WO2016076588A1 - 지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016076588A1
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fatty acid
plant
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recombinant expression
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PCT/KR2015/012014
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노경희
강한철
김종범
김현욱
이경렬
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대한민국(농촌진흥청장)
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Definitions

  • the present invention is a rapeseed ( Brassica) napus ) and a promoter for inducing high expression of a gene involved in fatty acid metabolism and its use.
  • the fats and oils contained in the plant are mainly composed of 16 or 18 fatty acid carbon chains, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. ) Is a mixture. Plant oils such as these are well decomposed, have excellent productivity, and have excellent lubricity, and thus are widely used as raw materials for cooking oil, biodiesel, lubricants, detergents, etc. and have high added value.
  • rapeseed Brassica napus
  • Palmitoyl Protein thioesterase Palmitoyl Protein thioesterase
  • Seeds of plants transformed with transgenic carriers containing the BnPPT promoter have increased fatty acid content as the genes involved in fatty acid metabolism increase, so that basic research on fatty acid metabolism regulation and practical value-added specific fatty acid content increase. It is expected that the BnPPT promoter will be very useful when doing this.
  • An object of the present invention is a rapeseed represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( Brassica napus ) to provide a promoter that induces increased fatty acid content in plant seeds.
  • the gene of SEQ ID NO: 1 is PPT (Palmitoyl Protein thioesterase) derived from rapeseed, and in this specification, the gene of SEQ ID NO: 1 will be abbreviated as "BnPPT”.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the promoter and a nucleotide sequence encoding the target protein operably linked with the promoter.
  • Another object of the present invention is to provide a microorganism transformed with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a plant transformed with the microorganism.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • the present invention is a rapeseed represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 ( Brassica napus ) provides a promoter that induces increased fatty acid content in plant seeds.
  • the promoter is Brassica napus ) is a BnPPT (Palmitoyl Protein thioesterase) promoter.
  • the promoter may be to induce the expression of a fatty acid biosynthetic gene, but is not limited thereto.
  • the fatty acid may be selected from the group consisting of palmitic acid (C16: 0) and stearic acid (C18: 0), but is not limited thereto.
  • a promoter is a gene region generally located upstream of a coding region that includes a point of initiation of transcription.
  • the promoter of the present invention affects gene expression in response to TATA boxes, CAAT box regions, and external stimuli that regulate gene expression. Notes include enhancers that promote expression of almost all genes, regardless of site, location and orientation.
  • the promoter of the present invention is characterized by specifically inducing expression only in plant seeds, and its expression may be constant and may be temporary depending on the environment of growth, night / day, temperature, season, and the like.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence encoding a target protein operably linked with the promoter.
  • the recombinant expression vector is preferably pCAMBIA3300-pBnPPT, but is not limited thereto.
  • the expression vector is a vector capable of expressing a target protein or a target RNA in a host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • Expression vectors include expression control sequences and signal or leader sequences for membrane targeting or secretion and can be prepared in a variety of ways.
  • An expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell.
  • Such regulatory sequences include promoters for conducting transcription, any operator sequence for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • the expression vector may comprise a selection marker for selecting a host cell comprising the vector, and in the case of a replicable expression vector, may comprise the origin of replication.
  • the recombinant expression vector of the present invention may include a nucleotide sequence encoding various proteins known in the art, the nucleotide sequence encoding the target protein is operably linked to the promoter. Operationally linked means that one nucleic acid fragment is associated with another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by another nucleic acid fragment.
  • the protein of interest according to the invention can be any target protein of external origin, ie exogenous protein or endogenous protein and reporter protein, which is to be expressed specifically by plant seed by the promoter of the invention.
  • the exogenous protein refers to a protein that does not naturally exist in a specific tissue or cell of the plant
  • the endogenous white matter refers to a protein expressed by a gene naturally present in a specific tissue or cell.
  • the reporter protein is a protein expressed by the reporter gene and refers to a labeling protein that indicates its activity in the cell by its presence.
