 피이크로서 용리시켰다.

칼럼 분획의 SDS-PAGE 분석으로, 칼럼으로부터 용리된 활성의 폴리펩티드 복합성은 로딩된 물질에 비해 상당히 감소되는 것으로 확인되었다. 약 41kD의 겉보기 분자 질량을 갖는 폴리펩티드는 칼럼 분획에서 왁스 형성 효소 활성을 갖는 것으로 것으로 관찰되었다. 호호바 및 아시네토박터에 대해 기술된 바와같은 추가의 정제 기술을 수행하여, 왁스 합성 효소 활성과 약 41kD 펩티드의 관련을 변화시켰다.

유글레나에서 왁스 합성 효소 활성의 추가의 분석을 위해, 크기 배제 크로마토그래피를 하기와 같이 수행하였다. 암실에서 유기 영양성 액체 배지(Tani et al., supra)상에서 성장시킨 유글레나 세포로부터 마이크로솜 막제조물을 수득하였다. 왁스 합성 효소 활성을 얼음 상에서 1시간 동안, 완충된 용액(25mM Bis-Tris, pH 7, 1mM EDTA 및 10%(w/v) 글리세롤) 중에서 2%(w/v) CHAPS 및 500mM NaCl로 막을 처리함으로써 용해시켰다. 희석 완충액의 첨가에 의해 CHAPS를 0.75%까지 회석시키고 NaCl을 200mM까지 희석시킨 후, 샘플을 약 200,000×g에서 1.5시간 동안 원심분리시켰다. 상층액 분획을 200mM NaCl을 또한 함유하는 칼럼 완충액(25mM Bis-Tris, pH 7.0, 1mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.75% CHAPS)으로 예비 평형시킨 블루 A 염료 칼럼 상에 로딩시켰다. 칼럼을 용리액의 A280이 사전 로딩 값으로 회복될 때까지 200mM NaCl을 함유하는 칼럼 완충액으로 세척시켰다. 칼럼에 결합된 왁스 합성 효소 활성을 컬럼 완충액 중의 NaCl 농도를 1.5M 까지 증가시킴으로써 방출시켰다. 1.5M NaCl에 의해 방출된 왁스 합성 효소 활성을 함유하는 블루 A 칼럼(약 20㎖ 조합 칼럼)으로부터의 분획을 푸울링시키고, 한외 여과(YM 30 막과 맞춘 아미콘 압력 셀)를 경유하여 약 30배 농축시켰다. 블루 A 칼럼으로부터의 농축된 물질을 수퍼로오스 12 배지 (Pharmacia) 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 경유한 분리를 위한 샘플로서 사용하였다.

약 200㎕의 샘플을 수퍼로오스 12 칼럼(HR 10/30) 상에 로딩시키고, 0.5M NaCl을 함유하는 칼럼 완충액으로 예비 평형시키고, 0.1㎖/분의 유속으로 전개시켰다. 매끄러운 피크로서 칼럼으로부터 확스 합성 효소 활성을 용리시켰다. 왁스 합성 효소 활성의 용리 부피를 분자 질량 표준 단백질의 용리 프로필과 비교하여, 효소의 겉보기 분자 질량이 166kD임을 평가하였다. 왁스 합성 효소 활성을 함유하는 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통한 후, 은 염색에 의해 분석하였다. 다양한 분획의 폴리펩티드 프로필의 일차 분석은 100kD 이상의 분자 질량을 갖는 어떠한 단백질도 나타내지 않았으며, 이것의 염색 정도는 활성 프로필을 매치시키는 것으로 보인다. 왁스 합성 효소 폴리펩티드는 은 염색 겔에서 쉽게 검출될 수 없는 샘플 혼합물 중의 소부분 성분으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 효소는 SDS-PAGE 동안 해리된 서브유닛으로 이루어질 수 있다.

[실시예 7]

[왁스 합성 효소 핵산 서열의 단리]

호호바 배 cDNA 라이브러리로부터 또는 게놈 DNA로부터의 왁스 합성효소 핵산의 단리가 설명된다.

A. 호호바 cDNA 라이브러리의 구성

골드버그(Goldberg) 등에 의해 변형된 방법(Developmental Biol. (1981) 83:201-217)과 같은, 초기에 잭슨(Jackson) 및 라르킨스(Larkins)에 의해 기술된 폴리리보솜 단리법(Plant Physiol. (1976) 57:5-10)을 사용하여 개화후 80 내지 90일에 수집한 호호바 배로부터 RNA를 단리시켰다. 상기 방법에서, 특별히 규정하지 않는 한은, 모든 단계는 4℃에서 수행하였다. 10g의 조직을, 조직이 미세 분말이 될때까지 워링(Waring) 배합기에서 액체 질소중에서 분쇄시켰다. 액체 질소를 증발시킨 후, 170㎖의 추출 완충액(200mM Tris (pH9.0), 160mM KCl, 25mM EGTA, 70mM MgCl₂, 1% 트리톤 X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 1mM 스페르미딘, 10mM β-메르캅토에탄올 및 500mM 슈크로오스)을 첨가하고, 조직을 약 2분 동안 균질화시켰다. 균질물을 무균 미라클로쓰를 통해 여과시키고, 12,000×g에서 20분 동안 원심분리시켰다. 상층액을 500㎖ 무균 플라스크 내로 따라내고, 1/19배의 20% 계면활성제 용액(20% Brij 35, 20% Tween 40, 20% Noidet p-40 w/v)을 실온에서 첨가하였다. 용액을 완만한 속도로 30분 동안 4℃에서 교반시키고, 상층액을 12,000×g에서 30분동안 원심분리시켰다.

