CN1378602A - 含修饰的多不饱和脂肪酸的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的核酸序列,其中所述的核酸序列是植物去饱和酶编码序列的基因组序列。本发明还提供了去饱和酶基因组序列的启动子和内含子序列。本发明进一步提供了使用多核苷酸序列的重组DNA构建体,以及在宿主植物细胞内改变脂肪酸成分的方法。

Description

含修饰的多不饱和脂肪酸的植物
引言
本申请要求于1999年8月26日申请的美国临时申请系列号为60/151,224和于1999年12月17日申请的美国临时申请系列号为60/172,128的优先权。
技术领域
本发明涉及核酸序列和构建体，以及与之相关的方法。
背景技术
植物油有多种用途。我们需要新的植物油成分和/或改善从生物合成或自然植物途径获得植物油成分的方法。根据油的目的用途，需要多种不同的脂肪酸成分。
一种假定的获得这些油类和/或改变脂肪酸成分的方法是通过植物基因工程的方法。然而，有必要识别能产生预期表型结果的合适的核酸序列以及能介导这些序列正确应用的调节区域等等。
高等植物似乎通过通常的代谢通路(脂肪酸合成通路)合成脂肪酸。在发育的种子中，脂肪酸连接到甘油主链上，形成甘油三酯，储存作为进一步萌芽的能量来源，这时的FAS通路位于原质体。最关键的步骤是通过乙酰-辅酶A：ACP转酰基酶(ATA)催化乙酰-辅酶A和ACP形成乙酰-ACP(酰基载体蛋白)。将乙酰-ACP延长至16和18个碳原子脂肪酸包括以下反应系列的循环反应：用二碳单位将丙二酰-ACP缩合形成β-酮脂酰ACP(β-酮脂酰ACP合酶)，缩酮形成乙醇(β-酮脂酰-ACP合酶)，脱氢形成烯酰-ACP(β羟酰-ACP脱氢酶)，最后将烯酰-ACP还原成延长的饱和酰基ACP(烯酰-ACP还原酶)。β-酮脂酰ACP合酶I催化延长成棕榈酰-ACP(C16：0)，而β-酮脂酰ACP合酶II催化最终延长成硬脂酰ACP(C18：0)。在储藏甘油三酯中常见的植物不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸和亚麻酸，来源于硬脂酰-ACP在由可溶性质粒Δ-9去饱和酶(也叫“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化的反应中发生去饱和作用形成油酰基-ACP(C18：1)。在去饱和过程中需要分子氧的参与，其中还原型铁氧化还原蛋白作为电子的共供体。另外的去饱和作用继续被膜结合性的Δ-12去饱和酶和Δ-15去饱和酶作用影响。因此，这些“去饱和酶”分别产生了单-或多不饱和脂肪酸。
获得能产生表型结果的核酸序列—该表型可以经脂肪酸合成(FAS)、脂肪酸去饱和作用和/或将脂肪酸整合入甘油主链以产生一种油—须遭受多种障碍包括但不局限于，识别需要的代谢因子、用合适的动力特征选择和鉴定酶的来源、将需要的蛋白纯化至可以使氨基酸测序的水平、利用氨基酸序列数据获得能用作探针提取需要的DNA序列的核酸序列、以及构建体的制备、转化和所获植物的分析。
因此，需要另加的靶核酸和修饰脂肪酸成分的方法。特别是需要产生多种范围的不同脂肪酸成分的构建体和方法。
发明概述
本发明总体涉及基因组去饱和酶多核苷酸，特别是编码催化在脂肪酰链从羧基末端数第12(Δ-12去饱和酶或fad2)或第15(Δ-去饱和酶或fad3)位碳的脂肪酰基部分插入双键的酶的基因组去饱和酶多核苷酸。另外，本发明提供了分离的这类基因组多核苷酸序列的非编码区域，特别包括内含子和启动子区域。本发明还提供了包括来源于Δ-12和Δ-15去饱和酶启动子和内含子序列的部分或全部序列的特异寡核苷酸。虽然本公开的序列是从大豆植物中获得的，但是，也可以考虑来源于与大豆去饱和酶序列同源或相同的去饱和酶基因组多核苷酸序列的内含子和启动子区域附加序列。所述的附加去饱和酶序列可以使用下面描述的标准方法从多种植物中获得，尤其是从含油种子作物中获得。
本发明的另外一个方面提供了在植物中用于改变脂肪酸成分的重组DNA构建体，尤其是改变去饱和酶基因或蛋白，如Δ-12和Δ-15去饱和酶，的转录或转录和翻译(表达)。本发明尤其涉及包含来源于基因组克隆的内含子或启动子区域的序列的DNA构建体，其中所述的序列在DNA构建体中的方向是正义方向或反义方向。然后将这些DNA构建体用于转化或转染宿主细胞，产生使脂肪酸水平，尤其油酸、亚油酸和亚麻酸水平发生变化的植物。本发明尤其有计划提供了下调Δ-12和Δ-15去饱和酶基因表达的构建体和方法，以便增加油酸水平，降低亚油酸和亚麻酸水平。本发明还有计划的改变了含油种子作物的种子组织中的脂肪酸成分。
通过Δ-12和Δ-15去饱和酶多核苷酸的表达获得的修饰的植物细胞、植物、种子和油产品也被认为是本发明的一部分。而且，也可以有计划地产生含有特定某一脂肪酸水平的油成分。一个优选的实施方案包含至少大约80-85％的油酸、不超过1-2％的亚油酸以及不超过1-3％的亚麻酸；第二个优选的实施方案包含至少大约50-75％的油酸、至少10-30％的亚油酸以及不超过大约3％的亚麻酸。发明的详述
本发明涉及去饱和酶基因组序列，尤其是从宿主细胞来源的基因组脂肪酸去饱和酶核酸序列分离的非编码序列。本发明去饱和酶序列包括任何可以从一种细胞源获得的核酸基因组序列，包括所有非编码区域，该序列编码来源于一种物质如蛋白、多肽或肽的氨基酸，它能在植物宿主细胞，如在体内，或类植物细胞环境，如在体外，催化双键插入脂肪酰基部分。正如以下会更加详细的描述的那样，本发明还提供了能在脂肪酰链从羧基末端数第12(Δ-12去饱和酶)和第15(Δ-15去饱和酶)位碳插入双键的特异基因组多核苷酸序列编码的酶。另外，本发明还提供了这类基因组序列的特异非编码区域。
术语“非编码”指不编码部分或全部表达蛋白的多核苷酸序列。非编码序列包括但不限于内含子、启动子区域和5’非翻译区。
这里使用的术语“内含子”指本名词的通常含义，意指不编码部分或全部表达蛋白的多核苷酸片段，通常是DNA。
这里使用的术语“外显子”指本名词的通常含义，意指编码部分或全部表达蛋白的多核苷酸片段，通常是DNA。
因此，术语“内含子”指能转录进入RNA分子，但在RNA翻译成蛋白之前就排除出RNA的基因区域。与之相反，术语“外显子”指能转录进入RNA，继之能翻译进入蛋白的基因区域。
本发明提供了Δ-12去饱和酶和Δ-15去饱和酶序列以及从该序列获得的内含子和启动子区域，这在序列表和实例中有详细的描述。特别是，两种Δ-12去饱和酶基因组克隆被鉴定并置于序列号1和23中。一种单独的Δ-15去饱和酶基因组克隆被鉴定并置于序列号3中。从每一Δ-12去饱和酶基因组克隆中获得了单独的内含子区域，其序列分别列于序列号2和24中。从每一个Δ-12去饱和酶基因组中克隆的启动子区被分别包括在序列号1(碱基对1-1094)和序列号23(碱基对1-1704)中。Δ-15去饱和酶在编码区包括7个内含子(列于序列号4，5，6，7，8，25和26)。另外，以前的结果表明，在5’非翻译区还有一个另外的内含子。
虽然这里描述的序列是从大豆中获得的，但也可以考虑从与大豆的去饱和酶序列同源或一致的去饱和酶基因组多核苷酸序列中获得内含子和启动子区域。特别是，可以从其他植物，尤其是从含油种子作物中获得这些序列。这些基因组序列可以使用标准方法获得，它们中的某些会在以下进行描述。
本发明序列可以用来改变植物中的脂肪酸组成成分(见实施例3和表I)。具体地说，可以看出正义和反义抑制可以用于获得更广范围的油酸、亚油酸和亚麻酸含量。尤其可以看出的是，油酸含量范围是从大约26-80％，亚油酸含量范围是从大约2.97-49.92％，以及亚麻酸含量范围是从大约3.38-8.81％。然而，这些范围仅仅代表所能获得的最大范围。而且，可以有计划地将这些序列结合以获得另外的脂肪酸组成成分。这些组成成分优选依赖于所用油的用途。一个优选的组合物包括至少大约50-75％的油酸，至少大约10-30％的亚油酸和不超过大约3％的亚麻酸。一个特别优选的实例包括至少大约60-70％的油酸，至少大约15-20％的亚油酸和不超过大约3％的亚麻酸。
