JP2015528027A - 植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
微細藻類、蘚類、および真菌類のような、生物におけるLC‐PUFAの生合成は、通常、一連の酸素依存的な不飽和化および鎖延長反応として生じる(図1)。これらの生物において、EPAを産生する最も一般的な経路は、Δ6‐不飽和化、Δ6‐伸長およびΔ5‐不飽和化(Δ6‐不飽和化経路と呼ばれる)を含み、一方、より一般的ではない経路は、Δ9‐伸長、Δ8‐不飽和化、およびΔ5‐不飽和化(Δ9‐不飽和化経路とよばれる)を使用する。これらの連続的な不飽和化および鎖延長反応は、図1の左上に模式的に示されるω6脂肪酸基質LA(ω6)または図1の右下に示されるEPAにたどり着くω3基質ALA(ω3)のいずれかにより開始し得る。最初のΔ6‐不飽和化がω6基質LAで行われる場合、一連の3つの酵素のLC‐PUFA産生物は、ω6脂肪酸ARAであろう。LC‐PUFA合成生物は、アラキドン酸(ARA,20:4ω6)のEPAへの転換について、図1にΔ17‐デサチュラーゼ工程として示されるように、ω3‐デサチュラーゼを用いて、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換することとしてもよい。ω3‐デサチュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、LAからARAの範囲の種々の基質で作用し得る。植物のω3‐デサチュラーゼはLAのALAへのΔ15‐不飽和化を特異的に触媒することが多く、一方、真菌および酵母のω3‐デサチュラーゼは、ARAのEPAへのΔ17‐不飽和化に特異的であることとしてもよい(非特許文献2、非特許文献3)。いくつかの報告は、多種多様なω6基質をそれらの対応するω3産生品に転換し得る非特異的なω3‐デサチュラーゼが存在することを示唆する(非特許文献4)。
ほとんどのLC‐PUFA代謝工学は、有酸素性のΔ6‐不飽和化/伸長経路を用いて行われてきた。タバコにおけるγ‐リノレン酸(GLA、18:3ω6)の生合成が、シアノバクテリウムシネコシスティス由来のΔ6‐デサチュラーゼを用いて、1996年に最初に報告された(非特許文献10)。より近年では、GLAがベニバナ(種子オイルにおける73%GLA;非特許文献11)およびダイズ(28%GLA;非特許文献12)のような作物植物において産生された。EPAおよびDHAのようなLC‐PUFAの産生は、増加した数の不飽和化および関連する伸長工程に起因する、より複雑な工学を伴う。陸上植物におけるEPAの産生は、イソクリシスガルバナ(Isochrysis galbana)由来のΔ9‐エロンガーゼ、ユーグレナグラシリス由来のΔ8‐デサチュラーゼ、およびモルティエレラアルピナ由来のΔ5‐デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシスに導入し、3%までのEPAを産生した非特許文献13により最初に報告された。この研究は、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来のΔ6‐デサチュラーゼおよびΔ6‐エロンガーゼ、並びにフェオダクチラム(Phaeodactylum tricornutum)由来のΔ5‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いる亜麻の種子において、0.8%までのEPAの産生を報告した非特許文献14により続けられた。
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルは、約2%から18%の間、または約2%から16%の間、または約2%から15%の間であり、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)のレベルは、約6%未満、または約3%未満、または約2%未満、または約1%未満である、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約20%の間、約30%から約60%の間、約45%から約60%、または約30%である、
iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルは、約4%から約35%の間、約4%から約20%の間、または約4%から17%の間である、
v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間、約4%から16%の間、または約2%から16%の間である、
vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から約7%の間、0.05%から約4%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
vii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)のレベルは、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
ix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、約4%未満、約2%未満、約1%未満、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間、または約0.05%から約1%の間である、
x)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)のレベルは、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約0.05%から約10%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
xi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)のレベルは、約4%未満、約3%未満、約2%未満、約0.05%から約8%の間、約0.05%から約5%の間、または約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
xii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xiii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含む、
xiv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まない、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約25%の間、約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、約4%から約60%の間、約30%から約60%の間、または約45%から約60%の間である、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間である、
xviii)記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約20%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間である、
xix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から約20%の間、約20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間である、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
xxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%から約65%の間、約40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
xxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、約9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
xxiii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
xxiv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
xxv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間の、Δ12‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のLAへの転換の効率に基づく、
xxvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の、Δ6‐デサチュラーゼによる、ALAのSDAへの転換の効率に基づく、
xxvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間の、Δ6‐エロンガーゼによる、SDAのETA酸への転換の効率に基づく、
xxviii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間の、Δ5‐デサチュラーゼによる、ETAのEPAへの転換の効率に基づく、
xxix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ5‐エロンガーゼによる、EPAのDPAへの転換の効率に基づく、
xxx)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ4‐デサチュラーゼによる、DPAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxxi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxxii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxxiii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxxiv)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xxxv)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間であり、
xxxvi)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
xxxvii)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.001%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含み、または、これらを実質的に含まない、
xxxviii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%または少なくとも80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
xxxix)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/18:3(TAG58:12)である、
xl)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
i)前記DHAのレベルが、約3%、約4%、約5%、約6%、または約7%であり、
ii)前記パルミチン酸のレベルが、約2%から約16%の間であり、
iii)前記ミリスチン酸のレベルが、約2%未満であり、
iv)前記オレイン酸のレベルが、約30%から約60%の間、好ましくは約45%から約60%の間であり、
v)前記LAのレベルが、約4%から約20%の間であり、
vi)前記ALAのレベルが、約2%から約16%の間であり、
vii)前記GLAのレベルが、約4%未満であり、
viii)前記SDAのレベルが、約6%未満、または約4%未満であり、
ix)前記ETAのレベルが、約6%未満、または約4%未満であり、
x)前記ETrAのレベルが、約1%未満であり、
xi)前記EPAのレベルが、約10%未満であり、および/または前記EPAのレベルが、前記DHAのレベルの0.5から2.0倍であり、
xii)前記DPAのレベルが、約4%未満であり、
xiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルが、約4%から約25%の間であり、
xiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルが、約30%から約70%の間であり、
xv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルが、約15%から約75%の間、好ましくは約15%から約30%の間であり、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルが、約0.5%から約10%の間であり、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総ω3脂肪酸のレベルが、約10%から約20%の間であり、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪酸のレベルが、約3%から約20%の間であり、
xix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.05から約3.0の間、好ましくは約0.50未満であり、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約0.03から約3.0の間であり、
xxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約70%であり、および
xxii)前記脂質は、コレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。より好ましくは、前記脂質は、SDAおよびETAを実質的に含まず、および/または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが約2%から約15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)のレベルが1%未満である、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約20%の間、約45%から約60%の間、または約30%である、
iv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルが、約4%から約20%の間、または約4%から17%の間である、
v)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルが、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間、または約4%から約16%の間である、
vi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
vii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)のレベルが、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
viii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA)のレベルが、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
ix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルが、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
x)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%,約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xiii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含む、
xiv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xv)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まない、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約20%の間、または約6%から約20%の間である、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間である、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約20%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間である、
xix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間である、
xx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
xxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
xxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
xxiii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
xxiv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
xxv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxviii)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xxix)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間である、
xxx)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
xxxi)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、約0.001%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含み、または、これらを実質的に含まない、
xxxii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも80%が、TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
xxxiii)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/18:3(TAG58:12)である、および
xxxiv)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。
i)前記脂質がオイルの形態であり、該オイルが、カンペステロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ5‐アベナステロール、Δ7‐スチグマステロールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上のまたは全てのような、1もしくはそれ以上のステロールを含み、および、任意に、前記オイルは10mg未満のステロール/gのオイルを含む、および/もしくは前記オイルはコレステロールを実質的に含まず、並びに/または、
ii)前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子であるような、油料種子由来のオイルの形態である。
i)脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに、任意にエイコサペンタエン酸(EPA)、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記植物部分における前記抽出可能な脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスを提供する。
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、1またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される。