약 30㎖의 상층액을 무균 Ti 60 원심 분리관 내로 분취해내고, 40mM Tris (pH 9.0),5mM EGTA, 200㎖ KCl, 30mM MgCl₂, 1.8M 슈크로오스 및 5mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 7㎖의 용액을 하층에 놓는다. 관을 추출 용매로 정상까지 채우고, Ti60 회전기에서 4℃에서 4시간 동안 60,00rpm으로 회전시켰다. 원심분리 후에, 상층액을 흡인시키고, 0.5㎖의 재현탁 완충액(40mM Tris (pH 9.0), 5mM EGTA, 200mM KCl, 30mM MgCl₂, 5mM β-메르캅토에탄올)을 각각의 관에 첨가하였다. 관을 10분 동안 얼음 위에 놓은 후, 펠릿을 골고루 재현탁시키고 푸울링시켰다. 그 다음, 상층액을 120×g에서 10분 동안 원심분리시켜서 불용성 물질을 분리해내었다. 20mM Tris (pH 7.6), 200mM EDTA 및 2% N-라우릴-사르코시네이트 중의 자체 절단된 1mg/㎖ 프로테이나제 K 1부피를 상층액에 첨가하고, 이 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.

RNA를 아세트산 나트륨 1/10 부피 및 에탄올 2 부피를 첨가하여 침전시켰다. -20℃에서 몇시간 후, RNA를 4℃에서 12,000×g로 30분 동안 원심분리하여 펠릿화시켰다. 펠릿을 TE 완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA) 10㎖ 중에 재현탁시키고, 동일한 부피의 트리스(pH 7.5)로 포화된 페놀로 추출하였다. 4℃에서 10,000×g로 20분 동안 원심분리하여 상을 분리하였다. 수성상을 제거하고, 유기상을 1부피의 TE 완충액으로 재추출시켰다. 수성상을 푸울링시키고, 1배의 클로로포름으로 추출하였다. 상을 다시 원심분리에 의해 분리하고, 상기 기술한 바와 같이 수성상을 에탄올로 침전시켜 폴리리보솜 RNA를 수득하였다.

폴리리보솜 RNA 제조물 중의 다당류의 불순물을 염농도가 높은 완충액(0.5M NaCl, 20mM Tris(pH7.5), 1mM EDTA, 0.1% SDS) 내의 셀룰로스 칼럼(Sigma-cell 50) 상에서 RNA를 작동시킴에 의해 제거하였다. 불순물은 칼럼에 결합하고 RNA가 용리액 중에 수집된다. 용리 분액을 푸울링시키고, RNA를 에탄올로 침전시켰다. 침전된 전체 RNA를 더 적은 부피로 재현탁시키고, 울리고 d(T) 셀룰로오스 칼럼에 적용하여 폴리아데닐화된 RNA를 분리하였다.

폴리아데닐화된 RNA를 사용하여 시판용 클로닝 벡터 블루스크라이브 Ml3-(Bluescribe M13-)[Stratagene Cloning Systems ; San Diego, CA)로부터 유도되고 하기와 같이 제조한 플리스미드 클로닝 벡터 PCGN1703에서 cDNA 라이브러리를 구성한다. 블루스크라이브 Ml3-의 폴리링커를 BamHl에 의한 절단, 녹두 엔도누클라아제에 의한 처리 및 블런트-단부 결찰에 의해 변경시켜 BamHl-결실 플라스미드, 즉 pcgn1700을 생성시켰다. pCGN1700을 EcoRl 및 Sstl(인접 제한 자리)에 의해 절단시키고, BamHl, Pstl, Xbal, Apal 및 Smal에 대한 제한 자리를 갖는 합성 링커, AATT의 5′오버행(overhang) 및 TCGA의 3′오버 행으로 어닐링시켰다. pCGN 1770내로 링커를 삽입시켜서 EcoRl 자리를 제거하고, 블루스크라이브에서 발견되는 Sstl(본원에서는“Sacl”라고도 표기함) 자리를 재생시키며, 링커 상에 포함된 새로운 제한 자리를 첨가하였다. 생성된 플라스미드 pCGN1702를 Hidlll에 의해 절단시키고 클레노우 효소에 위해 블런트-단부를 만들었으며; 선형 DNA를 부분적으로 pvull에 의해 절단시키고, 묽은 용액 중에서 T4 DNA 왁스 합성효소로 결찰시켰다. 결실된 lac 프로모터 영역을 갖는 형질 전환물을 선택하여(PCGN 1703), 플라스미드 클로닝 벡터로서 사용하였다.