虽然这里列举的实例是利用正义或反义抑制来下调目的基因，也可以考虑使用其他改变基因表达的方法。尤其是可以考虑使用所设计的可以与这里识别的非编码区域特异结合的DNA结合蛋白或所设计的切除这类非编码区域的核酶的方法下调基因的表达。另外，正如以下会有描述的那样，也可以考虑使用其它本领域已知的下调基因表达的方法，并且可以与本发明的序列一起使用。
分离的多核苷酸、蛋白和多肽
本发明一方面涉及分离的去饱和酶多核苷酸。本发明的多核苷酸序列包括可以从基因组核酸序列获得的分离多核苷酸。
本发明提供了一种全长与序列表中所列序列相一致的多核苷酸序列。该多核苷酸包括非编码序列，包括例如，但不局限于，非编码5’和3’序列，如已转录、但不翻译的序列，终止信号，核糖体结合区域，mRNA稳定序列，内含子，多聚腺苷酸信号以及编码附加氨基酸的附加编码序列。例如，可以包括有利于融合多肽纯化的标志序列。本发明的多核苷酸还包括含有结构基因和控制基因表达自然相关序列的多核苷酸。
本发明还包括以下通式的多核苷酸：
        X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y其中，在5’端，X是氢，在3’端，Y是氢或一种金属，R1和R3是任何核酸残基，n是1至3000之间的整数，优选在1至1000之间，R2是本发明的核酸序列，尤其是选自序列表中所列的核酸序列，优选序列号1-8和23-29。在通式中，R2是有方向的，其5’端残基在左，与R1结合，3’端残基在右，与R3结合。由任何R基团表示的任何一段核酸残基，其中R大于1，可以是杂聚物或均聚物，优选杂聚物。
本发明进一步优选的实例是其全长与本发明的一种多核苷酸至少有50％、60％或70％相同，以及与这些多核苷酸互补的多核苷酸。更优选的是含有其全长与本发明多核苷酸至少有80％相同的一个区域的多核苷酸，以及与这些多核苷酸互补的多核苷酸。从这一点来看，尤其优选其全长至少90％相同的多核苷酸，那些至少有95％相同的多核苷酸是特别优选的。进一步来说，至少97％相同的是高度优选的，至少98％和99％相同是特别更优选的，其中至少99％相同是最优选的。
优选的实例是从基因组多核苷酸序列中获得的多核苷酸，列于序列表中。
本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸。本发明尤其涉及在严紧条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。这里使用的术语“严紧条件”和“严紧杂交条件”意指当序列之间至少有95％，优选至少97％相同的时候就会发生杂交反应。严紧杂交条件的一个例子是在含50％甲酰氨、5XSSC(150mM NaCl，15mM枸橼酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升的变性、剪切鲑精子DNA的溶液中42℃孵育过夜，然后在0.1X SSC中在大约65℃洗脱。其它杂交和洗脱条件是已知的，并在Sambrook等人，分子克隆：实验手册，第二版，cold Spring Harbor，纽约(1989)，特别是第二章中有例证。
本发明还提供了一种多核苷酸，它实际上包括在严紧杂交条件下，用含所述多核苷酸序列或其片段的探针通过在含有全部基因的文库中筛选序列表中所列的多核苷酸序列获得的多核苷酸序列，以及分离所述的多核苷酸序列。有利于获得这类多核苷酸的片段包括，例如，这里描述的探针和引物。
这里讨论的关于本发明多核苷酸的测定，例如，本发明的多核苷酸可以用来作为RNA，cDNA或基因组DNA的杂交探针以分离编码多肽的全长cDNA或基因组克隆，以及分离具有与序列表中所列的多核苷酸序列高度相同的其它基因的cDNA或基因组克隆。这些探针通常包括至少15个碱基。优选具有至少30个碱基的探针，也可以有至少50个碱基。特别优选的是在30至50个碱基之间，包括30和50个碱基的探针。
通过使用序列表中提供的DNA序列来合成寡核苷酸探针，筛选分离某种含有或构成序列表中所列的多核苷酸序列的基因区域。然后使用标记的、含本发明多核苷酸互补序列的寡核苷酸筛选cDNA、基因组DNA或mRNA文库，识别与所选探针杂交的文库中的成员。例如，制备符合去饱和酶启动子和内含子序列的合成寡核苷酸。在这种方法中由于低水平的杂交背景，尤其适用于在噬菌体载体文库中筛选cDNA。
通常来说，使用核酸探针获得的去饱和酶序列在靶去饱和酶序列和用作探针的编码序列之间表现出60-70％的序列同源性。然而，也可以获得只有50-60％序列同源性的较长的序列。核酸探针可以是核酸序列的长片段，或者可以是较短的寡核苷酸探针。当较长的核酸片段用作探针时(超过100碱基)，可以在次严格条件下进行筛选，以从靶样品中获得与用作探针的序列有20-50％偏差(即50-80％序列同源)的序列。寡核苷酸探针与编码去饱和酶的整个核酸序列相比相对较短，但应该至少有大约10个碱基，优选至少大约15个，更优选至少大约20个的核苷酸。与使用较长的序列区域不同，使用较短的序列能有希望获得更高程度的序列同源性。因此识别高度保守的氨基酸序列区域来设计寡核苷酸探针，以探测和复原其它相关的去饱和酶基因是可取的。较短的探针在进行多聚酶链反应(PCR)时常常特别有用，尤其是当可以识别高度保守序列时。(见Gould等人，美国PNAS(1989)86：1934-1938)
“同源性”，正如本领域的技术人员理解的那样，是通过比较序列测定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的一种关系。在本领域中，“同源性”也指通过测定某种序列链之间的相配性，在多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度。“同源性”可以很容易地用已知的方法计算出来，这些方法包括，但不局限于，在计算分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编著，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(1988)；生物学计算(Biocomputing)：信息学和基因组计划(Informatics and GenomePro jects)，Smith，D.W.编著，学院出版社(Academic Press)，纽约，1993；序列数据的计算机分析。第一部分，Griffin，A.M.和Griffin H.G.编著，Humana出版社，新泽西(1994)；分子生物学的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.学院出版社(AcademicPress)(1987)；引物序列分析(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.编著，Stockton出版社，纽约(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.SIAM J Applied Math，48：1073(1988)中的描述。可以设计测定序列同源性的方法以获得测定序列之间的最大相配性。而且，测定同源性的方法已在可以公开获得的程序上编辑成册。用于测定两序列之间同源性的计算机程序包括，但不局限于，GCG(Devereux，J等人，核酸研究(Nucleic Acid Research)12(I)：387(1984)；5个BLAST配套程序，其中3个(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)用于查询核苷酸序列，2个(BLASTP和TBLASTN)用于查询蛋白序列(Coulson，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)12：76-80(1994)；Birren等人，基因组分析(Genome Analysis)，1：543-559(1997))。BLASTX程序可以从NCBI和其它渠道公开获得(BLAST手册，Altschul，S等人，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894；Altschul，S等人，分子生物学杂志(J Mol Biol)，215：403-410(1990))。众所周知的Smith Waterman算法也可以用来计算同源性。
