KR20020073580A - 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 - Google Patents

신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020073580A
KR20020073580A KR1020027010216A KR20027010216A KR20020073580A KR 20020073580 A KR20020073580 A KR 20020073580A KR 1020027010216 A KR1020027010216 A KR 1020027010216A KR 20027010216 A KR20027010216 A KR 20027010216A KR 20020073580 A KR20020073580 A KR 20020073580A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
pse
nucleic acid
gene
fatty acid
Prior art date
Application number
KR1020027010216A
Other languages
English (en)
Inventor
에른스트 하인쯔
쏘르스텐 잔크
울리히 자링거
옌스 레르클
안드레아스 렌쯔
Original Assignee
바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2000105973 external-priority patent/DE10005973A1/de
Priority claimed from DE10023893A external-priority patent/DE10023893A1/de
Priority claimed from DE10063387A external-priority patent/DE10063387A1/de
Application filed by 바스프 악티엔게젤샤프트 filed Critical 바스프 악티엔게젤샤프트
Publication of KR20020073580A publication Critical patent/KR20020073580A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5 및 서열 7에 나타낸 서열, 또는 이들의 상동체, 유도체 또는 유사체를 포함하는 신규 연장효소 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 유전자 또는 그의 상동체, 유도체 또는 유사체를 포함하는 유전자 구조물 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열 1, 서열 3, 서열 5 및 서열 7을 포함하는 연장효소 유전자를 포함하거나 또는 이들의 상동체, 유도체 또는 유사체를 포함하는 벡터 또는 유전자전환 생물에 관한 것이다. 본 발명은 연장효소 서열 단독의 용도 또는 추가의 연장효소 및(또는) 추가의 지방산 생합성 유전자의 조합과의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 서열 1을 포함하는 신규 연장효소 유전자 또는 그의 상동체, 유도체 또는 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다가불포화 지방산을 제조하는 방법 및 오일, 특히 불포화 지방산의 함량이 높은 오일을 다량 제조하는 생물에 DNA를 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2개 이상의 이중 결합을 포함하는 다가불포화 지방산을 높은 함량으로 포함하는 오일 및(또는) 지방산의 제조, 및(또는) 2개 이상의 이중 결합을 포함하는 다가불포화 지방산을 높은 함량으로 포함하는 트리아실글리세린의 제조에 관한 것이다.

Description

신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 {Novel Elongase Gene and Method for Producing Multiple-Unsaturated Fatty Acids}
세포내의 자연 발생적인 대사 과정중의 어떤 생성물 및 부산물은 동물 사료 산업, 식품 산업, 화장품 산업 및 제약 산업을 비롯하여 광범위한 산업 분야에서 사용될 수 있다. 일괄하여 "미세 화학물질 (fine chemical)"이라고 부르는 이러한 분자로는 또한 지질 및 지방산이 포함되며, 이들 중 한 종류의 예가 다가불포화 지방산이다. 다가불포화 지방산 (PUFA)은 예를 들어 어린이용 유동식에 첨가되어 영양적 가치를 증대시킨다. 예를 들어, PUFA는 인간의 혈중에서 콜레스테롤 수준에 대하여 긍정적인 효과를 가지며, 따라서 심장병을 예방하는데 적합하다. 미세 화학물질 및 다가불포화 지방산 (PUFA)은 동물성 공급원, 예를 들어 어류 또는 미생물로부터 분리될 수 있다. 이러한 미생물을 배양하여 한가지 이상의 목적하는 분자를 다량으로 제조하여 분리할 수 있다.
PUFA를 제조하는데 특히 적합한 미생물은 트라우스토키트리아 (Thraustochytria) 또는 쉬조키트리아 (Schizochytria) 종 등의 미생물, 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 또는 크립테코디니움 (Crypthecodinium) 종 등의 조류, 스틸로니키아 (Stylonychia) 또는 콜피디움 (Colpidium) 등의 실리아타 (Ciliata), 모르티렐라 (Mortierella), 엔토모프토라 (Entomophthora) 또는 무코르 (Mucor) 등의 진균이 있다. PUFA를 포함하여 일련의 바람직한 화합물을 생산하는 해당 미생물의 많은 변이체 종들이 균주 선별에 의해 발견되었다. 그러나, 어떤 분자의 생산을 증가시키는 종의 선별은 시간이 많이 들고, 어려운 과정이다. 또한, 단지 특정의 불포화 지방산 또는 단지 특정의 지방산종류만이 한정된 미생물에 의해 생산될 수 있다는 것과 같은 단점이 있다.
대안으로서, 미세 화학물질은 적합하게는 상기 언급한 PUFA를 제조하도록 육종된 식물의 재배를 통해 대규모로 제조할 수 있다. 이러한 목적에 특히 충분히 적합한 식물로는 다량의 지질 화합물을 포함하는 오일성 작물, 예를 들어 평지, 카놀라, 아마인, 대두, 해바라기, 보라고 및 달맞이꽃이 있다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명에 언급한 바와 같이, 오일 또는 지질 및 지방산을 포함하는 다른 작물도 충분히 적합하다. 종래의 식물 육종은 광범위한 바람직한 지질 및 지방산, 보조인자 및 효소를 생산하는 일련의 변이체 식물을 발생시켰다. 그러나, 어떤 분자의 생산을 증가시키는 새로운 다양한 식물의 선별은 시간이 많이 들고 어려운 과정이며, 화합물이 해당 식물에서 자연적으로 생산되지 않는 경우, 예를 들어 다가불포화 C2O-지방산, C22-지방산, 및 더 긴 탄소쇄를 갖는 지방산의 경우에는 심지어 불가능하기도 하다.
<발명의 개요>
본 발명은, 불포화 지방산의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하며 이들이 산업적 규모로 제조될 수 있도록 하는 신규 유전자에 대한 큰 수요로 인해, PUFA 생합성의 연장효소 유전자를 확인 및 단리하는데 적합하며, 오일, 지방산, 지질, 지질 유래의 화합물의 변형, 가장 바람직하게는 다가불포화 지방산의 제조에 사용될 수 있는 신규 핵산 분자를 제공한다. 특히, 다가불포화 지방산, 바람직하게는 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산을 연장시킬 수 있는 지방산 생합성 효소가 요구된다. 본 발명에 따른 핵산은 이러한 능력을 갖는 효소를 코딩한다.
파에오닥틸룸, 콜피디움, 모르티렐라, 엔토모프토라, 무코르, 크립테코디니움과 같은 미생물 및 기타 조류 및 진균, 및 식물, 특히 오일류 작물은 일반적으로 산업에서 다수의 미세 화학물질을 산업적 규모로 제조하는데 사용된다.
WO 98/01572 및 WO 00/23604에 개시된 바와 같은 상기 언급한 미생물 및 실리아타, 또는 조류 및 관련 생물, 예를 들어 문헌 (Falciatore et al. [1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251]; 및 Dunahay et al. [1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31:10004-1012] 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌)에 기재된 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 유전적 조작에 있어서 클로닝 벡터 및 기술이 이용될 수 있는 한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 이러한 생물을 재조합 변형시키는데 사용될 수 있으며, 그 결과 이들 생물은 한가지 이상의 미세 화학물질, 특히 불포화 지방산을 더 많이 또는 더 효율적으로 생산하게 된다. 이러한 미세 화학물질의 생산 증가 또는 생산 효율의 증가는 본 발명에 따른 유전자의 조작에 의한 직접적인 영향 또는 이러한 조작으로 인한 간접적인 영향에 의해 유발될 수 있다.
이끼류 및 조류는 상당량의 다가불포화 지방산, 예를 들어 아라키돈산 (= ARA) 및(또는) 에이코사펜타에노산 (= EPA) 및(또는) 도코사헥사에노산 (= DHA)을 생산하는 유일한 공지된 식물계이다. 이끼류는 막 지질중에 PUFA를 포함하지만, 조류, 조류계 생물 및 일부 진균은 또한 트리아실글리세롤 부분내에 상당량의 PUFA를 축적한다. 따라서, 트리아실글리세롤 부분내에 PUFA를 축적하기도 하는 종으로부터 단리된 핵산 분자는 숙주, 특히 미생물, 예를 들어 상기 언급된 미생물, 및 식물, 예를 들어 오일성 작물, 예를 들어 평지, 카놀라, 아마인, 대두, 해바라기, 보라고, 캐스터유 식물, 오일 야자, 잇꽃 (카르타무스 틴크토리우스; Carthamus tinctorius), 코코넛, 땅콩 또는 카카오 콩에서 지질 및 PUFA 생산계를 변형시키는데 특히 적합하다. 또한, 트리아실글리세롤-축적 미생물로부터의 핵산은 해당 생물에서 PUFA 전구체 분자의 생합성을 변화시키는데 적합한 다른 종의 DNA 서열 및 효소를 확인하는데 사용될 수 있다. 트리아실글리세롤내에 ARA, EPA 또는 DHA와 같은 PUFA를 축적하는 미생물로는 특히 크립테코디니움 코니 (Crypthecodinium cohnii) 및 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium) 종이 있다. 트라우스토키트리아 (Thraustochytria)는 또한 계통발생학적 측면에서 쉬조키트리아 (Schizochytria) 종과 밀접한 관련이 있다. 이러한 생물들이 이끼류, 예를 들어 피스코미트렐라 (Physcomitrella)와 밀접한 관련이 없을 지라도, DNA 서열에서의 서열 유사성, 특히 폴리펩티드 수준에서의 서열 유사성은 DNA 분자가 진화적 측면에서 관련성이 적은 생물에서 유래하는 경우에도 이종 혼성화 실험, 서열 배열, 및 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 실험에서 확인, 단리 및 기능적으로 특성화될 수 있는 정도로 관찰될 수 있다. 특히, 세번째 종에서 이종 스크리닝 또는 기능적 보충 및 유전자 기능의 예상에 적합한 컨센서스 서열이 유도될 수 있다. 따라서, 이러한 기능을 확인하는 능력, 예를 들어 효소의 기질 특이성을 예상하는 능력은 상당히 중요할 수 있다. 또한, 이러한 핵산 분자는 관련된 게놈을 맵핑하거나 PCR 프라이머를 유도하기 위한 기준 서열로 작용할 수 있다.
신규 핵산 분자는 본원에서 PUFA-특이적 연장효소 (= PSEs, 또는 단수로는 PSE)로 명명된 단백질을 코딩한다. 이러한 PSE는 예를 들어 지질 또는 지방산 합성, 예를 들어 PUFA에 요구되는 화합물의 대사 (예를 들어, 생합성 또는 분해)에 관여하는 기능, 또는 세포내로 또는 세포로부터 한가지 이상의 지질/지방산 조성물의 막횡단 운반에 관여하는 기능을 수행한다.
이와 같은 새로운 용도는 이러한 신규 연장효소 유전자의 단리를 보다 상세하기 나타낸다. 본 발명자들은 바람직하게는 지방산의 탄소 골격내에 18 또는 20개 이상의 탄소 원자 및(또는) 탄소 쇄내에 2개 이상의 이중 결합을 가지며, 트리아실글리세롤 부분내에 다량의 PUFA를 포함하는 통상의 생물로부터 유도되는 장쇄 다가불포화 지방산을 제조하는데 적합한 연장효소 유전자를 최초로 단리하였다. 이는, 단수로는 PSE 유전자 또는 PSE 단백질, 또는 복수로는 PSE 유전자들 또는 PSE 단백질들을 의미한다. 짧거나 중간 길이 사슬의 포화 지방산의 연장 (WO 98/46776 및 US 5,475,099), 또는 단지 하나의 이중 결합을 갖거나 장쇄 지방산 왁스 에스테르를 생성하는 장쇄 지방산의 연장 또는 생산 (WO 98/54954, WO 96/13582, WO 95/15387)을 보여주는 다른 공지의 특허 문헌 및 간행물들은 기능적으로 활성이 없는 PSE 유전자를 개시하거나 나타낸다. 본 발명은 새로운 특성을 갖는 신규 연장효소의 단리에 대하여 기재하고 있다. 서열 1에 기재된 서열로부터 시작하여, 불포화 지방산을 연장시키는 연장효소를 코딩하는 다른 핵산을 찾아낼 수 있었다.
WO 99/64616, WO 98/46763, WO 98/46764 및 WO 98/46765는 유전자전환 식물에서 PUFA의 생산을 기재하고 있으며, 특히 진균으로부터의 상응하는 불포화효소 (desaturase) 활성의 클로닝 및 기능적 발현을 입증하지만, PSE-코딩 유전자 및 기능적 PSE 활성은 입증하지 못한다. 불포화효소 활성의 발현은 유전자전환 식물에서 지방산 스펙트럼에서의 변화를 일으키지만, 불포화 지방산의 함량 증가는 관찰되지 않았다. C18-탄소쇄를 갖는 트리에노산의 생산이 입증되었고 감마-리놀렌산에 대하여 청구되었지만, 매우 장쇄의 다가불포화 지방산 (C20- 및 더 긴 탄소 사슬을 가지며, 트리에노산 및 이보다 불포화도가 더 높은 유형의 지방산)의 생산은 아직까지 입증된 바 없다.
장쇄 PUFA를 제조하기 위해, 다가불포화 C16- 또는 C18-지방산은 연장효소의 효소 활성에 의해 2개 이상의 탄소 원자에 의해 연장되어야 한다. 본 발명에 따른 서열 1의 핵산 서열은 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16- 또는 C18-지방산을 2개 이상의 탄소 원자에 의해 연장시킬 수 있는 제1의 식물 연장효소를 코딩한다. 1회의 연장 사이클 후에, 이 효소 활성은 C20-지방산을 형성하며, 2회, 3회 및 4회의 연장 사이클 후에는 C22-, C24- 또는 C26-지방산을 생성한다. 보다 장쇄의 PUFA는 개시된 다른 연장효소 (서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11)를 사용하여 합성할 수도 있다. 이들은 개별적으로 또는 복합적으로 사용되거나 또는 예를 들어 이끼류인 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens) 유래의 PUFA 연장효소 (서열 1)와 함께 사용되어 PUFA의 제조를 위한 신규한 방법에서 PUFA의함량을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 연장효소의 활성은 바람직하게는 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합, 바람직하게는 3개 또는 4개의 이중 결합, 특히 바람직하게는 3개의 이중 결합을 갖는 C20-지방산 및(또는) 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합, 바람직하게는 4개, 5개 또는 6개의 이중 결합, 특히 바람직하게는 5개 또는 6개의 이중 결합을 갖는 C22-지방산을 생성한다. 본 발명에 따른 효소에 의해 연장시킨 후에, 추가의 불포화 단계를 수행하여 고도로 불포화된 지방산을 얻을 수 있다. 연장효소 활성의 생성물 및 추가의 불포화 반응의 생성물은 따라서 높은 불포화도를 갖는 바람직한 PUFA, 예를 들어 도코사디에노산, 아라키돈산, ω6-에이코사트리엔디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타에노산, ω3-에이코사트리에노산, ω3-에이코사테트라에노산, 도코사펜타에노산 또는 도코사헥사에노산을 생성시킬 수 있다. 본 발명에 따른 효소 활성의 기질은 예를 들어 탁솔산; 7,10,13-헥사데카트리에노산, 6,9-옥타데카디에노산, 리놀산, 리놀렌산, α- 또는 γ-리놀렌산 또는 스테아리돈산 및 아라키돈산, 에이코사테트라에노산, 도코사펜타에노산, 에이코사펜타에노산이다. 바람직한 기질은 리놀산, γ-리놀렌산 및(또는) α-리놀렌산, 및 아라키돈산, 에이코사테트라에노산, 도코사펜타에노산 및 에이코사펜타에노산이다. 아라키돈산, 도코사펜타에노산 및 에이코사펜타에노산이 특히 바람직하다. 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16- 또는 C18-지방산은 본 발명에 따른 효소 활성에 의해 유리 지방산 형태 또는 에스테르 형태, 예를 들어 인지질, 당지질, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤 또는트리아실글리세롤 형태로 연장될 수 있다. 인간의 영양에 있어서는 컨쥬게이션된 리놀산 "CLA"가 특히 중요하다. CLA는 특히 C18:29시스, 11트랜스또는 아이소머인 C18:210트랜스, 12시스와 같은 지방산을 의미하는 것으로 이해되며, 인간 효소계에 의해 체내에 흡수된 이후에 불포화 또는 연장시킬 수 있으며, 건강 촉진 효과에 기여할 수 있다. 본 발명에 따른 연장효소는 또한 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 컨쥬게이션된 지방산을 연장킬 수 있으며, 따라서 인간의 영양을 위해 이러한 건강 촉진성 지방산을 이용할 수 있도록 만든다. 컨쥬게이션된 지방산의 다른 예는 알파-파리나르산, 엘레오스테아르산 및 칼렌둘산이다.
