KR102197208B1 - 식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산의 생성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산, 특히 도코사헥사에노산을 합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산의 생성{PRODUCTION OF LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACIDS IN PLANT CELLS}
본 발명은 재조합 식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산, 특히 도코사헥사에노산의 합성 방법에 관한 것이다.
오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)은 현재 인간 및 동물 건강에 중요한 화합물로서 널리 인식되고 있다. 상기 지방산은 식이성 공급원으로부터 수득되거나 또는 리놀레산(LA, 18:2ω6) 또는 α-리놀렌산(ALA, 18:3ω3) 지방산(이들은 둘다 인간의 음식물에서 필수 지방산으로서 간주된다)의 전환에 의해 수득될 수 있다. 인간 및 다수의 다른 척추동물들은 식물 공급원으로부터 수득된 LA 또는 ALA를 C22로 전환시킬 수 있지만, 상기 전환을 매우 낮은 비율로 수행한다. 더욱이, 대부분의 현대 사회는 다중불포화 지방산(PUFA)의 90% 이상이, 이상적인 것으로 간주되는 4:1 비 이하의 ω6:ω3 지방산 대신에, ω6 지방산인 불균형한 식사를 하고 있다(Trautwein, 2001). 인간의 경우 에이코사펜타에노산(EPA, 20:5ω3) 및 도코사헥사에노산(DHA, 22:6ω3)과 같은 LC-PUFA의 즉석 식이성 공급원은 대개 생선 또는 어유로부터 온다. 따라서 의료 종사자들은 상당한 수준의 LC-PUFA를 함유하는 어류를 인간의 음식물에 정규적으로 포함시킬 것을 권장하였다. 점점 더, 생선-유래된 LC-PUFA 오일들이, 예를 들어 식품 및 유아식에 혼입되고 있는 중이다. 그러나, 세계적이고 국가적인 수산업의 감퇴로 인해, 이들 이로운 건강-증대 오일의 대체 공급원이 필요하다.
동물들과 대조적으로, 화훼류(flowering plants)는 탄소수 18 초과의 쇄 길이를 갖는 다중불포화 지방산을 합성하는 능력이 없다. 특히, 다른 속씨식물들과 함께 농작물 및 원예식물들은 ALA로부터 유도되는 보다 장쇄의 ω3 지방산, 예를 들어 EPA, 도코사펜타에노산(DPA, 22:5ω3) 및 DHA를 합성하는데 필요한 효소를 갖고 있지 않다. 따라서 식물 생물공학에서 중요한 목적은 상당량의 LC-PUFA를 생산하는 농작물을 가공하여, 상기 화합물들의 대체 공급원을 제공하는 것이다.
LC-PUFA 생합성 경로
미세조류, 이끼 및 진균과 같은 유기체에서 LC-PUFA의 생합성은 대개 일련의 산소-의존성 불포화 및 신장(elongation) 반응으로서 발생한다(도 1). 이들 유기체에서 EPA를 생산하는 가장 통상적인 경로는 Δ6-불포화, Δ6-신장 및 Δ5-불포화(Δ6-불포화 경로라 칭한다)를 포함하는 반면, 덜 통상적인 경로는 Δ9-신장, Δ8-불포화 및 Δ5-불포화(Δ9-불포화 경로라 칭한다)를 사용한다. 이들 연속적인 불포화 및 신장 반응들은 도 1의 상부 좌측 부분(ω6)에 도식적으로 나타낸 ω6 지방산 기질 LA, 또는 도 1의 하부 우측 부분(ω3)에 나타낸 ω3 기질 ALA 내지 EPA로 시작할 수 있다. 상기 초기 Δ6-불포화가 상기 ω6 기질 LA상에서 수행되는 경우, 상기 일련의 3 개 효소의 LC-PUFA 산물은 ω6 지방산 ARA일 것이다. LC-PUFA 합성 유기체는 아라키돈산(ARA, 20:4ω6)에서 EPA로의 전환에 대해서 도 1에 Δ17-불포화효소 단계로서 나타낸 바와 같이, ω3-불포화효소를 사용하여 ω6 지방산을 ω3 지방산으로 전환시킬 수 있다. 상기 ω3-불포화효소과의 일부 구성원들은 LA에서 ARA에 이르는 범위의 다양한 기질들상에서 작용할 수 있다. 식물 ω3-불포화효소는 종종 LA의 ALA로의 Δ15-불포화를 특이적으로 촉매화하는 반면, 진균 및 효모 ω3-불포화효소는 ARA에서 EPA로의 Δ17-불포화에 특이적일 수 있다(Pereira et al., 2004a; Zank et al., 2005). 일부 보고서들은 광범위하게 다양한 ω6 기질들을 그들의 상응하는 ω3 산물로 전환시킬 수 있는 비-특이적인 ω3-불포화효소들이 존재할 수도 있음을 시사한다(Zhang et al., 2008).
이들 유기체에서 EPA의 DHA로의 전환은 DPA를 생성시키는 EPA의 Δ5-신장에 이어서 DHA를 생성시키는 Δ4-불포화에 의해 일어난다(도 1). 대조적으로, 포유동물들은 Δ4-불포화효소와 무관한 3 개의 별도의 반응들에 의해 DPA를 DHA로 전환시키는 소위 "스프레처" 경로를 이용한다(Sprecher et al., 1995).
식물, 이끼, 미세조류 및 하등 동물, 예를 들어 카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서 일반적으로 발견되는 전위(front-end) 불포화효소는 포스파티딜콜린(PC) 기질의 sn-2 위치에 에스테르화된 지방산 기질을 우세하게 수용한다. 따라서 상기 불포화효소는 아실-PC, 지질-결합된, 전위 불포화효소로서 공지된다(Domergue et al., 2003). 대조적으로, 보다 고등 동물의 전위 불포화효소는 일반적으로 상기 지방산 기질이 PC보다는 CoA에 결합되는 아실-CoA 기질을 수용한다(Domergue et al., 2005). 일부 미세조류 불포화효소 및 하나의 식물 불포화효소가 CoA에 에스테르화된 지방산 기질을 사용하는 것으로 공지되어 있다(표 2).
각각의 PUFA 신장 반응은 다성분 단백질 복합체에 의해 촉매화되는 4 개의 단계로 이루어진다, 즉 첫 번째, 축합 반응은 말로닐-CoA로부터 2C 단위를 상기 지방산에 첨가하여 β-케토아실 중간체를 형성시킨다. 이어서 상기 중간체를 NADPH에 의해 환원시킨 다음 탈수시켜 에놀 중간체를 제공한다. 마지막으로 상기 중간체를 두 번째 환원시켜 신장된 지방산을 생성시킨다. 일반적으로 이들 4 개의 반응 중 축합 단계는 기질 특이적인 반면 다른 단계들은 그렇지 않은 것으로 생각된다. 실제로, 이는 고유의 식물 신장 기구가, 상기 비-고유 PUFA 기질을 신장시킴에 있어서 상기 고유의 식물 신장 기구의 효율이 낮을 수도 있지만, 상기 PUFA에 특이적인 축합 효소(전형적으로 "신장효소"라 칭한다)가 도입되는 한, FUPA를 신장시킬 수 있음을 의미한다. 2007년에, 효모 신장 주기 탈수효소의 식별 및 특성화가 공개되었다(Denic and Weissman, 2007).
식물, 이끼 및 미세조류에서 PUFA 불포화는 자연적으로 우세하게는 아실-PC 풀 중의 지방산 기질에 대해 발생하는 반면, 신장은 아실-CoA 풀 중의 기질에 대해 발생한다. 아실-PC 분자로부터 CoA 담체로의 지방산의 이동은 포스포리파제(PLA)에 의해 수행되는 반면 아실-CoA 지방산의 PC 담체로의 이동은 리소포스파티딜-콜린 아실트랜스퍼라제(LPCAT)에 의해 수행된다(도 21)(Singh et al., 2005).
LC-PUFA의 공학적 생산
대부분의 LC-PUFA 대사 공학은 호기성 Δ6-불포화/신장 경로를 사용하여 수행되었다. 담배에서 γ-리놀렌산(GLA, 18:3ω6)의 생합성이 시아노박테리움 시네코시스티스(Synechocystis)로부터 Δ6-불포화효소를 사용하여 1996년에 최초로 보고되었다(Reddy and Thomas, 1996). 보다 최근에, GLA가 농작물, 예를 들어 잇꽃(종자유 중 73% GLA; Knauf et al., 2006) 및 대두(28% GLA; Sato et al., 2004)에서 생산되었다. EPA 및 DHA와 같은 LC-PUFA의 생산은 관련된 불포화 및 신장 단계의 증가된 수로 인해 보다 복잡한 가공을 수반한다. 육생 식물에서 EPA 생산은, 아이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana)로부터 Δ9-신장효소, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터 Δ8-불포화효소 및 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 Δ5-불포화효소를 암호화하는 유전자들을 아라비도프시스(Arabidopsis)에 도입시켜 3% 이하의 EPA를 제공한 퀴(Qi) 등(2004)에 의해 최초로 보고되었다. 상기 연구에 이어서, 아바디(Abbadi) 등(2004)은 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)로부터 Δ6-불포화효소 및 Δ6-신장효소 및 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)으로부터 Δ5-불포화효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 아마 종자에서 0.8% 이하의 EPA를 생산함을 보고하였다.
DHA 생산의 최초 보고서, 및 지금까지 보고된 가장 높은 수준의 VLC-PUFA 생산은 WO 04/017467에서 있었으며, 여기에서는 종자가 아닌, 대두 배아에서 3% DHA가, 사프로레그니아 디클리나(Saprolegnia diclina) Δ6-불포화효소, 모르티에렐라 알피나 Δ6-불포화효소, 모르티에렐라 알피나 Δ5-불포화효소, 사프로레그니아 디클리나 Δ4-불포화효소, 사프로레그니아 다클리나 Δ17-불포화효소, 모르티에렐라 알피나 Δ6-신장효소 및 파블로바 루테리(Pavlova lutheri) Δ5-신장효소를 암호화하는 유전자들의 도입에 의해 생산된다. DHA를 또한 생산하는 배아에서의 최대 EPA 수준은 19.6%이었으며, 이는 EPA에서 DHA로의 전환 효율이 불충분함을 가리킨다(WO 2004/071467). 상기 발견은 로버트(Robert) 등(2005)에 의해 공개된 것과 유사하였으며, 여기에서는 EPA에서 DHA로의 흐름이 낮으며, 다니오 레리오(Danio rerio) Δ5/6-불포화효소, 카에노라브디티스 엘레간스 Δ6-신장효소, 및 파블로바 살리나 Δ5-신장효소 및 Δ4-불포화효소를 사용하여 아라비도프시스에서 3% EPA 및 0.5% DHA가 생산되었다. 또한 2005년에, 우(Wu) 등은 피티움 이레귤라레(Pythium irregulare) Δ6-불포화효소, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) Δ5-불포화효소, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) Δ6-신장효소, 칼렌둘라 오피시아날리스(Calendula officianalis) Δ12-불포화효소, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) Δ5-신장효소, 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) Δ17-불포화효소, 온코링쿠스 미키스(Oncorhyncus mykiss) LC-PUFA 신장효소, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) Δ4-불포화효소 및 트라우스토키트리드 LPCAT를 사용하여 브라시카 준세아(Brassica juncea)에서 25% ARA, 15% EPA 및 1.5% DHA가 생산됨을 공개하였다(Wu et al., 2005). ω3 LC-PUFA를 합성하는 유지종자 작물의 생산을 위한 노력에 대한 요약이 문헌[Venegas-Caleron et al. (2010)] 및 [Ruiz-Lopez et al. (2012)]에 제공되어 있다. 문헌[Ruiz-Lopez et al. (2012)]에서 지적한 바와 같이, 트랜스제닉 식물에서 DHA의 생산에 대해 지금까지 획득된 결과들은 어유 중에서 나타나는 수준에 가까운 경우가 없었다.
따라서 재조합 세포에서 LC-PUFA, 특히 유지종자 식물의 종자에서 DHA의 보다 효율적인 생산이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명자들은 높은 수준의 DHA를 갖는 지질의 생산을 위한 방법 및 식물을 식별하였다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하는 추출된 식물 지질을 제공하며, 여기에서 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA) 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이다.
하나의 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는다
i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 18%, 약 2% 내지 16%, 또는 약 2% 내지 15%이고,
ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 약 6% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만이고,
iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 약 1% 내지 약 30%, 약 3% 내지 약 30%, 약 6% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 30% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 60%이거나, 또는 약 30%이고,
iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 약 4% 내지 약 35%, 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 4% 내지 약 17%이고,
v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 약 4% 내지 약 40%, 약 7% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 약 4% 내지 약 16%, 또는 약 2% 내지 약 16%이고,
vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 γ-리놀렌산(GLA)의 수준은 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 4%, 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 스테아리돈산(SDA)의 수준은 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 6%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사테트라에노산(ETA)의 수준은 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.05% 내지 약 6%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 약 0.05% 내지 약 2%이고,
ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 약 4% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.05% 내지 약 2%, 또는 약 0.05% 내지 약 1%이고,
x) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사펜타에노산(EPA)의 수준은 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 약 0.05% 내지 약 2%이고,
xi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 도코사펜타에노산(DPA)의 수준은 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 0.05% 내지 약 8%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 약 0.05% 내지 약 2%이고,
xii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 8% 내지 20%, 약 10% 내지 20%, 약 11% 내지 20%, 약 10% 내지 약 16%, 또는 약 14% 내지 20%이고,
xiii) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)을 포함하고,
xiv) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)이 본질적으로 없고,
xv) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 SDA, EPA 및 ETA가 본질적으로 없고,
xvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%, 약 4% 내지 약 20%, 약 6% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 45% 내지 약 60%이고,
xvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 35%, 약 8% 내지 약 25%, 또는 약 8% 내지 약 22%이고,
xviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 75%이고,
xix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산의 수준은 약 35% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 35%, 약 6% 내지 20%, 약 20% 미만, 약 16% 미만, 약 10% 미만, 약 1% 내지 약 16%, 약 2% 내지 약 10%, 또는 약 4% 내지 약 10%이고,
xx) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 6% 미만, 4% 미만, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 또는 약 0.5% 내지 4%이고,
xxi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 36% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%이고,
xxii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 약 9% 내지 약 33%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 12% 내지 약 25%, 약 13%, 약 15%, 약 17% 또는 약 20%이고,
xxiii) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 1.0 내지 약 3.0, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 1.0, 약 0.1 또는 약 0.2이고,
xxiv) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 1.0 내지 약 3.0, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 0.1, 약 0.2 또는 약 1.0이고,
xxv) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 약 60% 내지 약 98%, 약 70% 내지 약 95%, 또는 약 75% 내지 약 90%의 Δ12-불포화효소에 의한 올레산에서 LA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxvi) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 60%, 또는 약 50% 내지 약 70%의 Δ6-불포화효소에 의한 ALA에서 SDA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxvii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 88%, 또는 약 75% 내지 약 85%의 Δ6-신장효소에 의한 SDA에서 ETA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxviii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 75% 내지 약 98%의 Δ5-불포화효소에 의한 ETA에서 EPA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxix) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 Δ5-신장효소에 의한 EPA에서 DPA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxx) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 93%, 약 50% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 Δ4-불포화효소에 의한 DPA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxxi) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxxii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 22%, 적어도 약 25%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 30%의 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxxiii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 17%, 적어도 약 22%, 적어도 약 24%, 약 17% 내지 약 55%, 약 22% 내지 약 35%, 또는 약 24% 내지 약 35%의 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxxiv) 상기 추출된 지질 중 전체 지방산은 1% 미만의 C20:1을 갖고,
xxxv) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 90% 내지 약 99%이고,
xxxvi) 상기 지질은 다이아실글리세롤(DAG)을 포함하고,
xxxvii) 상기 지질은 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.001% 내지 약 5%의 유리(비-에스테르화된) 지방산 및/또는 인지질을 포함하거나, 또는 이들이 본질적으로 없고,
xxxviii) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%, 또는 적어도 80%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하고,
xxxix) 상기 지질 중 가장 풍부한 DHA-함유 TAG 종은 DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)이고,
xl) 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 오일의 형태로 존재하며, 여기에서 중량 기준으로 상기 오일의 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 95% 내지 약 98%는 지질이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 지질 또는 오일, 바람직하게는 종자유는 하기의 특징들을 갖는다: 상기 지질 또는 오일의 전체 지방산 함량 중, DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이고, 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고, 미리스트산의 수준은 약 6% 미만이고, 올레산의 수준은 약 1% 내지 약 30%이고, LA의 수준은 약 4% 내지 약 35%이고, ALA가 존재하고, GLA가 존재하고, SDA의 수준은 약 0.05% 내지 약 7%이고, ETA의 수준은 약 4% 미만이고, EPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 10%이고, DPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 8%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 35%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.05 내지 약 3.0이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 0.03 내지 약 3.0, 바람직하게는 0.50 미만이고, 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 60%의 Δ12-불포화효소에 의한 올레산에서 LA로의 전환 효율, 적어도 약 60%의 Δ6-신장효소에 의한 SDA에서 ETA로의 전환 효율, 약 50% 내지 약 95%의 Δ5-신장효소에 의한 EPA에서 DPA로의 전환 효율, 약 50% 내지 약 95%의 Δ4-불포화효소에 의한 DPA에서 DHA로의 전환 효율, 적어도 약 10%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고, 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%이고, 임의로 상기 지질은 콜레스테롤이 본질적으로 없고/없거나 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상기 지질 또는 오일, 바람직하게는 종자유는 하기의 특징들을 갖는다: 상기 지질의 전체 지방산 함량 중, DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이고, 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고, 미리스트산의 수준은 약 2% 미만이고, 올레산의 수준은 약 1% 내지 약 30%이고, LA의 수준은 약 4% 내지 약 35%이고, ALA의 수준은 약 7% 내지 약 40%이고, GLA의 수준은 약 4% 미만이고, SDA의 수준은 약 0.05% 내지 약 7%이고, ETA의 수준은 약 4% 미만이고, ETrA의 수준은 약 0.05% 내지 약 4%이고, EPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 10%이고, DPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 8%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 35%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 0.5% 내지 약 10%이고, 상기 추출된 지질 중 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 36% 내지 약 75%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 약 9% 내지 약 33%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.05 내지 약 3.0이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 0.03 내지 약 3.0이고, 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 60%의 Δ12-불포화효소에 의한 올레산에서 LA로의 전환 효율, 적어도 약 60%의 Δ6-신장효소에 의한 SDA에서 ETA로의 전환 효율, 적어도 약 60%의 Δ5-불포화효소에 의한 ETA에서 EPA로의 전환 효율, 약 50% 내지 약 95%의 Δ5-신장효소에 의한 EPA에서 DPA로의 전환 효율, 약 50% 내지 약 95%의 Δ4-불포화효소에 의한 DPA에서 DHA로의 전환 효율, 적어도 약 10%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율, 적어도 약 15%의 LA에서 DHA로의 전환 효율, 적어도 약 17%의 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고, 상기 추출된 지질 중 전체 지방산 함량은 1% 미만의 C20:1을 갖고, 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%이고, 상기 지질은 콜레스테롤이 본질적으로 없고 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 지질 또는 오일은 캐놀라유이고/이거나 식물 또는 식물 부분으로부터 추출된 후에 트랜스에스테르화 공정으로 처리되지 않았다. 특정한 실시태양에서, 상기 지질 또는 캐놀라유를 후속으로, 상기 오일 중 지방산을 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키기 위해 처리할 수도 있다. 추가의 처리를 적용하여 상기 지질 또는 오일에 DHA를 농축시킬 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 지질 또는 오일, 바람직하게는 종자유는 하기의 특징들을 갖는다: 상기 지질의 전체 지방산 함량 중, DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이고, 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고, 미리스트산의 수준은 약 2% 미만이고, 올레산의 수준은 약 30% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 60%이고, LA의 수준은 약 4% 내지 약 20%이고, ALA의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고, GLA의 수준은 약 3% 미만이고, SDA의 수준은 약 3% 미만이고, ETA의 수준은 약 4% 미만이고, ETrA의 수준은 약 2% 미만이고, EPA의 수준은 약 4% 미만이고, DPA의 수준은 약 4% 미만이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 40% 내지 약 60%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 0.5% 내지 약 10%이고, 상기 추출된 지질 중 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 약 10% 내지 약 20%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 약 9% 내지 약 20%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.05 내지 약 3.0, 바람직하게는 약 0.50 미만이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 0.03 내지 약 3.0이고, 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%이고, 상기 지질은 콜레스테롤이 본질적으로 없고 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 지질 또는 오일은 SDA, EPA 및 ETA가 본질적으로 없고/없거나 캐놀라유이고/이거나 식물 또는 식물 부분으로부터 추출된 후에 트랜스에스테르화 공정으로 처리되지 않았다. 특정한 실시태양에서, 상기 지질 또는 캐놀라유를 후속으로, 상기 오일 중 지방산을 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키기 위해 처리할 수도 있다. 추가의 처리를 적용하여 상기 지질 또는 오일에 DHA를 농축시킬 수도 있다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 지질 또는 오일, 바람직하게는 종자유는 하기의 특징들을 갖는다: 상기 지질 또는 오일의 전체 지방산 함량 중, DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이고, 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고, 미리스트산의 수준은 약 6% 미만이고, 올레산의 수준은 약 1% 내지 약 30%이고, LA의 수준은 약 4% 내지 약 35%이고, ALA가 존재하고, GLA가 존재하고, SDA의 수준은 약 0.05% 내지 약 7%이고, ETA의 수준은 약 6% 미만이고, EPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 10%이고, DPA의 수준은 약 0.05% 내지 약 8%이다.
추가의 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 하나 이상의 스테롤, 바람직하게는 식물 스테롤을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 오일의 형태로 존재하며, 약 10 ㎎ 미만의 스테롤/오일 g, 약 7 ㎎ 미만의 스테롤/오일 g, 약 1.5 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 스테롤/오일 g, 또는 약 1.5 ㎎ 내지 약 7 ㎎의 스테롤/오일 g을 포함한다.
추출된 지질 중에 존재할 수 있는 스테롤의 예는 비제한적으로 캄페스테롤/24-메틸콜레스테롤, Δ5-스티그마스테롤, 에부리콜, β-시토스테롤/24-에틸콜레스테롤, Δ5-아베나스테롤/아이소퓨코스테롤, Δ7-스티그마스테롤/스티그마스트-7-엔-3β-올, 및 Δ7-아베나스테롤 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물 종은 표 26에 나열된 것, 예를 들어 캐놀라이며, 스테롤의 수준은 상기 특정한 식물 종에 대해 표 26에 나열된 것과 대략 동일하다.
하나의 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 약 0.5 ㎎ 미만의 콜레스테롤/오일 g, 약 0.25 ㎎ 미만의 콜레스테롤/오일 g, 약 0 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 콜레스테롤/오일 g, 또는 약 0 ㎎ 내지 약 0.25 ㎎의 콜레스테롤/오일 g을 포함하거나, 또는 콜레스테롤이 본질적으로 없다.
추가의 실시태양에서, 상기 지질은 오일, 바람직하게는 유지종자로부터의 오일이다. 상기와 같은 오일의 예는 비제한적으로 브라시카 스페시즈(Brassica sp.) 오일, 예를 들어 캐놀라유, 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 오일, 리눔 유시타티시뮴(Linum usitatissimum) 오일, 헬리안투스 스페시즈(Helianthus sp.) 오일, 카르타무스 팅크토리우스(Carthamus tinctorius) 오일, 글리시네 맥스(Glycine max) 오일, 제아 메이스(Zea mays) 오일, 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 오일, 소르검 비콜라(Sorghum bicolor) 오일, 소르검 불가레(Sorghum vulgare) 오일, 아베나 사티바(Avena sativa) 오일, 트리폴리움 스페시즈(Trifolium sp.) 오일, 엘라에시스 구이니이니스(Elaesis guineenis) 오일, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 오일, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 오일, 루피누스 앙구스티폴리우스(Lupinus angustifolius) 오일, 오리자 사티바(Oryza sativa) 오일, 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima) 오일, 카멜리나 사티바(Camelina sativa) 오일, 크람베 아비시니카(Crambe abyssinica) 오일, 미스칸투스 엑스 기간테우스(Miscanthus x giganteus) 오일, 또는 미스칸투스 시넨시스(Miscanthus sinensis) 오일을 포함한다.
또한 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하는 추출된 식물 지질, 바람직하게는 추출된 캐놀라 종자유를 제공하며, 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 지질은 상기 지질의 전체 지방산 함량 중 하기의 특징들을 갖는다;
i) 상기 DHA의 수준은 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6% 또는 약 7%이고,
ii) 상기 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고,
iii) 상기 미리스트산의 수준은 약 2% 미만이고,
iv) 상기 올레산의 수준은 약 30% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 60%이고,
v) 상기 LA의 수준은 약 4% 내지 약 20%이고,
vi) 상기 ALA의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고,
vii) 상기 GLA의 수준은 약 4% 미만이고,
viii) 상기 SDA의 수준은 약 6% 미만, 또는 약 4% 미만이고,
ix) 상기 ETA의 수준은 약 6% 미만, 또는 약 4% 미만이고,
x) 상기 ETrA의 수준은 약 1% 미만이고,
xi) 상기 EPA의 수준은 약 10% 미만이고/이거나 상기 EPA의 수준은 DHA의 수준의 0.5 내지 2.0 배이고,
xii) 상기 DPA의 수준은 약 4% 미만이고,
xiii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%이고,
xiv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 30% 내지 약 70%이고,
xv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 15% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 30%이고,
xvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 0.5% 내지 약 10%이고,
xvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 약 10% 내지 약 20%이고,
xviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 약 3% 내지 약 20%이고,
xix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.05 내지 약 3.0, 바람직하게는 약 0.50 미만이고,
xx) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 0.03 내지 약 3.0이고,
xxi) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%이고,
xxii) 상기 지질은 콜레스테롤이 본질적으로 없다. 하나의 실시태양에서, 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 지질은 SDA 및 ETA가 본질적으로 없고/없거나 식물 또는 식물 부분으로부터 추출된 후에 트랜스에스테르화 공정으로 처리되지 않았다.
또 다른 태양에서, 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하는 추출된 식물 지질을 제공하며, 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 (i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 7% 내지 20%이고, (ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 16%이고, (iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 6% 미만이고, (iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 1% 내지 30% 또는 30% 내지 60%이고, (v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 4% 내지 35%이고, (vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 4% 내지 40%이고, (vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 4% 미만이고, (viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 4% 내지 25%이고, (ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 1.0 내지 3.0 또는 0.1 내지 1이고, (x) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 70%이고, (xi) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재한다. 하나의 실시태양에서, 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는다
i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 15%이고,
ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 1% 미만이고,
iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 약 3% 내지 약 30%, 약 6% 내지 약 30%, 1% 내지 약 20%, 약 45% 내지 약 60%이거나, 또는 약 30%이고,
iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 4% 내지 17%이고,
v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 약 7% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 또는 약 4% 내지 16%이고,
vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 γ-리놀렌산(GLA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 0.05% 내지 7%, 0.05% 내지 4%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 스테아리돈산(SDA)의 수준은 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사테트라에노산(ETA)의 수준은 약 4% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 약 0.05% 내지 약 2%이고,
ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 약 2% 미만, 약 1% 미만, 0.05% 내지 4%, 0.05% 내지 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%, 또는 0.05% 내지 약 1%이고,
x) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사펜타에노산(EPA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 0.05% 내지 10%, 0.05% 내지 5%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 도코사펜타에노산(DPA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 0.05% 내지 8%, 0.05% 내지 5%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 8% 내지 20%, 약 10% 내지 20%, 약 11% 내지 20%, 약 10% 내지 약 16%, 또는 약 14% 내지 20%이고,
xiii) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)을 포함하고,
xiv) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)이 본질적으로 없고,
xv) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 SDA, EPA 및 ETA가 본질적으로 없고,
xvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 6% 내지 약 20%이고,
xvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 35%, 약 8% 내지 약 25%, 또는 8% 내지 약 22%이고,
xviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 75%이고,
xix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산의 수준은 약 35% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 35%, 약 6% 내지 20%, 20% 미만, 약 16% 미만, 약 10% 미만, 약 1% 내지 약 16%, 약 2% 내지 약 10%, 또는 약 4% 내지 약 10%이고,
xx) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 6% 미만, 4% 미만, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 또는 약 0.5% 내지 4%이고,
xxi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 36% 내지 약 65%, 40% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%이고,
xxii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 9% 내지 약 33%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 12% 내지 약 25%, 약 13%, 약 15%, 약 17% 또는 약 20%이고,
xxiii) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 1.0, 약 0.1 또는 약 0.2이고,
xxiv) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 1.0 내지 약 3.0, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 0.1, 약 0.2 또는 약 1.0이고,
xxv) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxvi) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 22%, 적어도 약 25%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 30%의 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxvii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 17%, 적어도 약 22%, 적어도 약 24%, 약 17% 내지 약 55%, 약 22% 내지 약 35%, 또는 약 24% 내지 약 35%의 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxviii) 상기 추출된 지질 중 전체 지방산은 1% 미만의 C20:1을 갖고,
xxix) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 90% 내지 약 99%이고,
xxx) 상기 지질은 다이아실글리세롤(DAG)을 포함하고,
xxxi) 상기 지질은 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.001% 내지 약 5%의 유리(비-에스테르화된) 지방산 및/또는 인지질을 포함하거나, 또는 이들이 본질적으로 없고,
xxxii) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 80%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하고,
xxxiii) 상기 지질 중 가장 풍부한 DHA-함유 TAG 종은 DHA/18:3/18:2(TAG 58:12)이고,
xxxiv) 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다.
구체적으로 상기 태양에 관하여, 하나의 실시태양에서,
i) 상기 지질은 오일의 형태로 존재하며, 여기에서 상기 오일은 하나 이상의 스테롤, 예를 들어 캄페스테롤, Δ5-스티그마스테롤, 에부리콜, β-시토스테롤, Δ5-아베나스테롤, Δ7-스티그마스테롤, 및 Δ7-아베나스테롤 중 하나 이상 또는 전부를 포함하고, 임의로 상기 오일은 10 ㎎ 미만의 스테롤/오일의 g을 포함하고/하거나 상기 오일은 콜레스테롤이 본질적으로 없고/없거나,
ii) 상기 지질은 유지종자로부터의 오일의 형태로 존재한다, 예를 들어 유지종자는 브라시카 스페시즈 유지종자 또는 캐놀라 종자이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 추출된 식물 지질의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은
i) 지질을 포함하는 식물 부분을 수득하고, 상기 지질이 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA) 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 에이코사펜타에노산(EPA), 스테아리돈산(SDA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 식물 부분 중 추출 가능한 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 약 7% 내지 20%이고,
ii) 상기 식물 부분으로부터 지질을 추출하는
단계들을 포함하고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 상기 정의된 특징들 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물 부분은 종자, 바람직하게는 유지종자이다. 상기와 같은 종자의 예는 비제한적으로 브라시카 스페시즈, 고시피움 히르수툼, 리눔 우시타티시뮴, 헬리안투스 스페시즈, 카르타무스 팅크토리우스, 글리시네 맥스, 제아 메이스, 아라비도프시스 탈리아나, 소르검 비콜라, 소르검 불가레, 아베나 사티바, 트리폴리움 스페시즈, 엘라에시스 구이니이니스, 니코티아나 벤타미아나, 호르데움 불가레, 루피누스 앙구스티폴리우스, 오리자 사티바, 오리자 글라베리마, 카멜리나 사티바, 또는 크람베 아비시니카, 바람직하게는 브라시카 나푸스(Brassica napus), 비 준세아(B juncea) 또는 씨 사티바 종자이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 종자는 종자의 그램당 적어도 약 18 ㎎, 적어도 약 22 ㎎, 적어도 약 26 ㎎, 약 18 ㎎ 내지 약 100 ㎎, 약 22 ㎎ 내지 약 70 ㎎, 또는 약 24 ㎎ 내지 약 50 ㎎의 DHA를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 식물 부분은 하기의 효소들의 세트 중 하나를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고:
i) ω3-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
ii) Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
iii) Δ12-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
iv) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
v) ω3-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
vi) Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
vii) Δ12-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소, 또는
viii) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소;
각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물 부분의 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결된다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 식물 부분은 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는다
i) 상기 Δ12-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 약 60% 내지 약 98%, 약 70% 내지 약 95%, 또는 약 75% 내지 약 90%의 효율로 올레산을 리놀레산으로 전환시키고,
ii) 상기 ω3-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 약 65% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 95%, 또는 약 80% 내지 약 95%의 효율로 ω6 지방산을 ω3 지방산으로 전환시키고,
iii) 상기 Δ6-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 35% 내지 약 60%, 또는 약 50% 내지 약 70%의 효율로 ALA를 SDA로 전환시키고,
iv) 상기 Δ6-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 약 5% 미만, 약 2.5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 또는 약 0.5% 내지 약 1%의 효율로 리놀레산을 γ-리놀렌산으로 전환시키고,
v) 상기 Δ6-신장효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 88%, 또는 약 75% 내지 약 85%의 효율로 SDA를 ETA로 전환시키고,
vi) 상기 Δ5-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 75% 내지 약 98%의 효율로 ETA를 EPA로 전환시키고,
vii) 상기 Δ5-신장효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 효율로 EPA를 DPA로 전환시키고,
viii) 상기 Δ4-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 93%, 약 50% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 효율로 DPA를 DHA로 전환시키고,
ix) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 올레산의 DHA로의 전환 효율은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%이고,
x) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 LA의 DHA로의 전환 효율은 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 22%, 적어도 약 25%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 30%이고,
xi) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 ALA의 DHA로의 전환 효율은 적어도 약 17%, 적어도 약 22%, 적어도 약 24%, 약 17% 내지 약 55%, 약 22% 내지 약 35%, 또는 약 24% 내지 약 35%이고,
xii) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포는 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 세포보다 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 15% 내지 약 30%, 또는 약 22.5% 내지 약 27.5% 더 ω3 지방산을 포함하고,
xiii) 상기 Δ6-불포화효소는 리놀레산(LA)에 비해 α-리놀렌산(AL)을 우선적으로 불포화시키고,
xiv) 상기 Δ6-신장효소는 또한 Δ9-신장효소 활성을 갖고,
xv) 상기 Δ12-불포화효소는 또한 Δ15-불포화효소 활성을 갖고,
xvi) 상기 Δ6-불포화효소는 또한 Δ8-불포화효소 활성을 갖고,
xvii) 상기 Δ8-불포화효소는 또한 Δ6-불포화효소 활성을 갖거나 또는 Δ6-불포화효소 활성을 갖지 않고,
xviii) 상기 Δ15-불포화효소는 또한 GLA에 대한 ω3-불포화효소 활성을 갖고,
xix) 상기 ω3-불포화효소는 또한 LA에 대한 Δ15-불포화효소 활성을 갖고,
xx) 상기 ω3-불포화효소는 LA 및/또는 GLA를 모두 불포화시키고,
xxi) 상기 ω3-불포화효소는 LA에 비해 GLA를 우선적으로 불포화시키고,
xxii) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 30%, 또는 약 20% 내지 약 25%의 상기 식물 부분 중 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxiii) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 22%, 약 15% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 22% 내지 약 30%의 상기 식물 부분 중 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxiv) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 약 17%, 적어도 약 22%, 적어도 약 24%, 약 17% 내지 약 65%, 약 22% 내지 약 35%, 또는 약 24% 내지 약 35%의 상기 식물 부분 중 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
xxx) 상기 불포화효소들 중 하나 이상 또는 전부는 상응하는 아실-PC 기질보다 아실-CoA 기질에 대해 더 큰 활성을 갖고,
xxxi) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 LA보다 ALA에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
xxxii) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
xxxiii) 상기 Δ6-불포화효소는 LA에 비해 기질로서 ALA에 대해 적어도 약 2배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성, 적어도 3배 더 큰 활성, 적어도 4배 더 큰 활성 또는 적어도 5배 더 큰 활성을 갖고,
xxxiv) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA에 대해서보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 더 큰 활성을 갖고,
xxxv) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA에 대해서보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 적어도 약 5 배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성 또는 적어도 10 배 더 큰 활성을 갖고,
xxxvi) 상기 불포화효소는 전위(front-end) 불포화효소이고,
xxxvii) 상기 Δ6-불포화효소는 ETA에 대해 검출 가능한 Δ5-불포화효소 활성을 갖지 않는다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 식물 물질은 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는다
i) 상기 Δ12-불포화효소는 서열번호 10에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 10에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
ii) 상기 ω3-불포화효소는 서열번호 12에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 12에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
iii) 상기 Δ6-불포화효소는 서열번호 16에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 16에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
iv) 상기 Δ6-신장효소는 서열번호 25에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 예를 들어 서열번호 26, 또는 서열번호 25 및/또는 서열번호 26에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
v) 상기 Δ5-불포화효소는 서열번호 30에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 30에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
vi) 상기 Δ5-신장효소는 서열번호 37에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 37에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하고,
vii) 상기 Δ4-불포화효소는 서열번호 41에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 41에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물 부분은 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT), 모노아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(MGAT), 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT), 1-아실-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(LPAAT), 바람직하게는 C22 다중불포화 지방 아실-CoA 기질을 사용할 수 있는 LPAAT, 아실-CoA:리소포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제(LPCAT), 포스포리파제 A2(PLA2), 포스포리파제 C(PLC), 포스포리파제 D(PLD), CDP-콜린 다이아실글리세롤 콜린 포스포트랜스퍼라제(CPT), 포스파티딜콜린 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(PDAT), 포스파티딜콜린:다이아실글리세롤 콜린 포스포트랜스퍼라제(PDCT), 아실-CoA 신타제(ACS), 또는 이들 중 2 개 이상의 조합을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 식물 부분은 FAE1, DGAT, MGAT, GPAT, LPAAT, LPCAT, PLA2, PLC, PLD, CPT, PDAT, 티오에스테라제, 예를 들어 FATB, 및 Δ12-불포화효소, 및 이들 중 2 개 이상의 조합 중에서 선택된 상기 식물 부분의 세포 중 외인성 효소의 생산 및/또는 활성을 하향 조절하는 도입된 돌연변이 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 프로모터 중 적어도 하나 또는 전부는 종자 특이성 프로모터이다. 하나의 실시태양에서, 상기 프로모터 중 적어도 하나 또는 전부는 오일 생합성 또는 축적 유전자, 예를 들어 올레오신으로부터, 또는 종자 저장 단백질 유전자, 예를 들어 콘리닌으로부터 수득되었다.
또 다른 실시태양에서, 상기 Δ4-불포화효소 및 Δ5-신장효소를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 프로모터(들)는, 상기 프로모터(들)가 상기 Δ12-불포화효소 및 ω3-불포화효소를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하기 전에 상기 식물 세포의 발생 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 개시하거나, 또는 상기 전에 피크 발현에 도달한다.
추가의 실시태양에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자, 바람직하게는 T-DNA 분자에 공유 결합되고, 상기 식물 부분의 세포의 게놈에 통합되며, 바람직하게는 이때 상기 식물 부분의 세포의 게놈에 통합된 상기와 같은 DNA 분자의 수는 1, 2 또는 3 개 이하이거나 또는 2 또는 3이다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 식물은 적어도 2 개의 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 Δ6-불포화효소를 암호화한다.
추가의 실시태양에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 부분의 전체 오일 함량은, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 식물 부분의 전체 오일 함량의 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 약 50% 내지 약 80%이다. 이들 실시태양에서, 최대 오일 함량은 상응하는 야생형 식물 부분의 오일 함량의 약 100%일 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 지질은 오일, 바람직하게는 유지종자로부터의 종자유의 형태로 존재하며, 여기에서 상기 지질의 중량의 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 약 95% 내지 약 98%는 트라이아실글리세롤이다.
추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 지질을, 전체 지방산 함량의 백분율로서 DHA의 수준을 증가시키도록 처리함을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 처리는 트랜스에스테르화이다. 예를 들어, 상기 지질, 예를 들어 캐놀라유를, 상기 오일 중 지방산이 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환되도록 처리하고, 이어서 분별화시켜 상기 지질 또는 오일에 상기 DHA를 농축시킬 수 있다.
더욱이,
i) 지질을 포함하는 식물 부분, 바람직하게는 캐놀라 종자를 수득하고, 상기 지질이 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 에이코사펜타에노산(EPA), 스테아리돈산(SDA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 식물 부분 중 추출 가능한 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6% 또는 약 7%이고,
ii) 상기 식물 부분으로부터 지질을 추출하는
단계들을 포함하는, 추출된 식물 지질의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 상기 추출된 지질은 상기 지질의 전체 지방산 함량에서 하기의 특징들을 갖는다:
i) 상기 DHA의 수준은 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6% 또는 약 7%이고,
ii) 상기 팔미트산의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고,
iii) 상기 미리스트산의 수준은 약 2% 미만이고,
iv) 상기 올레산의 수준은 약 30% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 60%이고,
v) 상기 LA의 수준은 약 4% 내지 약 20%이고,
vi) 상기 ALA의 수준은 약 2% 내지 약 16%이고,
vii) 상기 GLA의 수준은 약 4% 미만이고,
viii) 상기 SDA의 수준은 약 6% 미만, 또는 약 4% 미만이고,
ix) 상기 ETA의 수준은 약 6% 미만, 또는 약 4% 미만이고,
x) 상기 ETrA의 수준은 약 1% 미만이고,
xi) 상기 EPA의 수준은 약 10% 미만이고/이거나 상기 EPA의 수준은 DHA의 수준의 0.5 내지 2.0 배이고,
xii) 상기 DPA의 수준은 약 4% 미만이고,
xiii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 25%이고,
xiv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 30% 내지 약 70%이고,
xv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 15% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 30%이고,
xvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 0.5% 내지 약 10%이고,
xvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 약 10% 내지 약 20%이고,
xviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 약 3% 내지 약 20%이고,
xix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.05 내지 약 3.0, 바람직하게는 약 0.50 미만이고,
xx) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 0.03 내지 약 3.0이고,
xxi) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 70%이고,
xxii) 상기 지질은 콜레스테롤이 본질적으로 없다. 하나의 실시태양에서, 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 지질은 SDA 및 ETA가 본질적으로 없고/없거나 식물 또는 식물 부분으로부터 추출된 후에 트랜스에스테르화 공정으로 처리되지 않았다.
또한, i) 지질을 포함하는 식물 부분을 수득하고, 상기 지질이 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 (i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 7% 내지 20%이고, (ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 16%이고, (iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 6% 미만이고, (iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 1% 내지 30% 또는 30% 내지 60%이고, (v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 4% 내지 35%이고, (vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 4% 내지 40%이고, (vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 4% 미만이고, (viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 4% 내지 25%이고, (ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 1.0 내지 3.0 또는 0.1 내지 1이고, (x) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 70%이고, (xi) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하고,
ii) 상기 식물 부분으로부터 지질을 추출하는
단계들을 포함하는, 추출된 식물 지질의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이다.
또한 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 지질 또는 상기 지질을 포함하는 오일을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 다중불포화 지방산의 에틸 에스테르의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 추출된 식물 지질 중 트라이아실글리세롤을 트랜스에스테르화(여기에서 상기 추출된 식물 지질은 트라이아실글리세롤의 형태로 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 7% 내지 20%이다)시키고, 이에 의해 상기 에틸 에스테르를 생성시킴을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 상기 정의된 특징들 중 하나 이상을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 다중불포화 지방산의 에틸 에스테르의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 추출된 식물 지질 중 트라이아실글리세롤을 트랜스에스테르화(여기에서 상기 추출된 식물 지질은 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA)을 포함하는 ω3 지방산, 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하고, 여기에서 (i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6% 또는 7% 내지 20%이고, (ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 16%이고, (iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 6% 미만이고, (iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 1% 내지 30% 또는 30% 내지 60%이고, (v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 4% 내지 35%이고, (vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 4% 내지 40%이고, (vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 4% 미만이고, (viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 4% 내지 25%이고, (ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 1.0 내지 3.0 또는 0.1 내지 1이고, (x) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 70%이고, (xi) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재한다)시키고, 이에 의해 상기 에틸 에스테르를 생성시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 추출된 지질은 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는다
i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 15%이고,
ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준은 1% 미만이고,
xxxv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 약 3% 내지 약 30%, 약 6% 내지 약 30%, 1% 내지 약 20%, 약 45% 내지 약 60%이거나, 또는 약 30%이고,
xxxvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 4% 내지 17%이고,
xxxvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 α-리놀렌산(ALA)의 수준은 약 7% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 35%, 또는 약 4% 내지 16%이고,
xxxviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 γ-리놀렌산(GLA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 0.05% 내지 7%, 0.05% 내지 4%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xxxix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 스테아리돈산(SDA)의 수준은 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xl) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사테트라에노산(ETA)의 수준은 약 4% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 또는 약 0.05% 내지 약 2%이고,
xli) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 약 2% 미만, 약 1% 미만, 0.05% 내지 4%, 0.05% 내지 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%, 또는 0.05% 내지 약 1%이고,
xlii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사펜타에노산(EPA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 0.05% 내지 10%, 0.05% 내지 5%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xliii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 도코사펜타에노산(DPA)의 수준은 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 0.05% 내지 8%, 0.05% 내지 5%, 또는 0.05% 내지 약 3%, 또는 0.05% 내지 약 2%이고,
xliv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 8% 내지 20%, 약 10% 내지 20%, 약 11% 내지 20%, 약 10% 내지 약 16%, 또는 약 14% 내지 20%이고,
xlv) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)을 포함하고,
xlvi) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 ω6-도코사펜타에노산(22:5Δ4,7,10,13,16)이 본질적으로 없고,
xlvii) 상기 지질은 그의 지방산 함량 중에 SDA, EPA 및 ETA가 본질적으로 없고,
xlviii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 6% 내지 약 20%이고,
xlix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 약 4% 내지 약 35%, 약 8% 내지 약 25%, 또는 8% 내지 약 22%이고,
l) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 약 20% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 75%이고,
li) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산의 수준은 약 35% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 35%, 약 6% 내지 20%, 20% 미만, 약 16% 미만, 약 10% 미만, 약 1% 내지 약 16%, 약 2% 내지 약 10%, 또는 약 4% 내지 약 10%이고,
lii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 6% 미만, 4% 미만, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 8%, 또는 약 0.5% 내지 4%이고,
liii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 36% 내지 약 65%, 40% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%이고,
liv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 9% 내지 약 33%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 12% 내지 약 25%, 약 13%, 약 15%, 약 17% 또는 약 20%이고,
lv) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 1.0, 약 0.1 또는 약 0.2이고,
lvi) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 약 1.0 내지 약 3.0, 약 0.1 내지 약 1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.50 미만, 약 0.40 미만, 약 0.30 미만, 약 0.20 미만, 약 0.15 미만, 약 0.1, 약 0.2 또는 약 1.0이고,
lvii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
lviii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 22%, 적어도 약 25%, 약 15% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 또는 약 20% 내지 약 30%의 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
lix) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 약 17%, 적어도 약 22%, 적어도 약 24%, 약 17% 내지 약 55%, 약 22% 내지 약 35%, 또는 약 24% 내지 약 35%의 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
lx) 상기 추출된 지질 중 전체 지방산은 1% 미만의 C20:1을 갖고,
lxi) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 90% 내지 약 99%이고,
lxii) 상기 지질은 다이아실글리세롤(DAG)을 포함하고,
lxiii) 상기 지질은 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.001% 내지 약 5%의 유리(비-에스테르화된) 지방산 및/또는 인지질을 포함하거나, 또는 이들이 본질적으로 없고,
lxiv) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 80%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하고,
lxv) 상기 지질 중 가장 풍부한 DHA-함유 TAG 종은 DHA/18:3/18:3(TAG 58:12)이고,
lxvi) 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다.
구체적으로 상기 태양에 관하여, 하나의 실시태양에서 하기 중 하나 이상 또는 전부를 적용한다
i) 상기 지질은 오일의 형태로 존재하며, 여기에서 상기 오일은 하나 이상의 스테롤, 예를 들어 캄페스테롤, Δ5-스티그마스테롤, 에부리콜, β-시토스테롤, Δ5-아베나스테롤, Δ7-스티그마스테롤, 및 Δ7-아베나스테롤 중 하나 이상 또는 전부를 포함하고, 임의로 상기 오일은 10 ㎎ 미만의 스테롤/오일의 g을 포함하고/하거나 상기 오일은 콜레스테롤이 본질적으로 없고/없거나,
ii) 상기 지질은 유지종자로부터의 오일의 형태로 존재한다, 예를 들어 유지종자는 브라시카 스페시즈 유지종자 또는 캐놀라 종자이고,
iii) 상기 추출된 식물 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%이거나, 또는 7% 내지 20%이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 제1 유전자, 제2 유전자, 제3 유전자, 제4 유전자, 제5 유전자 및 제6 유전자를 순서대로 포함하는 키메릭 유전자 구조물을 제공하며, 이들 유전자는 모두 단일 DNA 분자에 공유 결합되고,
여기에서 상기 제1, 제2 및 제3 유전자는 제1 유전자 클러스터로서 함께 결합되고, 상기 제4, 제5 및 제6 유전자는 제2 유전자 클러스터로서 함께 결합되며,
여기에서 각각의 유전자는, 각각의 프로모터가 암호화 영역 및 전사 종결자 및/또는 폴리아데닐화 영역에 작동적으로 연결되도록, 상기 프로모터, 상기 암호화 영역 및 상기 전사 종결자 및/또는 상기 폴리아데닐화 영역을 포함하고,
여기에서 각각의 프로모터는 독립적으로, DNA 분자가 3, 4, 5 또는 6 개의 상이한 프로모터를 포함하도록 다른 프로모터들과 동일하거나 상이하고,
여기에서 상기 프로모터들 중 하나 이상 또는 전부는 작동적으로 연결되는 암호화 영역에 대해서 이종이고,
여기에서 상기 제1 유전자의 전사 방향은 상기 제3 유전자로부터 멀리 상기 제3 유전자의 전사 방향에 상반되고,
여기에서 상기 제4 유전자의 전사 방향은 상기 제6 유전자로부터 멀리 상기 제6 유전자의 전사 방향에 상반되고,
여기에서 상기 제2 유전자의 전사 방향은 상기 제1 유전자 또는 상기 제3 유전자의 경우와 동일하고,
여기에서 상기 제5 유전자의 전사 방향은 상기 제4 유전자 또는 상기 제6 유전자의 경우와 동일하고,
여기에서 상기 제2 유전자의 전사 종결자 및/또는 폴리아데닐화 영역은, 어느 것이든 더 가까운 것이, 약 0.2 및 약 3.0 킬로염기의 제1 이격 영역만큼 상기 제1 또는 제3 유전자의 프로모터와 이격되고,
여기에서 상기 제1 유전자 클러스터는 상기 제2 유전자 클러스터와, 약 1.0 내지 약 10.0 킬로염기의 제2 이격 영역만큼 이격되고,
여기에서 상기 제5 유전자의 전사 종결자 및/또는 폴리아데닐화 영역은, 어느 것이든 더 가까운 것이, 약 0.2 및 약 3.0 킬로염기의 제3 이격 영역만큼 상기 제4 또는 제6 유전자의 프로모터와 이격된다.