간략하게, cDNA 합성에 대한 를로닝 방법은 다음과 같다. 플라스미드 클로닝 벡터를 Sstl로 절단시키고, 단독중합체 T-테일을 형성된 3′-오버행스틱키-단부 상에서 말단 데옥시누클레오티딜 전달효소를 사용하여 생성시켰다. T-테일 플라스미드를 올리고(dA)-셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 비절단 비말단 플라스미드로부터 분리시켰다. 생성된 벡터는 벡터 플라스미드의 양단부 중 어느 하나에 공유결합된 cDNA 제1가닥의 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. cDNA-mRNA-벡터 복합체를 데옥시구아노신 트리포스페이트의 존재하에서 말단 전달효소로 처리하여, G-테일을 형성시켰다. BamHl 자리에 인접한 엑스트라 cDNA-mRNA 복합체를 BamHl 절단에 의해 제거하여, 한 단부에서 BamHl 스틱키-단부를 갖고 나머지 단부에서 G-테일을 갖는 cDNA-mRNA-벡터 복합체를 생성시켰다. 이러한 복합체를 5′Bamhl 스틱키-단부, 제한 효소 Notl, EcoRl 및 Sstl에 대한 인식 서열 및 3′C-테일 단부를 가지는 어닐링된 합성 순환 링커를 사용하여 고리화시켰다. 결찰 및 회수 후에, 원형 복합체를 대장균 세포주 DH5α(BRL, Gaithersburg, MD)로 형질전환시켜서 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 호호바 배 cDNA 뱅크는 약 500개 염기쌍의 평균 DNA 삽입 크기를 갖는 약 1.5×10⁶개 클론을 함유하였다.

또한, 호호바 폴리아데닐화 RNA를 또한 클로닝 벡터 λZAP ll/EcoRl(Stratagene, San Diego, CA)에서 cDNA 라이브러리를 구성하는 데에 사용하였다. 라이브러리를 제조업자에 의해 공급되는 바와 같은 프로토콜, DNA 및 박테리아 세포주를 사용하여 구성하였다. 클론을 또한 제조업자에 따라 기가팩 팩킹 추출물(Gigapack Gold Packagin extracts)(Stratagene)에 사용하여 팩킹시켰다. 이러한 방식으로 구성된 cDNA 라이브러리는 약 400개 염기쌍의 평균 cDNA 삽입 크기를 갖는 약 1×10⁶개 클론을 함유한다.

B. 중합 효소 연쇄 반응

실시예 5에 기재된 바와 같이 얻어진 아미노산 서열 정보를 사용하여, 왁스 합성효소 단백질의 핵산 서열을 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수득하였다. 선택된 왁스 합성 효소 펩티드 단편의 아미노산 서열에 상응하는 합성 올리고누클레오티드를 합성하였다. 펩티드 중 하나가 N-말단으로 형성되거나 선택된 펩티드가 하나의 긴 펩티드 단편 상에 힘유되는 경우와 같이, 왁스 합성 효소 단백질 내의 단편의 순서가 공지된 경우, 단지 하나의 올리고누를레오티드 프라이머가 각각의 선택된 펩티드를 위해 필요하다. 더 많은 N-말단 펩티드에 대한 올리고누클레오티드 프라이머, 즉 진행방향 프라이머는 펩티드에 대한 코드화 서열을 함유한다. 더 많은 (-말단 펩티드에 대한 올리고누를레오티드 프라이머, 즉 역방향 프라이머는 선택된 펩티드에 대한 코드화 서열에 상보적이다. 대안적으로, 선택된 펩티드의 순서가 알려지지 않은 경우, 2개의 올리고누플레오티드가 각각의 펩티드에 대해 필요하며, 이중 하나는 선택된 아미노산 서열을 코드화하고, 나머지 하나는 선택된 아미노산 서열에 상보적이다. 보다 바람직한 펩티드가 메티오닌, 트릴토판 및 시스테인과 같은 최소한의 수의 코돈에 의해 코드화된 아미노산, 및 4개 이하의 코돈에 의해 코드화된 다른 아미노산을 함유하는 펩티드일 수도 있지만, 올리고누클레오티드의 구성을 위해 임의의 서열화된 왁스 합성효소 펩티드가 선택될 수 있다. 따라서, 올리고누클레오티드가 선택된 펩티드에 대한 모든 가능한 서열의 혼합물인 경우에, 퇴화된 올리고뉴클레오티드의 수는 낮을 수 있다.

당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 이들 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 PGR을 수행하였다. 역전사 cDNA, 상기 설명한 cDNA 라이브러리로부터 단리시킨 DNA 또는 게놈 DNA와 같은 호호바 핵산 서열을 상기 반응에서 템플레이트로서 사용하였다. 이러한 방식으로, 왁스 합성 효소 DNA의 단편을 생성시켰다. PCR 생성물을 겔 전기영동 기술에 의해 분석하여 원하는 왁스 합성효소 단편을 수득하는 반응을 선택하였다.

C. 왁스 합성효소 서열을 위한 스크리닝 라이브러리

PCR에 의해 얻어진 왁스 합성효소 DNA 단편을 표지 화시키고, 프로브로서 사용하여 상기 기술된 바와 같은 cDNA 라이브러리로부터 클론을 스크리닝하였다. DNA 라이브러리 스크리닝 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 매니아티스(Maniatis) 등의 문헌[Molecular Cloning A : Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 개시되어 있다. 이러한 방법으로, 핵산 서열에 대하여 분석할 수 있고 진핵 및 원핵 둘 모두의 다양한 숙주에서의 왁스 합성효소의 발현에 사용할 수 있는 왁스 합성효소 핵산 서열이 얻어졌다.