문헌 (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)에 공개 및 인용된 것과 같은 식물 및 식물의 형질전환에 사용되는 클로닝 벡터의 경우, 본 발명에 따른 핵산은 이들이 PUFA와 같은 1종 이상의 지질-유도된 생성물에 대하여 더 우수하거나, 보다 효율적이거나 또는 변경된 생산자가 되도록 하여 넓은 범위의 식물을 재조합 변형시키는데 사용될 수 있다. 이와 같이, PUFA와 같은 지질-유도된 생성물의 생산 증가 또는 생산 효율의 증가는 직접적인 조작 결과 또는 간접적인 조작 결과에 의해 유발될 수 있다.
본 발명에 따른 PSE 단백질의 변형이, 변형된 단백질로 인해, 오일 작물 또는 미생물 유래의 미세 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접적으로 영향을 줄 수 있는 일련의 메카니즘이 존재한다. 이러한 화합물들이 더 많은 양으로 드 노보 (de novo) 생산되도록 PSE 단백질 또는 PSE 유전자의 수 또는 활성을 증가킬 수 있는데, 이는 생물이 해당 유전자의 도입 이전에 이러한 활성 및 생합성 활성을 갖지 않기 때문이다. 또한, 여러 상이한 서열, 즉 DNA 서열 수준에서 차이가 있는 서열의 사용은 본 발명에 있어서 이로울 수 있다.
하나의 PSE 유전자 또는 다수개의 PSE 유전자를 생물 또는 세포내에 도입하는 것은 최종 생성물을 향한 생합성 흐름을 증가시킬 뿐만 아니라, 상응하는 트리아실글리세롤 조성물을 드 노보로 증가 또는 생성시킬 수 있다. 마찬가지로, 1종 이상의 미세 화학물질 (예를 들어, 지방산, 극성 및 중성 지질)의 생합성에 요구되는 영양물질의 유입에 관여하는 다른 유전자의 수 또는 활성을 증가시켜 세포내 또는 저장 부위에서 이러한 전구체, 보조인자 또는 중간체의 농도를 증가시킴으로써, 하기에 기술된 바와 같이 PUFA를 생산하는 세포의 능력을 더 증가시킬 수 있다. 지방산 및 지질 자체는 미세 화학물질로서 바람직하며, 활성을 최적화하는 것, 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 1종 이상의 PSE 수를 증가시키는 것, 또는 이러한 화합물의 분해에 관여하는 1종 이상의 PSE의 활성을 상실시키는 것은 식물 또는 미생물로부터의 지방산 분자 및 지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 PSE 유전자의 돌연변이유발은 1종 이상의 바람직한 미세 화학물질의 생산에 직접 또는 간접적으로 영향을 주는 변화된 활성을 갖는 PSE 단백질을 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 PSE 유전자의 수 또는 활성을 증가시켜, 세포의 정상 대사 폐산물 또는 부산물 (이들의 양은 목적하는 미세 화학물질의 과다생산으로 인해 증가될 수 있음)이 세포내에서 다른 분자 또는 프로세스를 파괴하거나 (세포의 생존성을 감소시킴) 또는 미세 화학물질의 생합성 경로를 방해하기 (따라서, 목적하는 미세 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율을 감소시킴) 전에 효과적인 방식으로 배출되도록 할 수 있다. 또한, 세포내에서 비교적 다량의 목적하는 미세 화학물질은 그 자체로 세포에 독성을 띠거나 또는 알로스테릭 (allosteric) 조절과 같은 효소 피드백 메카니즘을 방해할 수 있으며; 예를 들어 이들은 하류의 PUFA 경로의 다른 효소 또는 무독화 효소의 활성 또는 수의 증가로 인해 PUFA의 트리아실글리세롤 부분내의 배치 (allocation)를 증가시킬 수 있고; 종자 (seed) 세포의 생존성이 증가될 수 있으며, 따라서 배양중의 세포를 더 잘 발달시키거나 목적하는 미세 화학물질을 생산하는 종자를 생성시킨다. 또는, 본 발명에 따른 PSE 유전자는 상응하는 양의 다양한 지질 분자 및 지방산 분자가 생산되도록 하는 방식으로 조작될 수 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 대하여 결정적인 영향을 줄 수 있으며, 드 노보로 합성된 PUFA의 생성 이외에도 신규한 오일을 생성시킬 수 있다. 각 유형의 지질은 다른 물리적 특성을 가지기 때문에, 막의 지질 조성의 변화는 막의 유동성을 실질적으로 변화시킬 수 있다. 막 유동성에서의 변화는 막을 통한 분자의 운반 및 세포의 일체성에 영향을 줄 수 있으며, 이들 모두는 미세 화학물질의 생산에 대하여 결정적인 영향을 끼친다. 또한, 식물에서, 이러한 변화는 비생물성 및 생물성 스트레스 상황에 대한 내성과 같은 다른 특성에 영향을 줄 수도 있다.
생물성 및 비생물성 스트레스 내성은 일반적인 특징으로, 바람직하게는 광범위한 식물 종류, 예를 들어 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 트리티케일 (triticale), 벼, 보리, 콩, 땅콩, 면화, 평지 및 카놀라, 카사바, 후추, 해바라기 및 타게츠 (tagetes), 가지과 (Solanaceae) 식물, 예를 들어 감자, 담배, 아우베르진 (aubergine) 및 토마토, 비시아 (Vicia) 종, 완두, 알팔파, 관목 식물 (커피, 카카오, 홍차), 살릭스 (Salix) 종, 수목 (오일 야자, 코코넛) 및 다년생 잔디 및 사료용 작물에 부여된다. 본 발명에 따른 추가의 실시양태로서, 이러한 작물은 또한 유전 공학을 위한 대상 식물로서 바람직하다. 본 발명에 따른 매우 특히 바람직한 식물은 오일 작물, 예를 들어 콩, 땅콩, 평지, 카놀라 해바라기, 잇꽃, 수목 (오일 야자, 코코넛) 또는 작물, 예를 들어 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 트리티케일, 벼, 보리, 알팔파 또는 관목 식물 (커피, 카카오, 홍차)이다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 하나의 PSE 또는 여러 PSE 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (예를 들어, cDNA) 또는 PSE-코딩 핵산 (예를 들어, DNA 또는 mRNA)의 검출 또는 증폭을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로 적합한 핵산 단편에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열들 중 하나, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열 중 하나의 코딩 영역 또는 상보체를 포함한다. 특히 바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부와 혼성화하거나 또는 그와 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 그 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 나타낸 아미노산 서열 중 하나를 코딩한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 바람직한 PSE 유전자는 또한 본원에 기재된 PSE 활성들 중 하나 이상을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는데, 이 단백질 또는 그의 일부는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 충분히 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 PSE 활성을 보유한다. 바람직하게는, 핵산 분자에 의해 코딩되는 이들 단백질 또는 그의 일부는 식물 세포막의 합성 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 필요한 화합물의 대사에 관여하는 능력을 보유한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단백질은 전장 단백질이며, 그의 일부는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 완전한 아미노산 서열 (이는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 오픈 리딩 프레임으로 인한 것임)과 본질적으로 상동성이 있으며, 당업자에게 친숙한 방법 및 실험에 의해 그의 전장으로 단리될 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens), 크립테코디니움 코니 (Crypthecodinium cohnii) 또는 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium)으로부터 발생하고, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 약 50% 이상 또는 그 이상의 상동성을 가지고 식물 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 보유하거나 또는 ARA, EPA 또는 DHA 또는 그의 전구체 또는 분자와 같은 PUFA를 생성하는 연장 활성들 중 하나 이상 또는 표 1에 나열된 활성들 중 하나 이상을 갖는 생물학적으로 활성인 도메인을 포함하는 단백질 (예를 들어, PSE 융합 단백질)을 코딩하며, 또한 이종 폴리펩티드 또는 조절 단백질을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
5가지 유전자전환 효모 종의 지방산 프로파일 (몰%). 부가 및 수용된 γ-리놀렌산의 비율은 굵은 글씨로 인쇄된 숫자로 강조되었고, 연장된 생성물의 것들은 밑줄로 표시하였으며, 연장된 γ-리놀렌산의 것들은 굵은 글씨로 인쇄된 숫자로 강조되었다 (마지막 줄).
지방산 [몰%] pYES2 pY2PSE1a pY2PSE1b pY2PSE1c pY2PSE1d
16:0 17.0 17.6 16.4 16.3 17.6
16:1△9 28.0 26.8 28.0 27.9 25.1
18:0 6.5 6.0 6.4 5.6 6.1
18:1△9 25.9 23.5 27.0 25.2 21.4
18:3△6,9,12 22.6 15.7 13.2 16.4 22.8
20:3△8,11,14 - 10.3 9.0 8.6 7.1
18:3△6,9,12-연장 - 39.6 40.5 34.4 23.7
다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 뉴클레오티드 15개 이상의 길이이며, 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 혼성화한다. 단리된 핵산 분자는 바람직하게는 자연 발생적인 핵산 분자에 상응한다. 보다 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 자연 발생적인 크립테코디니움, 피토프토라 또는 트라우스토키트리움 PSE 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부를 코딩한다.
본 발명의 추가의 측면은 벡터, 예를 들어 본 발명에 따른 하나 이상의 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 벡터를 도입한 숙주 세포, 특히 미생물, 식물 세포, 식물 조직, 식물 기관 또는 원형 식물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 숙주 세포는 미세 화학물질, 특히 PUFA를 저장할 수 있으며, 목적하는 화합물을 단리하기 위해 세포를 수획한다. 이어서, 화합물 (오일, 지질, 트리아실글리세라이드, 지방산) 또는 PSE를 배지 또는 숙주 세포로부터 단리할 수 있고, 식물의 경우 미세 화학물질을 포함하거나 저장하는 세포, 가장 바람직하게는 종자 코트, 결절, 표피 세포 및 종자 세포와 같은 저장 조직의 세포로부터 단리할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 유전적으로 변형된 식물, 바람직하게는 상기 언급된 오일 작물, 특히 바람직하게는 PSE 유전자가 도입된 평지, 아마인 또는 피스코미트렐라 파텐스에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 평지, 아마인 또는 피스코미트렐라 파텐스의 게놈은 유전자전환유전자 (transgene)로서, 야생형 또는 변이된 PSE 서열을 코딩하는 본 발명에 따른 핵산 분자를 도입함으로써 변형된다. 다른 실시양태에서, 공급원 생물인 피스코미트렐라 파텐스, 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움의 게놈내의 내생 PSE 유전자가 변형, 즉 기능적으로 파괴되는데, 이는 예를 들어 변형된 PSE 유전자와의 상동 재조합 또는 DNA 서열에 의한 돌연변이유발 및 검출에 의한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 식물체는 피스코미트렐라 속, 세라토돈, 푸나리아, 평지 또는 아마인에 속하며, 피스코미트렐라, 평지 또는 아마인이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 피스코미트렐라, 평지 또는 아마인을 사용하여 지질 또는 지방산과 같은 목적하는 화합물을 제조하며, PUFA가 특히 바람직하다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 기재된 핵산을 기초로 한 상동 재조합을 이용하여 연장효소 유전자의 기능을 입증하는데 있어서 이끼류 피스코미트렐라 파텐스를 사용하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 PSE 유전자 또는 그의 일부, 예를 들어 그의 생물학적으로 활성인 부분에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 PSE또는 그의 부분은 미생물 또는 식물 세포에서 세포막의 합성에 필요한 화합물의 대사, 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 단리된 PSE 또는 그의 일부는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 충분한 상동성을 가지며, 미생물 또는 식물 세포에서 세포막의 합성에 필요한 화합물의 대사, 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 보유한다.
본 발명은 또한 단리된 PSE 제제를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, PSE 유전자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12 (서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)의 완전한 아미노산 서열과 본질적으로 상동성을 갖는 단리된 전장 단백질에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단리된 PSE는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열 중 하나와 약 50% 이상의 상동성을 가지며, 미생물 또는 식물 세포에서 지방산의 합성에 필요한 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있고, PUFA-연장 활성 중 하나 이상을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 연장은 이롭게는 둘 이상의 위치에서 이중 결합을 갖는 불포화 C16-, C18- 또는 C20-탄소 사슬과 관계한다.
다른 것으로서, 단리된 PSE는 예를 들어 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나, 또는 그와 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70%, 80% 또는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 도는 그 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 바람직한 PSE 형태의 경우 본원에 기재된 PSE 활성 중 하나를 갖는 것이 바람직하다.
PSE 폴리펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편을 비-PSE 폴리펩티드에 기능적으로 연결하여 융합 단백질을 형성시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 PSE 단독의 것과는 다른 활성을 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 미생물 또는 식물에서 지질 및 지방산, 보조인자 및 효소의 생합성에 필요한 화합물의 대사, 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 융합 단백질의 숙주 세포로의 도입은 세포에 의한 목적하는 화합물의 생산을 조절한다. 바람직한 실시양태에서, 이들 융합 단백질은 또한 △4-, △5- 또는 △6-, △8-, △15-, △17- 또는 △19-불포화효소 활성을 단독으로 또는 함께 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 미세 화학물질의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 적합한 미생물을 배양하거나, 또는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 그의 동족체, 유도체 또는 유사체, 또는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11 또는 그의 동족체, 유도체 또는 유사체를 포함하는 유전자 구조물, 또는 이러한 서열을 포함하는 벡터, 또는 본 발명에 따른 PSE 핵산 분자를 발현시키는 유전자 구조물을 배양하여, 미세 화학물질을 생산하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 또한 본 발명에 따른 연장효소 핵산 서열을 포함하는 세포를 얻는 단계를 포함하며, 이 때 세포는 연장효소 핵산 서열, 유전자 구조물 또는 벡터로 형질전환되어, 본 발명에 다른 PSE 핵산을 발현시킨다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 또한 배양물로부터 미세 화학물질을 얻는 단계를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 세포는 실리아타 목, 진균과 같은 미생물 또는 식물계, 특히 오일 작물에 속하며, 미생물 또는 오일 작물이 특히 바람직하다.
본 발명의 추가의 측면은 미생물에 의해 분자의 생산을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 세포를, PSE 활성 또는 PSE 핵산의 발현을 조절하는 물질과 조합하여 세포와 관련된 활성이 이러한 물질의 부재하에 동일한 활성에 대하여 변화되도록 하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 지질 및 지방산, 보조인자 및 효소에 대한 세포의 하나의 대사 경로 또는 두 대사 경로를 조절하거나 또는 이러한 막을 통한 화합물의 운반을 조절하여, 이러한 미생물에 의한 목적하는 미세 화학물질의 수율 또는 생산 속도를 향상시킨다. PSE 활성을 조절하는 물질은 PSE 활성 또는 PSE 핵산의 발현을 자극하거나 또는 지방산 생합성에서 중간체로 사용될 수 있는 물질일 수 있다. PSE 활성 또는 PSE 핵산의 발현을 자극하는 물질의 예는 특히 작은 분자로서, 세포내에 도입된 활성 PSE 및 PSE를 코딩하는 핵산이다. PSE 활성 또는 PSE 발현을 억제하는 물질의 예는 특히 작은 분자 및(또는) 안티센스 PSE 핵산 분자이다.
본 발명의 다른 측면은 별도의 플라스미드상에 유지되거나 숙주 세포의 게놈에 통합된 야생형 또는 변이체 PSE 유전자를 세포내에 도입하는 것을 포함하는, 세포로부터 목적하는 화합물의 수율을 조절하는 방법에 관한 것이다. 게놈내로 통합되는 경우, 통합은 무작위적이거나, 또는 도입되는 카피에 의해 천연 유전자가 대체됨으로써 세포에 의한 목적하는 화합물의 생산을 조절하거나 또는 트랜스 유전자를 사용하여 이 유전자가 그의 발현을 보장하는 하나 이상의 서열 및 기능적으로 전사되는 유전자의 폴리아데닐화를 보장하는 하나 이상의 서열을 포함하는 기능적 발현 단위에 기능적으로 연결되는 방식으로 재조합적으로 일어날 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 수율은 변화된다. 추가의 실시양태에서, 목적하는 화학물질을 증가시키고, 부정적인 효과를 갖는 바람직하지 못한 화합물을 감소시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 목적하는 미세 화학물질은 지질 또는 지방산, 보조인자 또는 효소이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이 화학물질은 다가불포화 지방산이다. 보다 바람직하게는, 화학물질은 아라키돈산 (= ARA), 에이코사펜타에노산 (= EPA) 또는 도코사헥사에노산 (= DHA)으로부터 선택된다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 피스코미트렐라 파텐스, 피토프토라 인페스탄스, 크립테코디니움또는 트라우스토키트리움에서 지질 및 지방산, PUFA 보조인자 및 효소의 대사, 또는 막을 통한 친지질성 화합물의 운반에 관여하는 PSE 핵산 및 PSE 단백질 분자를 제공한다. 본 발명에 따른 화합물은 생물, 예컨대 미생물, 예를 들어 섬모류, 진균, 효모, 박테리아, 조류 및(또는) 식물, 예를 들어 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 트리티케일, 벼, 보리, 콩, 땅콩, 면화, 브라시카 종, 예를 들어 평지, 카놀라 및 순무 평지 (turnip rape), 후추, 해바라기, 보라고, 달맞이꽃 및 타게츠, 가지과 식물, 예를 들어 감자, 담배, 아우베르진 및 토마토, 비시아 종, 완두, 카사바, 알팔파, 관목 식물 (커피, 카카오, 홍차), 살릭스 종, 수목 (오일 야자, 코코넛) 및 다년생 잔디 및 사료 작물로부터의 미세 화학물질의 생산을 조절하는데 직접적으로 사용될 수 있거나 (예를 들어, 지방산 생합성 단백질의 과다발현 또는 최적화는 변형된 생물로부터 지방산의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접적인 영향을 줌), 또는 이들은 간접적인 영향을 줌으로써 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율 증가를 초래하거나 또는 바람직하지 못한 화합물을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 지질 및 지방산, 보조인자 및 효소 대사의 조절이 세포내의 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율 또는 조성을 변화시킴으로써 하나 이상의 미세 화학물질의 생산에 영향을 줄 수 있는 경우). 본 발명의 측면은 하기에 보다 상세히 설명되어 있다.