하나의 실시태양에서, 상기 DNA 분자는, 어느 것이든 더 가까운 것이, 약 1.0 및 약 10.0 킬로염기의 이격 영역만큼 상기 제1 유전자 클러스터 또는 제2 유전자 클러스터와 이격된 제7 유전자를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 DNA 분자는 2 개 이상의 상이한 전사 종결자 및/또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 이격 영역들 중 적어도 하나는 기질 부착 영역(MAR)을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 DNA 분자는 유전자들의 측면에 인접한 우측 및 좌측 경계 영역을 포함하며 T-DNA 분자이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유전자 구조물은 아그로박테리움 세포 중에 있거나 또는 식물 세포의 게놈에 통합된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 유전자들 중 적어도 하나는 지방산 불포화효소 또는 지방산 신장효소를 암호화한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유전자 구조물은 본 발명에 정의된 바와 같은 일련의 효소들을 암호화하는 유전자를 포함하고/하거나 상기 유전자들 중 하나 이상은 본 발명에 정의된 바와 같은 효소를 암호화한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
i) 서열번호 1 내지 9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 또는 45 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드의 서열, 및/또는
ii) 서열번호 1 내지 9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 또는 45에 설명된 서열들 중 하나 이상과 적어도 95% 일치하거나 또는 99% 일치하는 뉴클레오티드의 서열.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드는
i) 서열번호 2의 뉴클레오티드의 서열, 및/또는
ii) 서열번호 2에 설명된 서열들과 적어도 95% 일치하거나 또는 99% 일치하는 뉴클레오티드의 서열
을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 유전자 구조물 및/또는 본 발명의 유전자 구조물을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 서열번호 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 또는 45 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오티드의 서열 또는 서열번호 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 또는 45에 설명된 서열들 중 하나 이상과 적어도 95% 일치하거나 또는 99% 일치하는 뉴클레오티드의 서열이 프로모터에 작동적으로 연결된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 하기 효소들의 세트 중 하나를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하고:
i) ω3-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
ii) Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
iii) Δ12-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
iv) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
v) ω3-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
vi) Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
vii) Δ12-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소, 또는
viii) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소;
여기에서 각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결된다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포는 상기 정의된 바와 같은 지질을 포함하거나, 또는 상기 불포화효소 또는 신장효소들 중 하나 이상 또는 전부는 상기 정의된 바와 같은 특징들 중 하나 이상을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
i) 서열번호 10에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 10에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 Δ12-불포화효소를 암호화하는 제1 외인성 폴리뉴클레오티드, 및
ii) 서열번호 12에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 12에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 ω3-불포화효소를 암호화하는 제2 외인성 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 여기에서 각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 유전자 구조물 및 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포는 식물, 식물 부분 중에 있고/있거나 또는 성숙한 식물 종자 세포이다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물 또는 식물 종자는 각각 유지종자 식물 또는 유지종자이다.
또한 본 발명의 세포를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 유기체를 제공한다. 바람직하게, 상기 트랜스제닉 비-인간 유기체는 트랜스제닉 식물, 바람직하게는 유지종자 식물 또는 아라비도프시스 탈리아나이다. 하나의 실시태양에서, 상기 식물은 브라시카 식물, 바람직하게는 비 나푸스 또는 비 준세아, 또는 아라비도프시스 탈리아나 외의 식물이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은
a) 종자 중의 지질(상기 지질은 에스테르화된 형태의 지방산을 포함한다), 및
b) i) Δ12-불포화효소, 진균 ω3-불포화효소 및/또는 진균 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소, 또는
ii) Δ12-불포화효소, 진균 ω3-불포화효소 및/또는 진균 Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소
의 세트 중 하나를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 유지종자 식물을 제공하고, 여기에서 각각의 폴리뉴클레오티드는 상기 식물의 발생 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 종자-특이성 프로모터에 작동적으로 연결되고, 여기에서 상기 지방산은 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA) 및 γ-리놀렌산(GLA)을 포함하는 ω6 지방산, α-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산(SDA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 도코사헥사에노산(DHA), 및 임의로 에이코사펜타에노산(EPA) 및/또는 에이코사테트라에노산(ETA) 중 하나 이상을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 여기에서 상기 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 약 7% 내지 20%이다.
유지종자 식물의 예는 비제한적으로 브라시카 스페시즈, 고시피움 히르수툼, 리눔 유시타티시뮴, 헬리안투스 스페시즈, 카르타무스 팅크토리우스, 글리시네 맥스, 제아 메이스, 아라비도프시스 탈리아나, 소르검 비콜라, 소르검 불가레, 아베나 사티바, 트리폴리움 스페시즈, 엘라에시스 구이니이니스, 니코티아나 벤타미아나, 호르데움 불가레, 루피누스 앙구스티폴리우스, 오리자 사티바, 오리자 글라베리마, 카멜리나 사티바, 또는 크람베 아비시니카를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유지종자 식물은 캐놀라, 글리시네 맥스, 카멜리나 사티바 또는 아라비도프시스 탈리아나 식물이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 유지종자 식물은 에이 탈리아나 외의 것이다.
하나의 실시태양에서, 상기 불포화효소들 중 하나 이상은 아실-CoA 기질을 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소 및 Δ8-불포화효소(존재하는 경우) 중 하나 이상은 아실-CoA 기질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 i) Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소 및 Δ4-불포화효소, 또는 ii) Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소 및 Δ8-불포화효소는 각각 아실-CoA 기질을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, Δ12-불포화효소 및/또는 ω3-불포화효소는 아실-CoA 기질을 사용할 수 있다. 상기 아실-CoA 기질은 바람직하게는 ALA-CoA, ETA-CoA, DPA-CoA, ETrA-CoA, LA-CoA, GLA-CoA, 또는 ARA-CoA이다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물의 성숙한, 수확된 종자는 종자 그램당 적어도 약 28 ㎎, 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 32 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 36 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 40 ㎎, 보다 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 44 ㎎, 또는 종자 그램당 적어도 약 48 ㎎의 DHA 함량을 갖는다. 최대 DHA 함량은 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎, 또는 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 DHA를 포함하는 종자를 생산할 수 있는 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물을 제공하며, 여기에서 상기 식물의 성숙한, 수확된 종자는 종자 그램당 적어도 약 28 ㎎, 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 32 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 36 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 40 ㎎, 보다 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 44 ㎎, 또는 종자 그램당 적어도 약 48 ㎎의 DHA 함량을 갖는다. 최대 DHA 함량은 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎, 또는 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 식물의 식물 세포를 제공한다.
또한 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 식물 부분, 바람직하게는 종자를 제공한다
i) 본 발명의 식물로부터 기원한다,
ii) 본 발명에서 한정된 바와 같은 지질을 포함한다,
iii) 본 발명의 방법에 사용될 수 있다,
iv) 본 발명의 유전자 구조물을 포함한다,
v) 본 발명에서 한정된 바와 같은 외인성 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 DHA 및 약 4 내지 약 15 중량%의 수분 함량을 포함하는 성숙한, 수확된 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 종자를 제공하며, 여기에서 상기 종자의 DHA 함량은 종자 그램당 적어도 약 28 ㎎, 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 32 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 36 ㎎, 종자 그램당 적어도 약 40 ㎎, 보다 바람직하게는 종자 그램당 적어도 약 44 ㎎, 또는 종자 그램당 적어도 약 48 ㎎이다. 최대 DHA 함량은 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎, 또는 종자 그램당 약 80 내지 약 100 ㎎일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 또는 본 발명의 종자를, 본 발명에서 정의된 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 포함하는 추출된 지질의 생성에 사용할 수 있다.
더욱 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 상기 세포, 바람직하게는 LC-PUFA를 합성할 수 없는 세포에, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에서 정의된 외인성 폴리뉴클레오티드들의 조합 중 하나 이상을 도입시키고,
b) 임의로, 상기 세포에서 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 발현시키고,
c) 임의로, 상기 세포의 지방산 조성을 분석하고,
d) 임의로, 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 발현하는 세포를 선택함
을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포 중의 지질은 본 발명에서 정의된 특징들 중 하나 이상을 갖는다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유전자 구조물, 상기 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터, 상기 유전자 구조물, 또는 외인성 폴리뉴클레오티드들의 조합은 상기 세포의 게놈내로 안정하게 통합된다.
추가의 실시태양에서, 상기 세포는 식물 세포이며, 상기 방법은 상기 단계 a)의 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유전자 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드(들)를 상기 세포에서 일시적으로 발현시킨다.
또한 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 종자의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 본 발명의 식물, 또는 본 발명에서 정의된 바와 같은 부분을 생산하는 식물을, 바람직하게는 적어도 1000 개의 상기와 같은 식물의 집단의 부분으로서 필드에서, 또는 표준 재식 밀도로 심어진 적어도 1 헥타아르의 면적에서 재배하고,
b) 상기 식물 또는 식물들로부터 종자를 수확하고,
c) 임의로, 상기 종자로부터 지질을 추출하여, 바람직하게는 적어도 60 ㎏ DHA/헥타아르의 전체 DHA 수율로 오일을 생산함
을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자는 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는다
i) 상기 오일은 본 발명에 정의된 바와 같고,
ii) 상기 식물 부분 또는 종자는 본 발명의 방법에 사용될 수 있고,
iii) 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 유전자 구조물에 포함되고,
iv) 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
v) 상기 식물 세포는 본 발명의 세포이고,
vi) 상기 종자는 본 발명의 방법에 따라 생성되었다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 지방산 불포화효소 및/또는 지방산 신장효소, 또는 하나 이상의 지방산 불포화효소 및 하나 이상의 지방산 신장효소의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 또는 무세포 발현 시스템에서, 바람직하게는 필드에서 유지종자 식물 중 발생하는 유지종자에서, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에서 정의된 외인성 폴리뉴클레오티드들의 조합 중 하나 이상을 발현시킴을 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법, 본 발명의 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나프스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 또는 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자를 사용하여 생성되거나 또는 이로부터 수득되는 지질 또는 오일을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 지질 또는 오일은 유지종자로부터 오일의 추출에 의해 수득된다. 유지종자로부터의 오일의 예는 비제한적으로 캐놀라유(브라시카 나푸스, 브라시카 라파 서브스페시즈(Brassica rapa ssp.)), 겨자 오일(브라시카 준세아), 다른 브라시카 오일, 해바라기 오일(헬리안투스 안누우스), 아마인유(리눔 유시타티시뮴), 대두 오일(글리시네 맥스), 잇꽃 오일(카르타무스 팅크토리우스), 옥수수 오일(제아 메이스), 담배 오일(니코티아나 타바쿰), 땅콩 오일(아라키스 하이포가에아(Arachis hypogaea)), 팜 오일, 면실유(고시피움 히르수툼), 코코넛 오일(코코스 누시페라(Cocos nucifera)), 아보카도 오일(페르세아 아메리카나(Persea americana)), 올리브 오일(올레아 유로파에아(Olea europaea)), 캐슈 오일(아나카르디움 옥시덴탈레(Anacardium occidentale)), 마카다미아 오일(마카다미아 인테르그리폴리아(Macadamia intergrifolia)), 아몬드 오일(프루누스 아미그달루스(Prunus amygdalus)) 또는 아라비도프시스 종자유(아라비도프시스 탈리아나)를 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법, 본 발명의 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나프스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 또는 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자를 사용하여 생성되거나 또는 이로부터 수득되는 지방산을 제공한다. 바람직하게는 상기 지방산은 DHA이다. 상기 지방산은 본 발명에 개시된 바와 같은 지방산 조성을 갖는 지방산들의 혼합물로 존재할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 지방산은 비-에스테르화된다.
또한 본 발명의 종자로부터 수득되는 종자박(seedmeal)을 제공한다. 바람직한 종자박은 비제한적으로 브라시카 나푸스, 비 준세아, 카멜리나 사티바 또는 글리시네 맥스 종자박을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 종자박은 본 발명에서 정의된 바와 같은 외인성 폴리뉴클레오티드(들) 및/또는 유전자 구조물을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 지질 또는 오일, 본 발명의 지방산, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에 따른 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자, 및 본 발명의 종자박 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 실시태양들에서, 상기 조성물은 약제, 식품 또는 농업용으로 적합한 담체, 종자 처리 화합물, 비료, 또 다른 식품 또는 사료 성분, 또는 첨가된 단백질 또는 비타민을 포함한다.
또한 본 발명의 지질 또는 오일, 본 발명의 지방산, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에 따른 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자, 본 발명의 종자박 (seedmeal) 및 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 포함하는 사료, 화장품 또는 화학약품을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 사료의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 지질 또는 오일, 본 발명의 지방산, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에 따른 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자, 본 발명의 종자박 및 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 적어도 하나의 다른 식품 성분과 함께 혼합함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 PUFA로부터 이익을 얻는 병의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에게 본 발명의 지질 또는 오일, 본 발명의 지방산, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에 따른 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자, 본 발명의 종자박, 본 발명의 조성물 및 본 발명의 사료 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
PUFA로부터 이익을 얻는 병의 예는 비제한적으로 심부정맥, 혈관성형술, 염증, 천식, 건선, 골다공증, 신장결석, AIDS, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 크론병, 정신분열증, 암, 태아알콜 증후군, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨증, 단극성 우울증, 공격성 적대감, 부신백질이영양증, 관상동맥 심장병, 고혈압, 당뇨병, 비만증, 알쯔하이머병, 만성 폐쇄성 폐 질병, 궤양성 대장염, 혈관성형술후 재협착증, 습진, 높은 혈압, 혈소판 응집, 위장출혈, 자궁내막증, 월경전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 바이러스 감염후 만성 피로, 또는 눈병을 포함한다.
또한 PUFA로부터 이익을 얻는 병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 지질 또는 오일, 본 발명의 지방산, 본 발명의 유전자 구조물, 본 발명의 단리된 및/또는 외인성 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 벡터 또는 유전자 구조물, 본 발명에 따른 세포, 본 발명의 트랜스제닉 유기체, 본 발명의 유지종자 식물, 본 발명의 브라시카 나푸스, 비 준세아 또는 카멜리나 사티바 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 종자, 본 발명의 식물, 식물 세포, 식물 부분 또는 종자, 본 발명의 종자박, 본 발명의 조성물 및 사료 중 하나 이상의 용도를 제공한다. 상기 약제의 제조는 본 발명에 개시된 바와 같은 병의 치료를 위해, 본 발명의 오일을 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 먼저 상기 오일의 정제 및/또는 트랜스에스테르화, 및/또는 DHA의 수준을 증가시키기 위한 상기 오일의 분별화를 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 방법은 캐놀라유와 같은 지질 또는 오일을, 상기 오일 중의 지방산을 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 또는 에틸 에스테르로 전환시키기 위해 처리함을 포함한다. 추가의 처리, 예를 들어 분별화 또는 증류를 적용시켜 상기 지질 또는 오일에 DHA를 농축시킬 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 약제는 DHA의 에틸 에스테르를 포함한다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 상기 약제 중의 DHA의 에틸 에스테르의 수준은 30% 내지 50%이다. 상기 약제는, 예를 들어 상기 약제 중에 전체 지방산 함량의 30% 내지 50%의 EPA의 에틸 에스테르를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 약제는 본 발명에 개시된 바와 같은 의학적 상태의 치료를 위해 인간 또는 동물 환자에게 투여하기에 적합하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 종자를 수득하고, 상기 수득된 종자를 재정적 이득을 위해 거래함을 포함하는, 종자의 거래 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 종자를 수득함은 본 발명의 식물을 재배하고/하거나 상기 식물로부터 종자를 수확함을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 종자를 수득함은 또한 상기 종자를 용기에 넣고/넣거나 상기 종자를 보관함을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 종자를 수득함은 상기 종자를 다른 장소로 운반함을 또한 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 상기 종자를 거래후 다른 장소로 운반함을 또한 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상기 거래를 컴퓨터와 같은 전자 수단을 사용하여 수행한다.
더욱 추가의 태양에서, 본 발명은
a) 본 발명의 종자를 포함하는 식물의 지상부를 베어내고, 줄지어 널어 놓고/놓거나 거둬 들이고,
b) 상기 식물의 상기 부분을 타작하고/하거나 키질하여 상기 식물 부분의 나머지로부터 종자를 분리시키고,
c) 상기 단계 b)에서 분리된 종자를 체질하고/하거나 분류하고, 상기 체질되고/되거나 분류된 종자를 통에 담아, 종자의 저장통을 생성시킴
을 포함하는, 종자의 저장통의 생산 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 적합한 경우, 본 발명의, 또는 본 발명에 유용한, 지질 또는 오일, 바람직하게는 종자유는 실시예 섹션의 표에 제공된 것들, 예를 들어 표 16의 종자 14의 지방 수준을 갖는다.
본 발명의 임의의 실시태양을, 달리 구체적으로 서술되지 않는 한 임의의 다른 실시태양들에 준용할 것이다.
본 발명은, 단지 예시를 목적으로 의도된 본 발명에 개시된 특정한 실시태양들로 범위가 제한되지 않는다. 작용상 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 발명에 개시된 바와 같이, 명백하게 본 발명의 범위내에 있다.
본 명세서 전체를 통해, 달리 구체적으로 서술되거나 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단일의 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹 또는 물질 조성물의 그룹에 대한 언급은 하나 및 복수(즉 하나 이상)의 상기 단계들, 물질의 조성물들, 단계들의 그룹들 또는 물질의 조성물들의 그룹을 포함하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명을 이후에 하기의 비제한적인 실시예에 의해, 첨부된 도면을 참조하여 개시한다.
도 1은 호기성 DHA 생합성 경로이다.
도 2는 pJP3416-GA7의 좌측 및 우측 경계 사이의 T-DNA 삽입 영역의 지도이다. RB는 우측 경계를 나타내고; LB, 좌측 경계; TER, 전사 종결자/폴리아데닐화 영역; PRO, 프로모터를 나타내고; 암호화 영역은 화살표 위에 나타내고, 프로모터 및 종결자는 화살표 아래에 나타낸다. Micpu-Δ6D, 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla) Δ6-불포화효소; Pyrco-Δ6E, 피라미모나스 코르다타(Pyramimonas cordata) Δ6-신장효소; Pavsa-Δ5D, 파블로바 살리나(Pavlova salina) Δ5-불포화효소; Picpa-ω3D, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) ω3-불포화효소; Pavsa-Δ4D, 피 살리나 Δ4-불포화효소; Lackl-Δ12D, 라칸세아 클루이베리(Lachancea kluyveri) Δ12-불포화효소; Pyrco-Δ5E, 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소. NOS는 아그로박테리움 튜메파시엔스 노팔린 신타제 전사 종결자/폴리아데닐화 영역을 나타내고; FP1, 브라시카 나푸스 절두된 나핀 프로모터; FAE1, 아라비도프시스 탈리아나 FAE1 프로모터; Lectin, 글리신 맥스 렉틴 전사 종결자/폴리아데닐화 영역을 나타내고; Cnl1 및 Cnl2는 리눔 유시타티시뮴 콘리닌1 또는 콘리닌2 프로모터 또는 종결자를 나타낸다. MAR은 니코티아나 타바쿰으로부터의 Rb7 기질 부착 영역을 나타낸다.
도 3은 pJP3404의 좌측 및 우측 경계 사이의 T-DNA 삽입 영역의 지도이다. 표지들은 도 2에서와 같다.
도 4는 pJP3367의 좌측 및 우측 경계 사이의 삽입 영역의 지도이다. 표지들은 도 2에서와 같다.
도 5는 T2 및 T3 세대 모두에서 다수의 독립적인 트랜스제닉 아라비도프시스 탈리아나 종자로부터의 종자 지질 중 전체 지방산의 백분율로서 DHA 수준이다. 괄호로 묶은 T2 사건들은 T3로 간주되었다. 콜럼비아(Columbia) 및 fad2 돌연변이체 에이 탈리아나 배경 모두로부터의 사건들을 나타낸다.
도 6은 트랜스제닉 아라비도프시스 탈리아나 종자로부터의 지질 중 전체 지방산 함량의 백분율로서 오일 함량(w/w) 대 DHA 함량이다.
도 7은 pJP3416-GA7을 사용하여 형질전환된 비 나푸스 배의 T-DNA 중 다른 트랜스유전자들에 비해 Δ6-불포화효소 유전자의 낮은 발현을 나타내는 전형적인 RT-PCR 젤이다. 좌측에서부터 레인들은 RT-PCR 산물들을 나타낸다: 1, DNA 크기 마커; 레인 2, Δ12 불포화효소; 레인 3, Δ3-불포화효소; 레인 4, Δ6-불포화효소 (낮은 발현); 레인 5, Δ6-신장효소; 레인 6, Δ5-불포화효소; 레인 7, Δ5-신장효소; 레인 8, Δ4-불포화효소.
도 8은 각각 트랜스제닉 35S:LEC2 브라시카 나푸스 체세포 배로부터 수득된 지질 중 전체 지방산의 백분율로서, 올레산의 백분율에 대해 플롯팅된 ALA의 백분율이다.
도 9는 A) 참치 오일, 및 B) 트랜스제닉 DHA 아라비도프시스 종자유에 대한 NMR에 의한 위치 분포 분석이다. 'DHA-알파' 표지된 피크들은 TAG의 sn-1 및 sn-3 위치에 존재하는 DHA의 양(상기는 위치 선호 없이 동등하게 전체 DHA의 66%일 것이다)을 나타내는 반면 'DHA-베타' 표지된 피크들은 TAG의 sn-2 위치에 존재하는 DHA의 양(상기는 선호 없이 동등하게 DHA의 33%일 것이다)을 나타낸다.
도 10은 트랜스제닉 에이 탈리아나 발생(회색) 및 성숙(흑색) 종자 중 주요 DHA-함유 트라이아실글리세롤 종의 LC-MS 분석이다. DHA 다음의 숫자는 다른 2 개 지방산 중 탄소 원자의 총수 및 이중 결합의 총수를 나타낸다. 따라서 DHA/34:1은 또한 TAG 56:7 등을 가리킬 수도 있다.
도 11은 pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert의 좌측 및 우측 경계 사이의 T-DNA 삽입 영역의 지도이다. 표지들은 도 2에서와 같고; SSU는 아라비도프시스 탈리아나 루비스코 작은 서브유닛 프로모터이다.
도 12는 후보 Δ12-불포화효소가 클로닝되는 NotI 제한 부위를 나타내는 2원 벡터 pJP3364의 지도이다.
도 13은 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T2 종자 집단의 종자 지질 중 지방산 20:4ω6(ARA)의 백분율을 나타내는 시그마플롯(SigmaPlot)을 사용하여 생성된 박스플롯(BoxPlot)이다. 0에 가장 가까운 각 박스의 경계는 25 번째 백분위수를 가리키며, 각 박스내 라인은 중앙값을 표시하고, 0에서부터 가장 먼 각 박스의 경계는 75 번째 백분위수를 가리킨다. 각 박스의 위 및 아래에 나타낸 오차 막대는 90 번째 및 10 번째 백분위수를 가리킨다.
도 14는 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T2 종자의 종자 지질 중 전체 지방산 함량의 백분율로서 ARA의 평균 수준이다.
도 15는 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T2 종자 집단의 종자 지질 중 지방산 20:2ω6(EDA)의 백분율을 나타내는 박스플롯이다. 상기 박스플롯은 도 13에 개시된 바와 같은 값들을 나타낸다.
도 16은 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T4 종자 집단의 종자 지질 중 ARA의 백분율을 나타내는 박스플롯이다. 상기 박스플롯은 도 13에 개시된 바와 같은 값들을 나타낸다.
도 17은 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T4 종자 집단의 종자 지질 중 전체 지방산 함량의 백분율로서 ARA의 평균 수준이다.
도 18은 pFN045-pFN050으로 형질전환된 아라비도프시스 T4 종자 집단의 종자 지질 중 EDA의 백분율을 나타내는 박스플롯이다. 상기 박스플롯은 도 13에 개시된 바와 같은 값들을 나타낸다.
도 19는 (A) 고리 및 측쇄 넘버링을 갖는 기본적인 피토스테롤 구조, (B) 상기 피토스테롤 중 일부의 화학 구조이다.
도 20은 공지된 LPAAT의 계통수이다.
도 21은 PC, CoA 풀, 및 TAG 풀 사이에서 지방산을 이동시키는 다양한 아실 교환 효소들이다. 문헌[Singh et al.(2005)]으로부터 적합화되었다.
서열목록에 대한 설명
서열번호 1 - pJP3416-GA7 뉴클레오티드 서열.
서열번호 2 - pGA7- mod_B 뉴클레오티드 서열.
서열번호 3 - pGA7- mod_C 뉴클레오티드 서열.
서열번호 4 - pGA7- mod_D 뉴클레오티드 서열.
서열번호 5 - pGA7- mod_E 뉴클레오티드 서열.
서열번호 6 - pGA7- mod_F 뉴클레오티드 서열.
서열번호 7 - pGA7- mod_G 뉴클레오티드 서열.
서열번호 8 - pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert 뉴클레오티드 서열.
서열번호 9 - 식물에서 라칸세아 클루이베리 Δ12 불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임.
서열번호 10 - 라칸세아 클루이베리 Δ12-불포화효소.
서열번호 11 - 식물에서 피키아 파스토리스 ω3 불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임.
서열번호 12 - 피키아 파스토리스 ω3 불포화효소.
서열번호 13 - 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 14 - 식물에서 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 1).
서열번호 15 - 식물에서 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 2).
서열번호 16 - 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소.
서열번호 17 - 오스트레오코커스 루시마리누스(Ostreococcus lucimarinus) Δ6-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 18 - 식물에서 오스트레오코커스 루시마리누스 Δ6-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임.
서열번호 19 - 오스트레오코커스 루시마리누스 Δ6-불포화효소.
서열번호 20 - 오스트레오코커스 타우리 Δ6-불포화효소.
서열번호 21 - 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 22 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(3' 단부에서 절두되었으며 작용성 신장효소를 암호화한다)(버전 1).
서열번호 23 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(3' 단부에서 절두되었으며 작용성 신장효소를 암호화한다)(버전 2).
서열번호 24 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(3' 단부에서 절두되었으며 작용성 신장효소를 암호화한다)(버전 3).
서열번호 25 - 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소.
서열번호 26 - 절두된 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소.
서열번호 27 - 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 28 - 식물에서 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 1).
서열번호 29 - 식물에서 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 2).
서열번호 30 - 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소.
서열번호 31 - 피라미모나스 코르다타 Δ5-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 32 - 피라미모나스 코르다타 Δ5-불포화효소.
서열번호 33 - 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 34 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 1).
서열번호 35 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 2).
서열번호 36 - 식물에서 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 3).
서열번호 37 - 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소.
서열번호 38 - 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 39 - 식물에서 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 1).
서열번호 40 - 식물에서 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임(버전 2).
서열번호 41 - 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소.
서열번호 42 - 아이소크리시스 갈바나 Δ9-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 43 - 아이소크리시스 갈바나 Δ9-신장효소.
서열번호 44 - 에밀리아니아 헉슬레이(Emiliania huxleyi) CCMP1516 Δ9-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 45 - 식물에서 에밀리아니아 헉슬레이 Δ9-신장효소의 발현을 위한 코돈-최적화된 개방 판독 프레임.
서열번호 46 - 에밀리아니아 헉슬레이 CCMP1516 Δ9-신장효소.
서열번호 47 - 파블로바 핑구이스 Δ9-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 48 - 파블로바 핑구이스 Δ9-신장효소.
서열번호 49 - 파블로바 살리나 Δ9-신장효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 50 - 파블로바 살리나 Δ9-신장효소.
서열번호 51 - 파블로바 살리나 Δ8-불포화효소를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 52 - 파블로바 살리나 Δ8-불포화효소.
서열번호 53 - P19 바이러스 억제인자.
서열번호 54 - V2 바이러스 억제인자.
서열번호 55 - P38 바이러스 억제인자.
서열번호 56 - Pe-P0 바이러스 억제인자.
서열번호 57 - RPV-P0 바이러스 억제인자.
서열번호 58 - P19 바이러스 억제인자를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 59 - V2 바이러스 억제인자를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 60 - P38 바이러스 억제인자를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 61 - Pe-P0 바이러스 억제인자를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 62 - RPV-P0 바이러스 억제인자를 암호화하는 개방 판독 프레임.
서열번호 63 - 아라비도프시스 탈리아나 LPAAT2.
서열번호 64 - 림난테스 알바(Limnanthes alba) LPAAT.
서열번호 65 - 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) LPAAT.
서열번호 66 - 마이크로모나스 푸실라 LPAAT.
서열번호 67 - 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) LPAAT.
서열번호 68 - 브라시사 나푸스 LPAAT.
서열번호 69 - 브라시카 나푸스 LPAAT.
서열번호 70 - 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) ω3 불포화효소.
서열번호 71 - 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana) ω3 불포화효소.
서열번호 72 - 피티움 이레귤라레 ω3 불포화효소.
일반적인 기법 및 정의
본 발명에 사용되는 모든 과학기술 용어들은 당해 분야(예를 들어 세포 배양, 분자 유전학, 지방산 합성, 트랜스제닉 식물, 단백질 화학, 및 생화학)의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주될 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 과정이다. 상기와 같은 기법은 하기와 같은 출처들에서 문헌 전체를 통해 개시되고 설명된다: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트물들 포함).
"및/또는", 예를 들어 "X 및/또는 Y"란 용어는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이며 이들 둘 다의 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명백한 지지를 제공하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 약이란 용어는, 달리 서술되지 않는 한, 지시된 값의 +/-10%, 보다 바람직하게 +/-5%, 보다 바람직하게 +/-1%를 지칭한다.
본 명세서 전체를 통해서 "포함하다"란 단어, 또는 "포함하는" 또는 "포함하고 있는"과 같은 변형들은 서술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함함을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 제외하는 것은 아니다.
선택된 정의
본 발명에 사용된 바와 같이, "추출된 식물 지질" 및 "단리된 식물 지질"이란 용어들은 예를 들어 파쇄에 의해, 식물 또는 종자와 같은 그의 부분으로부터 추출된 지질 조성물을 지칭한다. 상기 추출된 지질은, 예를 들어 식물 종자를 파쇄시켜 수득한 비교적 조질의 조성물이거나, 또는 상기 식물 물질로부터 유래된 물, 핵산, 단백질 및 탄수화물의 대부분(전부는 아니더라도), 하나 이상 또는 각각이 제거된 보다 정제된 조성물일 수 있다. 정제 방법의 예는 하기에 개시된다. 하나의 실시태양에서, 상기 추출되거나 단리된 식물 지질은 상기 조성물의 중량을 기준으로 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(w/w)의 지질을 차지한다. 상기 지질은 실온에서 고체 또는 액체(이때 액체는 오일인 것으로 간주된다)일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 추출된 지질은 또 다른 공급원에 의해 생성되지 않은 DHA(예를 들어 어유로부터의 DHA)와 같은 또 다른 지질과 블렌딩되지 않았다. 하나의 실시태양에서, 추출에 따른 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 및 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산 중 하나 이상 또는 전부의 비는, 완전한 종자 또는 세포에서의 비에 비해, 현저하게 변경되지 않았다(예를 들어 10% 또는 5% 이하로 변경되었다). 또 다른 실시태양에서, 상기 추출된 식물 지질은 완전한 종자 또는 세포에서의 비에 비해, 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 및 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산 중 하나 이상 또는 전부의 비를 변경시킬 수도 있는 수소화 또는 분별화 과정에 노출되지 않았다. 본 발명의 추출된 식물 지질이 오일 중에 포함될 때, 상기 오일은 스테롤과 같은 비-지방산 분자를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "추출된 식물 오일" 및 "단리된 식물 오일"이란 용어들은 추출된 식물 지질 또는 단리된 식물 지질을 포함하고 실온에서 액체인 물질 또는 조성물을 지칭한다. 상기 오일을 식물 또는 종자와 같은 그의 부분으로부터 수득한다. 상기 추출되거나 단리된 오일은 예를 들어 식물 종자를 파쇄시켜 수득되는 비교적 조질의 조성물, 또는 상기 식물 물질로부터 유래된 물, 핵산, 단백질 및 탄수화물의 대부분(전부는 아니더라도), 하나 이상 또는 각각이 제거된 보다 정제된 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 지질 또는 비-지질일 수 있는 다른 성분들을 포함할 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 오일 조성물은 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%(w/w)의 추출된 식물 지질을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 추출된 오일은 또 다른 공급원에 의해 생성되지 않은 DHA(예를 들어 어유로부터의 DHA)와 같은 또 다른 오일과 블렌딩되지 않았다. 하나의 실시태양에서, 추출에 따른 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 및 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산 중 하나 이상 또는 전부의 비는, 완전한 종자 또는 세포에서의 비에 비해, 현저하게 변경되지 않았다(예를 들어 10% 또는 5% 이하로 변경되었다). 또 다른 실시태양에서, 상기 추출된 식물 오일은 완전한 종자 또는 세포에서의 비에 비해, 올레산 대 DHA, 팔미트산 대 DHA, 리놀레산 대 DHA, 및 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산 중 하나 이상 또는 전부의 비를 변경시킬 수도 있는 수소화 또는 분별화 과정에 노출되지 않았다. 본 발명의 추출된 식물 오일은 스테롤과 같은 비-지방산 분자를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "오일"은 우세하게 지질을 포함하며 실온에서 액체인 조성물이다. 예를 들어, 본 발명의 오일은 바람직하게는 중량 기준으로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%의 지질을 포함한다. 전형적으로, 정제된 오일은 상기 오일 중에 적어도 90 중량%의 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함한다. 오일의 소량 성분, 예를 들어 다이아실글리세롤(DAG), 유리 지방산(FFA), 인지질 및 스테롤이 본 발명에 개시된 바와 같이 존재할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "지방산"이란 용어는 포화되거나 불포화된, 종종 긴 지방족 꼬리를 갖는 카복실산(또는 유기산)을 지칭한다. 전형적으로 지방산은 적어도 탄소수 8의 길이, 보다 바람직하게는 적어도 탄소수 12의 길이의 탄소-탄소 결합된 쇄를 갖는다. 대부분의 천연 지방산은 그의 생합성이 2 개의 탄소 원자를 갖는 아세테이트를 수반하므로 짝수의 탄소 원자를 갖는다. 상기 지방산은 유리 상태(비-에스테르화된) 또는 에스테르화된 형태로, 예를 들어 트라이글리세라이드, 다이아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 아실-CoA(티오-에스테르) 결합된 또는 다른 결합된 형태의 부분으로 존재할 수 있다. 상기 지방산은 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 또는 다이포스파티딜글리세롤로서 에스테르화될 수 있다.
"포화 지방산"은 상기 쇄를 따라 어떠한 이중 결합이나 다른 작용기들도 함유하지 않는다. "포화"란 용어는 모든 탄소(카복실산[-COOH] 기와 별개로)가 가능한 한 많은 수소를 함유한다는 점에서 수소를 지칭한다. 즉, 오메가(ω) 단부는 3 개의 수소(CH3-)를 함유하고, 쇄 내의 각각의 탄소는 2 개의 수소(-CH2-)를 함유한다.
"불포화 지방산"은 포화 지방산과 유사한 형태를 가지나, 단 하나 이상의 알켄 작용기가 상기 쇄를 따라 존재하며, 이때 각각의 알켄은 상기 쇄의 단일-결합된 "-CH2-CH2-" 부분이 이중으로-결합된 "-CH=CH-" 부분(즉, 또 다른 탄소에 이중 결합된 탄소)으로 치환된다. 상기 이중 결합의 어느 한쪽에 결합되는 상기 쇄 중의 2 개의 다음 탄소 원자들은 시스 또는 트랜스 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단일불포화 지방산"이란 용어는 탄소쇄 중에 적어도 12 개의 탄소 원자를 포함하고 상기 쇄 중에 단지 하나의 알켄기(탄소-탄소 이중 결합)만을 포함하는 지방산을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "다중불포화 지방산" 또는 "PUFA"란 용어는 탄소쇄 중에 적어도 12 개의 탄소 원자 및 2 개 이상의 알켄기(탄소-탄소 이중 결합)를 포함하는 지방산을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "장쇄 다중불포화 지방산" 및 "LC-PUFA"란 용어는 탄소 쇄 중에 적어도 20 개의 탄소 원자 및 적어도 2 개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 따라서 VLC-PUFA를 포함하는 지방산을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "매우 긴 장쇄 불포화 지방산" 및 "VLC-PUFA"란 용어는 탄소 쇄 중에 적어도 22 개의 탄소 원자 및 적어도 3 개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방산을 지칭한다. 통상적으로, 상기 지방산의 탄소 쇄 중의 탄소 원자의 수는 분지되지 않은 탄소 쇄를 지칭한다. 상기 탄소 쇄가 분지되는 경우, 상기 탄소 원자의 수는 측기 중의 것은 제외한다. 하나의 실시태양에서, 상기 장쇄 다중불포화 지방산은 ω3 지방산, 즉 상기 지방산의 메틸 단부로부터 세 번째 탄소-탄소 결합이 불포화된(탄소-탄소 이중 결합) 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 장쇄 다중불포화 지방산은 ω6 지방산, 즉 상기 지방산의 메틸 단부로부터 여섯 번째 탄소-탄소 결합이 불포화된(탄소-탄소 이중 결합) 것이다. 추가의 실시태양에서, 상기 장쇄 다중불포화 지방산은 아라키돈산(ARA, 20:4Δ5,8,11,14; ω6), 에이코사테트라에노산(ETA, 20:4Δ8,11,14,17, ω3), 에이코사펜타에노산(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17; ω3), 도코사펜타에노산(DPA, 22:5Δ7,10,13,16,19, ω3), 및 도코사헥사에노산(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,16,19, ω3)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 상기 LC-PUFA는 또한 다이호모-γ-리놀레산(DGLA) 또는 에이코사트라이에노산(ETrA, 20:3Δ11,14,17, ω3)일 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 LC-PUFA는 상기 화합물들 중 어느 하나 또는 전부의 혼합물일 수 있으며 다른 LC-PUFA 또는 이들 PUFA 중 어느 하나의 유도체를 포함할 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 ω3 지방산은 적어도 DHA, 바람직하게는 DPA 및 DHA, 또는 EPA, DPA 및 DHA이다.
더욱 또한, 본 발명에 사용된 바와 같이 "장쇄 다중불포화 지방산" 및 "매우 긴 장쇄 다중불포화 지방산"이란 용어는 유리 상태(비-에스테르화된) 또는 에스테르화된 형태로, 예를 들어 트라이글리세라이드, 다이아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 아실-CoA 결합된 또는 다른 결합된 형태의 부분으로 존재하는 지방산을 지칭한다. 상기 지방산은 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 또는 다이포스파티딜글리세롤 형태로서 에스테르화될 수 있다. 따라서, 상기 LC-PUFA는 세포의 지질 또는 세포, 조직 또는 유기체로부터 추출된 정제된 오일 또는 지질 중 형태들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 75% 또는 적어도 85%의 트라이아실글리세롤을 포함하는 오일을 제공하며, 이때 나머지는 다른 형태의 지질, 예를 들어 상기 언급한 것들로서 존재하며, 적어도 상기 트라이아실글리세롤은 LC-PUFA를 포함한다. 상기 오일을 후속으로, 예를 들어 유리 지방산의 방출을 위해 강염기에 의해 가수분해시키거나 또는 증류 등에 의해 정제하거나 처리할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "전체 ω6 지방산" 또는 "전체 ω6 지방산 함량" 등은 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타낸, 상기 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자 중의 에스테르화된 및 비-에스테르화된 모든 ω6 지방산의 합을 지칭한다. 이들 ω6 지방산은 (존재하는 경우) LA, GLA, DGLA, ARA, EDA 및 ω6-DPA를 포함하며, 임의의 ω3 지방산 및 단일불포화 지방산을 제외한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "신규 ω6 지방산" 또는 "신규 ω6 지방산 함량" 등은 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타낸, 상기 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자 중의 에스테르화된 및 비-에스테르화된, LA를 제외한 모든 ω6 지방산의 합을 지칭한다. 이들 신규의 ω6 지방산은 세포내에 도입되는 유전자 구조물(외인성 폴리뉴클레오티드)의 발현에 의해 본 발명의 세포, 식물, 식물 부분 및 종자에서 생성되는 지방산이며 (존재하는 경우) GLA, DGLA, ARA, EDA 및 ω6-DPA를 포함하고, LA 및 임의의 ω3 지방산 및 단일불포화 지방산은 제외한다. 예시적인 전체 ω6 지방산 함량 및 신규 ω6 지방산 함량을, 실시예 1에 개시된 바와 같이, 샘플 중 지방산의 FAME로의 전환 및 GC에 의한 분석에 의해 측정한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "전체 ω3 지방산" 또는 "전체 ω3 지방산 함량" 등은 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타낸, 상기 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자 중의 에스테르화된 및 비-에스테르화된 모든 ω3 지방산의 합을 지칭한다. 이들 ω3 지방산은 (존재하는 경우) ALA, SDA, EtrA, EPA, DPA 및 DHA를 포함하며, 임의의 ω6 지방산 및 단일불포화 지방산은 제외한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "신규 ω3 지방산" 또는 "신규 ω3 지방산 함량" 등은 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타낸, 상기 추출된 지질, 오일, 재조합 세포, 식물 부분 또는 종자 중의 에스테르화된 및 비-에스테르화된, ALA를 제외한 모든 ω3 지방산의 합을 지칭한다. 이들 신규의 ω3 지방산은 세포내에 도입되는 유전자 구조물(외인성 폴리뉴클레오티드)의 발현에 의해 본 발명의 세포, 식물, 식물 부분 및 종자에서 생성되는 지방산이며 (존재하는 경우) SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA를 포함하고, ALA 및 임의의 ω6 지방산 및 단일불포화 지방산은 제외한다. 예시적인 전체 ω3 지방산 함량 및 신규 ω3 지방산 함량을, 실시예 1에 개시된 바와 같이, 샘플 중 지방산의 FAME로의 전환 및 GC에 의한 분석에 의해 측정한다.
본 발명에 사용될 수 있는 불포화효소, 신장효소 및 아실 트랜스퍼라제 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자는 당해 분야에 공지된 것들 또는 이들의 동족체 또는 유도체 중 어느 하나이다. 상기와 같은 유전자 및 암호화된 단백질 크기의 예를 표 1에 나열한다. LC-PUFA 생합성에 관여하는 것으로 입증된 불포화효소들은 모두 소위 "전위" 불포화효소의 그룹에 속한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "전위 불포화효소"란 용어는 지질의 아실 쇄의 카복실기와 기존 불포화 부분 사이에 이중 결합을 도입시키는 효소 부류의 구성원을 지칭하며, 구조적으로 3 개의 고도로 보존된 히스티딘 박스를 포함하는 전형적인 지방산 불포화효소 도메인과 함께, N-말단 시토크롬 b5 도메인의 존재를 특징으로 한다(Napier et al., 1997).
본 발명에 사용하기 위한 신장효소 또는 불포화효소 중 어느 하나의 활성을 세포, 예를 들어 효모 세포, 식물 세포 또는 바람직하게는 체세포 배 또는 트랜스제닉 식물에서 상기 효소를 암호화하는 유전자를 발현시키고, 상기 세포, 배 또는 식물이, 상기 효소를 발현하지 않는 필적하는 세포, 배 또는 식물에 비해 LC-PUFA를 생성시키는 증가된 능력을 갖는지의 여부를 측정함으로써 시험할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 사용하기 위한 상기 불포화효소 및/또는 신장효소 중 하나 이상을 미세조류로부터 정제할 수 있다, 즉 상기는 미세조류로부터 정제될 수 있는 폴리펩티드와 아미노산 서열이 일치한다.
몇몇 효소를 구체적으로 본 발명에서 "이작용성"으로서 개시하지만, 상기와 같은 용어의 부재가 반드시, 특정 효소가 구체적으로 정의된 활성 외의 활성을 갖지 않음을 암시하는 것은 아니다.
불포화효소
본 발명에 사용된 바와 같이, "불포화효소"란 용어는 전형적으로 에스테르화된 형태, 예를 들어 아실-CoA 에스테르로 존재하는 지방산 기질의 아실기에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시킬 수 있는 효소를 지칭한다. 상기 아실기는 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린(PC), 또는 아실 담체 단백질(ACP), 또는 바람직한 실시태양에서 CoA로 에스테르화될 수 있다. 불포화효소는 일반적으로 3 개의 그룹으로 상응하게 분류될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 불포화효소는 전위 불포화효소이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ4-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 4 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. "Δ4-불포화효소"는 적어도 DPA를 DHA로 전환시킬 수 있다. DPA로부터 DHA를 생성시키는 불포화 단계는 포유동물 이외의 유기체에서 Δ4-불포화효소에 의해 촉매화되며, 상기 효소를 암호화하는 유전자는 담수 원생생물 종 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 및 해수 종 트라우스토키트리움 스페시즈(Thraustochytrium sp.)로부터 단리되었다(Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003). 하나의 실시태양에서, 상기 Δ4-불포화효소는 서열번호 41에 제공된 바와 같은 서열, 또는 트라우스토키트리움 스페시즈 Δ4-불포화효소, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 41과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
LC-PUFA 생합성에 관련된 클로닝된 유전자들
Figure 112020060294603-pat00001
Figure 112020060294603-pat00002
Figure 112020060294603-pat00003
Figure 112020060294603-pat00004
Figure 112020060294603-pat00005
* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ** 입증되지 않고/설명되지 않은 작용
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ5-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 5 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ5-불포화효소의 예는 문헌[Ruiz-Lopez et al. (2012)] 및 문헌[Petrie et al. (2010a)] 및 본 발명의 표 1에 나열된다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ5-불포화효소는 서열번호 30에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 30과 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ5-불포화효소는 서열번호 32에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 32와 적어도 53% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ5-불포화효소는 트라우스토키트리움 스페시즈 또는 에밀리아니아 헉슬레이로부터 유래한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ6-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 6 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ6-불포화효소의 예는 문헌[Ruiz-Lopez et al. (2012)] 및 문헌[Petrie et al. (2010a)] 및 본 발명의 표 1에 나열된다. 바람직한 Δ6-불포화효소는 마이크로모나스 푸실라, 피티움 이레귤라레 또는 오스트레오코커스 타우리이(Ostreococcus taurii)로부터 유래한다.
하나의 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 바람직하게는 식물 세포에서 하기 중 적어도 2 개, 바람직하게는 3 개 모두를 가짐을 추가의 특징으로 한다: i) 지방산 기질로서 리놀레산(LA, 18:2Δ9,12,ω6)보다 α-리놀렌산(ALA, 18:3Δ9,12,15,ω3)에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성; ii) 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA에 대해서보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성; 및 iii) ETrA에 대한 Δ8-불포화효소 활성. 상기와 같은 Δ6-불포화효소의 예를 표 2에 제공한다.
하나의 실시태양에서 Δ6-불포화효소는 상응하는 ω6 기질보다 ω3 기질에 대해 더 큰 활성을 가지며 재조합 세포, 예를 들어 식물 세포에서 외인성 폴리뉴클레오티드로부터 발현시 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50%의 효율로, 또는 효모 세포에서 발현시 적어도 35%의 효율로 옥타데카테트라에노산(스테아리돈산, SDA, 18:4Δ6,9,12,15,ω3)을 생산하는 ALA에 대한 활성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 LA보다 ALA에 대해 더 큰 활성, 예를 들어 적어도 약 2 배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 번 위치에 결합된 ALA에 대해서보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 더 큰 활성, 예를 들어 적어도 약 5 배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성 또는 적어도 10 배 더 큰 활성을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질 ALA-CoA 및 PC의 sn-2 번 위치에 결합된 ALA 모두에 대해서 활성을 갖는다.