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約95%の間、または約80%から約95%の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換する、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ALAをSDAに転換する、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、SDAをETAに転換する、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ETAをEPAに転換する、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の間、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、EPAをDPAに転換する、
viii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、DPAをDHAに転換する、
ix)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間である、
x)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのLAの転換の効率が、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間である、
xi)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのALAの転換の効率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間である、
xii)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約15%から約30%の間、または約22.5%から約27.5%の間で多いω3脂肪酸を含む、
xiii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、、リノール酸(LA)に対してα‐リノレン酸(ALA)を優先的に不飽和化する、
xiv)前記Δ6‐エロンガーゼは、また、Δ9‐エロンガーゼ活性を有する、
xv)前記Δ12‐デサチュラーゼは、また、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvi)前記Δ6‐デサチュラーゼは、また、Δ8‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvii)前記Δ8‐デサチュラーゼは、また、Δ6‐デサチュラーゼ活性を有し、またはΔ6‐デサチュラーゼ活性を有していない、
xviii)前記Δ15‐デサチュラーゼは、また、GLAでω3‐デサチュラーゼ活性を有する、
xix)前記ω3‐デサチュラーゼは、また、LAでΔ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xx)前記ω3‐デサチュラーゼは、両方のLAおよび/またはGLAを不飽和化する、
xxi)前記ω3‐デサチュラーゼは、、LAに対してGLAを優先的に不飽和化する、
xxii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約15%から約30%の間、または約20%から約25%の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxiii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、約15%から約60%の間、約20%から約40%の間、または約22%から約30%の間の、前記植物部分におけるLAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxiv)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約65%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間の、前記植物部分におけるALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxx)1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐PC基質よりもアシル‐CoA基質で、より高い活性を有する、
xxxi)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、LAよりもALAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのPCのsn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxiii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、基質としてのALAで、LAと比較して、少なくとも約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくとも4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有する、
xxxiv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高い活性を有する、
xxxv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、少なくとも約5倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する、
xxxvi)前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
xxxvii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAで、検出可能なΔ5‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、配列番号10で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、配列番号12で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、配列番号16で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号16と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iv)前記Δ6‐エロンガーゼが、配列番号25で規定される配列を有するアミノ酸、配列番号26のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号25および/または配列番号26と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
v)前記Δ5‐デサチュラーゼが、配列番号30で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号30と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vi)前記Δ5‐エロンガーゼが、配列番号37で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、配列番号41で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号41と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
ii)前記植物部分から脂質を抽出する工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスがさらに提供され、
前記抽出脂質は、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、以下の特徴を有する:
i)前記DHAのレベルは約3%、約4%、約5%、約6%、または約7%であり、
ii)前記パルミチン酸のレベルは約2%から約16%の間であり、
iii)前記ミリスチン酸のレベルは2%未満であり、
iv)前記オレイン酸のレベルは約30%から約60%の間、好ましくは約45%から約60%の間であり、
v)前記LAのレベルは約4%から約20%の間であり、
vi)前記ALAのレベルは約2%から約16%の間であり、
vii)前記GLAのレベルは約4%未満であり、
viii)前記SDAのレベルは、約6%未満、または約4%未満であり、
ix)前記ETAのレベルは、約6%未満、または約4%未満であり、
x)前記ETrAのレベルは約1%未満であり、
xi)前記EPAのレベルは約10%未満であり、および/または前記EPAのレベルは前記DHAのレベルの0.5から2.0倍であり、
xii)前記DPAのレベルは約4%未満であり、
xiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約4%から約25%の間であり、
xiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約30%から約70%の間であり、
xv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約15%から約75%の間、好ましくは、約15%から約30%の間であり、
xvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω6脂肪酸のレベルは約0.5%から約10%の間であり、
xvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは約10%から約20%の間であり、
xviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω3脂肪酸のレベルは約3%から約20%の間であり、
xix)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.05から約3.0の間、好ましくは約0.50未満であり、
xx)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は約0.03から約3.0の間であり、
xxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は少なくとも約70%であり、および
xxii)前記脂質はコレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質はトリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む。より好ましくは、前記脂質は、SDAおよびETAを実質的に含まず、および/または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
%、および、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスもまた提供される。
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが2%から15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)のレベルが1%未満である、
xxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、1%から約20%の間、約45%から約60%の間、または約30%である、
xxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルが、約4%から約20%の間、または約4%から17%である、
xxxvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルが、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間、または4%から16%の間である、
xxxviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xxxix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)のレベルが、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xl)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA)のレベルが、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
xli)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルが、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
xlii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xliii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)のレベルが、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
xliv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
xlv)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含む、
xlvi)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
xlvii)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まない、
xlviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約20%の間、または約6%から約20%の間である、
xlix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、または8%から約22%の間である、
l)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約20%から約75%の間、約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間である、
li)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間である、
lii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
liii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
liv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
lv)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
lvi)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
lvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
lviii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく、
lix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
lx)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
lxi)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間である、
lxii)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
lxiii)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.001%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
lxiv)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
lxv)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/18:3(TAG58:12)である、および
lxvi)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する。
i)前記脂質はオイルの形態であり、前記オイルは、カンペステロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ5‐アベナステロール、Δ7‐スチグマステロールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上のまたは全てのような、1もしくはそれ以上のステロールを含み、並びに、任意に、前記オイルは約10mg未満のステロール/gのオイルを含む、および/もしくは前記オイルはコレステロールを実質的に含まない、
ii)前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子のような、油料種子由来のオイルの形態である、
iii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約3%、約4%、約5%、約6%、または7%から20%である、
の1もしくはそれ以上、または全てが適用される。
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、および転写ターミネーター、および/またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記DNA分子が3、4、5、または6つの異なるプロモーターを含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、
1もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性であり、
前記第1の遺伝子の転写の方向が、前記第3の遺伝子から離れており、前記第3の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第4の遺伝子の転写の方向が、前記第6の遺伝子から離れており、前記第6の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第2の遺伝子の転写の方向が、前記第1の遺伝子または前記第3の遺伝子と同じであり、
前記第5の遺伝子の転写の方向が、前記第4の遺伝子または前記第6の遺伝子と同じであり、
前記第2の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第1のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第1または第3の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約1.0から約10.0キロベースの間の第2のスペーサー領域により前記第1の遺伝子クラスターが第2の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第5の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第3のスペーサー領域により、より近いいずれかの、第4または第6の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く。
i)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45に示される1またはそれ以上の配列と、少なくとも95%同一または99%同一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および/または外因性ポリヌクレオチドを提供する。
i)配列番号2のヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号2に示される配列と、少なくとも95%同一または99%同一であるヌクレオチドの配列、
を含む。
