KR101424154B1 - 신규한 ＣｖＦａｔＢ１ 유전자 및 팔미트산 생합성에서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Cuphea viscosissima로 부터 분리한 신규한 CvFatB1 및 이를 형질전환한 식물체의 팔미트산 함량 증가 효과에 관한 것으로, 상기 신규한 CvFatB1 유전자로 형질전환된 형질전환 식물체의 종자에서 팔미트산 함량이 향상되었으며 이와 같은 형질이 T2 세대에서 더욱 증강되었으므로 상기 형질전환체의 종자를 팔미트산의 생산에 이용할 수 있다.

Description

신규한 ＣｖＦａｔＢ１ 유전자 및 팔미트산 생합성에서의 이의 용도{CvFatB1 gene and their uses in palmitic acid biosynthesis}
블루 왁스위드(blue waxeed: Cuphea viscosissima)로부터 분리한 신규한 CvFatB1 및 이를 형질전환한 식물체의 팔미트산 함량 증가 효과에 관한 것이다.
식물 오일은 다양하게 사용된다. 신규한 식물성 오일 조성물(vegetable oil compositions)과 생합성 기원 또는 천연 식물 기원으로부터 오일 조성물을 얻기 위한 개선된 접근법이 요구된다. 의도하는 오일 용도에 따라, 여러 다른 지방산 조성물들이 요구된다. 식물, 특히 종자에서 다량의 오일을 합성하는 식물 종들은 식용 및 산업용 모두에 중요한 오일 공급원이다. 종자 오일은 글리세롤의 세 개의 히드록시기가 지방산들로 에스테르화된 트리아실글리세롤로 거의 대부분 구성된다.
고등식물은 일반적 대사 경로-색소체(plastid)에 존재하는 지방산 합성효소(FAS) 경로-를 통하여 지방산을 합성한다. β-케토아실-ACP 합성효소는 식물 세포의 FAS에서 중요한 속도 결정 효소이며, 몇 종류가 존재한다. β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ은 팔미토일-ACP(C16:0)에 사슬 연장을 촉매하는 반면, β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ는 스테아로일-ACP(C18:0)에 사슬 연장을 촉매한다. β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅳ는 β-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ의 변형체이고, 또한 18:0-ACP에 사슬 연장을 촉매할 수 있다. 대두에서, FAS의 주된 산물은 16:0-ACP와 18:0-ACP이다. 18:1-ACP를 형성하기 위한 18:0-ACP의 탈포화(desaturation)는 색소체에 위치한 가용성 Δ-9 탈포화효소(또한, "스테아로일-ACP 탈포화효소"로 언급됨)에 의하여 촉매된다 (Voelker 등, 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 335~61. 2001). 색소체성 FAS 및 Δ-9 탈포화효소의 산물인 16:0-ACP, 18:0-ACP 및 18:1-ACP는 특이적 티오에스테라아제(FAT)에 의하여 가수분해된다. 식물 티오에스테라아제는 서열 상동성(homology)과 기질 편향성에 따라 두 유전자 패밀리로 분류될 수 있다. 첫 번째 패밀리인 FATA는 주로 18:1-ACP에 대해 활성을 갖는 긴 사슬 아실-ACP 티오에스테라아제를 포함한다. 두 번째 패밀리 효소인 FATB는 일반적으로 16:0-ACP(팔미토일-ACP), 18:0-ACP(스테아로일-ACP) 및 18:1-ACP(올레오일-ACP)를 이용한다. 이러한 티오에스테라아제들은 식물에서의 신생 지방산 생합성 동안 사슬 길이를 결정하는데 중요한 역할을 하며, 이러한 효소들은 지방산 아실 조성, 특히 종자 저장 오일에 존재하는 여러 지방산 아실그룹의 상대적 비율에 대해 여러 가지 변형을 제공하는데 유용하다.
FATA와 FATB 반응의 산물인 유리 지방산은 색소체를 떠나, 그들 각각의 아실-CoA 에스테르들로 전환된다. 아실-CoA들은 소포체(ER)에 존재하는 지방-생합성 경로(Kennedy Pathway)의 기질이다. 이 경로는 종자 오일을 구성하는 트리아실글리세롤의 생합성 및 막 지질 형성에 관여한다. ER에는 18:1을 다중불포화 지방산으로 더 탈포화시킬 수 있는 추가적인 막결합 탈포화효소가 존재한다. Δ-12 탈포화효소(FAD2)는 이중결합을 18:1내로 도입하여 리놀레산(18:2)의 형성을 촉매한다. Δ-15 탈포화효소(FAD3)는 이중결합을 18:2내로 도입하여 리놀렌산(18:3)의 형성을 촉매한다.