아실-CoA 기질에 대해 활성을 갖는 것으로 입증된 불포화효소들
효소 유기체의 유형 종 수납 번호 단백질 크기 (aa’s) 참고문헌
D6-불포화효소 조류 만토니엘라 스쿠아마타 CAQ30479 449 Hoffmann et al., 2008
오스트레오코커스 타우리 AAW70159 456 Domergue et al., 2005
마이크로모나스 푸실라 EEH58637 Petrie et al., 2010a
(SEQ ID NO: 13)
D5-불포화효소 조류 만토니엘라 스쿠아마타 CAQ30478 482 Hoffmann et al., 2008

식물 아네모네 레베일레이 N/A Sayanova et al., 2007
w3-불포화효소 진균류 피티움 아파니데르마툼 FW362186.1 359 Xue et al., 2012; WO2008/054565
진균류 (난균) 피토프토라 소자에 FW362214.1 363 Xue et al., 2012; WO2008/054565
진균류 (난균) 피토프토라 라모룸 FW362213.1 361 Xue et al., 2012; WO2008/054565
하나의 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 ETA에 대해 검출 가능한 Δ5-불포화효소 활성을 갖지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 서열번호 16, 서열번호 19 또는 서열번호 20에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 16, 서열번호 19 또는 서열번호 20과 적어도 77% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ6-불포화효소는 서열번호 19 또는 서열번호 20에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 19 또는 서열번호 20과 적어도 67% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 상기 Δ6-불포화효소는 또한 Δ8-불포화효소 활성을 가질 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ8-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 8 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ8-불포화효소는 적어도 ETrA를 ETA로 전환시킬 수 있다. Δ8-불포화효소의 예는 표 1에 나열된다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ8-불포화효소는 서열번호 52에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 52와 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "ω3-불포화효소"는 지방산 기질의 메틸 단부로부터 3 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. 따라서 ω3-불포화효소는 LA를 ALA로 및 GLA를 SDA로(모두 C18 지방산), 또는 DGLA를 ETA로 및/또는 ARA를 EPA로(C20 지방산) 전환시킬 수 있다. 일부 ω3-불포화효소(그룹 I)는 C18 기질, 예를 들어 식물 및 시아노세균성 ω3-불포화효소에 대해서만 활성을 갖는다. 상기와 같은 ω3-불포화효소는 또한 Δ15-불포화효소이다. 다른 ω3-불포화효소는, C18 기질에 대한 활성 없이(그룹 II) 또는 약간의 활성(그룹 III)과 함께 C20 기질에 대해 활성을 갖는다. 상기와 같은 ω3-불포화효소는 또한 Δ17-불포화효소이다. 바람직한 ω3-불포화효소는 LA를 ALA로, GAL를 SDA로, DGLA를 ETA로, ARA를 EPA로 전환시키는 그룹 III 유형, 예를 들어 피키아 파스토리스 ω3-불포화효소(서열번호 12)이다. ω3-불포화효소의 예는 하기 문헌들에 개시된 것들을 포함한다[Pereira et al. (2004a)(사프로레그니아 디클리나 ω3-불포화효소, 그룹 II), Horiguchi et al. (1998), Berberich et al. (1998) 및 Spychalla et al. (1997)(씨 엘레간스 ω3-불포화효소, 그룹 III]. 바람직한 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 진균 ω3-불포화효소이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "진균 ω3-불포화효소"는 난균 공급원을 포함한 진균 공급원으로부터의 ω3-불포화효소, 또는 아미노산 서열이 상기와 적어도 95% 일치하는 그의 변이체를 지칭한다. 다수의 ω3-불포화효소를 암호화하는 유전자들이 진균 공급원, 예를 들어 피토프토라 인페스탄스(수탁 번호 CAJ30870, WO2005083053; 서열번호 70), 사프로레그니아 디클리나(수탁 번호 AAR20444, 문헌[Pereira et al., 2004a] & 미국특허 제 7211656 호), 피티움 이레귤라레(WO2008022963, 그룹 II; 서열번호 72), 모르티에렐라 알피나(문헌[Sakuradani et al., 2005]; 수탁 번호 BAD91495; WO2006019192), 탈라시오시라 슈도나나(문헌[Armbrust et al., 2004]; 수탁 번호 XP_002291057; WO2005012316, 서열번호 71), 라칸세아 클루이베리(또한 사카로마이세스 클루이베리로서 공지됨; 문헌[Oura et al., 2004]; 수탁 번호 AB118663)로부터 단리되었다. 문헌[Xue et al. (2012)]은 ω6 지방산 기질을 상응하는 ω3 지방산(이때 C20 기질이 바람직하다)으로 효율적으로 전환시킬 수 있는 난균 피티움 아파니데르마툼, 피토프토라 소자에, 및 피토프토라 라모룸으로부터의 ω3-불포화효소를 개시한다, 즉 상기 효소는 Δ15-불포화효소 활성보다 더 강한 Δ17-불포화효소 활성을 가졌다. 상기 효소는 Δ12-불포화효소 활성이 없지만, 기질로서 아실-CoA 및 인지질 분획 모두에서 지방산을 사용할 수 있었다.
보다 바람직한 실시태양에서, 상기 진균 ω3-불포화효소는 피키아 파스토리스(또한 코마가타엘라 파스토리스로서 공지됨) ω3-불포화효소/Δ15-불포화효소(문헌[Zhang et al., 2008]; 수탁 번호 EF116884; 서열번호 12) 또는 상기와 적어도 95% 일치하는 폴리펩티드이다.
하나의 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 적어도 ARA에서 EPA로, DGLA에서 ETA로, GLA에서 SDA로 중 하나, ARA에서 EPA로 및 DGLA에서 ETA로 모두, ARA에서 EPA로 및 GLA에서 SDA로 모두, 또는 이들 중 3 개 전부로 전환시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 적어도 3 개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 C20 지방산, 바람직하게는 ARA에 대해 Δ17-불포화효소 활성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 3 개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 C18 지방산, 바람직하게는 GLA에 대해 Δ15-불포화효소 활성을 갖는다. 바람직하게는 상기 두 활성이 모두 존재한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ12-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 12 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ12-불포화효소는 전형적으로 올레오일-포스파티딜콜린 또는 올레오일-CoA를 각각 리놀레오일-포스파티딜콜린(18:1-PC) 또는 리놀레오일-CoA(18:1-CoA)로 전환시킨다. 상기 PC 결합된 기질을 사용하는 하위부류를 인지질-의존성 Δ12-불포화효소라 칭하고, 후자의 하위부류를 아실-CoA 의존성 Δ12-불포화효소라 칭한다. 식물 및 진균 Δ12-불포화효소는 일반적으로 전자의 하위부류의 것인 반면, 동물 Δ12-불포화효소는 후자의 하위부류의 것, 예를 들어 문헌[Zhou et al.(2008)]에 의해 곤충으로부터 클로닝된 유전자에 의해 암호화된 Δ12-불포화효소이다. 다수의 다른 Δ12-불포화효소 서열들을 서열 데이터베이스의 탐색에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ15-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 15 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ15-불포화효소를 암호화하는 다수의 유전자들이 식물 및 진균 종으로부터 클로닝되었다. 예를 들어, US5952544는 식물 Δ15-불포화효소(FAD3)를 암호화하는 핵산을 개시한다. 이들 효소는 식물 Δ15-불포화효소의 특징인 아미노산 동기를 포함한다. WO200114538은 대두 FAD3를 암호화하는 유전자를 개시한다. 다수의 다른 Δ15-불포화효소 서열을 서열 데이터베이스의 탐색에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ17-불포화효소"는 지방산 기질의 카복실 단부로부터 17 번째 탄소-탄소 결합에 탄소-탄소 이중 결합을 도입시키는 불포화효소 반응을 수행하는 단백질을 지칭한다. Δ17-불포화효소를 또한 상기 효소가 C20 기질상에서 작용하여 ω3 결합에 불포화를 도입시키는 경우 ω3-불포화효소로서 간주한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 Δ12-불포화효소 및/또는 Δ15-불포화효소는 진균 Δ12-불포화효소 또는 진균 Δ15-불포화효소이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "진균 Δ12-불포화효소" 또는 "진균 Δ15-불포화효소"는 난균 공급원을 포함한 진균 공급원으로부터의 Δ12-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, 또는 아미노산 서열이 적어도 95% 일치하는 그의 변이체를 지칭한다. 다수의 불포화효소를 암호화하는 유전자들이 진균 공급원으로부터 단리되었다. US 7211656은 사프로레그니아 디클리나로부터의 Δ12-불포화효소를 개시한다. WO2009016202는 헬로브델라 로부스타(Helobdella robusta), 라카리아 비콜라(Laccaria bicolor), 로티아 기간테아(Lottia gigantea), 미크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 모노시가 브레비콜리스(Monosiga brevicollis), 마이코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis), 마이코스파에렐라 그라미니콜라(Mycospaerella graminicola), 나에글레리아 그루벤(Naegleria gruben), 넥트리아 하에마토코카(Nectria haematococca), 네마토스텔라 벡텐시스(Nematostella vectensis), 피코마이세스 블라케슬리아누스(Phycomyces blakesleeanus), 트리코더마 레시이(Trichoderma resii), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 포스티아 플라센타(Postia placenta), 셀라기넬라 모엘렌도르피이(Selaginella moellendorffii) 및 미크로도키움 니발레(Microdochium nivale)로부터의 진균 불포화효소를 개시한다. WO2005/012316은 탈라시오시라 슈도나나 및 다른 진균으로부터의 Δ12-불포화효소를 개시한다. WO2003/099216은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 단리된 진균 Δ12-불포화효소 및 Δ15-불포화효소를 암호화하는 유전자를 개시한다. WO2007133425는 하기로부터 단리된 진균 Δ15 불포화효소를 개시한다: 사카로마이세스 클루이베리, 모르티에렐라 알피나, 아스퍼질러스 니둘란스, 뉴로스포라 크라사, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) 및 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea). 바람직한 Δ12 불포화효소는 피토프토라 소자에로부터의 것이다(Ruiz-Lopez et al., 2012).
진균 Δ12-불포화효소, 및 진균 Δ15-불포화효소의 독특한 하위부류는 이작용성 진균 Δ12/Δ15-불포화효소이다. 이들을 암호화하는 유전자는 푸사리움 모노리포르메(수탁 번호 DQ272516, Damude et al., 2006), 아칸타모에바 카스텔라니이(Acanthamoeba castellanii)(수탁 번호 EF017656, Sayanova et al., 2006), 페르킨수스 마리누스(Perkinsus marinus)(WO2007042510), 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea)(수탁 번호 EF536898, Meesapyodsuk et al., 2007) 및 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus)(수탁 번호 AF269266, Zhang et al., 2007)로부터 클로닝되었다..
또 다른 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 상응하는 아실-PC 기질보다 아실-CoA 기질에 적어도 약간의 활성, 바람직하게는 더 큰 활성을 갖는다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "상응하는 아실-PC 기질"은 지방산이 아실-CoA 기질에서와 동일한 지방산인 포스파티딜콜린(PC)의 sn-2 위치에서 에스테르화된 지방산을 지칭한다. 예를 들어, 상기 아실-CoA 기질은 ARA-CoA일 수 있으며 상응하는 아실-PC 기질은 sn-2 ARA-PC이다. 하나의 실시태양에서, 상기 활성은 적어도 2 배 더 크다. 바람직하게, 상기 ω3-불포화효소는 아실-CoA 기질 및 그의 상응하는 아실-PC 기질 모두에 대해 적어도 약간의 활성을 가지며, C18 및 C20 기질 모두에 대해 활성을 갖는다. 상기와 같은 ω3-불포화효소의 예는 상기 나열된 클로닝된 진균 불포화효소들 가운데 공지되어 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 ω3-불포화효소는 서열번호 12에 제공된 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 12에 적어도 60% 일치하는, 바람직하게는 서열번호 12에 적어도 90% 또는 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
더욱 추가의 실시태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 불포화효소는 상응하는 아실-PC 기질보다 아실-CoA 기질에 더 큰 활성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 불포화효소는 상응하는 아실-CoA 기질보다 아실-PC 기질에 더 큰 활성을 갖지만, 상기 두 기질 모두에 대해 약간의 활성을 갖는다. 상기에 개략한 바와 같이, "상응하는 아실-PC 기질"은 지방산이 상기 아실-CoA 기질에서와 동일한 지방산인 포스파티딜콜린(PC)의 sn-2 위치에서 에스테르화된 지방산을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 더 큰 활성은 적어도 2 배 더 크다. 하나의 실시태양에서, 상기 불포화효소는 Δ5 또는 Δ6-불포화효소, 또는 ω3-불포화효소이며, 이들의 예는 비제한적으로 표 2에 나열된 것들을 제공한다. 불포화효소가 어느 기질, 즉 아실-CoA 또는 아실-PC 기질에서 작용하는 지를 시험하기 위해서, 문헌[Domergue et al.(2003) and (2005]에 개시된 바와 같이 효모 세포에서 분석을 수행할 수 있다. 불포화효소에 대한 아실-CoA 기질 능력은, 신장효소가 상기 불포화효소와 함께 발현될 때 식물 세포에서 적어도 약 90%의 효소 전환효율(이때 상기 신장효소는 상기 불포화효소의 산물의 신장을 촉매화한다)을 갖는 경우로 추론될 수 있다. 이를 근거로, GA7 구조물로부터 발현된 Δ5-불포화효소 및 Δ4-불포화효소(실시예 2 및 3) 및 그의 변이체(실시예 5)는 그들의 각각의 아실-CoA 기질, ETA-CoA 및 DPA-CoA를 불포화시킬 수 있다.
신장효소
생화학적 증거는 지방산 신장이 4 개의 단계, 즉 축합, 환원, 탈수 및 2차 환원으로 이루어짐을 암시한다. 본 발명과 관련하여, "신장효소"는 적합한 생리학적 조건 하에서, 신장 복합체의 다른 구성원들의 존재 하에서 축합 단계를 촉매화하는 폴리펩티드를 지칭한다. 세포에서 상기 신장 단백질 복합체의 오직 축합 성분("신장효소")만의 이종 또는 동종 발현이 각 아실 쇄의 신장에 필요한 것으로 나타났다. 따라서, 상기 도입된 신장효소는 트랜스제닉 호스트로부터 환원 및 탈수 활성들을 성공적으로 모집하여 성공적인 아실 신장을 수행할 수 있다. 지방산 기질의 쇄 길이 및 불포화 정도에 관하여 상기 신장 반응의 특이성은 상기 축합 성분에 있는 것으로 생각된다. 상기 성분은 또한 상기 신장 반응의 율속 인자인 것으로 생각된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ5-신장효소"는 적어도 EPA를 DPA로 전환시킬 수 있다. Δ5-신장효소의 예는 WO2005/013253에 개시된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ5-신장효소는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 65%, 보다 바람직하게는 적어도 70% 또는 가장 바람직하게는 적어도 80% 또는 90%의 효율로 DPA를 생산하는 EPA에 대한 활성을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 Δ5-신장효소는 서열번호 37에 제공된 바와 같은 아미노산 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 37에 적어도 47% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 Δ6-신장효소는 오스트레오코커스 타우리이 또는 오스트레오코커스 루시마리누스로부터 유래된다(US2010/088776).
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ6-신장효소"는 적어도 SDA를 ETA로 전환시킬 수 있다. Δ6-신장효소의 예는 표 1에 나열된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 신장효소는 서열번호 25에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편(예를 들어 서열번호 26으로서 제공된 단편), 또는 서열번호 25 및 서열번호 26 중 하나 또는 둘 다에 적어도 55% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ6-신장효소는 피스코미트렐라 파텐스(Zank et al., 2002; 수탁 번호 AF428243) 또는 탈라시오시라 슈도나나(Ruiz-Lopez et al., 2012)로부터 유래된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Δ9-신장효소"는 적어도 ALA를 ETrA로 전환시킬 수 있다. Δ9-신장효소의 예는 표 1에 나열된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 Δ9-신장효소는 서열번호 43에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 43에 적어도 80% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ9-신장효소는 서열번호 46에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 46에 적어도 81% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ9-신장효소는 서열번호 48에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 48에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Δ9-신장효소는 서열번호 50에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 50에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 Δ9-신장효소는 상응하는 ω3 기질보다 ω6 기질에 더 큰 활성을 갖거나, 또는 그 반대도 역시 같다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "상응하는 ω3 기질보다 ω6 기질에 더 큰 활성을 갖는다"란 용어는 ω3 불포화효소의 작용에 따라 상이한 기질들에 대한 상기 효소의 상대 활성을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 ω6 기질은 LA이고 상기 ω3 기질은 ALA이다.
Δ6-신장효소 및 Δ9-신장효소 활성을 갖는 신장효소는 적어도 (i) SDA를 ETA로 전환시킬 수 있고 (ii) ALA를 ETrA로 전환시킬 수 있으며 Δ9-신장효소 활성보다 더 큰 Δ6-신장효소 활성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 신장효소는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%인 ETA를 생산하는 SDA에 대한 전환효율, 및/또는 적어도 6% 또는 보다 바람직하게는 적어도 9%인 ETrA를 생산하는 ALA에 대한 전환효율을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 신장효소는 Δ9-신장효소 활성보다 적어도 약 6.5배 더 큰 Δ6-신장효소 활성을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 상기 신장효소는 검출 가능한 Δ5-신장효소 활성을 갖지 않는다.
다른 효소
본 발명에 사용된 바와 같이, "1-아실-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제"(LPAAT)(또한 리소포스파티드산-아실트랜스퍼라제 또는 아실CoA-리소포스파티데이트-아실트랜스퍼라제라 칭한다)란 용어는 sn-2 위치에서 sn-1-아실-글리세롤-3-포스페이트(sn-1 G-3-P)를 아실화하여 포스파티드산(PA)을 형성시키는 단백질을 지칭한다. 따라서, "1-아실-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 활성"이란 용어는 PA(EC 2.3.1.51)를 생성시키는 sn-2 위치에서 (sn-1 G-3-P)의 아실화를 지칭한다. 바람직한 LPAAT는 기질로서 다중불포화된 C22 아실-CoA를 사용하여 상기 다중불포화된 C22 아실기를 LPA의 sn-2 위치로 운반하여 PA를 형성시킬 수 있는 것들이다. 상기와 같은 LPAAT는 실시예 13에 예시되며 상기 중에 개시된 바와 같이 시험될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 유용한 LPAAT는 서열번호 63 내지 69 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 63 내지 69 중 임의의 하나 이상에 적어도 40% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 유용한 LPAAT는 서열번호 64, 65 및 67 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 64, 65 및 67 중 임의의 하나 이상에 적어도 40% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제"(EC 2.3.1.20; DGAT)는 아실-CoA로부터 지방 아실기를 다이아실글리세롤 기질로 운반하여 트라이아실글리세롤을 생성시키는 단백질을 지칭한다. 따라서, "다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성"이란 용어는 트라이아실글리세롤을 생성시키는 아실-CoA의 다이아실글리세롤로의 운반을 지칭한다. 각각 DGAT1, DGAT2 및 DGAT3 라 칭하는 3 개의 공지된 유형의 DGAT가 존재한다. DGAT1 폴리펩티드는 전형적으로 10 개의 막관통 도메인을 가지며, DGAT2는 전형적으로 2 개의 막관통 도메인을 갖는 반면, DGAT3은 전형적으로 용해성이다. DGAT1 폴리펩티드의 예는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)(수탁 번호 XP_755172), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(CAB44774), 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis)(AAR11479), 베르니시아 포르디이(Vernicia fordii)(ABC94472), 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)(ABV21945, ABV21946), 유오니무스 알라투스(Euonymus alatus)(AAV31083), 카에노라브디티스 엘레간스(AAF82410), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(NP_445889), 호모 사피엔스(NP_036211)로부터의 DGAT1 유전자뿐만 아니라 이들의 변종 및/또는 돌연변이체들에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함한다. DGAT2 폴리펩티드의 예는 아라비도프시스 탈리아나(수탁 번호 NP_566952), 리시누스 코뮤니스(AAY16324), 베르니시아 포르디이(ABC94474), 모르티에렐라 라마니아나(Mortierella ramanniana)(AAK84179), 호모 사피엔스(Q96PD7, Q58HT5), 보스 타우루스(Q70VD8), 무스 무스쿨루스(AAK84175), 마이크로모나스 CCMP1545로부터의 DGAT2 유전자뿐만 아니라 이들의 변종 및/또는 돌연변이체들에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함한다. DGAT3 폴리펩티드의 예는 땅콩(아라키스 히포가에아, Saha, et al., 2006)로부터의 DGAT3 유전자뿐만 아니라 이들의 변종 및/또는 돌연변이체들에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드/펩티드
폴리펩티드와 관련하여 "재조합"이란 용어는 자연적으로 생성되는 경우 고유 상태에 비해 세포에 의해서, 또는 무세포 발현 시스템에서, 변경된 양으로 또는 변경된 비율로 생성될 때의 폴리펩티드를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 상기 폴리펩티드를 자연적으로 생산하지 않는 세포이다. 그러나, 상기 세포는 상기 폴리펩티드의 변경된 양을 생성되게 하는 비-내인성 유전자를 포함하는 세포일 수도 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 상기가 생성되는 세포, 조직, 기관 또는 유기체, 또는 무세포 발현 시스템 중의 폴리펩티드, 즉 상기가 생성된 트랜스제닉(재조합) 세포의 다른 성분들로부터 정제되거나 분리되지 않은 폴리펩티드, 및 적어도 일부 다른 성분들로부터 후속으로 정제되지 않는 상기와 같은 세포 또는 무세포 시스템에서 생성된 폴리펩티드를 포함한다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 일반적으로 호환적으로 사용된다.
폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 부류는 기준 아미노산 서열과의 그의 아미노산 서열의 일치성(일치성%) 정도에 의해서, 또는 또 다른 것에 대해서보다 하나의 기준 아미노산 서열에 더 큰 일치성%를 가짐으로써 한정될 수 있다. 기준 아미노산 서열에 대한 폴리펩티드의 일치성%는 전형적으로 중단 생성 벌점 = 5 및 중단 연장 벌점 = 0.3의 매개변수로 GAP 분석(Needleman and Wunsch, 1970; GCG 프로그램)에 의해 측정한다. 조회 서열은 길이가 적어도 15 아미노산이며 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 15 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 조회 서열은 길이가 적어도 50 아미노산이며 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 50 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 조회 서열은 길이가 적어도 100 아미노산이며 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 100 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 조회 서열은 길이가 적어도 250 아미노산이며 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 적어도 250 아미노산의 영역에 걸쳐 정렬시킨다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 GAP 분석은 상기 두 서열을 전체 길이에 걸쳐 정렬시킨다. 상기 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 부류는 상기 기준 폴리펩티드와 동일한 효소 활성, 또는 상기와 상이한 활성을 갖거나, 또는 상기 활성이 없을 수도 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 상기 기준 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%의 효소 활성을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "생물 활성" 단편은 완전길이 기준 폴리펩티드의 한정된 활성을 유지하는, 예를 들어 불포화효소 및/또는 신장효소 활성 또는 다른 효소 활성을 갖는 본 발명에 정의된 폴리펩티드의 일부이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 생물 활성 단편은 완전길이 폴리펩티드를 제외한다. 생물 활성 단편은 상기 단편이 상기 한정된 활성을 유지하는 한 임의의 크기의 부분일 수 있다. 바람직하게, 상기 생물 활성 단편은 상기 완전길이 단백질의 활성의 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 90%의 활성을 유지한다.
한정된 폴리펩티드 또는 효소에 관하여, 본 발명에 제공된 것들보다 더 높은 일치성% 숫자는 바람직한 실시태양을 포함함을 알 것이다. 따라서, 적용 가능한 경우, 최소 일치성% 숫자에 비추어, 상기 폴리펩티드/효소가 관련된 지명된 서열번호와 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 65%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 76%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 보다 바람직하게는 적어도 99.1%, 보다 바람직하게는 적어도 99.2%, 보다 바람직하게는 적어도 99.3%, 보다 바람직하게는 적어도 99.4%, 보다 바람직하게는 적어도 99.5%, 보다 바람직하게는 적어도 99.6%, 보다 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8%, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99.9% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 정의된 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체/돌연변이체를, 적합한 뉴클레오티드 변화를 본 발명에 정의된 핵산에 도입시키거나, 또는 목적하는 폴리펩티드의 시험관내 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변이체/돌연변이체는 예를 들어 상기 아미노산 서열내 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 조합을 최종 구조물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 상기 최종 펩티드 생성물은 목적하는 효소 활성을 가져야 한다.
돌연변이(변경된) 펩티드를 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 하라야마(Harayama)(1998)에 의해 광범위하게 개시된 바와 같이 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드에 대해 시험관내 돌연변이 또는 DNA 셔플링 기법을 수행할 수 있다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유도된 생성물을 본 발명에 개시된 기법을 사용하여 선별하여, 상기 생성물이 예를 들어 불포화효소 또는 신장효소 활성을 갖는지를 쉽게 측정할 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체의 설계에 있어서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형되는 특징(들)에 따라 변할 것이다. 상기 돌연변이 부위들을 예를 들어 (1) 먼저 선택된 보존적 아미노산으로 치환하고 이어서 성취되는 결과에 따라 보다 근본적인 선택으로 치환하거나, 또는 (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 배치된 위치에 인접한 다른 잔기들을 삽입함으로써 개별적으로 또는 연속해서 변형시킬 수 있다.
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 15 개의 잔기, 보다 바람직하게는 약 1 내지 10 개의 잔기, 및 전형적으로 약 1 내지 약 5 개의 연속적인 잔기들의 범위이다.
치환 돌연변이체는 폴리펩티드 중에 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발에 가장 크게 중요한 부위는 천연 불활성효소 또는 신장효소들 가운데 보존되지 않은 부위를 포함한다. 이들 부위는 바람직하게는 효소 활성을 유지시키기 위해서 비교적 보존적인 방식으로 치환된다. 상기와 같은 보존적 치환을 표 3에 "예시적인 치환"의 제목하에 나타낸다.
바람직한 실시태양에서 돌연변이체/변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드와 비교시 단지 1 또는 2 또는 3 또는 4 개, 또는 그 이하의 보존적 아미노산 변화를 갖는다. 보존적 아미노산 변화에 대한 세부사항들을 표 3에 제공한다. 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 상기와 같은 작은 변화들은 재조합 세포에서 발현시 상기 폴리펩티드의 활성을 변경시키지 않음이 합당하게 예견될 수 있다.
폴리펩티드를 당해 분야에 공지된 방법에 따른 천연 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드의 생성 및 회수를 포함한 다양한 방식으로 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 재조합 폴리펩티드를, 본 발명에 정의된 숙주 세포와 같이, 상기 폴리펩티드를 생성시키기에 유효한 조건 하에서 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 배양함으로써 생성시킨다. 상기 폴리펩티드를 생성시키기에 보다 바람직한 세포는 식물, 특히 식물의 종자 중의 세포이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 예를 들어 유전자, 단리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자 구조물, 예를 들어 T-DNA 분자, 또는 키메릭 DNA일 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공하고/하거나 사용한다. 상기는 게놈 또는 합성 기원의 이중 가닥 또는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA이고 탄수화물, 지질, 단백질 또는 다른 물질과 결합하여 본 발명에 정의된 특정한 활성을 수행할 수 있다. "폴리뉴클레오티드"란 용어는 본 발명에서 "핵산 분자"란 용어와 호환적으로 사용된다. "단리된 폴리뉴클레오티드"는, 천연 공급원으로부터 수득되는 경우, 그의 고유의 상태 또는 비-천연 폴리뉴클레오티드와 결합되거나 연결된 폴리뉴클레오티드 서열과 분리된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 바람직하게, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기와 천연으로 결합된 다른 성분들이 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 없다.
예시적인 치환
원래의 잔기 예시적인 치환
Ala (A) val; leu; ile; gly
Arg (R) lys
Asn (N) gln; his
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gln (Q) asn; his
Glu (E) asp
Gly (G) pro, ala
His (H) asn; gln
Ile (I) leu; val; ala
Leu (L) ile; val; met; ala; phe
Lys (K) arg
Met (M) leu; phe
Phe (F) leu; val; ala
Pro (P) gly
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr
Tyr (Y) trp; phe
Val (V) ile; leu; met; phe, ala
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 비천연이다. 비천연 폴리뉴클레오티드의 예는 비제한적으로 돌연변이된 것들(예를 들어 본 발명에 개시된 방법들을 사용함으로써), 및 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임이 천연으로 결합되지 않은 프로모터에 작동적으로 연결되는(예를 들어 본 발명에 개시된 구조물에서와 같이) 폴리뉴클레오티드를 포함한다.본 발명에 사용된 바와 같이, "유전자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로 해석되어야 하며 전사된 영역, 및 번역된 경우, 구조 유전자의 단백질 암호화 영역을 포함하고 어느 한 단부에, 약 2 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 단부 모두상의 암호화 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함하며 상기 유전자의 발현에 관련되는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이에 관하여, 상기 유전자는 주어진 유전자와 자연적으로 관련된 조절 신호, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호, 또는 이종 조절 신호(이 경우에, 상기 유전자를 "키메릭 유전자"라 칭한다)를 포함한다. 상기 단백질 암호화 영역의 5'에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열을 5' 비-번역 서열이라 칭한다. 상기 단백질 암호화 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열을 3' 비-번역 서열이라 칭한다. "유전자"란 용어는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론", 또는 "중재 영역" 또는 "중재 서열"이라 칭하는 비-암호화 서열로 중단될 수도 있는 암호화 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자의 분절이다. 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인헨서를 함유할 수도 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사물로부터 제거되거나 "연접 파괴"된다; 따라서 인트론은 상기 전령 RNA(mRNA) 전사물에 존재하지 않는다. 상기 mRNA는 번역하는 동안 발생 폴리펩티드 중의 아미노산의 서열 또는 순서를 명시하는 작용을 한다. "유전자"란 용어는 본 발명에 개시된 본 발명의 단백질 전부 또는 그의 일부를 암호화하는 합성 또는 융합 분자 및 상기 중 어느 하나에 대한 상보성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "키메릭 DNA" 또는 "키메릭 유전자 구조물"은 그의 고유의 위치에서 고유의 DNA 분자가 아닌 DNA를 지칭하며; 또한 본 발명에서 "DNA 구조물"이라 칭한다. 전형적으로, 키메릭 DNA 또는 키메릭 유전자는 자연에서 함께 작동적으로 연결되어 발견되지 않는, 즉 서로에 대해 이종인 조절 및 전사된 또는 단백질 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 키메릭 DNA 또는 키메릭 유전자는 상이한 출처로부터 유래되는 조절 서열 및 암호화 서열, 또는 동일한 출처로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열되는 조절 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있다.
"내인성"이란 용어는 본 발명에서 예를 들어 연구중인 식물과 동일한 발생 단계에서 변형되지 않은 식물 중에 통상적으로 존재하거나 또는 상기 중에서 생성되는 물질을 지칭하는데 사용된다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 중 그의 본래 위치의 고유 유전자를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합 핵산 분자", "재조합 폴리뉴클레오티드" 또는 그의 변형들은 재조합 DNA 기술에 의해 제작되거나 변형된 핵산 분자를 지칭한다. "외래 폴리뉴클레오티드" 또는 "외인성 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종 폴리뉴클레오티드" 등의 용어들은 실험 조작에 의해 세포의 게놈내로 도입되는 임의의 핵산을 지칭한다. 외래 또는 외인성 유전자는 비-고유 유기체에 삽입되는 유전자, 고유 숙주내 새로운 위치에 도입된 고유 유전자, 또는 키메릭 유전자일 수 있다. "트랜스유전자"는 형질전환 과정에 의해 게놈내로 도입된 유전자이다. "유전자 변형된", "트랜스제닉"이란 용어 및 그의 변형들은 유전자를 형질전환 또는 형질도입에 의해 세포에 도입시키거나, 유전자를 세포에서 돌연변이시키고 유전자가 작용하는 세포 또는 유기체 또는 이들의 자손에서 상기 유전자의 조절을 변경 또는 조절함으로써 세포에 유전자를 도입시킴을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "게놈 영역"은 트랜스유전자, 또는 트랜스유전자들의 그룹(또한 본 발명에서 클러스터라 칭한다)이 세포 또는 그의 선조에 삽입된, 게놈내 위치를 지칭한다. 상기와 같은 영역은 오직 인간의 중재에 의해 통합된, 예를 들어 본 발명에 개시된 방법들에 의해 통합된 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드와 관련하여 "외인성"이란 용어는 그의 고유의 상태에 비해, 세포 중에 변경된 양으로 존재하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 포함하지 않는 세포이다. 그러나, 상기 세포는 암호화된 폴리펩티드를 변경된 양으로 생성시키는 비-내인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포일 수 있다. 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드는 존재하는 트랜스제닉(재조합) 세포, 또는 무세포 발현 시스템의 다른 성분들로부터 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드, 및 상기와 같은 세포 또는 무세포 시스템에서 생산되고 후속으로 적어도 일부 다른 성분들로부터 정제되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드(핵산)는 자연에 존재하는 뉴클레오티드의 연속적인 신장부이거나, 또는 단일 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 결합된 상이한 출처(천연 및/또는 합성)로부터의 뉴클레오티드의 2 개 이상의 연속적인 신장부일 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 키메릭 폴리뉴클레오티드는, 관심 세포 중에서 개방 판독 프레임의 전사를 구동하기에 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 적어도 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "상이한 외인성 폴리뉴클레오티드"란 용어 또는 그의 변형은 각각의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 적어도 하나, 바람직하게는 그 이상의 뉴클레오티드만큼 상이함을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포내 단백질로 번역되거나 번역되지 않을 수도 있는 RNA를 암호화한다. 일례로, 각각의 폴리뉴클레오티드는 상이한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것이 바람직하다. 또 다른 예에서, 각각의 외인성 폴리뉴클레오티드는 다른 외인성 폴리뉴클레오티드에 95% 미만, 90% 미만, 또는 80% 미만으로 일치한다. 바람직하게는, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 작용성 단백질/효소를 암호화한다. 더욱 또한, 상이한 외인성 폴리뉴클레오티드는 각각의 폴리뉴클레오티드가, 예를 들어 또 다른 외인성 폴리뉴클레오티드와 중복되지 않는 염색체외 운반 핵산의 별개의 영역이라는 점에서 중복되지 않는 것이 바람직하다. 최소한, 각각의 외인성 폴리뉴클레오티드는 전사 개시 및 정지 부위뿐만 아니라 지정된 프로모터를 갖는다. 개별적인 외인성 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다.
상기 정의된 폴리뉴클레오티드에 관하여, 상기에 제공된 것을 초과하는 일치율% 숫자는 바람직한 실시태양을 포함함을 알 것이다. 따라서, 적용가능한 경우, 최소 일치율% 숫자에 비추어, 상기 폴리뉴클레오티드는 관련된 지명된 서열번호에 60% 이상, 보다 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 91% 이상, 보다 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.1% 이상, 보다 바람직하게는 99.2% 이상, 보다 바람직하게는 99.3% 이상, 보다 바람직하게는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상, 보다 바람직하게는 99.6% 이상, 보다 바람직하게는 99.7% 이상, 보다 바람직하게는 99.8% 이상, 보다 바람직하게는 99.9% 이상 일치하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 엄격한 조건은 (1) 하이브리드화 동안 42 ℃에서 변성제, 예를 들어 폼아미드, 예를 들어 50%(v/v) 폼아미드를 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민, 0.1% 피콜(Ficoll), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, pH 6.5에서 750 mM NaCl, 75 mM 나트륨 시트레이트를 갖는 50 mM 나트륨 포스페이트 완충제와 함께 사용하거나; 또는 (2) 42 ℃에서, 0.2 x SSC 및 0.1% SDS 중의 50% 폼아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5 x 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50 g/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고/하거나, (3) 낮은 이온 강도 및 높은 세척 온도, 예를 들어 50 ℃에서 0.015 M NaCl/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% SDS를 사용하는 것들이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 분자에 비해 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 기준 서열에 비해 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드는 천연(즉, 천연 출처로부터 단리된)이거나 합성(예를 들어 상술한 바와 같이 핵산상에서 부위-지향된 돌연변이 또는 DNA 셔플링을 수행함으로써)일 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 공급원 또는 재조합체로부터 유래할 수 있음이 자명하다. 바람직한 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에 공지된 바와 같이, 식물 세포에서 번역을 위해 코돈-최적화된 암호화 영역을 갖는 것들이다.
재조합 벡터
본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명에 정의된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 전달할 수 있는 임의의 벡터내에 삽입된, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 발현 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 분자(들)가 유래된 종 이외의 종으로부터 유래되는, 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드 분자에 인접하여 자연에서 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 상기 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있으며 전형적으로는 플라스미드이다. 플라스미드 벡터는 전형적으로, 용이한 선택, 증폭, 및 원핵생물 세포에서 발현 카세트의 형질전환을 제공하는 추가적인 핵산 서열을 포함하며, 예를 들어 pUC-유도된 벡터, pSK-유도된 벡터, pGEM-유도된 벡터, pSP-유도된 벡터, pBS-유도된 벡터, 또는 바람직하게는 하나 이상의 T-DNA 영역을 함유하는 2원 벡터를 포함한다. 추가적인 핵산 서열은 상기 벡터의 자율적인 복제를 제공하는 복제의 기원, 선택성 마커 유전자, 바람직하게는 항생제 또는 제초제 내성을 암호화하는 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 구조물에서 암호화된 유전자를 삽입하기 위한 다수의 부위를 제공하는 독특한 다중 클로닝 부위, 및 원핵생물 및 진핵생물(특히 식물) 세포의 형질전환을 증대시키는 서열을 포함한다. 상기 재조합 벡터는 하나보다 많은 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6 개의 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드를, 바람직하게는 본 발명의 키메릭 유전자 구조물과 함께 포함할 수 있으며, 각각의 폴리뉴클레오티드는 관심 세포에서 작동 가능한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 하나보다 많은 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6 개의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단일 재조합 벡터에서, 바람직하게는 단일 T-DNA 분자 내에서 함께 공유 결합되며, 이어서 단일 분자로서 세포내에 도입되어 본 발명에 따른 재조합 세포를 형성하고, 바람직하게는 상기 재조합 세포, 예를 들어 트랜스제닉 식물의 게놈에 통합될 수 있다. 이에 의해, 상기와 같이 결합된 폴리뉴클레오티드는 재조합 세포 또는 식물의 자손에서 단일 유전자 자리로서 함께 유전될 것이다. 상기 재조합 벡터 또는 식물은 2 개 이상의 상기와 같은 재조합 벡터를 포함할 수 있으며, 이들은 각각 다수의 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 예를 들어 각각의 재조합 벡터는 3, 4, 5 또는 6 개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "작동적으로 연결되는"은 2 개 이상의 핵산(예를 들어 DNA) 분절간의 작용 관계를 지칭한다. 전형적으로, 전사된 서열에 대한 전사 조절 요소(프로모터)의 작용 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는, 상기가 적합한 세포 중의 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우, 본 발명에서 정의된 폴리뉴클레오티드와 같은 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 전사된 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 전사 조절 요소는 상기 전사된 서열에 물리적으로 인접한다, 즉 상기는 시스-작용이다. 그러나, 일부 전사 조절 요소, 예를 들어 인헨서는 상기가 증대시키는 전사를 갖는 암호화 서열에 물리적으로 인접하거나 가깝게 위치할 필요가 없다.
다수의 프로모터가 존재하는 경우, 각각의 프로모터는 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다.
재조합 분자, 예를 들어 키메릭 DNA 또는 유전자 구조물은 또한 (a) 본 발명에 정의된 발현된 폴리펩티드를, 상기 폴리펩티드를 생산하는 세포로부터 분비되게 할 수 있는 신호 펩티드 서열을 암호화하거나 또는 상기 발현된 폴리펩티드의 국소화, 예를 들어 세포내 소포체(ER) 중의 상기 폴리펩티드의 체류 또는 색소체내로의 이동을 제공하는 하나 이상의 분비 신호, 및/또는 (b) 융합 단백질로서 핵산 분자의 발현을 도출하는 융합 서열을 함유할 수 있다. 적합한 신호 분절의 예는 본 발명에 정의된 폴리펩티드의 분비 또는 국소화를 지시할 수 있는 임의의 신호 분절을 포함한다. 재조합 분자는 또한 본 발명에 정의된 핵산 분자의 핵산 서열 주변 및/또는 내부의 중재 및/또는 번역되지 않은 서열을 포함할 수 있다.
형질전환체의 식별을 용이하게 하기 위해서, 상기 핵산 구조물은 바람직하게는 외래 또는 외인성 폴리뉴클레오티드로서 또는 이외에 선택성 또는 선별성 마커 유전자를 포함한다. "마커 유전자"는 상기 마커 유전자를 발현하는 세포에 독특한 표현형을 부여하고 따라서 상기와 같은 형질전환된 세포를 상기 마커를 갖지 않는 세포와 구분되게 하는 유전자를 의미한다. 선택성 마커 유전자는 선택제(예를 들어 제초제, 항생제, 방사선, 열, 또는 형질전환되지 않은 세포에 손상을 주는 다른 처리)에 대한 내성을 근거로 "선택"할 수 있는 특징을 부여한다. 선별성 마커 유전자(또는 리포터 유전자)는 관찰 또는 시험을 통해서, 즉 "선별"(예를 들어 형질전환되지 않은 세포 중에 존재하지 않는 β-글루쿠로니다제, 루시페라제, GFP 또는 다른 효소 활성)에 의해 식별될 수 있는 특징을 부여한다. 상기 마커 유전자 및 관심 뉴클레오티드 서열은 연결시킬 필요가 없다. 마커의 실제 선택은, 상기 마커가 식물 세포와 같이 선택 세포와 함께 작용성인(즉 선택성인) 한 중요하지 않다.
세균 선택성 마커의 예는 항생제 내성, 예를 들어 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성, 바람직하게는 가나마이신 내성을 부여하는 마커이다. 식물 형질전환체의 선택을 위해 예시적인 선택성 마커는 비제한적으로 하이그로마이신 B 내성을 암호화하는 hyg 유전자; 가나마이신, 파로모마이신, G418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(nptII) 유전자; 예를 들어 EP 256233에 개시된 바와 같이 글루타치온 유도된 제초제에 대한 내성을 부여하는 래트 간으로부터의 글루타치온-S-트랜스퍼라제 유전자; 예를 들어 WO 87/05327에 개시된 바와 같이 과발현시 포스피노트리신과 같은 글루타민 신타제 억제제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신타제 유전자; 예를 들어 EP 275957에 개시된 바와 같이 선택성 작용제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모제네스로부터의 아세틸트랜스퍼라제 유전자; 예를 들어 문헌[Hinchee et al. (1988)]에 개시된 바와 같이 N-포스포노메틸글리신에 대한 내성을 부여하는 5-에놀쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS)를 암호화하는 유전자; 예를 들어 WO91/02071에 개시된 바와 같은 바이알라포스에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자; 브로목시닐에 대한 내성을 부여하는 클렙시엘라 오자에나에로부터의 bxn과 같은 니트릴라제 유전자(Stalker et al., 1988); 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(Thillet et al., 1988); 이미다졸리논, 설포닐유레아, 또는 다른 ALS-억제성 화학물질에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타제 유전자(ALS)(EP 154,204); 5-메틸 트립토판에 대한 내성을 부여하는 돌연변이된 안트라닐레이트 신타제 유전자; 또는 제초제에 대한 내성을 부여하는 달라폰 데할로게나제 유전자를 포함한다.
바람직한 선별성 마커는 비제한적으로 다양한 색원성 기질들이 공지된 β-글루쿠로니다제(GUS) 효소를 암호화하는 uidA 유전자; 색원성 기질들이 공지된 효소를 암호화하는 β-갈락토시다제 유전자; 칼슘-민감성 생물발광 검출에 사용될 수 있는 에쿠오린 유전자(Prasher et al., 1985); 녹색 형광 단백질 유전자(Niedz et al., 1995) 또는 그의 유도체; 또는 생물발광 검출을 허용하는 루시페라제(luc) 유전자(Ow et al., 1986)를 포함한다. "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 단백질 산물을 기준으로 프로모터 활성의 측정을 용이하게 하는, 분석학적으로 확인 가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다.
바람직하게, 상기 핵산 구조물은 식물 세포와 같은 세포의 게놈에 안정하게 통합된다. 따라서, 상기 핵산은 상기 분자가 상기 게놈, 바람직하게는 T-DNA 분자의 우측 및 좌측 경계 서열에 통합되게 하거나, 또는 상기 구조물이 상기 세포의 염색체내로 통합될 수 있게 하는 적합한 벡터 중에 놓이는 적합한 요소들을 포함할 수 있다.
발현
본 발명에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고 하나 이상의 명시된 폴리뉴클레오티드 분자(들)의 발현을 수행할 수 있는 DNA 벡터이다. 본 발명의 바람직한 발현 벡터는 효모 및/또는 식물 세포에서 유전자 발현을 지시할 수 있다. 본 발명에 유용한 발현 벡터는 조절 서열, 예를 들어 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 기원, 및 재조합 세포와 양립성이고 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하는 다른 조절 서열들을 함유한다. 특히, 본 발명에 유용한 폴리펩티드 또는 벡터는 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 것, 예를 들어 프로모터 및 인헨서 서열이다. 적합한 전사 조절 서열은 본 발명의 재조합 세포들 중 하나 이상에서 작용할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 사용되는 조절 서열의 선택은 표적 유기체, 예를 들어 관심 식물 및/또는 표적 기관 또는 조직에 따라 변한다. 상기와 같은 조절 서열을 식물 또는 식물 바이러스와 같은 임의의 진핵생물 유기체로부터 수득하거나, 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 다양한 상기와 같은 전사 조절 서열은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 특히 바람직한 전사 조절 서열은 식물 또는 그의 부분의 용도에 따라, 구성적으로 또는 단계 및/또는 조직 특이적으로, 상기 식물에서의 전사를 지시하는데 활성인 프로모터이다.
식물 세포의 안정한 형질감염 또는 트랜스제닉 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터들이 예를 들어 하기의 문헌들에 개시되었다: Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, 및 Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. 전형적으로, 식물 발현 벡터는 예를 들어 5' 및 3' 조절 서열의 전사 조절 하에 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자 및 우세한 선택성 마커를 포함한다. 상기와 같은 식물 발현 벡터는 또한 프로모터 조절 영역(예를 들어 유도성 또는 구성적인, 환경적으로 또는 발생적으로-조절된, 또는 세포- 또는 조직-특이성인 발현을 조절하는 조절 영역), 전사 개시 출발 부위, 리보솜 결합 부위, RNA 가공 신호, 전사 종결 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다.
식물 세포에서 활성인 다수의 구성 프로모터가 개시되었다. 식물에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는 비제한적으로 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스(FMV) 35S, 사탕수수 막대모양 바이러스 프로모터, 코멜리나 황색 반점 바이러스 프로모터, 리뷸로스-1,5-비스-포스페이트 카복실라제의 작은 서브유닛으로부터의 빛-유도성 프로모터, 벼 시토솔 트라이오스포스페이트 아이소머라제 프로모터, 아라비도프시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 프로모터, 벼 액틴 1 유전자 프로모터, 만노핀 신타제 및 옥토핀 신타제 프로모터, Adh 프로모터, 슈크로스 신타제 프로모터, R 유전자 복합체 프로모터, 및 클로로필 α/β 결합 단백질 유전자 프로모터를 포함한다.
잎, 종자, 뿌리 또는 줄기와 같은 식물의 출처 조직들에서의 발현을 위해서, 본 발명에서 사용되는 프로모터들은 이들 특정 조직에서 비교적 높은 발현을 갖는 것이 바람직하다. 이를 위해서, 조직- 또는 세포-특이성, 또는 -증대된 발현을 갖는 유전자에 대한 다수의 프로모터들 중에서 하나를 선택할 수 있다. 문헌에 보고된 상기와 같은 프로모터들의 예는 완두콩으로부터의 엽록체 글루타민 신타제 GS2 프로모터, 밀로부터의 엽록체 프럭토스-1,6-바이포스파타제 프로모터, 감자로부터의 핵 광합성 ST-LS1 프로모터, 세린/쓰레오닌 키나제 프로모터 및 아라비도프시스 탈리아나로부터의 글루코아밀라제(CHS) 프로모터를 포함한다. 또한 리뷸로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제 프로모터, 및 Cab 프로모터는 광합성적으로 활성인 조직에서 활성인 것으로 보고된다.
(1) 열, (2) 빛(예를 들어 완두콩 RbcS-3A 프로모터, 옥수수 RbcS 프로모터), (3) 호르몬, 예를 들어 아브시스산, (4) 상처(예를 들어 WunI), 또는 (5) 화학물질, 예를 들어 메틸 자스모네이트, 살리실산, 스테로이드 호르몬, 알콜, 완화제(WO 97/06269)에 의해 조절되는 프로모터를 포함하여, 환경, 호르몬, 화학적 및/또는 발생 신호에 응답하여 조절되는 다양한 식물 유전자 프로모터들을 또한 식물 세포에서의 유전자의 발현에 사용하거나, 또는 (6) 기관-특이성 프로모터를 사용하는 것이 또한 유리할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "식물 종자 특이성 프로모터"란 용어 또는 다른 변형은 다른 식물 조직에 비해 식물의 발생 종자에서의 유전자 전사를 우선적으로 지시하는 프로모터를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 종자 특이성 프로모터는 상기 식물의 잎 및/또는 줄기에 비해 상기 식물의 발생 종자에서 적어도 5 배 더 강하게 발현되며, 바람직하게는 다른 식물 조직에 비해 상기 발생 종자의 배에서 더 강하게 발현된다. 바람직하게, 상기 프로모터는 오직 상기 발생 종자에서 관심 유전자의 발현만을 지시하고/하거나, 상기 식물의 다른 부분, 예를 들어 잎에서의 관심 유전자의 발현은 노던 블럿 분석 및/또는 RT-PCR에 의해 검출될 수 없다. 전형적으로, 상기 프로모터는 상기 종자의 성장 및 발달 동안, 특히 상기 종자에서의 저장 화합물의 합성 및 축적 단계 동안 유전자의 발현을 구동한다. 상기와 같은 프로모터는 전체 식물 저장 기관 또는 단지 그의 부분, 예를 들어 바람직하게는 배, 쌍떡잎 식물의 종자 또는 외떡잎 식물의 종자의 내배유 또는 호분층 중 종피 또는 떡잎(들)에서 유전자 발현을 구동할 수 있다.