  • Proteins of interest include antibiotic resistant proteins, herbicide resistant proteins, viral resistant proteins, pest resistant proteins, metabolic related proteins, luminescent proteins, green fluorescence proteins (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), and ⁇ -galactosidase (GAL). It is not limited to this.
  • An expression vector according to the present invention can be prepared by inserting a promoter of the present invention using a conventional vector used for protein expression as a backbone and inserting a nucleotide sequence encoding a target protein downstream of the promoter.
  • the existing vector used for the expression of the protein may be a recombinant expression vector for plant transformation, which may be used for the production of a transgenic plant, in particular as a known recombinant expression vector. Examples include E. coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, plasmid vectors such as yeast-derived plasmids and Ti plasmids, cosmid vectors, bacteriophage vectors and viral vectors, and the like.
  • a binary vector or cointegration vector can be used.
  • a wide variety of binary vectors are widely used in plant transformation, and almost all binary vectors are available at international centers and university laboratories such as the Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia (CAMBIA). It is available.
  • pCAMBIA3300-pBnPPT a synthetic expression vector
  • pCAMBIA3300 containing herbicide-resistant Bar gene as a base vector.
  • the present invention also provides a microorganism transformed with the recombinant expression vector.
  • the microorganism is Escherichia coli), Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus mirabilis ), Staphylococcus , Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium) tumefaciens ) and Agrobacterium rhizogene ( Agrobacterium rhizogene ) is preferably, but not limited to.
  • Recombinant expression vectors comprising a promoter of the present invention and a base sequence encoding a protein of interest linked to the promoter can be introduced into a host using methods known in the art. For example, calcium chloride and heat shock, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporaion, PEG-hawk fusion, microinjection Method, micro-injection method, liposome mediated method and vacuum infiltration method, and the like.
  • the present invention provides a plant transformed with the microorganism.
  • the plant is preferably selected from the group consisting of Arabidopsis, rapeseed, perilla, soybean, cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot, but not limited thereto. Do not.
  • Recombinant expression vectors according to the present invention can be introduced into plants using methods known in the art.
  • Agrobacterium sp. Mediated method, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporaion, PEG -The method of fusion, microinjection, microinjection, liposome mediation, vacuum infiltration and dipping may be used, but is not limited thereto.
  • the method according to Agrobacterium sp. And methods exemplified in the literature can be used (Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ. 4: 227-288, 1985).
  • the present invention is a.
  • step (2) provides a method for increasing fatty acid content in plant seeds, comprising selecting a strain having increased fatty acid content in the T1 seed of step (1).
  • Rapeseed (Brassica according to the present invention Plant seed-specific Palmitoyl Protein Thioesterase (BnPPT) promoter derived from napus ) has a 1.9-fold increase in promoter expression efficiency compared to CaMV35S promoter, which is widely used, and three seed-specific expression promoters (BnNapin, Bn12S, and BnVPE) derived from rapeseed. It was found to be about 5.1 times higher (FIG. 4).
  • BnPPT Plant seed-specific Palmitoyl Protein Thioesterase
  • BnPPT promoter is particularly effective in inducing high expression of fatty acid biosynthetic genes and increasing saturated fatty acid content in plant seeds.
  • Saturated fatty acid is a basic material for the production of industrial processed oils (detergents, engine oils, etc.), which has a wide range of industrial applications, and thus high demand in industrial sites.
  • the BnPPT promoter is expected to contribute not only to the saturated fatty acid but also to the increase in the content of unsaturated fatty acids. As a result, the BnPPT promoter can be very useful for producing high value-added fatty acid crops. Seems to be high.
  • Rapeseed of the present invention (Brassica napus ) -derived plant seed-specific promoters induce high expression of fatty acid biosynthetic genes in plants, so that the seeds of plants transformed with recombinant expression vectors containing the same increase in fatty acid content, thereby regulating fatty acid metabolism. It can be usefully used for basic research and practical research to increase specific fatty acid content with high added value.
  • rapeseed Brassica napus ) isolates the BnPPT promoter from genomic DNA of leaves.