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
i)配列番号10に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ12‐デサチュラーゼをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列と、
ii)配列番号12に規定される配列を有するアミノ酸を含むω3‐デサチュラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列とを含む、宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができる1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
a)その種子における脂質であって、該脂質はエステル化形態における脂肪酸を含み、および
b)以下のセットの酵素:
i)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
ii)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、油料種子植物を提供し、各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように1またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、ならびに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)および/またはエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは約7%から20%である。
i)本発明の植物由来である、
ii)本明細書で定義される脂質を含む、
iii)本発明のプロセスで使用され得る、
iv)本発明の遺伝子コンストラクトを含む、または
v)本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の1またはそれ以上を有する。
a)前記細胞、好ましくは、LC‐PUFAを合成することができない細胞に、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書に定義される1またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
b)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
c)任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
d)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、
を含む。
a)好ましくは少なくとも1000のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも1ヘクタールのエリアで、本明細書の植物、または本明細書に定義される部分を産生する植物を成長させることと、
b)前記植物の1つまたは複数から種子を収穫することと、
c)任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgDHA/ヘクタールの総DHA収率を有するオイルを産生することと、
を含む。
i)前記オイルが本明細書に定義される、
ii)前記植物部分または種子が、本発明のプロセスで使用されることができる、
iii)前記外因性ポリヌクレオチドが、本発明の遺伝子コンストラクトに含まれる、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドは、本発明の外因性ポリヌクレオチドを含む、
v)前記植物細胞は、本発明の細胞である、
vi)前記種子は、本発明の方法で産生される、
の1またはそれ以上を有する。
a)本発明の種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および/または収穫することと、
b)前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し、および/または選り分けることと、
c)工程b)で分離された前記種子をふるいにかけおよび/またはソートすること、および容器内に前記ふるいにかけられたおよび/またはソートされた種子をロードすることにより、種子の入った容器を産生することと、
を含む、種子の入った容器を産生するプロセスを提供する。
配列番号1‐pJP3416‐GA7ヌクレオチド配列。
配列番号2‐pGA7‐mod_Bヌクレオチド配列。
配列番号3‐pGA7‐mod_Cヌクレオチド配列。
配列番号4‐pGA7‐mod_Dヌクレオチド配列。
配列番号5‐pGA7‐mod_Eヌクレオチド配列。
配列番号6‐pGA7‐mod_Fヌクレオチド配列。
配列番号7‐pGA7‐mod_Gヌクレオチド配列。
配列番号8‐pORE04+11ABGBEC_Cowpea_EPA_インサートヌクレオチド配列。
配列番号9‐植物におけるラカンセア・クルイベリ(Lachancea kluyveri)Δ12デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号10‐ラカンセア・クルイベリΔ12‐デサチュラーゼ。
配列番号11‐植物におけるピキア・パストリスω3デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号12‐ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ。
配列番号13‐ミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号14‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号15‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号16‐ミクロモナス・プシラΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号17‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号18‐植物におけるオストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号19‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号20‐オストレオコッカスタウリΔ6‐デサチュラーゼ。
配列番号21‐ピラミモナス・コルダタΔ6‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号22‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする)(バージョン1)。
配列番号23‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする)(バージョン2)。
配列番号24‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする)(バージョン3)。
配列番号25‐ピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼ。
配列番号26‐切断されたピラミモナス・コルダタΔ6‐エロンガーゼ。
配列番号27‐パブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号28‐植物におけるパブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号29‐植物におけるパブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号30‐パブロバサリナΔ5‐デサチュラーゼ。
配列番号31‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号32‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐デサチュラーゼ。
配列番号33‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号34‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号35‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号36‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン3)。
配列番号37‐ピラミモナス・コルダタΔ5‐エロンガーゼ。
配列番号38‐パブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号39‐植物におけるパブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン1)。
配列番号40‐植物におけるパブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム(バージョン2)。
配列番号41‐パブロバサリナΔ4‐デサチュラーゼ。
配列番号42‐イソクリシスガルバナΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号43‐イソクリシスガルバナΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号44‐エミリアニアハクスレイCCMP1516Δ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号45‐植物におけるエミリアニアハクスレイΔ9‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号46‐エミリアニアハクスレイCCMP1516Δ9‐エロンガーゼ。
配列番号47‐パブロバピンギスΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号48‐パブロバピンギスΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号49‐パブロバサリナΔ9‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号50‐パブロバサリナΔ9‐エロンガーゼ。
配列番号51‐パブロバサリナΔ8‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号52‐パブロバサリナΔ8‐デサチュラーゼ。
配列番号53‐P19ウイルスサプレッサー。
配列番号54‐V2ウイルスサプレッサー。
配列番号55‐P38ウイルスサプレッサー。
配列番号56‐Pe‐P0ウイルスサプレッサー。
配列番号57‐RPV‐P0ウイルスサプレッサー。
配列番号58‐P19ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号59‐V2ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号60‐P38ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号61‐Pe‐P0ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号62‐RPV‐P0ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号63‐シロイヌナズナLPAAT2。
配列番号64‐リムナンテスアルバLPAAT。
配列番号65‐サッカロマイセスセレビシエLPAAT。
配列番号66‐ミクロモナス・プシラLPAAT。
配列番号67‐モルティエレラアルピナLPAAT。
配列番号68‐セイヨウアブラナ(Braccisa napus)LPAAT。
配列番号69‐セイヨウアブラナLPAAT。
配列番号70‐フィトフトラインフェスタンスω3デサチュラーゼ。
配列番号71‐タラッシオシラシュードナナω3デサチュラーゼ。
配列番号72‐ピティウムイレギュラレω3デサチュラーゼ。
別途具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、タンパク質化学、および生化学における)により一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「抽出植物脂質」および「単離植物脂質」は、植物または種子のようなその植物部分を、例えば、破砕することにより、抽出形態である脂質組成物を指す。抽出脂質は、例えば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然の組成物、または全てではなくても、ほとんどの1もしくはそれ以上のもしくはそれぞれの、植物性物質由来の水、核酸、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製された組成物、であり得る。精製方法の例が、以下に記載される。一実施形態では、抽出または単離植物の脂質は、組成物の重量により、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%(w/w)脂質を含む。脂質は、室温で固体または液体であることとしてもよく、液体である場合に、オイルであることが考えられる。一実施形態では、本発明の抽出脂質は、別のソースにより産生されないDHAのような別の脂質(例えば、魚油由来のDHA)とブレンドされていない。一実施形態では、抽出後に、1もしくはそれ以上のまたは全ての、DHAに対するオレイン酸、DHAに対するパルミチン酸、DHAに対するリノール酸、および総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有意に変化していない(例えば、10%または5%以下の変化)。別の実施形態では、抽出植物脂質は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、1もしくはそれ以上のまたは全ての、DHAに対するオレイン酸、DHAに対するパルミチン酸、DHAに対するリノール酸、および総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水素化または分画法のような手順にさらされていない。本発明の抽出植物脂質がオイルにおいて含まれる場合、オイルは、ステロールのような、非脂肪酸分子をさらに含むこととしてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「デサチュラーゼ」は、例えば、アシル‐CoAエステルのような、典型的にはエステル化形態におけるものである、脂肪酸基質のアシル基内に炭素‐炭素二重結合を導入することが可能な酵素を指す。アシル基は、ホスファチジルコリン(PC)のようなリン脂質に対して、またはアシル担体タンパク質(ACP)に対して、または、好ましい実施形態ではCoAに対して、エステル化されることとしてもよい。よって、デサチュラーゼは、概して、3つのグループにカテゴライズされることとしてもよい。一実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである。
生化学的証拠が、脂肪酸伸長が4つの工程:濃縮、還元、脱水、および第2の還元からなることを示唆する。本発明の内容において、「エロンガーゼ」は、適切な生理的条件下で、伸長複合体の他のメンバーの存在下で凝縮工程を触媒するポリペプチドを指す。伸長タンパク質複合体の凝縮成分(「エロンガーゼ」)のみの細胞における異種性または相同性発現が、個々のアシル鎖の伸長のために必要とされることが示された。よって、導入されたエロンガーゼが、成功的なアシル伸長を行うためのトランスジェニック宿主からの還元および脱水作業を成功的に採用することができる。鎖の長さに対する鎖延長反応の特異性または脂肪酸基質の不飽和化の程度が、凝縮成分に存在することが考えられる。また、この成分は、鎖延長反応において律速であることが考えられる。
本明細書で使用される場合、用語「1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ」(LPAAT)は、リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼまたはアシルCoA‐リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼともよばれ、ホスファチド酸(PA)を形成するためにsn‐2位置でsn‐l‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェート(sn‐1 G‐3‐P)をアシル化するタンパク質を指す。よって、用語「1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ活性」は、PA(EC 2.3.1.51)を産生するための、sn‐2位置での(sn‐1 G‐3‐P)のアシル化を指す。好ましいLPAATは、LPAのsn‐2位置に多価不飽和C22アシル基を転移するために、基質として多価不飽和C22アシル‐CoAを使用し得るものであり、PAを形成する。このようなLPAATは、実施例13に例示され、そこに記載されるように試験され得る。一実施形態では、本発明のために有用なLPAATは、配列番号63から69のいずれか1つに規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または1もしくはそれ以上の配列番号63から69のいずれか1つと少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本発明について有用なLPAATは、配列番号64、65、および67のいずれか1つに規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または1もしくはそれ以上の配列番号64、65、および67のいずれか1つと少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。
ポリペプチドの内容における用語「遺伝子組換え」は、それが天然に産生される場合のその自然の状態と比較して、変化した量または変化した率で、細胞によりまたは細胞フリーの発現システムにより産生される場合のポリペプチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリペプチドを天然で産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生されるポリペプチドの変化した量を生じさせる非内因性遺伝子含む細胞であることとしてもよい。本発明の遺伝子組換えポリペプチドは、それが産生される、細胞、組織、器官、もしくは生物、または細胞フリー発現システムにおけるポリペプチド、つまり、それが産生されたトランスジェニック(遺伝子組換え)細胞の他の成分から分離または精製されていないポリペプチド、および、その後、少なくともいくつかの他の成分から精製されるこのような細胞または細胞フリーのシステムにおいて産生されるポリペプチドを含む。
また、本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、T‐DNA分子のようなキメラ遺伝子構築物、またはキメラDNAであることとしてもよい、ポリヌクレオチドを提供しおよび/または使用する。本明細書に定義される特定の活性を行うための、ゲノムまたは合成の起源、二本鎖または一本鎖のDNAまたはRNAであり、炭水化物、脂質、タンパク質、または他の材料との組み合わされることとしてもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で、用語「核酸分子」と互換的に使用される。「単離ポリヌクレオチド」で、天然のソースから得られる場合に、その天然状態で関連しもしくは結合されるポリヌクレオチド配列、または非天然で生じるポリヌクレオチドで、ポリヌクレオチド配列から分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、天然に関連する、他の成分から、少なくとも60%フリー、より好ましくは少なくとも75%フリー、およびより好ましくは少なくとも90%フリーである。