종자-특이성 발현에 바람직한 프로모터는 i) 지질 생합성 및 종자 중 축적에 관련된 효소, 예를 들어 불포화효소 및 엘론가제를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터, ii) 종자 저장 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 프로모터, 및 iii) 종자중 탄수화물 생합성 및 축적에 관련된 효소를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터를 포함한다. 적합한 종자 특이성 프로모터는 유지종자 유채 나핀 유전자 프로모터(US 5,608,152), 누에콩 USP 프로모터(Baumlein et al., 1991), 아라비도프시스 올레오신 프로모터(WO 98/45461), 파세올루스 불가리스 파세올린 프로모터(US 5,504,200), 브라시카 Bce4 프로모터(WO 91/13980), 또는 비시아 파바(Vicia faba)로부터의 레구민 LeB4 프로모터(Baumlein et al., 1992), 및 옥수수, 보리, 밀, 호밀, 벼 등과 같은 외떡잎식물에서의 종자-특이성 발현을 도출하는 프로모터들이다. 적합한 주목할만한 프로모터들은 보리 lpt2 또는 lpt1 유전자 프로모터(WO 95/15389 및 WO 95/23230), 또는 WO 99/16890에 개시된 프로모터들(보리 호르데인 유전자, 벼 글루텔린 유전자, 벼 오리진 유전자, 벼 프롤아민 유전자, 밀 글리아딘 유전자, 밀 글루텔린 유전자, 옥수수 제인 유전자, 귀리 글루텔린 유전자, 수수 카시린 유전자, 호밀 세칼린 유전자로부터의 프로모터들)이다. 다른 프로모터는 하기에 개시된 것들을 포함한다: Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 및 US 20030159173. 하나의 실시태양에서, 상기 종자 특이성 프로모터는 배, 떡잎(들) 또는 내배유와 같은 종자의 한정된 부분들에서 우선적으로 발현된다. 상기와 같은 특이성 프로모터의 예는 비제한적으로 FP1 프로모터(Ellerstrom et al., 1996), 완두콩 레구민 프로모터(Perrin et al., 2000), 콩 피토헤마글루티닌 프로모터(Perrin et al., 2000), 아마 2S 저장 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 콘리닌 1 및 콘리닌 2 프로모터(Cheng et al., 2010), 아라비도프시스 탈리아나로부터의 FAE1 유전자의 프로모터, 브라시카 나푸스의 글로불린-유사 단백질 유전자의 BnGLP 프로모터, 리눔 유시타티시뮴으로부터의 퍼옥시레독신 유전자의 LPXR 프로모터를 포함한다.
5' 비-번역 리더 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 이종 유전자 서열을 발현하도록 선택된 프로모터로부터 유래하거나, 또는 생성되는 효소의 암호화 영액에 대해서 이종이며, 경우에 따라 mRNA의 번역을 증가시키기 위해서 특이적으로 변형될 수도 있다. 트랜스유전자의 최적화 발현에 대한 리뷰에 대해서, 문헌[Koziel et al.(1996)]을 참조한다. 상기 5' 비-번역 영역을 또한 식물 바이러스 RNA(특히 담배 모자이크 바이러스, 담배 부식 바이러스, 옥수수 오갈병 모자이크 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스)로부터, 적합한 진핵생물 유전자, 식물 유전자(밀 및 옥수수 염록소 a/b 결합 단백질 유전자 리더)로부터, 또는 합성 유전자 서열로부터 획득할 수 있다. 본 발명은, 상기 비-번역 영역이 상기 프로모터 서열을 수반하는 5' 비-번역 서열로부터 유도된 구조물로 제한되지 않는다. 상기 리더 서열은 또한 관련없는 프로모터 또는 암호화 서열로부터 유도될 수도 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 리더 서열은 옥수수 Hsp70 리더(US5,362,865 및 US5,859,347), 및 TMV 오메가 요소를 포함한다.
전사의 종결은 키메릭 벡터에서 관심 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 3' 비-번역 DNA 서열에 의해 수행된다. 재조합 DNA 분자의 3' 비-번역 영역은, 식물에서 상기 RNA의 3' 단부에 대한 아데닐레이트 뉴클레오티드의 첨가를 야기하는 작용을 하는 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 상기 3' 비-번역 영역을 식물 세포에서 발현된 다양한 유전자로부터 획득할 수 있다. 노팔린 신타제 3' 비번역 영역, 완두콩 작은 서브유닛 루비스코 유전자로부터의 3' 비번역 영역, 대두 7S 종자 저장 단백질 유전자 또는 아마 콘리닌 유전자로부터의 3' 비번역 영역이 상기 능력에 통상적으로 사용된다. 아그로박테리움 종양-유도(Ti) 플라스미드 유전자의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 전사된, 비-번역 영역이 또한 적합하다.
재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들어 숙주 세포내 폴리뉴클레오티드 분자의 사본수, 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 전사되는 효율, 생성되는 전사물이 번역되는 효율, 및 번역-후 변형의 효율을 조작함으로써 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 개선시킬 수 있다. 본 발명에 정의된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 증가시키기에 유용한 재조합 기법은 비제한적으로 하나 이상의 숙주세포 염색체내 상기 폴리뉴클레오티드 분자의 통합, mRNA에 안정성 서열의 첨가, 전사 조절 신호(예를 들어 프로모터, 오퍼레이터, 인헨서)의 치환 또는 변형, 번역 조절 신호(예를 들어 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용에 상응하도록 폴리뉴클레오티드 분자의 변형, 및 전사물을 탈안정화하는 서열의 결실을 포함한다.
재조합 세포
본 발명은 또한 본 발명에 정의된 하나 이상의 재조합 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자 구조물 또는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포인 재조합 세포, 바람직하게는 재조합 식물 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 세포들의 임의의 조합, 예를 들어 2 개 또는 3 개의 재조합 벡터, 또는 재조합 벡터와 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드 또는 키메릭 DNA를 포함할 수도 있다. 본 발명의 적합한 세포는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 키메릭 DNA 또는 재조합 벡터, 예를 들어 본 발명에 개시된 폴리펩티드 또는 효소를 암호화하는 분자로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 LC-PUFA의 생산에 사용될 수 있는 세포이다. 상기 재조합 세포는 배양물 중 세포, 시험관내, 또는 예를 들어 식물과 같은 유기체 중, 또는 종자 또는 잎과 같은 기관 중 세포일 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 식물 또는 식물 부분 중에, 보다 바람직하게는 식물의 종자 중에 있다.
상기 폴리뉴클레오티드(들)가 도입되는 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 하나 이상의 핵산 분자로 이미 형질전환된 세포일 수 있다. 상기와 같은 핵산 분자는 LC-PUFA 합성과 관련될 수도, 관련되지 않을 수도 있다. 본 발명의 숙주 세포는 본 발명에 정의된 단백질을 내인성으로(즉 천연으로) 생산할 수 있으며, 이 경우 상기로부터의 재조합 세포는 상기 폴리펩티드를 생산하는 증대된 능력을 갖거나, 또는 오직 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 후에만 상기와 같은 단백질을 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 세포는 장쇄 다중불포화 지방산을 합성하는 증대된 능력을 갖는다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "장쇄 다중불포화 지방산을 합성하는 증대된 능력을 갖는 세포"란 용어는 본 발명의 재조합 세포를 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)가 없는 숙주 세포와 비교하는 경우의 상대적인 용어이며, 이때 상기 재조합 세포는 고유의 세포보다 보다 많은 장쇄 다중불포화 지방산 또는 보다 큰 농도의 LC-PUFA, 예를 들어 DHA(다른 지방산에 비해)를 생산한다. 또 다른 생성물, 예를 들어 또 다른 지방산, 지질, 탄수화물, 예를 들어 전분, RNA 분자, 폴리펩티드, 약제 또는 다른 생성물을 합성하는 증대된 능력을 갖는 세포는 상응하는 의미를 갖는다.
본 발명의 숙주 세포는 본 발명에 개시된 적어도 하나의 단백질을 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있으며, 세균, 진균(효모 포함), 기생생물, 절지동물, 동물 및 식물 세포를 포함한다. 상기 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 효모, 조류 및 식물 세포이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 식물 세포는 종자 세포, 특히 종자의 떡잎 또는 내배유 중의 세포이다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 동물 세포 또는 조류 세포이다. 상기 동물 세포는 임의의 유형의 동물의 세포, 예를 들어 비-인간 동물 세포, 비-인간 척추동물 세포, 비-인간 포유동물 세포, 또는 수생 동물, 예를 들어 어류 또는 갑각류, 무척추동물, 곤충 등의 세포일 수 있다. 상기 세포는 발효 과정에 적합한 유기체의 것일 수도 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "발효 과정"이란 용어는 임의의 발효 과정 또는 발효 단계를 포함하는 임의의 과정을 지칭한다. 발효 미생물의 예는 진균 유기체, 예를 들어 효모를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "효모"는 사카로마이세스 스페시즈(Saccharomyces spp.), 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 칼베르젠시스(Saccharomyces carlbergensis), 칸디다 스페시즈(Candida spp.), 클루베로마이세스 스페시즈(Kluveromyces spp.), 피키아 스페시즈(Pichia spp.), 한세눌라 스페시즈(Hansenula spp.), 트리코더마 스페시즈(Trichoderma spp.), 리포마이세스 스타키(Lipomyces starkey), 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다. 바람직한 효모는 사카로마이세스 스페시즈 및 특히 사카로마이세스 세레비지아에의 균주를 포함한다.
트랜스제닉 식물
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 포함하는 식물, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 식물을 또한 제공한다. 명사로서 본 발명에 사용된 바와 같이 "식물"이란 용어는 전체 식물을 지칭하지만, 형용사로서 사용되는 경우 예를 들어 식물 기관(예를 들어 잎, 줄기, 뿌리, 꽃), 단세포(예를 들어 꽃가루), 종자, 식물 세포 등과 같이 식물 중에 존재하거나, 상기로부터 수득되거나, 상기로부터 유래되거나, 또는 상기와 관련되는 임의의 물질을 지칭한다. "식물 부분"이란 용어는 상기 식물 부분이 본 발명에 따른 지질을 합성하는 한, 식물 DNA를 포함하는 모든 식물 부분, 예를 들어 식물 구조, 예를 들어 잎 또는 줄기, 뿌리, 꽃 기관 또는 구조, 꽃가루, 종자, 종자 부분, 예를 들어 배, 내배유, 배반, 또는 종피, 식물 조직, 예를 들어 관 조직, 세포 및 그의 자손을 지칭한다.
"트랜스제닉 식물", "유전자 변형된 식물" 또는 이들의 변형은 동일한 종, 품종 또는 품종의 야생형 식물에서 발견되지 않는 유전자 구조물("트랜스유전자")를 함유하는 식물을 지칭한다. 본 발명과 관련하여 정의된 바와 같은 트랜스제닉 식물은 재조합 기법을 사용하여 유전자 변형시켜 목적하는 식물 또는 식물 기관에 지질 또는 본 발명에 정의된 하나 이상의 폴리펩티드를 생성시킨 식물 및 그의 자손을 포함한다. 트랜스제닉 식물 세포 및 트랜스제닉 식물 부분은 상응하는 의미를 갖는다. 본 발명에서 지칭되는 바와 같은 "트랜스유전자"는 생물공학 분야에서의 통상적인 의미를 가지며, 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 생성되거나 변경되고 본 발명의 세포, 바람직하게는 식물 세포에 도입된 유전자 서열을 포함한다. 상기 트랜스유전자는 상기 트랜스유전자가 도입되는 식물 세포와 동일한 종, 변종 또는 품종, 또는 상이한 종, 변종 또는 품종으로부터의 것일 수 있는 식물 세포, 또는 식물 세포 이외의 세포로부터 유도된 유전자 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 트랜스유전자를 인간 조작에 의해, 예를 들어 형질전환에 의해 상기 세포, 예를 들어 식물에 도입시켰지만, 당해 분야의 숙련가가 인정하는 바와 같은 임의의 방법을 사용할 수 있다.
"종자" 및 "그레인"이란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다. "그레인"은 성숙한 그레인, 예를 들어 수확된 그레인, 또는 여전히 식물상에 있지만 수확할 준비가 된 그레인을 지칭하지만, 문맥에 따라 침윤 또는 발아 후의 그레인을 지칭할 수도 있다. 성숙한 그레인은 통상적으로 약 18 내지 20% 미만의 수분 함량을 갖는다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "발생 종자"는 수정 또는 개화 후 식물의 생식 구조에서 전형적으로 발견되는, 성숙전의 종자를 지칭하지만, 식물로부터 단리된 성숙전의 상기와 같은 종자를 또한 지칭할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "식물 부분을 수득함" 또는 "종자를 수득함"이란 용어는 각각 식물 부분 또는 종자를 수득하는 임의의 수단, 예를 들어 필드에서 또는 온실 또는 생육 챔버와 같은 봉쇄구역에서 식물 부분 또는 식물로부터의 종자의 수확, 또는 상기 식물 부분 또는 종자의 공급자로부터 구입 또는 수령에 의한 수단을 지칭한다. 상기 종자는 식재에 적합하거나, 즉 발아 및 자손 식물 생산이 가능하거나, 또는 한편으로 더 이상 발아할 수 없도록 하는 방식으로 처리되었다, 예를 들어 식품 또는 사료 용도에 유용하거나 또는 본 발명의 지질의 추출에 유용한 열분해되거나, 손질되거나 또는 분쇄된 종자일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "식물 저장 기관"이란 용어는 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질의 형태로 에너지를 저장하도록 분화된 식물의 부분을 지칭한다. 식물 저장 기관의 예는 종자, 열매, 괴근 및 괴경이다. 본 발명의 바람직한 식물 저장 기관은 종자이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "표현형적으로 정상적인"이란 용어는 변형되지 않은 식물 또는 식물 기관에 비해 성장 및 번식 능력이 현저하게 감소되지 않은 본 발명의 종자와 같은 유전자 변형된 식물 또는 식물 기관, 특히 저장 기관을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 표현형적으로 정상적인 유전자 변형된 식물 또는 식물 기관은 식물 저장 기관 특이적 프로모터에 작동적으로 연결된 침묵화 억제인자를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 상응하는 식물 또는 기관과 본질적으로 동일한 성장 또는 번식 능력을 갖는다. 바람직하게, 바이오매스, 증식률, 발아율, 저장 기관 크기, 종자 크기 및/또는 생산된 생육성 종자의 수는 동일한 조건 하에서 생육시 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 식물의 경우의 90% 이상이다. 상기 용어는, 야생형 식물과 상이할 수 있지만 상업적인 목적을 위해 상기 식물의 유용성을 성취하지 못하는 상기 식물의 특징들, 예를 들어 묘목잎의 발레리나 표현형은 포함하지 않는다.
본 발명의 실시에 사용하기 위해 제공되거나 고려되는 식물은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 모두를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 식물은 농작물(예를 들어 곡류 및 콩류, 옥수수, 밀, 감자, 타피오카, 벼, 수수, 기장, 카사바, 보리 또는 완두콩), 또는 다른 콩과 식물이다. 상기 식물을 식용 뿌리, 괴경, 잎, 줄기, 꽃 또는 열매의 생산을 위해 재배할 수 있다. 상기 식물은 야채 또는 관상용 식물일 수 있다. 본 발명의 식물은 옥수수(제아 메이스), 캐놀라(브라시카 나푸스, 브라시카 라파 스페시즈), 겨자(브라시카 준세아), 아마(리눔 유시타티시뮴), 알팔파(메디카고 사티바), 벼(오리자 사티바), 호밀(세칼레 세랄레), 수수(소르검 비콜로르, 소르검 불가레), 해바라기(헬리안투스 안누스), 밀(트리티움 아에스티븀), 대두(글리시네 맥스), 담배(니코티아나 타바쿰), 감자(솔라늄 튜베로슘), 땅콩(아라키스 히포가에아), 면(고시피움 히르수툼), 고구마(로프모에아 바타투스), 카사바(마니호트 에스큘렌타), 커피(코페아 스페시즈), 코코넛(코코스 누시페라), 파인애플(아나나 코모수스), 시트리스 나무(시트러스 스페시즈), 코코아(테오브로마 카카오), 차(카멜리아 세넨시스), 바나나(뮤사 스페시즈), 아보카도(페르세아 아메리카나), 무화과(피쿠스 카시카), 구아바(프시디움 구아자바), 망고(만지페르 인디카), 올리브(올레아 유로파에아), 파파야(카리카 파파야), 캐슈(아나카르디움 옥시덴탈레), 마카다미아(마카다미아 인테르그리폴리아), 아몬드(프루누스 아미그달루스), 사탕무(베타 불가리스), 귀리 또는 보리일 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 식물은 속씨식물이다.
하나의 실시태양에서, 상기 식물은 유지종자 식물, 바람직하게는 유지종자 작물이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "유지종자 식물"은 상기 식물의 종자로부터 상업적인 오일 생산에 사용되는 식물 종이다. 상기 유지종자 식물은 유지종자 유채(예를 들어 캐놀라), 옥수수, 해바라기, 대두, 수수, 아마(아마인) 또는 사탕무일 수 있다. 더욱 또한, 상기 유지종자 식물은 다른 배추속, 면, 땅콩, 양귀비, 겨자, 아주까리, 참깨, 잇꽃, 또는 너트 생산 식물일 수 있다. 상기 식물은 그의 열매, 예를 들어 올리브, 오일팜 또는 코코넛 중에 높은 수준의 오일을 생산한다. 본 발명이 적용될 수 있는 원예식물은 상추, 앤다이브, 또는 양배추, 브로콜리 또는 콜리플라워를 포함한 채소 배추속이다. 본 발명을 담배, 박, 당근, 딸기, 토마토 또는 후추에 적용할 수도 있다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 트랜스제닉 식물의 생산에 사용되는 비-트랜스제닉 식물은 i) 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 18:2 지방산 및/또는 ii) 10% 미만 또는 5% 미만의 18:3 지방산을 갖는, 특히 종자 중의 오일을 생산한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 트랜스제닉 식물은 그의 자손이 목적하는 표현형에 대해 분리되지 않도록 도입된 모든 유전자(트랜스유전자)에 대해 동형접합성이다. 상기 트랜스제닉 식물은 또한 도입된 트랜스유전자(들)에 대해서 이형접합성, 바람직하게는 예를 들어 하이브리드 종자로부터 번식된 F1 자손에서 트랜스유전자에 대해 균일하게 이형접합성일 수 있다. 상기와 같은 식물들은 당해 분야에 널리 공지된, 잡종 강세와 같은 이점을 제공할 수 있다.
적합한 경우, 상기 트랜스제닉 식물은 LC-PUFA의 생산에 관련된 추가적인 트랜스유전자 암호화 효소, 예를 들어 비제한적으로 Δ6-불포화효소, Δ9-신장효소, Δ8-불포화효소, Δ6-신장효소, Δ5-불포화효소, ω3-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ5-신장효소, 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, LPAAT, Δ17-불포화효소, Δ15-불포화효소 및/또는 Δ12 불포화효소를 또한 포함할 수 있다. 이들 활성 중 하나 이상을 갖는 상기와 같은 효소의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명에 개시된 것들을 포함한다. 특정한 실시예에서, 상기 트랜스제닉 식물은 적어도 하기를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
a) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-신장효소 및 Δ6-신장효소,
b) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-신장효소 및 Δ9-신장효소,
c) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-신장효소, Δ6-신장효소, 및 Δ15-불포화효소,
d) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-신장효소, Δ9-신장효소, 및 Δ15-불포화효소,
e) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-신장효소, Δ6-신장효소, 및 Δ17-불포화효소, 또는
f) Δ4-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-신장효소, Δ9-신장효소, 및 Δ17-불포화효소.
하나의 실시태양에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 피티움 이레귤라레 Δ6-불포화효소, 트라우스토키트리드 Δ5-불포화효소 또는 에밀리아나 헉슬레이 Δ5-불포화효소, 피스코미트렐라 파텐스 Δ6-신장효소, 트라우스토키트리드 Δ5-신장효소 또는 오스트레오커스 타우리이 Δ5-신장효소, 피토프토라 인페스탄스 ω3-불포화효소 또는 피티움 이레귤라레 ω3-불포화효소 및 트라우스토키트리드 Δ4-불포화효소인 폴리펩티드들의 세트를 암호화한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 식물들을 필드에서, 본질적으로 동일한 적어도 1,000 또는 1,000,000 개 식물들의 집단으로서, 또는 적어도 1 헥타아르의 면적에서 재배한다. 재식 밀도는 식물 종, 식물 품종, 기후, 토양 조건, 비료 비율 및 당해 분야에 공지된 다른 인자들에 따라 상이하다. 예를 들어 캐놀라는 전형적으로 헥타아르당 120만 내지 150만 식물의 재식 밀도로 재배된다. 식물을 당해 분야에 공지된 바와 같이 수확하며, 이는 상기 식물의 지상부를 베어내고, 줄지어 널어 놓고/놓거나 거둬 들인 다음, 상기 식물 물질을 타작하고/하거나 키질하여 종종 왕겨 형태의 상기 식물 부분의 나머지로부터 종자를 분리시킴을 포함할 수 있다. 한편으로, 종자를 단일 공정으로, 즉 콤바인 수확으로 필드에서 식물로부터 수확할 수도 있다.
식물의 형질전환
트랜스제닉 식물을 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 문헌[A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003)] 및 문헌[P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)]에 일반적으로 개시된 바와 같은 기법을 사용하여 생산할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "안정하게 형질전환되는", "안정하게 형질전환된"이란 용어들 및 그의 변형들은 세포 분열 동안 그의 존재에 대한 양의 선택의 필요 없이 자손 세포로 전달되도록 세포의 게놈에 외인성 핵산 분자를 통합시킴을 지칭한다. 안정한 형질전환체, 또는 그의 자손을 당해 분야에 공지된 임의의 수단, 예를 들어 염색체 DNA 상에서의 서던 블럿 또는 게놈 DNA의 원위치 하이브리드화에 의해 선택할 수 있다.
아그로박테리움-매개된 전달은, DNA를 상기 DNA의 식물 세포 게놈내로의 일시적인 발현 또는 안정한 통합을 위해 전체 식물 조직, 식물 기관 또는 조직 배양물 중의 외식체 중의 세포에 도입시킬 수 있으므로, 유전자를 식물 세포에 도입시키기 위해 널리 적용할 수 있는 시스템이다. DNA를 식물 세포에 전달할 수 있는 아그로박테리움 또는 다른 세균을 사용하는 플로랄 침지법을 포함하여 DNA를 식물 세포에 도입시키기 위한 아그로박테리움-매개된 식물 통합 벡터의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 5177010, US 5104310, US 5004863, 또는 US 5159135 참조). 전달되는 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 한정되며, 중재 DNA(T-DNA)가 대개 식물 게놈내로 삽입된다. 더욱이, 상기 T-DNA의 통합은 거의 재배열을 생성시키지 않는 비교적 정밀한 과정이다. 아그로박테리움-매개된 형질전환이 효율적인 식물 품종들에서, 상기는 상기 유전자 전달의 용이하고 한정된 성질로 인해 선택되는 방법이다. 바람직한 아그로박테리움 형질전환 벡터는 개시된 바와 같이 이 콜라이뿐만 아니라 아그로박테리움에서 복제가 가능하여 편리한 조작을 허용한다(Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)).
사용될 수 있는 가속화 방법은 예를 들어 미세입자 투사법 등을 포함한다. 식물 세포에 형질전환 핵산 분자의 전달 방법의 일례가 미세입자 투사법이다. 상기 방법은 문헌[Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)]에 리뷰되어 있다. 비-생물 입자(미세투사물)를 핵산으로 코팅하고 추진력에 의해 세포내로 전달할 수 있다. 예시적인 입자는 텅스텐, 금, 백금 등을 포함하는 것들을 포함한다. 미세입자 투사법의 특정한 이점은 상기가 외떡잎식물을 번식가능하게 형질전환시키는 유효한 수단이라는 것 외에, 원형질체의 단리도, 아그로박테리움 감염의 민감성도 필요하지 않다는 것이다.
또 다른 대안적인 실시태양에서, 색소체를 안정하게 형질전환시킬 수 있다. 고등 식물에서 색소체 형질전환에 대해 개시된 방법은, 선택성 마커를 함유하고 동종 재조합을 통해 상기 색소체 게놈에 대해 DNA를 표적화하는, DNA의 입자 건 전달을 포함한다(US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932479, 및 WO 99/05265).
세포 형질전환의 다른 방법들을 또한 사용할 수 있으며 여기에는 비제한적으로 꽃가루내로의 직접적인 DNA 전달에 의해서, 식물의 번식 기관내로의 DNA의 직접 주입에 의해서, 또는 미성숙 배의 세포내로 DNA를 직접 주입한 다음 탈수된 배의 재수화에 의해서 식물내로 DNA를 도입시킴이 포함된다.
단일 식물 원형질체 형질전환체로부터 또는 다양한 형질전환된 외식체로부터 식물의 재생, 발생, 및 배양은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). 상기 재생 및 생육 과정은 전형적으로 형질전환된 세포의 선택, 뿌리내린 묘목 단계를 통한 배 발생의 통상적인 단계를 통해 개별화된 세포들의 배양을 포함한다. 트랜스제닉 배 및 종자는 유사하게 재생된다. 그 후에 생성된 트랜스제닉의 뿌리내린 어린싹을 토양과 같은 적합한 식물 생육 배지에 심는다.
상기 외래, 외인성 유전자를 함유하는 식물의 발생 또는 재생은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게, 상기 재생된 식물은 자가-수분되어 동형접합성 트랜스제닉 식물을 제공한다. 달리, 상기 재생된 식물로부터 수득된 꽃가루를 작물학적으로 중요한 계통의 종자-생육된 식물과 교배한다. 환원하면, 상기 중요한 계통의 식물로부터의 꽃가루를 사용하여 재생된 식물을 수분한다. 목적하는 외인성 핵산을 함유하는 본 발명의 트랜스제닉 식물을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 재배한다.
트랜스제닉 세포 및 식물 중의 상기 트랜스유전자의 존재를 확인하기 위해서, 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭 또는 서던 블럿 분석을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 트랜스유전자의 발현 산물을 상기 산물의 성질에 따라 다양한 방식들 중 어느 하나로 검출할 수 있으며, 상기 방식은 웨스턴 블럿 및 효소 분석을 포함한다. 일단 트랜스제닉 식물이 수득되었으면, 상기 식물을 목적하는 표현형을 갖는 식물 조직 또는 부분을 생산하도록 생육시킬 수 있다. 상기 식물 조직 또는 식물 부분을 수확하고/하거나 종자를 수거할 수 있다. 상기 종자는 상기 목적하는 특성들을 갖는 조직 또는 부분을 갖는 추가의 식물들을 생육시키기 위한 공급원으로서 작용할 수 있다.
아그로박테리움 또는 다른 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로 하나의 염색체상에 단일의 트랜스제닉 자리를 함유한다. 상기와 같은 트랜스제닉 식물을 첨가된 유전자(들)에 대해 반접합성인 것으로 칭할 수 있다. 첨가된 유전자(들)에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 식물, 즉 하나의 염색체 쌍의 각각의 염색체상의 동일한 자리에 하나씩, 2 개의 첨가된 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물이 보다 바람직하다. 동형접합성 트랜스제닉 식물을, 반접합성 트랜스제닉 식물을 자가-수분하고, 생성된 종자 중 일부를 발아시키고, 관심 유전자에 대해 생성된 식물을 분석함으로써 수득할 수 있다.
2 개의 독립적으로 분리되는 외인성 유전자 또는 자리를 함유하는 2 개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배(교잡)시켜 상기 두 유전자 또는 자리 세트를 모두 함유하는 자손을 생산할 수 있는 것으로 생각된다. 적합한 F1 자손의 자가수정은 상기 두 외인성 유전자 또는 자리에 대해 동형접합성인 식물들을 생산할 수 있다. 모 식물에 대한 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배가 또한, 생장 번식과 같이, 고려된다. 상이한 특성 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법들에 대한 설명을 문헌[Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)]에서 찾을 수 있다.
외인성 RNA 수준의 증대 및 안정화된 발현
침묵화 억제인자
하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포, 식물 또는 식물 부분은 침묵화 억제인자 단백질을 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
전사후 유전자 침묵화(PTGS)는 외래(이종) 또는 내인성 DNA로 안정하게 또는 일시적으로 형질전환된 식물 또는 진균에서 분해 PTGS 발생에 대해 세포 및 바이러스 mRNA 모두를 표적화할 수 있고 도입된 핵산과 서열 유사성을 갖는 RNA 분자의 감소된 축적을 생성시키는 뉴클레오티드 서열-특이성 방어 기전이다.
침묵화 억제인자와 관심 트랜스유전자와의 공-발현이 상기 트랜스유전자로부터 전사된 세포 중에 존재하는 RNA의 수준을 증가시킬 것임은 널리 생각되어 왔다. 이는 시험관내 세포의 경우 참인 것으로 입증되었지만, 다수의 전체적인 식물 공-발현 연구들에서 상당한 부작용들이 관찰되었다. 보다 구체적으로, 문헌[Mallory et al. (2002)], [Chapman et al. (2004)], [Chen et al. (2004)], [Dunoyer et al. (2004)], [Zhang et al. (2006)], [Lewsey et al. (2007)] 및 [Meng et al. (2008)]에 개시된 바와 같이, 침묵화 억제인자를 발현하는 식물들은 일반적으로 구성 프로모터 하에서 종종 상업적인 생산에 유용하지 않은 정도로 표현형적으로 비정상적이다.
최근에, 상기 침묵화 억제인자의 발현을 식물의 종자 또는 상기 식물의 부분으로 제한함으로써 RNA 분자 수준을 증가시키고/시키거나 RNA 분자 수준을 다수의 세대에 걸쳐 안정화시킬 수 있음이 밝혀졌다(WO2010/057246). 본 발명에 사용된 바와 같이, "침묵화 억제인자 단백질" 또는 SSP는 식물 세포에서, 특히 초기에 형질전환된 식물로부터 반복된 세대에 걸쳐 상이한 트랜스유전자로부터 발현 산물의 수준을 증대시키는, 식물 세포에서 발현될 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 하나의 실시태양에서, 상기 SSP는 바이러스 침묵화 억제인자 또는 그의 돌연변이체이다. 다수의 바이러스 침묵화 억제인자들이 당해 분야에 공지되어 있으며, 비제한적으로 P19, V2, P38, Pe-Po 및 RPV-P0를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 바이러스 침묵화 억제인자는 서열번호 53 내지 57 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 서열, 그의 생물 활성 단편, 또는 서열번호 53 내지 57 중 임의의 하나 이상에 적어도 50% 일치하는 아미노산 서열을 갖고 침묵화 억제인자로서 활성을 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "안정화 발현", "안정하게 발현된", "안정화된 발현"이란 용어들 및 이들의 변형은 상기 침묵화 억제인자를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 동질유전자 식물에 비해, 반복된 세대에 걸쳐, 예를 들어 적어도 3, 적어도 5 또는 적어도 10 세대 이상에 걸쳐 자손 식물에서 본질적으로 동일하거나 더 높은 RNA 분자의 수준을 지칭한다. 그러나, 상기 용어(들)는 선행 세대에 비해, 반복된 세대에 걸쳐, 예를 들어 세대당 10% 이상의 상기 RNA 분자 수준의 일부 상실이 존재할 가능성을 배제하지 않는다.
상기 억제인자를 임의의 공급원, 예를 들어 식물, 바이러스, 포유동물 등으로부터 선택할 수 있다. 상기 억제인자가 수득될 수 있는 바이러스의 목록 및 각각의 특정 바이러스로부터의 상기 억제인자의 단백질(예를 들어 B2, P14 등) 또는 암호화 영역 명칭에 대해서 WO2010/057246을 참조한다. 억제인자의 다수의 사본을 사용할 수도 있다. 상이한 억제인자들을 함께(예를 들어 나란히) 사용할 수 있다.
RNA 분자
본질적으로 식물 종자에서 발현되는 것이 바람직한 임의의 RNA 분자를 상기 침묵화 억제인자와 공-발현시킬 수 있다. 상기 암호화된 폴리펩티드는 오일, 전분, 탄수화물, 영양소 등의 대사에 관련되거나, 또는 단백질, 펩티드, 지방산, 지질, 왁스, 오일, 전분, 당, 탄수화물, 향, 냄새, 독소, 카로티노이드, 호르몬, 중합체, 플라보노이드, 저장 단백질, 페놀산, 알칼로이드, 리그닌, 탄닌, 셀룰로스, 당단백질, 당지질 등의 합성, 바람직하게는 TAG의 생합성 또는 조립을 책임질 수 있다.
특정한 실시예에서, 상기 생성된 식물은 배추속, 예를 들어 캐놀라 또는 해바라기, 잇꽃, 아마, 면, 대두, 카멜리나 또는 옥수수와 같은 식물에서 오일 생산을 위해 효소의 수준을 증가시켰다.
생성된 LC-PUFA의 수준
종자와 같은 식물 부분 또는 재조합 세포에서 생성되는 LC-PUFA 또는 LC-PUFA들의 조합의 수준이 중요하다. 상기 수준을 특정한 LC-PUFA 또는 관련된 LC-PUFA의 그룹, 예를 들어 ω3 LC-PUFA 또는 ω6 LC-PUFA, 또는 VLC-PUFA인 전체 지방산의 조성(퍼센트)으로서, 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는 다른 것으로서 나타낼 수 있다. 상기 수준을 또한 LC-PUFA 함량으로서, 예를 들어 상기 재조합 세포를 차지하는 물질의 건조 중량 중 LC-PUFA의 백분율, 예를 들어 LC-PUFA인 종자의 중량의 백분율로서 나타낼 수도 있다. 유지종자에서 생성되는 LC-PUFA는 오일 생산을 위해 재배되지 않았지만 유사한 LC-PUFA 조성을 가질 수 있는 식물 또는 그레인 중에서보다 LC-PUFA 함량이 상당히 더 높을 수 있으며, 이들을 모두 인간 또는 동물 소비를 위한 LC-PUFA의 공급원으로서 사용할 수 있다.
상기 LC-PUFA의 수준을 당해 분야에 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 바람직한 방법에서, 전체 지질을 세포, 조직 또는 유기체로부터 추출하고 상기 지방산을 메틸 에스테르로 전환시킨 후에 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 분석한다. 상기와 같은 기법은 실시예 1에 개시된다. 상기 크로마토그램에서 피크 위치를 사용하여 각각의 특정한 지방산을 확인하고, 각 피크 아래 면적을 적분하여 그 양을 측정할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 달리 서술되지 않는 한, 샘플 중 특정 지방산의 백분율을 상기 크로마토그램 중 지방산에 대한 전체 면적의 백분율로서 상기 지방산에 대한 피크 아래 면적으로서 측정한다. 이는 중량 백분율(w/w)에 본질적으로 상응한다. 지방산의 정체를 GC-MS에 의해 확인할 수 있다. 전체 지질을 당해 분야에 공지된 기법에 의해 분리시켜 분획들, 예를 들어 TAG 분획을 정제할 수 있다. 예를 들어 구체적으로 TAG의 지방산 조성을 측정하기 위해서 박층 크로마토그래피(TLC)를 분석 규모로 수행하여 다른 지질 분획들, 예를 들어 DAG, 아실-CoA 또는 인지질로부터 TAG를 분리시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 추출된 지질 중의 지방산 중 ARA, EPA, DPA 및 DHA의 전체 합은 상기 세포 중 전체 지방산의 약 7% 내지 약 25%이다. 추가의 실시태양에서, 상기 세포 중 전체 지방산은 1% 미만의 C20:1을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세포 중 추출성 TAG는 본 발명에 언급된 수준의 지방산을 포함한다. 본 발명에 개시된 바와 같은 지질을 한정하는 특징들의 각각의 가능한 조합이 또한 포함된다.
재조합 세포, 식물 또는 종자와 같은 식물 부분 중 LC-PUFA의 생성 수준을 또한 특정 기질 지방산의 하나 이상의 생성물 지방산으로의 전환 백분율(또한 본 발명에서 "전환 효율" 또는 "효소적 효율"로서 지칭된다)로서 나타낼 수 있다. 상기 매개변수는 상기 세포, 식물, 식물 부분 또는 종자로부터 추출된 지질 중 지방산 조성, 즉 하나 이상의 기질 지방산(상기로부터 유도된 모든 다른 지방산 포함)의 백분율로서 상기 형성된 LC-PUFA(상기로부터 유도된 다른 LC-PUFA 포함)의 양을 기준으로 한다. 전환 백분율에 대한 일반식은 100 x (생성물 LC-PUFA 및 상기로부터 유도된 모든 생성물의 백분율의 합)/(기질 지방산 및 상기로부터 유도된 모든 생성물의 백분율의 합)이다. 예를 들어 DHA에 관하여, 이를 기질 지방산(예를 들어 AO, LA, ALA, SDA, ETA 또는 EPA) 및 상기 기질로부터 유도된 DHA 이외의 모든 생성물의 수준에 대한 DHA의 수준(지질 중 전체 지방산 함량 중 백분율로서)의 비로서 나타낼 수도 있다. 상기 전환 백분율 또는 전환효율을 하나의 경로에서 단일 효소 단계에 대해, 또는 하나의 경로의 부분 또는 전체에 대해 나타낼 수 있다.
특정한 전환 효율들을 본 발명에서 하기 식에 따라 계산한다:
1. OA 에서 DHA = 100 x (%DHA)/(OA, LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
2. LA 에서 DHA = 100 x (%DHA)/(LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
3. ALA 에서 DHA = 100 x (%DHA)/(ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
4. EPA 에서 DHA = 100 x (%DHA)/(EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
5. DPA 에서 DHA (Δ4-불포화효소 효율) = 100 x (%DHA)/(DPA 및 DHA에 대한 %합).
6. Δ12-불포화효소 효율 = 100 x (LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/(OA, LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
7. ω3-불포화효소 효율 = 100 x (ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/(LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
8. OA 에서 ALA = 100 x (ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/(OA, LA, GLA, DGLA, ARA, EDA, ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
9. Δ6-불포화효소 효율(ω3 기질 ALA에 대한) = 100 x (SDA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/ (%ALA, SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA).
10. Δ6-신장효소 효율(ω3 기질 SDA에 대한) = 100 x (ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/(SDA, ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
11. Δ5-불포화효소 효율(ω3 기질 ETA에 대한) = 100 x (EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합)/(ETA, EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
12. Δ5-신장효소 효율(ω3 기질 EPA에 대한) = 100 x (DPA 및 DHA에 대한 %합)/(EPA, DPA 및 DHA에 대한 %합).
본 발명의 지질, 바람직하게는 종자유의 지방산 조성은 또한 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산 또는 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산에 대한, 전체 지방산 함량 중 ω6 지방산:ω3 지방산의 비를 특징으로 한다. 전체 ω6 지방산, 전체 ω3 지방산, 신규 ω6 지방산 및 신규 ω3 지방산이란 용어들은 본 발명에서 정의된 바와 같은 의미를 갖는다. 상기 비를 본 발명에 예시된 바와 같은 방식으로, 상기 세포, 식물, 식물 부분 또는 종자로부터 추출된 지질 중 지방산 조성으로부터 계산한다. 상기 지질 중 ω6 지방산보다 ω3의 수준이 더 높은 것이 바람직하며, 따라서 1.0 미만의 ω6:ω3 비가 바람직하다. 0.0의 비는 상기 한정된 ω6 지방산의 완벽한 부재를 가리키며; 0.03의 비가 실시예 6에 개시된 바와 같이 성취되었다. 상기와 같은 낮은 비는 ω3-불포화효소, 특히 진균 ω3-불포화효소, 예를 들어 본 발명에 예시된 바와 같은 피키아 파스토리스 ω3-불포화효소와 함께 ω3 기질 선호를 갖는 Δ6-불포화효소의 병용을 통해 성취될 수 있다.
종자의 중량당 LC-PUFA의 수율을 또한 상기 종자 중 전체 오일 함량 및 상기 오일 중 DHA%를 근거로 계산할 수 있다. 예를 들어, 캐놀라 종자의 오일 함량이 약 40%(w/w)이고 상기 오일 중 전체 지방산 함량의 약 12%가 DHA인 경우, 상기 종자의 DHA 함량은 약 4.8% 또는 종자의 그램당 약 48 ㎎이다. 실시예 2에 개시된 바와 같이, 약 9% DHA를 갖는 아라비도프시스 종자의 DHA 함량(이는 캐놀라보다 더 낮은 오일 함량을 갖는다)은 약 25 ㎎/g 종자이었다. 약 7%의 DHA 함량에서, 캐놀라 종자 또는 카멜리나 사티바 종자는 종자의 그램당 약 28 ㎎의 DHA 함량을 갖는다. 따라서 본 발명은 종자 그램당 적어도 약 28 ㎎을 포함하는 브라시카 나푸스, 비 준세아 및 카멜리나 사티바 식물, 및 이로부터 수득된 종자를 제공한다. 상기 종자는 건조후 수확된 성숙한 종자에 대한 기준(4 내지 15% 수준)의 수분 함량을 갖는다. 본 발명은 또한 종자를 수득하고 상기 종자로부터 오일을 추출함을 포함하는 오일의 수득 방법, 및 상기 오일의 용도 및 본 발명에 따른 식물로부터 종자를 수확함을 포함하는 상기 종자의 수득 방법을 제공한다.
헥타아르당 생성되는 DHA의 양을 또한, 헥타아르당 상기 종자 수율을 알고 있거나 추정할 수 있는 경우 계산할 수 있다. 예를 들어, 호주에서 캐놀라는 전형적으로 헥타아르당 약 2.5 톤의 종자를 제공하며, 40% 오일 함량에서 약 1000 ㎏의 오일을 제공한다. 전체 오일 중 12% DHA에서, 상기는 헥타아르당 약 120 ㎏의 DHA를 제공한다. 상기 오일 함량이 50%까지 감소되는 경우, 상기는 여전히 약 60 ㎏ DHA/ha를 제공한다.
지금까지의 증거는 효모 또는 식물에서 이종으로 발현된 일부 불포화효소들이 일부 신장효소들과 함께 비교적 낮은 활성을 가짐을 암시한다. 이는 LC-PUFA 합성에서 기질로서 상기 지방산의 아실-CoA 형태를 사용하는 능력을 갖는 불포화효소를 제공함으로써 경감될 수 있으며, 이는 재조합 세포, 특히 식물 세포에서 유리한 것으로 생각된다. 효율적인 DHA 합성에 특히 유리한 조합은 진균 ω3-불포화효소, 예를 들어 피키아 파스토리스 ω3-불포화효소(서열번호 12)와 ω3 아실 기질에 바람직한 Δ6-불포화효소, 예를 들어 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소(서열번호 13) 또는 적어도 95%의 아미노산 서열 일치성을 갖는 그의 변이체와의 조합이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "본질적으로 없는"이란 용어는 상기 조성물(예를 들어 지질 또는 오일)이 상기 한정된 성분을 거의(예를 들어 약 0.5% 미만, 약 0.25% 미만, 약 0.1% 미만, 또는 약 0.01% 미만) 또는 전혀 포함하지 않음을 의미한다. 하나의 실시태양에서, "본질적으로 없는"은 상기 성분을 통상적인 분석 기법을 사용하여 검출할 수 없음, 예를 들어 특정 지방산(예를 들어 ω6-도코사펜타에노산)을 실시예 1에 개략된 바와 같이 기체 크로마토그래피를 사용하여 검출할 수 없음을 의미한다.
오일의 생산
당해 분야에서 통상적으로 실시되는 기법들을 사용하여 본 발명의 세포, 식물, 종자 등에 의해 생산된 오일을 추출, 처리 및 분석할 수 있다. 전형적으로, 식물 종자를 쿠킹하고, 압착하고, 추출하여 조 오일을 생성시키고, 이어서 이를 정련하고, 정제하고, 표백하고 탈취시킨다. 일반적으로, 종자 파쇄 기법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 유지종자를 물로 분무하여 수분 함량을 예를 들어 8.5%까지 상승시킴으로써 불리고, 0.23 내지 0.27 ㎜의 간격 설정을 갖는 매끄러운 롤러를 사용하여 박편화하였다. 종자의 유형에 따라, 물을 파쇄 전에 가하지 않을 수도 있다. 열을 적용하여 효소를 불활성화시키고, 추가적인 세포 파괴를 촉진하고, 오일 소적을 유합시키고, 단백질 입자를 응집시키며, 이들은 모두 추출 공정을 용이하게 한다.
하나의 실시태양에서, 상기 종자유의 대부분이 스크류 프레스를 통과하여 방출된다. 이어서 상기 스크류 프레스로부터 배출된 덩어리를, 예를 들어 헥산으로, 열 추적 컬럼을 사용하여 용매 추출한다. 한편으로, 상기 압착 작업에 의해 생성된 조 오일을, 상기 압착 작업 동안 상기 종자유와 함께 압착된 고체를 제거하기 위해서 슬롯망 배수 탑이 있는 침전조에 통과시킬 수 있다. 상기 등명화된 오일을 평판형 필터에 통과시켜 임의의 잔류 미세 고체 입자를 제거할 수 있다. 경우에 따라, 상기 추출 공정으로부터 회수된 오일을 상기 등명화된 오일과 합하여 블렌딩된 조 오일을 생성시킬 수 있다.
일단 용매가 상기 조 오일로부터 스트리핑되면, 상기 압착되고 추출된 부분들을 합하고 통상적인 오일 처리 과정을 가한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "정제된"이란 용어는 본 발명의 지질 또는 오일과 관련하여 사용될 때 전형적으로 상기 추출된 지질 또는 오일에 상기 지질/오일 성분의 순도를 증가시키는 하나 이상의 처리 단계를 가했음을 의미한다. 예를 들어, 정제 단계는 상기 추출된 오일의 정련, 탈취, 탈색, 건조 및/또는 분별화로 이루어지는 그룹 중 하나 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용된 바와 같이, "정제된"이란 용어는 전체 지방산 함량의 백분율로서 상기 DHA 함량을 증가시키기 위해서 본 발명의 지질 또는 오일의 지방산 조성을 변경시키는 트랜스에스테르화 과정 또는 다른 과정을 포함하지 않는다. 즉 달리 표현하자면, 상기 정제된 지질 또는 오일의 지방산 조성은 정제되지 않은 지질 또는 오일의 경우와 본질적으로 동일하다.
정련
정련은 오일의 정제에서 초기 단계이며 그의 주목적은 상기 오일로부터 대부분의 인지질(전체 추출된 지질의 대략 1 내지 2%로서 존재할 수 있다)을 제거하는 것이다. 70 내지 80 ℃에서, 전형적으로 인산을 함유하는, 약 2%의 물을 상기 조 오일에 첨가하여 미량 금속 및 안료에 의해 동반되는 인지질의 대부분을 분리시킨다. 상기 제거되는 불용성 물질은 주로 인지질과 트라이아실글리세롤의 혼합물이며 또한 레시틴으로서 공지되어 있다. 정련은 농축된 인산을 조 시드오일에 가하여 비-수화성 포스파티드를 수화성 형태로 전환시키고, 존재하는 소량 금속을 킬레이트화함으로써 수행될 수 있다. 원심분리에 의해 상기 시드오일로부터 검이 분리된다.
알칼리 정제
알칼리 정제는 조 오일의 처리를 위한 정제 공정들 중 하나(때때로 또한 중화라고도 칭한다)이다. 상기는 대개 정련에 이어지고 표백에 선행한다. 정련에 이어서, 상기 시드오일을, 상기 지방산 및 인산 모두를 적정하기에 충분한 양의 알칼리 용액을 첨가하고 따라서 형성된 비누를 제거함으로써 처리할 수 있다. 적합한 알칼리성 물질은 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 나트륨, 수산화 리튬, 수산화 칼슘, 탄산 칼슘 및 수산화 암모늄을 포함한다. 상기 공정은 전형적으로는 실온에서 수행되며 유리 지방산 분획을 제거한다. 비누는 원심분리에 의해서 또는 상기 비누에 대한 용매내로의 추출에 의해서 제거되며, 중화된 오일을 물로 세척한다. 경우에 따라, 상기 오일 중 임의의 과잉 알칼리를 적합한 산, 예를 들어 염산 또는 황산으로 중화시킬 수도 있다.
표백
표백은 오일을 90 내지 120 ℃에서 10 내지 30 분 동안 표백토(0.2 내지 2.0%)의 존재 하에서 및 질소 또는 증기와 함께 또는 진공 하에서 작동시킴으로써 산소의 부재 하에서 가열하는 정제 공정이다. 오일 가공에서 상기 단계는 불필요한 색소(카로티노이드, 클로로필, 고시폴 등)를 제거하도록 설계되며 상기 공정은 또한 산화 생성물, 미량 금속, 황 화합물 및 잔량의 비누를 제거한다.
탈취
탈취는 고온(200 내지 260 ℃) 및 저압(0.1 내지 1 mmHg)에서의 오일 및 지방의 처리이다. 이는 전형적으로 상기 시드오일내로 증기를 약 0.1 ㎖/분/100 ㎖ 시드오일의 속도로 도입시킴으로써 성취된다. 약 30 분의 살포 후에, 상기 시드오일을 진공 하에서 냉각시킨다. 상기 시드오일을 전형적으로는 유리 용기로 옮기고 아르곤으로 플러싱시킨 후에 냉장 하에서 보관한다. 이러한 처리는 상기 시드오일의 색상을 개선시키고 임의의 잔류 유리 지방산, 모노아실글리세롤 및 산화 생성물을 포함하는 휘발성 물질 또는 냄새나는 화합물의 대부분을 제거한다.
동결방지 처리
동결방지 처리는 때때로 주변 온도 이하의 온도에서 결정화에 의해 오일 및 지방의 고체(스테아린) 및 액체(올레인) 분획으로의 분리를 위해 오일의 상업적인 생산에 사용되는 공정이다. 이는 원래 고체-부재 생성물을 생성시키기 위해 면실유에 적용되었다. 이를 전형적으로는 오일의 포화 지방산 함량을 감소시키기 위해 사용한다.