I.미세 화학물질 및 PUFA
"미세 화학물질"이라는 용어는 당업계에 공지되어 있으며, 생물에 의해 생산되어, 예를 들어 제약 산업, 농업, 식품 산업 및 화장품 산업 분야를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 각종 산업 분야에 사용되는 분자를 포함한다. 이들 화합물로는 지질, 지방산, 보조인자 및 효소 등 (예를 들어, 문헌 (Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed.: VCH Weinheim) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들어, 아라키돈산), 비타민 및 보조인자 (문헌 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, Vitamins, pp. 443-613 (1996): VCH Weinheim, and references cited therein; and Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, held September 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), 효소 및 다른 모든 화학물질 (문헌 (Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086) 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌)이 포함된다. 몇몇 미세 화학물질의 대사 및 용도는 하기에 보다 상세히 설명되어 있다.
다양한 전구체 분자 및 생합성 효소를 병용하여 막 조성에 결정적인 영향을 주는 다양한 지방산 분자를 생산한다. PUFA는 트리아실글리세롤내로 뿐만 아니라 막 지질내로도 혼입되는 것으로 생각된다.
막 합성은 이중막의 일부인 지질을 포함하여 많은 성분들이 관여하는 잘 특성화된 과정이다. PUFA와 같은 신규 지방산의 생산은 따라서 세포 또는 유기체내에서 새로운 특성의 막 기능을 생성시킬 수 있다.
세포막은 세포에서 여러가지 기능을 한다. 첫째로 가장 중요한 것으로, 막은 세포의 함유물을 세포외 환경으로부터 격리시킴으로써, 세포에 대하여 일체성을 부여한다. 막은 또한 위험하거나 바람직하지 못한 화합물의 유입 또는 바람직한 화합물의 유출에 대한 차단막으로서 작용할 수도 있다.
막의 연관성 및 관련된 메카니즘의 보다 상세한 설명에 대하여는, 문헌 (Bamberg, E., et al. (1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26:1-25; Gennis, R.B. (1989) Pores, Channels and Transporters, in: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 270-322; and Nikaido, H., und Saier, H. (1992) Transport proteins in bacteria: common themes in their design, Science 258:936-942), 및 이들 문헌 각각에 포함된 인용문헌을 참고한다.
지질 합성은, 지방산의 합성 및 이들의 sn-글리세롤-3-포스페이트로의 결합, 및 극성 헤드 (head) 기의 부가 또는 수식의 두 부분으로 나뉠 수 있다. 막에 사용되는 통상적인 지질로는 인지질, 당지질, 스핑고지질 및 포스포글리세라이드가 포함된다. 지방산 합성은 아세틸-CoA 카르복실라제에 의한 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 전환 또는 아세틸 트랜스아실라제에 의한 아세틸-CoA의 아세틸-ACP로의 전환으로 시작된다. 축합 반응 후에, 이들 두가지 생성물 분자는 함께 아세토아세틸-ACP를 형성하며, 이는 일련의 축합, 환원 및 탈수 반응을 통해 전환되어 목적하는 쇄 길이를 갖는 포화 지방산 분자를 생성한다. 이러한 분자로부터목적하는 지방산을 생산하는 것은 특정의 불포화효소 (desaturase)에 의해 산소 분자의 존재하에 호기적으로 또는 혐기적으로 촉진된다 (미생물에서 지방산 합성에 대하여는, 문헌 (F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., pp. 612-636) 및 이 문헌에 포함된 참고문헌; 문헌 (Lengeler et al. (Ed.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, and the references contained therein, and Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542) 및 이 문헌에 포함되는 참고문헌)을 참조한다).
PUFA 생합성에 대한 전구체의 예로는 리놀산 및 리놀렌산이 있다. 에이코사 및 도코사 쇄 유형의 지방산을 생성하기 위해서는, 이러한 C18-탄소 지방산이 C20또는 C22로 연장되어야 한다. △6-불포화효소, △5- 및 △4-불포화효소 활성을 갖는 효소 등의 각종 불포화효소는 아라키돈산, 에이코사펜타에노산 및 도코사헥사에노산, 및 다양한 다른 장쇄 PUFA를 생성할 수 있으며, 이들은 식품 및 사료, 화장품 또는 제약 분야에서의 다양한 목적을 위해 추출 및 사용될 수 있다.
장쇄 PUFA를 생산하기 위해, 다가불포화 C16-, C18- 또는 C20-지방산은, 상기 언급한 바와 같이, 연장효소의 효소 활성에 의해 2개 이상의 탄소 원자에 의해 연장되어야 한다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 트리아실글리세롤 부분내에 PUFA를 포함하는 전형적인 생산자로부터의 제1 미생물 연장효소를 코딩하며, 이 연장효소는 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 탄소 원자2개 이상 연장시킬 수 있거나, 또는 예를 들어 C16- 또는 C18-지방산을 C20-지방산으로 전환시키고 나서 이 C20-을 2C 원자를 갖는 단위를 포함하는 C22- 이상의 짝수 지방산으로 전환시킴으로써 이들을 순차적으로 연속하여 전환시킨다. 1회의 연장 사이클 후에, 이러한 효소 활성은 C20-지방산을 생성하며, 2회, 3회 및 4회의 연장 사이클 후에, C22-, C24- 또는 C26-지방산을 생성한다. 또한, 본 발명에 따른 연장효소를 사용하여 더 긴 PUFA를 합성할 수도 있다. 본 발명에 따른 연장효소의 활성은 바람직하게는 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C20- 및(또는) C22-지방산, 지방산 분자내에 바람직하게는 3개, 4개 또는 5개의 이중 결합, 특히 바람직하게는 3개의 이중 결합을 갖는 C20-지방산, 지방산 분자내에 바람직하게는 3개, 4개, 5개 또는 6개의 이중 결합, 특히 바람직하게는 5개 또는 6개의 이중 결합을 갖는 C22-지방산을 생성한다. 본 발명에 따른 효소로 연장한 후에, 추가의 불포화 단계를 수행할 수 있다. 즉, 연장효소 활성 및 가능한 추가의 불포화에 의한 생성물은 더 높은 불포화도를 갖는 바람직한 PUFA, 예를 들어 도코사디에노산, 아라키돈산, ω6-에이코사트리엔디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타에노산, ω3-에이코사트리에노산, ω3-에이코사테트라에노산, 도코사펜타에노산 또는 도코사헥사에노산을 생성한다. 본 발명에 따른 이러한 효소 활성에 대한 기질의 예로는 탁솔산; 7,10,13-헥사데카트리에노산, 6,9-옥타데카디에노산, 리놀산, γ-리놀렌산, 리놀렌산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타에노산 또는 스테아리돈산이다. 바람직한 기질은 리놀산, γ-리놀렌산 및(또는) α-리놀렌산 또는 아라키돈산, 에이코사테트라에노산 또는 에이코사펜타에노산이다. 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산은 본 발명에 따른 효소 활성에 의해 유리 지방산 형태 또는 에스테르 형태, 예를 들어 인지질, 당지질, 스핑고지질, 포스포글리세라이드, 모노아실글리세롤, 디아실글리세롤 또는 트리아실글리세롤 형태로 연장될 수 있다.
또한, 지방산은 이후에 다양한 위치로 운반되어 트리아실글리세롤 저장 지질에 혼입되어야 한다. 지질 합성에 있어서 또 다른 중요한 단계는 예를 들어 글리세롤 지방산 아실트랜스퍼라제에 의한 지방산의 극성 헤드 기로의 전달이다 (문헌 (Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166) 참조).
식물 지방산의 생합성, 지방 화합물의 불포화, 지질 대사 및 막 운반, 베타-산화, 지방산 변형 및 보조인자 및 트리아실글리세롤 저장 및 어셈블리에 대한 간행물, 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌에 대하여는, 문헌 (Kinney, 1997, Genetic Engineering, Ed.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge and Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin and Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engineering, Ed.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Guhnemann-Schafer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Ed.: Murata and Somerville,Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16)을 참조한다.
비타민, 보조인자 및 "영양제 (nutraceutical)," 예를 들어 PUFA는, 박테리아와 같은 다른 생물에 의해서는 쉽게 합성되지만, 고등 동물은 전혀 합성할 수 없기 때문에 보유해야만 하거나, 또는 고등 동물이 이들을 충분한 정도로 합성할 수 없기 때문에 추가로 보유해야만 하는 분자 그룹을 포함한다. 이들을 생산할 수 있는 생물체, 예를 들어 박테리아에서 이러한 분자의 생합성은 다소 특이적이다 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, held September 1-3, 1994, in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 pp).
상기 언급한 분자들은 그들 자체로 생물학적으로 활성인 분자이거나 또는 다양한 대사 경로에서 전자 운반체 또는 중간체로 작용하는 생물학적으로 활성인 물질의 전구체이다. 이들의 영양적 가치뿐 아니라, 이러한 화합물은 착색제, 항산화제 및 촉매, 또는 다른 프로세싱 보조제로서 중요한 산업적인 가치도 갖는다 (이러한 화합물의 구조, 활성 및 산업적 적용에 대한 검토에 관하여는, 예를 들어 문헌 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp.443-613, VCH Weinheim, 1996)을 참조한다. 다가불포화 지방산은 예를 들어 관상동맥 심장병, 염증 기전 및 유아의 영양 등의 경우에서 다양한 기능 및 건강-촉진 작용을 갖는다. 이 문헌에 인용된 참고문헌을 포함하는 간행물 및 문헌에 대하여는 문헌 (Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70 (3rd Suppl.):560-569, Takahata et al., Biosc. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(11):2079-2085, Willich and Winther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120(7):229 et seq)을 참조한다.
II.본 발명의 요소 및 방법
본 발명은 적어도 부분적으로는 본원에서 PSE 핵산 및 PSE 단백질 분자로 명명된 신규한 분자의 발견을 근간으로 하며, 이들 분자는 피스코미트렐라 파텐스, 크립테코디니움 코니, 피토프토라 인페스탄스, 트라우스토키트리움 및(또는) 세라토돈 푸르푸레우스 (Ceratodon purpureus)의 세포막 생성에 있어서 역할을 수행하며, 예를 들어 이러한 막을 통한 분자의 이동에 영향을 준다. 한 실시양태에서, PSE 분자는 미생물 및 생물 등의 생물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사에 관여하거나, 이러한 막을 통한 분자의 운반에 간접적으로 영향을 준다. 바람직한 실시양태에서, 막 성분의 생산 및 막 이동의 조절에 있어서 본 발명에 따른 PSE 분자의 활성은 이러한 생물에 의한 목적하는 미세 화학물질의 생산에 영향을 준다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PSE 분자의 활성을 조절하여, 본 발명에 따른 PSE를 조절하는 미생물 또는 식물의 대사 경로의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율이 달라지고 막을 통한 화합물의 운반 효율이 변화되도록 하는데, 이는 미생물 및 식물에 의한 목적하는 미세 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 직접 또는 간접적으로 조절한다.
PSE 또는 PSE 폴리펩티드라는 용어는 미생물 및 식물 등의 생물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 단백질을 포함한다. PSE의 예는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11, 또는 이들의 동족체, 유도체 또는 유사체로 개시되어 있다. PSE 또는 PSE 핵산 서열이라는 용어는 PSE, 및 코딩영역일 수 있으며 또한 5'- 및 3'-비번역 서열 영역에 상응하는 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. PSE 유전자의 예는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열이다. 생산 및 생산성이라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특정 기간 및 특정 발효 부피 (예를 들어, 소정의 시간 동안 리터 당 생성물 kg)에서 형성되는 발효 생성물 (예를 들어, 목적하는 미세 화학물질의 발효 생성물)의 농축을 포함한다. 생산 효율이라는 용어는 특정 생산량을 달성하는데 필요한 시간 (예를 들어, 세포가 미세 화학물질의 특정 생산량 속도를 확립하는데 요구되는 시간)을 포함한다. 수율 또는 생산물/탄소 수율이라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있으며, 탄소 공급원이 생산물 (즉, 미세 화학물질)로 전환되는 효율을 포함한다. 일반적으로, 이 용어는 예를 들어 탄소 공급원 kg 당 생성물 kg으로 표현된다. 화합물의 수율 또는 생산을 증가시키면 얻어지는 분자의 양 또는 정해진 기간 동안 특정량의 배양물 중에서 얻어지는 이러한 화합물의 적합한 분자의 양이 증가된다. 생합성 또는 생합성 경로라는 용어는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 강하게 조절되는 다단계 프로세스에서 세포에 의한 중간체로부터의 화합물, 바람직하게는 유기 화합물의 합성을 포함한다. 이화작용 또는 이화작용 경로라는 용어는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 강하게 조절되는 다단계 프로세스에서 세포에 의한 화합물, 바람직하게는 유기 화합물의 이화 생성물 (일반적으로, 더 작은 복합 분자)로의 절단을 포함한다. 대사라는 용어는 당업계에 공지되어 있으며, 생물에서 일어나는 생화학 반응의 일체를 포함한다. 어떤 화합물의 대사 (예를 들어, 지방산의 대사)는 따라서 이러한 화합물과 관련된 세포에서 이들 화합물의 생합성, 변형 및 이화 경로의 일체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 PSE 분자는 미생물 또는 식물내에서 목적하는 분자, 예를 들어 미세 화학물질의 생산을 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 PSE의 변형이 이러한 변형된 단백질을 포함하는 미생물 균주 또는 식물 종으로부터의 미세 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접 영향을 줄 수 있는 일련의 기작이 존재한다. 세포내 또는 세포로부터의 미세 화학물질의 분자의 운반에 관여하는 PSE의 수 또는 활성을 증가시켜, 더 많은 양의 이러한 화합물들이 막을 통해 운반되도록 할 수 있으며, 이로서 이들은 보다 쉽게 얻어지고 서로 전환될 수 있다. 또한, 지방산, 트리아실글리세롤 및(또는) 지질은 그들 자체로 바람직한 미세 화학물질이고; 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 본 발명에 따른 1종 이상의 PSE의 수를 증가시키거나 또는 이러한 화합물의 이화작용에 관여하는 1종 이상의 PSE의 활성을 방해하는 것은 미생물 또는 식물 등의 가능한 생물로부터 지방산 및지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 증가시킨다.
본 발명에 따른 PSE 유전자의 돌연변이유발은 미생물 또는 식물로부터 1종 이상의 목적하는 미세 화학물질의 생산에 간접적으로 영향을 주는 변형된 활성을 갖는 PSE를 생성할 수도 있다. 예를 들어, 폐 생성물의 배출에 관여하는 본 발명에 따른 PSE는 더 큰 수 또는 더 높은 활성을 나타낼 수 있으며, 세포의 정상 대사 폐 생성물 (이 양은 목적하는 미세 화학물질의 과다생산으로 인해 증가될 수 있음)은 이들이 세포에서 분자를 파괴 (세포의 생존성을 감소시킴)시키거나 미세 화학물질의 생합성 경로를 방해 (목적하는 미세 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율을 저하시킴)하기 전에 효과적으로 배출된다. 비교적 다량의 세포내 미세 화학물질은 그 자체로 또한 세포에 독성일 수 있어서, 세포로부터 이러한 화합물을 배출시킬 수 있는 운반자의 활성 또는 수를 증가시키는 것은 배양중인 세포의 생존성을 증가시키며, 따라서 목적하는 미세 화학물질을 생산하는 배양물중에서 더 많은 수의 세포를 초래한다. 본 발명에 따른 PSE는 상응하는 양의 다른 지질 분자 및 지방산 분자가 생산되도록 하는 방식으로 조작될 수도 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 실제적인 영향을 줄 수 있다. 각 지질 유형은 다른 물리적 특성을 가지기 때문에, 막의 지질 조성 변화는 막의 유동성을 상당히 변화시킬 수 있다. 막 유동성의 변화는 막을 통한 분자의 운반 및 세포 일체성에 영향을 줄 수 있는데, 이들 각각은 대규모 발효 배양에서 미생물 및 식물로부터 미세 화학물질의 생산에 실제적인 영향을 준다. 식물의 막은 고온 및 저온, 염, 가뭄에 대한 내성 및 박테리아 및 진균 등의 병원체에 대한 내성 등의 특이적 성질을 부여한다. 막 성분의 조절은 따라서 상기 언급한 스트레스 파라메타 조건하에 생존하는 식물의 능력에 중요한 영향을 줄 수 있다. 이는 신호 캐스케이드에서의 변화를 통해 또는 변화된 막 조성 (예를 들어, 문헌 (Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3(11):419-426) 참조) 및 신호 캐스케이드 (문헌 (Wang 1999, Plant Physiology, 120:645-651) 참조)를 통해 일어나거나 또는 문헌 (WO 95/18222)에 개시된 바와 같은 저온의 내성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 단리된 핵산 서열은 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)을 통해 균주 번호 ATCC26185 (트라우스토키트리움)으로 이용할 수 있는 트라우스토키트리움 균주의 게놈내에 또는 크립테코디니움의 경우 예를 들어 프로바솔리-길라드 내셔날 센터 포 컬쳐 오브 마린 피토플랑크톤 [Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton ((CCMP) West Boothbay Harbour, ME, USA)]을 통해 이용가능한 균주 배양 번호 CCMP316의 게놈내에 존재한다. 피토프토라 인페스탄스의 경우, 설명된 핵산 분자는 균주 ATCC 48886를 통해 단리된다.