本発明の一実施形態には、組み換えベクターが含まれ、これは、宿主細胞にポリヌクレオチド分子を導入するのが可能ないずれかのベクターに挿入された、本明細書で定義される少なくとも1つのポリヌクレオチド分子を含む。組み換えベクターには発現ベクターが含まれる。組み換えベクターは、異種性ポリヌクレオチド配列、つまり、本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子に、自然には隣接して見つからず、好ましくは、該ポリヌクレオチド分子(複数可)が由来した種以外の種由来であるヌクレオチド配列を含む。ベクターはRNAまたはDNAのいずれかであり得、一般的にプラスミドである。プラスミドベクターには通常、1つ以上のT−DNA領域を含む、たとえばpUC由来ベクター、pSK由来ベクター、pGEM由来ベクター、pSP由来ベクター、pBS由来ベクターまたは好ましくはバイナリーベクターといった、原核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅および形質転換を提供する追加の核酸配列を含む。追加の核酸配列には、ベクターの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築物にコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する特有のマルチプルクローニング部位、および、原核および真核(特に植物)細胞の形質転換を強化する配列が含まれる。組み換えベクターには、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを2つ以上、たとえば、3、4、5または6つの本明細書で定義されるポリヌクレオチドを組み合わせて含み得、好ましくは、それぞれのポリヌクレオチドが、対象細胞で動作可能な発現制御配列に操作可能に結合している本発明のキメラ遺伝子構築物を含み得る。本明細書で定義される2つ以上のポリヌクレオチド、たとえば、3、4、5または6つのポリヌクレオチドは、好ましくは単一組み換えベクターと共有結合し、好ましくは単一T−DNA分子内で共有結合し、これは、次いで、単一分子として細胞に導入され、本発明に従った組み換え細胞を形成し得、好ましくは、たとえばトランスジェニック植物の組み換え細胞のゲノムに組み込まれ得る。したがって、そのように結合したポリヌクレオチドは組み換え細胞または植物の子孫内に単一遺伝子座として一緒に受け継がれる。組み換えベクターまたは植物は、たとえば、各組み換えベクターが3、4、5または6つのポリヌクレオチドを含む、それぞれが複数のポリヌクレオチドを含むそのような組み換えベクターを2つ以上含み得る。
本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換する、および、1つ以上の特定のポリヌクレオチド分子(複数可)の発現をもたらすことが可能なDNAベクターである。本発明の好ましい発現ベクターは、酵母菌および/または植物細胞の遺伝子発現を指示できる。本発明に有益な発現ベクターには、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点といった調整配列および組み換え細胞に適合し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調整配列が含まれる。特に、本発明に有益なポリヌクレオチドまたはベクターには、転写制御配列が含まれる。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよびエンハンサー配列といった、転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の組み換え細胞の少なくとも1つで機能し得る、いずれかの転写制御配列が含まれる。使用される調整配列の選択は、植物といった標的有機生物および/または対象の標的器官または組織による。そのような調整配列は、植物または植物ウイルスといった任意の真核生物から得られ得、または、化学的に合成され得る。そのような様々な転写制御配列が、当業者には公知である。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその部分の使用によって、恒常的、または発生段階および/もしくは組織特異的のいずれかで植物の転写を指示することにおいて活性を有するプロモーターである。
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、キメラ遺伝子構築物または組み換えベクターといった1つ以上の組み換え分子で形質転換した宿主細胞である、組み換え細胞、好ましくは組み換え植物細胞も提供する。組み換え細胞は、2または3つの組み換えベクター、または組み換えベクターおよび1つ以上の追加ポリヌクレオチドもしくはキメラDNAといった、その任意の組み合わせを含み得る。本発明の適切な細胞には、たとえば本明細書に記載されるポリペプチドまたは酵素をコードする分子といった、本発明のポリヌクレオチド、キメラDNAまたは組み換えベクターで形質転換され得る任意の細胞が含まれる。細胞は好ましくは、それによってLC−PUFAを生産するために使用されることができる細胞である。組み換え細胞は培養中の細胞、インビトロの細胞であり得、または、たとえば植物といった有機生物内にあり得、もしくは、たとえば種子もしくは葉といった器官内にあり得る。好ましくは細胞は、植物または植物部分内にあり、さらに好ましくは植物の種子内にある。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを1つ以上含むトランスジェニック植物といった、本発明の細胞を含む植物も提供する。本明細書で名詞として使用される「植物」という語句は、全体の植物を指すが、形容詞として使用される場合は、たとえば植物器官(たとえば、葉、茎、根、花)、単細胞(たとえば、花粉)、種子、植物細胞などといった、植物に存在する、植物から得られる、植物由来の、または植物に関係する任意の物質を指す。「植物部分」という語句は、その植物部分が本発明に従った脂質を合成する限り、たとえば葉または茎といった植物構造、根、花器官または構造、花粉、種子、胚、胚乳、胚盤または種皮といった種子部分、たとえば維管束組織といった組織、細胞および同植物の子孫を含む、植物DNAを含む全植物部分を指す。
a)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼおよびΔ6エロンガーゼ、
b)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼおよびΔ9エロンガーゼ、
c)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ、Δ6エロンガーゼおよびΔ15デサチュラーゼ、
d)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ、Δ9エロンガーゼおよびΔ15デサチュラーゼ
e)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ、Δ6エロンガーゼおよびΔ17デサチュラーゼ、または、
f)Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5エロンガーゼ、Δ9エロンガーゼおよびΔ17デサチュラーゼ、をコードする外因性ポリヌクレオチドを少なくとも含む。
トランスジェニック植物を、A.Slater et al.、Plant Biotechnology−The Genetic Manipulation of Plants、オックスフォード大学出版局(2003)およびP.ChristouおよびH.Klee、Handbook of Plant Biotechnology、ジョン・ワイリー&サンズ社(2004)で広く説明されるものといった、当該技術では公知の技術を用いて生産できる。
サイレンシング抑制因子
ある実施形態では、本発明の細胞、植物または植物部分は、サイレンシング抑制因子タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
植物種子に発現されることが望ましいRNA分子は実質的にどれもサイレンシング抑制因子と同時発現され得る。コードされたポリペプチドは、油、デンプン、炭水化物、栄養素などの代謝に関連し得、または、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ろう、油、デンプン、砂糖、炭水化物、風味、匂い、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン酸、セルロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成、好ましくはTAGの生合成または構築に関与し得る。
組み換え細胞または種子といった植物部分で生産されるLC−PUFAまたはLC−PUFA(複数)の組み合わせの量は重要である。量は、特定のLC−PUFA、または、たとえば、ω3LC−PUFAもしくはω6LC−PUFAもしくはVLC−PUFAといった関連LC−PUFAのグループ、または、当該技術分野で知られる方法によって決定され得る他のものである脂肪酸の合計の組成(パーセントで)として表され得る。量は、LC−PUFA含有量としても表され得、たとえば、組み換え細胞を含む材料の乾燥重量におけるLC−PUFAのパーセンテージ、たとえば、LC−PUFAである種子の重量のパーセンテージである。油料種子で生産されるLC−PUFAは、LC−PUFA含有量の面で見れば、油生産のためには育てられない野菜または穀物においてよりも著しく高い可能性があることがわかるが、双方は類似したLC−PUFA組成を有し得、双方はヒトまたは動物の消費のためのLC−PUFAの供給源として使用され得る。
1.OAからDHA=100×(%DHA)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
2.LAからDHA=100×(%DHA)/( LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
3.ALAからDHA=100×(%DHA)/ ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
4.EPAからDHA=100×(%DHA)/(EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
5.DPAからDHA(Δ4デサチュラーゼ効率)=100×(%DHA)/(DPAおよびDHAの合計%)。
6.Δ12デサチュラーゼ効率=100×(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
7.ω3デサチュラーゼ効率=100×(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
8.OAからALA=100×(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
9.Δ6デサチュラーゼ効率(ω3基質ALA上)=100×(SDA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(%ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPAおよびDHA)。
10.Δ6エロンガーゼ効率(ω3基質SDA上)=100×(ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(SDA、ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
11.Δ5デサチュラーゼ効率(ω3基質ETA上)=100×(EPA、DPAおよびDHAの合計%)/(ETA、EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
12.Δ5エロンガーゼ効率(ω3基質EPA上)=100×(DPAおよびDHAの合計%)/(EPA、DPAおよびDHAの合計%)。
当該技術分野で日常的に実施される技術を用いて、本発明の細胞、植物、種子などによって生産される油を抽出、プロセスおよび分析し得る。通常、植物種子を、調理、プレスおよび抽出して、粗油を生産し、これを次いで、脱ガム、精製、脱色、脱臭する。一般的に、種子を粉砕する技術は当該技術分野では公知である。たとえば、油料種子に水をスプレーして含水量をたとえば8.5%まで上げることで油料種子を和らげ得、隙間設定が0.23から0.27mmの滑らかなローラーを用いてフレーク状にし得る。種子の種類によっては、粉砕前に水を加えない可能性がある。熱の適用は酵素を非活性化させ、細胞破裂を助長し、油の液滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集し、これらはすべて抽出プロセスを助長する。
脱ガムは、油の精製において初期の工程であり、その第1の目的は抽出した総脂質のうちおよそ1〜2%で存在し得るリン脂質の大部分を油から取り除くことである。通常リン酸を含む約2%の水を70〜80℃で粗油に添加すると、微量金属および色素を伴う、大部分のリン脂質の分離につながる。取り除かれた難溶性物質は、主にリン脂質およびトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしても知られる。濃縮したリン酸を粗種子油に添加することで脱ガムを実施し、非水和性ホスファチドを水和性形態に変換し得、および、存在する少量の金属をキレート化し得る。遠心分離によって、ガムを種子油から分離する。
アルカリ精製は、粗油を処理するための精製プロセスの1つであり、時折中和とも呼ばれる。アルカリ精製は、通常脱ガムに続き、脱色の前に行われる。脱ガムに続いて、種子油を十分な量のアルカリ溶液の添加によって処理し、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定し、こうして形成されたセッケンを取り除く。適切なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび水酸化アンモニアが含まれる。このプロセスは通常室温で実行され、遊離脂肪酸分画を取り除く。セッケンを遠心分離またはセッケンのための溶媒への抽出によって取り除いて、中和した油を水で洗う。必要であれば、油中の任意の余分なアルカリを、塩酸または硫酸といった適切な酸で中和し得る。
脱色は、窒素もしくは蒸気と、または、真空で作用させることで、漂白土(0.2〜2.0%)の存在下および酸素の不在下で、油を90〜120℃で10〜30分間加熱する精製プロセスである。油プロセシングにおけるこの工程は、所望しない色素(カロテノイド、クロロフィル、ゴシポールなど)を取り除くように設計され、該プロセスはまた、酸化産物、微量金属、硫黄化合物および微量のセッケンも取り除く。
脱臭は、高温度(200〜260℃)および低圧(0.1〜1mmHg)での油および脂肪の処理である。これは通常、蒸気を、種子油100mlあたり、約0.1ml/分の速度で種子油に導入することで達成される。30分のスパージング後、種子油を真空下で放冷する。通常、種子油をガラス容器に移し、冷蔵下で保管する前に、アルゴンで洗い流す。この処理によって、種子油の色が改善され、任意の残存している遊離脂肪酸、モノアシルグリセロールおよび酸化産物を含む、揮発性物質または臭気化合物の大部分が取り除かれる。
脱ろうは、周囲以下の温度での結晶化によって、油および脂肪を固体(ステアリン)および液体(オレイン)分画に分離するために、油の商業上の生産において時折使用されるプロセスである。これは本来、固体フリー生成物を生産するために綿実油に適用された。通常は油の飽和脂肪酸含有量を低下するために使用される。
エステル交換反応は、初めに脂肪酸をTAGから自由脂肪酸または脂肪酸エステルのいずれか、通常は脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルとして放出することで、脂肪酸をTAG内または間で交換する、または、その脂肪酸を別のアルコールに移してエステルを形成するプロセスである。分画化プロセスと組み合わせる場合、エステル交換反応を用いて脂質の脂肪酸組成を改変し得る(Marangoni et al.、1995)。セステル交換は、化学的(たとえば、強酸または塩基触媒性)または酵素的方法のいずれかを用い得、後者はTAG上の脂肪酸に関して位置特異的(sn−1/3またはsn−2特異的)であり得るリパーゼを用い、または、他よりもいくつかの脂肪酸に対して好みを有する(Speranza et al.、2012)。油中のLC−PUFAの濃度を増大するための脂肪酸分画化は、たとえば、冷凍結晶化、尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出および銀イオン錯体形成といった、当該技術で公知の方法のいずれかによって達成され得る。尿素との複合体結成はその油中の飽和および一価不飽和脂肪酸の量を減らす際の単純性および効率性のために好ましい方法である(Gamez et al.、2003)。始めに、酸または塩基触媒性反応条件下での加水分解によって、油のTAGを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分け、それによって、過剰なアルコールが用いられ、形成されたアルキルエステルおよび、さらに形成されたグリセロールの分離を可能にする、1molのTAGが少なくとも3molのアルコール(たとえば、エチルエステルにはエタノール、メチルエステルにはメタノール)と反応し、または、リパーゼによって、油のTAGを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分ける。その処理によって脂肪酸組成が通常は改変した、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを次いで、複合体形成のための尿素のエタノール溶液と混合する。飽和および一価不飽和脂肪酸は容易に尿素と複合体形成し、冷却の際に結晶化し、続いて濾過によって取り除かれ得る。非尿素と複合した分画はこうしてLC−PUFAに富んでいる。
本発明には、家畜飼料として使用され得る組成物を含む。本発明のために、「家畜飼料」には、体内に取り込まれた際に(a)組織に栄養分を与え、もしくは組織を築く、またはエネルギーを供給するために役立つ;および/または(b)十分な栄養状態または代謝機能を維持、再建または支持する、ヒトまたは動物の消費のための任意の食物または調製物が含まれる。本発明の家畜飼料には、たとえば、本発明の調製粉乳および種子ミールといった、乳児および/または小さな子供にとって栄養のある組成物が含まれる。
また、本発明には、本発明の方法を用いて生産される1つ以上の脂肪酸および/または結果として得られる油を含む組成物、具体的には医薬組成物も包含される。
一過性発現系での植物細胞の遺伝子発現
外因性遺伝子構築物を、基本的にVoinnet et al.(2003)およびWood et al.(2009)が説明する通りに、一過性発現系で植物細胞に発現させた。CaMV 35Sプロモーターといった強度の恒常的プロモーターから発現されるコード領域を含むプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に導入した。国際公開第2010/057246号に記載される通り、p19ウイルス性サイレンシング抑制因子発現のためのキメラ遺伝子35S:p19を別でAGL1内に導入した。組み換えアグロバクテリウム細胞を、50mg/Lカナマイシンおよび50mg/Lリファンピシンを添加したLBブロス内で、28℃で静止期まで成長させた。次いで、10mMのMES pH5.7、10mMのMgCl2および100μΜアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液内でOD600=1.0まで再懸濁する前に、室温で15分間、5000gでの遠心分離によって細菌をペレット状にした。次いで、35S:p19および対象の試験キメラ構築物(複数可)を含む同じ体積のアグロバクテリウム培養物を、葉の組織への浸潤に先立って混合する前に、細胞を振動させながら28℃で3時間インキュベートした。一般的に、浸潤後、葉のディスクを脂肪酸のGC分析のために取り出して凍結乾燥させる前に、植物をさらに5日間成長させた。
30mのSGE−BPX70カラム(70%シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン、0.25mmの内部直径、0.25mmのフィルムの厚さ)、FID、分割/非分割注入器ならびにアジレント・テクノロジー社7693シリーズ自動回収装置および注入器を備えたアジレント・テクノロジー社7890A GC(米国、カリフォルニア州、パロアルト)を用いたガスクロマトグラフィーによって、FAMEを分析した。ヘリウムをキャリアガスとして用いた。150℃のオーブン温度で試料を分割モード(50:1比)で注入した。注入後、オーブン温度を150℃で1分間維持し、次いで、1分あたり3℃ずつ210℃まで上げ、再度1分あたり50℃ずつ240℃まで上げ、最終的に、240℃で1.4分間維持した。アジレント・テクノロジー社ChemStationソフトウェア(Rev B.04.03(16)、米国、カリフォルニア州、パロアルト)で、既知の量である外部標準GLC−411(Nucheck)およびC17:0−ME内部標準の反応をもとにピークを定量化した。