  • Figure 2 is a diagram showing the nucleotide sequence and cis-acting element (Cis-acting element) of the BnPPT promoter.
  • Figure 3 is a schematic diagram of a recombinant expression vector for plant transformation prepared according to the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the content of palmitic acid by promoter type.
  • Figure 5 is a diagram showing the change in the unsaturated degree and saturation ratio of fatty acids according to the content of palmitic acid by promoter type.
  • the inventors have used rapeseed ( Brassica) After extracting genomic DNA from the leaves of napus ), four libraries ( Dra I, EcoR V, Pvu II, Stu I) were prepared using Genome Walker TM Universal Kit.
  • For the library four kinds of primers Forward: 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3 ' ( SEQ ID NO: 2), Reverse: 5'-3-AGGATGTTCCAGGAGGGTACAAGTCAA' (SEQ ID NO: 3)
  • the results of the PCR reaction using, as shown in FIG. 1 Dra Gene fragments were amplified from the I library and the Pvu II library, respectively. Two amplified gene fragments were transferred to pGEM-T-easy vector to confirm their nucleotide sequence.
  • base sequence information of a BnPPT (Palmitoyl Protein Thioesterase) promoter corresponding to 1200 bp was obtained from the gene fragments derived from the Dra I library (SEQ ID NO: 1, FIG. 2). .
  • PlantCARE (Plant Cis acting regulatory element) database showed that there are six cis-acting elements in the sequencing, and the Skn-1 motif is involved in seed-specific expression of cis-acting elements. It can be seen that the BnPPT promoter has a function of seed-specific expression promoter.
  • Each of the five recombinant expression vectors was transformed into Agrobacterium EHA105 and Arabidopsis was used for assaying the promoter function in plants. thaliana cv. Colombia) was transformed by floral dipping. Thereafter, after seeding from the transformed Arabidopsis larvae, the seedlings with two main leaves were sprayed with 0.3% Basta herbicide, and the surviving individuals were transplanted into pots, and then planted in the plant growth room (22 ° C., 16 hours light condition). Seeds were harvested after three months of cultivation.
  • the expression rate of the CvFatB1 gene which is a fatty acid biosynthesis gene, was analyzed for the recombinant expression vector including the BnPPT promoter and the recombinant expression vector including the CaMV35S, BnNapin, Bn12S, and BnVPE promoters prepared in Example 3-1, respectively.
  • the BnPPT promoter maximized the expression rate of the CvFatB1 gene in the seed of the transgenic plant, compared to the previously developed rapeseed seed-specific expression promoters.

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Abstract

본 발명의 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이적 발현을 유도하는 프로모터에 관한 것으로, 구체적으로 식물 내 지방산 생합성 유전자의 고발현을 유도하여, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 함량이 증대되므로 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 유채(Brassica napus) 유래 지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 내에 포함되어 있는 유지는 탄소사슬 16개 또는 18개의 지방산을 주성분으로 하며 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)의 혼합물이다. 이와 같은 식물 유지는 자연분해가 잘되고 생산성이 뛰어나며 윤활성이 뛰어난 장점을 가지고 있어 식용유, 바이오디젤, 윤활유, 세제류 등 이용범위가 넓고 부가가치성이 높은 원료로 이용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 식물 종자 내에서 지방산 대사 관여 유전자의 고발현을 유도하는 프로모터를 탐색하였으며, 유채(Brassica napus)로부터 BnPPT(Palmitoyl Protein thioesterase) 프로모터를 분리하였다. BnPPT 프로모터를 포함하는 형질전환운반체로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 대사 관여 유전자가 고발현됨에 따라 지방산 함량이 증대되므로, 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구를 수행하고자 할 때 BnPPT 프로모터가 매우 유용하게 사용될 것으로 기대한다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자 내 지방산 함량 증대를 유도하는 프로모터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 유전자는 유채에서 유래한 PPT(Palmitoyl Protein thioesterase)로서, 본 명세서에서 상기 서열번호 1의 유전자를 "BnPPT"라고 약칭하기로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은,
(1) 상기 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은,
(1) 상기 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법을 제공하기 위한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자 내 지방산 함량 증대를 유도하는 프로모터를 제공한다.