이 방법으로 약 1500개의 누플레오티드 cDNA 콜론이 얻어졌다. 표 2에 제공된 왁스 합성효소 펩티드 단편에 대한 비교로, SQ1129를 제외한 번역된 서열 중의 이들 펩티드 각각의 존재가 밝혀졌다. 호호바 배 RNA에 대한 노던 분석으로, 왁스 함성효소 mRNA의 길이가 2Kb임을 알 수 있었다. 5′RACE와 같은 추가의 PCR 기술[Frogman et al., Proc. Nac. Acad. Sci. (1988) 85:8998-9002]을 사용하여 추가의 왁스 합성효소 핵산 서열을 얻었다. 대안적으로, cDNA 라이브러리를 다시 스크리닝함으로써 또는 게놈 DNA로부터 추가의 서열을 얻을 수 있다. 호호바 왁스 합성효소 유전자의 DNA서열을 제2도에 도시하였다. pCGN1703중에 전체 왁스 합성효소 서열을 함유하는 플라스미드를 pCGN7614로 표시하였다.

D. 대장균에서의 왁스 합성효소의 발현

pCGN7614로부터의 왁스 합성효소 유전자를 하기와 같이 대장균 발현벡터 pDR540(Pharmacia)의 Tac 프로모터의 조절하에 두었다. pCGN7614 DNA를 벡터 Sall 자리에서 절단시키고, 말단을 DNA 중합효소 l과 누클레오티드 TTP 및 dCTP의 클레노우 단편을 사용하는 데에 있어서 부분적으로 충전하였다. BamHl으로 절단시키고 말단에서 dGTP와 dATP로 충전시켜서 pDR540 벡터를 제조하였다. pCGN7614로부터의 1.8kD 단편과 절단된 pDR540 벡터를 저융점 아가로스를 사용하여 겔 정제시키고 T4 DNA 리가아제를 사용하여 함께 결찰시켰다. 대장균 프로모터에 대해 센스 배향으로 왁스 합성효소를 함유하는 콜로니를 pCGN7620으로 표시하고, 안티센스 배향으로 왁스 합성효소 유전자를 함유하는 콜로니를 pCGN7621로 표시하였다. 왁스 합성효소 활성을 검정하기 위해, pCGN7620과 pCGN7621의 50㎖ 배양물을 액체 배양물에서 로그 상(log phase)으로 성장시키고, 2시간 동안 IPTG를 첨가하여 1mM의 농도를 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수득하고, 호호바 추출에 대해 기술된 바와 같이 왁스 합성효소 활성에 대하여 검정하였다. TLC 분석으로 pCGN7620으로부터의 세포 추출물이 왁스 에스테르의 합성을 지향하고, pCGN7621로부터의 대조군 추출물은 왁스 에스테르의 합성을 지향하지 않는다는 것을 알 수 있다.

[실시예 8]

[식물 발현용 왁스 합성효소 및 환원효소 구성물]

식물 세포에서의 왁스 합성효소 및 환원효소 서열의 발현을 제공하는 구성물을 다음과 같이 제조할 수 있었다.

A. 발현 카세트

종자 조직에서 우선적으로 발현된 유전자로부터 5′및 3′조절 영역을 함유하는 발현 카세트를, 예를 들어 WO92/03564호에 기술된 바와 같이 나핀, Bce4 및 AGP 유전자로 부터 제조할 수 있었다.

예를 들어, 나핀 발현카세트를 다음과 같이 제조하였다. 왁스 합성효소 또는 환원효소 유전자 구성물의 발현에 사용할 수 있는 나핀 발현 카세트, 즉 pCGN1808는 본원에 참고문헌으로 인용된 크리들(Kridl) 등의 문헌[Seed Science Research (1991) 1:209-219]에 기술되어 있다.

대안적으로, pCGN1808을 플랭킹 제한 자리를 함유하도록 변형시켜서, 발현 서열만을 이동시키고, pCGN1557과 같은 2원 벡터에 대한 항생 물질 저항성 마커는 이동시키지 않았다[McBride and Summerfelt]. Kpnl, Not | 및 Hind||| 제한 자리를 함유하는 합성 올리고누클레오티드를 어닐링시키고, Hind||| 자리만이 회수될 수 있도록 pCGN1808의 유일한 Hind||| 자리에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드, 즉 pCGN3200은 서열분석에 의해 확인한 바와 같이 나핀 3′-조절 서열의 3′-말단에서 유일한 Hind|||, Not | 및 Kpn| 제한 자리를 함유한다.