트랜스에스테르화
트랜스에스터화는 초기에 TAG로부터 지방산을 유리 지방산으로서 또는 지방산 에스테르, 대개는 지방산 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르로서 방출시킴으로써 TAG 내 및 TAG 간 지방산을 교환하거나 상기 지방산을 또 다른 알콜로 전달하여 에스테르를 형성시키는 공정이다. 분별 공정과 병행시, 트랜스에스테르화를 사용하여 지질의 지방산 조성을 변형시킬 수 있다(Marangoni et al., 1995). 트랜스에스테르화는 화학적(예를 들어 강산 또는 강염기 촉매화되는) 또는 효소적 수단을 사용할 수 있으며, 후자는 TAG 상의 지방산에 대해 위치-특이적(sn-1/3 또는 sn-2 특이적)일 수 있는 리파제를 사용하거나, 또는 다른 것들에 대해 일부 지방산에 바람직하다(Speranza et al, 2012). 오일 중 LC-PUFA의 농도를 증가시키기 위한 상기 지방산 분별화는 당해 분야에 공지된 방법들 중 어느 하나, 예를 들어 동결 결정화, 유레아를 사용하는 복합체 형성, 분자 증류, 초임계 유체 추출 및 은 이온 복합화에 의해 성취될 수 있다. 유레아와의 복합체 형성이 그의 간편성 및 오일 중 포화 및 단일불포화 지방산 수준의 감소에서의 효율성으로 인해 바람직한 방법이다(Gamez et al., 2003). 처음에, 상기 오일의 TAG를 그의 구성 지방산, 종종 지방산 에스테르의 형태로, 산 또는 염기 촉매화된 반응 조건 하에서 가수분해에 의해서[이때 1 몰의 TAG를 적어도 3 몰의 알콜(예를 들어 에틸 에스테르의 경우 에탄올 또는 메틸 에스테르의 경우 메탄올)과, 과잉의 알콜을 사용하여 반응시켜, 형성된 알킬 에스테르 및 또한 형성된 글리세롤의 분리를 가능하게 한다] 또는 리파제에 의해서 분리시킨다. 이어서 상기 유리 지방산 또는 지방산 에스테르(이들은 대개 상기 처리에 의해 지방산 조성이 변경되지 않는다)를 복합체 형성을 위해 유레아의 에탄올 용액과 혼합한다. 상기 포화 및 단일불포화된 지방산은 유레아와 쉽게 복합화하며 냉각시 결정화되고 후속으로 여과에 의해 제거될 수 있다. 이에 의해 상기 비-유레아 복합화된 분획은 LC-PUFA가 농축된다.
식료품
본 발명은 식료품으로서 사용될 수 있는 조성물을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, "식료품"은 체내로 섭취시 (a) 자양분을 주거나 또는 조직을 형성시키거나 에너지를 공급하는 작용을 하고/하거나, (b) 적합한 영양 상태 또는 대사 기능을 유지하거나, 회복하거나 지지하는 인간 또는 동물 소비용의 임의의 식품 또는 제제를 포함한다. 본 발명의 식료품은 아기 및/또는 아동을 위한 영양 조성물, 예를 들어 유아식 및 본 발명의 종자박을 포함한다.
본 발명의 식료품은 예를 들어 본 발명의 세포, 본 발명의 식물, 본 발명의 식물 부분, 본 발명의 시드, 본 발명의 추출물, 본 발명 방법의 생성물, 본 발명의 발효 과정의 생성물, 또는 적합한 담체(들)를 갖는 조성물을 포함한다. "담체"란 용어는 그의 가장 넓은 의미에서 영양가를 갖거나 갖지 않을 수도 있는 임의의 성분을 포함하는 것으로 사용된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 상기 담체는 식료품을 소비하는 유기체에 대해 유해한 영향을 미치지 않도록, 상기 식료품에 사용하기에(또는 충분히 낮은 농도로 사용하기에) 적합해야 한다.
본 발명의 식료품은 본 발명에 개시된 방법, 세포 또는 유기체의 사용에 의해 직접 또는 간접적으로 생산된 오일, 지방산 에스테르, 또는 지방산을 포함한다. 상기 조성물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식용 다량영양소, 단백질, 탄수화물, 비타민 및/또는 미네랄을 특정 용도에 원하는 양으로 포함할 수 있다. 이들 성분들의 양은 상기 조성물을 정상적인 개인에 사용하고자 하는지 또는 대사 질환 등을 앓고 있는 개인과 같이 특수한 필요를 갖는 개인에 사용하고자 하는지에 따라 다양할 것이다.
영양가가 있는 적합한 담체의 예는 비제한적으로 다량영양소, 예를 들어 식용 전분, 탄수화물 및 단백질을 포함한다. 상기와 같은 식용 지방의 예는 비제한적으로 코코넛 오일, 보리지 오일, 진균 오일, 블랙커런트 오일, 대두 오일, 및 모노- 및 다이-글리세라이드를 포함한다. 상기와 같은 탄수화물의 예는 비제한적으로 글루코스, 식용 락토오스 및 가수분해된 전분을 포함한다. 또한, 본 발명의 영양 조성물에 사용될 수 있는 단백질의 예는 비제한적으로 대두 단백질, 전기투석된 유장, 전기투석된 탈지유, 유장, 또는 이들 단백질의 가수분해산물을 포함한다.
비타민 및 미네랄에 관하여, 하기를 본 발명의 식료품 조성물에 첨가할 수 있다: 칼슘, 인, 칼륨, 나트륨, 클로라이드, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 셀레늄, 요오드 및 비타민 A, E, D, C 및 B 복합체. 다른 상기와 같은 비타민 및 미네랄을 또한 첨가할 수도 있다.
본 발명의 식료품 조성물에 사용되는 성분들은 반 (semi)-정제되거나 정제된 기원의 것일 수 있다. 반-정제된 또는 정제된이란 천연 물질의 정제에 의해 제조되거나, 또는 드노보 합성에 의해 제조된 물질을 의미한다.
본 발명의 식료품 조성물을 또한 상기 음식물의 보충이 필요하지 않은 경우에조차 식품에 첨가할 수도 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 임의의 유형의 식품, 예를 들어 비제한적으로 마가린, 변성 버터, 치즈, 우유, 요거트, 초콜릿, 캔디, 스낵, 샐러드 오일, 쿠킹 오일, 쿠킹 지방, 고기, 생선 및 음료에 첨가할 수 있다.
상기 사카로마이세스 스페시즈 종은 맥주 및 와인의 양조 모두에 사용되며 또한 특히 빵 굽기에 작용제로서 사용된다. 다른 효모들, 예를 들어 야로위아 스페시즈를 포함한 유성 효모는 또한 LC-PUFA 생산에 유용하다. 효모를 동물 사료에, 예를 들어 양식에 첨가제로서 사용할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이 LC-PUFA 합성에 적합화된 유전 공학 효모 균주를 제공할 수 있음은 자명할 것이다. 이어서 이들 효모 균주, 또는 상기 중에 생산된 LC-PUFA를 식료품 및 와인 및 맥주 제조에 사용하여 지방산 함량이 증대된 생성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 생성된 지방산 또는 주제 유전자를 함유하고 발현하도록 형질전환된 숙주 세포를 또한 동물 식품 보충제로서 사용하여 동물의 조직, 계란 또는 우유 지방산 조성을 인간 또는 동물 소비에 바람직한 하나 이상으로 변경시킬 수 있다. 상기와 같은 동물의 예는 양, 소, 말, 닭과 같은 가금류 등을 포함한다.
더욱 또한, 본 발명의 식료품을 수산양식에 사용하여 인간 또는 동물 소비용 생선 또는 갑각류 동물, 예를 들어 참새우 중 지방산 수준을 증가시킬 수 있다. 바람직한 생선은 연어이다.
본 발명의 바람직한 식료품은 인간 또는 다른 동물용 식품 또는 사료로서 직접 사용될 수 있는 식물, 시드 및 다른 식물 부분, 예를 들어 잎, 열매 및 줄기이다. 예를 들어, 동물은 들판에서 자란 상기와 같은 식물을 직접 뜯어 먹거나, 또는 조절된 급식에서 보다 표준에 맞는 양을 먹을 수 있다. 본 발명은 인간 및 다른 동물에서 LC-PUFA 수준을 증가시키기 위한 사료로서 상기와 같은 식물 및 식물 부분의 용도를 포함한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 지방산 및/또는 생성 오일 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물을 포함한다.
약학 조성물은 상기 지방산 및/또는 오일 중 하나 이상을, 표준의, 널리 공지된, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 비히클, 예를 들어 인산염 완충된 염수, 물, 에탄올, 폴리올, 식물성 오일, 습윤제, 또는 유화제, 예를 들어 수/오일 유화제와 함께 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체 또는 고체 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 정제, 캡슐, 삼킬 수 있는 액체 또는 분말, 주사성 또는 국소용 연고 또는 크림의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 유동성이, 예를 들어 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 등장제, 예를 들어 당, 염화 나트륨 등을 포함하는 것도 또한 바람직할 수 있다. 상기와 같은 불활성 희석제 외에, 상기 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제 및 방향제를 포함할 수 있다.
현탁액은 상기 활성 화합물 외에, 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 아이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다.
고체 투여형, 예를 들어 정제 및 캡슐을 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 지방산을 통상적인 정제 베이스, 예를 들어 락토스, 슈크로스 및 옥수수 전분으로, 결합제, 예를 들어 아카시아, 옥수수전분 또는 젤라틴, 붕해제, 예를 들어 감자 전분 또는 알긴산, 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 함께 타정할 수 있다. 캡슐은 상기 부형제들을 젤라틴 캡슐에, 산화방지제 및 적합한 지방산(들)과 함께 혼입시킴으로써 제조할 수 있다.
정맥내 투여를 위해서, 본 발명에 따라 제조된 지방산 또는 그의 유도체를 상업적인 제형에 혼입시킬 수 있다.
특정 지방산의 전형적인 투여량은 0.1 ㎎ 내지 20 g으로, 하루에 1 내지 5 회 복용되며(매일 100 g 이하), 바람직하게는 매일 약 10 ㎎ 내지 약 1, 2, 5 또는 10 g(1 회 또는 수회 용량으로 복용)의 범위이다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 최소 약 300 ㎎/일의 지방산, 특히 LC-PUFA가 바람직하다. 그러나, 어떤 양의 지방산이 환자에게 이로울 것인지를 알 것이다.
본 발명의 약학 조성물의 가능한 투여 경로는 예를 들어 경장(예를 들어 경구 및 직장) 및 비경구를 포함한다. 예를 들어, 액체 제제는 경구 또는 직장 투여될 수 있다. 또한, 균일한 혼합물을 물에 완전히 분산시키고, 멸균 조건 하에서 생리학적으로 허용 가능한 희석제, 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합하여 스프레이 또는 흡입제를 형성시킬 수 있다.
환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 결정될 수 있으며, 다양한 인자들, 예를 들어 상기 환자의 체중, 상기 환자의 연령, 상기 환자의 전반적인 건강, 상기 환자의 과거 병력, 상기 환자의 면역 상태 등에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 화장용으로 사용할 수도 있다. 상기 조성물을 기존의 화장품 조성물에, 혼합물이 형성되도록 첨가하거나, 또는 본 발명에 따라 제조된 지방산을 화장품 조성물 중의 유일한 "활성" 성분으로서 사용할 수도 있다.
실시예
실시예 1. 일반적인 물질 및 방법
일시적인 발현 시스템에서 식물 세포 중 유전자의 발현
외인성 유전자 구조물을 본질적으로 문헌[Voinnet et al. (2003)] 및 [Wood et al. (2009)]에 개시된 바와 같이 일시적인 발현 시스템에서 식물 세포에서 발현시켰다. 강한 구성 프로모터, 예를 들어 CaMV 35S 프로모터로부터 발현되는 암호화 영역을 함유하는 플라스미드를 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. p19 바이러스 침묵화 억제인자의 발현을 위해 키메릭 유전자 35S:p19를 WO 2010/057246에 개시된 바와 같이, AGL1에 별도로 도입시켰다. 상기 재조합 아그로박테리움 세포를 50 ㎎/L 가나마이신 및 50 ㎎/L 리팜피신이 보충된 LB 브로쓰에서 28 ℃에서 정지상으로 증식시켰다. 이어서 상기 세균을 실온에서 15 분간 5000 g에서 원심분리에 의해 펠릿화한 후에 10 mM MES pH 5.7, 10 mM MgCl2 및 100 μM 아세토시링온을 함유하는 침윤 완충제 중에 OD600 = 1.0으로 재현탁시켰다. 이어서 상기 세포를 28 ℃에서 3 시간 동안 진탕시키면서 배양한 후에 35S:19p 및 관심 시험 키메릭 구조물(들)을 함유하는 같은 부피의 아그로박테리움 배양액을 잎 조직에 침윤시키기 전에 혼합하였다. 상기 식물을 전형적으로는 침윤후 추가로 5일동안 증식시킨 후에 잎 원반을 취하고 지방산의 GC 분석을 위해 동결-건조시켰다.
동결-건조된 샘플 중 전체 잎 지질의 지방산 메틸 에스테르(FAME)를, 상기 샘플들을 메탄올/HCl/다이클로로메탄(10/1/1 v/v) 용액 중에서 80 ℃에서 2 시간 동안 내부 표준으로서 기지량의 헥사데칸산과 함께 배양함으로써 생성시켰다. FAME를 헥산/DCM 중에서 추출하고, 헥산 중에 작은 부피로 농축시키고 GC에 주입하였다. 상기 지질 분획 중에 존재하는 개별 및 전체 지방산의 양을 상기 기지량의 내부 표준을 근거로 정량분석하였다.
지방산의 기체 크로마토그래피(GC) 분석
FAME를 30 m SGE-BPX70 컬럼(70% 시아노프로필 폴리실페닐렌-실록산, 0.25 ㎜ 내부 직경, 0.25 ㎜ 필름 두께), FID, 분할/비분할 주입기 및 에이질런트 테크놀로지스 7693 시리즈 자동 샘플러 및 주입기가 구비된 에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 7890A GC(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)를 사용하여 기체 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 헬륨을 캐리어 기체로서 사용하였다. 샘플을 150 ℃의 오븐 온도에서 분할 방식(50:1 비)으로 주입하였다. 주입 후, 상기 오븐 온도를 1 분간 150 ℃에서 유지시키고 이어서 3 ℃ 분-1으로 210 ℃까지 상승시키고, 다시 50 ℃ 분-1으로 240 ℃까지 상승시키고, 최종적으로 240 ℃에서 1.4 분 동안 유지시켰다. 피크들을 기지량의 외부 표준 GLC-411(누첵(Nucheck)) 및 C17:1-ME 내부 표준의 반응을 근거로 에이질런트 테크놀로지스 켐스테이션 소프트웨어(Rev B.04.03(16), 미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)에 의해 정량분석하였다.
지질의 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)
전체 지질을, 내부 정량분석 표준으로서 기지량의 트라이-C17:0-TAG를 첨가한 후에 동결-건조된 발생 종자, 개화후 12일째(daf) 및 성숙한 종자로부터 추출하였다. 상기 추출된 지질을 건조 물질 5 ㎎당 1 ㎖의 부탄올:메탄올(1:1 v/v) 중 10 mM 부틸화된 하이드록시톨루엔에 용해시키고, 에이질런트 1200 시리즈 LC 및 6410b 전기분무 이온화 삼중 4극자 LC-MS를 사용하여 분석하였다. 지질을 0.2 ㎖/분 유량의 2원 구배로 작동하는 에이센티스 익스프레스(Ascentis Express) RP-아미드 컬럼(5 ㎜ x 2.1 ㎜, 2.7 ㎛, 슈펠코)을 사용하여 크로마토그래피에 의해 분리시켰다. 이동상은 A, H2O:메탄올:테트라하이드로퓨란(50:20:30, v/v/v) 중의 10 mM 암모늄 포르메이트; B. H2O:메탄올:테트라하이드로퓨란(5:20:75, v/v/v) 중의 10 mM 암모늄 포르메이트이었다. 다중 반응 모니터링(MRM) 목록은 30 V의 충돌 에너지 및 60 V의 단편화 전압을 사용하여 주요 지방산 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 20:1, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6을 기본으로 하였다. 개별적인 MRM TAG를 암모니아와 화합된 전구체 이온 및 22:6의 중성 손실로부터의 생성물 이온을 근거로 확인하였다. TAG를 10 μM 트라이스테아린 외부 표준을 사용하여 정량분석하였다.
종자 지방산 프로파일 및 오일 함량의 측정
종자유 함량을 측정하고자 하는 경우, 종자를 건조기에서 24 시간 동안 건조시키고 대략 4 ㎎의 종자를, 태플론을 댄 스크류 캡을 함유하는 2 ㎖ 유리 바이알로 옮겼다. 0.1 ㎖ 톨루엔에 용해된 0.05 ㎎ 트라이헵타데카노인을 내부 표준으로서 상기 바이알에 가하였다.
종자 FAME를, 종자 물질을 함유하는 바이알에 0.7 ㎖의 1N 메탄올성 HCl(슈펠코)을 가함으로써 제조하고, 간단히 와동시키고 80 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 0.3 ㎖의 0.9% NaCl(w/v) 및 0.1 ㎖ 헥산을 상기 바이알에 가하고 헤이돌프 비브라맥스(Heidolph Vibramax) 110에서 10 분간 잘 혼합하였다. 상기 FAME를 0.3 ㎖ 유리 삽입물에 수거하고 앞서 언급한 바와 같이 화염 이온화 검출기(FID)로 GC에 의해 분석하였다.
개별적인 FAME의 피크 면적을 먼저 상업적인 표준 GLC-411(NU-CHEK PREP, INC., 미국 소재) 중에 존재하는 기지량의 동일한 FAME의 피크 면적 반응을 근거로 보정하였다. GLC-411은 C8:0 내지 C22:6 범위의, 동량의 31 지방산(중량%)을 함유한다. 상기 표준 중에 존재하지 않는 지방산의 경우에, 본 발명자들은 가장 유사한 FAME의 피크 면적 반응을 취하였다. 예를 들어, 16:1d9의 FAME의 피크 면적 반응을 16:1d7에 사용하고 C22:6의 FAME 반응을 C22:5에 사용하였다. 상기 보정된 면적을 사용하여 내부 표준 질량에의 비교에 의해 상기 샘플 중 각 FAME의 질량을 계산하였다. 오일은 주로 TAG의 형태로 저장되며 그의 중량을 FAME 중량을 기준으로 계산하였다. 글리세롤의 전체 몰을, 각 FAME의 몰을 계산하고 FAME의 전체 몰을 3으로 나누어 측정하였다. TAG를 하기 관계를 사용하여 글리세롤 및 지방산 부분의 합으로서 계산하였다: 오일의 중량% = 100 x ((41 x FAME 전체 몰/3) + (FAME 전체 g - (15 x FAME 전체 몰)))/시드 g(여기에서 41 및 15는 각각 글리세롤 부분과 메틸기의 분자량이다).
오일 샘플의 스테롤 함량의 분석
내부 표준으로서 C24:0 모놀의 분액이 첨가된 대략 10 ㎎의 오일 샘플을 4 ㎖의 80% MeOH 중의 5% KOH를 사용하여 비누화시키고 테플론을 댄 스크류-캡핑된 유리 튜브 중에서 80 ℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후에, 2 ㎖의 밀리-Q 수를 가하고 상기 스테롤을 2 ㎖의 헥산:다이클로로메탄(4:1 v/v) 내로 진탕 및 와동에 의해 추출하였다. 상기 혼합물을 원심분리시키고 스테롤 추출물을 제거하고 2 ㎖의 밀리-Q 수로 세척하였다. 이어서 상기 스테롤 추출물을 진탕 및 원심분리 후 제거하였다. 상기 추출물을 질소 기체의 스트림을 사용하여 증발시키고 상기 스테롤을 200 ㎖의 BSTFA를 사용하여 실릴화하고 80 ℃에서 2 시간 동안 가열하였다.
상기 스테롤의 GC/GC-MS 분석을 위해서, 스테롤-OTMSi 유도체를 40 ℃ 열 블록상에서 질소 기체의 스트림 하에 건조시키고 이어서 GC/GC-MS 분석 직전에 클로로폼 또는 헥산에 재용해시켰다. 상기 스테롤-OTMS 유도체를 슈펠코 이쿠이티(Supelco Equity)(상표)-1 융합된 실리카 모세관 컬럼(15 m x 0.1 ㎜ 직경, 0.1 ㎛ 필름 두께), FID, 분할/비분할 주입기 및 에이질런트 테크놀로지스 7683B 시리즈 자동 샘플러 및 주입기가 구비된 에이질런트 테크롤로지스 6890A GC(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)를 사용하여 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 분석하였다. 헬륨이 캐리어 기체였다. 샘플을 120 ℃의 오븐 온도에서 비분할 방식으로 주입하였다. 주입 후, 상기 오븐 온도를 10 ℃ 분-1으로 270 ℃까지 상승시키고 최종적으로 5 ℃ 분-1으로 300 ℃까지 상승시켰다. 피크들을 에이질런트 테크놀로지스 켐스테이션 소프트웨어(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)에 의해 정량분석하였다. GC 결과에 개별 성분 면적의 ±5%의 오차를 가한다.
GC-질량 분광측정(GC-MS) 분석을 피니간 써모퀘스트(Finnigan Thermoquest) GCQ GC-MS 및 피니간 써모 일렉트론 코포레이션 GC-MS 상에서 수행하였으며; 이 두 시스템은 모두 온-컬럼 주입기 및 써모퀘스트 엑스칼리버(Xcalibur) 소프트웨어(미국 텍사스주 오스틴 소재)가 구비되어 있다. 각각의 GC는 상술한 바와 유사한 극성을 갖는 모세관 컬럼이 구비되어 있다. 개별적인 성분들을, 질량 스펙트럼 데이터를 사용하고 체류시간 데이터를 진정한 표준 및 실험용 표준에 대해 획득된 경우와 비교함으로써 확인하였다. 전체 과정 블랭크 분석을 상기 샘플 배치와 동시에 수행하였다.
RT-PCR 조건
역전사-PCR(RT-PCR) 증폭을 전형적으로 제조사의 설명에 따라 완충제 및 뉴클레오티드 성분들과 함께, 10 pmol의 순방향 프라이머 및 30 pmol의 역방향 프라이머를 사용하는 25 ㎕ 부피의 슈퍼스크립트(Superscript) III 1-단계 RT-PCR 시스템(인비트로젠(Invitrogen)), 2.5 mM의 최종 농도의 MgSO4, 400 ng의 전체 RNA를 사용하여 수행하였다. 전형적인 온도 섭생은 하기와 같았다: 역전사 발생을 위해서 1 주기의 45 ℃ 30 분; 이어서 1 주기의 94 ℃ 2 분 이어서 40 주기의 94 ℃ 30 초, 52 ℃ 30 초, 70 ℃ 1 분; 이어서 5 ℃로 반응 혼합물을 냉각시키기 전에 1 주기의 72 ℃ 2 분.
35S-LEC2에 의한 유도에 의한 비 나푸스 체세포 배의 생산
비 나푸스(cv. Oscar) 종자를 문헌[Attila Kereszt et al., 2007]에 개시된 바와 같이 염소 기체를 사용하여 멸균시켰다. 멸균된 종자를, pH 5.8로 조절한 0.8% 아가를 갖는 1/2 강도 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962) 상에서 발아시키고, 6 내지 7일 동안 18/6 시간(명/암) 광주기로 형광 조명(50 μE/㎡s) 하에 24 ℃에서 증식시켰다. 2 내지 4 ㎜ 자루 길이를 갖는 떡잎 잎자루를 상기 묘종으로부터 무균적으로 단리하고 외식체로서 사용하였다. 형질전환된 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1의 배양물들(하나는 종자 특이적 2원 벡터를 갖고 두 번째는 35S-LEC2 구조물을 갖는다)을 새로운 플레이트로부터의 단일 콜로니로부터 접종하고, 적합한 항생제가 있는 10 ㎖의 LB 배지에서 증식시키고 28 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 증식시켰다. 상기 세균 세포를 4000 rpm에서 5 분간 원심분리에 의해 수거하고, 2% 슈크로스를 함유하는 MS 배지로 세척하고 10 ㎖의 동일한 배지에 재-현탁하고, 아세토시링온을 100 μM로 첨가한 후에 4 시간 동안 적합한 대로 선택용 항생제와 함께 증식시켰다. 상기 식물 조직에 첨가하기 2 시간 전에, 스페르미딘을 1.5 mM의 최종 농도로 가하고 상기 세균의 최종 밀도를 새로운 배지로 OD 600 ㎚ = 0.4로 조절하였다. 2 개의 세균 배양물(하나는 종자 특이적 구조물을 갖고 다른 것은 35S-AtLEC2를 갖는다)을 1:1 내지 1:1.5 비로 혼합하였다.
새로-단리된 비 나푸스 떡잎 잎자루를 6 분 동안 20 ㎖ 에이 튜메파시엔스 배양물로 감염시켰다. 상기 떡잎 잎자루를 멸균 여과지상에 블럿팅하여 과잉의 에이 튜메파시엔스를 제거하고 이어서 공-배양 배지[1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA, L-시스테인(50 ㎎/L), 아스코르브산(15 ㎎/L) 및 MES(250 ㎎/L)가 보충된 100 μM 아세토시링온이 있는 MS 배지]로 옮겼다. 상기 플레이트를 미세-구멍 테이프로 밀봉하고 암실에서 24 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 상기 공-배양된 외식체를 예비-선택 배지(1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA, 3 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심 및 50 ㎎/L 티멘틴을 함유하는 MS)로 옮기고 24 ℃에서 4 내지 5 일 동안 16 h/8 h 광주기로 배양하였다. 이어서 상기 외식체를 상기 종자 특이적 벡터상의 선택성 마커 유전자에 따라 선택 배지(1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA, 3 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심 및 50 ㎎/L 티멘틴을 함유하는 MS)로 옮기고 24 ℃에서 2 내지 3 일 동안 16 h/8h 광주기로 배양하였다. 녹색 배발생 캘러스를 갖는 외식체를 무호르몬 MS 배지(3 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심, 50 ㎎/L 티멘틴 및 상기 선택제를 함유하는 MS)로 옮기고 추가로 2 내지 3 주 동안 배양하였다. 상기 선택 배지상의 생존 외식체로부터 단리된 어뢰 또는 떡잎 단계 배를 GC를 사용하여 그의 전체 지질 중 지방산 조성에 대해 분석하였다.
실시예 2. 아라비도프시스 탈리아나 종자에서 트랜스제닉 DHA 경로의 안정한 발현
2원 벡터 제작
2원 벡터 pJP3416-GA7 및 pJP3404는 각각, 5 개의 불포화효소 및 2 개의 신장효소를 암호화하는 7 개의 이종 지방산 생합성 유전자를 함유하였으며, 각각의 벡터 중에는 T-DNA의 좌측과 우측 경계 반복부 사이에 식물 선택성 마커가 존재하였다(도 2 및 3). 서열번호 1은 우측에서부터 좌측 경계 서열로 pJP3416-GA7의 T-DNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 상기 두 유전자 구조물은 모두 라칸세아 클루이베리 Δ12-불포화효소(서열번호 1의 뉴클레오티드 14143-16648을 포함한다), 피키아 파스토리스 ω3-불포화효소(서열번호 1의 뉴클레오티드 7654-10156을 포함한다), 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소(서열번호 1의 뉴클레오티드 226-2309를 포함한다), 파블로바 살리나 Δ5- 및 Δ4-불포화효소(각각 서열번호 1의 뉴클레오티드 4524-6485 및 10157-14142를 포함한다) 및 피라미모나스 코르다타 Δ6- 및 Δ5-신장효소(각각 서열번호 1의 뉴클레오티드 2310-4523 및 17825-19967을 포함한다)를 암호화하는 식물 코돈-최적화된 유전자를 함유하였다. 서열번호 1에 관하여 상기 2원 벡터 pJP3416-GA7의 T-DNA(배향: 우측에서부터 좌측 경계 서열로) 영역의 특정한 영역들은 하기와 같다:
뉴클레오티드 1-163: 우측 경계; 480-226, 아그로박테리움 튜메파시엔스 노팔린 신타제 종결자(TER_NOS); 1883-489, 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소; 2309-1952, 브라시카 나푸스 절두된 나핀 프로모터(PRO_FP1); 2310-3243, 아라비도프시스 탈리아나 FAE1 프로모터(PRO_FAE1); 3312-4181, 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소; 4190-4523, 글리시네 맥스 렉틴 종결자(TER_Lectin); 4524-4881, PRO_FP1; 4950-6230: 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소; 6231-6485: TER_NOS; 7653-6486, 니코티아나 타바쿰 Rb7 기질 부착 영역(MAR); 8387-7654, 리눔 유시타티시뮴 콘리닌1 종결자(TER_Cnl1); 9638-8388, 피키아 파스토리스 ω3-불포화효소; 10156-9707, 리눔 유시타티시뮴 콘리닌1 프로모터 (PRO_Cnl1); 10157-12189, 리눔 유시타티시뮴 콘리닌1 프로모터; 12258-13604, 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소; 13605-14142, 리눔 유시타티시뮴 콘리닌2 종결자; 14143-14592, PRO_Cnl1; 14661-15914, 라칸세아 클루이베리 Δ12-불포화효소; 15915-16648, TER_Cnl1; 17816-16649, MAR; 17825-18758, PRO_FAE1; 18827-19633, 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소; 19634-19967, TER_Lectin; 19990-20527, 중복된 인헨서 영역을 갖는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터; 20537-21088, 스트렙토마이세스 비리도크로모제네스 포스피노트리신-N-아세틸트랜스퍼라제; 21097-21349, TER_NOS; 21367-21527, 좌측 경계.
상기 구조물 중 7 개의 암호화 영역들은 각각 종자-특이적 프로모터의 조절 하에 있다 - 3 개의 상이한 프로모터들, 즉 절두된 브라시카 나푸스 나핀 프로모터(pBnFP1), 아라비도프시스 탈리아나 FAE1 프로모터(pAtFAE1) 및 리눔 유시타티시뮴 콘리닌1 프로모터(pLuCnl1)이 사용되었다. 상기 7 개의 지방산 생합성 유전자들은 함께, 18:1Δ9(올레산)을 22:6Δ4,7,10,13,16,19(DHA)로 전환하도록 설계된 전체 DHA 합성 경로를 암호화하였다. 상기 두 2원 벡터는 모두 중복된 인헨서 영역 및 에이 튜메파시엔스 nos3' 폴리아데닐화 영역-전사 종결자와 함께 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터에 작동적으로 연결된 BAR 식물 선택성 마커 암호화 영역을 함유하였다. 상기 식물 선택성 마커는 상기 T-DNA 영역의 좌측 경계에 인접하여 위치하며, 따라서 상기 식물 세포내로의 T-DNA 전달 배향에 관하여 상기 T-DNA상에서 원위에 위치하였다. 이는 상기 T-DNA의 부분 전달(상기 선택성 마커 유전자를 포함하지 않을 듯 하다)이 선택되지 않을 가능성을 증가시켰다. pJP3416-GA7 및 pJP3404는 각각 아그로박테리움 리조제네스로부터의 RiA4 복제 기원을 함유하였다(Hamilton, 1997).
pJP3416-GA7을, 서열번호 1의 뉴클레오티드 226-19975에 상응하는 DNA 영역(GA7 영역)을 합성하고 상기 영역을 수용 2원 벡터 pJP3416에 PspOMI 부위에서 삽입함으로써 생성시켰다. GA7상의 각각의 지방산 생합성 유전자는, 상기 프로모터와 번역 개시 ATG 사이에, 상기 유전자로부터 생성된 mRNA의 번역 효율을 최대화하기 위해서 각각의 암화화 영역에 작동적으로 연결된 담배 모자이크 바이러스 5' 비번역 영역(5'UTR) 서열을 포함하였다. 상기 GA7 구조물은 문헌[Hall et al.(1991)]에 개시된 바와 같이, 2 개의 니코티아나 타바쿰 Rb7 기질 부착 영역(MAR) 서열을 또한 포함하였다. MAR 서열(때때로 핵 부착 영역이라 칭함)은 시험관내에서 상기 핵 기질에 특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있으며 생체내에서 핵 기질에 대한 염색질의 결합을 매개할 수 있다. MAR은 트랜스유전자 침묵화를 감소시키는 작용을 하는 것으로 생각된다. pJP3416-GA7에서 상기 MAR은 또한 DNA 이격자로서 작용하여 트랜스제닉 발현 카세트를 격리시키기 위해 상기 T-DNA 영역 중에 삽입되어 위치하였다. 상기 GA7 영역의 삽입전에 pJP3416 벡터는 상기 경계들 사이에 오직 식물 선택성 마커 카세트만을 함유하였다.
상기 유전자 구조물 pJP3404는 유전자 카세트를 2원 벡터, pJP3367(시드에서 SDA의 생산을 위한 유전자를 포함하였다)에 첨가하는 연속적인 제한 효소-기재 삽입에 의해 제조되었다. 상기 구조물은 엘 클루이베리 Δ12-불포화효소 및 피 파스토리스 ω3-불포화효소(이들은 모두 비 나푸스 절두된 나핀 프로모터(FP1)에 의해 발현되었다), 및 에이 탈리아나 FAE1 프로모터에 의해 발현된 엠 푸실라 Δ6-불포화효소를 암호화하는 유전자를 함유하였다(도 4). 먼저, 상기 에이 탈리아나 FAD2 인트론을 EcoRI 부위에 의해 측면 인접시키고, pJP3367 MfeI 부위내로 클로닝하여 pJP3395를 생성시켰다. 각각 FAE1 및 FP1 프로모터에 의해 구동되는 피 코르다타 Δ6- 및 Δ5-신장효소 카세트를 함유하는 단편을 pJP3395의 KasI 부위내로 클로닝하여 pJP3398을 생성시켰다. 이어서 pJP3399를, pJP3398 중의 RK2 복제 기원을 RiA4 복제 기원으로 대체시켜 생성시켰다. 최종 2원 벡터, pJP3404를, 각각 FP1 및 FAE1 프로모터에 의해 구동되는 피 살리나 Δ5- 및 Δ4-불포화효소 카세트를 함유하는 SbfI-측면 인접된 단편을 pJP3399의 SbfI 부위내로 클로닝하여 생성시켰다.
에이 탈리아나 형질전환 및 지방산 조성의 분석
키메릭 벡터를 상기 사용된 에이 튜메사피엔스 균주 AGL1 및 형질전환된 아그로박테리움의 배양물로부터의 세포내로 도입시켜 형질전환을 위한 플로랄 침지 방법을 사용하여 에이 탈리아나(생태형 콜럼비아 및 fad2 돌연변이체) 식물을 처리하였다(Clough and Bent, 1998). 성숙후, 상기 처리된 식물로부터 T1 종자를 수확하고 BAR 선택성 마커 유전자를 함유하는 식물의 선택을 위해 PPT를 함유하는 MS 플레이트상에 도말하였다. 생존하는 건강한 T1 묘종을 토양으로 옮겼다. 상기 식물을 성숙기로 증식시키고 자가-수분정을 허용한 후에, 상기 식물로부터 T2 종자를 수확하고 그의 종자 지질의 지방산 조성을 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC 분석에 의해 분석하였다.
상기 종자 지질 중 DHA 수준에 대한 데이터를, 상기 콜럼비아 유전자 배경내로 pJP3416-GA7을 사용한 13 개의 형질전환체, 및 fad2 돌연변이체를 사용한 6 개의 형질전환체에 대해 도 5에 나타낸다(T2 표지된 레인들). 상기 pJP3416-GA7 구조물은 상기 pJP3404 구조물에 비해 평균적으로, 전체 지방산 함량의 백분율로서, 약간 더 높은 수준의 DHA를 생성시켰다. 표 4는 최고의 DHA 수준을 갖는 T2 라인으로부터의 전체 종자 지질의 지방산 조성을 나타낸다. 동일한 종자 중 올레산으로부터의 DHA의 생산에서 각 효소 단계에 대해 계산된 전환 효율을 표 5에 나타낸다. 전환 효율은 (생성물% x 100)/(남은 기질% + 생성물%)로서 계산되었으며, 백분율로서 나타내었다.
상기 pJP3416-GA7 T2 형질전환된 라인에서 생성된, 관찰된 DHA의 최고의 수준은 6.2%이었으며, 또한 0.5% EPA 및 0.2% DPA가 존재하였다(라인 #14). 이들 T2 종자는 여전히 상기 트랜스유전자와 분리되었다, 즉 여전히 균일하게 동형접합성이 아니었다. 독립적인 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일(표 4)로부터 집계된 데이터를 표 6에 나타낸다. 이들 종자 중 트랜스유전자의 결과로서 생성된 ω3 지방산의 수준(상기 콜럼비아 배경에서 외인성으로 생성된 ALA의 수준을 제외한, 전체 신규 ω3 지방산)은 10.7%인 반면, ω6 지방산의 수준(전체 신규 ω6 지방산, 그러나 18:2Δ9,12는 제외됨)은 1.5%이었다. 이는 신규 ω3 지방산:신규 ω6 지방산의 매우 유리한 비, 즉 7.3:1을 나타낸다.
pJP3416-GA7로 형질전환된 선택된 라인, 즉 상기 콜럼비아 배경에서 7, 10, 14, 22 및 34로 나타낸 라인들 및 상기 fad2 돌연변이체 배경에서 18, 21 및 25로 나타낸 라인들에 대한 T2 종자를 시험관내에서 트랜스유전자 묘종의 선택을 위해 PPT를 함유하는 MS 배지상에 도말하였다. 각각의 라인에 대한 20 개의 PPT-내성 묘종을 토양으로 옮기고 자가-수분후에 성숙기로 증식시켰다. 이들 식물은 상기 선택성 마커 유전자에 대해, 따라서 상기 식물의 게놈 중 적어도 하나의 T-DNA 삽입에 대해 대단히 동형접합성인 듯하였다. 이들 식물로부터 T3 종자를 수확하고 GC에 의해 그들의 종자유 중 지방산 조성에 대해 분석하였다. 데이터를 표 7에 나타낸다. 이 분석은 pJP3416-GA7 구조물이 상기 분리된 T2 종자에서보다 상기 동형접합성 식물의 T3 종자에서 더 높은 수준의 ω3 LC-PUFA DHA를 생성시킴을 밝혀냈다. 상기 콜럼비아 배경에서 22.2로 나타낸 T3 pJP3416-GA7 형질전환된 라인에서 약 13.9% 이하의 DHA가 관찰되었으며, 이는 반접합성 T2 종자에서 약 5.5%로부터 증가된 것이고, 이때 상기 종자 지질 함량 중 전체 지방산의 백분율로서 약 24.3%의 신규 ω3 지방산들의 합계 수준을 가졌다. 신규 ω6 지방산은 전체 지방산의 1.1%의 수준이었으며, 이는 신규 ω3 지방산:신규 ω6 지방산의 매우 유리한 비, 즉 약 22:1을 나타낸다. 유사하게, 상기 fad2 돌연변이 배경에서 형질전환체들은 상기 종자 지질 함량 중 전체 지방산의 백분율로서, 11.5% DHA를 포함하여, 신규 ω3 지방산들의 합으로서 20.6%를 제공하였다.
관찰된 범위의 보다 높은 끝의 DHA 수준을 갖는 독립적인 트랜스제닉 T2 아바리도프시스 종자로부터의 전체 종자 지질의 지방산 조성. 'Col'은 콜럼비아 생태형을, 'FAD2'는 fad2 돌연변이체 생태형을 지칭한다. 'GA7'은 pJP3416-GA7 벡터의 T-DNA에 의한 형질전환을, pJP3404는 pJP3404 벡터의 T-DNA에 의한 형질전환을 지칭한다. 20:1n-9 및 20:1n-11 지방산은 GC 분석에서 분석되지 않았다. "그 밖의 소수" 지방산은 14:0, 16:1n7, 16:1n9, 16:1n13t, 16:2n6, 16:3n3, i18:0, 18:1n5, 20:1n5, 22:0, 22:1n7, 22:1n11/n13, 24:0, 24:1n9를 포함한다.
pJP3404_Col_#1 pJP3404_FAD2_#31 GA7_Col_#7 GA7_Col_#34 GA7_Col_#2 GA7_Col_#10 GA7_Col_#22 GA7_Col_#14 GA7_FAD2_#25 GA7_FAD2_#21 GA7_FAD2_#18
16:0 9.6 7.8 8.7 8.2 8.7 8.6 8.3 9.7 7.2 8.5 7.5
18:0 2.9 3.9 3.7 3.9 3.6 3.3 3.4 3.6 3.2 3.9 3.0
18:1d11 2.2 1.8 2.0 1.9 2.0 2.3 2.3 2.7 1.9 2.0 1.8
20:0 1.6 2.3 2.0 2.0 2.1 1.6 1.6 1.8 1.6 2.2 1.5
20:1d13 2.2 1.8 1.6 1.5 1.7 1.6 1.5 1.7 1.5 1.7 1.4
20:1d9/d11 13.0 15.9 16.1 16.1 16.3 15.0 13.9 13.5 18.3 15.9 17.0
22:1d13 1.1 1.2 1.1 1.1 1.3 1.0 1.0 1.0 1.0 1.3 1.2
그 밖의 소수 1.9 1.5 1.5 1.4 1.5 1.3 1.6 1.7 1.6 1.4 1.6
18:1d9 10.8 14.0 10.6 10.6 10.1 11.1 10.0 7.7 26.0 8.2 20.9
18:2w6 28.9 28.3 16.4 16.1 18.2 13.7 13.7 11.4 6.6 16.6 4.3
18:3w3 16.6 14.9 29.6 29.6 27.5 32.4 30.4 32.8 21.9 27.7 30.1
18:3w6 0.7 0.5 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1
20:2w6 1.6 1.5 1.1 1.2 1.3 1.0 1.0 1.0 0.4 1.4 0.4
20:3w6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
20:4w6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
22:4w6 1.6 0.6 0.3 0.3 0.3 0.4 0.5 0.4 0.5 0.4 0.4
22:5w6 0.1 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
18:4w3 1.0 0.5 1.2 1.1 1.1 1.5 2.7 2.7 1.9 1.8 1.7
20:3w3 0.0 0.0 0.0 0.6 0.0 0.0 0.6 0.7 0.0 0.8 0.6
20:4w3 0.4 0.6 0.6 0.7 0.5 0.8 0.8 0.4 1.0 0.8 0.8
20:5w3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.7 0.5 0.6 0.4 0.5
22:5w3 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3
22:6w3 3.6 2.4 3.0 3.1 3.3 3.9 5.5 6.2 4.3 4.4 4.8
표 4에 관해서 독립적인 트랜스제닉 종자로부터 전체 종자 지질에서 관찰된, 올레산으로부터 DHA의 생성을 위한 개별적인 효소 단계들의 전환 효율
Figure 112020060294603-pat00006
표 2에 나타낸 독립적인 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일로부터 집계된 데이터. 계산은 표 4의 '소수 지방산'을 포함하지 않는다.
매개변수 pJP3404_Col_#1 pJP3404_FAD2_#31 GA7_Col_#7 GA7_Col_#34 GA7_Col_#2 GA7_Col_#10 GA7_Col_#22 GA7_Col_#14 GA7_FAD2_#25 GA7_FAD2_#21 GA7_FAD2_#18
전체 w3 (전체 FA 중의 %) 21.8 18.8 34.9 35.6 32.9 39.1 40.9 43.5 30.0 36.2 38.8
전체 w6 (전체 FA 중의 %) 32.9 31.0 17.9 17.7 19.9 15.2 15.4 12.9 7.6 18.6 5.2
w3 / w6 비 0.66 0.61 1.95 2.01 1.65 2.57 2.66 3.37 3.95 1.95 7.46
w6 / w3 비 1.51 1.65 0.51 0.50 0.60 0.39 0.38 0.30 0.25 0.51 0.13
전체 신규 w3 (전체 FA 중의 %) 5.2 3.9 5.3 6.0 5.4 6.7 10.5 10.7 8.1 8.5 8.7
전체 신규 w6 (전체 FA 중의 %) 4.0 2.7 1.5 1.6 1.7 1.5 1.7 1.5 1.0 2.0 0.9
신규 w3 / w6 비 1.30 1.44 3.53 3.75 3.18 4.47 6.18 7.13 8.10 4.25 9.67
신규 w6 / w3 비 0.77 0.69 0.28 0.27 0.31 0.22 0.16 0.14 0.12 0.24 0.10
OA 에서 EPA 효율 4.8% 3.5% 4.3% 4.4% 4.7% 5.4% 7.9% 8.8% 6.3% 6.4% 6.7%
OA 에서 DHA 효율 4.5% 3.0% 3.7% 3.8% 4.1% 4.8% 6.8% 7.9% 5.2% 5.5% 5.8%
LA 에서 EPA 효율 6.9% 5.6% 6.6% 6.8% 7.2% 8.1% 11.4% 12.2% 13.8% 9.3% 12.7%
LA 에서 DHA 효율 6.6% 4.8% 5.7% 5.8% 6.3% 7.2% 9.8% 11.0% 11.4% 8.0% 10.9%
ALA 에서 EPA 효율 17.4% 14.9% 10.0% 10.1% 11.6% 11.3% 15.6% 15.9% 17.3% 14.1% 14.4%
ALA 에서 DHA 효율 16.5% 12.8% 8.6% 8.7% 10.0% 10.0% 13.4% 14.3% 14.3% 12.2% 12.4%
전체 포화물 14.1 14.0 14.4 14.1 14.4 13.5 13.3 15.1 12.0 14.6 12.0
전체 단일불포화물 29.3 34.7 31.4 31.2 31.4 31.0 28.7 26.6 48.7 29.1 42.3
전체 다중불포화물 54.7 49.8 52.8 53.3 52.8 54.3 56.3 56.4 37.6 54.8 44.0
전체 C20 17.4 20 19.7 20.4 20.1 18.7 18.5 17.8 21.8 21 20.7
전체 C22 6.4 4.5 4.6 4.7 5.1 5.5 7.2 7.8 6.1 6.4 6.7
C20/C22 비 2.72 4.44 4.28 4.34 3.94 3.40 2.57 2.28 3.57 3.28 3.09
표 3에서와 같은 식물 라인으로부터 수득된 독립적인 트랜스제닉 T3 및 T4 아라비도프시스 자손 종자로부터의 전체 종자 지질의 지방산 조성. T4 세대에 나타낸 오차는 n=10의 SD를 나타낸다.
Figure 112020060294603-pat00007
Figure 112020060294603-pat00008
Figure 112020060294603-pat00009
Figure 112020060294603-pat00010
올레산으로부터 DHA의 생성을 위한 경로 중 각 효소 단계에 대한 효소 전환 효율들을 보다 높은 DHA 수준을 갖는 T3 종자에 대해서 표 8에 나타낸다. 라인 22.2의 종자에서 Δ12-불포화효소 전환 효율은 81.6%이고 ω3-불포화효소 효율은 89.1%이었으며, 이들은 둘 다 현저하게 높았고 이는 이들 진균(효모) 효소가 발생 종자에서 잘 작용할 수 있음을 가리킨다. 상기 DHA 경로에서 다른 외인성 효소들의 활성은 ω3 기질에 대해서 매우 유사하게, Δ6-불포화효소가 42.2% 효율로 작용하고, Δ6-신장효소가 76.8%, Δ5-불포화효소가 95.0%, Δ5-신장효소가 88.7%, 및 Δ4-불포화효소가 93.3%의 효율로 작용하였다. 상기 ω6 기질 LA에 대한 Δ6-불포화효소 활성은 훨씬 더 낮았으며, 이때 상기 Δ6-불포화효소는 LA에 대해서 단지 0.7%의 전환 효율로 작용하였다. GLA는 단지 0.4%의 수준으로 존재하였으며, 최고의 DHA 함량을 갖는 T3 종자에서 검출된 20:2ω6를 제외하고 유일한 신규 ω6 생성물이었다. 독립적인 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일(표 7)로부터 집계된 데이터를 표 9에 나타낸다. 최고 DHA 수준을 갖는 라인에 대한 상기 데이터는 0.10의 전체 ω6 FA(LA 포함) 대 전체 ω3 FA(ALA 포함) 비를 포함하였다. 상기 라인의 지질 중 신규 ω6 FA(LA 제외) 대 신규 ω3 FA(ALA 제외) 비는 0.05였다. 전체 다중불포화 지방산 수준은 이들 라인에서 50%를 초과하였으며 상기 라인 중 적어도 4 개에서 60%를 초과하였다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: OA 에서 EPA = 21.8%, OA 에서 DHA = 18.0%, LA 에서 EPA = 26.9%, LA 에서 DHA = 22.2%, ALA 에서 EPA = 30.1%, ALA 에서 DHA = 24.9%.
표 7에서와 같이 트랜스제닉 T3 아라비도프시스 종자로부터 전체 종자 지질에서 관찰된, 올레산으로부터 DHA의 생성을 위한 개별적인 효소 단계들의 전환 효율
Figure 112020060294603-pat00011
표 5에 나타낸 독립적인 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일로부터 집계된 데이터. 계산은 표 7의 '소수 지방산'을 포함하지 않는다.