内部定量化標準として既知の量のtri−C17:0−TAGを添加した後、開花から12日後(daf)の、凍結乾燥した発育中の種子および成熟した種子から全ての脂質を抽出した。5mgの乾燥材料あたりで、抽出した脂質をブタノール:エタノール(1:1 v/v)中10mMのブチル化ヒドロキシトルエン1mLに溶解し、アジレント社1200シリーズLCおよび6410bエレクトロスプレーイオン化3連4重極LC−MSを用いて分析した。0.2mL/分のフロー速度でバイナリ勾配を操作するAscentis Express RP−Amideカラム(50mm×2.1mm、2.7μm、Supelco)を用いて、脂質をクロマトグラフィーによって分離した。移動相は:A.H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(50:20:30 v/v/v)中10mMの蟻酸アンモニウム;B.H2O:メタノール:テトラヒドロフラン(5:20:75、v/v/v)中10mMの蟻酸アンモニウムであった。マルチプルリアクションモニタリング(MRM)リストは、30Vの衝突エネルギーおよび60Vのフラグメンターを用いて、次の主要な脂肪酸をもとにした:16:0、18:0、18:1、18:2、18:3、18:4、20:1、20:2、20:3、20:4、20:5、22:4、22:5、22:6。アンモニア化合プリカーサーイオンおよび22:6のニュートラルロスによるプロダクトイオンをもとに、各MRM TAGを同定した。10μΜのトリステアリン外部標準を用いてTAGを定量化した。
種子油含有量を測定する予定であった場合、種子を24時間デシケーター内で乾燥させ、およそ4mgの種子を、テフロン加工のねじ口を含む2mlのガラス小瓶に移した。0.1mlトルエン中に溶解した0.05mgトリヘプタデカノインを内部標準として小瓶に添加した。
およそ10mgの油の試料を、内部標準として添加した一定分量のC24:0モノオールと一緒に、80%MeOH中4mLの5%KOHを用い、テフロン加工のねじ口のガラス管内で80℃にて2時間加熱し、けん化した。反応混合物を冷やした後、2mLのMilli−Q水を添加し、振動および撹拌することで、ステロールを2mLのヘキサン:ジクロロメタン(4:1 v/v)に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を取り除き、2mLのMilli−Q水で洗浄した。振動および遠心分離のあと、ステロール抽出物を次いで除去した。窒素ガスの流れを利用して抽出物を蒸発させ、200mLのBSTFAを用い、および80℃で2時間加熱して、ステロールをシリル化した。
逆転写PCR(RT−PCR)増幅は、一般的に、製造業者の説明にしたがって10pmolのフォワードプライマーおよび30pmolのリバースプライマー、2.5mMの最終濃度までのMgSC4、緩衝液を伴う400ngの全RNAならびにヌクレオチド成分を用いた、体積25μLのSuperscript III One−Step RT−PCRシステム(インビトロゲン社(Invitrogen))を使用して実行された。典型的な温度レジームは:逆転写が起こるために30分間45℃で1サイクル;次いで、2分間94℃で1サイクル、引き続き、30秒間94℃、30秒間52℃、1分間70℃の40サイクル;次いで、反応混合物を5℃に冷やす前に2分間72℃の1サイクルであった。
バイナリーベクターpJP3416−GA7およびpJP3404はそれぞれ、5つのデサチュラーゼおよび2つのエロンガーゼをコードする7つの異種性脂肪酸生合成遺伝子、ならびに、各ベクターに存在するT−DNAの左境界と右境界の反復の間に植物選択マーカーを含んでいた(図2および3)。配列番号1は、右境界から左境界の配列のpJP3416−GA7のT−DNA領域のヌクレオチド配列を提供する。双方の遺伝子構築物は、ラカンセア・クルイベリΔ12−デサチュラーゼ(配列番号1のヌクレオチド14143〜16648を含む)、ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ(配列番号1のヌクレオチド7654〜10156を含む)、ミクロモナス・プシラΔ6デサチュラーゼ(配列番号1のヌクレオチド226〜2309を含む)、パブロバ・サリナΔ5およびΔ4デサチュラーゼ(それぞれ配列番号1のヌクレオチド4524〜6485および10157〜14142を含む)およびピラミモナス・コルダタΔ6およびΔ5エロンガーゼ(それぞれ配列番号1のヌクレオチド2310〜4523および17825〜19967を含む)をコードする、植物コドン最適化遺伝子を含んでいた。配列番号1に対して、バイナリーベクターpJP3416−GA7のT−DNA(方向:右境界から左境界の配列)領域の特定の領域は次の通りである:
ヌクレオチド1〜163:右境界;480〜226、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼターミネーター(TER_NOS);1883〜489、ミクロモナス・プシラΔ6デサチュラーゼ;2309〜1952、セイヨウアブラナ切断ナピンプロモーター(PRO_FPl);2310〜3243、シロイヌナズナFAE1プロモーター(PRO_FAE1);3312〜4181、ピラミモナス・コルダタΔ6エロンガーゼ;4190〜4523、グリシンマックスレクチンターミネーター(TER_レクチン);4524〜4881、PRO_FPl;4950〜6230:パブロバ・サリナΔ5デサチュラーゼ;6231〜6485:TER_NOS;7653〜6486、ニコチアナ・タバカムRb7マトリックス付着領域(MAR);8387〜7654、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン1ターミネーター(TER_Cnl1);9638〜8388、ピキア・パストリスω3デサチュラーゼ;10156〜9707、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン1プロモーター(PRO_Cnl1);10157〜12189、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン1プロモーター;12258〜13604、パブロバ・サリナΔ4デサチュラーゼ;13605〜14142、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン2ターミネーター;14143〜14592、PRO_Cnl1;14661〜15914、ラカンセア・クルイベリΔ12デサチュラーゼ;15915〜16648、TER_Cnl1;17816〜16649、MAR;17825〜18758、PRO_FAE1;18827〜19633、ピラミモナス・コルダタΔ5エロンガーゼ;19634〜19967、TER_レクチン;19990〜20527、複製エンハンサー領域を伴うカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター;20537〜21088、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスホスフィノトリシン−N−アセチルトランスフェラーゼ;21097〜21349、TER_NOS;21367〜21527、左境界。
キメラベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用してA.タリアナ(シロイヌナズナ)(生態型コロンビアおよびfad2変異体)植物を処理した(CloughおよびBent、1998)。成熟後、処理した植物からのT1種子を回収しBAR選択マーカー遺伝子を含む植物の選択のためにPPTを含むMSプレート上に播いた。生き残った、健康なT1実生を土壌に移した。植物が成熟まで成長し、自家受精が可能にした後、これら植物からのT2種子を回収し、それらの種子脂質の脂肪酸組成を実施例1で記載する通りにGC分析によって分析した。
様々な量のDHAを有するトランスジェニックA.タリアナ種子の油含有量を実施例1で説明した通りGCで測定した。データは図6に示され、油含有量(種子の重量%油)をDHA含有量(総脂肪酸のパーセンテージとして)に対してグラフ化している。種子1グラムあたり最大26.5mgのDHAが観察された(表10)。トランスジェニックアラビドプシスの油含有量は、DHA含有量と負で相関していることが分かった。種子の重量あたりのDHA量は、約14%DHAを有する種子と比較して、約9%のDHA量を有する形質転換種子でより高かった。これがアラビドプシス以外の種子にもあてはまるかどうかはまだ測定されていない。
上記のバイナリーベクターpJP3416−GA7を、A.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を用いてC.サティバ(カメリナサティバ)顕花植物を処理した(LuおよびKang、2008)。植物の成長および成熟後、処理した植物のT1種子を回収し、土壌に播き、得られた植物を除草剤BASTAで噴霧することで処理し、pJP3416−GA7のT−DNA上に存在するbar選択マーカー遺伝子のトランスジェニックであり、pJP3416−GA7のT−DNA上に存在するbar選択マーカー遺伝子を発現していた植物を選択した。除草剤に耐性を持ち、生き残ったT1植物を、自家受精させた後に成熟するまで成長させ、得られたT2種子を回収した。5つのトランスジェニック植物が得られ、そのうち3つのみが全体のT−DNAを含んでいた。
単一ベクターを用いたB.ナプス(セイヨウアブラナ)形質転換および脂肪酸組成の分析
バイナリーベクターpJP3416−GA7を使用して、形質転換セイヨウアブラナ植物およびその植物からの種子を作製した。標準的なエレクトロポレーション手法を介して、上記のベクターpJP3416−GA7をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に導入した。トランスジェニックアグロバクテリウム細胞の培養物を、150rpmでの振動を伴って、28℃のLB培地で一晩成長させた。細菌細胞を5分間の4000rpmでの遠心分離によって回収し、Winans AB培地(Winans、1988)で洗浄し、10mLのWinans AB培地(pH5.2)に再懸濁し、カナマイシン(50mg/L)、リファンピシン(25mg/L)および100μΜアセトシリンゴンの存在下で一晩成長を続けた。ブラシカ細胞の感染の2時間前に、スペルミジン(120mg/L)を添加し、細菌の最終密度を新しいAB培地で0.3〜0.4のOD600nmまで調節した。1/2MS(MurashigeおよびSkoog、1962)で成長した8日目のセイヨウアブラナ実生から新たに単離した子葉柄または1mg/Lのチジアズロン(TDZ)および0.1mg/Lのα−ナフタレン酢酸(NAA)を伴うMS培地上で3〜4日で事前に条件を整えた胚軸断片を、10mLのアグロバクテリウム培養物で5分間感染した。アグロバクテリウムで感染した外植片を次いで滅菌フィルター紙にブロットして余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤(L−システイン50mg/Lおよびアスコルビン15mg/L)を添加した、または添加していない、同時培養培地(1mg/LのTDZ、0.1mg/LのNAAおよび100μΜアセトシリンゴンを伴うMS培地)に移した。全プレートをパラフィルムで密封し、23〜24℃の暗所で48時間インキュベートした。
B.ナプスの別の実験において、および、導入遺伝子を導入するための代替形式として、国際公開第2010/057246号に記載されるバイナリーベクターpJP3115およびpJP3116を使用して、形質転換B.ナプス植物を別々に作製し、形質転換種子をその植物から得た。pJP3115上のT−DNAは、クレピス・パレスチナ(Crepis palestina)Δ12デサチュラーゼ、ミクロモナス・プシラΔ6デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ6エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ5デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子を含み、pJP3116上のT−DNAはペルリア・フルテスケンス(Perilla frutescens)Δ15デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ5エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ4デサチュラーゼを含んでいた。2つのT−DNAは、一緒に存在し、発育中の種子に発現された場合、内因的に生産されたオレイン酸からDHAを生産するための7遺伝子経路を形成した。これらのベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に、標準的なエレクトロポレーション手法で導入し、形質転換した細胞を独立して使用し、上記の方法を用いてB.ナプスを形質転換し、安定的に形質転換したT0植物を作製した。29のpJP3115および19のpJP3116形質転換体を得て、これらの植物を成熟するまで成長させ、自家受精の後に得られた種子を、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。pJP3115のT−DNAでの形質転換は、内因的に生産されたALAからのEPA生産につながると予測された一方で、pJP3116のT−DNAでの形質転換はLAからのALA生産増大につながると予測された。これらの表現型を示す植物を複数同定した。事象の大部分は、低量のEPA生産を伴うΔ12不飽和化のために、低下したOA/増大したLA表現型を示した。最大2.6%のEPAがpJP31115トランスジェニック種子プールで観察された。同様に、pJP3116事象の大部分はΔ15デサチュラーゼ活性のために増大したALA表現型を有することが分かった。最大18.5%のALAがpJP3116のT−DNAで形質転換したプール種子で発見された。
B.ナプスでのDHA生産量を実施例4に記載される量を超えて改善するために、バイナリーベクターpJP3416−GA7−modA、pJP3416−GA7−modB、pJP3416−GA7−modC、pJP3416−GA7−modD、pJP3416−GA7−modEおよびpJP3416−GA7−modFを次のように作製した。これらのバイナリーベクターは、実施例2に記載されたpJP3416−GA7構築物の変異形であり、特にΔ6デサチュラーゼおよびΔ6エロンガーゼ機能を改善することで、植物種子でのDHAの合成をさらに増大するように設計した。Δ5エロンガーゼと比べて比較的低い伸長効率のために、GA7構築物で形質転換したある種子では、SDAが蓄積されるのが観察されていたので、他の改変の中で、2つのエロンガーゼ遺伝子配置をT−DNAで交換した。
種子特異的プロモーターの制御下である種子中の遺伝子構築物の発現を予測する迅速アッセイシステムを作るために、体細胞胚システムをセイヨウアブラナに準備した。これには、体細胞胚形成の開始に関わるLEC2転写因子を発現するベクターが使用された。実演として、バイナリーベクター35S:LEC2およびpJP107(Petrie et al.、2010aおよびb)をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に標準的なエレクトロポレーションを介して導入し、そのアグロバクテリウム形質転換体を使用して同時培養によってセイヨウアブラナを同時形質転換した。pJP107のT−DNA領域はイソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)Δ9エロンガーゼ、P.サリナΔ8デサチュラーゼおよびP.サリナΔ5デサチュラーゼをコードする遺伝子を含んでおり、各遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現された。対照形質転換には35S:LEC2ベクターが単独で用いられた。35S:LEC2発現は、実施例1に記載される形質転換B.ナプスカルス組織に直接由来する組織培養物での体細胞胚の形成につながった。
形質転換A.タリアナ種子のTAG上のDHAの位置分布をNMRで決定した。およそ200mgの種子から、初めにそれらをヘキサン下でつぶし、つぶした種子を、10mLヘキサンを含むガラス管に移すことで、全ての脂質を抽出した。管をおよそ55℃の水浴内で温め、次いで撹拌および遠心分離した。ヘキサン溶液を除去し、その手順をさらに4×10mLで繰り返した。抽出物を1つにまとめ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、ヘキサン中20mLの7%ジエチルエーテルを用いた短いシリカカラムを通過させることで、抽出脂質内のTAGを極性脂質から精製した。精製TAG上のアシル基の位置分布を以前に説明された通り量的に決定した(Petrie et al.、2010aおよびb)。
GA7遺伝子構築物を用いた、15%量でのアラビドプシス種子のDHAの効率的な生産を実施例2で実証した。セイヨウアブラナ種子における同じ構築物は、主にこの種のGA7のΔ6でサンチュラーゼ遺伝子の不十分な発現のために、形質転換体の多く(全てではない)で約1.5%のDHAしか生産しなかった(実施例4)。GA7構築物の改変はΔ6デサチュラーゼ遺伝子発現問題を克服するであろうという認識に基づいて(実施例5を参照、実施例6で実証された)、計算を実施し、JP3416−GA7の変異形から遺伝子を発現すし、ここで、各導入遺伝子をコードした酵素が、GA7構築物を有するA.タリアナで観察されたのと同じくらい効率的に作用していたB.ナプストランスジェニック種子の、あり得る脂肪酸プロフィールを決定した。3つの計算に対して予測される脂肪酸組成(#1、#2、#3)が表20に示される。これは、59%オレイン酸、20%LAおよび8%ALAを含んでいたB.ナプスに関する野生型(非形質転換)脂肪酸組成に基づいた。表の下半分に示される3つの予測された部分的脂肪酸プロフィールは、表の上半分で示される各酵素的工程の転換効率に基づいた。予測#2では、75%効率のΔ12不飽和化、75%のΔ15不飽和化、35%のΔ6不飽和化、80%のΔ6伸長化、90%のΔ5不飽和化、90%のΔ5伸長化および90%のΔ4不飽和化の組み合わせが、一般的なキャノーラトランスジェニック種子でのおよそ10%のDHAの生産につながるであろう。これらの効率は全て、アラビドプシスで見られるそれぞれの効率より低いまたはほぼ同じであったため、予測#2は控えめな推定を意味した。#3に列挙される転換効率は、pJP3416−GA7で形質転換したA.タリアナで見られる効率的な転換に基づいた概算である。DHAは、B.ナプスで生産される種子油の総脂肪酸含有量の約15%で生産されると予測され、A.タリアナで観察された最も効率的な生産量を反映した結果であった。ホモ接合状態での複数のT−DNAの挿入は、B.ナプスでDHA量を20%まで増やすと期待される。
バイナリーベクター構築
葉組織でのEPAの合成のための植物へのT−DNA導入のために、バイナリーベクターpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片(配列番号8)を設計した。このバイナリーベクターは、酵素:M.プシラΔ6デサチュラーゼ(配列番号16)、P.コルダタΔ6エロンガーゼ(配列番号:25)およびP.サリナΔ5デサチュラーゼ(配列番号30)をコードするキメラ遺伝子を含んでおり、それぞれは、CaMV35SおよびA.タリアナRubisco小サブユニット(SSU)プロモーターの制御下であった(図9)。配列番号2の領域199〜10878を合成し、これをBsiWIおよびKasI部位で受容バイナリーベクターpORE04(Coutu et al.、1997)内にクローニングすることで、バイナリーベクターを作製した。3つの脂肪酸生合成遺伝子は、ALA、18:3Δ9、12、15からEPA、20:5Δ5、8、11、14、17に変換するのに必要な酵素をコードした。
構築物が正しく、葉組織で効率的に遺伝子を発現することを試験するために、キメラベクターpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片をA.ツメファシエンス株AGL1に導入した。キメラベクター35S:p19もA.ツメファシエンス株AGL1に実施例1で説明された通り導入した。これらの培養物からの細胞を、24℃の成長室でベンサミアナタバコ植物の葉組織内に浸潤させた。同じ葉の両面に位置する比較中の試料に、複数の直接比較物を湿潤させた。実験は3通りで実施された。浸潤に続いて、実施例1に説明されるGCによる脂肪酸プロフィール分析のために葉ディスクを取り出す前に、植物をさらに5日間成長させた。GC分析によって、EPAベクターはベンサミアナタバコ葉で機能してEPAを生産し(表21)、最も高い量のEPAは総葉脂質の10.7%であったことが明らかになった。