팔미트산(palmitic acid, C16:00)은 CH3(CH2)14COOH. C16H32O2.분자량 256.43. 탄소수 16의 포화 곧은 사슬 지방산. 스테아린산, 올레인산과 같이 가장 널리 유지계에 분포하고 있는 지방산이다. 명명의 유래이기도 한 팜유에서는 구성지방산의 35~40%를, 면실유에서는 20%를 차지하고 있다. 특히 목랍, 종려유,시나랍에 많고 고급 알코올과 결합하여 여러 종의 납에 포함된다. 팔미트산을 포함하는 트리아실글리세롤은 트리팔미틴이라고 한다. 모든 생물은 팔미트산의 합성능력을 가지고 있으며 동물에서는 간, 젖샘 등이, 식물에서는 엽록체의 스트로마가 높은 합성효소활성을 한다. 미토콘드리아의 효소계에서 활성화하며 팔미틸 CoA가 되고 β산화되어 시트르산회로를 거쳐 완전산화된다.
팔미트산은 세제류, 화장품류, napalm(고체석유), 이형제(release agent, 離形製)에 많이 이용되고 있는 산업적 이용 가치가 높은 지방산으로 국내 생산이 전무하여 현재 전량 수입하고 있는 실정이다.
현재에는 많은 복잡한 생화학적 경로들이 일반적으로 단일 유전자의 억제 또는 과발현에 의하여 유전학적으로 조작되고 있다. 식물 유전자 조작의 잠재력에 대한 추가적 개발은 경로에서 여러 유전자의 동조적 조작을 요구할 것이다. 한 식물에서 형질전환유전자들(transgenes)을 결합하기 위하여, 성교배, 재형질전환(retransformation), 동시형질전환(cotransformation) 및 연결된 형질전환유전자들의 사용을 포함하는 다양한 접근법들이 사용되어 왔다. 연결된 부분적 유전자 서열들을 갖는 키메릭 형질전환유전자는 많은 식물성 내생적 유전자를 동조적으로 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 다수의 코딩 유전자들을 식물 세포에 동시에 도입하기 위하여 바이러스성 폴리단백질상에 만들어진 구조물이 사용될 수 있다 (Halpin 등, Plant Mol. Biol. 47:295~310. 2001).
따라서, 원하는 식물 표현형은 하나 이상의 유전자들의 발현 및 다른 유전자 또는 유전자들의 발현의 동시 감소가 필요할 수 있다. 따라서, 단일 형질전환유전자 구조물을 사용하여, 식물에서 하나 이상의 유전자들의 과발현과 다른 유전자 또는 유전자들의 발현 억제 또는 하향-조절의 동시 발생을 위한 필요성이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 팔미트산 생산 함량을 증진시키기 위한 유전자를 탐색하였으며, 신규한 CvFatB1 유전자를 발굴하였다. 따라서, 이를 이용한 팔미트산 함량 증가 종자는 고부가성 유지작물 개발에 기여할 것이며, 국내 재배 가능 유지작물에서 팔미트산 생산이 가능하게 되어 해당 제품의 생산비 절감 및 농가 소득 제고에 기여하게 될 것이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 팔미트산 생산에 이용되는 CvFatB1 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 팔미트산 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 팔미트산 생산에 이용되는 CvFatB1 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 팔미트산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 CvFatB1 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체의 T1 종자 및 T2 종자에서 팔미트산의 함량이 증가하였으므로 이를 팔미트산의 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 NCBI에 등록된 Cuphea 속 12종의 FatB 유전자의 아미노산과 DNA sequences의 alignment 분석 결과를 나타내는 도이다;
파란색 네모 박스: 상동성이 높은 부위.
도 2는 CvFatB1 유전자 분리 과정에서의 RNA 및 DNA를 확인한 아가로오스 젤 사진이다;
(A)는 Cuphea viscosissima의 미숙종자에서 총 RNA를 분리하여 확인한 사진이다; 및
(B)는 PCR반응으로 분리한 CvFatB1 유전자를 확인한 사진이다.