매개변수
Figure 112020060294603-pat00012
전체 w3 (전체 FA 중의 %)
Figure 112020060294603-pat00013
전체 w6 (전체 FA 중의 %)
Figure 112020060294603-pat00014
w3 / w6 비
Figure 112020060294603-pat00015
w6 / w3 비
Figure 112020060294603-pat00016
전체 신규 w3 (전체 FA 중의 %)
Figure 112020060294603-pat00017
전체 신규 w6 (전체 FA 중의 %)
Figure 112020060294603-pat00018
신규 w3 / w6 비
Figure 112020060294603-pat00019
신규 w6 / w3 비
Figure 112020060294603-pat00020
OA 에서 EPA 효율
Figure 112020060294603-pat00021
OA 에서 DHA 효율
Figure 112020060294603-pat00022
LA 에서 EPA 효율
Figure 112020060294603-pat00023
LA 에서 DHA 효율
Figure 112020060294603-pat00024
ALA 에서 EPA 효율
Figure 112020060294603-pat00025
ALA 에서 DHA 효율
Figure 112020060294603-pat00026
전체 포화물
Figure 112020060294603-pat00027
전체 단일불포화물
Figure 112020060294603-pat00028
전체 다중불포화물
Figure 112020060294603-pat00029
전체 C20
Figure 112020060294603-pat00030
전체 C22
Figure 112020060294603-pat00031
C20/C22 비
Figure 112020060294603-pat00032
T2 라인 22로부터의 자손인, 콜럼비아 배경 중 pJP3416-GA7 라인 22.2로부터의 T3 종자를 직접 토양에 파종하고 생성된 T3 식물로부터 성숙한 종자의 지방산 조성을 GC에 의해 분석하였다. 이들 종자의 평균 DHA 수준은 상기 종자 지질 중 전체 지방산의 백분율로서 13.3%±1.6(n=10)이었다. 표 6(우측 컬럼)에 나타낸 바와 같이, 최고 수준의 DHA를 갖는 라인은 종자 지질의 전체 지방산 중 15.1% DHA를 함유하였다. 효소 전환 효율을 올레산으로부터 DHA의 생성에서 각 단계에 대해 표 8에 나타낸다.
최고의 DHA 수준을 갖는 라인에서 전체 ω6 FA(LA 포함) 대 ω3 FA(ALA 포함) 비는 0.102이었다. 최고의 DHA 수준을 갖는 라인에서 신규 ω6 FA(LA 제외) 대 신규ω3 FA(ALA 제외) 비는 0.053이었다. 전체 포화 지방산의 수준은 약 17.8%이고 단일불포화 지방산의 수준은 약 18.1%이었다. 전체 ω6-지방산의 수준은 약 5.7%이고 ω3-지방산의 수준은 약 55.9%이었다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: OA 에서 EPA = 24.5%, OA 에서 DHA = 20.1%, LA 에서 EPA = 29.9%, LA 에서 DHA = 24.5%, ALA 에서 EPA = 32.9%, ALA 에서 DHA = 27.0%. 전체 오메가-3 지방산은 전체 지방산의 55.9%로 축적되는 것으로 밝혀진 반면 오메가-6 지방산은 전체 프로파일의 5.7%이었다.
서던 블럿 하이브리드화 분석을 수행하였다. 결과는 고-축적 DHA 라인이 트랜스제닉 라인 콜럼비아#22(아라비도프시스 식물의 게놈 중에 3 개의 T-DNA 삽입을 가졌다)를 제외하고 상기 pJP3416-GA7 구조물로부터 T-DNA에 대한 단일- 또는 이중-사본임을 나타내었다. T5 세대 종자를 또한 분석하였으며 전체 종자 지질 중에 13.5% 이하의 DHA를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 GA7 구조물은 DHA 생성 능력에 관하여 다수의 세대에 걸쳐 안정한 것으로 밝혀졌다.
트랜스제닉 에이 탈리아나 DHA 라인에서 오일 함량의 측정
다양한 수준의 DHA를 갖는 트랜스제닉 에이 탈리아나 종자의 오일 함량을 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC에 의해 측정하였다. 데이터를 도 6에 나타내며, 도 6은 DHA 함량(전체 지방산의 백분율로서)에 대한 오일 함량(종자의 오일 중량%)을 그래프로 나타낸다. 종자의 그램당 26.5 ㎎ 이하의 DHA가 관찰되었다(표 10). 상기 트랜스제닉 아라비도프시스 종자의 오일 함량은 DHA 함량과 음으로 상관되는 것으로 밝혀졌다. 종자의 중량당 DHA의 양은 약 14% DHA를 갖는 종자에 비해 약 9%의 DHA 수준을 갖는 형질전환된 시드에서 더 높았다. 이것이 아라비도프시스 이외의 종자들에 대해서도 사실인지의 여부는 측정되지 않았다.
GA7-형질전환된 아라비도프시스 종자 중 DHA의 비율 및 양
Figure 112020060294603-pat00033
실시예 3. 카멜리나 사티바 종자에서 트랜스제닉 DHA 경로의 안정한 발현
상술한 바와 같이 2원 벡터 pJP3416-GA7을 상기 사용된 에이 튜메사피엔스 균주 AGL1 및 형질전환된 아그로박테리움의 배양물로부터의 세포내로 도입시켜 형질전환을 위한 플로랄 침지 방법을 사용하여 씨 사타비 화훼 식물을 처리하였다(Lu and Kang, 2008). 상기 식물의 증식 및 성숙후, 상기 처리된 식물로부터 T1 종자를 수확하고, 토양상에 파종하고, 생성된 식물을 제초제 BASTA로 분무 처리하여, pJP3416-GA7의 T-DNA 상에 존재하는 bar 선택성 마커 유전자에 대해 트랜스제닉이고 이를 발현하는 식물을 선택하였다. 상기 제초제에 허용성인 생존하는 T1 묘종을 성숙기로 증식시키고 자가-수분을 허용한 후에, 생성된 T2 종자를 수확하였다. 5 개의 트랜스제닉 식물을 수득하였으며, 이중 단지 3 개만이 전체 T-DNA를 함유하였다.
지질을 상기 전체 T-DNA를 함유하는 3 개의 식물들 각각으로부터의 대략 20 개의 종자 풀로부터 추출하였다. 상기 수집된 샘플 중 2 개는 매우 낮은, 거의 검출할 수 없는 수준의 DHA를 함유하였으나, 세 번째 풀은 약 4.7%의 DHA를 함유하였다(표 12). 따라서, 지질을 상기 식물로부터 10 개의 개별적인 T2 종자로부터 추출하고 지방산 조성을 GC에 의해 분석하였다. 상기 형질전환된 라인에 대한 개별적인 종자의 지방산 조성 데이터를 또한 표 11에 나타낸다. 전체 종자 지질 프로파일(표 11)로부터 집계한 데이터를 표 12에 나타낸다.
pJ3416-GA7로부터의 T-DNA로 형질전환된 트랜스제닉 T2 카멜리나 사티바 종자로부터의 전체 종자 지질의 지방산 조성. 상기 지방산 조성을 수집된 종자 배치(FD5.46) 및 최고에서부터 최저까지의 DHA로 순위를 매긴(좌에서 우로) 10 개의 단일 종자에 대해서 나타낸다.
지방산 수집된
FD5.46 		# 2 # 4 # 8 # 7 # 9 # 1 # 3 # 5 # 6 # 10
14:0 0 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2
16:0 11.6 12.1 12.3 12.1 13.2 12.3 12.8 11.9 11.4 11.5 11.7
16:1 0.2 0.0 0.1 0.1 0.0 0.2 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2
16:3 0.3 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
18:0 3.7 3.3 3.2 3.2 3.0 3.1 3.2 3.3 3.1 3.2 3.2
18:1 10.8 8.0 8.0 8.6 8.5 9.4 11.0 10.2 8.3 9.4 8.6
18:1d11 1.7 1.3 1.4 1.4 1.7 1.4 1.5 1.3 1.3 1.3 1.3
18:2 24.7 18.2 19.5 19.2 18.5 20.1 23.8 32.2 30.3 29.8 31.6
18:3w3 27.4 26.7 26.6 27.3 28.9 28.2 27.4 28.3 29.2 29.5 28.2
18:3w6 0.2 1.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.5 0.0 0.5 0.4 0.6
20:0 1.6 1.4 1.3 1.4 1.2 1.4 1.4 1.8 2.1 1.9 2.0
18:4w3 2.2 6.8 6.4 5.7 7.2 5.7 4.1 0.0 0.0 0.0 0.0
20:1d11 5.3 4.4 4.6 4.8 3.3 4.1 3.5 4.4 6.1 5.8 5.5
20:1iso 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.0 0.5 0.6 0.5 0.5
20:2w6 0.8 0.8 0.9 0.8 0.6 0.8 0.7 1.3 1.5 1.4 1.4
20:3w3 0.6 0.8 0.8 0.8 0.7 0.8 0.7 0.6 0.7 0.7 0.6
22:0 0.4 0.5 0.5 0.5 0.4 0.5 0.5 0.6 0.6 0.6 0.6
20:4w3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0
22:1 1.1 1.1 1.2 1.1 0.5 0.9 0.8 1.6 2.2 1.9 2.0
20:5w3 0.7 1.3 1.6 1.5 1.6 1.1 1.7 0.0 0.0 0.0 0.1
22:2w6 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.3 0.2 0.2
22:4w6+22:3w3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.0 0.3 0.0 0.4 0.6 0.5 0.5
24:0 0.3 0.3 0.3 0.3 0.0 0.3 0.0 0.4 0.4 0.4 0.4
24:1 0.3 0.4 0.4 0.3 0.0 0.3 0.0 0.5 0.6 0.5 0.5
22:5w3 0.3 1.1 1.2 1.1 1.1 0.9 0.8 0.0 0.0 0.0 0.0
22:6w3 4.7 9.0 8.5 8.3 8.3 7.1 4.9 0.0 0.0 0.0 0.0
표 11에 나타낸 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일로부터 집계된 데이터. 계산은 표 11의 '소수 지방산'을 포함하지 않는다.
매개변수 수집된
FD5.46 		# 2 # 4 # 8 # 7 # 9 # 1 # 3 # 5 # 6
전체 w3 (전체 FA의 %) 36.1 46 45.4 45 48.2 44.2 40.1 28.9 29.9 30.2
전체 w6 (전체 FA의 %) 25.8 20.4 20.7 20.3 19.5 21.1 25 33.7 32.6 31.8
w3 / w6 비 1.40 2.25 2.19 2.22 2.47 2.09 1.60 0.86 0.92 0.95
w6 / w3 비 0.71 0.44 0.46 0.45 0.40 0.48 0.62 1.17 1.09 1.05
전체 신규 w3 (전체 FA의 %) 8.1 18.5 18 16.9 18.6 15.2 12 0 0 0
전체 신규 w6 (전체 FA의 %) 1.1 2.2 1.2 1.1 1 1 1.2 1.5 2.3 2
신규 w3 / w6 비 7.36 8.41 15.00 15.36 18.60 15.20 10.00
신규 w6 / w3 비 0.14 0.12 0.07 0.07 0.05 0.07 0.10
OA 에서 EPA 효율 8.2% 15.6% 15.5% 15.1% 15.1% 12.8% 10.5% 0.0% 0.0% 0.0%
OA 에서 DHA 효율 6.7% 12.3% 11.6% 11.5% 11.4% 10.0% 7.0% 0.0% 0.0% 0.0%
LA 에서 EPA 효율 9.2% 17.2% 17.1% 16.7% 16.2% 13.9% 11.4% 0.0% 0.0% 0.0%
LA 에서 DHA 효율 7.6% 13.6% 12.9% 12.7% 12.3% 10.9% 7.5% 0.0% 0.0% 0.0%
ALA 에서 EPA 효율 15.8% 24.8% 24.9% 24.2% 22.8% 20.6% 18.5% 0.0% 0.0% 0.0%
ALA 에서 DHA 효율 13.0% 19.6% 18.7% 18.4% 17.2% 16.1% 12.2% 0.0% 0.0% 0.0%
전체 포화물 17.6 17.8 17.8 17.6 18 17.8 18.1 18.2 17.7 17.8
전체 단일불포화물 19.8 15.5 16 16.6 14.3 16.6 16.8 18.7 19.3 19.6
전체 다중불포화물 62.5 66.6 66.4 65.6 67.7 65.6 65.1 63 63.1 62.5
전체 C20 9.6 9.3 9.8 9.9 8.1 8.9 8.5 8.6 11 10.3
전체 C22 5.4 10.3 10 9.7 9.4 8.3 5.7 0.6 0.9 0.7
C20/C22 비 1.78 0.90 0.98 1.02 0.86 1.07 1.49 14.33 12.22 14.71
DHA는 10 개의 개별적인 종자 중 6 개에 존재하였다. 4 개의 다른 종자는 DHA를 갖지 않았으며, 부모 식물에서 T-DNA 삽입의 반접합성 상태를 근거로 상기 T-DNA를 갖지 않는 빈(null) 분리개체인 것으로 추정되었다. 최고 수준의 DHA를 갖는 단일 종자로부터 추출된 지질은 9.0% DHA를 갖는 반면 EPA, DPA 및 DHA에 대한 백분율의 합은 11.4%이었다. 형질전환의 결과로서 상기 종자 중에 생성된 신규 ω3 지방산들(SDA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA)에 대한 백분율의 합은 19.3%인 반면 신규 ω6 지방산들(GLA, EDA, DGLA, ARA 및 임의의 ω6 신장 생성물)에 대한 상응하는 합은 2.2%이었고, 오직 GLA 및 EDA만이 신규 ω6 지방산으로서 검출되었다. 전체 ω6 FA(LA 포함) 대 ω3 FA(ALA 포함) 비는 0.44인 것으로 밝혀졌다. 최고 수준의 DHA를 갖는 종자 중 신규 ω6 FA(LA 제외) 대 신규 ω3 FA(ALA 제외) 비는 0.12였다. 전체 포화 지방산 수준은 약 17.8%이고 단일불포화 지방산의 수준은 약 15.5%이었다. 전체 ω6-지방산의 수준은 약 20.4%이고 ω3-지방산의 수준은 약 46%이었다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: OA 에서 EPA = 15.6%, OA 에서 DHA = 12.3%, LA 에서 EPA = 17.2%, LA 에서 DHA = 13.6%, ALA 에서 EPA = 24.8%, ALA 에서 DHA = 19.6%.
상기 라인으로부터 동종접합성 종자를 T4 세대에서 수득하였다. 10.3% 이하의 DHA가 사건 FD5-46-18-110에서 생성되었으며 이때 전체 T4 세대에 걸쳐 평균 7.3%의 DHA가 관찰되었다.
동형접합성 종자를 다수의 온실에 걸쳐 내다 심어 총 600 개 이상의 개별적인 식물을 생성시켰다. 오일을 다양한 방법들, 예를 들어 속슬렛, 아세톤 및 헥산 추출을 사용하여 종자로부터 추출한다.
상술한 바와 같이 수득된 씨 사티바의 독립적으로 형질전환된 라인의 수는 낮기 때문에, pJP3416-GA7로 씨 사티바를 형성질환시키는 추가적인 실험을 수행한다. 본 발명자들은 종자유중 전체 지방산의 백분율로서 10%를 초과하는 DHA 수준이 추가적인 형질전환된 라인에서 성취되고 상기 T-DNA에 대해 동종접합성인 식물에서 20% DHA가 성취될 것임을 예견한다. 20 개의 씨 사티바 GA7_modH 사건이 발생하였고 종자를 DHA 함량에 대해 분석 중에 있다. 3 개의 GA7_modB 사건이 발생하였고 사건 CMD17.1로부터 T1 종자의 분석은 9.8%의 수집된 종자 DHA 함량을 밝혀내었다. 최고의 단일 종자 DHA 값은 13.5%인 것으로 밝혀졌다.
실시예 4. 브라시카 나푸스 종자에서 트랜스제닉 DHA 경로의 안정한 발현
비 나푸스 형질전환 및 단일 벡터를 사용하는 지방산 조성의 분석
2원 벡터 pJP3416-GA7을 사용하여 형질전환된 브라시카 나푸스 식물 및 상기 식물로부터의 종자를 생성시켰다. 상술한 바와 같은 벡터 pJP3416-GA7을 표준 일렉트로포레이션 과정을 통해 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1내로 도입시켰다. 트랜스제닉 아그로박테리움 세포의 배양물을 LB 배지에서 150 rpm으로 교반하면서 28 ℃에서 밤새 증식시켰다. 상기 세균 세포를 4000 rpm에서 5 분간 원심분리에 의해 수거하고, 위난스(Winans) AB 배지(Winans, 1988)로 세척하고, 10 ㎖의 위난스 AB 배지(pH 5.2)에 재현탁하고 가나마이신(50 ㎎/L), 리팜피신(25 ㎎/L) 및 100 μM 아세토시링온의 존재 하에서 밤새 계속 증식시켰다. 상기 브라시카 세포의 감염 2 시간 전에, 스페르미딘(120 ㎎/L)을 가하고 상기 세균의 최종 밀도를 새로운 AB 배지로 OD 600 ㎚ = 0.3 - 0.4로 조절하였다. 1/2 MS(Murashige and Skoog, 1962)상에서 증식시킨 8일된 브라시카 나푸스 묘종으로부터 새로 단리된 떡잎 잎자루 또는 1 ㎎/L 티디아주론(TDZ) 및 0.1 ㎎/L α-나프탈렌아세트산(NAA)이 있는 MS 배지상에서 3 내지 4일 전처리된 배축을 10 ㎖의 아그로박테리움 배양물로 5 분간 감염시켰다. 이어서 아그로박테리움으로 감염된 외식체를 멸균 여과지상에 블럿팅하여 과잉의 아그로박테리움을 제거하고, 상이한 항생제(L-시스테인 50 ㎎/L 및 아스코르브산 15 ㎎/L)이 보충되거나 보충되지 않은 공-배양 배지(1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA 및 100 μM 아세토시링온이 있는 MS 배지)로 옮겼다. 상기 모든 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 암실에서 23-24 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다.
이어서 상기 처리된 외식체를 500 ㎎/L 세포탁심 및 50 ㎎/L 티멘틴을 함유하는 멸균 증류수로 10 분간 세척하고, 멸균 증류수로 10 분간 세정하고, 멸균 여과지상에 건조 블럿팅하고, 예비-선택 배지(1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA, 20 ㎎/L 아데닌 설페이트(ADS), 1.5 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심 및 50 ㎎/L 티멘틴을 함유하는 MS)로 옮기고 24 ℃에서 5 일 동안 16 h/8 h 광주기로 배양하였다. 이어서 상기 외식체를 상기 형질전환된 세포의 선택을 위해 작용제로서 1.5 ㎎/L 글루포시네이트 암모늄과 함께 선택 배지(1 ㎎/L TDZ, 0.1 ㎎/L NAA, 20 ㎎/L ADS, 1.5 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심 및 50 ㎎/L 티멘틴을 함유하는 MS)로 옮기고 동일 배지 상에서 2주마다 계대배양하면서 24 ℃에서 4 주 동안 16 h/8h 광주기로 배양하였다. 녹색 캘러스를 갖는 외식체를 싹 개지 배지(1 ㎎/L 키네틴, 20 ㎎/L ADS, 1.5 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심, 50 ㎎/L 티멘틴 및 1.5 ㎎/L 글루포시네이트 암모늄을 함유하는 MS)로 옮기고 추가로 2 내지 3 주 동안 배양하였다. 상기 내성 외식체로부터 발아하는 싹을 싹 신장 배지(0.1 ㎎/L 지베렐린산, 20 ㎎/L ADS, 1.5 ㎎/L AgNO3, 250 ㎎/L 세포탁심, 및 1.5 ㎎/L 글루포시네이트 암모늄을 함유하는 MS)로 옮기고 추가로 2 주 동안 배양하였다. 2 내지 3 ㎝ 길이의 건강한 싹을 선택하고 발근 배지(1 ㎎/L NAA, 20 ㎎/L ADS, 1.5 ㎎/L AgNO3, 및 250 ㎎/L 세포탁심을 함유하는 1/2 MS)로 옮기고 2 내지 3 주 동안 배양하였다. 뿌리를 갖는 잘 확립된 싹을 육묘 믹스를 함유하는 화분으로 옮기고 2 주 동안 생육 캐비넷에서 생육시키고 후속으로 온실로 옮겼다. 상기 GA7 구조물로 형질전환된 대략 40 개(T0)의 식물을 상기 방법에 의해 수득하였다.
식물을 성숙기로 증식시킨 후에 자가-수분을 허용하였다. 형질전환된 식물로부터 수득된 종자를 실시예 1에 개시된 바와 같이 그의 종자유 중 지방산 조성에 대해 분석하였다. 최고의 DHA 수준을 갖는 형질전환된 라인에 대한 데이터를 표 13에 나타낸다. DHA 수준은 평균적으로 동일한 구조물로 형질전환된 에이 탈리아나 종자(실시예 2) 또는 카멜리나 종자(실시예 3)에서보다 pJP3416-GA7로부터의 T-DNA로 형질전환된 비 나푸스의 종자유에서 현저하게 더 낮았다. 대략 40 개의 라인에서 DHA의 최고 수준은 1.52%인 것으로 밝혀졌으며 상기 트랜스제닉 라인의 대부분은 검출 가능한 DHA를 가졌다. 이들 종자에서 ALA의 상당한 축적, 약 35%의 전체 지방산이 존재하였으며, 이는 상기 경로에서 SDA 또는 다음 생성물로 효율적으로 전환되지 않았다.
T1 사건으로부터 단일 비 나푸스 종자의 지방산 프로파일 분석을 수행하여 트랜스제닉 종자에서 생성된 DHA의 양을 더 잘 측정하였다. 종자는 0%(빈 종자) 내지 8.5%의 DHA를 함유하는 것으로 밝혀졌다(표 13).
상기 식물 라인 CT116뿐만 아니라 DHA 생성을 나타내는 다른 트랜스제닉 라인으로부터의 종자들 중 일부를 자손 식물을 생산하도록 파종하였다. RT-PCR을, 상기 GA7 구조물이 동일한 구조물을 갖는 트랜스제닉 에이 탈리아나 및 씨 사티바에 비해 DHA 생산을 불충분하게 수행하고, pJP3115 및 pJP3116(하기)상의 유전자들의 조합에 비해 불량한 이유를 측정하기 위해서 상기 식물로부터의 발생 배로부터 단리된 전체 RNA에 대해 수행하였다. RT-PCR을 1-단계 RT-PCR 키트(인비트로젠) 및 각각의 트랜스유전자를 표적화하는 유전자-특이성 프라이머를 사용하여 전체 RNA에 대해 수행하였다. 이는 상기 GA7 구조물 중 유전자들 각각이, 대부분의 형질전환된 종자에서 불충분하게 발현된 Δ6-불포화효소를 제외하고 상기 비 나푸스 형질전환체에서 잘 발현됨을 입증하였다. 상기 구조물로부터의 다른 유전자들은 비 나푸스 및 에이 탈리아나 종자 모두에서 잘 작용하였다, 예를 들어 상기 Δ12- 및 Δ15-불포화효소는 올레산 수준을 감소시키면서 종자 중 증가된 LA 및 ALA의 수준을 생성시키는 작용을 하였다. 전형적인 RT-PCR 젤을 도 7에 나타내며, 상기 도면은 pJP3416-GA7으로부터의 다른 트랜스유전자들에 비해 Δ6-불포화효소의 낮은 발현을 명백히 나타낸다.
상기 트랜스유전자들에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 식물 및 종자를, 최고의 DHA를 갖는 라인으로부터 자손을 식재하여 생성시킨다.
야생형(형질전환되지 않은) 대조군에 비해, pJP3416-GA7, 라인 CT116-11 및 CT-125-2로 형질전환된 독립적인 T1 브라시카 나푸스 종자로부터의 종자유 중 전체 지방산의 백분율로서 지방산 조성. 22:6ω3은 DHA이다. 단일 CT125-2 비 나푸스 종자로부터의 데이터는 'SS'로 나타낸다.
대조군 CT116-11 CT125-2 CT125-2
#2 SS 		CT125-2
#3 SS 		CT125-2
#10 SS
14:0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1
16:0 4.3 7.2 5.2 6.5 4.7 7.7
16:1 0.2 0.5 0.4 0.3 0.3 0.8
16:3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2
18:0 2.1 2.2 2.4 2.3 2.3 2.8
18:1d9 59.1 27.0 38.1 34.0 19.3 14.8
18:1d11 3.7 6.6 4.2 4.4 4.3 9.6
18:2 19.7 14.1 16.6 13.9 10.2 10.2
18:3w3 8.3 35.2 27.7 34.1 49.5 37.9
20:0 0.6 0.5 0.6 0.4 0.3 0.7
18:4w3 0.0 0.9 0.3 0.5 0.6 2.6
20:1d11 1.2 1.1 1.0 1.0 0.8 0.6
20:1is0 0.2 0.1 0.2
20:2w6 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
20:3w3 1.3 0.7 0.8 1.6 0.9
22:0 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.4
20:4w3 0.1 0.3 0.4 0.6 0.5
22:1
20:5w3 0.1 0.3
22:3w3 0.1
24:0 0.2 0.4 0.3 0.1 0.1 0.3
24:1 0.1 0.3 0.1 0.1 0.2 0.1
22:5w3 0.1 0.1 0.1 0.1 0.5
22:6w3 1.52 1.2 1.3 2.7 8.5
2 개의 벡터를 사용하는 비 나푸스 형질전환 및 지방산 조성의 분석비 나푸스에서의 또 다른 실험에서, 및 트랜스유전자의 도입을 위한 또 다른 포맷으로서, WO 2010/057246에 개시된 바와 같은 2원 벡터 pJP3115 및 pJP3116을 사용하여 형질전환된 비 나푸스 식물들을 별도로 생성시키고 형질전환된 종자를 상기 식물들로부터 수득하였다. 상기 pJP3115상의 T-DNA는 크레피스 팔레스티나(Crepis palestina) Δ12-불포화효소, 마이크로모나스 푸실라 Δ6-불포화효소, 피라미모나스 코르다타 Δ6-신장효소 및 파블로바 살리나 Δ5-불포화효소를 암호화하는 키메릭 유전자를 포함하였고, pJP3116상의 T-DNA는 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens) Δ15-불포화효소, 피라미모나스 코르다타 Δ5-신장효소 및 파블로바 살리나 Δ4-불포화효소를 암호화하는 키메릭 유전자를 함유하였다. 상기 두 T-DNA는 발생 종자 중에서 함께 존재하고 발현될 때, 내인성으로 생성된 올레산으로부터 DHA를 생성시키는 7-유전자 경로를 형성하였다. 이들 벡터를 표준 일렉트로포레이션 과정을 통해 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시키고 상기 형질전환된 세포들을 독립적으로 사용하여 상술한 바와 같은 방법으로 비 나푸스를 형질전환시켜 안정하게 형질전환된 T0 식물을 생성시켰다. 29 개의 pJP3115 및 19 개의 pJP3116 형질전환체를 수득하고 이들 식물을 성숙기로 증식시키고 자가-수분 후에 수득된 종자를 그의 종자유 중 지방산 조성에 대해 분석하였다. pJP3115로부터의 T-DNA에 의한 형질전환은 내인성으로 생성된 ALA로부터 EPA 생성을 생성시키는 것으로 예상된 반면 pJP3116으로부터의 T-DNA에 의한 형질전환은 LA로부터 증가된 ALA 생성을 생성시키는 것으로 예상되었다. 이러한 표현형들을 나타내는 다수의 식물들을 확인하였다. 상기 사건의 대부분은 낮은 수준의 EPA 생성과 함께 Δ12 불포화로 인한 감소된 OA/증가된 LA 표현형을 나타내었다. pJP31115 트랜스제닉 수집된 종자에서 2.6% 이하의 EPA가 관찰되었다. 유사하게, pJP3116 사건의 대부분은 Δ15-불포화효소 활성으로 인해 상승된 ALA 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다. pJP3116으로부터의 T-DNA에 의해 형질전환된 수집된 종자에서 18.5% 이하의 ALA가 밝혀졌다.
최고 수준의 EPA 및 ALA를 갖는 라인으로부터의 T1 식물들을 교배하고 24 개의 회수된 사건으로부터의 자손 종자(F1)를 DHA 함량에 대해 분석하였다. DHA는 이들 사건 중 17 개에서 발견되었으며, 이때 1.9% 이하의 DHA가 이들 사건으로부터의 모든 종자에서 발견되었다. 단일-종자 분석을 수행하여 DHA 생성 범위를 측정하였으며, 데이터를 표 14에 나타낸다. 상기 교배된 자손에서, 추정상 부모 식물의 T-DNA의 반접합성 성질로 인해(따라서 일부 종자는 상기 두 T-DNA를 모두 받지 않았다), 넓은 범위의 DHA 수준이 관찰되었다. 전체 종자 지질 중 6.7% 이하의 DHA가 관찰되었다.
pJP3116으로부터의 T-DNA에 대해 트랜스제닉인 식물과 pJP3115로부터의 T-DNA에 대해 트랜스제닉인 식물의 교배로부터의 비 나푸스 F1 단일 종자의 종자유 중 전체 지방산의 백분율로서 지방산 조성. B1, B2 및 B4는 사건들을 가리킨다. 0.0 = GC 방법에 의해 검출할 수 없음.
Figure 112020060294603-pat00034
표 14에 나타낸 트랜스제닉 종자로부터의 전체 종자 지질 프로파일로부터 집계된 데이터. 계산은 표 14의 '소수 지방산'을 포함하지 않는다.
매개변수 B1.1 B1.2 B1.3 B1.4-g B1.5-g B2.1 B2.2 B2.3g B2.4g B2.5g B3.1
전체 w3 (전체 FA의 %) 4.6 3.9 2.3 12.1 9 2.7 2.6 14.8 0.8 3.6 2.6
전체 w6 (전체 FA의 %) 44.5 38.5 38.5 48.8 50.3 40.5 34.1 49.4 52.7 40.5 35.7
w3 / w6 비 0.10 0.10 0.06 0.25 0.18 0.07 0.08 0.30 0.02 0.09 0.07
w6 / w3 비 9.67 9.87 16.74 4.03 5.59 15.00 13.12 3.34 65.88 11.25 13.73
전체 신규 w3 (전체 FA의 %) 2.6 2 1.1 8.9 6.5 1.4 1.4 11.4 0 2 1.5
전체 신규 w6 (전체 FA의 %) 10.5 7.5 7.9 19.1 15.4 8.4 6.1 15.8 28.3 6.7 7.5
신규 w3 / w6 비 0.25 0.27 0.14 0.47 0.42 0.17 0.23 0.72 0.00 0.30 0.20
신규 w6 / w3 비 4.04 3.75 7.18 2.15 2.37 6.00 4.36 1.39 3.35 5.00
OA 에서 EPA 효율 2.5% 2.1% 0.9% 10.1% 6.9% 1.3% 1.3% 12.8% 1.9% 1.4%
OA 에서 DHA 효율 1.7% 1.2% 0.6% 7.2% 4.8% 0.9% 0.8% 8.5% 1.3% 1.0%
LA 에서 EPA 효율 4.3% 4.0% 2.0% 12.6% 9.4% 2.5% 3.0% 15.7% 3.6% 3.1%
LA 에서 DHA 효율 2.9% 2.4% 1.2% 9.0% 6.6% 1.9% 1.9% 10.4% 2.5% 2.1%
ALA 에서 EPA 효율 47.7% 44.7% 36.4% 68.1% 65.9% 44.0% 45.8% 72.1% 47.1% 50.0%
ALA 에서 DHA 효율 31.8% 26.3% 22.7% 48.7% 45.9% 32.0% 29.2% 47.9% 32.4% 33.3%
전체 포화물 10.2 10.6 7.9 15.1 12.4 9.6 10.2 13.7 11.6 11.3 10.6
전체 단일불포화물 40.4 47 51.1 23.8 28.7 47.2 53 21.8 34.7 44.7 51
전체 다중불포화물 49.2 42.5 40.9 61 59.4 43.3 36.8 64.3 53.7 44.2 38.4
전체 C20 4.2 4 3.2 5.1 4.7 3.6 3.5 5.1 2.8 4 3.4
전체 C22 2.6 2.5 1.3 8.3 6.4 1.7 1.8 11.1 0.5 2.4 1.9
C20/C22 비 1.62 1.60 2.46 0.61 0.73 2.12 1.94 0.46 5.60 1.67 1.79
전체 지질 프로파일(표 14)로부터 집계된 데이터를 표 15에 나타낸다. 표 15의 데이터로부터, 최고 수준의 DHA를 갖는 종자에서 전체 ω6 FA(LA 포함) 대 ω3 FA(ALA 포함) 비는 3.34이었다. 신규 ω6 FA(LA 제외) 대 신규 ω3 FA(ALA 제외) 비는 1.39이었다. 전체 포화 지방산의 수준은 약 13.7%이고 단일불포화 지방산의 수준은 약 21.8%이었다. 전체 ω6-지방산의 수준은 약 46.4%이고 ω3-지방산의 수준은 약 14.8%이었다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: OA 에서 EPA = 12.8%, OA 에서 DHA = 8.5%, LA 에서 EPA = 15.7%, LA 에서 DHA = 10.4%, ALA 에서 EPA = 72.1%, ALA 에서 DHA = 47.9%. pJP3115 및 pJP3116의 조합을 사용하여 상기 실험에서 관찰된 ω6 지방산에서 ω3 지방산으로의 감소된 전환 효율은 ALA에서 DHA로의 전환을 위해 상기 유전자들과 병용시 진균 Δ15/ω3 불포화효소(실시예 2 및 3)에 비해 식물 Δ15-불포화효소의 더 낮은 효율에 기인하는 것으로 생각된다.
상기 도입된 트랜스유전자들 모두에 대해 동형접합성인 DHA-함유 라인으로부터의 자손을 분석에 사용한다.
실시예 5. 식물 종자에서 DHA 경로를 암호화하는 T-DNA에 대한 변형
비 나푸스에서 DHA 생산 수준을 실시예 4에 개시된 수준 이상으로 개선시키기 위해서, 2원 벡터들 pJP3416-GA7-modA, pJP3416-GA7-modB, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7-modE 및 pJP3416-GA7-modF를 하기와 같이 제작하였다. 이들 2원 벡터는 실시예 2에 개시된 pJP3416-GA7 구조물의 변형들이며, 특히 Δ6-불포화효소 및 Δ6-신장효소 작용을 개선시킴으로써 식물 종자 중 DHA의 합성을 추가로 증가시키도록 설계되었다. SDA가 Δ5-신장효소에 비해, 비교적 낮은 신장 효율로 인해 GA7 구조물로 형질전환된 일부 종자(따라서 다른 변형들 중에서도 2 개의 신장효소 유전자 위치가 T-DNA에서 변환되었다)에서 축적되는 것으로 관찰되었다.
pJP3416-GA7 중 2 개의 신장효소 암호화 서열을, 먼저 신규 피 코르다타 Δ6-신장효소 카세트를 pJP3416-GA7의 SbfI 부위 사이에 클로닝하여 피 코르다타 Δ5-신장효소 카세트를 대체시킴으로써 T-DNA 상에서 그의 위치를 변환시켜 pJP3416-GA7-modA를 제공하였다. 엠 푸실라 Δ6-불포화효소를 구동하는 FP1 프로모터를 콘리닌 Cnl2 프로모터(pLuCnl2)로 교환하여 pJP3416-GA7-modB를 제공함으로써 상기 구조물을 추가로 변형시켰다. 이러한 변형은 상기 Δ6-불포화효소 발현을 증가시키고 이에 의해 효소 효율을 증가시키고자 수행되었다. 상기 Cnl2 프로모터는 절두된 나핀 프로모터보다 비 나푸스에서 상기 트랜스유전자의 더 높은 발현을 제공할 수도 있는 것으로 생각되었다. pJP3416-GA7-modC는, 약간 상이한 코돈 사용(서열번호 15)을 갖고 FP1 프로모터에 의해 구동되는 제2 엠 푸실라 Δ6-불포화효소 카세트를 첨가함으로써(이는 pJP3416-GA7-modB의 우측 경계 바로 안쪽에 PmeI 부위에서 삽입되었다) 생성되었다. 상기 제2 Δ6-불포화효소 카세트는 상기 Δ6-불포화효소 발현 수준을 증가시키고 다수의 프로모터의 사용에 의한 Δ6-불포화효소의 발현을 위해 종자 발생 기간을 연장시키기 위해서 pJP3416-GA7-modB 및 pJP3416-GA7-modF 모두에 첨가되었다. 상이한 코돈 사용을 상기 두 뉴클레오티드 서열에 사용하여 동일한 T-DNA 내 유사한 암호화 영역으로부터 공-억제의 위험 없이 동일한 단백질 서열의 번역을 생성시켰다. pJP3416-GA7-modD 및 pJP3416-GA7-modE는, 서열번호 1의 뉴클레오티드 16649-17816에 상응하는 제3 MAR 서열이 상기 PmeI 부위에서 각각 pJP3416-GA7 및 pJP3416-GA7-modB에 첨가된 유사한 변이체들이다. pJP3416-GA7-modF는, 고유 Δ6-불포화효소 뉴클레오티드 서열을 함유하고 pJP3416-GA7-modB의 우측 경계의 PmeI 부위에서 FP1 프로모터에 의해 구동되는 제2 엠 푸실라 Δ6-불포화효소 카세트를 첨가함으로써 생성되었다. pJP3416-GA7-modG는, 먼저 상기 엠 푸실라 Δ6-불포화효소 카세트를 AscI-PacI 부위에서 제한 클로닝에 의해 Cnl2:피 코르다타 Δ5-신장효소 카세트로 대체함으로써 제조되었다. 이어서 pJP3416-GA7-modG를, 원래의 FAE1:피 코르다타 Δ5-신장효소 카세트를 SbfI 부위에서의 제한 클로닝에 의해 FAE1:엠 푸실라 Δ6-불포화효소 카세트로 대체함으로써 제조하였다. 이들 유전자 구조물 각각으로부터의 T-DNA의 뉴클레오티드 서열들을 하기와 같이 나타낸다: pJP3416-GA7-modB (서열번호 2), pJP3416-GA7-modC (서열번호 3), pJP3416-GA7-modD (서열번호 4), pJP3416-GA7-modE (서열번호 5), pJP3416-GA7-modF (서열번호 6) 및 pJP3416-GA7-modG (서열번호 7).
상기 2원 벡터들 pJP3416-GA7-modB, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7-modE,pJP3416-GA7-modF 및 pJP3416-GA7-modG를 사용하여 형질전환된 브라시카 체세포 배 및 브라시카 나푸스, 카멜리나 사티바 및 아라비도프시스 탈리아나 식물 및 자손 종자를 생성시킨다. pJP3416-GA7-modB에 대한 데이터를 다음 실시예에 나타낸다.
8 개의 트랜스제닉 pJP3416-GA7-modB 에이 탈리아나 사건 및 15 개의 트랜스제닉 pJP3416-GA7-modG 에이 탈리아나 사건들이 생성되었다. 수집된 pJP3416-GA7-modB 종자에서 3.4% 내지 7.2% DHA가 관찰되었으며 수집된 T2 pJP3416-GA7-modG 종자에서 0.6 내지 4.1% DHA가 관찰되었다. 최고의 pJP3416-GA7-modB 사건들 중 다수를 선택성 배지에 파종하고 생존 묘종을 다음 세대로 간주하였다. 종자를 DHA 함량에 대해 분석하고 있다. 상기 수집된 T1 종자는 상기 트랜스유전자와 분리되고 임의의 빈 분리물을 포함하는 집단을 나타내기 때문에, 자손 식물로부터의 동형접합성 종자는 종자유 중 전체 지방산 함량의 20% 이하의 증가된 수준의 DHA를 가질 것으로 예상된다. 다른 변형된 구조물들을 사용하여 에이 탈리아나를 형질전환시켰다. 오직 소수의 형질전환된 라인들만이 수득되었지만, 어느 것도 상기 modB 구조물보다 더 높은 수준의 DHA를 제공하지 못하였다.
상기 pJP3416-GA7-modB 구조물을 또한 사용하여 오스카 품종 및 NX005로 표시한 육종 라인의 형질전환된 비 나푸스 식물을 생성시켰다. 지금까지 상기 오스카 형질전환에 대해서 10 개의 독립적인 형질전환된 식물(T0)이 수득되었고 NX005에 대해서는 20 개의 독립적인 라인이 수득되었다. 종자(T1 종자)를 이들 트랜스제닉 라인들로부터 수확하였다. 종자의 풀을 종자유 중 DHA의 수준에 대해 시험하였으며, 최고 수준을 나타낸 2 개의 라인을 선택하였고, 이들을 라인 CT132.5(오스카 품종에서) 및 CT133.15(NX005에서)로 표시하였다. CT132.5로부터 20 개의 종자 및 CT133.15로부터 11 개의 종자를 흡수팽윤시키고, 2일 후에, 개별적인 종자들 각각으로부터 반쪽 떡잎으로부터 오일을 추출하였다. 배축을 갖는 다른 반쪽 떡잎을 보존하고 배지상에서 배양하여 특정한 자손 라인을 유지시켰다. 상기 오일 중 지방산 조성을 측정하였으며; CT132.5에 대한 데이터를 표 16에 나타낸다. 상기 분석된 20 개 종자 중 10 개의 DHA 수준은 GC 분석에 의해 측정된 바와 같이 전체 지방산 함량의 7 내지 20%의 범위였다. 다른 종자는 7% 미만의 DHA를 가졌으며 pJP3416-GA7-modB로부터 T-DNA의 부분(불완전) 사본을 함유할 수도 있다. 상기 트랜스제닉 라인은 유전학적으로 연결되지 않은 다수의 트랜스유전자 삽입을 함유하는 것으로 나타났다. 트랜스제닉 라인 CT133.15의 종자는 0 내지 5% 범위의 DHA 수준을 나타내었다. DHA가 없는 종자는 빈 분리물인 듯하였다. 상기 데이터는 상기 modB 구조물이 캐놀라 종자에서 DHA 생산에 대해 잘 수행됨을 입증하였다.
pJP3416-GA7-modB 및 pJP3416-GA7-modF 구조물을 또한 형질전환된 카멜리나 사티바 식물의 생성에 사용하였다. 적어도 24 개의 독립적인 형질전환된 식물(T0)이 수득되었으며 이를 자손 분석에 의해 보다 상세히 검사하였다. 종자(T1 종자)를 이들 트랜스제닉 라인으로부터 수확하였다. 종자의 풀을 상기 종자유 중 DHA 수준에 대해 시험하였으며, 최고 수준의 DHA(6% 내지 9%)를 나타낸 6 개의 라인을 선택하였다. 각 라인으로부터 20 개의 T1 종자 중 DHA 수준을 분석하였으며, 대부분의 종자는 GC 분석에 의해 측정된 바와 같이 전체 지방산 함량의 6 내지 14% 범위의 DHA 수준을 나타내었다. 상기 오일 중 지방산 조성을 측정하였다; 다수의 트랜스제닉 종자에 대한 데이터를 표 17에 나타낸다. 이들 제이터는 modB 및 modF 구조물이 모두 카멜리나 종자에서 DHA 생성을 잘 수행함을 입증하였다.
modB 구조물을 함유하는 T1 트랜스제닉 비 나푸스 종자를 발아하는 반쪽 떡잎의 지방산 프로파일. 10% 초과의 DHA를 함유하는 다수의 샘플에 대해서 18.1% 이하의 DHA가 관찰되었다.
Figure 112020060294603-pat00035
Figure 112020060294603-pat00036
modB 또는 modF 구조물을 함유하는 T1 트랜스제닉 씨 사티바 종자의 지방산 프로파일
Figure 112020060294603-pat00037
본 발명자들은, 일반적으로 DHA 경로에서 속도-제한 효소 활성의 효율이 단일-사본 T-DNA 형질전환체에 비해 다중사본 T-DNA 형질전환체에서 더 크거나, 또는 상기 효율을 상기 T-DNA에 상기 경로에서 제한일 수도 있는 효소를 암호화하는 다수의 유전자들을 삽입함으로써 증가시킬 수 있음을 생각하였다. 다중-사본 형질전환체의 가능한 중요성에 대한 증거가 상기 GA7 구조물에 의해 형질전환된 아라비도프시스 종자에서 나타났으며(실시예 2), 이때 최고 수율의 DHA 사건은 숙주 게놈내에 삽입된 3 개의 T-DNA를 가졌다. 상기 다수의 유전자들은 동일하거나, 또는 바람직하게는 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 상이한 변이체이거나, 또는 중복되는 발현 패턴을 갖는 상이한 프로모터들의 조절 하에 있다. 예를 들어, 증가된 발현은, 동일한 단백질이 생성된다 하더라도, 다수의 Δ6-불포화효소 암호화 영역들의 발현에 의해 성취될 수 있었다. 예를 들어 pJP3416-GA7-modF 및 pJP3416-GA7-modC에서, 엠 푸실라 Δ6-불포화효소의 2 개의 버전이 존재하였으며 상이한 프로모터들에 의해서 발현되었다. 상기 암호화 서열은 상이한 코돈 사용, 및 따라서 상이한 뉴클레오티드 서열을 가져, 잠재적인 침묵화 또는 공-억제 효과를 감소시켰지만, 동일한 단백질을 생성시켰다.
실시예 6. 체세포 배에서 종자-특이성 구조물의 활성
종자-특이성 프로모터의 조절 하에서 종자 중 유전자 구조물의 발현을 예견하는 고속 분석 시스템을 확립시키기 위해서, 체세포 배 시스템을 브라시카 나푸스에 대해 구성하였다. 상기 시스템은 체세포 배발생의 개시에 관련된 LEC2 전사 인자를 발현하는 벡터를 사용하였다. 증명으로서, 2원 벡터 35S:LEC2 및 pJP107(Petrie et al., 2010a and b)를 표준 일렉트로포레이션을 통해 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시키고 상기 아그로박테리움 형질전환체를 공-배양에 의해 브라시카 나푸스의 공-형질전환에 사용하였다. 상기 pJP107의 T-DNA 영역은 아이소크리시스 갈바나 Δ9-신장효소, 피 살리나 Δ8-불포화효소 및 피 살리나 Δ5-불포화효소를 암호화하는 유전자들을 함유하였으며, 이때 각각의 유전자는 종자-특이성 프로모터에 의해 발현되었다. 대조용 형질전환은 35S:LEC2 벡터만을 사용하였다. 35S:LEC2 발현은 실시예 1에 개시된 바와 같이 형질전환된 비 나푸스 캘러스 조직으로부터 직접 조직 배양물에 체세포 배를 생성시켰다.
지방산 분석은 상기 구조물 pJP107의 T-DNA상의 종자-특이성 유전자가 상기 공-형질전환된 LEC2 유전자의 존재 하에서 트랜스제닉 체세포 배에서 발현되고 LA로부터 ARA(20:4Δ5,8,11,14) 및 ALA로부터 EPA(20:5Δ5,8,11,14,17)를 생성시키는 작용을 함을 입증하였다. 상기 3 개의 공-형질전환된 체세포 배에 대한 데이터를 표 18에 나타내며 각각의 지방산 조성을, pJP107(Petrie et al., 2010a and b)의 T-DNA에 대해 트랜스제닉이고 이를 발현하는 브라시카 나푸스 종자로부터의 종자유의 지방산 조성과 비교하였다. 유사한 ARA의 전체 백분율 및 중간 지방산 EDA(20:2ω6) 및 DGLA(20:3ω6)뿐만 아니라 전환 효율이, 안정하게-형질전환된 종자 프로파일과 비교시 체세포 배 조직에서 관찰되었다. 유사한 결과가 안정한 T2 트랜스제닉 종자 및 체세포 배의 지방산 조성물에서 관찰되었다: ω6 지방산은 각각 26.6% 및 25.6%(평균)의 수준인 반면, ARA 수준은 각각 9.7% 및 10.6%(평균)인 것으로 밝혀졌다.
35S:LEC2를 단독으로 도입시키고 체세포 배를 시간 과정으로 분석했을 때, 상기 지방산 프로파일은 역으로 관련된 방식으로 18:3Δ9,12,15 감소 및 18:1Δ9 증가를 갖는 보다 배-유사 프로파일로 변하는 것으로 밝혀졌다(도 8). 이러한 결과는 상기 체세포 배가 실제로 특성상 종자-유사하게 되고 pJP107로부터 T-DNA상의 유전자가 발현됨을 나타내었다. 이는, 상기 체세포 배 시스템이 트랜스제닉 식물을 생성시키는 전체 과정, 및 이로부터의 성숙한 종자의 필요 없이, 비 나푸스에서 트랜스제닉 종자-특이성 구조물의 신속한 특성화를 허용함을 입증하였다.
대조용 형질전환되지 않은(WT) 및 pJP107로 형질전환된 T2 종자에 비해, 35S:LEC2에 의한 pJP107의 공-형질전환에 의해 생성된 브라시카 나푸스 체세포 배로부터 수득된 지질의 지방산 조성. 개별적인 효소 전환 효율을 적합한 효소 단계 후에 괄호안에 나타낸다. D9-Elo는 Δ9-신장효소이다. D8-Des는 Δ8-불포화효소이고 D5-Des는 Δ5-불포화효소이다.