キメラベクターpORE04+11ABGBEC_ササゲ_EPA_挿入断片を使って、ニコチアナ・タバカムを安定に形質転換した。ベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に標準的なエレクトロポレーション手法を介して導入した。形質転換した細胞を、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(25mg/L)を添加した固相LB培地で成長させ、28℃で2日間インキュベートした。単一のコロニーを用いて新しい培養を開始した。48時間の活発な培養に続いて、細胞を2,000x gでの遠心分離によって回収し、上澄みを除去した。細胞を50%LBおよび50%MS培地をOD600=0.5の密度で含む新しい溶液に再懸濁した。
キメラベクターpORE04+11AB GBEC−ササゲ−EPA−挿入断片をササゲ(ビグナ・ウンギクラタ)に次の通りに形質転換した。成熟した乾燥種子が好ましい出発材料であるが、種子が最大新鮮重量である未熟なさやから回収した種子を使用してもよい。乾燥種子を手で脱穀し、種子の皮が破けるのを避け、したがって、微生物との混入を低減する。
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、150mg/lのジチオスレイトールおよび0.4g/lのL−システインを含むMS塩基性培地)に再懸濁する。メスで分裂領域に傷をつけてから、外植片を振らずに細菌懸濁物に1時間浸す。処理した外植片を次いで滅菌フィルター紙上にブロットし、フィルター紙をかけた固定培地2(0.8%寒天を含む培地1)に移す。同時培養の4日後、発芽および形質転換した芽の選択のために、外植片を培地3(100mg/lのミオイノシトール、150mg/lのチメンチン、30g/Lのスクロース、3mMのMES、1.7mg/LのBAP、5mg/LのPPTまたは25〜50mg/Lのジェネテシンまたは150mg/Lのカナマイシン、0.8g/Lの寒天を添加し、pH5.6に調節した全強度MS培地)に移す。2週間後、初めの芽が見られる。子葉を子葉節領域から取り除き、培養物を新しい培地3に移す。死組織および瀕死の組織の除去に続いて、2週間ごとに培養物を新しい培地3に移す。初めの4つの継代培養物はカナマイシン選択上にあり、続いてジェネテシンおよびカナマイシンと交互にする。6継代培養後、生き残った若芽を、芽伸長のために、培地4(BAPを含まないが0.5mg/lのGA3、50mg/lのアスパラギン、0.1mg/lの3−インドール酢酸(IAA)、150mg/lのチメンチンおよびPPT(10mg/1)、ジェネテシン(50mg/L)またはカナマイシン(150mg/L)のいずれかを添加した培地3)に移す。それぞれの芽が1cmの長さを超えるまで芽を2週間ごとに継代培養する。選択下でのさらなる成長のために、より大きなこれらの芽をペトリ皿から培養瓶(高さ80mm)に移す。
バイナリーベクター作製
一連のキメラΔ12デサチュラーゼ遺伝子を試験および比較する試みとして、複数のバイナリーベクターを作り、これらを使用してA.タリアナおよびB.ナプスを形質転換した。バイナリーベクターpJP3365、pJP3366、pJP3367、pJP3368およびpJP3369はそれぞれ、P.パストリスω3デサチュラーゼ(配列番号12)およびM.プシラΔ6デサチュラーゼ(配列番号16)酵素、および一連のΔ12デサチュラーゼの1つを含んでいた。Δ12デサチュラーゼはクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcusneoformans)(pJP3365において受託番号XP_570226)由来であり、遺伝子活性を増大する試みとしてL151M突然異変(pJP3366において)、ラカンセア・クルイベリ(pJP3367において配列番号10)、シネコシスティスPCC6803(pJP3368において受託番号BAA18169)およびクレピス・パラエスチナ(Crepis palaestina)(pJP3369において受託番号CAA76157、Lee et al.、1998)を含んだクリプトコッカス・ネオフォルマンスΔ12デサチュラーゼのバージョンである。クレピスデサチュラーゼはこの一連の中で唯一の植物デサチュラーゼであり;他は真菌酵素であった。野生型であったクレピス・パレスチナΔ12デサチュラーゼを除いた、各Δ12デサチュラーゼのための植物コドン最適化タンパク質コード領域を、FP1プロモーターに操作可能に結合して各デサチュラーゼの種子特異的発現を提供する配向で、ベクターpJP3364のNotI部位に挿入することで、ベクターを作った(図12参照)。ベクターpJP3364は、それぞれが種子特異的プロモーターの制御下にあるP.パストリスω3デサチュラーゼおよびM.プシラΔ6デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子をすでに含んでいた(図12)。3つの脂肪酸生合成酵素、すなわちΔ12デサチュラーゼ、ω3デサチュラーゼおよびΔ6デサチュラーゼの組み合わせを、オレイン酸(18:1Δ9)からSDA(18:4Δ6、9、12、15)に変換する経路を構築するよう設計した。したがって、アッセイを実行し、形質転換種子のSDA生産量を測定した。
キメラバイナリーベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用してfad2変異体A.タリアナ植物を形質転換した(CloughおよびBent、1998)。成熟後、処理した植物のT1種子を回収し、各キメラベクターのT−DNA上に存在するNptII選択マーカー遺伝子を有する小植物の選択のために、カナマイシンを含むMSプレート上にプレート化した。生き残ったT1実生を土壌に移した。植物を自家受精させ、成熟するまで成長させた後、これらの植物からのT2種子を回収し、種子脂質の脂肪酸組成をGCによって分析した。
バイナリーベクターの構築
国際公開第2010/057246号で、植物の種子における導入遺伝子発現を増大させるためのサイレンシング抑制因子タンパク質(SSP)の使用が説明される。そのようなタンパク質が、複数の世代にわたって
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のLC−PUFAの生産を強化および安定させ得ることを実証するために、複数のSSP、すなわち、V2(受託番号GU178820.1)、p19(受託番号AJ288943.1)、p38(受託番号DQ286869.1)およびP0PE(受託番号L04573.1)を試験のために選択した。p19は、トマトブッシースタントウイルス(TBSV)由来の抑制因子タンパク質であり、これは、21個のヌクレオチドの長さのsiRNAが相同RNAのアルゴノート誘導切断を誘導する前に、21個のヌクレオチドの長さのsiRNAに結合する(Voinnet et al.、2003)。トマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)由来の抑制因子タンパク質であるV2は、ssRNA基質から二本鎖RNA中間体を生成するのに必要であると考えられるタンパク質である(Beclin et al.、2002)、植物タンパク質SGS3に結合し(Glick et al.、2008)、または、5’オーバーハングを有するdsRNA構造に結合する(Fukunaga et al.、2009)。p38は、ダイサーまたはアルゴノートタンパク質に結合することによって植物サイレンシングメカニズムに干渉する、ターニップクリンクルウィルス(TCV)由来の抑制因子タンパク質である(Azevedo et al.、2010)。ポレロウイルス由来の、P0PEおよびRPV−P0といったP0タンパク質は、強化した分解のためにアルゴノートタンパク質を標的とする(Baumberger et al.、2007;Bortolamiol et al.、2007、Fusaro et al.、2012)。したがって、LA(18:1Δ9、12)からARA(20:4Δ5、8、11、14)への生産のための一連の脂肪酸生合成遺伝子と組み合わせて、植物種子でのこれらSSPの発現のために、遺伝子構築物を次のように調製した。
その種子脂質において高いリノール酸量を有するfad2/fae1二重変異体である、アラビドプシスの遺伝子型MC49を形質転換するために、フローラルディップ方法によって(CloughおよびBent、1998)、6つの各構築体pFN045〜pFN050で個別に形質転換したA.ツメファシエンス株GV3101で、植物を処理した。処理した植物を成熟するまで成長させ、それらから回収したT1種子を、カナマイシンを含むMS培地上にプレートし、形質転換したT1種子を選択した。種子のGFP発現のスクリーニングも、形質転換T1種子のための視覚的なマーカーとして使用した。MS/Kanプレート上に生き残った、または、GFP陽性種子から得た実生を土壌に移し、T2種子のために成熟まで成長させた。得られた形質転換植物の数は、pFN045、pFN046、pFN047、pFN048、pFN049およびpFN050との形質転換でそれぞれ5、14、32、8、23および24であった。この段階で、pFN046にp38をコードする遺伝子は機能的ではないことが分かり、したがって、ベクターpFN046で形質転換した植物を追加対照、すなわち、pFN050と基本的に同じであると見なした。
オーストラリアの商業的供給源から購入した12個の植物油試料の植物ステロールを、実施例1に記載される通り、GCおよびGC−MS分析によってO−トリメチルシリルエーテル(OTMSi−エーテル)として特徴づけた。保持データ、質量スペクトルの解釈ならびに文献および実験室標準質量スペクトルとの比較によってステロールを同定した。ステロールを、5β(H)−コラン−24−オール内部標準の使用によって定量化した。基本的な植物ステロール構造および同定ステロールのいくつかの化学構造が図19および表25に示される。
本発明者らは、TAGのsn−2位置でのDHA蓄積は、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)をGA7構築物またはその変異形によって提供されるようなDHA生合成経路と一緒に同時発現することで増加し得ることを考察した。好ましいLPAATは、多価不飽和C22脂肪アシル−CoAに基質として作用するものであり、内因性LPAATに比べ、PAを形成するLPAのsn−2位置での多価不飽和C22鎖の挿入の増加につながる。細胞質LPAAT酵素はしばしば、特にその種がTAGにて異常な脂肪酸を合成および蓄積する場合、様々な基質の好みを示す。リムナンテス・ダグラシー(Limnanthes douglasii)由来のLPAAT2は、PA合成のためにエルコイル−CoA(C22:1−CoA)を基質として用いることが示され、これは、C22基質を使用し得ない同じ種由来のLPAAT1とは対照的であった(Brown et al.、2002)。
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Claims (85)
- エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに、任意にステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である、抽出植物脂質。
- 以下の特徴:
i)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約2%から18%の間、または約2%から16%の間、または約2%から15%の間である、
ii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸(C14:0)のレベルは、6%未満、または3%未満、または2%未満、または1%未満である、
lxvii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、または約6%から約30%の間、または1%から約20%の間、または約30%から約60%の間、または約45%から約60%、または約30%である、
lxviii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸(LA)のレベルは、約4%から約35%の間、または約4%から約20%の間、または約4%から17%の間である、
lxix)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸(ALA)のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、または約10%から約35%の間、または約20%から約35%の間、または約4%から16%の間、または約2%から16%の間である、
lxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸(GLA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸(SDA)のレベルは、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約5%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、または約0.05%から約2%の間である、
lxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間である、
lxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸(EPA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸(DPA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から8%の間、0.05%から5%の間、または0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間である、
lxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約8%から20%の間、約10%から20%の間、約11%から20%の間、約10%から約16%の間、または約14%から20%の間である、
lxxvii)前記脂質は、その脂肪酸含有量にω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含む、
lxxviii)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω6‐ドコサぺンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を実質的に含まない、
lxxix)前記脂質は、その脂肪酸含有量に、SDA、EPA、およびETAを実質的に含まない、
lxxx)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約25%の間、または約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、約4%から約60%の間、約30%から約60%の間、または約45%から約60%の間である、
lxxxi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約4%から約35%の間、または約8%から約25%の間、または8%から約22%の間である、
lxxxii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約20%から約75%の間、または約50%から約75%の間、または約60%から約75%の間である、
lxxxiii)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸のレベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間である、
lxxxiv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、約0.5%から約8%の間、または約0.5%から4%の間である、
lxxxv)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸のレベルは、36%から約65%の間、40%から約60%の間、約20%から約35%の間、約10%から約20%の間、約25%、約30%、約35%、または約40%である、
lxxxvi)前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸のレベルは、9%から約33%の間、約10%から約20%の間、約20%から約30%の間、約12%から約25%の間、約13%、約15%、約17%、または約20%である、
lxxxvii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0、約0.1、または約0.2である、
lxxxviii)前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.1、約0.2、または約1.0である、
lxxxix)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間の、Δ12‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のLAへの転換の効率に基づく、
xc)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の、Δ6‐デサチュラーゼによる、ALAのSDAへの転換の効率に基づく、
xxci)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間の、Δ6‐エロンガーゼによる、SDAのETA酸への転換の効率に基づく、
xcii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間の、Δ5‐デサチュラーゼによる、ETAのEPAへの転換の効率に基づく、
xciii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ5‐エロンガーゼによる、EPAのDPAへの転換の効率に基づく、
xciv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の、Δ4‐デサチュラーゼによる、DPAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcv)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間の、オレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xcvi)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間の、LAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcvii)前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間のALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xcviii)前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、C20:1を1%未満有する、
xcix)前記脂質の前記トリアシルグリセロール(TAG)含有量は、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間であり、
c)前記脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含む、
ci)前記脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満、または約0.001%から約5%の間の、遊離(非エステル化)脂肪酸および/もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
cii)TAGの形態でエステル化されたDHAの少なくとも70%または少なくとも80%が、前記TAGのsn‐1またはsn‐3の位置にある、
ciii)前記脂質において最も豊富なDHA含有TAGの種は、DHA/18:3/18:3(TAG58:12)である、
civ)前記脂質は、トリ‐DHA TAG(TAG66:18)を含む、の1もしくはそれ以上、または全てを有する請求項1の脂質。 - オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約95%から約98%の間が前記脂質である、請求項1または請求項2の脂質。
- 1またはそれ以上のステロールをさらに含む、請求項1から3のいずれか1つの脂質。
- オイルの形態であって、約10mgのステロール/gのオイル未満、約7mgのステロール/gのオイル未満、約1.5mgから約10mgの間のステロール/gのオイル、または約1.5mgから約7mgの間のステロール/gのオイルを含む請求項4の脂質。