典型的多肽序列比较参数包括：
算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J Mol Biol)48：443-453(1970)。
比较模板(matrix)：BLOSSUM62，Hentikoff和Hentikoff，美国国家科学院(Proc.Natl.Acad.Sci USA)89：10915-10919(1992)
缺口补偿：12
缺口长度补偿：4
可以使用这些参数的程序可以从遗传计算机集团(GeneticComputer Group)，Madison Wisconsin作为“缺口”程序公开获得。末端缺口无补偿的上述参数是肽比较的默认参数。
多核苷酸序列比较参数包括：
算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J Mol Biol)48：443-453(1970)。
比较模板(matrix)：相配＝+10；不相配＝0
缺口补偿：50
缺口长度补偿：3
可以使用这些参数的程序可以从遗传计算机集团(GeneticComputer Group)，Madison Wisconsin作为“缺口”程序公开获得。上述参数是核酸比较的默认参数。
对免疫学筛选来说，可以通过将纯化蛋白或其一部分注射入兔或小鼠制备蛋白的抗体，这类制备抗体的方法在本领域是已知技术。可以产生单克隆抗体或多克隆抗体，虽然典型的多克隆抗体更利于基因分离。可以用Western分析通过抗体与编码蛋白的交叉反应测定待测植物天然提取物中存在的相关蛋白。当观察到交叉反应时，通过筛选代表待测植物的表达文库分离编码相关蛋白的基因。表达问库可以构建在多种商业上可以获得的载体中，包括λgtll，如Sambrook等人描述。(分子克隆：实验手册，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，纽约)。植物构建体及使用方法
本发明特别注重于使用重组DNA构建体中的多核苷酸序列介导本发明去饱和酶基因组序列在宿主植物细胞中的转录。表达构建体通常包括在宿主植物细胞中起作用的、有效连接至本发明核酸序列的启动子和在宿主植物细胞中起作用的转录终止区域。
本领域的技术人员理解在植物细胞中起作用的有许多启动子，在文献中已有描述。特异的叶绿体和质体启动子，功能性叶绿体或质体启动子以及有效的叶绿体或质体启动子都可以考虑。
一类启动子是结构型的启动子，如CaMV35S或FMV35S启动子，它们在多数植物器官中产生了高水平的表达。CaMV35S和FMV35S启动子的增加或复制本在本发明实践中是有用的(Odell等人，自然(1985)313：810-812；Rogers，美国专利号5,378,619)。另外，还可以使本发明的序列在特异的植物组织如叶、茎、根、管、种子、果实等中表达，且选择的启动子应该具有组织和发育上的特异性。
本发明特别注重于本发明核酸序列从转录起始区的表达，优选在植物种子组织中的表达。这类种子优选转录起始序列的例子包括来源于编码植物储存蛋白基因序列或参与含油种子脂肪酸生物合成基因的那些序列。这些启动子例子包括诸如napin(Kridl等人，种子科学研究杂志(Seed Sci Res J)：209：219(1991))、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、β-大豆共球蛋白的大豆α’亚单位(soy 7s(Chen等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，83：8560-8564(1986)))和油脂蛋白等基因的5’调节区域。
介导去饱和酶蛋白定位于特定的细胞亚单位，例如定位在线粒体、内质网、液泡、叶绿体或其它质体单位可能是有益的。例如，本发明目的基因将会靶向于质体，如叶绿体，表达的地方，构建体也会利用序列介导基因进入质体。此处所述的这类序列如叶绿体转运肽(CTP)或质体转运肽(PTP)。以这种方式，在目的基因没有被直接插入质体的地方，表达构建体会另外包含一段编码转运肽的基因介导目的基因进入质体。叶绿体转运肽可以来源于目的基因，或者可以来源于含有CTP的异源序列。这些转运肽在本领域是已知的。见例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol Biol Rep.9：104-126；Clark等人(1989)生物化学杂志(JBiol Chem.)264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)植物生理(Plant Physiol.)84：965-968；Romer等人(1993)生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)196：1414-1421；以及Shah等人。(1986)科学233：478-481。
根据目的用途，构建体可以含有整个基因组核酸序列或该序列的特别非编码区或这类序列的一部分。例如，如果需要反义抑制所选去饱和酶蛋白就不需要完整序列。进一步来说，如果构建体所用的去饱和酶序列是用作探针的话，仅制备含去饱和酶序列的一个特别部分的构建体就可以了，例如，编码高度保守去饱和酶区域的序列。
本领域技术人员知道有许多抑制宿主细胞内源序列表达的方法。这些方法包括，但不局限于，反义抑制(Smith等人(1988)，自然，334：724-726)，共同抑制(Napoli等人(1989)，植物细胞(Plant cell)2：279-289)，核酶(PCT公开WO97/10328)，正义和反义结合(Waterhouse等人(1998)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)95：13959-13964)，启动子沉默(Park等人(1996)，植物杂志(Plant J)9(2)：183-194)，DNA结合蛋白(Beerli等人(1997)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)95：14628-14633；和liu等人(1998)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)94：5525-5530。抑制宿主细胞内源序列的方法通常使用转录或转录和翻译至少一部分的被抑制序列。这些序列可能与内源序列的编码区以及非编码区同源。
本发明植物表达构建体还提供了转录调节终止区域。转录终止区域可以由编码去饱和酶的DNA序列或来源于异源基因的合适转录终止区域提供，例如，与转录起始区域自然相关的转录终止区域。本领域技术人员知道任何合适的能终止植物细胞转录的转录终止区域可以用于本发明构建体。
或者是，可以直接从宿主细胞质体制备构建体介导去饱和酶序列的表达。这类构建体和方法在本领域中是已知的，且有一般描述，例如，Svab等人(1990)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)87：8526-8530及Svab和Maliga(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)90：913-917以及美国专利号5,693,507。