WT T2 pJP107 트랜스제닉 종자 LEC2:#45 LEC2:#57 LEC2:#58
18:1 ?9 57.2 45.7 3.8 2.5 1.9
18:2 ?9,12 19.1 8.7 10 10.6 10
18:3 ?9,12, 15 10.2 4.1 22.5 27.5 24.2
20:2 ?11,14 7.1 ± 1.9 (67% D9-elo) 5.2
(61.8% D9-elo) 		3.7
(56.7% D9-elo) 4.6
(61.8% D9-elo)
20:3 ?8,11,14 1.1 ± 0.2 (60% D8-des) 0.4
(67% D8-des)		 0.2
(73% D8-des)		 0.4
(73% D8-des)
20:4 ?5,8,11,14 9.7 ± 0.9 (90% D5-des) 10.6
(98% D5-des) 		10
(96% D5-des) 		11.2
(97% D5-des)
20:3 ?11,14,17 4.0 ± 0.8 9.9 5.5 7.3
20:4 ?8,11,14,17 0.3 ± 0.1 0.4 0.3 0.4
20:5 ?5,8,11,14,17 2.4 ± 0.2 7.6 6.4 7.9
신규 합계 24.6 34.1 26.1 31.8
체세포 배를 생성시키는 것과 동일한 시스템을 사용하여, 브라시카 나푸스 세포를 pJP3416-GA7-modB 및 pJP3416-GA7-modD로 별도로 형질전환시켰다. modB에 대해 18 개 및 modD에 대해 24 개의, 42 개의 배를 수득하였다. 전체 지질을 상기 배로부터 추출하고 지방산 조성에 대해 분석하였다. 상기 배는 0% 내지 16.9%의 DHA를 함유하였다(표 19). 0% DHA의 결과는 오직 부분적인 T-DNA의 통합 또는 상기 게놈의 전사 침묵 영역내로의 삽입에 기인하는 것으로 추정되었다. 전체 ω3 FA(ALA 포함) 대 전체 ω6 FA(LA 포함) 비는 배 #270에 대해 2.3 및 배 #284에 대해 11.96인 것으로 밝혀졌다. 전체 ω6 FA(LA 포함) 대 전체 ω3 FA(ALA 포함) 비는 #284에 대해 0.08이었다. 신규 ω6 FA(LA 제외) 대 신규 ω3 FA(ALA 제외) 비는 #284에 대해 0.03이었다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: (배 #270, #284에 대해) OA 에서 EPA = 14.0%, 29.8%; OA 에서 DHA = 9.7%, 24.2%; LA 에서 EPA = 15.4%, 30.7%; LA 에서 DHA = 10.7%, 25.0%; ALA 에서 EPA = 22.1%, 33.3%; ALA 에서 DHA = 15.3%, 27.0%. 이들 효율은 T3 pJP3416-GA7 아라비도프시스 라인에 대해 관찰된 경우보다 #284의 경우에 대해 유사하거나 또는 #284의 경우에서보다 더 컸으며, 이는 상기 pJP3416-GA7-modB 벡터가 비 나푸스 세포에서 잘 작용할 수 있음을 가리켰다. 상기 SDA 수준은 3.0% 이하였으며, 이는 상기 Δ6-신장효소가 상기 GA7 구조물보다 훨씬 잘 수행되고 있음을 가리켰다. #284에서 성취된 개별적인 효소 효율은 Δ12-불포화효소, 97.4%; Δ3-불포화효소, 92.3%; Δ6-불포화효소, 38.2%; Δ6-신장효소, 88.2%; Δ5-불포화효소, 98.8%; Δ5-신장효소, 94.1%; 및 Δ4-불포화효소, 86.3%이었다. 전체 포화물은 21.2%이었고, 전체 단일불포화물은 10.2%이었으며, 전체 다중불포화물은 68.6%이었다.
본 발명자들은 상기가 하기에 개시되는 추가의 데이터를 제외하고, 지금까지 비 나푸스 세포에서 성취된 최고 수준의 DHA이라고 생각한다. 이는 또한 pJP3416-GA7에 비해 pJP3416-GA7-modB에서의 변형이 상기 Δ6-불포화효소 유전자의 발현 수준을 증가시키는데 유효함을 입증하였다. 상술한 바와 같은 2원 벡터들 pJP3416-GA7, pJP3416-GA7-modA, pJP3416-GA7-modC, pJP3416-GA7-modD, pJP3416-GA7-modE 및 pJP3416-GA7-modF은 35S:LEC2로 공-형질전환되어 형질전환된 비 나푸스 체세포 배를 생성시킨다. 7.0% 이하의 DHA가 modD 배에서 관찰되었고, modE 배에서 9.9%, modF 배에서 8.3% 및 소수의 modG 배에서 3.6%가 관찰되었다.
종자-특이성 DHA 산 구조물 pJP3416-GA7-modB를 35S:LEC2, 및 #286 및 #289(pJP3416-GA7-modD)로 공-형질전환시킴으로써 생성된 브라시카 나푸스 체세포 배 #270 및 #284로부터의 오일의 지방산 조성.
#270 #284 #286 #289
14:0 0.3 0.2 0.2 0.2
16:0 14.0 15.7 17.2 16.6
16:1d9 0.7 0.4 0.8 0.8
16:3 0.5 0.6 1.1 1.3
18:0 2.6 2.4 2.5 2.5
18:1d9 6.6 1.8 1.5 1.1
18:1d11 6.3 6.8 6.5 6.7
18:2 18.9 4.5 10.0 9.8
18:3w6 0.7 0.8 0.3 0.3
18:3w3 33.0 37.2 42.0 41.5
20:0 0.9 0.9 0.8 0.8
18:4w3 1.9 2.8 3.6 4.5
20:1d11 0.2 0.1 0.1 0.1
20:2w6 0.1 0.1 0.1 0.2
20:3w3 0.5 0.0 0.5 0.6
22:0 0.8 1.5 0.6 0.7
20:4w3 0.2 0.9 0.7 0.7
20:5w3 0.7 0.2 0.3 0.3
22:2w6 0.0 1.2 0.0 0.0
22:3w3 0.0 0.1 0.0 0.1
24:0 0.8 1.0 1.0 1.0
24:1 0.8 1.0 0.7 0.9
22:5w3 2.4 2.7 3.2 3.0
22:6w3 7.0 16.9 6.1 6.4
실시예 7. DHA를 생성시키는 트랜스제닉 에이 탈리아나 종자로부터의 TAG의 분석
형질전환된 에이 탈리아나 종자로부터의 TAG 상의 DHA의 위치 분포를 NMR에 의해 측정하였다. 전체 지질을, 먼저 헥산 하에서 파쇄시킨 후에 상기 파쇄된 종자를 10 ㎖ 헥산을 함유하는 유리 튜브로 옮김으로써 대략 200 ㎎의 종자로부터 추출하였다. 상기 튜브를 수욕에서 대략 55 ℃에서 가온하고 이어서 와동시키고 원심분리시켰다. 상기 헥산 용액을 제거하고 상기 과정을 추가의 4 x 10 ㎖로 반복하였다. 상기 추출물들을 합하고, 회전 증발에 의해 농축시키고 상기 추출된 지질 중의 TAG를, 20 ㎖의 헥산 중 7% 다이에틸 에테르를 사용하여 짧은 실리카 컬럼에 통과시킴으로써 극성 지질로부터 정제시켰다. 상기 정제된 TAG상의 아실기 위치 분포를 앞서 개시된 바와 같이(Petrie et al., 2010a and b) 정량적으로 측정하였다.
상기 분석은 전체 종자유 중 DHA의 대부분이 TAG의 sn-1/3 위치에 위치하였으며 이때 sn-2 위치에서는 거의 발견되지 않음을 보였다(도 9). 이는 ARA 생성 종자(ARA(20:4Δ5,8,11,14)의 50%가 트랜스제닉 캐놀라 오일의 sn-2 위치에 위치한 반면 단지 33%만이 무작위 분포로 예상되는 것으로 나타났다(Petrie et al., 2012))로부터의 TAG와 대조적이었다.
pJP3416-GA7 또는 pJP3115 및 pJP3116의 조합으로 형질전환된 비 나푸스 종자로부터의 TAG 중 DHA의 위치 분포를 본질적으로 동일한 방법에 의해 측정한다.
트랜스제닉 에이 탈리아나로부터의 전체 지질을 또한 3 중 4극자 LC-MS에 의해 분석하여 주요 DHA-함유 트라이아실글리세롤(TAG) 종을 측정하였다(도 10). 가장 풍부한 DHA-함유 TAG 종은 DHA-18:3-18:3(TAG 58:12; 명명법은 위치 분포를 묘사하지 않는다)인 것으로 밝혀졌으며, 두 번째-가장 풍부한 것은 DHA-18:3-18:2(TAG 58:11)이다. 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)가, 낮은 수준이지만 검출 가능한 수준으로 전체 종자유에서 관찰되었다. 다른 주요 DHA-함유 TAG 종은 DHA-34:3 (TAG 56:9), DHA-36:3 (TAG 58:9), DHA-36:4 (TAG 58:10), DHA-36:7 (TAG 58:13) 및 DHA-38:4 (TAG 60:10)를 포함하였다. 상기 2 개의 주요 DHA-함유 TAG의 정체를 Q-TOF MS/MS에 의해 추가로 확인하였다.
실시예 8. 비 나푸스 종자에서 DHA 생성의 예견
상기 GA7 유전자 구조물을 사용하여 15% 수준으로 아라비도프시스 종자에서 DHA를 효율적으로 생성시킴이 실시예 2에서 입증되었다. 같은 구조물이 브라시카 나푸스 종자에서 다수(전부는 아님)의 형질전환체 중 단지 약 1.5%의 DHA만을 생성시켰으며, 이는 주로 상기 종에서 GA7의 Δ6-불포화효소 유전자의 불충분한 발현에 기인하였다(실시예 4). 상기 GA7 구조물에 대한 변형이 상기 Δ6-불포화효소 유전자 발현 문제를 극복할 것이라는 이해를 근거로(실시예 5 참조, 실시예 6에 입증된 바와 같이), 계산을 수행하여 pJP3416-GA7의 변이체로부터 유전자를 발현하는 비 나푸스 트랜스제닉 종자의 있음직한 지방산 프로파일을 계산하였으며, 이때 각각의 트랜스유전자-암호화된 효소는 GA7 구조물에 의해 에이 탈리아나에서 관찰된 만큼 효율적으로 수행되었다. 3 개의 계산(#1, #2, #3)에 대해 예견된 지방산 조성을 표 20에 나타낸다. 이는 59% 올레산, 20% LA 및 8% ALA를 포함하는 비 나푸스에 대한 야생형(형질전환되지 않은) 지방산 조성을 근거하였다. 상기 표의 하부 절반에 나타낸 3 개의 예견된 부분적인 지방산 프로파일은 상기 표의 상부 절반에 나타낸 각 효소 단계에 대한 전환 효율에 근거하였다. 예견 #2에서, 75% 효율의 Δ12-불포화, 75%의 Δ15-불포화, 35%의 Δ6-불포화, 80%의 Δ6-신장, 90%의 Δ5-불포화, 90%의 Δ5-신장 및 90%의 Δ4-불포화의 조합은 전형적인 캐놀라 트랜스제닉 종자에서 대략 10% DHA를 생성시킬 것이다. 상기 효율들은 모두 아라비도프시스에서 나타난 개별적인 효율들 이하였으며, 따라서 예견 #2는 보존적인 평가를 나타내었다. #3에 나열된 전환 효율들은 pJP3416-GA7로 형질전환된 에이 탈리아나에서 나타난 효율적인 전환에 근거한 근사치였다. DHA가 비 나푸스 종자에서 생성된 종자유 중 전체 지방산 함량의 약 15%로 생성되는 것으로 예견되었으며, 이 결과는 에이 탈리아나에서 관찰된 가장 효율적인 생성 수준을 반영하였다. 상기 동형접합성 상태에서 다수의 T-DNA의 삽입은 DHA 수준을 비 나푸스에서 20%로 상승시킬 것으로 예상된다.
트랜스제닉 아라비도프시스에서 관찰된 효소적 효율에 근거한, DHA 경로 구조물로 형질전환된 브라시카 나푸스로부터의 종자유 중 전체 지방산 함량의 백분율로서 선택된 지방산에 대해 예견된 지방산 조성. 상기 효소들을 올레산으로부터 DHA를 생성시키기 위한 경로에서의 순으로 나열한다. 예견된 지방산 조성물 #1, #2 및 #3은 표의 상부 절반의 효율들에 근거한다.
효소 #1 #2 #3
d12-des 70% 75% 80%
d15-des 70% 75% 80%
d6-des (w3) 30% 35% 40%
d6-elo 80% 80% 90%
d5-des 80% 90% 90%
d5-elo 80% 90% 90%
d4-des 80% 90% 90%
지방산 WT #1 #2 #3
18:1d9 59% 26% 22% 18%
18:2w6 20% 19% 17% 14%
18:3w6 1% 2% 3%
18:3w3 8% 30% 32% 34%
18:4w3 3% 3% 2%
20:4w3 2% 1% 2%
20:5w3 2% 1% 2%
22:5w3 1% 1% 2%
22:6w3 5% 10% 15%
실시예 9. 식물 잎에서 트랜스제닉 EPA 경로의 안정한 발현
2원 벡터 제작
2원 벡터, pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert(서열번호 8)을 잎 조직 중 EPA의 합성을 위해 식물에 T-DNA의 도입을 위해 설계하였다. 상기 벡터는, 각각 CaMV 35S 및 에이 탈리아나 루비스코 작은 서브유닛(SSU) 프로모터의 조절 하에서 하기의 효소를 암호화하는 키메릭 유전자들을 함유하였다: 엠 푸실라 Δ6-불포화효소(서열번호 16), 피 코르다타 Δ6-신장효소(서열번호 25) 및 피 푸실라 Δ5-불포화효소(서열번호 30)(도 9). 상기 2원 벡터를, 서열번호 2의 영역 199-10878을 합성하고 이를 수용 2원 벡터 pORE04(Coutu et al., 1997)에 BsiWI 및 KasI 부위에서 클로닝시킴으로써 제작하였다. 상기 효소들을 암호화하는 3 개의 지방산 생합성 유전자가, ALA, 18:3Δ9,12,15을 EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17로 전환시키는데 필요하였다.
엔 벤타미아나 잎 세포에서 EPA 구조물의 일시적인 발현
상기 구조물이 바르고 잎 조직에서 상기 유전자들을 효율적으로 발현하는지를 시험하기 위해서, 상기 키메릭 벡터 pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert을 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 상기 키메릭 벡터 35S:p19를 또한 실시예 1에 개시된 바와 같이 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 이들의 배양물로부터의 세포를 24 ℃ 생육실에서 니코티아나 벤타미아나 식물의 잎 조직에 침윤시켰다. 다수의 직접 비교물을 같은 잎의 어느 한 면에 위치한 비교 샘플로 침윤시켰다. 실험을 3회 중복하여 수행하였다. 침윤에 이어서, 상기 식물들을 추가로 5일 동안 증식시킨 후에 잎 원반을, 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC에 의해 지방산 프로파일 분석을 위해 취하였다. GC 분석은, 상기 EPA 벡터가 니코티아나 벤타미아나 잎에서 EPA를 생성시키는 작용을 하며(표 21), EPA의 최고 수준은 전체 잎 지질의 10.7%임을 나타내었다.
니코티아나 타바쿰 안정성 형질전환
상기 키메릭 벡터 pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert을 사용하여 니코티아나 타바쿰을 안정하게 형질전환시켰다. 상기 벡터를 표준 일렉트로포레이션 과정을 통해 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시켰다. 상기 형질전환된 세포를 가나마이신(50 ㎎/L) 및 리팜피신(25 ㎎/L)이 보충된 고체 LB 배지상에서 증식시키고 28 ℃에서 2 일 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 사용하여 새로운 배양을 개시시켰다. 48 시간 활발한 배양에 이어서, 상기 세포를 2,000 x g에서 원심분리에 의해 수집하고 상등액을 제거하였다. 상기 세포를 50% LB 및 50% MS 배지를 함유하는 신선한 용액 중에 OD600 = 0.5의 밀도로 재현탁하였다.
각각의 실험으로부터 최고의 EPA 수준을 갖는 트랜스제닉 니코티아나 벤타미아나(일시적인) 및 니코티아나 타바쿰(안정한 1차 형질전환체) 사건으로부터의 전체 잎 지질의 지방산 조성.
엔 벤타미아나 엔 타바쿰
14:0 0.1 0.1
16:0 18.5 17.8
16:1w13t 2.2 3.8
16:1d9 0.1 0
16:3 6.2 5.7
18:0 3.4 3.2
18:1d11 0.3 0.3
20:0 0.5 0.5
22:0 0.2 0.3
24:0 0.1 0.4
18:1 2.9 1.6
18:2w6 12.6 14.5
오메가-6 18:3w6 2.3 2.9
20:2w6 0.0 0.0
20:3w6 0.1 0.0
20:4w6 0.3 0.7
오메가-3 18:3w3 37.1 32.4
18:4w3 1.6 1.9
20:3w3 0.1 0.3
20:4w3 0.3 1.1
20:5w3 10.7 12.1
22:5w3 0.3 0.4
시험관내에서 생육된 엔 타바쿰 품종 W38의 잎 샘플을 절제하고 예리한 칼로 대략 0.5 내지 1 ㎠ 크기의 사각형 조각으로 절단하였으며 이를 에이 튜메파시엔스 용액에 침지시켰다. 에이 튜메파시엔스 중에 잠긴 상처난 엔 타바쿰 잎 조각을 10 분 동안 실온에서 정치시킨 후에 멸균 여과지상에 블럿팅하고 건조시키고 보충제가 없는 MS 플레이트상으로 옮겼다. 24 ℃에서 2일의 공-배양 기간에 이어서, 상기 외식체를 멸균 액체 MS 배지로 3 회 세척하고, 이어서 멸균 여과지상에 블럿팅하고 건조시키고, 1.0 ㎎/L 벤질아미노퓨린(BAP), 0.25 ㎎/L 인돌아세트산(IAA), 50 ㎎/L 가나마이신 및 250 ㎎/L 세포탁심이 보충된 선택성 MS 아가상에 놓았다. 상기 플레이트를 24 ℃에서 2 주 동안 배양하여 상기 형질전환된 엔 타바쿰 잎 조각으로부터 발아를 허용하였다.
시험관내에서 뿌리를 내린 트랜스제닉 식물을 확립시키기 위해서, 건강한 새싹을 절단하고 25 ㎍/L IAA, 50 ㎎/L 가나마이신 및 250 ㎎/L 세포탁심이 보충된 MS 아가 배지를 함유하는 200 ㎖ 조직 배양 용기로 옮겼다. 트랜스제닉 싹을 토양으로 옮긴 후 뿌리를 내리고 온실에서 성숙기로 증식시켰다. 충분히 큰 잎 원반을 21 개의 성숙한 트랜스제닉 식물로부터 취하고 실시예 1에 개시된 바와 같이 지방산 프로파일에 대해 분석하였다. 모든 트랜스제닉 샘플은 EPA를 함유하는 것으로 밝혀졌으며(표 21), 이때 반접합성 1차 형질전환체 중의 EPA의 최고 수준은 전체 잎 지질의 12.1%인 것으로 밝혀졌다. 상기 잎 샘플은 또한 그의 지질 중에 소량(<0.5%)의 DPA를 함유하였으며, 이는 Δ6-신장효소의 낮은 수준의 Δ5-신장 활성에 의한 상기 EPA의 신장으로부터 생성되었다. 전체 ω3 FA(ALA 포함) 대 전체 ω6 FA(LA 포함) 비는 2.7인 것으로 밝혀졌다. 전체 전환 효율은 하기인 것으로 계산되었다: OA에서 EPA = 18.4%, LA에서 EPA = 18.9%, ALA에서 EPA = 25.9%. 12.1% EPA의 생성은 특히 상기 사건들이 반접합성 1차 형질전환체들이었기 때문에 현저하다. 상기 ALA에서 EPA로의 효율은 특히 안정한 종자 형질전환체에서 관찰된 경우에 가깝다. 상기 구조물이 OA 및 LA의 ALA로의 전환을 증가시키기 위해 Δ12 또는 Δ15-불포화효소를 함유하지 않았음은 주목할만하다. 증가된 효율은 이들 활성의 첨가에 의해 예상될 수 있다.
반접합성 형질전환체로부터 종자가 수확 중이며 파종되어 동종접합성 식물을 생성 중에 있다.
상위 EPA 라인에 놓인 종자는 정상적으로 보였으며, 라인 #10 및 #17로부터의 종자가 잘 발아되어 T2 세대를 확립시켰다. EPA 대 빈(EPA 없음) 라인의 비는 사건 #28이 단일 자리이고 따라서 상기 라인의 T3 세대가 또한 확립되었음을 나타내었다. 상기 T3 집단의 지방산 프로파일 분석은, 상기 트랜스유전자들이 동형접합성이며, 이때 빈 사건은 발견되지 않았고 안정량의 EPA를 가짐을 나타내었다. 상기 전체 T3 집단에서 전체 잎 지질 중 EPA의 평균량은 9.4%±0.3인 것으로 밝혀졌다(표 22).
야생형(WT) 및 독립적인 트랜스제닉 또는 일시적으로-형질전환된 라인(EPA)으로부터의 전체 잎 지질의 전형적인 지방산 프로파일. 종들은 니코티아나 벤타미아나(일시적인 형질전환), 엔 타바쿰(안정하게 형질전환된 T3 집단), 비그나 운구이쿨라타(Vigna unguiculata)(안정하게 형질전환된 T1 사건)이다. 오차는 다수의 샘플들의 표준 편차를 나타낸다. 기부에 나타낸 겉보기 전환 효율은 ω3 경로를 개시하며 생성물 FA의 합/기질 + 생성물 FA의 합으로서 계산된다.
Figure 112020060294603-pat00038
동형접합성 T3 엔 타바쿰 식물의 잎 샘플에 대해 추가의 생화학적 분석을 수행하였다. 전체 지질을 동결건조된 잎 물질로부터 추출하고 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분별하였다. EPA가 엔 타바쿰 TAG 중에 30.1% 이하로 존재할뿐만 아니라 극성 지질 중에 6.3%로 존재하는 것으로 밝혀졌다(표 23). 흥미롭게도 상기 트랜스제닉 경로에 의해 생성된 EPA가 TAG, MGDG, DGDG, SQDG, PG, PC, PE, PI 및 PS를 포함하여 평가된 지질 분획들 모두에 존재함이 주목되었다. 모든 지질 풀은 낮은 수준의 신규 중간체 또는 ω6 LC-PUFA 지방산을 함유하였으며 이때 신규 ω3 대 ω6 지방산의 TAG 비는 10:1이었다.
동부의 안정한 형질전환
키메릭 벡터 pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert을 하기와 같이 동부(비그나 운구이쿨라타)에 형질전환시켰다. 성숙한 마른 종자가 바람직한 출발 물질이지만 최대로 신선한 종자 중량의 미숙한 꼬투리로부터 수확한 종자를 또한 사용할 수 있다. 마른 종자를 손으로 타작하여 종자피가 깨지는 것을 피하고 따라서 미생물에 의한 오염을 감소시킨다.
마른 종자 또는 미숙한 꼬투리를 70% 에탄올 중에 2분간 잠기게 하고 이어서 20% 상업적인 표백제(8.4 g/L의 나트륨 하이포클로라이트 최종 농도)에서 30 분간 처리한다. 이어서 상기 종자를 멸균수로 수회 세척한다. 성숙한 종자를 밤새 흡수팽윤시키는 반면 미숙한 종자는 무균적으로 제거한다. 2 개의 상이한 외식체, 즉 배축 및 떡잎 자체, 바람직하게는 양분된 배축이 부착된 떡잎을 수회의 싹 생산에 사용할 수 있다. 상기 싹 및 뿌리 끝을 상기 축으로부터 제거한 후에 떡잎 마디, 즉 상기 떡잎에 대한 상기 축의 부착점에 상처를 낸다. 19 개의 품종 및 라인의 초기 비교로부터, 이제 대부분의 라인의 동부를 형질전환시킬 수 있음이 분명하며, 유일한 제지는 상이한 조직 배양 조건을 각 라인에 대해 최적화할 필요가 있다는 것이다.
트랜스제닉 니코티아나 타바쿰 잎 샘플로부터 어린 및 성숙한(어린│성숙한) 잎 지질 분획들 트라이아실글리세롤(TAG), 전체 극성 지질(PL), 모노갈락토실다이아실글리세롤(MGDG), 다이갈락토실다이아실글리세롤(DGDG), 설포퀴노보실다이아실글리세롤(SQDG), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 포스파티딜세린(PS)의 분석. 오차는 다수의 샘플들의 표준 편차를 나타낸다. 30% 이하의 EPA가 잎 TAG 중에서 관찰되었으며, EPA는 또한 극성 지질 전체를 통해 분포되었다. 어린 잎과 성숙한 잎의 프로파일들간의 차이가 또한 다수의 지방산들에 대해서 관찰되었다.
Figure 112020060294603-pat00039
선택성 마커 유전자, bar 또는 NptII를 형질전환에 사용할 수 있다. 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1이 동부 형질전환에 바람직한 균주이다. pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_insert 벡터를 함유하는 아그로박테리움을 28 ℃에서 180 rpm의 진탕기상에서 밤새 배양하고 현탁액을 8000 g에서 10 분간 원심분리시키고 배지 1(1/10로 희석되고 30 g/l 슈크로스, 20 mM 2-MES를 함유하고 오토클레이브처리전에 pH 5.6으로 조절되고, 필터 멸균된 MS-비타민, 100 ㎎/l 마이오이노시톨, 1.7 ㎎/l BAP, 0.25 ㎎/l GA3, 0.2 mM 아세토시링온, 250 ㎎/l Na-티오설페이트, 150 ㎎/l 다이티오쓰레이톨 및 0.4 g/l L-시스테인이 보충된 MS-기본 배지)중에 재현탁시킨다. 상기 외식체를, 작은 칼로 분열부에 상처를 낸 다음 1 시간 동안 상기 세균 현탁액 중에 진탕없이 잠기게 한다. 이어서 상기 처리된 외식체를 멸균 여과지상에 블럿팅하고 여과지가 덮인 고화된 배지 2(0.8% 아가를 함유하는 배지 1)로 옮긴다. 4일의 공-배양후, 외색체를 싹 개시 및 형질전환된 싹의 선택을 위해 배지 3(100 ㎎/l 마이오이노시톨, 150 ㎎/l 티멘틴, 30 g/L 슈크로스, 3 mM MES, 1.7 ㎎/l BAP, 5 ㎎/l PPT 또는 25 내지 50 ㎎/l 제네티신 또는 150 ㎎/l 가나마이신, 0.8 g/L 아가가 보충되고 pH 5.6으로 조절된, 완전 농도 MS 배지)로 옮긴다. 2주 후에 첫 번째 싹이 보인다. 상기 떡잎을 상기 떡잎 마디 영역으로부터 제거하고 배양물을 새로운 배지 3으로 옮긴다. 배양물을 죽거나 죽어가는 조직의 제거에 이어서 매 3주마다 새로운 배지 3으로 옮긴다. 첫 번째 4 개의 계대배양물을 가나마이신 선택 하에 두고 이어서 제네티신 및 가나마이신으로 교번한다. 6 회의 계대배양 후에, 생존하는 새싹을 싹 신장을 위해 배지 4(BAP는 없지만 0.5 ㎎/l GA3, 50 ㎎/l 아스파라진, 0.1 ㎎/l 3-인돌아세트산(IAA), 150 ㎎/l 티멘틴, 및 PPT(10 ㎎/l), 제네티신(50 ㎎/l) 및 가나마이신(150 ㎎/l) 중 어느 하나가 보충된 배지 3)로 옮긴다. 상기 싹을 단일 싹이 1 ㎝를 초과하는 길이로 될 때까지 매 2 주 동안 계대배양한다. 이들 보다 큰 싹을, 선택하의 추가적인 생육을 위해서 페트리 디쉬로부터 배양 용기(80 ㎜ 높이)로 옮긴다.
상기 다시 발생된 싹의 대부분은 시험관내에서 뿌리를 내릴 수 있으며, 상기 뿌리 내린 식물을 토양으로 옮기고 14 내지 21일 동안 다습한 챔버에서 확립시킨 후에 주변 온실 조건으로 옮긴다.
동부로의 유전자 전달을 증대시키기 위해서, 공-배양 배지에 티올 화합물을 보충한다. L-시스테인, 다이티오쓰레이톨, 및 나트륨 티오설페이트의 첨가는 상처난 조직의 갈변을 감소시킨다.
다수의 동부 외식체를 간단한 프로토콜로 처리할 수 있다. 요컨대, 상기 프로토콜은 하기의 단계들로 이루어진다: 멸균된 성숙한 종자를 수중에서 밤새 흡수팽윤시키고, 상기의 결과로서 상기 종자를 종방향으로 양분하여 외식체를 얻고, 상기 분할된 배축(싹 및 뿌리 끝이 제거된)은 여전히 떡잎에 부착되어 있으며, 상기 분열부의 국소적인 상처에 의해 아그로박테리움 균주 AGL1에 의한 감염을 돕고, 티올 화합물을 함유하는 배지상에서 4일에 걸쳐 25 ℃에서 빛의 존재 하에서 공-배양하고, 선택제를 함유하는 배지상에서 싹 개시 및 신장시키고, 싹이 시험관내에서 뿌리를 내리고, 이를 개화 및 종자 결실을 위해 온실 조건으로 옮기고, 추정적인 트랜스제닉 식물을 PCR 또는 효소 분석하고, PCR 또는 효소 활성에 의해 다음 세대 자손을 선별한다.
상기 트랜스제닉 T0 식물의 자손은 표현형상 정상이다. 상기 트랜스유전자는 상기 자손에 유전되며 동형접합성 T2 식물은 효소 활성에 대한 그의 T3 자손의 선별 또는 PCR에 의해서 확인된다.
상기 형질전환 시스템을 사용하여 1000 개의 외식체당 약 10 개의 트랜스제닉 식물이 생산되며, 이는 다른 콩류에 대한 형질전환 빈도와 유사하다. 상기 형질전환되는 품종 또는 라인에 따라, 상기 프로토콜은 외식체 제조에서부터 수확된 T1 종자까지 5 내지 8 개월이 필요하다.
상기 형질전환 시스템을 사용하여 상기 pORE04+11ABGBEC-동부-EPA-insert 2원 벡터를 상기 재생된, 형질전환된 동부 식물에 도입시킨다.
Δ5-신장효소 및 Δ4-불포화효소를 암호화하는 유전자를 가하는, 상기 pORE04+11ABGBEC-동부-EPA-insert 2원 벡터에 대한 변형을 수행하여, 생성된 EPA를 DHA로 추가로 전환시키는 능력을 부여하는 유전자 구조물을 제공한다. 상기 구조물을 식물 조직 중 DHA의 생산을 위해 식물내로 형질전환시킨다.
EPA는 화학적 선택을 견디는 소수의 사건들에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 최고의 라인은 전체 잎 지질 중 7.1%±0.2 EPA를 함유하였다. 상기 형질전환율은 동부가 대개 경험하는 경우(단지 6 개의 라인만이 트랜스제닉인 것으로 입증된다)보다 더 낮았다. 아직까지, 이러한 효과를 야기하는 것은 알려지지 않고 있지만, 흥미롭게도 통상적인 비율보다 많은 트랜스제닉 사건들이 불완전한 T-DNA 영역을 함유하는 것이 주목된다. 큰 구조물 크기가, 상기 감소된 효율에 기여하는 것도 가능하다. 상기 3 개의 트랜스제닉 효소 각각의 겉보기 전환 효율이 또한 계산되었다(표 22). 결과는 3 개의 종 모두에서 대략 유사하였으며, 이때 고유 ALA의 초기 Δ6 불포화 후 EPA로의 전환은 양호하였다. EPA에서 DPA로의 일부 Δ5-신장이 특정한 Δ5-신장효소의 부재에도 불구하고 주목되었다. 앞서 피 코르다타 Δ6-신장효소가 낮은 수준의 Δ9-신장효소 활성(즉 18:3Δ9,12,15에서 20:3Δ11,14,17로의 전환)을 갖는 것으로 나타났지만 효모 분석에서 Δ5-신장효소 활성은 검출되지 않았다.
실시예 10. Δ12-불포화효소 유전자의 변화 시험
2원 벡터 제작
일련의 키메릭 Δ12-불포화효소 유전자를 시험하고 비교하고자, 에이 탈리아나 및 비 나푸스를 형질전환시키기 위해서 사용되는 다수의 2원 벡터들을 제조하였다. 2원 벡터들 pJP3365, pJP3366, pJP3367, pJP3368 및 pJP3369는 각각 피 파스토리스 ω3-불포화효소(서열번호 12) 및 엠 푸실라 Δ6-불포화효소(서열번호 16) 효소, 및 일련의 Δ12-불포화효소들 중 하나를 암호화하는 유전자들을 함유하였다. 상기 Δ12-불포화효소들은 유전자 활성을 증가시키고자(pJP3366에서) L151M 돌연변이를 함유한 크립토코커스 네오포르만스 Δ12-불포화효소의 한 버전인 크립토코커스 네오포르만스(pJP3365 중 수탁번호 XP_570226), 라칸세아 클루이베리(pJP3367 중 서열번호 10), 시네코시스티스 PCC6803(pJP3368 중 수탁번호 BAA18169) 및 크렙시스 팔라에스티나(pJP3369 중 수탁번호 CAA76157, Lee et al. 1998)로부터 유래하였다. 상기 크렙시스 불포화효소는 상기 시리즈 중 유일한 식물 불포화효소이며; 다른 것들은 진균 효소들이었다. 상기 벡터를, 야생형인 크렙시스 팔레스티나 Δ12-불포화효소를 제외하고, 식물 코돈-최적화된 단백질 암호화 영역을, 각각 Δ12-불포화효소의 경우 벡터 pJP3364(도 12 참조)의 NotI 부위에, 각각의 불포화효소의 종자-특이성 발현을 제공하기 위해 FP1 프로모터에 작동적으로 연결되는 배향으로 삽입함으로써 제조하였다. 상기 벡터 pJP3364는 이미 상기 피 파스토리스 ω3-불포화효소 및 엠 푸실라 Δ6-불포화효소를 암호화하는 키메릭 유전자를 함유하였으며, 이들은 각각 종자-특이성 프로모터의 조절 하에 있었다(도 12). 상기 3 개의 지방산 생합성 효소들, 즉 Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 및 Δ6-불포화효소의 조합을, 올레산(18:1Δ9)에서 SDA(18:4Δ6,9,12,15)로의 전환을 위한 경로를 조립하도록 설계하였다. 따라서 분석을 형질전환된 종자 중 SDA 생성 수준을 측정하기 위해서 수행하였다.
에이 탈리아나 및 비 나푸스 형질전환 및 분석
키메릭 2원 벡터를 에이 튜메파시엔스 균주 AGL1에 도입시키고 상기 형질전환된 아그로박테리움의 배양물로부터의 세포를 형질전환을 위한 플로랄 침지 방법(Clough and Bent, 1998)을 사용하여 fad2 돌연변이 에이 탈리아나 식물을 형질전환시키는데 사용하였다. 성숙화후에, 상기 처리된 식물로부터 T1 종자를 수확하고 각각의 키메릭 벡터의 T-DNA 상에 존재하는 NptII 선택성 마커 유전자를 갖는 묘목의 선택을 위해 가나마이신 함유 MS 플레이트상에 도말하였다. 생존 T1 묘종을 토양으로 옮겼다. 상기 식물을 자가-수분하도록 두고 성숙기로 증식시킨 후에, 상기 식물로부터 T2 종자를 수확하고 종자 지질의 지방산 조성을 GC에 의해 분석하였다.
키메릭 벡터 pJP3367을 또한 실시예 4에 개시된 방법에 의해 비 나푸스를 형질전환시키는데 사용하여 12 개의 트랜스제닉 사건을 생성시켰다. SDA가 상기 수집된 식물의 종자에서 0.6% 내지 2.2%의 범위인 것으로 밝혀졌으며, 최고의 SDA 트랜스제닉 식물을 갖는 트랜스제닉 식물로부터 9 개의 개별적인 종자를 지방산 조성에 대해 분석하였다. 상기와 같은 분석으로부터의 지방산 조성 데이터를 표 24에 나타낸다.
상기 데이터는 에이 탈리아나 및 비 나푸스 모두 중의 T-DNA 각각으로부터 발현된 Δ12-불포화효소 활성이 뜻밖에도 낮으며, 이는 GA7 구조물에서 동일한 발현 카세트에 의해 나타나는 70 내지 80%보다 오히려 약 20%의 효소 전환 효율을 제공함을 보였다. 상기 벡터로부터의 이러한 비교적 불량한 Δ12-불포화효소 유전자 발현의 이유는 불명확하지만, 전체적으로 상기 구조물 중 상기 유전자들의 위치와 관련될 수도 있다.
대조적으로, RT-PCR 발현 분석은 T-DNA 상의 피 파스토리스 ω3-불포화효소 및 엠 푸실라 Δ6-불포화효소 유전자가 상기 형질전환된 종자에서 비교적 잘 발현됨을 입증하였다. 표 24는 상기 형질전환된 종자에서 Δ6-불포화효소 전환 효율을 포함하며, 그 범위는 하나의 비 나푸스 형질전환된 종자에서 약 11% 내지 약 25%의 범위였다. 이는 상기 GA7 구조물로 형질전환된 비 나푸스 종자에서 나타난 약 7%의 Δ6-불포화효소 전환 효율(실시예 4)보다 상당히 더 컸다.
pJP3367로부터의 T-DNA로 형질전환된 T1 브라시카 나푸스 식물로부터의 단일 종자의 종자유 중 전체 지방산의 백분율로서 지방산 조성. SDA(18:4ω3)를 진하게 나타낸다.
샘플 CT110-3#1 CT110-3#2 CT110-3#3 CT110-3#4 CT110-3#5 CT110-3#6 CT110-3#7 CT110-3#8 CT110-3#9
C14:0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
C16:0 4.3 4.2 4.1 4.5 3.8 4.3 4.0 5.0 4.7
16:1d7 0.1 0.1 0.1 0.1 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1
C16:1d9 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3
16:3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
C18:0 1.9 1.9 1.3 1.8 2.1 1.8 2.4 3.1 2.2
C18:1 58.1 59.4 55.5 59.1 62.1 56.0 57.2 52.0 53.2
C18:1d11 3.5 3.6 3.0 3.2 2.9 3.6 3.2 4.4 3.5
C18:2 18.4 17.1 19.2 17.3 17.4 18.7 19.0 20.3 20.2
C18:3w6 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3
C18:3w3 8.2 9.0 11.1 8.6 7.5 10.2 9.8 9.3 9.8
C20:0 0.5 0.5 0.4 0.5 0.6 0.5 0.6 0.7 0.6
18:4w3 2.4 2.0 2.8 2.5 1.4 2.6 1.3 2.4 3.2
C20:1d11 1.1 1.1 1.2 1.2 1.2 1.1 1.2 1.1 1.1
20:1iso 0.03 0.03 0.03 0.03 0.01 0.03 0.02 0.03 0.02
C20:2w6 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
C22:0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2
C24:0 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.3 0.2
C24:1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
△6-des % 22.9 17.9 20.3 22.8 15.8 20.2 11.7 20.9 24.9
따라서, pJP3367로부터의 T-DNA에 의해 부여된 보다 높은 Δ6-불포화효소 전환 효율을 이용하기 위해서, 상기 T-DNA로 형질전환된 비 나푸스 식물을 pJP3416-GA7로부터의 T-DNA로 형질전환된 식물(실시예 4)과 교배하여 상기 두 T-DNA를 모두 갖는 자손 식물 및 종자를 생성시켰다. F1 종자로부터 추출된 오일의 지방산 조성을 DHA 함량 및 다른 지방산 함량에 대해 GC에 의해 분석하였다. 증가된 DHA 수준이 상기 Δ6-불포화효소의 증가된 발현의 결과로서 관찰된다. 상기 두 T-DNA 모두에 대해 동형접합성인 식물이 생산되고 보다 높은 수준의 DHA를 생성시킬 것이다.
실시예 11. 침묵화 억제인자 단백질의 사용에 의한 지방산 축적의 증가
2원 벡터 제작
WO 2010/057246은 식물 종자에서 트랜스유전자 발현을 증가시키기 위한 침묵화 억제인자 단백질(SSP)의 용도를 개시한다. 상기와 같은 단백질의 사용이 여러 세대에 걸쳐 유지종자 중 LC-PUFA의 생산을 증대시키고 안정화시킬 수 있음을 입증하기 위해서, 다수의 SSP, 즉 V2(수탁번호 GU178820.1), p19(수탁번호 AJ288943.1), p38(수탁번호 DQ286869.1) 및 P0PE(수탁번호 L04573.1)를 시험을 위해 선택하였다. p19는 동종 RNA의 아고너트-유도된 절단을 유도하기 전에 21 개의 뉴클레오티드 길이 siRNA에 결합하는 토마토 덤불성장위축 바이러스(TBSV)로부터의 억제인자 단백질이다(Voinnet et al., 2003). 토마토 황색잎 말림 바이러스(TYLCV)로부터의 억제인자 단백질인 V2는 식물 단백질 SGS3(Glick et al., 2008)(ssRNA 기질로부터 이중 가닥 RNA 중간체의 생산에 필요한 것으로 생각되는 단백질)(Beclin et al.., 2002)에 결합하거나, 또는 5' 돌출부를 갖는 dsRNA 구조물에 결합한다(Fukunaga et al., 2009). p38은, 다이서 및 아고너트 단백질에 결합함으로써 식물 침묵화 기전을 방해하는 터닙 크링클 바이러스(Turnip Crinkle Virus)(TCV)로부터의 억제인자 단백질이다(Azevedo et al., 2010). 폴레로바이러스로부터의 P0 단백질, 예를 들어 P0PE 및 RPV-P0는 증대된 분해를 위해 아고너트 단백질을 표적화한다(Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007, Fusaro et al., 2012). 따라서 유전자 구조물들을 하기와 같이 LA(18:1Δ9,12)로부터 ARA(20:4Δ5,8,11,14)의 생성을 위한 지방산 생합성 유전자 세트와 함께 식물 종자에서 상기 SSP의 발현을 위해 제조하였다.
아이소크리시스 갈바나 Δ9-신장효소 및 파블로바 살리나 Δ8- 및 Δ5-불포화효소를 암호화하는 지방산 생합성 유전자 및 세균 선택 마커를, 9560 bp 단편을 생성시키는 PmeI 및 AvrII에 의한 절단에 의해 pJP3010으로부터 단일의 DNA 단편상에서 수득하였다. 상기 단편상의 Δ9-신장효소 암호화 영역을 에이 탈리아나 FAE1 프로모터(pAtFAE1) 및 콘리닌 전사 종결/폴리아데닐화 영역(LuCnl2-3')에 결합시켰다. 상기 불포화효소 암호화 영역을 각각 절두된 나핀 FP1 프로모터(pBnFP1) 및 nos3' 전사 종결/폴리아데닐화 영역에 결합시켰다. 상기 단편상의 3 개의 지방산 생합성 유전자들은 pJP107(Petrie et al., 2012)에서와 동일한 방식으로 배향되고 이격되었으며 pJP107과 동일한 단백질을 암호화하였다. 상기 DNA 단편은 또한 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 pCW141로부터의 pFP1:GFiP:nos3' 유전자를 포함하였다(WO 2010/057246 참조). 상기 선별가능한 마커 유전자를 가시적인 종자-특이성 마커로서 사용하여, 간단하고 비-파괴적인 식별 및 이에 의해 상기 유전자를 포함하고 발현하는 트랜스제닉 종자의 선택을 허용하였다.
상기 PmeI-AvrII 단편을 일련의 5 개의 벡터 각각의 PmeI-AvrII 부위에 삽입하여(상기 벡터들은 각각 상이한 SSP 유전자를 함유하였다(WO2010/057246)), apFN045, pFN046, pFN047, pFN048 및 pFN049라 표시된 유전자 구조물을 생성시켰다. 이들은 각각 SSPs P0PE, p38, p19, 35S:V2 및 V2를 암호화하는 유전자들을 포함한다. 상기 SSP 유전자들은 각각, 구조물 pFN048(이때 V2 암호화 영역은 구성적 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 있다)을 제외하고, FP1 프로모터 및 ocs3' 전사 종결자/폴리아데닐화 영역의 조절 하에 있었다. 각각의 경우에 SSP 유전자는 상기 T-DNA의 우측 경계(RB)에 인접하여, 상기 구조물의 T-DNA 영역내에 있었다. 여섯 번째 구조물, pFN050(임의의 SSP 암호화 서열이 없다)을, pFN045를 AhdI 및 NheI로 절단한 다음 DNA 리가제에 의한 재환화에 의해 FP1:P0PE 유전자를 결실시킴으로써 제조하였다. 상기 6 개의 구조물들은 각각 상기 T-DNA내에 NptII 선택성 마커 유전자를 포함하였으며 T-DNA의 좌측 경계에 인접하였다. 상기 구조물들은 모두 아그로박테리움 중에서 상기 플라스미드의 유지를 위해 RK2 복제 기원을 가졌다.
SSP와 함께 ARA 발현 벡터에 의한 에이 탈리아나의 형질전환
종자 지질 중 높은 리놀레산 수준을 갖는 fad2/fae1 이중 돌연변이체인, 아라비도프시스의 유전자형 MC49를 형질전환시키기 위해서, 식물들을 6 개의 구조물 pFN045-pFN050 각각에 의해 별도로 형질전환된 에이 튜메파시엔스 균주 GV3101로 플로랄 침지 방법(Clough and Bent, 1998)에 의해 처리하였다. 상기 처리된 식물을 성숙기로 증식시키고 이로부터 수확된 T1 종자를, 형질전환된 T1 식물을 선택하기 위해서 가나마이신을 함유하는 MS 배지상에 도말하였다. 상기 종자 중 GFP 발현에 대한 선별을 또한 형질전환된 T1 종자에 대한 가시적 마커로서 사용하였다. MS/Kan 플레이트상에서 생존하거나 GFP-양성 종자로부터 수득된 묘종을 토양으로 옮기고 T2 종자에 대해 성숙기로 증식시켰다. 상기 수득된 형질전환된 식물의 수는 pFN045, pFN046, pFN047, pFN048, pFN049 및 pFN050 각각에 의한 형질전환에 대해 5, 14, 32, 8, 23 및 24였다. 이 단계에서 pFN046 중 p38을 암호화하는 유전자는 작용성이 아닌 것으로 밝혀졌으며 따라서 벡터 pFN046으로 형질전환된 식물을 추가적인 대조군으로서, 즉 pFN050에 관하여 본질적으로 동일한 것으로서 간주하였다.
대략 100 개의 수집된 T2 종자를, FAME 제조 및 GC 분석에 의한 종자 지질의 지방산 조성 측정을 위해 각각의 형질전환된 식물로부터 취하였다. 각각의 트랜스제닉 라인으로부터 6 개의 T2 묘종을 또한 증식시켜 T3 종자를 생성시켰다.
상기 T2 종자로부터 추출된 전체 지질 중 지방산 조성을 GC를 사용하여 측정하였다. 상기 분석은 상기 T2 집단 중 ARA 및 중간체 EDA(20:2ω6) 및 DGLA(20:3ω6)의 일련의 수준을 나타내었다. ARA에 대한 데이터를 도 13 및 14에 나타낸다.
도 13은 상기 T2 종자의 집단 중 지질 중의 ARA 수준에 대한 박스-플롯을 나타낸다. 상기 ARA 생합성 유전자 외에 FP1:p19 및 35S:V2 유전자를 함유하는 종자의 집단 중 ARA의 중간(50번째 백분위수) 수준은 결함성 FP1:p38 유전자 또는 SSP 유전자를 함유하지 않는 pFP050으로부터의 대조용 T-DNA를 함유하는 종자에서보다 현저하게 더 높은 것이 분명하였다. p19 및 V2를 암호화하는 유전자들로 형질전환된 종자에 대한 평균 ARA 수준은 p38 유전자 또는 SSP가 없는 것으로 형질전환된 종자들의 경우보다 더 컸다(도 14). 하나의 FP1:p19 및 2 개의 FP1:V2 라인은 각각 약 19%, 20% 및 23% ARA를 나타내었다. 이들은 이상치이며 따라서 상기 박스-플롯 분석을 위한 계산에 포함되지 않았다. 유전자 FP1:P0PE 및 35S:V2를 포함하는 T-DNA로 형질전환된 보다 적은 식물들이 다른 구조물들에 비해 생존하였으며; 이들 유전자는 MC49 배경에서 식물 건강에 유해할 수 있는 것으로 생각된다.
상기 구조물들 중에서 ARA 수준은 현저하게 상이할뿐만 아니라, LA에서 ARA로의 경로의 첫 번째 중간체, 즉 EDA(20:2ω6)의 종자 지질 중 수준이, SSP가 없거나 또는 p38 구조물을 함유하는 종자에서보다 V2 또는 p19를 발현하는 라인에서 더 낮은 것으로 관찰되었다(도 15). T3 종자에서, p19를 발현하는 구조물을 함유하는 하나의 집단은 상기 종자 지질 중 전체 지방산의 백분율로서 38% ARA를 나타내었다.
일련의 트랜스제닉 T3 라인들이 T4 세대로 진행하였다. V2를 발현하는 T4 종자에서 ARA의 수준은 선행 세대에 비해 동일하거나 또는 실제로 그의 T3 부모에 비해 증가된 수준을 나타내었다(도 16). p19를 발현하는 라인은 보다 변화된 ARA 수준을 나타내었다. 상기 ARA 수준은 일부 라인에서 감소한 반면 다른 것들에서는 상기 T3 부모에 비해 동일하거나 증가되었다. 대조적으로, 상기 결함성 p38 유전자를 함유하거나 SSP가 없는 라인들은 일반적으로 ARA 수준의 감퇴 및 중간체 수준의 증가를 나타내었다(도 18). 이들 라인 중 일부에서, ARA는 약 1%로 감소하고 EDA의 수준은 약 20%로 증가하였다. T4 종자에서 ARA의 평균 수준은 p38을 발현하거나 SSP가 없는 라인에 비해 p19 및 V2를 발현하는 라인의 경우 더 높았다(도 17).
이 실험은 트랜스제닉 식물의 종자 중 SSP의 발현이 LC-PUFA 생합성 경로에 대한 추가적인 유전자들과 함께 첫 번째 자손 세대에서 목적하는 지방산의 생성 수준을 증가시켰을 뿐만 아니라, 나중의 세대들, 예를 들어 세 번째 또는 네 번째 자손 세대에서 상기 지방산 생성 수준을 안정화시켰음을 보였다. 상기 증가된 지방산 생성은 상기 생합성 경로에서 중간 지방산의 감소된 수준을 동반하였다. 종자-특이성 프로모터로부터 발현된 SSP의 p19 및 V2가 바람직하였다. 상기 p38 SSP를 발현하도록 설계된 구조물은 결함성이었으며 상기 구조물에 의해 유용한 데이터를 획득하지 못했다. 다른 바이러스로부터의 V2 SSP 및 그의 동족체들이, 상기 생합성 경로 유전자의 최대 발현을 허용하고 발생 종자 중 동일 세포에서 다른 유전자의 동시적인 침묵화를 허용하기 때문에 특히 바람직한 것으로 생각된다.