도 3은 Cuphea viscosissima 유래의 CvFatB1 유전자 염기서열과 추정 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 4는 CvFatB1 유전자 염기서열정보를 NCBI에 등록한 것을 나타내는 도이다.
도 5는 CvFatB1 유전자 함유 식물형질전환용 재조합 벡터를 나타내는 도식이다.
도 6은 CvFatB1 유전자 함유 애기장대 형질전환체(T2)에서의 서던 분석을 나타낸 도이다.
도 7은 CvFatB1 함유 애기장대 형질전환체에서 세대진전에 따른 지방산 조성 변화를 나타낸 그래프이다;
(A): C16:0 함량;
(B): C18:0 함량;
(C): C18:1 함량;
(D): C18:2 함량;
(E): C18:3 함량; 및
화살표: 함량 변화의 일반적 추이.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 팔미트산 생산에 이용되는 CvFatB1 유전자를 제공한다.
상기 유전자는 블루 왁스위드(blue waxeed: Cuphea viscosissima)로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 팔미트산 생합성 증진용인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되고 CvFatB1 유전자의 5' 말단 앞에 CaMV 35S 프로모터가 위치하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CvFatB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 pCAMBIA 3300 재조합 벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 5에 기재된 pCAM3300-35SCvFatB1 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 CvFatB1 유전자 발현에 의해 종자 내의 팔미트산 함량이 증가한 것이 바람직하며, T1 종자가 더욱 바람직하고, T2 종자가 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물체는 애기장대 또는 유지식물(oil plant)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 유지식물은 씨나 열매에서 기름을 얻는 식물이 바람직하며, 참깨, 유채, 해바라기, 아주까지, 땅콩, 콩, 코코야자, 기름야자 및 호호바로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 및 식물체 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물체이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 아그로박테리움-매개 형질 감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 바스타 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
(1) 상기 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 팔미트산 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;
(3) 상기 단계 (3)에서 선발한 계통을 T2 세대로 전개하는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3)의 T2 세대의 종자로부터 팔미트산을 수득하는 단계를 포함하는 팔미트산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Cuphea viscosissima로부터 신규한 FatB1 유전자를 분리하고 이를 CvFatB1로 명명하였으며 (도 3 및 4 참조), 상기 유전자를 포함하는 pCAM3300-35SCvFatB1 벡터를 제작하여 (도 5 참조) CvFatB1 유전자를 형질전환한 애기장대를 제작하였다. 제작한 형질전환 애기장대의 T1 종자에서의 팔미트산 함량이 대조구 (8 mol%)에 비해 150% 증가 (12 mol%)하는 것을 확인하였으며 (표 2 참조), 형질전환 애기장대의 T2 종자에서의 팔미트산 함량 (16 mol%)이 T1세대 보다도 더 증가함을 확인하였다 (표 3 및 및 7 참조).
따라서, 본 발명의 신규한 CvFatB1 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체는 팔미트산 함량이 유의적으로 증가하며, 이와 같은 형질이 T2 종자에서 더욱 증강되므로, 이를 팔미트산 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> CvFatB1 유전자 분리
<1-1> 프라이머 설계
본 발명자들은 Cuphea 속의 FatB 유전자 특이적인 프라이머를 설계하였다.
구체적으로, NCBI에 등록되어 있는 Cuphea 속 12종의 FatB 유전자 정보를 확보하여 유전자분석프로그램인 DNASTAR (7.0ver)의 alignment 소프트웨어프로그램을 이용하여 아미노산간 그리고 DNA 서열간 상동성이 높게 나타난 부위를 조사한 뒤 (도 1), 공통 부위의 DNA 서열을 FatB 특이 반응 프라이머로 설계하였다 (표 1).
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 서열
3 FatB-S 5’-GTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGT-3’
4 FatB-AS 5’-ACGTGCTGATTGACATCCAAGTCATTCCAC-3’
<1-2> Cuphea viscosissima 유래 FatB1 유전자 분리
본 발명자들은 실시예 <1-1>의 프라이머를 이용하여 Cuphea viscosissima로부터 FatB1 유전자를 분리하였다.