단리된 피스코미트렐라, 크립테코디니움, 피토프토라 인페스탄스 또는 트라우스토키트리움 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 피스코미트렐라 파텐스 PSE의 추정 아미노산 서열은 서열 1 내지 서열 12에 나타나 있다. 세포막 성분의 대사에 관여하는 단백질을 코딩하거나 또는 세포막을 통한 화합물의 운반 또는 PUFA 생합성에 관여하는 서열로서 이러한 뉴클레오티드 서열을 분류 및(또는) 확인하는 컴퓨터 분석을 수행하였다. 본 발명자의 데이타베이스에서 데이타베이스 입력 번호PP001019019F, CC001042041R, PI001002014R, TC002034029R, TC002034029R-11 및 TC002014093R을 갖는 EST는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에서 본 발명에 따른 서열을 구성한다. 유사한 방식으로, 부분 폴리펩티드는 PP001019019F, CC001042041R, PI001002014R, TC002034029R, TC002034029R-11 및 TC002014093R로 명명되었으며, 표 2에 따른 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에서 본 발명에 따른 서열을 구성한다. EST TC002034029R의 완전한 단편 삽입체는 표 3에 서열화하여 나타내었으며, 이는 TC002034029R의 완전한 서열이다. TC002034029R-11은 트라우스토키트리움 유래의 연장효소의 전장 서열을 나타낸다. 나머지 클론의 명명도 유사하다. 또한, 상응하는 유전자 명칭이 다양한 클론에 배정되었다. 약자는 다음과 같다: Tc = 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium), Cc = 크립테코디니움 (Crypthecodinium), Pp = 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens), P: 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans).
명칭/EST 명칭 유전자 명 폴리펩티드 서열 번호 핵산 서열 번호
PP001019019F Pp_PSE1 2 1
TC002034029R Tc_PSE1 4 3
TC002014093R Tc_PSE2 6 5
CC001042041R Cc_PSE1 8 7
TC002034029R-11 Tc_PSE1_1 10 9
PI001002014R Pi_PSE1 12 11
본 발명은 또한 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 본질적으로 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 이러한 경우에 사용된 바와 같이, 선택된 아미노산 서열과 본질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질은 선택된 아미노산 서열, 예를 들어 선택된 완전한 아미노산 서열과 대략 50% 이상의 상동성을 갖는다. 선택된 아미노산 서열과 본질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질은 선택된 아미노산 서열과 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 또는 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 PSE 또는 생물학적으로 활성인 그의 부분 또는 단편은 미생물 또는 식물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하거나 또는 C16-, C18- 또는 C20-PUFA의 연장에 요구되는 한가지 이상의 활성을 가져서, C20-, C22- 또는 C24-PUFA 및 관련된 PUFA를 얻을 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.
A.단리된 핵산 분자
본 발명의 한 실시양태는 지방산에서 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16- 또는 C18-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장하거나 또는 지방산에서 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C20-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장하는 폴리펩티드를 코딩하는, PUFA를 생산하는 미생물로부터 유도된 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 다른 실시양태는 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 연장하는 폴리펩티드를 코딩하며, 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
a) 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 핵산 서열,
b) 유전자 코드의 다의성에 따라 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열들 중 하나로부터 유도된 핵산 서열, 또는
c) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하며, 폴리펩티드 효소 작용의 실질적인 감소 없이 아미노산 수준에서 50% 이상의 상동성을 갖는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열의 유도체.
C16-, C18- 또는 C20-연장효소로 작용하는 상기 언급한 본 발명에 따른 핵산은 PUFA를 합성할 수 있는 섬모류, 진균, 조류, 식물 또는 와편모충류 (dinoflagellate), 바람직하게는 식물 또는 조류, 특히 바람직하게는 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움, 트라우스토키트리움 또는 쉬조키트리움 (Schizochytrium), 가장 바람직하게는 피토프토라 인페스탄스, 피스코미트렐라 파텐스, 크립테코디니움 코니 또는 트라우스토키트리움 종, 쉬조키트리움 종 또는 밀접하게 관련된 생물 속으로부터 유도된다.
본 발명의 한 측면은 PSE 폴리펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 PSE-코딩 핵산 (예를 들어, PSE DNA)을 동정하거나 증폭시키기 위한 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용되는데 충분한 핵산 단편에 관한 것이다. 본원에 사용된 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, mRNA), 및 뉴클레오티드 유사체에 의해 생성되는 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는 또한 코딩 유전자 영역의 3' 및 5' 말단의 비번역 서열, 즉 코딩 영역의 5' 말단 상류의 약 100개 이상의 뉴클레오티드 서열 및 코딩 유전자 영역의 3' 말단 하류의 약 20개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 천연 핵산 공급원 중에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된다. "단리된" 핵산은 바람직하게는 핵산이 유도되는 생물의 게놈 DNA에서 핵산을 자연적으로 플랭킹하는 서열 (예를 들어, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 가지고 있지 않다. 다양한 실시양태에서, 단리된 PSE 핵산 분자는 예를 들어 핵산이 유도되는 세포 (예를 들어, 피스코미트렐라 파텐스 세포)의 게놈 DNA에서 핵산 분자를 자연적으로 플랭킹하는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. "단리된" 핵산 분자, 예를 들어 cDNA 분자는 또한 본질적으로는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 세포 물질 또는 세포 배지를 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에는 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자, 예를 들어 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분을 갖는 핵산 분자는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 단리할 수 있다. 또한, 예를 들어 DNA 또는 아미노산 수준에서 상동성 서열 또는 상동성인 보존된 서열 영역은 배열 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 cDNA는 혼성화 프로브로서 완전한 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및(또는) 서열 11, 또는 그의 부분을 사용하고 표준 혼성화 기술에 의해 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 라이브러리로부터 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기재된 바와 같음). 또한, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 완전한 서열 또는 그의 부분을 포함하는 핵산 분자는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리할 수 있는데, 이러한 서열 또는 그의 부분, 특히 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 His-박스 모티프 주변의 영역 또는 이들 각각의 정의된 아미노산의 변형물을 토대로 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용된다 (예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 완전한 서열 또는 그의 부분을 포함하는 핵산 분자는 이들 동일한 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열을 토대로 생성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리할 수 있다). 또한, 이러한 목적에 특히 적합한 것은 도 10에 나타낸 이들의 부분 서열이다. 예를들어, mRNA는 세포로부터 (예를 들어, 문헌 (Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299)에 기재된 구아니디니움 티오시아네이트 추출 방법에 의해 단리할 수 있으며, cDNA는 역전사효소 (예를 들어, Gibco/BRL (Bethesda, MD)로부터 입수가능한 Moloney MLV 역전사효소, 또는 Seikagaku America, Inc.(St. Petersburg, FL)사로부터 입수가능한 AMV 역전사효소)에 의해 생성할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열중 하나를 토대로 또는 도 10에 나타낸 아미노산 서열을 사용하여 생성할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 표준 PCR 증폭 기술에 따라 cDNA를 사용하거나, 또는 주형으로 게놈 DNA 및 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산은 적합한 벡터내에 클로닝될 수 있으며, DNA 서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. PSE 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 방법, 예를 들어 자동화 DNA 합성기를 사용하여 생성할 수 있다.
서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 cDNA는 PSE를 코딩하는 서열 (즉, "코딩 영역")을 포함하며 또한 5'-비번역 서열 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 또는, 핵산 분자는 단지 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열들 중 하나의 코딩 영역을 포함하거나 또는 게놈 DNA로부터 단리된 완전한 게놈 단편을 포함할 수 있다.
서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12는 관련성에 대하여 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11과 동일한 EST 입력 번호 코드에의해 확인된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열들 중 하나 또는 그의 부분의 상보체이다. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열들 중 하나에 상보적인 핵산 분자는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열들 중 하나와 혼성화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 경우 충분히 상보적이다.
서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열을 갖는 새로운 연장효소 핵산 서열의 동족체란 예를 들어 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열들중 하나 또는 그의 동족체, 유도체 또는 유사체, 또는 이들의 일부와 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 또는 90 내지 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 대립유전자 변이체를 의미한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열들 중 하나 또는 그의 부분과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대립유전자 변이체는 특히 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열로부터(서열내에) 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 얻어질 수 있는 기능성 변이체를 포함하지만, 하나 이상의 유전자의 삽입에 대하여 합성되는 생성 단백질의 효소 활성이 이롭게 유지되도록 의도된다. 연장효소의 효소 활성을 보유하는 단백질이란 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 의해 코딩되는 단백질과 비교하여 원래 효소 활성의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 특히 바람직하게는 30% 이상, 매우 특히 바람직하게는 40% 이상을 갖는 단백질을 의미한다. 상기 언급한 활성을 보유하는 연장효소는 효소 활성이 실질적으로 감소되지 않은 연장효소를 의미한다.
서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 동족체는 또한 예를 들어 코딩 및 비코딩 DNA 서열에 대한 박테리아, 진균 및 식물의 동족체, 말단절단된 서열, 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 의미한다.
또한, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 동족체는 예를 들어 프로모터 변이체 등의 유도체를 의미한다. 설명된 뉴클레오티드 서열 상류의 프로모터는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및(또는) 결실에 의해 변형될 수 있지만, 프로모터의 기능성 또는 활성을 방해하지는 않는다. 또한, 이들 서열의 변형에 의해, 또는 이종 생물체일지라도 보다 활성인 프로모터에 의해 이들이 완전히 치환됨으로써 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열들 중 하나의 코딩 영역의 일부, 예를 들어 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있는 단편 또는 PSE의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 단편만을 포함할 수 있다. 피스코미트렐라 파텐스, 피토프토라 인페스탄스, 트라우스토키트리움 및 크립테코디니움의 PSE 유전자를 클로닝하는 것으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열은 다른 세포 유형 및 생물에서 PSE 동족체와 기타 이끼류 또는 관련된 종으로부터 PSE 동족체를 동정 및(또는) 클로닝하도록 설계된 프로브 및 프라이머를 생성시킬 수 있다. 통상, 프로브/프라이머는 본질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열들 중 하나의 센스 가닥, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열들 중 하나의 안티센스 가닥, 또는 이들의 동족체, 유도체 및 유사체, 또는 이들의 자연 발생적인 변이체의 연속 올리고뉴클레오티드 약 12개 이상, 바람직하게는 약 16개 이상, 보다 바람직하게는 약 25개, 40개, 50개 또는 75개 이상과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 프라이머는 PSE 동족체를 클로닝하기 위한 PCR 반응에 사용될 수 있다. PSE 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 프로브는 동일하거나 상동성인 단백질을 코딩하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로브는 그에 결합된 표지기, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 추가로 포함한다. 이러한 프로보는 세포 샘플에서 PSE-코딩 핵산의 양을 측정하여, 예를 들어 PSE mRNA 수준을 측정하여 PSE를 오발현 (misexpress)시키는 세포를 확인하기 위한 시험 키트, 또는 게놈 PSE 유전자가 변이 또는 결실되었는지를 결정하기 위한 시험 키트의 일부로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 미생물 또는 식물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 보유하는 단백질 또는 그의 부분에 대하여 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 충분한 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 부분을 코딩한다. 본원에 사용된 바와 같이, "충분한 상동성"이라는 용어는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 동등한 최소수의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 2 내지 서열 12의 서열들 중 하나의 아미노산 잔기 등의 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)를 갖는 서열을 보유하는 단백질 또는 그의 부분과 관련되며, 이 단백질 또는 그의 부분은 미생물 또는 식물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 막 성분 또는 막 운반계에 대한 이러한 대사 경로중의 단백질 성분은 1종 이상의 미세 화학물질의 생산 및 분비에 있어서 역할을 할 수 있다. 이러한 활성의 예가 또한 본원에 기재되어 있다. 즉, "PSE의 기능"은 1종 이상의 미세 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율에 직접 또는 간접적으로 기여한다. 촉매 활성의 PSE 기질 특이성의 예는 표 1에 나타나 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 유도체는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 완전한 아미노산 서열과 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩한다. 아미노산서열의 상동성은 프로그램 PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5, 1989:151-153) 또는 BESTFIT 또는 GAP (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992). Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)을 사용하여 전체 서열 영역에 대하여 결정하였다.
본 발명에 따른 PSE 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 부분은 바람직하게는 PSE 중 하나의 생물학적으로 활성인 부분이다. 본원에 사용된 바와 같이, "PSE의 생물학적으로 활성인 부분"이라는 용어는 미생물 또는 식물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있거나 또는 표 1에 나타낸 활성을 갖는 PSE의 단편, 예를 들어 도메인/모티프를 포함하는 의미이다. 효소 활성의 분석은 PSE 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분이 미생물 또는 식물에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있는지를 결정하기 위해 수행할 수 있다. 실시예 부분의 실시예 8에 상세히 기재된 이러한 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
PSE의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 다른 핵산 단편은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에서 이러한 서열들 중 하나의 부분을 단리하는 단계, (예를 들어, 시험관내 재조합 발현에 의해) PSE 또는 펩티드의 코딩된 단편을 발현시키는 단계, 및 PSE 또는 펩티드의 코딩된 부분의 활성을 결정하는 단계에 의해 생성시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11 (및그의 부분)에 나타낸 뉴클레오티드 서열들 중 하나와 서열이 상이하지만, 유전자 코드의 다의성으로 인해 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 동일한 PSE를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12 (서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)의 아미노산 서열과 본질적으로 상동성이 있으며, 통상의 방법에 의해 동정 및 단리될 수있는 전장 PSE 단백질을 코딩한다.
서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 PSE 뉴클레오티드 서열 이외에, 당업자라면 집단 (예를 들어, 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 집단)내에서 PSE의 아미노산 서열의 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성 (polymorphism)이 존재할 수 있음을 알 것이다. PSE 유전자내의 이러한 유전적 다형성은 자연적인 변이로 인해 집단내의 개체들 사이에서 존재할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "유전자" 및 "재조합 유전자"라는 용어는 PSE를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 갖는 핵산 분자, 바람직하게는 피토프토라, 피스코미트렐라 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 PSE를 의미한다. 이러한 천연 변이체는 일반적으로 PSE 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1 내지 5%의 변이를 일으킨다. 자연적인 변이의 결과이며 PSE의 기능적 활성을 변화시키지 않는, PSE에서의 이러한 뉴클레오티드 변화 및 생성되는 아미노산 다형성의 모두는 본 발명의 범위내인 것으로 의도된다.