나핀 발현 카세트의 대부분을 pCGN3200으로부터 Hind||| 및 Sac|로 절단하고 Hind||| 및 Sac|로 절단한 pIC19R [Marsh, et at., (1984) Gene 32:481-485]에 결찰시켜 서브클로닝시켜서 pCGN3212를 제조하였다. 나핀 프로모터 영역의 극단 5′-서열을, pCGN을 템플레이트로 사용하고 Sac| 자리 및 나핀 5′-프로모터의 접합부에 플랭킹되는 2개의 프라이머 및 pCGN1808 구성물로부터의 pCGN3200의 pUC 골격을 사용하여 PGR에 의해 재구성하였다. 진행방향 프라이머는 Cla|, Hind|||, Nol| 및 Kpn| 제한부위와 나핀 5′-서열의 누클레오티드 408-423(EcoRV 자리로부터)을 함유하고, 역방향 프라이머는 5′-프로모터 중에 유일한 Sac|자리를 포함하는 나핀 서열 718-739에 대한 상보물을 함유한다. 제조업자의 지시에 따라 Perkin Elmer/Cetus 열순환장치를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 단편을 둔단 단편으로서 pUC8[Vieirc and Messing (1982) Gene 19 : 259-268) 내로 서브클로닝하고, Hinc||로 절단하여 pCGN3217을 수득하였다. 나핀 삽입물을 가로지르는 pCGN3217의 서열은 부적당한 누클레오티드가 PCR에 의해 도입되지 않음을 입증하였다. pCGN3217 내의 나핀 5-서열을 Cla| 및 Sac|로 절단시키고 Cla|및 Sa|로 절단한 pCGN3212에 결찰시켜서 나핀 발현 카세트의 나머지 부분에 결찰시켰다. 생성된 발현 카세트 pCGN3221을 Hind|||으로 절단하고, 나핀 발현 서열을 겔로 정제시키고, Hind|||으로 절단시킨 pIC20H(Marsh)에 결찰시켰다. 최종 발현 카세트는 pCGN3223이며, 이는 암피실린 저항성 백그라운드에서 본질적으로 pCGN1808에서 발견된 것과 동일한 1.725 나핀 5′및 1.265 3′조절 영역을 함유한다. 조절 영역을 Hind|||로 플랭킹시키고, Not| 및 Kpn| 제한 자리 및 유일한 Sal|, Bgl ||, Paf| 및 Xho| 클로닝 자리를 5′및 3′비코드화 영역 사이에 위치시켰다.

왁스 합성효소 유전자 서열을 이러한 카세트 내에 삽입시켜서 식물형질전환 방법용 발현 구조물을 제공하였다. 예를 들어, 이러한 구성물을 하기에 기술되는 바와 같이 아그로박테리움 중개 형질전환용 2원 벡터 내에 삽입시킬 수 있다.

B. 식물 형질전환용 왁스 합성효소 구성물

왁스 합성효소 유전자 플라스미드 pCGN7614를 Afl|||으로 절단시키고, 어댑터로 결찰시켜서 Bcl| 자리를 Afl||| 점착말단에 첨가한 다음, Saf|과 Bcl|로 절단하였다. 왁스 합성효소 유전자를 함유하는 단편을 겔로 정제시키고, Sal|/BamHI로 절단한 pCGN3223, 즉 나핀 발현 카세트 내로 클로닝시켰다. 나핀 발현 카세트 내에 센스 배향으로 왁스 합성효소 유전자를 함유하는 생성된 플라스미드를 pCGN7624로 표시하였다. pCGN7624로부터 단리시킨 DNA를 Asp718 (Kpn| isoschzimer)로 절단하고, 나핀/왁스 합성효소 융합 유전자를 Asp718로 절단시킨 2원 벡터 pCGN1578(McBrode and Summefelt) 내로 클로닝시켰다. pCGN7626으로 표시한 생성된 2원 벡터를 아그로박테리움 종 EHA101로 형질전환시키고, 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 평지씨 식물체의 형질전환에 사용하였다.

C. 식물의 형질전환용 환원효소 구성물

나핀 유전자로부터의 5′및 3′조절 영역을 이용하여 식물에서 환원효소의 발현용 구성물을 제조하였다.

pCGN7571로 표시되는 환원효소 cDNA(상기 기술된 바와 같은 pCGN1703 벡터 내)를 Sph|(염기 1594-1599의 3′미번역 서열 내의 자리)으로 절단하고, 이 자리에 Sal| 링커를 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 BamHl 과 Sal|으로 절단하고, 환원효소 cDNA를 함유하는 단편을 겔 정제시켜서 Bgl||/Xho|로 절단한 pCGN3223내로 클로닝시켜서 상기 기술한 나핀 카세트를 pCGN7585으로 생성시켰다.

나핀 5′/환원요소/나핀 3′구성물을 함유하는 pCGN7585 Hind||| 단편을, Hind|||로 절단된 pCGN1578(McBride and Summerfelt) 내로 클로닝시켜서, 식물 형질전환용 2원 벡터인 pCGN7586을 형성시켰다.

또한 나핀 프로모터의 발현하에 호호바 환원효소 유전자를 함유하는 식물 형질전환 구성물 pCGN7589를 다음과 같이 제조하였다. pCGN7571을 생체외에서 변이시켜서, Ndel 자리를 환원효소 코드화 서열의 제1ATG에 도입시키고, Ndel 자리의 바로 상류에 Bgl|| 자리를 도입시켰다. 환원효소 코드화 영역 하류의 Sph| 자리에 BamHl 링커를 도입시켰다. 1.5Kb Bgl||-BamHl 단편을 겔 정제시키고, Bgl||-BamHl으로 절단시킨 pCGN3686(하기 참조) 내로 클로닝시켜 pCGN7582를 형성시켰다.