구체적으로, Cuphea viscosissima의 미숙 종자를 재료로 식물 RNA 분리 TRIZOL 시약 (Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하여 아가로오스 젤로 이를 확인하였으며 (도 2A), 이 중에서 DynabeadsmRNA Purification Kit (Invitrogen)를 이용하여 mRNA를 분리한 후, GeneRacerTM Kit (Invitrogen)을 이용하여 5’-캡 구조를 가진 5‘말단-cDNA 또는 3‘폴리 A tail를 가진 3’말단-cDNA를 제조하였다. 그 후, FatB 특이 반응 프라이머 (서열번호 3 및 4)를 이용하여 RACE-PCR 반응을 통해 유전자 일부를 분리하였다. 염기서열분석을 통해 분리된 유전자의 ORF (open reading frame)에 해당되는 프라이머를 제작하여 PCR로 유전자를 분리하고 아가로오스 젤로 분리된 유전자를 확인하였다.
그 결과, Cuphea viscosissima 유래 FatB1 유전자를 분리하고 이를 CvFatB1로 명명하였다 (도 2B).
<1-3> CvFatB1 유전자 서열 확인
본 발명자들은 상기 실시예 <1-2>에서 분리한 Cuphea viscosissima 유래 CvFatB1 유전자의 염기서열을 확인하였다.
구체적으로, PCR반응에 의해 분리된 유전자 단편을 pGEM-TA-클로닝 키트 (Promega)를 이용하여 유전자를 pGEM-T-easy 벡터로 옮긴 후, 시퀀싱을 하여 유전자 염기서열 정보 (서열번호 1)를 획득한 뒤, 이를 토대로 아미노산 서열 (서열번호 2)을 추정하였다 (도 3).
또한, 상기 유전정보를 BlastX로 검색한 결과, 엽록체내에서 지방산 사슬 연장을 중단시키는 지방산(Fatty acid) 티오에스터라제(thioesterase) 유전자들과 상동성이 높은 것을 알 수 있었으며, 상기 신규한 CvFatB1 유전자의 유전정보를 NCBI에 등록하여 등록번호(Accession no) GU225692를 부여받았으며, 2012년 12월 24일에 유전정보가 공개되었다 (도 4).
< 실시예 2> CvFatB1 유전자 기능 검정
<2-1> CvFatB1 형질전환 애기장대 T1 제작
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 CvFatB1 유전자의 기능을 확인하기 위하여 벡터를 제작하여 형질전환 식물체를 제조하였다.
구체적으로, CvFatB1 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제작하기 위하여, 제초제 저항성 Bar 유전자가 들어간 pCAMBIA 3300을 기본벡터로 이용하였고, 전신발현 CaMV 35S 프로모터를 CvFatB1 유전자의 5‘- 말단 앞에 오도록 벡터 pCAM3300-35SCvFatB1를 설계하였다 (도 5). 그 후, 식물형질전환을 위해서 제작한 벡터 pCAM3300-35SCvFatB1를 아그로박테리움 EHA105에 형질전환한 뒤, 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. Colombia)에 플로럴 디핑(floral dipping) 방법으로 형질전환하였다. 형질전환체에서 얻어진 종자를 파종한 후 본엽 2매를 가진 유묘기에 0.3% 바스타 제초제를 살포하여 살아남은 개체를 이식하여 CvFatB1 유전자 형질전환 애기장대를 제작하였다.
<2-2> CvFatB1 형질전환 애기장대 T1 종자에서의 팔미트산 함량 확인
본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 형질전환 애기장대의 T1 종자에서의 팔미트산 함량을 확인하였다.
구체적으로, CvFatB1 유전자 함유 애기장대 형질전환체를 총 23개체 획득하여 T1종자에서 지방산 분석을 수행한 결과 8 계통에서 팔미트산(C16:0) 함량이 증대되는 것이 관찰되었다. 특히, 6번 계통과 16번 계통에서 팔미트산 함량이 12.1%로 가장 높게 나타났다. 포화지방산 함량을 살펴보면 팔미트산 함량이 증가한 8 계통 모두 대조구에 비해 포화지방산 함량이 증가됨을 알 수 있었으며, 팔미트산 함량이 높았던 6번 계통과 16번 계통에서 포화지방산 함량이 대조구 13.9%에 비해 17.6%로 약 3.7% 증가되었음을 알 수 있었다 (표 2).