- カンペステロール/24‐メチルコレステロール、Δ5‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール/24‐エチルコレステロール、Δ5‐アベナステロール/イソフコステロール、Δ7‐スチグマステロール/スティグマスト‐7‐エン‐3β‐オールおよび、Δ7‐アベナステロールの1もしくはそれ以上、または全てを含む請求項4または請求項5の脂質。
- 約0.5mgのコレステロール/gのオイル未満、約0.25mgのコレステロール/gのオイル未満、約0mgから約0.5mgの間のコレステロール/gのオイル、もしくは約0mgから約0.25mgの間のコレステロール/gのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない、請求項4から6のいずれか1つの脂質。
- 前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである、請求項1から7のいずれか1つの脂質。
- 前記脂質は、アブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレオイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシスオイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアングスティフォリウスオイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバオイル、クランベアビシニカオイル、ミスカンサスxギガンティウスオイル、またはススキオイルである、請求項8の脂質。
- i)脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)およびエイコサテトラエン酸(ETA)の1またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
ii)前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは、約7%から20%である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセス。 - 前記抽出脂質は、請求項2から9に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、請求項10のプロセス。
- 前記植物部分が、種子、好ましくは油料種子である、請求項10または請求項11のプロセス。
- 前記種子が、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバの種子である、請求項12のプロセス。
- 種子1グラム当たり、少なくとも約18mg、少なくとも約22mg、少なくとも約26mg、約18mgから約100mgの間、約22mgから約70mgの間、または約24mgから約50mgの間のDHAを、前記種子が含む、請求項12または請求項13のプロセス。
- 前記植物部分は、以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードし、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、1またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項10から14のいずれか1つのプロセス。 - 前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約95%の間、約70%から約90%の間、または約75%から約85%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約91%の間、または約80%から約91%の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換する、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ALAをSDAに転換する、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約80%の間、または約75%から約80%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、SDAをETAに転換する、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約95%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、ETAをEPAに転換する、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の間、約50%から約90%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、EPAをDPAに転換する、
viii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約93%、約50%から約95%の間、約80%から約95%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1またはそれ以上の植物の細胞において、DPAをDHAに転換する、
ix)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間である、
x)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのLAの転換の効率が、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間である、
xi)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞における、DHAへのALAの転換の効率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間である、
xii)前記植物部分の1またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約15%から約30%の間、または約22.5%から約27.5%の間で多いω3脂肪酸を含む、
xiii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、、リノール酸(LA)に対してα‐リノレン酸(ALA)を優先的に不飽和化する、
xiv)前記Δ6‐エロンガーゼは、また、Δ9‐エロンガーゼ活性を有する、
xv)前記Δ12‐デサチュラーゼは、また、Δ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvi)前記Δ6‐デサチュラーゼは、また、Δ8‐デサチュラーゼ活性を有する、
xvii)前記Δ8‐デサチュラーゼは、また、Δ6‐デサチュラーゼ活性を有する、またはΔ6‐デサチュラーゼ活性を有していない、
xviii)前記Δ15‐デサチュラーゼは、また、GLAでω3‐デサチュラーゼ活性を有し、
xix)前記ω3‐デサチュラーゼは、また、LAでΔ15‐デサチュラーゼ活性を有する、
xx)前記ω3‐デサチュラーゼは、両方のLAおよび/またはGLAを不飽和化する、
xxi)前記ω3‐デサチュラーゼは、、LAに対してGLAを優先的に不飽和化する、
xxii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、約10%から約50%の間、約15%から約30%の間、または約20%から約25%の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のDHAへの転換の効率に基づく、
xxiii)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、約15%から約60%の間、約20%から約40%の間、または約22%から約30%の間の、前記植物部分におけるLAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxiv)前記植物部分における前記DHAのレベルは、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、約17%から約65%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間の、前記植物部分におけるALAのDHAへの転換の効率に基づく、
xxx)1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐PC基質よりもアシル‐CoA基質で、より高い活性を有する、
xxxi)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、LAよりもALAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高いΔ6‐デサチュラーゼ活性を有する、
xxxiii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、基質としてのALAで、LAと比較して、少なくとも約2倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくとも4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有する、
xxxiv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、より高い活性を有する、
xxxv)前記Δ6‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn‐2位置に結合するALAよりも、脂肪酸基質としてのALA‐CoAで、少なくとも約5倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有する、
xxxvi)前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
xxxvii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAで、検出可能なΔ5‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する請求項15のプロセス。 - 前記植物部分が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、配列番号10で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、配列番号12で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、配列番号16で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号16と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
iv)前記Δ6‐エロンガーゼが、配列番号25で規定される配列を有するアミノ酸、配列番号26のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号25および/または配列番号26と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
v)前記Δ5‐デサチュラーゼが、配列番号30で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号30と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vi)前記Δ5‐エロンガーゼが、配列番号37で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号37と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
vii)前記Δ4‐デサチュラーゼが、配列番号41で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号41と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列を含む、
の1もしくはそれ以上、または全てを有する、請求項15または請求項16のプロセス。 - 前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1‐アシル‐グリセロール‐3‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ(LPAAT)好ましくはC22多価不飽和脂肪族アシル‐CoA基質を使用し得るLPAAT、アシル‐CoA:リソホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスホリパーゼA2(PLA2)、ホスホリパーゼC(PLC)、ホスホリパーゼD(PLD)、CDP‐コリンジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(CPT)、ホスファチジル(phoshatidyl)コリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)、ホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ(PDCT)、アシル‐CoAシンターゼ(ACS)、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項15から17のいずれか1つのプロセス。
- 前記植物部分が、FAE1、DGAT、MGAT、GPAT、LPAAT、LPCAT、PLA2、PLC、PLD、CPT、PDAT、FATBのようなチオエステラーゼ、またはΔ12‐デサチュラーゼ、または2つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および/または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項10から18のいずれか1つのプロセス。
- 少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項15から19のいずれか1つのプロセス。
- 少なくとも1つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニンのような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られた、請求項20のプロセス。
- 前記Δ4‐デサチュラーゼおよび前記Δ5‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモーターが前記Δ12‐デサチュラーゼおよび前記ω3‐デサチュラーゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける、請求項15から21のいずれか1つのプロセス。
- 前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるDNA分子、好ましくはT‐DNA分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなDNA分子の数は、1、2もしくは3以下であり、または2もしくは3である、請求項15から22のいずれか1つのプロセス。
- 前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ6‐デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも2つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項23のプロセス。
- 前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または約50%から約80%の間である、請求項15から24のいずれか1つのプロセス。
- 前記脂質は、オイル、好ましくは油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の重量の少なくとも約90%、または少なくとも約95%、少なくとも約98%、または約95%から約98%の間がトリアシルグリセロールである、請求項10から25のいずれか1つのプロセス。
- 前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記DHAのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む、請求項10から26のいずれか1つのプロセス。
- 前記処理がエステル交換反応である、請求項27のプロセス。
- 請求項10から28のいずれか1つのプロセスを用いて産生された、脂質または該脂質を含むオイル。
- 単一のDNA分子に全て共有結合で結合される、第1の遺伝子、第2の遺伝子、第3の遺伝子、第4の遺伝子、第5の遺伝子、および第6の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子コンストラクトであって、
第1、第2、および第3の遺伝子が第1の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第4、第5、および第6の遺伝子が第2の遺伝子クラスターとしてともに結合され、
各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、および転写ターミネーター、および/またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記DNA分子が3、4、5、または6つの異なるプロモーターを含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、1もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性であり、
前記第1の遺伝子の転写の方向が、前記第3の遺伝子から離れており、前記第3の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第4の遺伝子の転写の方向が、前記第6の遺伝子から離れており、前記第6の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第2の遺伝子の転写の方向が、前記第1の遺伝子または前記第3の遺伝子と同じであり、
前記第5の遺伝子の転写の方向が、前記第4の遺伝子または前記第6の遺伝子と同じであり、
前記第2の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第1のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第1または第3の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約1.0から約10.0キロベースの間の第2のスペーサー領域により前記第1の遺伝子クラスターが第2の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第5の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域が、約0.2から約3.0キロベースの間の第3のスペーサー領域により、より近いいずれかの、第4または第6の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く、キメラ遺伝子コンストラクト。 - 前記DNA分子が、約1.0から約10.0キロベースの間のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第1の遺伝子クラスターまたは前記第2の遺伝子クラスターから間隔を置く第7の遺伝子を含む、請求項30の遺伝子コンストラクト。
- 前記DNA分子が、2つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび/またはポリアデニル化領域を含む、請求項30または請求項31の遺伝子コンストラクト。
- 少なくとも1つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域(MAR)を含む、請求項30から32のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
- 前記DNA分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつT‐DNA分子である、請求項30から33のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
- アグロバクテリウム細胞である、または植物細胞のゲノムに組み込まれる、請求項30から34のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