其中被引入了含有表达构建体的重组DNA构建体的植物细胞、组织、器官或植物被认为是转化、转染或转基因的细胞、组织、器官或组织。转基因或转化的细胞或植物还包括细胞或植物的子代及使用该转基因植物作为亲代杂交，因去饱和酶核酸序列存在导致改变的表型繁育产生的子代。
含有本发明去饱和酶多核苷酸作为DNA目的序列以增加或降低其表达的植物表达或转录构建体，可以用于较广范围的植物生长周期，尤其是参与具有可食性和工业用途的蔬菜油生产的植物生长周期。最优选的是温带含油种子作物。相关植物包括，但不局限于，油菜籽(Canola andHigh Erucic Acid Varieties)、向日葵、红花、棉花、大豆、花生、椰子、棕榈油(coconut and oil palmx)和玉米。根据将重组构建体导入宿主细胞的方法，可能需要其它的DNA序列。重要的是，本发明对类双子叶或单子叶种属是实用的，而且将会非常容易的应用于新的和/或改善的转化和调节技术。
特别需要关注的是，在植物中使用植物去饱和酶启动子和/或内含子构建体产生含修饰的脂肪酸成分的植物或植物的一部分，包括，但不局限于叶、茎、根、繁殖体和籽。在去饱和酶启动子和/或内含子构建体中特别需要关注的是在正义或反义方向使用Δ-12和Δ-15去饱和酶基因组序列的启动子和/或内含子序列，以改变宿主细胞中脂肪酸组成成分。
本发明的多核苷酸可以用于制备在多种宿主细胞中使用的构建体。本发明中可以使用的构建体包括，但不局限于植物细胞、细菌细胞、真菌细胞(包括酵母)、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
例如，为了确定所识别的核酸序列即去饱和酶编码的蛋白的活性和特异性，可以使用杆状病毒表达系统对培养的昆虫细胞进行了体外测试。这些杆状病毒表达系统在本领域中是已知的，具体描述见Lee等人，美国专利号5,348,886，在此引入仅供参考。
获得这类转基因植物的转化方法对本发明来说并不是至关重要的，可以使用当前的多种植物转化方法。进一步来说，正如新方法可以用于转化植物那样，这些新方法也可以在下文中直接应用。例如，许多自然存在的易被土壤杆菌属感染的植物种属可以通过土壤杆菌属调节的三或二载体转化方法成功转化。在许多例子中都可以通过T-DNA将构建体的一面或两面连接起来，优选左侧和右侧接壤，更优选右侧接壤。当构建体使用根癌农杆菌或发根农杆菌作为转化模式时，上述的接壤尤其有用，虽然T-DNA连接也可以用于其它转化模式。另外，微注射、DNA微粒轰击和电打孔技术也得到改善，使得多种单子叶植物和双子叶植物都可以转化。
一般说来，DNA构建体可以包括具有必要的调节宿主细胞表达的区域以及提供选择转化细胞的结构基因。该基因可能给毒性制剂，如抗生素、重金属、毒素等等提供抗性，给营养缺陷型宿主互补提供原养，以及提供病毒免疫等等。根据宿主的类型，可以引入表达载体或其组成成分，可以使用一种或多种标记物，其中选择不同的宿主使用不同的条件。
在那些使用土壤杆菌属转化植物细胞的情况中，可以使用一种载体，将该载体导入土壤杆菌属宿主，用在土壤杆菌属宿主中存在的T-DNA或Ti-或Ri-质粒进行同源重组。含有用于重组的T-DNA的Ti-或Ri-质粒可以有加长臂(能引起瘿瘤形成)或没有加长臂(不能引起瘿瘤形成)，只要在转化的土壤杆菌属宿主中存在vir基因，后者就是容许的。有加长臂的质粒可以产生正常植物细胞和瘿瘤的混合体。
在一些实例中，当土壤杆菌属用做转化宿主植物细胞的工具时，T-DNA连接区域连接的表达或转录构建体将被插入具有更广宿主范围的载体，该载体能在大肠杆菌和土壤杆菌中复制，在文献中有关于更广宿主范围载体的描述。通常使用的是pRK2或其衍生物，见，例如，Ditta等人(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)77：7347-7351))和欧洲专利申请(EPA)0 120 515，在此引入以供参考。或者，也可以将要在植物细胞中表达的序列插入含分离复制序列的载体中，该复制序列的其中一条稳定了大肠杆菌中的载体，另外一条稳定了土壤杆菌中的载体。见，例如，McBride和Summerfelt(植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)(1990)14：269-276)，其中利用了复制pRiHRI(Jouamin等人，分子基因的产生(Mol.Gen.Gener.)(1985)201：370-374)的起始点，增加了宿主土壤杆菌属细胞中植物表达载体的稳定性。
在表达构建体和T-DNA中包括一种或多种标志，该标志能选择转化的土壤杆菌或转化的植物细胞。已经发现许多标志都可以用于植物细胞，如氯霉素、卡那霉素、氨基糖苷G418、潮霉素抗性或其它抗性。使用的特殊标志不是本发明的要点，优选使用的一种或另一种标志取决于特殊的宿主和构建的方式。
为了使用土壤杆菌转化植物细胞，外植体可以与转化的土壤杆菌结合并孵育足够的时间以利于转化，在合适的选择性介质中，细菌被灭活，植物细胞得到培养。一旦愈伤组织形成，就可以根据已知技术通过使用合适的植物激素促进茎干形成，而且将茎干转移到生根介质以繁殖植物。然后植物会结种子，而种子可以用来产生重复性子代以及分离植物油。
为了改变宿主细胞内不饱和脂肪酸的含量，根据本发明可以使用第二个表达构建体。例如，可以将去饱和酶表达构建体引入宿主细胞以便与含有编码参与脂肪酸生物合成的蛋白的核酸序列的第二个表达构建体连接。
有几种可能的途径可以用来获得本发明含有多个表达构建体的植物细胞。本发明包括任何产生植物的方法，该方法包括含有编码本发明表达构建体的DNA序列的构建体以及至少一种含有另外一种编码一种酶的DNA序列的其他构建体。例如，表达构建体可以用来转化一种植物，同时第二个构建体或者通过将两个表达构建体包含在单一转化载体之中，或者通过使用不同的载体，而其中每一种载体都表达目的基因。可以将第二个表达构建体引入一株已被去饱和酶表达构建体转化的植物，或者，可以将分别转化的多株植物—其中一株表达去饱和酶构建体，一株表达第二个构建体—通过杂交将多个构建体引入同一株植物。
以上仅对本发明进行了大体的描述，通过参考以下实施例将会更容易理解，以下实施例的目的仅仅为了阐明，而非限制本发明。
                     实施例实施例1去饱和酶基因序列的克隆1A.大豆Δ-12去饱和酶(fad2-1)
通过使用大豆fad2-1 cDNA探针在大豆基因文库中进行筛选，识别出大豆fad 2-1A序列。识别了三种公认的大豆fad2-1克隆，并进行了空斑纯化。三个大豆fad2-1克隆中的两个被连接入pBluescript IIKS+(Stratagene)并进行了测序。两个克隆(14-1和11-12)是相同的，完全符合大豆fad2-1 cDNA。序列号1中提供了完整的fad2-1A克隆序列。
在获得该全长克隆之前，使用PCR引物对fad2-1A基因组克隆的一部分进行了PCR扩增，该PCR引物是从5’未翻译序列(引物12506，5’-ATACAA GCCACTAGGCAT-3’，序列号9)在cDNA(引物11698：5’-GATTGGCCATGCAATGAGGGAAAAGG-3’，序列号10)内设计的。所获得的PCR产物，其中含有fad2-1A内含子，被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。通过使用Macvector中的Pustell比较程序比较大豆cDNA序列识别了大豆fad2-1A的部分基因组克隆(序列号27)及其内含子区域(序列号2)。内含子序列在ATG起始密码子之后开始，长度为420碱基。
fad2-1基因家族的第二个成员也被识别并进行了克隆，在这里称作fad2-1B。大豆fad2-1B部分基因组克隆(序列号23)含有启动子(碱基对1-1074)；5’非翻译区(碱基对1705-1782)；内含子#1(碱基对1786-2190)；以及通过使用Macvector中的Pustell比较程序比较了大豆cDNA序列识别了一部分fad2-1B编码区(碱基对1783-1785和2191-2463)及其内含子区域(序列号24)。内含子序列在ATG起始密码子之后开始，长度为405碱基。1B.大豆Δ15去饱和酶(fad 3)