pCGN3686은 Bluescript KS+(Stratagene Cloning Systems ; San Diego)로부터 유도되지만, 클로르암페니콜 저항성 유전자 및 변형된 링커 영역을 갖는 클로닝 벡터이다. 클로르암페니콜 저항성 유전자, 즉 pCGN65의 공급원은 PUC12-cm(K. Buckley Ph. D. Thesis, Regulation and expression of the phi Xl74 Iysis gene, University of Ca1ifornia, San Diego, 1985)를 기재로 하지만, pUC18 링커(Yanisch-Perron, et al., Gene (1985) 53:103-119)를 함유하는 클로닝 벡터이다. pCGN565를 Hhal로 절단하고, 클로르암페니콜 저항성 유전자를 함유하는 단편을 절제하고, 녹두 누클레아제를 사용하여 블런트화시키고, Bluescript KS-(Stratagene : La Jolla, CA)의 EcoRV 내로 삽입하여 pCGN2008을 생성시켰다. pCGN2008의 클로르암페니콜 저항성 유전자를 EcoRI/Hind||| 절단에 의해 제거하였다. 클레나우 효소로 처리하여 말단을 블런트화시킨 후에, 단편을 Dral로 절단한 Bluescript KS+에 결찰시켰다. 클로르암페니콜 저항성 대신에 암피실린 저항성을 함유하는 Dra| 단편을 갖는 콜론을 선택하고 pCGN2015로 명명하였다. pCGN2015의 링커 영역을 pCGN368을 제공하도록 변형시키며, 이것은 lacZ 링커 영역 내의 5′부터 3′에 다음과 같은 제한 절단 자리를 함유한다 : Pst|, Bgl||, Xho |, Hinc||, Sal|, Hind|||, EcoRV, EcoRl, Pst|, Smal, BamHl, Spel, Xbal 및 Sac |.

pCGN7582의 Xbal 자리에 Xhol 링커를 삽입하였다. 환원효소 유전자를 함유하는 Bgl ||-Xho | 단편을 단리시키고, Bgl ||-Xho|로 절단한 pCGN3223 내로 클로닝시켰다. 호호바 유전자로부터 5′미번역 리더 서열이 결여된 생성된 플라스미드를 pCGN7802 표시하였다. pCGN7802로부터의 나핀/환원효소 단편을 Hind |||로 절제하고, Hind |||로 절단한 pCGN1578 내로 클로닝시켜서 pCGN7589를 수득하였다.

pCGN7586 및 pCGN7589를 홀스터스(Holsters) 등의 방법[Mol. Gen. Genet. (1978) 163 : 181-187]에 의해 계통 EHA101[Hook et al., J. Bacteriol(1986) 168 : 181-187]의 세포와 같은 아그로박테리움 세포로 형질전환시키고, 하기에 기술되는 바와 같이 식물 형질전환에 사용하였다.

[실시예 9]

[식물 형질전환 방법]

관심있는 DNA 서열을 식물 숙주의 게놈에 삽입시켜서, 서열을 전사시키거나, 전사시키고 번역시켜서 페노타입을 변형시키는 다양한 방법이 개발되어 왔다.

[브라시카 형질전환]

레스톤(Reston) 품종 또는 브라시카 나푸스(Brassica napes)의 카놀라형 변종과 같은 에루스산 함량이 높은 종자를 95% 에탄올에 2분 동안 담그고, 한방을의 Tween 20을 함유하는 1.0% 아염소산나트륨 용액 중에서 45분동안 표면을 살균한 다음, 멸균 증류수 중에서 3회 세정하였다. 상기 종자들을 피리옥소딘(50㎍/ℓ), 니코틴산(50㎍/ℓ), 글리신(200㎍/ℓ) 및 0.6% 피타가(Phy tagar)(Gibco)가 보충된 pH5.8인 1/10 농도의 무라시게(Murashige) 최소 유기 배지(Gibco, Grand Island, NY를 갖는 마젠타(Magenta) 상자에 플레이팅시켰다. 종자들은 22℃에서 페르시발(Percival) 챔버 내에서, 냉형광 및 세기가 약 65μEm^-2S^-1(초당 평방미터 당 μ아인쉬타인)인 적광을 사용하여 16시간 광주기로 발아되었다.

배축을 파종 후 5 내지 7일경에 절제하고, 약 4mm 길이의 조각으로 절단하여, 공급 플레이트에 플레이팅시켰다[Horsch et al., Science (1985) 227 : 1229-1231). 공급 플레이트는 사용 전에, 약 30㎖ MS 염 염기(California Biological, Burlington, NC), 100㎎/ℓ의 이노시톨, 1.3㎎/ℓ의 트리아민-HCI, 3% 수크로오스를 갖는 200㎎의 KH₂PO₄, 2,4-D(1.0㎎/ℓ), 0.6%w/v 피타가를 함유하고, 오토클레이브 처리 전에 pH를 5.8로 조절한 (Ms/0/1/0 배지) 페트리 플레이트(100×25mm)에 1.0㎖의 담배 현탁 배양액을 플레이팅시켜서 제조하였다. 멸균 필터 페이퍼 디스크(Whatman, 3mm)를 사용전에 공급층의 최상부에 위치시켰다. 2,4-D(0.2㎎/ℓ), 키네틴(0.1㎎/ℓ)을 갖는 공급 플레이트에 대해 설명한 바와 같이 10㎎의 새로운 배양물을 100㎎의 새로운 MS 배지에 옮김으로써, 담배 현탁 배양물을 매주 2차 배양시켰다. 공급 세포를 사용하지 않은 실험에서는, 배축 외식편을 절단하여 MSO/1/10 배지의 최상부에 있는 필터 페이퍼 디스크 상에 위치시켰다. 배축 외식편 모두를 공급 플레이트상에서 22℃에서 24시간 동안 세기가 30μEm^-2S^-1내지 65μEm^-2S^-1인 연속광하에서 예비 인큐베이션시켰다.