즉, 이러한 결과를 통해 포화지방산인 팔미트산 함량이 증가됨에 따라 다른 포화지방산이 감소된 것이 아닌 불포화지방산 함량이 감소되었음을 알 수 있었다.
계통번호 C12:0 C14:0 C16 :0 C18:0 C18:1 C18:2 18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C22:1 포 화
지방산		 불포화
지방산
대조구 0.1 0.1 7.9 3.1 15.1 30.3 18.5 2.1 20.1 0.4 2.0 13.9 86.4
1 0.0 0.1 9.4 3.0 15.8 29.6 18.2 2.0 19.4 0.3 1.8 14.9 85.1
2 0.0 0.1 8.0 2.6 17.4 32.4 15.8 2.0 19.1 0.4 2.0 13.0 87.0
3 0.0 0.1 10.7 3.2 14.0 29.6 18.3 2.1 19.7 0.4 1.8 16.5 83.5
4 0.0 0.1 7.5 2.9 16.4 31.1 16.9 2.0 20.6 0.4 2.0 12.8 87.2
5 0.0 0.1 7.3 2.7 17.5 31.4 16.3 1.8 20.4 0.3 2.0 12.2 87.8
6 0.1 0.1 12.1 3.0 13.8 30.0 17.4 2.0 19.2 0.3 1.8 17.6 82.4
7 0.1 0.1 7.6 2.8 14.9 31.7 18.0 2.1 20.0 0.4 2.1 13.0 87.0
8 0.1 0.0 7.3 2.7 16.8 31.3 12.0 1.9 25.2 0.3 2.1 12.3 87.7
9 0.1 0.1 11.3 3.1 13.2 29.4 18.9 2.2 19.3 0.4 1.9 17.2 82.8
10 0.1 0.1 9.0 3.1 14.5 28.8 19.2 2.0 20.7 0.3 1.9 14.6 85.4
11 0.1 0.0 7.8 3.3 15.1 29.7 18.7 2.0 20.5 0.3 2.1 13.4 86.6
12 0.1 0.1 7.7 3.1 15.5 29.3 18.4 2.0 21.2 0.3 2.0 13.3 86.7
13 0.1 0.1 7.9 3.3 14.8 29.5 19.2 2.0 20.5 0.4 1.9 13.8 86.2
14 0.1 0.1 7.9 3.2 13.4 29.1 20.4 2.1 21.0 0.3 2.0 13.8 86.2
15 0.2 0.0 7.9 3.3 14.3 29.6 19.2 2.0 21.1 0.3 1.9 13.6 86.4
16 0.1 0.1 12.1 3.3 13.5 28.3 18.5 1.9 19.9 0.3 1.7 17.9 82.1
17 0.1 0.1 7.9 3.4 15.2 29.5 18.4 2.1 20.8 0.3 2.0 13.8 86.2
18 0.1 0.0 7.7 3.3 15.2 29.5 18.5 2.1 21.0 0.4 2.0 13.5 86.5
19 0.1 0.1 7.5 3.5 15.9 29.5 17.9 2.0 20.9 0.3 2.0 13.5 86.5
20 0.2 0.1 8.5 3.1 15.5 29.6 18.0 1.9 20.5 0.5 1.9 14.2 85.8
21 0.2 0.1 8.1 3.3 14.1 29.3 19.4 2.1 20.7 0.3 1.9 14.1 85.9
22 0.1 0.0 7.6 2.7 16.3 30.2 18.4 2.0 20.0 0.3 2.0 12.8 87.2
23 0.1 0.1 8.3 2.8 16.6 29.8 17.6 2.0 20.1 0.3 1.9 13.7 86.3
<2-3> CvFatB1 형질전환 애기장대 T2 종자에서의 팔미트산 함량 확인
본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 형질전환 애기장대의 T2 종자에서의 팔미트산 함량을 확인하였다.
구체적으로, 팔미트산 함량이 증가한 8 계통 중 6 계통을 선발하여 T2세대를 전개하였다. 먼저 각 계통별 CvFatB1 유전자가 들어간 카피(copy)수를 조사하고자 서던(southern) 분석을 실시하여 1번 계통은 2 카피, 3번 계통은 4 카피, 6번 계통은 1 카피, 9번 계통은 1 카피, 10번 계통은 3 카피, 16번 계통은 6 카피가 있음을 확인하였다 (도 6). 그 후, CvFatB1유전자가 함유된 애기장대 형질전환체 T2 종자에서 지방산 조성을 분석하였다.