상기 프로모터는 유채(Brassica napus)에서 유래한 BnPPT(Palmitoyl Protein thioesterase)프로모터이다.
상기 프로모터는 지방산 생합성 유전자의 발현을 유도하는 것일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
상기 지방산은 팔미트산(C16:0), 스테아릭산(C18:0)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
프로모터는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 본 발명의 프로모터는 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 프로모터는 식물 종자에서만 특이적으로 발현을 유도하는 특징이 있으며, 그 발현은 상시적일 수 있고 성장 정도, 밤/낮, 온도, 계절 등의 환경에 따라 한시적일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 재조합 발현 벡터는 pCAMBIA3300-pBnPPT인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 발현 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 발현 벡터는 발현 조절 서열 및 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있으며, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에는 당업계에 알려진 다양한 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결(operablylinked) 된다는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.
본 발명에 따른 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물 종자 특이적으로 발현시키고자 하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 식물체의 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의하여 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 목적 단백질은 항생제 저항성 단백질, 제초제 저항성 단백질, 바이러스 저항성 단백질, 해충 저항성 단백질, 대사 관련 단백질, 발광 단백질, GFP(green fluorescence 단백질), GUS(β-glucuronidase), GAL(β-galactosidase) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터는 공지의 재조합 발현 벡터로 특히 형질전환 식물체의 제조에 이용될 수 있는 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터일 수 있다. 그 예로는 대장균 유래 플라스미드, 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드, 효모 유래 플라스미드 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지벡터 및 바이러스 벡터 등일 수 있으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열 같은 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터는 CAMBIA(centerfor the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제 센터 및 대학 연구소에서 입수 가능하다.
본 발명의 일실시예에서는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되어 있는 pCAMBIA3300을 기본벡터로 이용하여 팔미트산 생합성에 관여하는 CvFatB1 유전자의 5‘-말단 앞에 BnPPT 프로모터를 융합함으로써 제조합 발현 벡터인 pCAMBIA3300-pBnPPT를 제조하였다(실시예 3 및 도 3).
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로 코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하며, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 숙주 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 및 열 쇼크법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법 및 진공침윤법 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 미생물로 형질전환된 식물체를 제공한다.
상기 식물은 애기장대, 유채, 들깨, 콩, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporaion), PEG-매게 융합법, 미세사출법, 미세주입법, 리포좀 매개법, 진공침윤법 및 화아침지법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않으나, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)매개에 의한 방법을 사용할 수 있으며 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985; An et al., EMBOJ. 4:227-288, 1985).
본 발명은
(1) 상기 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
(1) 상기 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이 BnPPT(Palmitoyl Protein Thioesterase) 프로모터는 일반적으로 널리 사용하고 있는 프로모터인 CaMV35S 프로모터와 유채에서 유래한 종자특이 발현 프로모터 3종(BnNapin, Bn12S, BnVPE)에 비하여 프로모터 발현 효율이 1.9~5.1배 가량 높은 것으로 나타났다(도 4).
또한, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 애기장대 형질전환체의 T1종자에서 지방산 분석을 수행한 결과, 모든 계통에서 포화지방산인 팔미트산(C16:0) 함량이 음성대조구인 비형질전환체에 비해 3.9~5.8배 증가하였으며, 스테아릭산(C18:0) 함량은 음성대조구에 비해 약 2배 증가하였음을 확인하였다(표 1).
이와 같은 결과는 BnPPT 프로모터가 특히 지방산 생합성 유전자의 고발현 유도 및 식물 종자 내 포화지방산 함량 증대에 우수한 효과가 있음을 시사한다.