피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 cDNA의 자연적인 변이체 및 비-피스코미트렐라, 비-크립테코디니움 또는 비-트라우스토키트리움 동족체, 유도체 및 유사체의 핵산 분자는, 본원에 개시된 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 PSE 핵산과 이들의 상동성으로 인해 엄격 혼성화 조건하에 표준 혼성화 기술에 따라 혼성화 프로브로서 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 cDNA 또는 그의 부분을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 뉴클레오티드 15개의 최소 길이를 가지며, 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 혼성화한다. 다른 실시양태에서, 핵산은 뉴클레오티드 25개, 50개, 100개, 250개 또는 그 이상의 최소 길이를 갖는다. 본원에 사용된 "엄격 조건하에 혼성화하는"이라는 용어는 서로 60% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 서로 혼성화된채로 남아 있도록 하는 혼성화 및 세척 조건을 설명하는 의미이다. 이 조건은 서로 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 75% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 서열이 일반적으로 서로 혼성화된 채로 남아 있는 조건인 것이 바람직하다. 이러한 엄격 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)에서 찾을 수 있다. 엄격 혼성화 조건의 바람직한 비제한적예는 약 45 ℃에서 6 ×염화나트륨/시트르산나트륨 (염화나트륨/시트르산나트륨 = SSC) 중의 혼성화 이후에 50 내지 65 ℃에서 0.2 ×SSC, 0.1% SDS 중에서의 1회 이상의 세척 단계를 수행하는 것이다. 이러한 혼성화 조건은 핵산의 유형, 예를 들어 유기 용매가 존재하는 경우 완충액의 온도 및 농도에 따라 다르다는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 온도는 "표준 혼성화 조건"하에 0.1 내지 5 ×SSC (pH 7.2)의 농도의 수성 완충액 중에서 42 ℃ 내지 58 ℃의 온도에서 핵산의 유형에 따라 달라진다. 유기 용매가 상기 언급한 완충액, 예를 들어 50% 포름아미드 중에 존재하는 경우, 표준 조건하의 온도는 약 42 ℃이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는 예를 들어 0.1 ×SSC 및 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 45 ℃이다. DNA:RNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는 예를 들어 0.1 ×SSC 및 30 ℃ 내지 55 ℃, 바람직하게는 45 ℃ 내지 55 ℃이다. 상기 언급한 혼성화 온도는 예를 들어 길이가 약 100 bp (= 염기쌍)이고 포름아미드의 부재하에 G + C 함량이 50%인 핵산에 대하여 결정된다. 당업자라면 상기 언급한 참고문헌 등의 문헌 또는 문헌 (Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames and Higgins (Ed.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford)을 참고로 하여 필요한 혼성화 조건을 어떻게 결정할 수 있는지를 알 것이다.
바람직하게는, 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및서열 11의 서열과 혼성화하는 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 자연 발생적인 핵산 분자에 대응한다. 본원에 사용된 바와 같이, "자연 발생적인" 핵산 분자란 자연에 존재하는 (예를 들어, 천연 단백질을 코딩하는) 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 한 실시양태에서, 핵산은 자연 발생적인 피스코미트렐라 파텐스 PSE, 피토프토라 인페스탄스 PSE, 크립테코디니움 코니 PSE 또는 트라우스토키트리움 PSE를 코딩한다.
집단내에 존재할 수 있는 PSE 서열의 자연 발생적인 변이체 이외에, 당업자라면 또한 돌연변이에 의한 변화가 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열내에 도입될 수 있고, 이는 PSE 단백질의 기능에 부정적인 영향을 주지 않으면서 코딩된 PSE의 아미노산 서열을 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에 대해 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열에서 발생될 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기란 PSE의 활성에 영향을 주지 않으면서 PSE (서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12) 중 하나의 야생형 서열에서 변화될 수 있는 잔기이지만, "필수" 아미노산 잔기는 PSE 활성에 대하여 요구된다. 그러나, 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, PSE 활성 도메인에서 보존되지 않거나 단지 반-보존된 잔기)는 활성에 대해 필수적이지 않을 수 있으며, 따라서 PSE 활성을 변화시키지 않으면서 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 PSE 활성에 대하여 필수적이지 않은 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 PSE를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 PSE는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 서열과 아미노산 서열에 있어서 상이하지만, 본원에 개시된 PSE 활성들 중 하나 이상을 여전히 보유한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 약 50% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 피토프토라, 피스코미트렐라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 서열들 중 하나와 바람직하게는 약 50 내지 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
두 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 서열 중 하나와 그의 돌연변이 형태) 또는 두 핵산 서열의 상동성 비율을 결정하기 위해, 최적의 비교를 위해 한 서열을 다른 서열 밑에 나타내었다 (예를 들어, 다른 단백질 또는 다른 핵산과의 최적의 비교를 위해 단백질 또는 핵산의 서열내에 갭을 도입할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 한 서열 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 서열들 중 하나)에서의 어떤 위치가 다른 서열 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10및 서열 12로부터 선택된 서열의 돌연변이 형태)에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 이 위치에서 상동성이 있다고 한다 (즉, 본원에 사용된 아미노산 또는 핵산의 "상동성"은 아미노산 또는 핵산의 "동일성"에 대응된다). 두 서열 사이의 상동성 비율은 서열이 공유하는 동일한 위치의 개수에 대한 함수이다 (즉, 상동성 (%) = 동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 ×100).
서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 단백질 서열과 상동성이 있는 PSE를 코딩하는 단리된 핵산 분자는, 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 코딩되는 단백질에 도입되도록, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열내에 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가 또는 결실을 도입하여 생성시킬 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법 등의 표준 기술에 의해 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열들 중 하나에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 보존된 아미노산 치환은 하나 이상의 추정 비필수 아미노산 잔기에서 발생된다. "보존적 아미노산 치환"에서, 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교환한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 전문가 분야에서 정의되었다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 쓰레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. PSE에서 추정 비필수 아미노산 잔기는 따라서 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교환된다. 다른 것으로서, 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 포화 돌연변이유발법에 의해 PSE-코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위적으로 돌연변이를 도입할 수 있고, 생성된 돌연변이를 본원에 기재된 PSE 활성에 대하여 스크리닝하여 PSE 활성을 보유하는 변이체를 확인할 수 있다. 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열들 중 하나의 돌연변이유발 이후에, 코딩된 단백질은 재조합적으로 발현되며, 단백질의 활성은 예를 들어 본원에 기재된 분석법을 이용하여 결정할 수 있다 (예를 들어, 실시예 부분을 참조).
상기 기재된 PSE를 코딩하는 핵산 분자 이외에도, 본 발명의 다른 측면은 이들에 대하여 "안티센스"인 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. "안티센스" 핵산은 단백질을 코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 이중 가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥 또는 mRNA 서열에 상보적인 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 안티센스 핵산은 수소 결합을 통해 센스 핵산에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 완전한 PSE-코딩 가닥 또는 그의 일부에만 상보적일 수 있다. 한 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 PSE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "코딩 영역"에 대해 "안티센스"이다. "코딩 영역"이라는용어는 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역 (예를 들어, 시작하여 종결 코돈, 즉 종결 코돈 앞의 마지막 코돈으로 끝나는 전체 코딩 영역)을 의미한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 PSE를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "비코딩 영역"에 대해 "안티센스"이다. "비코딩 가닥"이라는 용어는 코딩 영역을 플랭킹하며 아미노산 잔기로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열 (즉, 또한 5'- 및 3'-비번역 영역이라고도 부른다)을 의미한다.
코딩 가닥인 본원에 개시된 PSE-코딩 서열 (예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열)을 고려하여, 본 발명에 따른 안티센스 핵산을 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍 규칙에 따라 설계할 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 PSE mRNA의 모든 코딩 영역에 대해 상보적일 수 있지만, 보다 바람직하게는 PSE mRNA의 코딩 또는 비코딩 영역의 일부에만 "안티센스"인 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PSE mRNA의 번역 개시 부위 부근의 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 뉴클레오티드 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 이상의 길이를 가질 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이롭게는 뉴클레오티드 15개 내지 25개 길이이다. 본 발명에 따른 안티센스 핵산은 화학 합성법 및 효소 라이게이션 반응을 이용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 자연 발생적인 뉴클레오티드 또는 각종 변형된 뉴클레오티드를 이용하여 이들이 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘-치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 특히 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 메틸 우라실-5-옥시아세테이트, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린이 있다. 또는, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 방향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 발생시킬 수 있다 (즉, 도입되는 핵산에 의해 전사되는 RNA는 대상 표적 핵산에 대해 안티센스 방향으로 있으며, 이는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다).
본 발명에 따른 안티센스 핵산 분자는 일반적으로 세포에 투여되고 원위치에서 생성되며, 이들은 PSE를 코딩하는 세포내 mRNA 및(또는) 게놈 DNA와 혼성화하거나 결합함으로써, 예를 들어 전사 및(또는) 번역을 억제한다. 혼성화는 안정한 듀플렉스를 형성하는 통상의 뉴클레오티드 상보성에 의해 수행되거나 또는 예를 들어 DNA 듀플렉스와 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우 이중 듀플렉스의 큰 홈 (cleft)에서의 특이적 상호작용에 의해 수행될 수 있다. 안티센스 분자는 그가 수용체 또는 선택된 세포 표면에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 방식으로, 예를 들어 안티센스 핵산 분자를, 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항체에 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 벡터를 이용하여 안티센스 핵산 분자를 세포에 제공할 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하는데 있어서는, 안티센스 핵산 분자가 식물 프로모터를 비롯하여 강력한 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 프로모터의 조절하에 있는 벡터 구조물이 바람직하다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 (anomer) 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적 RNA와 특이적 이중-가닥 하이브리드를 형성하며, 이들 가닥들은 통상의 β-유닛과는 달리 서로에 대해 평행하게 유지된다 [Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641]. 또한, 안티센스 핵산 분자는 2'-o-메틸리보뉴클레오티드 [Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148] 또는 키메라 RNA-DNA 아날로곤 (analogon) [Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330]을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 안티센스 핵산은 리보자임 (ribozyme)이다. 리보자임은 이들이 상보적 영역을 갖는 단일-가닥 핵산, 예를 들어 mRNA를 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임, 예를 들어 햄머헤드 (hammerhead) 리보자임 [문헌 (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591)에 기재되어 있음]은 PSE mRNA의 번역을 억제하기 위한 PSE mRNA 전사체의 촉매적 절단에 사용될 수 있다. PSE-코딩 핵산에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 본원에 개시된 PSE cDNA의 뉴클레오티드 서열 (즉, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에서 38 ℃ k21_g07fwd)을 기초로 하여 또는 본 발명에 교시된 방법에 따라 단리되는 이종 서열을 기초로 하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 테트라히메나 (Tetrahymena)-L-19-IVS RNA의 유도체를 구성할 수 있는데, 여기서 활성 부위의 뉴클레오티드 서열은 PSE-코딩 mRNA에서 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이다. 예를 들어, 문헌 (Cech et al., US 4,987,071 and Cech et al., US 5,116,742)을 참조한다. 다른 것으로는, RNA 분자의 푸울 중에서 특이적 뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선별하는데 있어서 PSE mRNA를 사용할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Bartel, D., and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418)을 참조한다].
대안으로, 3중 나선형 구조물을 형성시켜 이것이 대상 세포에서 PSE 유전자의 전사를 억제하는 방식으로 PSE 뉴클레오티드 서열의 조절 영역 (예를 들어, PSE 프로모터 및(또는) 인핸서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 지시하여 PSE 유전자 발현을 억제시킬 수 있다 [일반적으로, 문헌 (Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-84; Helene, C., et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher. L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-815)을 참조한다].
B.유전자 구조물
본 발명의 다른 실시양태는 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움으로부터 유도된 단리된 핵산을 포함하는 신규 유전자 구조물에 관한 것이며, 이 구조물은 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장하는 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 이롭게는 유전자 발현을 증가시키는데 있어서 하나 이상의 조절 신호에 기능적으로 연결된 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 유전자 서열, 그의 동족체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 이러한 조절 서열이 예로는 인덕터 (inductor) 또는 리프레서 (repressor)에 결합하여 이러한 방식으로 핵산의 발현을 조절하는 서열이 있다. 이러한 신규 조절 서열 이외에도, 실제적인 구조 유전자 앞쪽에서 이러한 서열의 자연적인 조절이 있을 수 있으며, 경우에 따라 유전적으로 변형되어, 자연적인 조절이 중지되고 (switched off) 유전자의 발현은 증대된다. 그러나, 유전자 구조물은 유사한 구조를 가질 수도 있는데, 즉 다른 조절 신호는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 서열 또는 이들의 동족체의 앞쪽에 삽입되지 않고, 조절능을 갖는 천연 프로모터는 결실되지 않는다. 대신에, 천연 조절 서열은 조절이 더 이상 일어나지 않으며 유전자 발현이 증대되는 방식으로 돌연변이되었다. 또한, 유전자 구조물은 이롭게는 프로모터에 기능적으로 연결되어 핵산 서열의 발현을 증가시키는 1종 이상의 소위 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 또한, 추가적으로 DNA 서열의 3' 말단에 이로운 서열, 예를 들어 다른 조절 요소 또는 터미네이터 (terminator)를 삽입시킬 수도 있다. 연장 효소 유전자는 유전자 구조물 중에 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다. 다른 유전자가 유전자 구조물내에 존재하는 경우, 추가의 유전자를 생물에 삽입시키는 것이 이롭다.
신규한 방법에 대한 이로운 조절 서열은 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR또는 λ-PL프로모터 등의 프로모터 중에 존재하며, 이롭게는 그람-음성 박테리아에서 사용된다. 다른 유리한 조절 서열은 예를 들어 그람 양성 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, 또는 식물 프로모터 CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos, 또는 유비퀴틴 또는 파세올린 프로모터내에 존재한다. 본원에서 이로운 것은 유도성 프로모터, 예를 들어 문헌 (EP-A-0 388 186 (벤질술폰아미드-유도성), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., 테트라사이클린-유도성), EP-A-0 335 528 (아브시스산 (abscisic acid)-유도성) 또는 WO 93/21334 (에탄올- 또는 시클로헥세놀-유도성))에 개시된 프로모터이다. 다른 적합한 식물 프로모터는 세포질 FBPase 또는 포테이토 ST-LSI 프로모터 (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), 글라이신 맥스 (max) 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 프로모터 (Genbank Accession No. U87999) 또는 EP-A-0 249 676에 기재된 노드 (node)-특이적 프로모터이다. 특히 이로운 프로모터는 지방산 생합성에 관여하는 조직내의 발현을 허용하는 프로모터이다. 매우 특히 이로운 것은 종자 (seed)-특이적 프로모터, 예를 들어 usp, LEB4, 파세올린 또는 나핀 (napin) 프로모터이다. 보다 특히 이로운 프로모터는 문헌 (US 5,608,152 (평지 나핀 프로모터), WO 98/45461 (아라비돕시스 (Arabidopsis) 파세올린 프로모터), US 5,504,200 (파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris) 파세올린 프로모터), WO 91/13980 (브라시카 (Brassica) Bce4-프로모터), Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (콩과식물 LEB4 프로모터))에 기재된 모노코트 (monocot) 또는 디코트 (dicot)에 사용될 수 있는 종자-특이적 프로모터이며, 이러한 프로모터는 디코트에 대하여 적합하다. 모노코트에 대하여는, 예를 들어 보리 lpt-2 또는 lpt-1 프로모터 (WO 95/15389 및 WO 95/23230), 보리 호르데인 (hordein) 프로모터, 및 WO 99/16890에 기재된 다른 적합한 프로모터가 적합하다.
원칙적으로, 본 발명의 새로운 방법에 있어서 상기 언급된 바와 같은, 조절 서열을 갖는 모든 천연 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터를 사용하는 것이 가능하며 이롭다.
상기 언급된 바와 같이, 유전자 구조물은 또한 생물내에 도입되는 다른 유전자를 포함할 수도 있다. 효소 활성으로 인해 생합성 경로의 하나 이상의 유전자의 조절에 관여하는 인덕터, 리프레서 또는 효소에 대한 유전자 등의 조절 유전자를 숙주 생물내에 도입하여 그 곳에서 발현시키는 것이 가능하며 유리하다. 이러한 유전자는 이종 또는 동종 기원의 것일 수 있다. 삽입된 유전자는 자신의 고유한프로모터를 가지거나 또는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11, 또는 이들의 동족체, 유도체 또는 유사체의 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.
존재하는 다른 유전자를 발현시키기 위해, 유전자 구조물은 발현을 증가시키기 위한 3'- 및(또는) 5'-말단의 조절 서열을 더 포함하는 것이 이로우며, 이들은 선택된 숙주 생물 및 유전자의 작용으로 최적의 발현을 위해 선택된다.
상기 언급한 바와 같이, 이러한 조절 서열은 유전자의 특이적 발현 및 단백질의 발현을 가능하게 하도록 의도된다. 숙주 생물에 따라, 이것은, 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현되거나 과다발현되는 것 또는 유전자가 즉시 발현되고(되거나) 과다발현되는 것을 의미할 수 있다.
또한, 조절 서열 또는 조절 요소는 바람직하게는 도입되는 유전자의 발현에 대하여 이로운 효과를 가지며, 따라서 발현을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 조절 요소는 이롭게는 전사 수준에서 강한 전사 신호, 예를 들어 프로모터 및(또는) 인핸서를 사용하여 증가될 수 있다. 그러나, 또한 예를 들어 mRNA 안정성을 향상시켜 번역을 증대시킬 수도 있다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 이롭게는 유전자 구조물 (= 발현 카세트, 핵산 구조물)내에 하나 이상의 리포토 유전자와 함께 클로닝되며, 이 유전자 구조물은 벡터를 통해 또는 게놈내에 직접 도입된다. 이러한 리포터 유전자는 증식, 형광, 화학발광, 생물발광 또는 내성 분석에 의해 또는 광측정을 통한 용이한 검출을 가능하게 한다. 언급될 수 있는 리포터 유전자의 예로는 항생제 또는 제초제에 대한 내성 유전자, 히드롤라제 유전자, 형광 단백질 유전자, 생체발광 유전자, 당 또는 뉴클레오티드 대사 유전자 또는 생합성 유전자,예를 들어 Ura3 유전자, Ilv2 유전자, 루시페라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자, gfp 유전자, 2-데옥시글루코스-6-포스페이트 포스파타제 유전자, β-글루쿠로니다제 유전자, β-락타마제 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 또는 BASTA (= 글루포시네이트 내성) 유전자가 있다. 이러한 유전자는 전사 활성, 즉 유전자 발현이 쉽게 측정 및 정량될 수 있도록 한다. 이로서 다른 생산성을 나타내는 게놈에서 위치를 확인할 수 있게 한다.