使用引物10632：5’-CUACUACUACUACTCGAGACAAAGCCTTTAGCCTATG-3’(序列号11)和10633：5’-CAUCAUCAUCAUGGATCCCATGTCTCTCTATGCAAG-3’(序列号12)从大豆DNA中对部分大豆fad3基因组序列进行了PCR扩增。根据制造商的说明使用了延伸长模板PCR系统(Expand Long Template PCR System)(Boehringer Mannheim)。获得的PCR产物被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。通过使用Macvector中的Pustell程序比较大豆fad 3 cDNA序列确定了大豆fad 3的部分基因组克隆序列以及内含子区域。从识别的部分大豆基因组fad 3序列(序列号3)中识别了7个内含子：序列号4(内含子#1)，序列号5(内含子#2)，序列号6(内含子#3A)，序列号7(内含子#4)，序列号8(内含子#5)，序列号25(内含子#3B)以及序列号26(内含子#3C)。内含子#1长度为192个碱基对，定位于294和485位之间，内含子#2长度为348个碱基对，定位于576和923位之间，内含子#3A长度为142个碱基对，定位于991和1132位之间，内含子#3B长度为98个碱基对，定位于1225和1322位之间，内含子#3C长度为115个碱基对，定位于1509和1623位之间，内含子#4长度为1231个碱基对，定位于1705和2935位之间，内含子#5长度为626个碱基对，定位于3074和3699位之间。
实施例2表达构建体
使用fad2-1A部分基因组克隆(序列号27)作为模板，引物12701(5’-ACGAATTCCTCGAGGTAAATTAAATTGTGCCTGC-3’(序列号13)和引物12702(5’-GCGAGATCTATCGATCTGTGTCAAAGTATA AAC-3’(序列号14)，通过PCR扩增了大豆fad2-1A内含子序列。获得的扩增产物被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。然后将大豆fad2-1A内含子在正义和反义方向克隆进入表达序列盒，pCGN3892。载体pCGN3892含有大豆7S启动子和豌豆RBCS 3’。然后将两个融合基因分别连入pCGN9372，一种含有通过FMV启动子调节的CP4基因的载体。使用以下描述的生物表(biolistic)方法，获得的表达构建体(pCGN5469正义和pCGN5471反义)用作大豆的转化。
使用fad2-1B部分基因组克隆(序列号23)作为模板，引物13883(5’-GCGATCGATGTATGATGCTAAATTAAATTGTGCCTG-3’(序列号30)和引物13876(5’-GCGGAATTCCTGTGTCAAAGTATAAAGA AG-3’(序列号31)，通过PCR扩增了大豆fad2-1B内含子序列。获得的扩增产物被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。大豆fad2-1B分别在正义和反义方向融合进质粒pCGN5468(含有大豆7S启动子融合进大豆fad2-1A内含子(正义)和豌豆RBCS 3’)或pCGN5470(含有大豆7S启动子融合进大豆fad2-1A内含子(反义)和豌豆RBCS 3’)中的大豆fad2-1A内含子的3’端。然后将获得的内含子融合体(intron comb fussion)分别引入pCGN9372，一种含由FMV启动子调节的CP4基因的载体。使用以下描述的生物表(biolistic)方法将获得的表达构建体(pCGN5485，fad2-1A&B内含子正义方向和pCGN5486，fad2-1A&B内含子反义方向)用作大豆的转化。
使用大豆fad 3部分基因组克隆作为模板，和以下引物：内含子#1，12568：GATCGATGCCCGGGGTAATATTTTTGTGT(序列号15)和12569：CACGCCTCGAGTGTTCAATTCAATCAATG(序列号16)；内含子#2，引物12514：5’-CACTCGAGTTAGTTCATACTGGCT-3’(序列号17)和12515：5’-CGCATCGATTGCAAAATCCATCAAA-3’(序列号18)；内含子#4，引物10926：5’-CUACUACUACUACTCGAGCGTAA ATAGTGGGTGAACAC-3’(序列号19)和10927：5’-CAUCAUCAUC AUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3’(序列号20)；内含子#5，引物10928：5’-CUACUACUACUACTCGAGGCGCGTACATTT TATTGCTTA-3’(序列号21)和10929：5’-CAUCAUCAUC AUCTCGAGGAATTCTGCAGTGAATCCAAATG-3’(序列号22)对从大豆fad 3基因组克隆中识别的7个内含子中的4个进行了PCR扩增。获得的每一内含子的PCR产物被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。内含子#1、#2、#4和#5在正义和反义方向被分别引入pCGN3892。pCGN3892含有大豆7S启动子和豌豆RBCS3’。这些融合体被引入pCGN9372，一种含由FMV启动子调节CP4基因转化进入大豆的载体。使用以下描述的生物表(biolistic)方法将获得的表达构建体(pCGN5455，fad3内含子#4内含子的正义方向；pCGN5459，fad3内含子#4内含子的反义方向；pCGN5456，fad3内含子#5内含子的正义方向；pCGN5460，fad3内含子#5内含子的反义方向；pCGN5466，fad3内含子#2内含子的反义方向；pCGN5473，fad3内含子#1内含子的反义方向)用作大豆的转化。
大豆fad3内含子#3C和#4也从fad3基因家族的第二个成员进行了PCR扩增，这里称为fad3-1B。大豆fad3-1B内含子#3C和#4从大豆DNA进行了PCR扩增，使用了以下的引物，5’-CATGCTTTCT GTGCTTCTC-3’(序列号32)和5’-GTTGATCCAA CCATAGTCG-3’(序列号33)。PCR产物被克隆进入载体pCR2.1(Invitrogen)并进行了测序。大豆fad3-1B内含子#3C和#4的序列见序列号28和29。实施例3    植物转化和分析
通过McCabe等人(1988)生物/技术(Bio/Technology)6：923-926描述的方法将含有正义和反义表达的Δ-12和Δ-15去饱和酶内含子表达构建体的线性DNA片段稳定引入大豆(Asgrow variety A4922)。转化的大豆植物通过在含草甘膦的介质上选择鉴定。
使用气相色谱法对用大豆内含子表达构建体转化的大豆系种子进行脂肪酸成分分析。T2合并的种子(库ed seed)和单独T2种子含油成分分析表明，与未转化的大豆种子相比，转基因大豆系种子油中单和多不饱和脂肪酸成分有了改变。表1提供了使用所述的构建体获得的简要结果。这些数据清楚地表明，去饱和酶基因非编码区的正义和反义表达导致脂肪酸成分的改变。这些数据还表明，内含子可以用于获得含有不同脂肪酸成分的多种植物系。根据所需要的脂肪酸成分的不同选择相关的植物系。另外，由于每一内含子都能使脂肪酸水平进行某种程度的改变，可以考虑根据所需脂肪酸成分的不同，结合使用这些内含子。
                          表1
油酸 亚油酸 亚麻酸
Fad2 方向 事件