실시예 12. 오일 중 스테롤 함량 및 조성의 분석
오스트레일리아의 상업적인 공급원으로부터 구입한 12 개 식물성 오일 샘플로부터의 피토스테롤을 실시예 1에 개시된 바와 같이 GC 및 GC-MS 분석에 의해 O-트라이메틸실릴 에테르(OTMSi-에테르) 유도체로서 특성화하였다. 스테롤은 체류 데이터, 질량 스펙트럼의 해석 및 문헌 및 실험 표준 질량 스펙트럼 데이터와의 비교에 의해 확인되었다. 상기 스테롤을 5β(H)-콜란(Cholan)-24-올 표준의 사용에 의해 정량분석하였다. 상기 확인된 스테롤 중 일부의 기본적인 피토스테롤 구조 및 화학 구조를 도 19 및 표 25에 나타낸다.
상기 분석된 식물성 오일은 하기로부터였다: 참깨(세사뮴 인디쿰(Sesamum indicum)), 올리브(올레아 에우로파에(Olea europaea)), 해바라기꽃(헬리안투스 안누스(Helianthus annus)), 아주까리(리시누스 코뮤니스(Ricinus communis)), 카놀라(브라시카 나푸스(Brassica napus)), 잇꽃(카르타무스 팅크토리우스(Carthamus tinctorius)), 땅콩(아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 아마(리늄 유시타티슘(Linum usitatissimum)) 및 대두(글리시네 맥스(Glycine max)). 상대적인 풍부성이 감소함에 있어서, 상기 오일 샘플 전체에 걸쳐, 주요 피토스테롤은 β-시토스테롤(범위 전체 스테롤 함량의 28 내지 55%), Δ5-아베나스테롤(아이소퓨코스테롤)(3 내지 24%), 캄페스테롤(2 내지 33%), 5-스티그마스테롤(0.7 내지 18%), Δ7-스티그마스테롤(1 내지 18%) 및 Δ7-아베나스테롤(0.1 내지 5%)이었다. 다수의 다른 소량 스테롤들이 확인되었으며, 이들은 콜레스테롤, 브라시카스테롤, 칼리나스테롤, 캄페스타놀 및 에부리콜이었다. 4 개의 C29:2 및 2 개의 C30:2 스테롤이 또한 검출되었으나, 이들 소량 성분의 확인을 완료하기 위해서는 추가의 연구가 필요하다. 또한, 다수의 다른 확인되지 않은 스테롤들이 상기 오일 중 일부에 존재하였으나, 이들의 매우 낮은 풍부성으로 인해, 질량 스펙트럼은 이들 구조의 확인이 가능할 정도로 충분히 강하지 못했다.
오일의 ㎎/g으로서 표현되는 감소하는 스테롤 함량은 카놀라 오일(6.8 ㎎/g), 참깨 오일(5.8 ㎎/g), 아마 오일(4.8 내지 5.2 ㎎/g), 해바라기 오일(3.7 내지 4.1 ㎎/g), 땅콩 오일(3.2 ㎎/g), 잇꽃 오일(3.0 ㎎/g), 대두 오일(3.0 ㎎/g), 올리브 오일(2.4 ㎎/g), 피마자 오일(1.9 ㎎/g)이었다. 상기 스테롤 조성% 및 총 스테롤 함량을 표 26에 나타낸다.
확인된 스테롤들의 IUPAC/체계명
스테롤 번호 일반명(들) IUPAC/체계명
1 콜레스테롤 콜레스트-5-엔-3β-올
2 브라시카스테롤 24-메틸콜레스타-5,22E-다이엔-3β-올
3 칼리나스테롤/24-메틸렌 콜레스테롤 24-메틸콜레스타-5,24(28)E-다이엔-3β-올
4 캄페스테롤/24-메틸콜레스테롤 24-메틸콜레스트-5-엔-3β-올
5 캄페스타놀/24-메틸콜레스테롤 24-메틸콜레스탄-3β-올
7 Δ5-스티그마스테롤 24-에틸콜레스타-5,22E-다이엔-3β-올
9 에르고스트-7-엔-3β-올 24-메틸콜레스트-7-엔-3β-올
11 에부리콜 4,4,14-트라이메틸에르고스타-8,24(28)-다이엔-3β-올
12 β-시토스테롤/24-에틸콜레스테롤 24-에틸콜레스트-5-엔-3β-올
13 Δ5-아베나스테롤/아이소퓨코스테롤 24-에틸콜레스타-5,24(28)Z-다이엔-3β-올
19 Δ7-스티그마스테롤/스티그마스트-7-엔-3b-올 24-에틸콜레스트-7-엔-3β-올
20 Δ7-아베나스테롤 24-에틸콜레스타 7,24(28)-다이엔-3β-올
상기 모든 시드 오일 샘플들 중에서, 주요 피토스테롤은 일반적으로 β-시토스테롤(범위 전체 스테롤 함량의 30 내지 57%)이었다. 상기 오일 중에서 광범위한 다른 주요 스테롤들이 존재하였다: 캄페스테롤(2 내지 17%), Δ5-스티그마스테롤(0.7 내지 18%), Δ5-아베나스테롤(4 내지 23%), Δ7-스티그마스테롤(1 내지 18%). 상이한 종들로부터의 오일은 상이한 스테롤 프로파일을 가졌으며, 일부는 매우 독특한 프로파일을 가졌다. 캐놀라 오일은 최고 비율의 캄페스테롤(33.6%)을 가진 반면, 다른 종 샘플들은 일반적으로 보다 낮은 수준, 예를 들어 땅콩 오일에서 17% 이하를 가졌다. 잇꽃 오일은 비교적 높은 비율의 Δ7-스티그마스테롤(18%)을 가진 반면, 상기 스테롤은 대개 다른 종 오일에서, 해바라기 오일에서 9% 이하로 낮았다. 따라서 스테롤 프로파일은 각각의 종들에 대해 독특하였기 때문에, 특정 식물성 또는 식물 오일의 확인을 돕고 다른 오일의 진정성 또는 섞임을 검사하는데 사용될 수 있다.
분석된 식물 오일의 스테롤 함량 및 조성
스테롤 번호* 스테롤 일반명 참깨 올
리
브 		해바라기 해바라기 아주까리 캐놀라 잇꽃 잇꽃 땅콩 아마
(아마인) 		아마
(아마인) 		대
두
　 　 　 　 저온-압축 　 　 　 저온-압축 　 　 　
1 콜레스테롤 0.2 0.8 0.2 0.0 0.1 0.3 0.2 0.1 0.2 0.4 0.4 0.2
2 브라시카스테롤 0.1 0.0 0.0 0.0 0.3 0.1 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.0
3 칼리나스테롤 /24-메틸렌 콜레스테롤 1.5 0.1 0.3 0.1 1.1 2.4 0.2 0.1 0.9 1.5 1.4 0.8
4 캄페스테롤 /24-메틸콜레스테롤 16.2 2.4 7.4 7.9 8.4 33.6 12.1 8.5 17.4 15.7 14.4 16.9
5 캄페스타놀 /24-메틸콜레스타놀 0.7 0.3 0.3 0.1 0.9 0.2 0.8 0.8 0.3 0.2 0.2 0.7
6 C29:2* 0.0 0.0 0.1 0.2 0.0 0.1 0.5 0.5 0.0 1.2 1.3 0.1
7 D5-스티그마스테롤 6.4 1.2 7.4 7.2 18.6 0.7 7.0 4.6 6.9 5.1 5.8 17.6
8 미지의 것 0.5 1.3 0.7 0.6 0.8 0.7 0.7 1.3 0.4 0.7 0.6 1.3
9 에르고스트-7-엔-3b-올 0.1 0.1 1.9 1.8 0.2 0.4 2.7 4.0 1.4 1.4 1.4 1.0
10 미지의 것 0.0 1.3 0.9 0.8 1.2 0.9 1.8 0.7 1.2 0.7 0.5 0.7
11 에부리콜 1.6 1.8 4.1 4.4 1.5 1.0 1.9 2.9 1.2 3.5 3.3 0.9
12 b-시토스테롤 / 24-에틸콜레스테롤 55.3 45.6 43.9 43.6 37.7 50.8 40.2 35.1 57.2 29.9 28.4 40.2
13 D5-아베나스테롤 / 아이소퓨코스테롤 8.6 16.9 7.2 4.1 19.3 4.4 7.3 6.3 5.3 23.0 24.2 3.3
14 트라이터페노이드 알콜 0.0 2.4 0.9 1.1 0.0 0.0 1.6 1.9 0.0 0.0 0.0 0.9
15 트라이터페노이드 알콜 0.0 0.0 0.7 0.6 0.0 0.0 2.8 1.8 0.0 0.0 0.3 0.0
16 C29:2* 0.0 0.5 0.7 0.7 1.5 1.2 2.8 1.9 2.0 1.0 0.7 0.5
17 C29:2* 1.0 0.9 2.3 2.4 0.6 0.4 1.3 1.9 0.9 1.0 1.0 1.0
18 C30:2* 0.0 0.0 0.0 0.0 1.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
19 D7-스티그마스테롤 / 스티그마스트-7-엔-3b-올 2.2 7.1 9.3 10.9 2.3 0.9 10.5 18.3 1.1 7.9 8.7 5.6
20 D7-아베나스테롤 1.3 0.1 4.0 3.6 0.6 0.2 2.0 4.7 0.7 0.4 0.4 0.6
21 미지의
것		 0.7 7.1 0.9 0.8 0.0 0.4 0.3 0.4 0.0 3.0 3.6 0.0
22 미지의
것		 0.3 0.0 0.3 0.9 0.0 0.0 1.2 1.3 0.2 0.1 0.0 0.3
23 미지의
것		 0.2 0.2 0.3 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 0.2 0.1 0.2 0.5
24 미지의
것		 0.0 3.1 0.9 1.3 0.6 0.4 0.2 0.4 0.7 1.7 1.9 0.8
25 미지의
것		 0.9 0.4 0.3 0.5 0.3 0.1 0.5 0.7 0.3 0.1 0.1 0.6
26 C30:2 2.2 6.0 4.6 5.7 1.4 0.6 1.0 1.2 1.2 1.2 1.1 5.2
27 미지의
것		 0.0 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.1 0.2 0.3 0.1 0.0 0.3
합계 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
전체
스테롤 (mg/g 오일)		 5.8 2.4 4.1 3.7 1.9 6.8 3.2 3.0 3.2 4.8 5.2 3.0
C29:2* 및 C30:2*는 각각 2 개의 이중 결합을 갖는 C29 스테롤 및 2 개의 이중 결합을 갖는 C30 스테롤을 나타낸다.
해바라기 및 잇꽃의 2 개 샘플들을 각각 비교하였으며, 각각의 경우에 하나는 시드의 저온 압착에 의해 생성되고 정제되지 않은 반면, 다른 것은 저온-압착되지 않고 정제되었다. 약간의 차이가 관찰되었지만, 상기 두 오일 공급원들은 유사한 스테롤 조성 및 총 스테롤 함량을 가졌으며, 이는 처리 및 정제가 이들 두 매개변수에 거의 영향을 미치지 않음을 암시한다. 상기 샘플들 가운데 스테롤 함량은 1.9 ㎎/g 내지 6.8 ㎎/g의 범위로 3배까지 다양하였다. 캐놀라 오일은 최고의 스테롤 함량을, 아주까리 오일은 최저의 스테롤 함량을 가졌다.
실시예 13. sn-2 TAG 위치에서 DHA의 축적의 증가
본 발명자들은 TAG의 sn-2 위치에서 DHA 축적을, 1-아실-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(LPAAT)를 상기 GA7 구조물 또는 그의 변이체에 의해 부여된 바와 같은 DHA 생합성 경로와 함께 공-발현시킴으로써 증가시킬 수 있음을 고려하였다. 바람직한 LPAAT는, 내인성 LPAAT에 비해, 기질로서 다중불포화 C22 지방 아실-CoA 상에서 작용하여 LPA의 sn-2 위치에서 상기 다중불포화 C22 쇄의 증가된 삽입을 생성시켜 PA를 형성시킬 수 있는 것들이다. 세포질 LPAAT 효소는 종종, 특히 상기 종이 TAG 중의 색다른 지방산을 합성하고 축적하는 경우 변화된 기질 선호를 나타낸다. 림난테스 더글라시이(Limnanthes douglasii)로부터의 LPAAT2는, C22 기질을 사용할 수 없는 같은 종으로부터의 LPAAT1과 대조적으로, PA 합성에 대한 기질로서 에루코일-CoA(C22:1-CoA)를 사용하는 것으로 나타났다(Brown et al., 2002).
공지된 LPAAT들이 고려되었으며 다수를 시험을 위해 선택되었고, 대조군으로서, sn-2 위치에서 DHA 결합을 증가시키지 않는 것으로 예상되는 것들을 포함하였다. 공지된 LPAAT는 아라비도프시스 탈리아나 LPAAT2: (서열번호 63, 수탁번호 ABG48392, Kim et al., 2005), 림난테스 알바 LPAAT(서열번호 64, 수탁번호 AAC49185, Lassner et al., 1995), 사카로마이세스 세레비지아에 Slc1p(서열번호 65, 수탁번호 NP_010231, Zou et al., 1997), 모르티에렐라 알피나 LPAAT1(서열번호 67, 수탁번호 AED33305; 미국특허 제 7879591 호) 및 브라시카 나푸스 LPAAT(서열번호 68 및 서열번호 69, 각각 수탁번호 ADC97479 및 ADC97478)를 포함하였다. 이들을 3 개의 LPAAT 효소 그룹을 포함하도록 선택하였다: 1) 비범한 장쇄 다중불포화 지방산에 대해 전형적으로 낮은 활성을 갖는 대조용 식물 종자 LPAAT(아라비도프시스 및 브라시카 LPAAT 포함); 2. 기질로서 C22 아실-CoA를 사용하여 C22 지방산에 대해 작용하는 것으로 앞서 입증된 LPAAT(이 경우에 에루스산 C22:1)(림난테스 및 사카로마이세스 LPAAT 포함), 3. 본 발명자들이 기질로서 장쇄 불포화 지방산, 예를 들어 EPA 및 DHA를 사용할 수 있을 것처럼 생각되는 LPAAT(모르티에렐라 LPAAT 포함).
상기 아라비도프시스 LPAAT2(또한 LPAT2로 표시됨)는 C16 및 C18 기질에 대해 활성을 갖는 것으로 나타난(그러나, C20 또는 C22 기질에 대한 활성은 시험되지 않았다) 소포체-국소화된 효소이다(Kim et al., 2005). 리만테스 알바 LPAAT2는 PA의 sn-2 위치에 C22:1 아실 쇄를 삽입하는 것으로 나타났지만, 기질로서 DHA를 사용하는 능력은 시험되지 않았다(Lassner et al., 1995). 상기 선택된 에스 세레비지아에 LPAAT Slc1p는 기질로서 18:1-CoA 외에 22:1-CoA를 사용하는 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 쇄 길이에 대한 넓은 기질 특이성을 가리킨다(Zou et al., 1997). 다시, DHA-CoA 및 다른 LC-PUFA는 기질로서 시험되지 않았다. 상기 모르티에렐라 LPAAT는 앞서 트랜스제닉 야로위아 리포리티카에서 EPA 및 DHA 지방산 기질에 대한 활성을 갖는 것으로 나타났다(US 7879591).
추가적인 LPAAT들이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 마이크로모나스 푸실라는 그의 오일 중에 DHA를 생산하고 축적하는 미세조류이지만, 상기 종에서 TAG상의 DHA의 위치 분포는 확인되지 않았다. 마이크로모나스 푸실라 LPAAT(서열번호 66, 수탁번호 XP_002501997)는 BLAST 조회 서열로서 아라비도프시스 LPAAT2를 사용하는 마이크로모나스 푸실라 게놈 서열을 탐색함으로써 확인되었다. 다수의 후보 서열들이 출현하였으며 서열 XP_002501997이 C22 LC-PUFA에 대한 활성을 갖고 있음직한 LPAAT 효소로서 시험하기 위해 합성되었다. 리시누스 코뮤니스 LPAAT는 아주까리 게놈 서열에서 추정적인 LPAAT로서 주석이 달렸다(Chan et al., 2010). 상기 아주까리 게놈으로부터 4 개의 후보 LPAAT가 합성되었으며 침윤된 엔 벤타미아나 잎 조직의 조 잎 용해물에서 시험되었다. 여기에 개시된 후보 서열은 LPAAT 활성을 나타내었다.
다수의 후보 LPAAT를 계통수상의 공지된 LPAAT와 정렬시켰다(도 20). 추정적인 마이크로모나스 LPAAT는 추정적인 C22 LPAAT와 무리를 이루는 것이 아니고 분기된 서열이었다.
기질로서 DHA-CoA를 사용하는 능력에 대한 다양한 LPAAT의 초기 시험으로서, 키메릭 유전자 구조물을 엔 벤타미아나 잎 중 외인성 LPAAT의 구성적 발현을 위해 제조하며, 이들 구조물은 각각 하기와 같은 35S 프로모터의 조절 하에 있다: 35S:Arath-LPAAT2(아라비도프시스 ER LPAAT); 35S:Ricco-LPAAT2; 35S:Limal-LPAAT(림난테스 알바 LPAAT); 35S:Sacce-Slc1p(에스 세레비지아에 LPAAT); 35S:Micpu-LPAAT(마이크로모나스 푸실라 LPAAT); 35S:Moral-LPAAT1(모르티에렐라 알피나 LPAAT). 외인성 LPAAT가 없는 35S:p19 구조물은 상기 실험에서 대조군으로서 사용된다. 이들 구조물을 각각 실시예 1에 개시된 바와 같이 아그로박테리움을 통해 엔 벤타미아나 잎에 도입시키고, 침윤후 5일째에, 상기 처리된 잎 대역을 절제하고 분쇄하여 잎 용해물을 제조한다. 각각의 용해물은 외인성 LPAAT뿐만 아니라 LPA 합성을 위한 내인성 효소를 포함한다. 14C-표지된-OA, -LA 또는 -ALA(C18 기질), -ARA(C20 기질) 및 -DHA(C22)를 상기 용해물에 3 회 중복해서 별도로 가함으로써 시험관내 반응을 마련한다. 반응물들을 25 ℃에서 배양하고 PA내로의 14C 표지된 지방산의 통합 수준을 TLC에 의해 측정하였다. ARA 및 C18 지방산에 비해 DHA를 사용하는 각 LPAAT의 능력을 계산한다. 메도우폼, 모르티에렐라 및 사카로마이세스 LPAAT는 DHA 기질에 대해 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이때 방사성표지된 PA가 이들에 대해 존재하였지만, 다른 LPAAT에 대해서는 존재하지 않았다. 모든 LPAAT는 유사한 올레산 공급물에 의해 활성인 것으로 입증되었다.
종자 중 LPAAT 활성을 시험하기 위해서, 다수의 단백질 암호화 서열 또는 LPAAT를 콘리닌(pLuCnll) 프로모터의 조절 하에서 2원 벡터에 삽입한다. 이어서 각각 키메릭 유전자, Cnl1:Arath-LPAAT(음성 대조군), Cnl1:Limal-LPAAT, Cnl:Sacce-Slc1p, 및 Cnl1:Moral-LPAAT를 함유하는 생성된 유전자 구조물을 사용하여 비 나푸스 및 에이 탈리아나 식물을 형질전환시켜 종자-특이성 방식으로 상기 LPAAT를 발현하는 안정한 형질전환체를 생성시킨다. Cnl1:LPAAT 구조물을 갖는 형질전환된 식물을, 종자 중에서 DHA를 생산하는 GA7 구조물 및 그의 변이체(실시예 5)를 발현하는 식물과 교배하여 TAG의 sn-2 위치에서 DHA의 통합을 증가시킨다. 상기 구조물을 또한, 이미 상기 GA7 구조물 및 그의 변이체를 함유하는 비 나푸스, 씨 사티바 및 에이 탈리아나 식물의 형질전환에 사용하여 부모 및 LPAAT 유전자 구조물을 모두 갖는 자손을 생성시킨다. 상기 LPAAT 암호화 트랜스유전자가 없는 식물에서의 통합에 비해 TAG의 sn-2 위치에서 DHA의 증가된 통합이 예상된다. 오일 함량도 또한 상기 종자에서, 특히 보다 높은 수준의 DHA를 생성시키는 종자에서 개선되며, 이는 실시예 2에 개시된 바와 같은 아라비도프시스 종자에서 나타나는 성향과 정반대이다.
당해 분야의 숙련가들은 다수의 변화 및/또는 변형들을, 광범위하게 개시된 바와 같은 본 발명의 진의 또는 범위로부터 이탈됨 없이 특정한 실시태양에 나타낸 바와 같이 본 발명에 대해 수행할 수 있음을 알 것이다. 따라서 본 발명의 실시태양들은 모든 관점에서 예시적이고 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.
본 출원은 2012년 6월 15일자로 출원된 US 61/660,392, 2012년 6월 22일자로 출원된 US 61/663,344, 2012년 9월 6일자로 출원된 US 61/697,676, 및 2013년 3월 14일자로 출원된 US 61/782,680으로부터의 우선권을 주장하며, 이들 출원은 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명에 논의되고/되거나 참고한 모든 공보들은 이들 내용 전체가 본 발명에 인용된다.
본 출원은 2012년 6월 15일자로 출원된 US 61/660,392, 2012년 6월 22일자로 출원된 US 61/663,344 및 2012년 9월 6일자로 출원된 US 61/697,676을 본 발명에 참고로 인용한다.
본 명세서에 포함된 서류, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오직 본 발명에 대한 배경을 제공하기 위한 것이다. 이들 자료 모두가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 것으로서 종래 기술 토대의 부분을 형성하거나 본 발명과 관련된 분야의 통상적인 일반 지식임을 인정하는 것으로서 간주해서는 안 된다.
참조
Figure 112020060294603-pat00040
Figure 112020060294603-pat00041
Figure 112020060294603-pat00042
Figure 112020060294603-pat00043
<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Grain Research and Development Corporation Nuseed Pty Ltd <120> PRODUCTION OF LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACIDS IN PLANT CELLS <130> IPA141263-AU-D1 <150> US 61/660,392 <151> 2012-06-15 <150> US 61/663,344 <151> 2012-06-22 <150> US 61/697,676 <151> 2012-09-06 <150> US 61/782,680 <151> 2013-03-14 <160> 72 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJP3416-GA7 nucleotide sequence. <400> 1 tcctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga cgaacggata aaccttttca cgccctttta 60 aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt ttacccgcca atatatcctg 120 tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgctagtg gatctcccag 180 tcacgacgtt gtaaaacggg cgccccgcgg aaagcttgcg gccgcccgat ctagtaacat 240 agatgacacc gcgcgcgata atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt tttctatcgc 300 gtattaaatg tataattgcg ggactctaat cataaaaacc catctcataa ataacgtcat 360 gcattacatg ttaattatta cgtgcttaac gtaattcaac agaaattata tgataatcat 420 cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa gaaactttat tgccaaatgt ttgaacgatc 480 ggcgcgcctc attagtgagc cttctcagcc tttccgttaa cgtagtagtg ctgtcccacc 540 ttatcaaggt tagagaaagt agccttccaa gcaccgtagt aagagagcac cttgtagttg 600 agtccccact tcttagcgaa aggaacgaat cttctgctaa cctcaggctg tctgaattga 660 ggcatatcag ggaagaggtg gtggataacc tgacagttaa ggtatcccat aagccagttc 720 acgtatcctc tagaaggatc gatatcaacg gtgtgatcaa cagcgtagtt aacccaagaa 780 aggtgcttat cagatggaac aacagggagg tgagtatgag aagtagagaa gtgagcgaaa 840 aggtacatgt aagcgatcca gtttccgaaa gtgaaccacc agtaagcaac aggccaagag 900 tatccagtag caagcttgat aacagcggtt ctaacaacat gagaaacgag catccaagaa 960 gcctcttcgt agttcttctt acggagaact tgtctagggt ggagaacgta gatccagaaa 1020 gcttgaacaa gaagtccaga ggtaacagga acgaaagtcc aagcttgaag tctagcccaa 1080 gctctagaga atcctctagg tctgttatcc tcaacagcag tgttgaagaa agccacagca 1140 ggagtggtat caagatccat atcgtgtcta accttttgag gggtagcatg gtgcttgtta 1200 tgcatctggt tccacatctc accagaagta gaaagtccga atccacaagt catagcctga 1260 agtctcttgt ccacgtaaac agatccggta agagagttat gtccaccctc atgttgaacc 1320 catccacatc tagctccgaa gaaagcaccg taaacaacag aagcaatgat agggtatcca 1380 gcgtacataa gagcagttcc aagagcgaat gtagcaagaa gctcgagaag tctgtaagcc 1440 acatgggtga tagaaggctt gaagaatcca tctctctcaa gctcagcacg ccatctagcg 1500 aaatcctcaa gcataggagc atcctcagac tcagatctct tgatctcagc aggtctagaa 1560 ggcaaagctc taagcatctt ccaagccttg agagaacgca tgtggaattc tttgaaagcc 1620 tcagtagcat cagcaccagt gttagcaagc atgtagaaga tcacagatcc accagggtgc 1680 ttgaagttag tcacatcgta ctcaacgtcc tcaactctaa cccatctagt ctcgaaagta 1740 gcagcaagct catgaggctc aagagtctta agatcaacag gagcagtaga agcatcctta 1800 gcatcaagag cctcagcaga agatttagac ctggtaagtg gagatctagg agaagatctt 1860 ccatcagtct taggagggca catggtatgg taattgtaaa tgtaattgta atgttgtttg 1920 ttgtttgttg ttgttggtaa ttgttgtaaa agatcctcgt gtatgttttt aatcttgttt 1980 gtatcgatga gttttggttt gagtaaagag tgaagcggat gagttaattt ataggctata 2040 aaggagattt gcatggcgat cacgtgtaat aatgcatgca cgcatgtgat tgtatgtgtg 2100 tgctgtgaga gagaagctct taggtgtttg aagggagtga caagtggcga agaaaaacaa 2160 ttctccgcgg ctgcatgcta tgtgtaacgt gtagctaatg ttctggcatg gcatcttatg 2220 aacgattctt tttaaaaaca aggtaaaaac ttaacttcat aaaattaaaa aaaaaaacgt 2280 ttactaagtt ggtttaaaag gggatgagac tagtagattg gttggttggt ttccatgtac 2340 cagaaggctt accctattag ttgaaagttg aaactttgtt ccctactcaa ttcctagttg 2400 tgtaaatgta tgtatatgta atgtgtataa aacgtagtac ttaaatgact aggagtggtt 2460 cttgagaccg atgagagatg ggagcagaac taaagatgat gacataatta agaacgaatt 2520 tgaaaggctc ttaggtttga atcctattcg agaatgtttt tgtcaaagat agtggcgatt 2580 ttgaaccaaa gaaaacattt aaaaaatcag tatccggtta cgttcatgca aatagaaagt 2640 ggtctaggat ctgattgtaa ttttagactt aaagagtctc ttaagattca atcctggctg 2700 tgtacaaaac tacaaataat atattttaga ctatttggcc ttaactaaac ttccactcat 2760 tatttactga ggttagagaa tagacttgcg aataaacaca ttcccgagaa atactcatga 2820 tcccataatt agtcagaggg tatgccaatc agatctaaga acacacattc cctcaaattt 2880 taatgcacat gtaatcatag tttagcacaa ttcaaaaata atgtagtatt aaagacagaa 2940 atttgtagac 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gtccgcgacc tcacgggcga cagcgtggtg 300 cagctctacc aggacgtgag cccatcccct gcattcgcga acaagctctt ccggtactca 360 gcggtggcgt tccactactc aaagtacgtg gagtacatgg acacagcgtg gcttgtgctg 420 aagggcaagc ccgtctcgtt cctgcagggc ttccaccact tcggcgccgc gtgggacacc 480 tactttggca tcacgtttca gaacgagggc acctacgtct ttgtgctgct caacgcattc 540 atccacacaa tcatgtacac ctactacggc gcgacggcag cgggcatcaa aatctcgatg 600 aagccgctga tcaccctcat gcagatcacg cagttcctgc tgggcttcgc gctcgtctac 660 ccgtacattg acctcggcta cttccgtgcg tcgcccgagc tcgtgtggag ctacctgttc 720 aactatgcgt acgtactcat ggtgctcttc ctcttcatgc gcttcttcta ccacgacaac 780 tttagcaagc acaagccaat ctcgcgcatc gactccagca accgcatgaa aaccgagtag 840 <210> 50 <211> 279 <212> PRT <213> Pavlova salina <400> 50 Met Ala Thr Glu Gly Met Pro Ala Ile Thr Leu Asp Trp Leu Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Leu Lys Asp Ala Val Ile Gly Gly Glu Val Leu Tyr Phe Ser 20 25 30 Leu Gly Tyr Leu Leu Leu Glu Pro Ile Leu Lys Arg Ser Pro Phe Val 35 40 45 Asp Lys Arg Lys Gly Ala Tyr Arg Asn Gly Met Ile Ala 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acgtagcaca 660 agccgttcca ggcaaattcc tcctttatat ggcagcgttt tgcaccacgt tttgggcctg 720 gccgagagag actgcatcct ctttgatacg gatagtaact actcctctta cactcatcgg 780 gttcttgaac aagaccggaa tcgggctgat cagtcattgt ttagcattga cttggaatat 840 gttcatgacc tggagcttat tgccctgggt tactctgatg aagatgatga agatcttgat 900 aacttcttct ag 912 <210> 62 <211> 771 <212> DNA <213> Cereal yellow dwarf virus <400> 62 atgttcatcg cccaaccttg cgggcgagtt cttgtgttcg acgtcgcctc ccgcacgcca 60 tcgttcttca ctcgttatag tgttgaactc tcgctccgtg ttctagaccc attcttcacg 120 cgagcagtaa cagatttccg atacacccaa aatgaaatcg atttattttg tgtgtctctt 180 ggctttctgt tgccaattct cctcacagga gaatcttact cttggcgcgg tcacctcaac 240 ctcccccttt cttacaccga attacttgtt cgatgggggc tcgcagtggg gtacttccct 300 accttctcca ctgatggtga cattcgacag aacccagaac tccgcatcga cctgtccacc 360 atgtcaaccc gctctttcta cgagcagttc ctactcagat ataacacgag tgggttggca 420 aaagctatcg tcggacagca agagtgcttt caaagcggca tggagtcttt taaaagattc 480 ctacactacc gcctcacgtg ctttgaaagc tgccttccac gacctcgttg 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Leu Phe Ala Gly 165 170 175 Phe Pro Pro Arg Thr Met Asn His Phe Asn Pro Trp Glu Ala Met Tyr 180 185 190 Val Arg Arg Val Ala Ala Val Ile Ile Ser Leu Gly Val Leu Phe Ala 195 200 205 Phe Ala Gly Leu Tyr Ser Tyr Leu Thr Phe Val Leu Gly Phe Thr Thr 210 215 220 Met Ala Ile Tyr Tyr Phe Gly Pro Leu Phe Ile Phe Ala Thr Met Leu 225 230 235 240 Val Val Thr Thr Phe Leu His His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr 245 250 255 Ala Asp Ser Glu Trp Thr Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp 260 265 270 Arg Ser Tyr Gly Ala Leu Ile Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr 275 280 285 His Gln Ile His His Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn 290 295 300 Asp Ala Thr Ala Ala Phe Ala Lys Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys 305 310 315 320 Asn Ala Ala Pro Ile Ile Pro Thr Phe Phe Arg Met Ala Ala Met Tyr 325 330 335 Ala Lys Tyr Gly Val Val Asp Thr Asp Ala Lys Thr Phe Thr Leu Lys 340 345 350 Glu Ala Lys Ala Ala Ala Lys Thr Lys Ser Ser 355 360

Claims (39)

  1. 브라시카 나푸스(Brassica napus) 종자 또는 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 종자로부터 추출된 오일로서, 상기 오일은 하기를 포함하는 전체 지방산 함량을 포함하는, 오일:
    (a) 올레산을 포함하는 전체 단일불포화 지방산 함량,
    (b) 팔미트산, 또는 팔미트산 및 미리스트산(C14:0)을 포함하는 전체 포화지방산 함량,
    (c) 리놀레산(LA) 및 γ-리놀렌산(GLA)을 포함하는 전체 ω6 지방산 함량, 및
    (d) α-리놀렌산(ALA), 도코사헥사에노산(DHA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 전체 ω3 지방산 함량,
    여기서
    (i) EPA, DPA 및 DHA는 상기 전체 지방산 함량 중에 각각 한 수준으로 존재하고, 각각의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타나며, 이때 상기 추출된 오일 중 아라키돈산(ARA), EPA, DPA 및 DHA의 수준의 전체 합은 상기 전체 지방산 함량의 7% 내지 25%이고,
    (ii) DHA는 트라이아실글리세롤(TAG)의 형태로 에스테르화되어 있고, 여기서 TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에서 에스테르화된 것이며,
    (iii) 팔미트산은 상기 전체 지방산 함량의 2% 내지 16%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (iv) 올레산은 상기 전체 지방산 함량의 1% 내지 60%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (v) LA는 상기 전체 지방산 함량의 4% 내지 35%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (vi) GLA는 상기 전체 지방산 함량의 4% 미만의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (vii) 상기 추출된 오일의 상기 전체 포화지방산 함량은 상기 전체 지방산 함량의 4% 내지 25%이고,
    (viii) 상기 추출된 오일의 상기 전체 ω3 지방산 함량에 대한 상기 전체 ω6 지방산 함량의 비는 0.1 내지 3.0이고,
    (ix) 미리스트산의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 1% 미만이고,
    (x) 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 4% 미만이다.
  2. 브라시카 나푸스 종자, 카멜리나 사티바(Camelina sativa) 종자 또는 아라비도프시스 탈리아나 종자로부터 추출된 오일로서, 상기 오일은 하기를 포함하는 전체 지방산 함량을 포함하는, 오일:
    (a) 올레산을 포함하는 전체 단일불포화 지방산 함량,
    (b) 팔미트산, 또는 팔미트산 및 미리스트산(C14:0)을 포함하는 전체 포화지방산 함량,
    (c) 리놀레산(LA) 및 γ-리놀렌산(GLA)을 포함하는 전체 ω6 지방산 함량, 및
    (d) α-리놀렌산(ALA), 도코사헥사에노산(DHA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 전체 ω3 지방산 함량,
    여기서
    (i) EPA, DPA 및 DHA는 상기 전체 지방산 함량 중에 각각 한 수준으로 존재하고, 각각의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타나며, 이때 상기 추출된 오일 중 아라키돈산(ARA), EPA, DPA 및 DHA의 수준의 전체 합은 상기 전체 지방산 함량의 7% 내지 25%이고,
    (ii) 에이코사트라이에노산(ETrA)은 상기 전체 지방산 함량의 0.05% 내지 3%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (iii) 팔미트산은 상기 전체 지방산 함량의 2% 내지 16%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (iv) 올레산은 상기 전체 지방산 함량의 1% 내지 60%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (v) LA는 상기 전체 지방산 함량의 4% 내지 35%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (vi) GLA는 상기 전체 지방산 함량의 4% 미만의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하고,
    (vii) 상기 추출된 오일의 상기 전체 포화지방산 함량은 상기 전체 지방산 함량의 4% 내지 25%이고,
    (viii) 상기 추출된 오일의 상기 전체 ω3 지방산 함량에 대한 상기 전체 ω6 지방산 함량의 비는 0.1 내지 3.0이며,
    (ix) 미리스트산의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 1% 미만이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올레산은 상기 전체 지방산 함량의 30% 내지 60%의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하는, 오일.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, GLA는 상기 전체 지방산 함량의 2% 미만의 수준으로 상기 추출된 오일 중에 존재하는, 오일.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출된 오일의 상기 전체 포화지방산 함량은 상기 전체 지방산 함량의 6% 내지 20%인, 오일.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전체 ω3 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산 및 상기 전체 ω6 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산을 포함하는 오일로서, 여기서 상기 추출된 오일 중 상기 신규 ω3 지방산에 대한 상기 신규 ω6 지방산의 비는 0.1 내지 1인, 오일.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)을 포함하는, 오일.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 80%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하는, 오일.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, SDA, ETA, EPA, DPA 및 DHA는 상기 전체 지방산 함량 중에 각각 한 수준으로 존재하고, 각각의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타나며, 이때 SDA, ETA, EPA, DPA 및 DHA의 백분율의 합으로 나눈 ETA, EPA, DPA 및 DHA의 백분율의 합은, 백분율로 나타내며, 적어도 75%인, 오일.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, ETA, EPA, DPA 및 DHA는 상기 전체 지방산 함량 중에 각각 한 수준으로 존재하고, 각각의 수준은 상기 전체 지방산 함량의 백분율로서 나타나며, 이때 ETA, EPA, DPA 및 DHA의 백분율의 합으로 나눈 EPA, DPA 및 DHA의 백분율의 합은, 백분율로 나타내며, 70% 내지 88%인, 오일.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHA는 상기 전체 지방산 함량의 2.7% 내지 3.3%의 수준으로 존재하는, 오일.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHA는 상기 전체 지방산 함량의 3.6% 내지 4.4%의 수준으로 존재하는, 오일.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHA는 상기 전체 지방산 함량의 4.5% 내지 5.5%의 수준으로 존재하는, 오일.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHA는 상기 전체 지방산 함량의 5.4% 내지 6.6%의 수준으로 존재하는, 오일.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHA는 상기 전체 지방산 함량의 7% 내지 20%의 수준으로 존재하는, 오일.
  16. 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하는 추출된 식물 지질로서, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, 및 α-리놀렌산(ALA), 도코사헥사에노산(DHA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 7% 내지 20%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준이 2% 내지 16%이며, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준이 1% 미만인, 지질.
  17. 제16항에 있어서,
    하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는 지질:
    i) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준은 2% 내지 15%이고,
    ii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 올레산의 수준은 1% 내지 60%이고,
    iii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 리놀레산(LA)의 수준은 4% 내지 35%이고,
    iv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 γ-리놀렌산(GLA)의 수준은 4% 미만이고,
    v) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 스테아리돈산(SDA)의 수준은 4% 미만이고,
    vi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사테트라에노산(ETA)의 수준은 4% 미만이고,
    vii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사트라이에노산(ETrA)의 수준은 4% 미만이고,
    viii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 에이코사펜타에노산(EPA)의 수준은 4% 미만이고,
    ix) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 도코사펜타에노산(DPA)의 수준은 4% 미만이고,
    x) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준은 11% 내지 20%이고,
    xi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 포화 지방산의 수준은 4% 내지 25%이고,
    xii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 단일불포화 지방산의 수준은 4% 내지 35%이고,
    xiii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 다중불포화 지방산의 수준은 20% 내지 75%이고,
    xiv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산의 수준은 20% 미만이고,
    xv) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산의 수준은 10% 미만이고,
    xvi) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 전체 ω3 지방산의 수준은 40% 내지 60%이고,
    xvii) 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 신규 ω3 지방산의 수준은 9% 내지 33%이고,
    xviii) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 전체 ω6 지방산:전체 ω3 지방산의 비는 1.0 내지 3.0이고,
    xix) 상기 추출된 지질의 지방산 함량 중 신규 ω6 지방산:신규 ω3 지방산의 비는 1.0 내지 3.0이고,
    xx) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 10%의 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxi) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 15%의 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxii) 상기 지질의 지방산 조성은 적어도 17%의 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxiii) 상기 추출된 지질 중 전체 지방산은 1% 미만의 C20:1을 갖고,
    xxiv) 상기 지질의 트라이아실글리세롤(TAG) 함량은 적어도 70%이고,
    xxv) 상기 지질은 다이아실글리세롤(DAG)을 포함하고,
    xxvi) 상기 지질은 10% 미만의 유리(비-에스테르화된) 지방산 및/또는 인지질, 또는 0.5% 미만의 유리(비-에스테르화된) 지방산 및/또는 인지질을 포함하고,
    xxvii) TAG의 형태로 에스테르화된 DHA의 적어도 70%는 상기 TAG의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하고,
    xxviii) 상기 지질은 트라이-DHA TAG(TAG 66:18)를 포함한다.
  18. 제16항에 있어서, 하나 이상의 스테롤을 추가로 포함하고/하거나, 오일의 형태로 존재하며, 10 ㎎ 미만의 스테롤/오일 g, 7 ㎎ 미만의 스테롤/오일 g, 1.5 ㎎ 내지 10 ㎎의 스테롤/오일 g, 또는 1.5 ㎎ 내지 7 ㎎의 스테롤/오일 g을 포함하는, 지질.
  19. 제16항에 있어서, 상기 지질은 브라시카 속(Brassica sp.) 오일 또는 카멜리나 사티바(Camelina sativa) 오일인, 지질.
  20. 추출된 식물 지질을 생산하는 방법으로서,
    i) 지질을 포함하는 식물 부분을 수득하는 단계로서, 상기 지질이 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하며, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA) 및 γ-리놀렌산(GLA)을 포함하는 ω6 지방산, 및 α-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산(SDA), 도코사펜타에노산(DPA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜타에노산(EPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 상기 식물 부분 중 추출 가능한 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 7% 내지 20%이고, 상기 추출 가능한 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준이 2% 내지 16%이며, 상기 추출 가능한 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준이 1% 미만인 단계,
    ii) 상기 식물 부분으로부터 지질을 추출하는 단계를 포함하고,
    상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 7% 내지 20%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준이 2% 내지 16%이며, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준이 1% 미만인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 추출된 지질이 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 특징들 중 하나 이상을 갖는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 식물 부분이 Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오티드가 상기 식물 부분의 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 식물 부분이 하기의 특징들 중 하나 이상 또는 전부를 갖는 방법:
    i) 상기 Δ12-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 60%의 효율로 올레산을 리놀레산으로 전환시키고,
    ii) 상기 ω3-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 65%의 효율로 ω6 지방산을 ω3 지방산으로 전환시키고,
    iii) 상기 Δ6-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 30%의 효율로 ALA를 SDA로 전환시키고,
    iv) 상기 Δ6-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 5% 미만의 효율로 리놀레산을 γ-리놀렌산으로 전환시키고,
    v) 상기 Δ6-신장효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 60%의 효율로 SDA를 ETA로 전환시키고,
    vi) 상기 Δ5-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 60%의 효율로 ETA를 EPA로 전환시키고,
    vii) 상기 Δ5-신장효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 80%의 효율로 EPA를 DPA로 전환시키고,
    viii) 상기 Δ4-불포화효소는 상기 식물의 하나 이상의 세포에서 적어도 80%의 효율로 DPA를 DHA로 전환시키고,
    ix) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 올레산의 DHA로의 전환 효율은 적어도 10%이고,
    x) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 LA의 DHA로의 전환 효율은 적어도 15%이고,
    xi) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포에서 ALA의 DHA로의 전환 효율은 적어도 17%이고,
    xii) 상기 식물 부분의 하나 이상의 세포는 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 세포보다 적어도 15% 더 ω3 지방산을 포함하고,
    xiii) 상기 Δ6-불포화효소는 리놀레산(LA)에 비해 α-리놀렌산(AL)을 우선적으로 불포화시키고,
    xiv) 상기 Δ6-신장효소는 또한 Δ9-신장효소 활성을 갖고,
    xv) 상기 Δ12-불포화효소는 또한 Δ15-불포화효소 활성을 갖고,
    xvi) 상기 Δ6-불포화효소는 또한 Δ8-불포화효소 활성을 갖고,
    xvii) 상기 ω3-불포화효소는 또한 LA에 대한 Δ15-불포화효소 활성을 갖고,
    xviii) 상기 ω3-불포화효소는 LA 및/또는 GLA를 모두 불포화시키고,
    xix) 상기 ω3-불포화효소는 LA에 비해 GLA를 우선적으로 불포화시키고,
    xx) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 10%의 상기 식물 부분 중 올레산에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxi) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 15%의 상기 식물 부분 중 LA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxii) 상기 식물 부분 중 DHA의 수준은 적어도 17%의 상기 식물 부분 중 ALA에서 DHA로의 전환 효율을 기본으로 하고,
    xxiii) 상기 불포화효소들 중 하나 이상 또는 전부는 상응하는 아실-PC 기질보다 아실-CoA 기질에 대해 더 큰 활성을 갖고,
    xxiv) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 LA보다 ALA에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
    xxv) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
    xxvi) 상기 Δ6-불포화효소는 LA에 비해 기질로서 ALA에 대해 적어도 2배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
    xxviii) 상기 Δ6-불포화효소는 지방산 기질로서 PC의 sn-2 위치에 결합된 ALA에 대해서보다 지방산 기질로서 ALA-CoA에 대해 적어도 5배 더 큰 Δ6-불포화효소 활성을 갖고,
    xxx) 상기 Δ6-불포화효소는 ETA에 대해 검출 가능한 Δ5-불포화효소 활성을 갖지 않는다.
  24. 제22항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징들이 적용되는 방법:
    i) 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 T-DNA 분자에서 공유 결합되고, 상기 식물 부분의 세포의 게놈에 통합되며, 이때 상기 식물 부분의 세포의 게놈에 통합된 T-DNA 분자의 수가 1, 2 또는 3 개 이하이거나 또는 2 또는 3이고,
    ii) 상기 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 식물 부분의 전체 오일 함량이, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드가 없는 상응하는 식물 부분의 전체 오일 함량의 적어도 40%이고,
    iii) 상기 지질이 유지종자로부터의 오일의 형태로 존재하며, 상기 지질의 중량의 적어도 90%가 트라이아실글리세롤이고,
    iv) 상기 지질을, 전체 지방산 함량의 백분율로서 DHA의 수준을 증가시키도록 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
  25. 하기 효소들의 세트 중 하나를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포로서:
    i) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    ii) ω3-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    iii) Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    iv) Δ12-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    v) ω3-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    vi) Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소,
    vii) Δ12-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소, 또는
    viii) Δ12-불포화효소, ω3-불포화효소 또는 Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소;
    각각의 폴리뉴클레오티드가 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결되며, 상기 세포는 제1항, 제2항 또는 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지질을 포함하는, 숙주세포.
  26. 제25항의 세포를 포함하는, 트랜스제닉 식물.
  27. a) 종자 내에 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하는 지질, 및
    b) i) Δ12-불포화효소, 진균 ω3-불포화효소 및/또는 진균 Δ15-불포화효소, Δ6-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ6-신장효소 및 Δ5-신장효소, 또는
    ii) Δ12-불포화효소, 진균 ω3-불포화효소 및/또는 진균 Δ15-불포화효소, Δ8-불포화효소, Δ5-불포화효소, Δ4-불포화효소, Δ9-신장효소 및 Δ5-신장효소
    의 효소 세트 중 하나를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 유지종자 식물로서,
    각각의 폴리뉴클레오티드가 상기 식물의 발생 종자에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 종자-특이성 프로모터에 작동적으로 연결되고, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA) 및 γ-리놀렌산(GLA)을 포함하는 ω6 지방산, 및 α-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산(SDA), 도코사펜타에노산(DPA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜타에노산(EPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 상기 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 7% 내지 20%, 상기 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준이 2% 내지 16%이며, 상기 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준이 1% 미만인, 식물.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징들이 적용되는, 식물:
    i) 상기 식물은 캐놀라, 글리시네 맥스, 카멜리나 사티바 또는 아라비도프시스 탈리아나 식물이고,
    ii) 상기 불포화효소들 중 하나 이상이 아실-CoA 기질을 사용할 수 있고,
    iii) 식물의 성숙한, 수확된 종자가 종자 그램당 적어도 28 ㎎의 DHA 함량을 갖는다.
  29. 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 식물 부분:
    i) 제1항, 제2항 또는 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지질 또는 오일을 포함하거나,
    ii) 제20항의 방법에 사용될 수 있다,
  30. 제29항에 있어서, 상기 식물 부분은 종자인, 식물 부분.
  31. 종자의 생산 방법으로서,
    a) 제30항의 종자를 생산하는 식물을 재배하는 단계, 및
    b) 상기 식물 또는 식물들로부터 종자를 수확하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 종자로부터 지질을 추출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  33. 제30항의 종자로부터 수득되는 종자박(seedmeal).
  34. 제1항, 제2항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 지질 또는 오일 중 하나 이상을 적어도 하나의 다른 식품 성분과 혼합함을 포함하는, 식료품의 제조 방법.
  35. 제33항의 종자박을 적어도 하나의 다른 식품 성분과 혼합함을 포함하는, 식료품의 제조 방법.
  36. PUFA로부터 이익을 얻는 병태의 치료 또는 예방을 위한, 제1항, 제2항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 지질 또는 오일.
  37. PUFA로부터 이익을 얻는 병태의 치료 또는 예방을 위한, 제25항의 세포.
  38. 추출된 식물 지질 중의 트라이아실글리세롤을 트랜스에스테르화시키고, 이에 의해 에틸 에스테르를 생성시킴을 포함하는, 다중불포화 지방산의 에틸 에스테르의 제조 방법으로서, 상기 추출된 식물 지질이 에스테르화된 형태의 지방산을 포함하고, 상기 지방산이 올레산, 팔미트산, 리놀레산(LA)을 포함하는 ω6 지방산, 및 α-리놀렌산(ALA), 도코사헥사에노산(DHA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사펜타에노산(EPA), 도코사펜타에노산(DPA) 및 에이코사테트라에노산(ETA)을 포함하는 ω3 지방산을 포함하고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 DHA의 수준이 7% 내지 20%이고, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 팔미트산의 수준이 2% 내지 16%이며, 상기 추출된 지질의 전체 지방산 함량 중 미리스트산(C14:0)의 수준이 1% 미만인, 방법.
  39. 삭제
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