연장효소를 코딩하는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 본 발명에 따른 핵산 서열은 발현 카세트 (= 유전자 구조물) 중에 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다.
발현 카세트 (= 유전자 구조물, 핵산 구조물)는 숙주 생물내에 도입되는, 바람직하게는 지방산 생합성의 유전자를 코딩하는 하나 이상의 다른 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 이들 유전자는 본 발명에 따른 연장효소에 대한 유전자와 다른 조절하에 있거나 또는 동일한 조절 영역에 있을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어 지방산 생합성에 있어서 이롭게는 합성을 증가시킬 수 있는 다른 생합성 유전자이다. 예로서 언급될 수 있는 유전자는 △19-, △17-, △15-, △12-, △9-, △8-, △6-, △5-, △4-불포화효소, 각종 히드록실라제, △12-아세틸레나제, 아실-ACP 티오에스테라제, β-케토아실-ACP 신타제 또는 β-케토아실-ACP 리덕타제에 대한 유전자이다. 불포화효소 유전자는 이롭게는 핵산 구조물내에서 사용된다. 마찬가지로, 이러한 유전자는 유전자 구조물내에 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다.
C.재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 벡터, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 또는 PSE (또는 그의 부분)를 코딩하는 본 발명에 따른 유전자 구조물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "벡터"라는 용어는 그가 결합된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 유형은 다른 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 다른 DNA 단편이 바이러스 게놈내에 라이게이션될 수 있다. 어떤 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포내에서 스스로 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아의 복제 오리진를 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀 (episomal) 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포내에 도입되는 경우에 숙주 세포의 게놈내로 통합되며, 그래서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 어떤 벡터는 이들이 기능적으로 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 적합한 발현 벡터는 플라스미드 형태를 갖는다. 본원에서, 플라스미드는 가장 자주 사용되는 벡터 형태이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 바꾸어 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 유사한 기능을 수행하는, 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제-결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 등의 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 벡터라는 용어는 당업자에게 공지된 다른 벡터, 예를 들어 파아지, 바이러스, 예를 들어 SV40, CMV, 바쿨로바이러스, 아데노바이러스, 트랜스포존, IS 요소, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 선형 또는 원형 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 유전자 구조물을 숙주 세포에서 핵산을 발현시키기에 적합한 형태로 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포를 기초로 하여 선택된, 발현되는 핵산 서열에 기능적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, "기능적으로 연결된"이란 뉴클레오티드 서열의 발현이 가능한 방식으로 대상 뉴클레오티드 서열에 연결되어 있고, 이들이 서로 연결되어 있어서 두 서열이 서열에 근거한 예상 기능을 수행하는 것을 의미한다 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 또는 숙주 세포에서, 벡터가 숙주 세포로 도입되는 경우). "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 (Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed.: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108) 및 이들 문헌에 포함된 참고문헌에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 조절하는 서열 및 특정 조건하의 어떤 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 직접적 발현을 조절하는 것을 포함한다. 당업자라면 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및 목적하는 단백질이 발현되는 정도 등의요소에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포로 도입하여 본원에 개시된 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 융합 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, PSE, PSE의 변이체 형태 및 융합 단백질 등)를 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 PSE를 발현시키도록 설계할 수 있다. 예를 들어, PSE 유전자는 박테리아 세포, 예를 들어 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum), 곤충 세포 (바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용), 효모 및 다른 진균 세포 [see Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge], 조류 [Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239-251], 다음과 같은 유형의 섬모류, 즉 홀로트리키아 (Holotrichia), 페리트리키아 (Peritrichia), 스피로트리키아 (Spirotrichia), 수크토리아 (Suctoria), 테트라히메나 (Tetrahymena), 파라메시움 (Paramecium), 콜피디움 (Colpidium), 글라우코마 (Glaucoma), 플라티오프리아 (Platyophrya), 포토마쿠스 (Potomacus), 슈도코닐렘부스 (Pseudocohnilembus), 유플로테스(Euplotes), 엔겔마니엘라 (Engelmaniella) 및 스틸로니키아 (Stylonychia), 특히 스틸로니키아 렘나 (Stylonychia lemnae) 속의 섬모류에서 발현될 수 있으며, 벡터 및 WO 98/01572에 기재된 형질전환 방법, 및 다세포 식물의 세포 [문헌 (Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Chapter 6/7, pp.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌] 또는 포유동물 세포가 사용된다. 적합한 숙주 세포는 또한 문헌 (Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 논의되어 있다. 다른 것으로, 재조합 발현 벡터는 시험관내에서 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 전사 및 번역될 수 있다.
원핵세포에서, 단백질은 일반적으로 융합 단백질 또는 비융합 단백질의 발현을 조절하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 사용하여 발현된다. 융합 벡터는 일련의 아미노산을 그에 의해 코딩되는 단백질에, 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단 및 C 말단에 부가하거나 또는 단백질의 적합한 영역내에 융합시킨다. 이러한 융합 벡터는 일반적으로 다음과 같은 세가지 역할을 한다: 1)재조합 단백질의 발현을 증가시키는 것; 2) 재조합 단백질의 용해성을 증가시키는 것; 및 3) 친화성 정제에서 예를 들어 소위 his 태그를 통해 리간드로 작용하는 것에 의해 재조합 단백질의 정제를 지지하는 것. 융합 발현 벡터의 경우, 단백질분해 절단 부위는 흔히 융합 단위 및 재조합 단백질이 연결되는 부위에 도입되어, 융합 단백질의 정제 후에 재조합 단백질이 융합 단위로부터 분리될 수 있다. 이러한 효소 및 이들의 상응하는 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.
전형적인 융합 발현 벡터는 특히 pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL [New England Biolabs, Beverly, MA] 및 pRIT5 [Pharmacia, Piscataway, NJ]이고, 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스-E-결합 단백질 또는 단백질 A는 재조합 표적 단백질에 융합된다. 한 실시양태에서, PSE-코딩 서열은 pGEX 발현 벡터내에 클로닝되어 N 말단으로부터 C 말단으로 GST-트롬빈 절단 부위-X-단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 생성시킨다. 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. GST와 융합되지 않는 재조합 PSE는 트롬빈을 사용하여 융합 단백질을 절단하여 얻을 수 있다.
적합한 유도성 비융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 특히 pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) 및 pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89)이다. pTrc 벡터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 기초로 한다. pET 11d 벡터의 표적 유전자 발현은 공동발현되는 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7 gn1)에 의해 매개되는 T7-gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사를 기초로 한다. 이러한 바이러스 폴리머라제는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절하에 T7 gn1 유전자를 보유하는 상주 λ프로파지에 의해 숙주 균주 BL21 (DE3) 또는 HMS174 (DE3)에 의해 제공된다.
원핵생물에 사용하기에 적합한 다른 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이러한 벡터로는 예를 들어 이. 콜라이에서 pLG338, pACYC184, pBR 시리즈, 예를 들어 pBR322, pUC 시리즈, 예를 들어 pUC18 또는 pUC19, M113mp 시리즈, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, pgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스 (Streptomyces)에서 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실루스 (Bacillus)에서 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 (Corynebacterium)에서 pSA77 또는 pAJ667이 있다.
재조합 단백질의 발현을 최대화하는 전략은 재조합 단백질을 단백질분해로 절단하는 능력이 소멸된 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 것이다 [Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]. 다른 전략은 발현 벡터내에 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변형시키는 것이며, 각 아미노산에 대한 각 코돈은 발현을 위해 선택되는 박테리아, 예를 들어 씨. 글루타미쿰에서 주로 사용되는 것이다 [Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]. 본 발명에 따른 핵산 서열의 변형은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행된다.
다른 실시양태에서, PSE 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지아 (S. cerevisiae)에서 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 [Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234], pMFa [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943], pJRY88 [Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123] 및 pYES2 [Invitrogen Corporation, San Diego, CA]가 포함된다. 벡터, 및 다른 진균, 예를 들어 사상 진균 등에 사용하기에 적합한 벡터의 구성을 위한 방법으로는 문헌 (van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, or in: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Ed., pp. 396-428: Academic Press: San Diego])에 상세히 기재된 것들이 포함된다. 다른 적합한 효모 벡터로는 예를 들어 pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23가 있다.
대안으로, 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 본 발명에 따른 PSE를 곤충 세포에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질을 발현시키는데 이용가능한 바쿨로바이러스 벡터로는 pAc 시리즈 [Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 및 pVL 시리즈 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39]가 포함된다.
상기 언급한 벡터는 이용가능한 적합한 벡터의 몇가지 예일 뿐이다. 다른 플라스미드가 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 (Cloning Vectors (Ed.Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018))에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8 [Seed, B. (1987) Nature 329:840] 및 pMT2PC [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195]가 포함된다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 흔히 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 일반적으로 사용되는 프로모터는 예를 들어 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 (simian) 바이러스 40로부터 유도된다. 원핵세포 및 진핵세포를 위한 다른 적합한 발현계는 문헌 (Chapters 16 and 17 of Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에서 찾을 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 조절할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현시키는데 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비제한적 예는 특히 알부민 프로모터 [간-특이적; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277], 림프계-특이적 프로모터 [Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275], 특히 T-세포 수용체 [Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 이뮤노글로불린 [Banerji et al. (1983)Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748]의 프로모터, 뉴론-특이적 프로모터 [예를 들어, 신경섬유 프로모터; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477], 췌장-특이적 프로모터 [Edlund et al., (1985) Science 230:912-916] 및 포유기관 (mamma)-특이적 프로모터 [예를 들어, 밀크 혈청 프로모터; US 4,873,316 및 EP-A-0 264 166]가 있다. 또한, 발생-조절된 프로모터, 예를 들어 마우스 hox 프로모터 [Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379] 및 페토 (feto)-단백질 프로모터 [Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546]가 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 PSE는 단세포 식물 세포 (예를 들어, 조류; algae) (문헌 (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251) 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌 참조) 및 고등 식물 (예를 들어, 작물 등의 종자식물)로부터의 식물 세포에서 발현될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 (Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38)에 상세히 기재된 것들이 포함된다. 다른 적합한 벡터는 특히 문헌 ("Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chapter 6/7, pp. 71-119)에기재되어 있다. 이로운 벡터는 이. 콜라이 및 아그로박테리움 (Agrobacterium)에서 복제하는 이른바 셔틀 (shuttle) 벡터 또는 바이너리 (binary) 벡터이다.
식물 발현 카세트는 바람직하게는 식물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있고, 기능적으로 연결되어 있어서 전사 종결, 예를 들어 폴리아데닐화 신호와 같은 기능을 수행할 수 있는 조절 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리아데닐화 신호는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) t-DNA로부터 유도된 것들, 예를 들어 옥토파인 (octopine) 신타제로 알려져 있는 Ti 플라스미드 pTiACH5의 유전자 3 [Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 et seq.] 또는 그의 기능적 동등물이 있지만, 식물에서 기능적으로 활성인 모든 다른 터미네이터도 또한 적합하다.
식물 유전자 발현은 매우 자주 전사 수준으로 한정되지 않기 때문에, 유전자 발현 카세트는 바람직하게는 다른 기능적으로 연결된 서열, 예를 들어 번역 인핸서, 예를 들어 단백질/RNA 비율을 증가시키는, 5'-비번역성 담배 모자이크 바이러스 리더 서열을 포함하는 오버드라이브 (overdrive) 서열을 포함한다 [Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711].
식물 유전자 발현은 정확한 타이밍으로 세포- 또는 조직-특이적인 방식으로 유전자 발현을 수행하는 적합한 프로모터에 기능적으로 연결되어야 한다. 바람직한 프로모터는 구성적 발현을 초래하는 것들 [Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202], 예를 들어 식물 바이러스, 예를 들어 35S CAMV [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], 19S CaMV (see also US 5,352,605 and WO 84/02913)로부터 유래하는 것들, 또는 US 4,962,028에 기재된 루비스코 (Rubisco) 작은 서브유닛 프로모터와 같은 식물 프로모터이다.
식물 유전자 발현 카세트에서 기능적 연결에 사용하기에 바람직한 다른 서열은 유전자 생성물을 그의 상응하는 세포 부분, 예를 들어 식물 세포의 액포, 핵, 모든 유형의 플라스티드 (plastid), 예를 들어 아밀로플라스트, 클로로플라스트, 크로모플라스트, 세포외 공간, 미토콘드리아, 소포체, 엘라이오플라스트 (elaioplast), 페록시좀 및 다른 부분으로 표적화하는데 요구되는 표적화 서열이다 [검토를 위해서는, 문헌 (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423) 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다].
식물 유전자 발현은 또한 화학적으로 유도가능한 프로모터를 통해 촉진될 수도 있다 [검토를 위해서는,, 문헌 (Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108)을 참조한다]. 화학적으로 유도가능한 프로모터는 유전자 발현이 타이밍 특이적인 방식으로 일어나는데 필요한 경우에 특히 적합하다. 이러한 프로모터의 예는 살리실산-유도가능한 프로모터 (WO 95/19443), 테트라사이클린-유도가능한 프로모터 [Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404] 및 에탄올-유도가능한 프로모터이다.
다른 적합한 프로모터는 생물성 또는 비생물성 스트레스 조건에 반응하는 프로모터, 예를 들어 병원체-유도성 PRP1 유전자 프로모터 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366], 열-유도가능한 토토마토 (totomato) hsp80 프로모터 (US 5,187,267), 저온-유도가능한 포테이토 알파-아밀라제 프로모터 (WO96/12814) 또는 상처-유도가능한 pinII 프로모터 (EP-A-0 375 091)이다.
특히 바람직한 프로모터는 지질 및 오일 생합성이 일어나는 조직 및 기관, 배유 세포 및 배를 발생시킬 수 있는 세포 등의 종자 세포에서 유전자 발현을 일으키는 프로모터이다. 적합한 프로모터는 평지 나핀 (napin) 유전자 프로모터 (US 5,608,152), 비시아 파바 (Vicia faba) USP 프로모터 [Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459-67], 아라비돕시스 (Arabidopsis) 올레오신 (oleosin) 프로모터 (WO 98/45461), 파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris) 파세올린 프로모터 (US 5,504,200), 브라시카 (Brassica) Bce4 프로모터 (WO 91/13980) 또는 레구민 (legumin) B4 프로모터 [LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9], 및 옥수수, 보리, 밀, 호밀 및 벼 등의 모노코트 (monocot)에서 종자-특이적 발현을 일으키는 프로모터가 있다. 주목할만한 적합한 프로모터는 보리 lpt2 또는 lpt1 유전자 프로모터 (WO 95/15389 및 WO 95/23230), 또는 문헌 WO 99/16890에 개시된 프로모터 (보리 호르데인 (hordein) 유전자, 벼 글루텔린 (glutelin) 유전자, 벼 오리진 (oryzin) 유전자, 벼 프롤라민 (prolamin) 유전자, 밀 글리아딘 (gliadin) 유전자, 밀 글루텔린 유전자, 옥수수 제인 (zein) 유전자, 귀리 글루텔린 유전자, 소르굼 카시린 (sorghum kasirin) 유전자 및 호밀 세칼린 (secalin) 유전자로부터의 프로모터)가 있다.
플라스티드는 지질 생합성의 전구체 및 몇몇 최종 생성물이 합성되는 구획이기 때문에, 특히 적합한 프로모터는 또한 플라스티드-특이적 발현을 일으키는 프로모터이다. 적합한 프로모터, 예를 들어 바이러스 RNA 폴리머라제 프로모터는 WO95/16783 및 WO 97/06250에 기재되어 있으며, 아라비돕시스 clpP 프로모터는 WO 99/46394에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 발현 벡터내에 안티센스 방향으로 클로닝된, 즉 PSE mRNA에 대해 "안티센스"인 RNA 분자의 발현 (DNA 분자를 전사함으로써)을 허용하는 방식으로 DNA 분자가 조절 서열에 기능적으로 연결된 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 기능적으로 연결되어 있고 다수의 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 지속적인 발현을 조절하는 조절 서열을 선택할 수 있는데, 예를 들어 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포 특이적 발현을 조절하는 바이러스 프로모터 및(또는) 인핸서 또는 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약화된 바이러스내에 존재할 수 있으며, 여기서 안티센스 핵산은 벡터가 도입된 세포 유형에 의해 활성이 결정될 수 있는 고도로 효율적인 조절 영역의 조절하에 생산된다. 안티센스 유전자에 의한 유전자 발현의 조절에 대한 설명에 관하여는, 문헌 (Weintraub, H., et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986)을 참조한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"라는 용어는 본원에서 서로 바꾸어 쓸 수 있는 용어이다. 본래, 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손 세포를 의미한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 이후의 세대에서 특이적 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이들 자손 세포들은 본질적으로는 모 세포와 동일하지 않지만, 본원에 사용된 용어의 범위내에 있다.
숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 예를 들어, PSE는 박테리아 세포, 예를 들어 씨. 글루타미쿰, 곤충 세포, 진균 세포 또는 포유동물 세포 (예를 들어, 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 COS 세포), 조류, 섬모류, 식물 세포, 진균 또는 다른 미생물, 예를 들어 씨. 글루타미쿰에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
벡터 DNA는 통상의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵세포 또는 진핵세포내에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 "형질전환 (transformation)" 및 "형질감염 (transfection)", 컨쥬게이션 (conjugation) 및 형질도입 (transduction)이라는 용어는 외부 핵산 (예를 들어, DNA)을 숙주 세포에 도입하는데 있어서 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동침전법, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 자연적인 컴피턴스 (competence), 화학적으로 매개된 운반, 전기천공법 또는 입자충격법을 포함하는 의미이다. 식물 세포를 비롯하여 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적합한 방법은 문헌 (Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)) 및 다른 실험 서적, 예를 들어 문헌 (Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey)에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염에 대하여, 사용된 발현 벡터 및 사용된 형질감염 기술에 따라 소수의 세포만이 외부 DNA를 그들의 게놈내에 통합시킨다는 것은 공지된 사실이다. 이러한 통합체 (integrant)를 확인 및 선별하기 위해, 선택적 마커 (예를 들어, 항생제에 대하여 내성을 나타내는 마커)를 코딩하는 유전자가 일반적으로 목적 유전자와 함께 숙주 세포내에 도입된다. 바람직한 선택적 마커는 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트 등의 약물에 대해 내성을 부여하는 것, 또는 식물에서 글리포스페이트 또는 글루포시네이트 등의 제초제에 내성을 부여하는 것을 포함한다. 다른 선택적 마커로는 예를 들어 당 또는 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 코딩하는 마커, 예를 들어 β-갈락토시다제, ura3 또는 ilv2가 있다. 루시퍼라제, gfp 또는 다른 형광 유전자 등의 유전자를 코딩하는 마커가 또한 적합하다. 이러한 마커는 변이체에서 사용될 수 있고, 이 때 이들 유전자는 예를 들어 통상의 방법에 의해 결실되었기 때문에 기능적이지 못하다. 또한, 선택적 마커를 코딩하는 핵산을 코딩하는 마커는 PSE를 코딩하는 것과 동일한 벡터상에서 숙주 세포로 도입되거나 별도의 벡터상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 예를 들어 약물 선별에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 통합된 선택적 마커를 갖는 세포는 다른 세포의 사멸시에도 생존한다).
상동 재조합 미생물을 생성하기 위해, PSE 유전자를 변형시켜 예를 들어 이 유전자를 기능적으로 파괴하는 결실, 삽입 또는 치환이 도입된 PSE 유전자의 하나 이상의 단편을 포함하는 벡터를 생성한다. 이 PSE 유전자는 바람직하게는 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 PSE 유전자이지만, 다른 생물, 심지어 포유동물, 진균 또는 곤충 공급원 유래의 동족체 또는 유사체를 사용할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 내생 PSE 유전자가 상동 재조합시에 기능적으로 파괴되는 방식으로 벡터 (즉, 더 이상 기능성 단백질을 코딩하지 않으므로, 녹-아웃 (knock-out) 벡터라고도 부름)를 설계한다. 다른 방법으로는, 내생 PSE 유전자가 돌연변이되거나 또는 상동 재조합시에 달리 변형되지만 기능성 단백질을 여전히 코딩하도록 벡터를 설계할 수 있다 (예를 들어, 상류의 조절 서열은 그가 내생 PSE의 발현을 변화시키는 방식으로 변형될 수 있다). 상동 재조합을 통해 점 돌연변이를 생성하기 위해, 키메라플라스티 (chimeraplasty)라고도 알려져 있으며 문헌 (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 and Kmiec, Gene therapy, 1999, American Scientist, 87(3):240-247)에 공지되어 있는 DNA-RNA 하이브리드를 사용할 수도 있다.
상동 재조합을 위한 벡터에서, PSE 유전자의 변형된 단편은 PSE 유전자의 다른 핵산에 의해 5' 및 3' 말단에 플랭킹되며, 상동 재조합은 벡터상에 존재하는 외생 PSE 유전자와 미생물 또는 식물내의 내생 PSE 유전자 사이에서 가능하다. 다른 플랭킹 PSE 핵산은 내생 유전자와의 성공적인 상동 재조합을 위해서는 충분히 길다. 일반적으로, 수백 내지 수천 염기쌍의 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두)가 벡터내에 존재한다 [상동 재조합을 위한 벡터의 설명에 관하여는, 예를 들어 문헌 (Thomas, K.R., and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503)을, 피스코미트렐라 파텐스에서 cDNA 베이스상의 재조합에 관하여는 문헌 (Strepp et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (8):4368-4373)을 참조한다]. 벡터는 미생물 또는 식물세포내에 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜-매개된 DNA에 의해) 도입되고, 도입된 PSE 유전자가 내생 PSE 유전자와 함께 상동 재조합을 수행한 세포는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 선택된다.
다른 실시양태에서, 도입되는 유전자의 조절된 발현을 가능케 하는 선택된 시스템을 포함하는 재조합 미생물, 예를 들어 식물의 미생물을 생성시킬 수 있다. 벡터내에서 lac-오페론의 조절하에 놓인 PSE 유전자의 도입에 의해, 예를 들어 IPTG의 존재하에서만 PSE 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 조절 시스템은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 숙주 세포, 예를 들어 배양되거나 또는 바깥에서 성장하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 PSE의 생산 (즉, 발현)에 사용할 수 있다. 또한, 식물에서는 전기천공법 또는 아그로박테리움-매개된 유전자 전달을 통해 DNA를 개화하는 꽃에 직접 전달하는 다른 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 숙주 세포를 이용하여 PSE를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 이 방법은, PSE가 생산될 때까지 본 발명에 따른 숙주 세포 (여기에, PSE를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되거나 또는 그의 게놈내에 야생형 또는 변형된 PSE를 코딩하는 유전자가 도입됨)를 적합한 배지에서 증식시키는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 PSE를 단리하는 것을 포함한다.
원칙적으로 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 신규 유전자 생성물 또는 본 발명에 따른 벡터를 수용하기에 적합한 숙주 세포는 모든 원핵 또는 진핵 생물이다. 이롭게 사용되는 숙주 생물은 박테리아, 진균, 효모, 동물 세포 또는 식물 세포 등의 생물이다. 보다 이로운 생물은 동물, 또는 바람직하게는 식물 또는 그의 부분이다. "동물"이라는 용어는 본원에서 사람을 포함하지 않는 것으로 이해된다. 진균, 효모 또는 식물이 바람직하게 사용되며, 특히 바람직하게는 진균 또는 식물, 매우 특히 바람직하게는 진균 또는 다량의 지질 화합물을 포함하는 오일 작물 등의 식물, 예를 들어 평지, 달맞이꽃, 캐스터유 식물, 카놀라, 땅콩, 아마인, 콩, 잇꽃, 해바라기, 보라고, 오일 야자, 코코넛 또는 식물, 예를 들어 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 트리티케일 (triticale), 벼, 보리, 면화, 카사바, 후추, 타게츠 (tagetes), 가지과 (Solanaceae) 식물, 예를 들어 감자, 담배, 아우베르진 및 토마토, 비시아 종, 완두, 알팔파, 관목 식물 (커피, 카카오, 홍차), 살릭스 종, 수목 (오일 야자, 코코넛) 및 다년생 잔디 및 사료 작물이 사용된다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 식물은 오일 작물, 예를 들어 콩, 땅콩, 평지, 카놀라, 캐스터유 식물, 아마인, 달맞이꽃, 해바라기, 잇꽃, 수목 (오일 야자, 코코넛)이다.
본 발명의 특히 바람직한 측면은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 식물 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하는 유전자전환 (transgenic) 식물 또는 식물 조직이 바람직하다. 본 발명의 다른 측면은, 본 발명에 따른 핵산을 발현시키는 본 발명에 따른 식물 세포를 포함하거나 또는 본 발명에 따른 증가된 수준의 단백질을 갖는 세포를 포함하며 재배할 수 있는 본 발명에 따른 식물 및 본 발명에 따른 유전자전환 식물을 번식시키는데 적합한 재료에 관한 것이다. 원칙적으로, 모든 식물 부분, 특히 꽃, 화분,과실, 묘목, 뿌리, 잎, 종자, 덩이줄기, 줄기 등은 수확할 수 있다. 번식 재료로는 예를 들어 종자, 과실, 묘목, 덩이줄기, 삽수 (cutting) 및 뿌리줄기가 포함된다.
D.단리된 PSE
본 발명의 다른 측면은 단리된 PSE 및 그의 생물학적으로 활성인 부분에 관한 것이다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편이 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우 세포 물질을 본질적으로 함유하지 않거나 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않는다. "본질적으로 세포 물질을 함유하지 않는"이라는 용어는 자연적으로 또는 재조합적으로 생산된 단백질이 세포의 세포 성분들로부터 분리된 PSE 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, "본질적으로 세포 물질을 함유하지 않는"이라는 용어는 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만의 비-PSE (본원에서 "오염성 단백질"이라고도 함), 보다 바람직하게는 약 20% 미만의 비-PSE, 보다 더 바람직하게는 약 10% 미만의 비-PSE, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비-PSE를 포함하는 PSE 제제를 포함한다. PSE 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합 기술에 의해 생산되는 경우, 그는 본질적으로 배양 배지를 함유하지 않는데, 즉 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 양이다. "본질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않는"이라는 용어는 단백질이 단백질의 합성에 관여하는 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 PSE 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, "본질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 함유하지 않는"이라는 용어는 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만의 화학물질 전구체 또는 비-PSE 화학물질, 보다 바람직하게는 약 20% 미만의 화학물질 전구체 또는 비-PSE 화학물질, 보다 더 바람직하게는 약 10% 미만의 화학물질 전구체 또는 비-PSE 화학물질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 화학물질 전구체 또는 비-PSE 화학물질을 포함하는 PSE 제제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 PSE가 발생하는 동일한 생물로부터의 오염성 단백질이 없음을 나타낸다. 서열 10에 나타낸 서열을 포함하거나 또는 서열 9를 포함하는 유전자에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 단백질의 경우, 그러나, 서열이 두개의 Met로 시작한다는 것을 고려해야 한다. 상응하는 코딩 핵산 서열의 번역에 있어서, 이는 제1 또는 제2 Met로 출발하는 본 발명에 따른 단백질의 두가지 유도체를 발현시킬 수 있다. 두 유도체 사이의 발현 비율은 발현 유형 또는 숙주 생물의 유형에 따라 0 내지 1일 수 있다. 본 발명은 따라서 상기 언급된 유도체 둘 다를 포함하거나 또는 이들 중 한가지만을 포함하는 PSE를 포함한다. 두가지 유도체는 다른 활성, 위치, 반감기, 조절 기전 등을 나타낼 수 있다. 이러한 단백질은 일반적으로 식물, 예를 들어 피스코미트렐라 파텐스, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움에서, 또는 미생물, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum), 진균, 예를 들어 모르티에렐라 (Mortierella), 효모, 예를 들어 사카로마이세스, 또는 섬모류, 예를 들어 콜피디움 (Colpidium) 또는 조류, 예를 들어 파에오닥틸룸 (Phaeodactylum)에서 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움또는 트라우스토키트리움 PSE의 재조합 발현에 의해 생산된다.
본 발명에 따른 단리된 PSE 또는 그의 부분은 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여하는 능력을 보유하는 단백질 또는 그의 부분에 있어서, 이 단백질 또는 그의 부분은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 충분한 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 단백질의 부분은 바람직하게는 본원에 기재된 생물학적으로 활성인 부분이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 PSE는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 나타낸 아미노산 서열들 중 하나를 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, PSE는 예를 들어 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, PSE는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 완전한 아미노산 서열과 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 따른 바람직한 PSE는 바람직하게는 또한 본원에 기재된 PSE활성들중 하나 이상을 갖는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 바람직한 PSE는 예를 들어 엄격 조건하에 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산을 포함하며, 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움에서 세포막의 합성에 요구되는 화합물의 대사 또는 이러한 막을 통한 분자의 운반에 관여할 수 있고, 2개 이상의 이중 결합을 갖는 1종 이상의 다가불포화 지방산 및 C16또는 C18의 쇄 길이를 연장할 수 있다.
다른 실시양태에서, PSE는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 아미노산 서열과 본질적으로 상동성이 있으며, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 서열들 중 한 단백질의 기능적 활성을 보유하는데, 이들의 아미노산 서열은 상기 서브섹션 I에서 상세히 설명한 바와 같이 자연적인 변이 또는 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열의 차이가 있다. 다른 실시양태에서, PSE는 따라서 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 완전한 아미노산 서열과 약 50 내지 60% 이상, 바람직하게는 약 60 내지 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 70 내지 80% 이상, 80 내지 90% 이상, 90 내지 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 그 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 본원에 설명된 PSE 활성들중 하나 이상을 갖는 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12의 완전한 아미노산 서열과 본질적으로 상동성이 있는 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 단백질에 관한 것이다.
PSE의 생물학적으로 활성인 부분은 PSE의 아미노산 서열, 예를 들어 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12에 나타낸 아미노산 서열로부터 유도되는 아미노산 서열 또는 PSE와 상동성이 있는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는데, 이 펩티드는 전장 PSE, 또는 PSE와 상동성이 있고 PSE 활성들중 하나 이상을 갖는 전장 단백질보다 적은 수의 아미노산을 갖는다. 생물학적으로 활성인 부분 (펩티드, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드)은 일반적으로 PSE의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 또한, 단백질의 다른 영역이 결실된 생물학적으로 활성인 다른 부분은 재조합 기술에 의해 생성될 수 있으며, 본원에 기재된 활성들 중 하나 이상에 대하여 연구된다. PSE의 생물학적 활성 부분은 바람직하게는 하나 이상의 선택된 도메인/모티프 또는 생물학적 활성을 갖는 그의 부분을 포함한다.
이러한 도메인 및 모티프의 몇몇은 서열 분석, 예를 들어 컴퓨터-보조 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 서열은 예를 들어 KK 모티프를 포함하는 것으로 알려져 있다.
문헌 (Kermode 1996, Critical Reviews in Plant Sciences 15 (4): 285-423)은 주로 KKXX 또는 K X K XXX 모티프로서 밝혀져 있으며, ER로부터 골지체로의 재순환에 영향을 주며, 따라서 특정 위치, 특히 ER에서 단백질의 체류 시간 및 그의효소 활성에 영향을 주는 이중 (double) 라이신인 KK 모티프를 설명하고 있다.
이중 라이신 모티프는 또한 예를 들어 △12-불포화효소에서 나타나며 (Arondel et al. 1992, Science 258:1353), 이들은 본 발명에 따른 연장효소 중에도 존재한다. 특히, C-말단에 위치할 수 있는 모티프가 기재되어 있다. 본 발명에 따른 서열에서, 라이신은 C-말단에 두드러지게 축적된다.
이끼 연장효소 PSE1: C-말단KQKGAKTE
서열 2:KTKKA
서열 4:KKSTPAAKKTN
서열 6:KHLK
이들은 가능한 유전자 변이일 수 있다.
ER에서 또는 ER내에서의 표적화, 어드레싱 및 위치화에 영향을 주는 Lys 라디칼이 있다. 예를 들어, GFP "녹색 형광 단백질"과의 융합에 의해 C-말단의 말단부 근처에서 이러한 서열의 마스킹, 변형 또는 공간적 변형을 이용하여 배치 (compartmentalization)에 영향을 줄 수 있다.
PSE는 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 발현 벡터 (상기 설명됨)에 클로닝하고, 이 발현 벡터를 숙주 세포 (상기 설명됨)에 도입하여, PSE를 숙주 세포에서 발현시킨다. PSE는 단백질 정제에 대한 표준 기술을 이용하여 적합한 정제 반응에 의해 세포로부터 단리할 수 있다. 재조합 발현의 다른 방법으로, PSE, PSE 폴리펩티드 또는 PSE 펩티드는 펩티드 합성의 표준 기술에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 천연 PSE는 예를 들어 본 발명에 따른 PSE 또는 그의 단편을 사용하여 표준 기술에 의해 생성될 수 있는 항-PSE 항체를 사용하여 세포 (예를 들어, 내피 세포)로부터 단리할 수 있다.