野生型(对照) 5469-5无T2库10粒种子平均5469-27无T2库A49225471-13无T2库10粒种子平均A4922 18.15％13.89％19.15％15.75％17.02％13.86％14.95％ 55.59％55.89％54.62％56.1％54.49％56.14％55.95％ 7.97％9.067％9.32％8.75％9.08％9.49％9.07％
全长cDNA(对照) 正义 5462-133 T2库最优5462-133 T2种子 84％84％ 2.17％0.59％ 1.55％1.76％
内含子1 正义 5469-6 T2库5469-8 T2库最优5469-6 T2种子最优5469-8 T2种子5469-14 T2库5469-20 T2库5469-22 T2库最优5469-14 T2种子5485-3 T2库5485-53 T2库 29.93％36.5％44.41％41.26％61.06％48.89％80％62.21％63.54％47.58％ 46.53％42.11％29.34％33.16％16.42％31.61％2.97％11.97％14.0927.64 5.98％6.68％5.74％7.75％4.89％4.78％8.81％7.32％7.81％
反义 5471-8 T2库5471-2 T2库5471-26 T2库最优5471-8 T2库种子最优5471-2 T2库种子最优5471-26 T2库种子5486-33 T2库5486-12 T2库548640 T2库 31.05％27.98％32.66％57.4％28.08％43.3％32.37％27.32％26.79％ 43.62％48.88％44.54％23.37％46.14％34.15％43.66％46.97％48.72％ 7.07％6.83％6.76％5.73％6.52％5.6％6.87％6.4％6.55％
  Fad3
  野生型(对照)   5743-7无T2库A4922 T2库   15.65％19.84％   56.74％56.79％   9.55％7.48％
  全长cDNA(对照)   正义   5464-50 T2库最优5464-50 T2种子   18.06％17.08％   62.03％62.44％   2.75％1.72％
  内含子1   反义   5473-8 T2库5473-1 T2库   33.47％33.34％   45.97％42.67％   5.54％7.59％
  内含子2   反义   5466-20 T2库5466-16 T2库   28.43％27.61％   48.83％49.92％   6.37％5.96％
  内含子4   正义   5455-19 T2库5455-10 T2库5455-57 T2库5455-76 T2库5455-107 T2库最优5455-57 T2库种子最优5455-76 T2库种子最优5455-107 T2库种子   40.35％35.14％38.04％37.24％36.44％45.36％35.3％45.56％   39.97％43.59％42.44％42.42％42.72％35.55％43.54％34.85％   4.61％5.53％5.24％5.37％5.62％4.92％5.53％5.12％
  反义   5459-2 T2库5459-6 T2库5459-20 T2库最优5459-2 T2库种子最优5459-6 T2库种子最优5459-20 T2库种子   34.5％33.78％28.26％61.45％53.51％30％   43.87％44.12％49.48％23.45％29.68％50.55％   5.59％5.62％5.5％3.38％3.53％4.15％
  内含子4   正义   5456-38 T2库5456-62 T2库最优5456-62 T2库种子   28.23％28.94％29.5％   49.59％48.66％43.69％   6.74％6.25％5.4％
  反义   5460-9 T2库5460-21 T2库最优5460-21 T2库种子   29.78％28.37％35.18％   48.57％49.79％40.52％   5.54％5.54％5.33％
本说明书中提及的所有公开和专利申请都属于本发明所属技术领域熟练技术人员的水平。所有公开和专利申请在此引入供参考的程度是，假定每一公开或专利申请都是明确地和个别地引入供参考。
虽然以阐述和实施例的方式对本发明进行了一些具体描述，其目的是为了更清楚地理解本发明，显而易见的改变和修改都在本发明附属的权利要求范围之内。

Claims (48)

1.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号1的多核苷酸；
b)一种具有与序列号1全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号1全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号1全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号1全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号1序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号2的多核苷酸；
b)一种具有与序列号2全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号2全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号2全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号2全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号2序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，选自以下群体包括：
a)包含序列号3的多核苷酸；
b)一种具有与序列号3全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号3全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号3全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号3全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号3序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
4.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号4的多核苷酸；
b)一种具有与序列号4全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号4全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号4全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号4全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号4序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
5.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号5的多核苷酸；