포화지방산은 산업용 가공오일 (세제류, 엔진오일 등) 생산의 기본물질로서 산업적 이용범위가 넓어 산업현장에서의 수요가 높다. 또한 BnPPT 프로모터는 포화지방산뿐만 아니라 불포화지방산 함량 증대에도 기여할 것으로 예상되는 바, BnPPT 프로모터는 고부가성 지방산 작물 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 결과적으로 농가소득창출 및 품종로얄티로 인한 경제적 효과가 높을 것으로 보인다.
본 발명의 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자특이적 발현을 유도하는 프로모터는 식물 내 지방산 생합성 유전자의 고발현을 유도하여, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체의 종자는 지방산 함량이 증대되므로 지방산 대사 조절에 관한 기초 연구 및 부가가치성이 높은 특정 지방산 함량을 높이는 실용화 연구에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 유채(Brassica napus) 잎의 유전체 DNA로부터 BnPPT 프로모터를 분리하여 확인한 도이다.
도 2는 BnPPT 프로모터의 염기서열 및 시스작용요소(Cis-acting element)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따라 제작한 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터의 모식도이다.
도 4는 프로모터 종류별 팔미트산 함량을 나타낸 도이다.
도 5는 프로모터 종류별 팔미트산 함량에 따른 지방산의 불포화도 및 포화도 비율의 변화를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 유채( Brassica napus )로부터 유전자 분리
본 발명자들은 유채(Brassica napus) 잎에서 유전체 DNA를 추출한 후 Genome Walker™ Universal Kit를 이용하여 4종(DraI, EcoRV, PvuⅡ, StuI)의 라이브러리를 제작하였다. 4종의 라이브러리에 대해 프라이머 Forward: 5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’(서열번호 2), Reverse:5’-AGGATGTTCCAGGAGGGTACAAGTCAA-3’(서열번호 3)를 사용하여 PCR 반응을 한 결과, 도 1과 같이 DraI 라이브러리와 PvuⅡ 라이브러리로부터 유전자 단편이 각각 증폭되었다. 증폭된 2종의 유전자 단편을 pGEM-T-easy 벡터로 옮겨 염기서열을 확인하였다.
< 실시예 2> 유전자 단편의 염기서열 정보 분석
증폭된 2종의 유전자 단편의 염기서열을 확인한 결과, DraI 라이브러리에서 유래한 유전자 단편으로부터 1200 bp에 해당하는 BnPPT(Palmitoyl Protein Thioesterase) 프로모터의 염기서열 정보를 획득하였다(서열번호 1, 도 2).
PlantCARE(Plant Cis acting regulatory element) 데이터베이스를 이용하여 염기서열 내에 6개의 시스작용요소(Cis-acting element)가 존재함을 알 수 있었고, 시스작용요소 중 종자특이 발현에 관여하는 Skn-1 모티브가 있는 것으로 보아 BnPPT 프로모터가 종자특이 발현 프로모터의 기능이 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 3> BnPPT(Palmitoyl Protein Thioesterase) 프로모터의 기능 검정
<3-1> 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터 제작
BnPPT 프로모터의 기능을 검정하기 위하여, 식물 형질전환용 재조합 발현 벡터를 제작하였다(도 3). 형질전환체 선발을 위해 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함되어 있는 pCAMBIA3300을 기본벡터로 이용하였으며 팔미트산 생합성에 관여하는 CvFatB1 유전자의 5‘-말단 앞에 BnPPT 프로모터를 융합하였다.
또한, BnPPT 프로모터의 유전자 발현 효율을 양성대조구와 비교하기 위하여, 앞에서 기재한 바와 동일한 방식으로 일반적으로 널리 사용하고 있는 프로모터인 CaMV35S 프로모터와 유채에서 유래한 종자특이 발현 프로모터 3종(BnNapin, Bn12S, BnVPE)을 재조합 발현 벡터로 제작하였다.
<3-2> 형질전환 식물체 제작
제작한 재조합 발현 벡터 5종을 각각 아그로박테리움 EHA105에 형질전환하고 식물에서의 프로모터 기능 검정을 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. Colombia)에 화아침지법(floral dipping)으로 형질전환하였다. 이후, 형질전환된 애기장대로부터 수득한 종자를 파종한 후 본엽 2매를 가진 유묘기에 0.3% 바스타 제초제를 살포하고 살아남은 개체를 포트에 이식하여 식물생장실(22℃, 16시간 광조건)에서 약 3개월간 재배한 후 종자를 수확하였다.