- 少なくとも1つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコードする、請求項30から35のいずれか1つの遺伝子コンストラクト。
- 請求項15に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および/または請求項16または17に定義される酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項36の遺伝子コンストラクト。
- i)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および/または
ii)配列番号1から9、11、14、18、22、23、28、34、35、39、または45に示される1またはそれ以上の配列と、少なくとも95%同一または99%同一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および/または外因性ポリヌクレオチド。 - 請求項38のポリヌクレオチドおよび/または請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクト。
- 配列番号11、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45のいずれか1つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号11、14、18、22、23、28、34、35、39、もしくは45で示される1もしくはそれ以上の前記配列と少なくとも95%同一もしくは99%同一である前記ヌクレオチドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される、請求項39のベクターまたは遺伝子コンストラクト。
- 以下のセットの酵素:
i)ω3‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
ii)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
iv)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
v)ω3‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vi)Δ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
vii)Δ12‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
viii)Δ12‐デサチュラーゼ、ω3‐デサチュラーゼもしくはΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、
の1つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。 - 請求項1から9のいずれか1つに定義される脂質を含み、または1もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、請求項16または請求項17に定義される1またはそれ以上の特徴を有する、請求項41の細胞。
- i)配列番号10に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ12‐デサチュラーゼをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号10と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列と、
ii)配列番号12に規定される配列を有するアミノ酸を含むω3‐デサチュラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号12と少なくとも50%同一であるアミノ酸配列とを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができる1またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される、宿主細胞。 - 1またはそれ以上の請求項38の前記ポリヌクレオチド、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、または請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
- 植物における、植物部分におけるものである、および/または成熟した植物種子の細胞である、請求項41から44のいずれか1つの細胞。
- 前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である、請求項45の細胞。
- 請求項41から46のいずれか1つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
- トランスジェニック植物である、請求項47のトランスジェニック非ヒト生物。
- a)その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含み、および
b)以下のセットの酵素:
i)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/または真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ6‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、または
ii)Δ12‐デサチュラーゼ、真菌のω3‐デサチュラーゼ、および/もしくは真菌のΔ15‐デサチュラーゼ、Δ8‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、Δ9‐エロンガーゼ、およびΔ5‐エロンガーゼ、の1つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように1またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)およびγ‐リノレン酸(GLA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)、ならびに任意にエイコサペンタエン酸(EPA)および/またはエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルは約7%から20%である、油料種子植物。 - 前記植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、またはシロイヌナズナ植物である、請求項49の植物。
- 1またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐CoA基質を使用することができる、請求項49または請求項50の植物。
- 1またはそれ以上の前記Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐CoA基質を用いることができ、好ましくは、i)Δ6‐デサチュラーゼ、Δ5‐デサチュラーゼ、およびΔ4‐デサチュラーゼ、またはii)Δ5‐デサチュラーゼ、Δ4‐デサチュラーゼ、およびΔ8‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐CoA基質を用いることができる、請求項51の植物。
- 前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgのDHA含有量を有する、請求項49から52のいずれか1つの植物。
- DHAを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物であって、
前記植物の成熟した、収穫された種子は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgのDHA含有量を有する植物。 - 前記外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項49から54のいずれか1つの植物の植物細胞。
- 以下の特徴:
i)請求項48から54のいずれか1つの植物由来である、
ii)請求項1から9のいずれか1つに定義される脂質を含む、
iii)請求項10から28のいずれか1つのプロセスで使用され得る、
iv)請求項30から37のいずれか1つの遺伝子コンストラクトを含む、または
v)請求項14、41、または48から52のいずれか1つに定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の1またはそれ以上を有する植物部分、好ましくは種子。 - DHAおよび重量で約4%から約15%の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子であって、
前記種子の前記DHAの含有量は、1グラムの種子あたり少なくとも約28mg、好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約32mg、1グラムの種子あたり少なくとも約36mg、1グラムの種子あたり少なくとも約40mg、より好ましくは1グラムの種子あたり少なくとも約44mg、または1グラムの種子あたり少なくとも約48mgである、種子。 - 請求項1から9のいずれか1つに定義される、1もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む、抽出脂質を産生するために使用され得る、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、または請求項57の前記種子。
- 請求項41から45のいずれか1つの細胞を産生する方法であって、
a)前記細胞、好ましくは、LC‐PUFAを合成することができない細胞に、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、請求項39または請求項40の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、請求項14、41から43、または48から52のいずれか1つに定義される1またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
b)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
c)任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
d)任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、を含む方法。 - 前記細胞における脂質が、1またはそれ以上の請求項1から9に定義される特徴を有する、請求項59に記載の方法。
- 前記遺伝子コンストラクト、前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる、請求項59または請求項60に記載の方法。
- 前記細胞は植物細胞であり、前記方法は、工程a)の前記細胞から形質転換植物を再生する工程をさらに含む、請求項59から61のいずれか1つの方法。
- 前記遺伝子および/または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現される、請求項62の方法。
- 請求項59から63のいずれか1つの方法を用いて産生される細胞。
- 種子を産生する方法であって、
a)好ましくは少なくとも1000のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも1ヘクタールのエリアで、請求項48から54のいずれか1つの植物、または請求項10から28、56、もしくは57のいずれか1つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
b)前記植物の1つまたは複数から種子を収穫することと、
c)任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgDHA/ヘクタールの総DHA収率を有するオイルを産生することと、
を含む、方法。 - 以下の特徴:
i)前記オイルが請求項2、または4から7のいずれか1つに定義される、
ii)前記植物部分または種子が、請求項14、16から19、21から28のいずれか1つのプロセスで使用され得る、
iii)前記外因性ポリヌクレオチドが、請求項30から35のいずれか1つの遺伝子コンストラクトに含まれる、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドは、請求項38の外因性ポリヌクレオチドを含む、
v)前記植物細胞は、請求項43の細胞である、
vi)前記種子は、請求項65の方法で産生された、
の1またはそれ以上を有する、請求項48から57のいずれか1つの前記植物、植物細胞、植物部分、または種子。 - 1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび/もしくは脂肪酸エロンガーゼ、または1もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに1もしくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法であって、
請求項36または請求項37の前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/または外因性ポリヌクレオチド、請求項39または請求項40の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、1またはそれ以上の請求項14、41から43、または48から52のいずれか1つで定義される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを含む方法。 - 請求項10から28のいずれか1つの前記プロセス、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、または請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイル。
- 油料種子のオイルの抽出により得られる、請求項29または請求項68の脂質またはオイル。
- キャノーラオイル(セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種)、マスタードオイル(セイヨウカラシナ)、他のアブラナオイル、ヒマワリ油(ヒマワリ)、亜麻仁油(アマ)、ダイズオイル(ダイズ)、ベニバナオイル(ベニバナ)、コーンオイル(トウモロコシ)、タバコオイル(タバコ)、ピーナッツオイル(ピーナッツ)、パームオイル、綿実油(ワタ)、ココナッツオイル(ココヤシ)、アボカドオイル(アボカド)、オリーブオイル(オリーブ)、カシューオイル(カシューナッツ)、マカダミアオイル(マカダミア)、アーモンドオイル(アーモンド)、またはシロイヌナズナ種子オイル(シロイヌナズナ)である、請求項29、68、または69の脂質またはオイル。
- 請求項10から28のいずれか1つの前記プロセス、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、または請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸。
- 請求項56、57、または66のいずれか1つの種子から得られる種子ミール。
- 1またはそれ以上の、請求項29、もしくは59から51のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または請求項72の前記種子ミールを含む組成物。
- 1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、または請求項73の組成物を含む家畜飼料、化粧品、または化学物質。
- 家畜飼料を産生する方法であって、
1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、または請求項73の前記組成物を、少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む、方法。 - PUFAから利益を得る、症状を治療または防止する方法であって、
対象に、1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、請求項73の前記組成物、または請求項74の前記家畜飼料、を投与することを含む、方法。 - 前記症状は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、AIDS、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意(aggressive hostility)、副腎白質ジストロフィー(adrenoleukodystophy)、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患である、請求項76の方法。
- PUFAから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、1またはそれ以上の、請求項1から9、29、もしくは59のいずれか1つの前記脂質もしくはオイル、請求項62の前記脂肪酸、請求項30から37のいずれか1つの前記遺伝子コンストラクト、請求項38の前記単離および/もしくは外因性ポリヌクレオチド、請求項39もしくは請求項40の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、請求項41から46、もしくは55のいずれか1つの前記細胞、請求項47もしくは請求項48の前記トランスジェニック生物、請求項49から53のいずれか1つの前記油料種子植物、請求項54の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、請求項49もしくは請求項56の前記植物部分、請求項57の前記種子、請求項66の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、請求項72の前記種子ミール、請求項73の前記組成物、または請求項74の前記家畜飼料、の使用。
- 請求項56、57、または66のいずれか1つの種子を得ることと、金銭的利益のために得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法。
- 前記種子を得ることは、請求項48から54、または66のいずれか1つの前記植物を栽培すること、および/または前記植物から前記種子を収穫することを含む、請求項79の方法。
- 前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および/または前記種子を保存することをさらに含む、請求項80の方法。
- 前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む、請求項79から81のいずれか1つの請求項の方法。
- 前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる、請求項79から82のいずれか1つの請求項の方法。
- a)請求項56、57、または66のいずれか1つに定義された種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および/または収穫することと、
b)前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し、および/または選り分けることと、
c)工程b)で分離された前記種子をふるいにかけおよび/またはソートすること、および容器内に前記ふるいにかけられたおよび/またはソートされた種子をロードすることにより、種子の入った容器を産生することを含む、種子の入った容器を産生するプロセス。 - 多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α‐リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸(DHA)、並びに任意に1またはそれ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサぺンタエン酸(DPA)、およびエイコサテトラエン酸(ETA)を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記DHAのレベルが約7%から20%であり、これにより前記エチルエステルを産生する、プロセス。
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