그 결과, 팔미트산(C16:0)함량을 보면 1계통에서 평균 9.5%였으며 이 중 1-5개체에서 11.3%로 가장 높았다. 3 계통에서는 평균 10.6%였고 이 중 3-18개체에서 15.7%로 가장 높았다. 6 계통에서는 평균 12.3%였으며, 이 중 6-4개체에서 13.6%로 가장 높았다. 9 계통에서 평균 10.5%였으며, 이 중 9-5개체에서 12%로 가장 높았다. 10 계통에서는 평균 8.1%였으며 이 중 10-19개체에서 9.2%로 가장 높았다. 16 계통에서는 평균 11.8%였으며, 이 중 16-7개체에서 12.6%로 가장 높았다. 스테아르산(C18:0) 함량을 보면 대조구(3.0%)와 비교하였을 때 10 계통의 경우 3.1%로 대조구와 같은 반면, 나머지 계통에서는 대체적으로 평균 3.4%로 대조구에 비해 0.4% 증가하였으며, 이 중 6 계통은 3.6%로 다른 계통에 비해 함량이 약간 더 증가하는 경향을 보였다. 올레인산(C18:1)의 함량 변화를 살펴보면 대조구(14.2%)에 비해 10 계통(14.4%)을 제외한 나머지 계통에서는 전반적으로 함량이 감소하였으며, 특히 16 계통의 경우 올레인산 함량이 11.1%로 가장 낮았다. 리노레산(C18:2)과 리놀렌산(C18:3)의 함량 변화를 살펴보면 대조구와 비교하였을 때 모든 계통에서 함량 변화가 거의 없는 것으로 관찰되었다. 이 외의 다른 지방산 조성(C16:1, C20:0, C20:1, C22:0, C22:1)에서도 대조구와 비교하였을 때 모든 계통에서 함량 변화가 없는 것으로 나타났다 (표 3 및 도 7). 이러한 결과를 통해서 CvFatB1 유전자는 팔미트산(C16:0) 생성에만 영향을 미치는 C16:0-티오에스터라제(thioesterase) 임을 확인 할 수 있었다.
Figure 112013023634837-pat00001
Figure 112013023634837-pat00002
Figure 112013023634837-pat00003

< 실시예 3> 계통별 내 세대진전에 따른 팔미트산 조성 변화 확인
본 발명자들은 상기 제작된 CvFatB1 유전자 형질전환 애기장대의 계통별 내 세대진전에 따른 팔미트산(C16:0) 지방산 조성 변화를 확인하였다.
구제척으로, 계통별 T1종자에서의 지방산 조성별 함유량과 T2종자에서의 지방산 조성별 평균 함유량을 비교 분석한 결과, 팔미트산 함량이 가장 많이 증가된 6 계통의 경우 T1 종자에서 그 함량이 12.1%였으나, 6-4개체의 T2종자에서 그 함량이 13.6%로 약 1.5% 더 증가된 것을 알 수 있었다. 후대 계통별 개체 중 팔미트산 함량이 가장 높게 나타난 개체는 3-18로 그 함량이 15.7%였다. 3 계통의 T1종자에서 그 함량이 10.7%인 것에 비해 T2세대에서 그 함량이 5%까지 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (표 4 및 도 7).
Figure 112013023634837-pat00004
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Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 팔미트산 생산에 이용되는 CvFatB1 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 Cuphea viscosissima로부터 분리된 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 제 1항의 유전자로부터 유추되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
  4. 제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 팔미트산 생합성 증진용인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되고 CvFatB1 유전자의 5' 말단 앞에 CaMV 35S 프로모터가 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 식물체는 CvFatB1 유전자 발현에 의해 종자 내의 팔미트산 함량이 증가한 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대 또는 유지식물(oil plant)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 유지식물은 참깨, 유채, 해바라기, 아주까리, 땅콩, 콩, 코코야자, 기름야자 및 호호바로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  11. (1) 제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
    (3) 바스타 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법.
  12. (1) 제 7항의 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 팔미트산 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계;
    (3) 상기 단계 (3)에서 선발한 계통을 T2 세대로 전개하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)의 T2 세대의 종자로부터 팔미트산을 수득하는 단계를 포함하는 팔미트산 생산 방법.
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