<3-3> 형질전환 식물체에서의 지방산 분석
BnPPT 프로모터가 형질전환된 애기장대 형질전환체 4개 계통(7번, 10번, 12번, 15번)을 획득하여 각 계통의 T1종자에서 지방산 분석을 수행하였다.
그 결과, 모든 계통에서 포화지방산인 팔미트산(C16:0) 함량이 음성대조구인 비형질전환체에 비해 3.9~5.8배 증가하였으며, 스테아릭산(C18:0) 함량은 음성대조구에 비해 약 2배 증가하였음을 알 수 있었다(표 1, 단위: mol%). 특히, 7번 계통과 12번 계통은 포화지방산 함량이 54mol% 이상으로, 14mol%인 음성대조구에 비해크게 증가하였음을 확인하였다. 포화지방산 함량이 증대된 2개 계통(7번, 12번)을 살펴보면 다른 계통에 비하여 불포화지방산인 올레인산(C18:1)과 아라키도닉산(C20:1)의 함량이 크게 감소하였고, 리놀레산(C18:2)와 리놀렌산(C18:3)의 함량 또한 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 이러한 결과를 통해 BnPPT 프로모터는 CvFatB1 유전자의 발현을 크게 증대시킴을 알 수 있었다.
계통번호 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 포화지방산 불포화지방산
음성대조구 0 8 3 14 31 19 3 19 14 86
7 1 44 6 7 23 13 4 4 54 46
10 0 31 5 10 26 17 3 8 39 61
12 1 46 6 6 22 13 3 3 56 44
15 1 36 5 11 26 13 3 5 45 55
<3-4> 지방산 생합성 유전자의 발현율 분석
BnPPT 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터와 실시예 3-1에서 제작한 CaMV35S, BnNapin, Bn12S 및 BnVPE 프로모터를 각각 포함하는 재조합 발현 벡터에 대하여, 지방산 생합성 유전자인 CvFatB1 유전자의 발현율을 분석하였다.
그 결과, CvFatB1 유전자의 산물인 팔미트산의 함량은 BnPPT 프로모터 처리구에서 46mol%로 가장 높은 것으로 나타나, BnPPT 프로모터 발현 효율이 CaMV35S, BnNapin, Bn12S 및 BnVPE 프로모터에 비하여 1.9~5.1배 가량 높은 것을 확인하였다(도 4).
또한, 형질전환 식물체의 종자 내에 분포하고 있는 지방산의 불포화도 및 포화도 함량을 조사한 결과, 음성대조구인 비형질전환체에 비해 BnPPT 프로모터 처리구에서 불포화도 및 포화도의 함량 비율이 가장 크게 변화하였음을 확인하였다(도 5).
이는 기존에 개발된 유채 유래 종자특이 발현 프로모터들보다 BnPPT 프로모터가 형질전환 식물체의 종자 내에서 CvFatB1 유전자의 발현율을 최대화하였음을 시사하였다.

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유채(Brassica napus) 유래의 식물 종자 내 지방산 함량 증대를 유도하는 프로모터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 지방산 생합성 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 지방산은 팔미트산(C16:0), 스테아릭산(C18:0)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터.
  4. 제 1항의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pCAMBIA3300-pBnPPT인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  6. 제 4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 미생물.
  8. 제 6항의 미생물로 형질전환된 식물체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 식물은 애기장대, 유채, 들깨, 콩, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  10. (1) 제 4항의 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
    (3) 제초제를 살포하여 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  11. (1) 제 8항의 형질전환 식물체로부터 T1 종자를 수득하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 T1 종자 중에 지방산의 함량이 증가한 계통을 선발하는 단계를 포함하는 식물 종자 내 지방산 함량 증대 방법.
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