b)一种具有与序列号5全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号5全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号5全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号5全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号5序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
6.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号6的多核苷酸；
b)一种具有与序列号6全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号6全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号6全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号6全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号6序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
7.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号7的多核苷酸；
b)一种具有与序列号7全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号7全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号7全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号7全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号7序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
8.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号8的多核苷酸；
b)一种具有与序列号8全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号8全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号8全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号8全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号8序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
9.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号23的多核苷酸；
b)一种具有与序列号23全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号23全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号23全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号23全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号23序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
10.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号24的多核苷酸；
b)一种具有与序列号24全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号24全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号24全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号24全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号24序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
11.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号25的多核苷酸；
b)一种具有与序列号25全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号25全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号25全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号25全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号25序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
12.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号26的多核苷酸；
b)一种具有与序列号26全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号26全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号26全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号26全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号26序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
13.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号27的多核苷酸；
b)一种具有与序列号27全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号27全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号27全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号27全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号27序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
14.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号28的多核苷酸；
b)一种具有与序列号28全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号28全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号28全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号28全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号28序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
15.一种分离的多核苷酸，选自以下群体：
a)包含序列号29的多核苷酸；
b)一种具有与序列号29全长上的多核苷酸序列至少70％相同的多核苷酸序列；
c)一种具有与序列号29全长上的多核苷酸序列至少80％相同的多核苷酸序列；
d)一种具有与序列号29全长上的多核苷酸序列至少90％相同的多核苷酸序列；
e)一种具有与序列号29全长上的多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列；
f)一种在严紧条件下与序列号29序列或其片段杂交的多核苷酸序列；以及
g)一种与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
16.从选自以下群体的基因组多核苷酸序列获得的内含子：
a)在序列号1全部编码区域上与序列号1的编码区域具有至少70％相同的基因组多核苷酸序列；
b)在序列号1全部编码区域上与序列号1的编码区域具有至少80％相同的基因组多核苷酸序列；
c)在序列号1全部编码区域上与序列号1的编码区域具有至少90％相同的基因组多核苷酸序列；以及
d)在序列号1全部编码区域上与序列号1的编码区域具有至少95％相同的基因组多核苷酸序列；
17.从选自以下群体的基因组多核苷酸序列获得的内含子：
a)在序列号3全部编码区域上与序列号3的编码区域具有至少70％相同的基因组多核苷酸序列；
b)在序列号3全部编码区域上与序列号3的编码区域具有至少80％相同的基因组多核苷酸序列；
c)在序列号3全部编码区域上与序列号3的编码区域具有至少90％相同的基因组多核苷酸序列；以及
d)在序列号3全部编码区域上与序列号3的编码区域具有至少95％相同的基因组多核苷酸序列；
18.从选自以下群体的基因组多核苷酸序列获得的内含子：
a)在序列号23全部编码区域上与序列号23的编码区域具有至少70％相同的基因组多核苷酸序列；
b)在序列号23全部编码区域上与序列号23的编码区域具有至少80％相同的基因组多核苷酸序列；
c)在序列号23全部编码区域上与序列号23的编码区域具有至少90％相同的基因组多核苷酸序列；以及
d)在序列号23全部编码区域上与序列号23的编码区域具有至少95％相同的基因组多核苷酸序列；
19.从选自以下群体的基因组多核苷酸序列获得的内含子：
a)在序列号27全部编码区域上与序列号27的编码区域具有至少70％相同的基因组多核苷酸序列；
b)在序列号27全部编码区域上与序列号27的编码区域具有至少80％相同的基因组多核苷酸序列；
c)在序列号27全部编码区域上与序列号27的编码区域具有至少90％相同的基因组多核苷酸序列；以及
d)在序列号27全部编码区域上与序列号27的编码区域具有至少95％相同的基因组多核苷酸序列；
20.包含至少一种如权利要求1-19所述的多核苷酸序列的重组DNA构建体。
21.根据权利要求20所述的重组DNA构建体，其中所述的多核苷酸序列是一段内含子序列。
22.根据权利要求21所述的重组DNA构建体，其中所述的内含子序列的方向选自正义和反义方向。
23.一种含有权利要求20所述的DNA构建体的植物细胞。
24.一种包括权利要求24所述细胞的植物。
25.一种修饰植物细胞内脂肪酸成分的方法，所述的方法包括：
用权利要求21所述的构建体转化一个植物细胞，和
在启动所述的多核苷酸序列转录的条件下培植所述细胞，
由此改变了所述细胞的所述脂肪酸成分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的改变选自增加油酸，降低亚麻酸以及降低亚油酸。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述的多核苷酸序列是一段内含子序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的内含子序列的方向选自正义和反义方向。
29.一种通过权利要求25所述的方法产生的植物细胞。
30.一种抑制植物细胞内基因表达的方法，包括以下步骤：
用含有被抑制基因的非编码区在正义方向被占位的DNA构建体转化植物细胞；以及
在启动所述的非编码区域转录的条件下培植所述细胞，由此抑制所述基因的表达。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的非编码区域选自内含子、启动子区域、5’非翻译区以及这些序列的某些部分。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述的非编码区域选自以下群体：序列号2、序列号24、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号25、序列号26、序列号28和序列号29。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述的基因编码去饱和酶。
34.一种抑制植物细胞内去饱和酶表达的方法，包括以下步骤：
用含有编码去饱和酶基因的非编码区在反义方向被占位的DNA构建体转化一个植物细胞；以及
在启动所述的非编码区域转录的条件下培植所述细胞，由此抑制所述的去饱和酶表达。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的非编码区域选自内含子、启动子区域、5’非翻译区和这些序列的某些部分。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述的非编码区域选自以下群体：序列号2、序列号24、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号25、序列号26、序列号28和序列号29。
37.一种根据权利要求34所述方法产生的植物细胞。
38.根据权利要求37所述的植物细胞，其中所述的细胞包括含有至少大约80-85％的油酸、不超过大约1-2％的亚油酸和不超过大约1-3％的亚麻酸的油成分。
39.根据权利要求37所述的植物细胞，其中所述的细胞包括含有至少大约50-75％的油酸、不超过大约10-30％的亚油酸和不超过大约1-3％的亚麻酸的油成分。
40.一种修饰植物细胞内脂肪酸成分的方法，包括以下步骤：
用含有编码去饱和酶基因的非编码区域在正义或反义方向被占位的DNA构建体转化植物细胞；以及
在启动所述的非编码区域转录的条件下培植所述的细胞，由此抑制所述的去饱和酶的表达。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述的非编码区域选自内含子、启动子区域、5’非翻译区和这些序列的某些部分。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述的非编码区域选自以下群体：序列号2、序列号24、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号25、序列号26、序列号28和序列号29。
43.一种根据权利要求40所述方法产生的植物细胞。
44.根据权利要求43所述的植物细胞，其中所述的细胞包括含有至少大约80-85％的油酸、不超过大约1-2％的亚油酸和不超过大约1-3％的亚麻酸的油成分。
45.根据权利要求43所述的植物细胞，其中所述的细胞包括含有至少大约50-75％油酸、不超过大约10-30％的亚油酸和不超过大约1-3％的亚麻酸的油成分。
46.一种抑制植物细胞内去饱和酶表达的方法，包括以下步骤：
用含有能结合或切除编码去饱和酶基因非编码区的核酸序列的构建体转化一个植物细胞；以及
在启动所述的核酸序列转录的条件下培植所述的细胞，由此抑制所述的去饱和酶的表达。
47.一种根据权利要求46所述的方法产生的植物细胞。
48.一种含油种子成分，包括：
至少大约50-75％的油酸，不超过大约10-30％的亚油酸和不超过大约1-3％的亚麻酸。
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