원하는 유전자 구성물을 갖는 2원 플라스미드를 함유하는 A. 투메팍시엔스(A. tumefaciens) 계통 EHA101의 단일 콜로니를 5㎖의 MG/L 브로쓰에 옮기고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 배축 외식편물 1×108 박테리아/㎖로 희석된 박테리아를 갖는 7-12㎖ MG/L브로쓰 중에 담그고, 10 내지 25분 후에 공급 플레이트상에 위치시켰다. 리터당, MG/L 브로쓰는 5g의 만니톨, 1g의 L-글루탐산 또는 1.15g의 글루탐산나트륨, 0.25g의 KH₂PO₄, 0.10g의 NaCl, 0.10g의 MgSO₄·7H2O, 1㎎의 비오틴, 5g의 트립톤 및 2.5g의 효모 추출물이 함유하며, 브로쓰의 pH를 7.0으로 조절하였다. 아그로박테리움과 공동 인큐베이션시킨 지 48시간 후에, 배축 외식편을 여과 멸균시킨 카르베니실린(500㎎/ℓ, 오토클레이브 처리 후에 첨가)과 황산 카나마이신(Boehringer Mannhein ; Indianapolis, IN)을 25㎎/ℓ 농도로 함유하는 B50/1/0 유합 조직 유도 배지에 옮겼다.

65μEm^-2S^-1의 연속광으로 배양시킨 지 3 내지 7일 후, 유합 조직이 절단부 표면에서 관찰되었으며, 배축 외식편을 새싹 유도 배지 B5BZ(3㎎/ℓ의 벤질아미노푸린, 1㎎/ℓ의 제아틴, 1% 슈크로오스 및 0.6% 피타가를 보충하고 pH를 5.8로 조절한 B5 염 및 비타민)에 옮겼다. 상기 배지는 또한 카르베니실린(500㎎/ℓ) 및 황산 카나마이신(25㎎/ℓ)을 함유한다. 배축 외식편을 2주마다 새로운 새싹 유도 배지상에서 2차 배양시켰다.

새싹은 1 내지 3개월 후에 배축 유합 조직으로부터 재생된다. 길이가 1㎝ 이상인 녹색 새싹을 유합 조직으로부터 절제해내고, B5 염 및 비타민류, 1% 슈크로오스, 카르베니실린(300㎎/ℓ), 황산 카나마이신(50㎎/ℓ) 및 0.6%w/v 피타가를 함유하는 배지 상에 위치시켰다. 2 내지 4주 후, 녹색을 유지하는 새싹을 기부부터 잘라내고, 뿌리 유도 배지(B5 염 및 비타민류, 1% 슈크로오스, 2㎎/ℓ의 인돌부티르산, 50㎎/ℓ의 황산 카나마이신 및 0.6% 피타가)를 함유하는 마젠타 상자에 옮겼다. 녹색 뿌리가 형성된 새싹을 티오에스테라제 활성에 대하여 시험하였다.

[아라비돕시스 형질전환]

발베르겐스(Valverkens) 등의 문헌[Prec. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540]에 기술된 바와 같이 아그로박테리움 중개 형질전환에 의해 유전자 교환된 아라비돕시스 탈리아나 식물을 생성시킬 수 있다. 구성물을 홀스터 등의 방법(Mel. Gen. Genet. (1978) 163 : 181-187)에 의해, 계통 EHA 101과 같은 아그로박테리움 세포로 형질전환시켰다.

[낙화생 형질전환]

관심있는 DNA 서열을 하나 이상의 프로모터 영역, 관심있는 유전자 및 말단 영역을 포함하는 발현 카세트로서 입자 충격법을 거쳐 식물 게놈 내에 도입시켰다.

간략하게, 크기가 0.5mM 내지 3mM인 텅스텐 또는 금 입자를 발현 카세트의 DNA로 코팅시켰다. 이 DNA는 수성 혼합물 또는 건조 DN신입자 침전물의 형태일 수 있다.

충격용 표적으로 사용된 조직은 자열 외식체, 새싹 분열 조직, 미성숙 잎사귀 또는 꽃밥으로부터 유도된 것일 수 있다. DNA 코팅 입자를 조직의 충격 작업은 바이오리스틱스(Biolistics) 입자 총(Dupont ; Wilmington, DE)을 사용하여 수행하였다. 입자들을 배럴 입구로부터 l㎝ 내지 14㎝ 범위의 변동 거리에서 배럴 중에 위치시켰다. 충격을 가할 조직을 마개 플레이트 바로밑에 놓고, 20㎝ 까지의 거리에 있는 조직에 대하여 시험을 수행하였다. 방출되는 순간에, 조직을 나일론 그물, 또는 10mM 내지 300mM 메쉬 범위의 나일론 그물들의 조합물로 보호하였다.

발사 후에, 식물을 아트레야(Atreya) 등의 방법(Plant Science Letters(1984) 34:379-383)에 따라 재생시킬 수 있다. 간략하게, 배축 조직 또는 자엽 단편을 MS 배지[Murashige and Skoog, Physio. Plant. (1962) 15:15:473](자엽 단편용, MS+2.0㎎/ℓ 6-벤질아데닌(BA)) 상에 놓고, 암실에서 25±2℃로 1주일 동안 인큐베이션시킨 다음, 후속적으로 백색 냉형광(6.0W/m²)에 전달하였다. 배양 10일 째에, 식물을 멸균 토양을 함유하는 화분에 옮기고 3 내지 5일 동안 그늘에서 유지시킨 다음, 최종적으로 온실에 옳겼다. 유전자의 변화가 일어났다고 추정되는 새싹들은 뿌리를 내리고 있었다. 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 외부 DNA가 식물 게놈에 혼입되었음을 확인하였다.

[실시예 10]

[왁스의 제조를 위한 형질전환된 식물의 분석]

형질전환된 식물로부터의 종자 또는 다른 식물 물질을 실시예 1에 기술된 왁스 합성효소 검정방법을 이용하여 왁스 합성효소 활성에 대해 분석하였다.

환원효소와 왁스 합성효소 구성물을 둘 모두 갖는 식물을 도한 검정하여 왁스 제조를 측정하였다. 이러한 식물을 상기 기술한 바와 같이 아그로박테리움 형질전환 방법에 의해 제조할 수 있다. 원하는 유전자 구성물을 모두 갖는 식물을 환원 효소와 왁스 합성효소 구성물에 의한 공동 형질전환에 의해, 또는 단일 식물 형질전환 2원 벡터 상에서 왁스 합성효소와 환원효소 구성물을 조합시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 왁스 합성효소 발현 식물 또는 환원효소 발현 식물 중 어느 하나를 다른 원하는 유전자 서열을 코드화하는 구성물에 의해 다시 형질전환시켜서, 이러한 환원효소 및 왁스 합성 효소 발현 식물을 제공할 수도 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법에 의해서 제조된 환원효소를 발현시키는 유전자 교환 식물을 유사한 방법으로 제조된 왁스 합성효소 발현 식물과 교배시킬 수도 있다. 이러한 방식으로, 식물을 발육시키는 공지의 방법을 사용하여, 환원효소 및 왁스 합성 효소 발현 식물을 제공하였다.

이러한 식물은 예를 들어 타니(Tani) 등이 설명한 바와 같이 왁스 에스테르로부터 TAG를 분리시킴으로써, 왁스 에스테르의 존재에 대해 검정할 수 있다. GC 분석 방법을 사용하여, 예를 들어 피나(Pina) 등의 문헌[Lipids(1987) 22 (5) 358-361에 기술된 바와 같이, 생성된 왁스를 추가로 분석할 수도 있다.

상기 결과는 지방 알코올과 지방 아실 기질로부터 왁스 에스테르를 생성시키는 데에 활성인 부분적으로 정제된 왁스 합성효소 단백질물 얻을 수 있는 능력을 입증하였다. 왁스 합성효소 단백질 및 이들의 아미노산 서열을 얻는 방법이 제공되었다. 또한, 아미노산 서열로부터 얻어진 왁스 합성효소 핵산 서열도 제공되었다. 이들 핵산 서열을 조작하여, 숙주 세포에서 서열의 전사 및/또는 왁스 합성효소 단백질의 발현을 제공할 수 있으며, 이들 단백질은 다양한 용도로 사용할 수 있다. 이러한 용도는 지방 알코올 기질의 공급원을 갖는 숙주 세포에서 왁스 합성효소를 사용할 경우에 왁스 에스테르 화합물의 생성을 포함하며, 이들 기질은 숙주 세포 본래의 기질이거나, 지방아실 기질로부터 알코올을 생성에 활성인 지방 아실 환원효소 단백질을 코드화하는 재조합 구성물의 사용에 의해 공급될 수도 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허 출원은, 이들 공보 및 특허 출원이 본원에 참고문헌으로 인용되는 것으로 특정하게 그리고 개별적으로 제시된 경우와 같이 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

지금까지 본 발명은 명료함 및 이해를 위한 예시 및 실시예에 의해 어느정도 상세히 설명되었지만, 당업자들은 본 발명의 교시에 의해서, 첨부된 특허청구의 범위에 기재된 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 어떤 변화와 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 인식할 수 있을 것이다.

Claims

제2도에 도시된 cDNA 서열.
제1항의 서열과 이러한 서열을 식물 세포에서 전사시키는 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
제2항에 있어서, 식물 세포가 식물 종자 배 세포임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항의 서열과 이러한 서열을 박테리아 세포에서 전사시키는 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
제2항에 있어서, 프로모터가 식물 종자 배 세포에서 우선적으로 발현되는 유전자로부터 얻어짐을 특징으로 하는 발현 벡터.
제4항에 따른 발현 벡터를 포함하는 박테리아 세포.
제2항에 따른 발현 벡터를 포함하는 식물 세포.