본 발명은 또한 키메라 PSE 단백질 또는 PSE 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "키메라 PSE 단백질" 또는 "PSE 융합 단백질"은 비-PSE 폴리펩티드에 기능적으로 연결된 PSE 폴리펩티드를 포함한다. "PSE 폴리펩티드"는 PSE에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미하지만, "비-PSE 폴리펩티드"는 PSE와 본질적으로 상동성이 없는 단백질, 예를 들어 PSE와 상이하며 동일 또는 다른 생물로부터 발생하는 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 융합 단백질내에서, 용어 "기능적으로 연결된"이라는 용어는 PSE 폴리펩티드 및 비-PSE 폴리펩티드가 사용된 이들 서열에 보유된 예상 기능을 수행하는 방식으로 서로 융합되는 것을 의미하는 것으로 생각된다. 비-PSE 폴리펩티드는 PSE 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 예를 들어 PSE 서열이 GST 서열의 C 말단에 융합된 GST-PSE 융합 단백질이다. 이 융합 단백질은 재조합 PSE의 정제를 촉진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 그의 N 말단에 이종 신호 서열을 갖는 PSE이다. 어떤 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 숙주 세포)에서, PSE의 발현 및(또는) 분비는 이종 신호 서열을 사용하여 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 PSE 단백질 또는 PSE 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 다른 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 서로 정확한 리딩 프레임내에 라이게이션 할 수 있는데, 통상의 기술, 예를 들어 라이게이션을 위한 블런트 (blunt) 말단 또는 점착성 (sticky) 말단; 적합한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 절단; 부착성 (cohesive) 말단을 채우는 것; 필요에 따라, 원치않는 연결을 방지하기 위한 알칼리 포스파타제로의 처리; 및 효소 라이게이션을 이용한다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술에 의해 합성할 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 혼성화되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 형성할 수 있는 연속적인 유전자 단편들 사이의 상보적인 오버행 (overhang)을 생성시키는 앵커 (anchor) 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992)을 참조한다). 또한, 이미 융합 단위 (예를 들어, GST 폴리펩티드)를 코딩하는 다수의 발현 벡터가 시판되고 있다. PSE-코딩 핵산을 이러한 발현 벡터내에 융합 단위가 PSE 단백질에 대해 정확한 리딩 프레임내에 연결되도록 클로닝할 수 있다.
PSE 동족체는 돌연변이유발법, 예를 들어 특정의 점 돌연변이에 의하거나 또는 PSE를 말단절단하여 생성시킬 수 있다. 본원에 사용되는 "동족체 (homolog)"라는 용어는 PSE 활성의 아고니스트 또는 길항제로 작용하는 PSE의 변이체 형태를 의미한다. PSE 아고니스트는 본질적으로 PSE와 동일한 활성 또는 이러한 생물학적 활성들 중 몇가지를 보유할 수 있다. PSE 길항제는 예를 들어 PSE를 포함하는 세포막 성분에 대한 대사 캐스케이드의 상류 또는 하류 요소에 경쟁적으로 결합함으로써 또는 세포막을 통한 화합물의 운반을 매개하는 PSE에 결합하여 전위 (translocation)를 억제함으로써 자연 발생적인 PSE 형태의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있다.
다른 실시양태에서, PSE 동족체는 PSE 아고니스트 또는 PSE 길항제 활성에 대하여 PSE의 변이체, 예를 들어 말단절단 변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝하여 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, PSE 변이체의 다양한 라이브러리는 조합 돌연변이유발에 의해 핵산 수준에서 생성되며 다양한 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열내에 효소적으로 라이게이션하여 PSE 변이체의 다양한 라이브러리를 생성시킴으로써, 잠재적인 PSE 서열의 다의성 세트를 개별 폴리펩티드로서 발현시키거나 또는 다르게는 이러한 PSE 서열 세트를 포함하는 큰 융합 단백질의 세트 (예를 들어, 파아지 디스플레이)로서 발현시킬 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 PSE 동족체의 라이브러리를 생성시키는데 사용될 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 다의성 유전자 서열의 화학적 합성은 DNA 합성기로 수행할 수 있으며, 이어서 합성 유전자를 적합한 발현 벡터내에 라이게이션할 수 있다. 다의성 유전자 세트를 사용하여 잠재적인 PSE 서열의 목적하는 세트를 코딩하는 모든 서열을 혼합물로 제공할 수 있다. 다의성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike etal. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)을 참조한다].
또한, PSE 동족체를 스크리닝하여 선별하기 위한 PSE 단편의 다양한 집단을 생성시키는데 있어서 PSE 단편의 라이브러리를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 이중 가닥 절단이 분자 당 약 1회만 일어나는 조건하에 뉴클레아제를 사용하여 코딩 PSE 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 처리하는 단계, 이중 가닥 DNA를 변성시키는 단계, DNA를 재변성시켜 이중 가닥 절단부를 갖는 다양한 생성물의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성시키는 단계, S1 뉴클레아제로 처리하여 새로 형성된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하는 단계, 및 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터내에 라이게이션하는 단계에 의해 코딩 서열 단편의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이 방법에 의해 다양한 크기의 PSE의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.
점 돌연변이 또는 말단절단에 의해 생성된 조합 라이브러리에서 유전자 생성물을 스크리닝하는 기술 및 선택된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이 기술을 적용하여 PSE 동족체의 조합 돌연변이유발에 의해 생성되는 유전자 라이브러리를 빠르게 스크리닝할 수 있다. 고-처리 분석될 수 있는 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 가장 흔히 사용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터내에 클로닝하는 단계, 생성된 벡터 라이브러리로 적합한 세포를 형질전환하는 단계, 및 목적하는 활성을 검출하는 것이 검출된 생성물을 발현시키는 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 촉진시키는 조건하에 조합 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 재현가능한 앙상블 뮤타제네스 (Recursive ensemble mutagenese; REM)은 라이브러리에서 기능적 변이체의 빈도를 증가시키는 새로운 기술이며, PSE 동족체를 확인하는 스크리닝 분석과 함께 사용될 수 있다 [Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331]. 또한, 이롭게는 상기 언급된 방법을 병용할 수 있다.
효소 또는 그를 코딩하는 유전자의 촉매적 특성을 변경시키는 다른 공지된 기술은 유전자 셔플링 (shuffling)인데 (예를 들어, WO 97/20078 또는 WO 98/13487 참조), 이는 유전자 단편들을 조합하는 것으로, 여기서 이 새로운 조합은 또한 오류 (erroneous) 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 변형될 수 있으며, 따라서 높은 서열 다양성이 분석되도록 한다. 그러나, 이러한 방법을 이용하는데 있어서의 전제 조건은 생성된 유전자의 다양성을 기능에 대하여 시험하는 것이다. PUFA-의존성 효소 활성 또는 활성들을 확인하는 스크리닝 방법은 특히 연장효소 활성을 스크리닝하는데 있어서 전제조건이다. PUFA에 대해 특이성을 갖는 연장효소 활성에 대하여, 독성 대사산물의 존재하에 아라키돈산 (본원에서: 살리실산 또는 살리실산 유도체)의 독성을, 공지된 형질전환 방법에 의해 목적하는 유전자 구조물을 사용하여 형질전환시킬 수 있는 뮤코르 (Mucor) 종에서 이용하여 (Eroshin et al., Mikrobiologiya, Vol. 65, No.1, 1996, pages 31-36), 증식을 기초로 한 일차 스크리닝을 수행할 수 있다. 이어서, 생성된 클론을 가스 크로마토그래피 및 매스 스펙트로스코피에 의해 이들의 지질 구성성분에 대하여 분석하여 출발 물질 및 생성물의 특성 및 양을 확인할 수 있다.
다른 실시양태에서, 당업계에 공지된 다른 방법을 이용하여 다양한 PSE 라이브러리를 분석하는데 있어서는 세포-기초 분석을 이용할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 부분, 예를 들어 항체 단백질의 에피토프에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체를 사용하여 다른 연장효소, 특히 PSE를 확인 및 단리할 수 있다. 이러한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 합성 항체일 수 있고, 이러한 항체의 단편, 예를 들어 Fab, Fv 또는 scFV 단편 등일 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 (Kohler and Milstein in Nature 256 (1975), 485, and Galfro in Meth. Enzymol. 73 (1981))에 기재된 것과 같은 방법에 의해 제조할 수 있다. 항체 및 그의 단편은 또한 예를 들어 문헌 (Harlow & Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988)에 따라 제조할 수도 있다. 이러한 항체를 사용하여 예를 들어 본 발명에 따른 단백질을 침전시켜 위치화하거나 또는 예를 들어 재조합 생물에서 이러한 단백질의 합성을 모니터링하고, 본 발명에 따른 단백질과 상호작용하는 화합물을 확인할 수 있다. 많은 경우에서, 항체와 항원의 결합은 다른 리간드와 항-리간드의 결합과 동등하다.
본 발명은 또한,
a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 후보 물질과 접촉시키는 단계;
b) PSE 활성을 시험하는 단계; 및
c) 후보 물질의 부재하에 PSE 활성을 표준 활성과 비교하는 단계를 포함하며, 이 때 PSE 활성이 표준 활성보다 더 높은 경우 후보 물질이 아고니스트이며, PSE 활성이 표준 활성보다 더 낮은 경우 후보 물질이 길항제임을 알 수 있는 것인, 연장효소, 특히 PSE의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
언급된 후보 물질은 화학적으로 합성되거나 또는 미생물적으로 생산되는 물질일 수 있으며, 예를 들어 식물, 동물 또는 미생물의 세포 추출물 중에 존재한다. 언급된 물질은 또한 선행 기술에 공지된 것일 수 있지만, 선행 기술에서는 PSE의 활성을 증가시키거나 억제시키는 것에 대하여 알려진 바 없다. 반응 혼합물은 세포-무함유 추출물일 수 있거나 또는 세포 또는 세포 배양물을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 예를 들어 문헌 (Alberts, Molecular Biology of the cell, 3rd edition (1994), 예를 들어 Chapter 17)에 기재되어 있다. 언급된 물질은 예를 들어 반응 혼합물 또는 배양 배지에 첨가되거나, 세포내에 주입되거나 또는 식물상에 분무될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 활성인 물질을 포함하는 샘플이 확인된 경우, 원래 샘플로부터 물질을 직접 분리하거나 또는 샘플을 여러 그룹으로 나누고, 예를 들어 샘플이 다수의 상이한 성분들로 구성되는 경우, 샘플 당 상이한 물질의 수를 감소시킨 다음, 원래 샘플의 "서브(sub)-샘플"을 사용하여 본 발명에 따른 방법을 반복할 수 있다. 샘플의 복잡도에 따라, 상기 설명된 단계를 다수회, 바람직하게는 본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 샘플이 단지 소수의 물질 또는 한 물질만을 포함할 때까지 반복할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 확인되는 물질 또는 그의 유도체는 바람직하게는 이들이 식물 육종, 또는 식물 세포 또는 조직 배양에 사용되기에 적합하도록 추가로 제제화된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 확인 및 시험될 수 있는 물질은 발현 라이브러리, 예를 들어 cDNA 발현 라이브러리, 펩티드, 단백질, 핵산, 항체, 작은 유기 물질, 호르몬 또는 PNA 등일 수 있다 (문헌 (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198) 및 이들 문헌에 인용된 문헌). 이러한 물질은 또한 공지된 억제제 또는 활성제의 기능성 유도체 또는 유사체일 수도 있다. 화학적 유도체 또는 유사체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 공지된 유도체 및 유사체는 선행 기술의 방법을 이용하여 시험할 수 있다. 또한, 컴퓨터-보조 디자인 또는 펩티드모방체를 사용하여 적합한 유도체 및 유사체를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 세포 또는 조직은 바람직하게는 상기 실시양태에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 숙주 세포, 식물 세포 또는 식물 조직이다.
따라서, 본 발명은 상기 언급된 본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 물질에 관한 것이다. 이 물질은 예를 들어 본 발명에 따른 PSE의 동족체이다. PSE의 동족체는 돌연변이유발, 예를 들어 PSE의 점 돌연변이 또는 결실에 의해 생성될 수 있다. 본원에서, "동족체"라는 용어는 PSE 활성에 대하여 아고니스트 또는 길항제로 작용하는 PSE의 변이체 형태를 의미하는데 사용된다. 아고니스트는 실질적으로 PSE의 생물학적 활성의 약간 또는 일부를 가질 수 있다. PSE의 길항제는 PSE의 자연 발생적인 형태의 하나 이상의 활성을 억제할 수 있는데, 예를 들어 PSE를 비롯하여 지방산 합성의 대사 경로의 하류 또는 상류 요소에 경쟁적으로 결합하거나 또는 PSE에 결합하여 이 프로세스에서의 활성을 감소 또는 억제시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 PSE의 활성을 억제하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 본 발명에 따른 상기 기재된 아고니스트 또는 길항제를 특이적으로 인식하거나 또는 그와 결합하는 항체에 관한 것이다.
추가의 측면은 본 발명에 따른 방법에 의해 확인되는 항체, 정지 또는 안티센스 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
E.본 발명에 따른 용도 및 프로세스/방법
본원에 기재된 핵산 분자, 단백질, 단백질 동족체, 융합 단백질, 항체, 프라이머, 벡터 및 숙주 세포는 다음과 같은 방법들 중 하나 이상에서 사용될 수 있다: 피스코미트렐라 파텐스, 크립테코디니움, 피토프토라 인페스탄스 또는 트라우스토키트리움 및 관련 생물의 확인, 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움과 관련된 생물의 게놈 맵핑, 및 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 대상 서열의 확인 및 위치화, 진화 연구, 기능에 요구되는 PSE 단백질 영역의 결정, PSE 활성의 조절; 하나 이상의 세포막 성분의 대사 조절; 하나 이상의 화합물의 막통과 운반의 조절, 및 미세 화학물질 등의 목적하는 화합물의 세포내 생산의 조절. 본 발명에 따른 PSE 핵산 분자는 다양한 용도를 갖는다. 첫째, 이 핵산 분자는 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 또는 이들과 밀접하게 관련되는 종 등의 생물을확인하는데 사용될 수 있다. 이 핵산 분자는 또한 미생물의 혼합 집단에서 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 또는 이들과 밀접하게 관련되는 종의 존재를 확인하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 일련의 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 유전자의 핵산 서열을 제공하며; 이 생물의 존재 또는 부재는 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 생물에 대하여 특이적인 유전자의 영역 또는 이 유전자의 일부 영역을 포함하는 프로브를 사용하여 엄격 조건하에 미생물의 균일 집단 또는 혼합 집단의 배양물에 대해 추출된 게놈 DNA를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 자체는 다가불포화산의 상업적 생산에 사용된다. 또한, 생성되는 PUFA가 트리아실글리세롤 부분으로 혼입되도록 의도되는 경우, 본 발명에 따른 핵산은 또한 다른 생물에서 PUFA를 생산하는데 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 및 단백질 분자는 게놈의 특이적 영역에 대한 마커로 작용할 수 있다. 이들은 게놈을 맵핑하는데 적합할뿐 아니라 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 단백질의 기능을 연구하는데 있어서도 적합하다. 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움의 어떤 DNA-결합 단백질이 결합하는 게놈 영역을 확인하기 위해, 예를 들어 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 게놈을 단편화하고, 단편을 DNA-결합 단백질과 인큐베이션하였다. 단백질과 결합하는 대상은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자, 바람직하게는 빠르게 검출가능한 마커를 사용하여 스크리닝할 수 있고; 이러한 핵산 분자와 게놈 단편의 결합은 피스코미트렐라, 피토프토라, 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움의 게놈 맵상에 단편을 위치화하는 것을 가능케하며, 다른 효소를 사용하여 이를 반복적으로 수행하는 경우, 단백질이 결합하는 핵산 서열의 빠른 결정을 촉진시킨다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는, 이들 핵산 분자가 관련 진균 또는 조류의 게놈 맵의 구성에 있어서 마커로 작용할 수 있기 때문에, 관련 종의 서열과 충분한 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 PSE 핵산 분자는 또한 진화 연구 및 단백질 구조의 연구에 있어서 적합하다. 본 발명에 따른 분자가 관여하는 대사 및 운반 프로세스는 다수의 원핵 및 진핵 세포에 의해 이용되며; 생물의 진화적 관련성 정도는 본 발명에 따른 핵산 분자의 서열을 다른 생물로부터의 유사한 효소를 코딩하는 것과 비교하여 결정할 수 있다. 따라서, 이러한 비교에 의해 서열 영역이 보존되었는지 그렇지 않은지를 결정할 수 있으며, 이는 효소 기능에 필수적인 단백질의 영역을 결정하는 경우에 도움을 줄 수 있다. 이러한 유형의 결정은 단백질 조작 연구에 있어서 가치가 있으며, 단백질이 그의 기능을 상실하지 않으면서 얼마나 많은 돌연변이유발을 견딜 수 있는지에 대한 단서를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 PSE 핵산 분자의 조작에 의해 야생형 PSE와 기능적으로 상이한 PSE를 생산할 수 있다. 이러한 단백질의 효능 또는 활성이 개선될 수 있거나; 이들 단백질이 세포내에 일반적으로 존재하는 것보다 더 많은 수가 존재할 수 있거나; 또는 이들의 효능 또는 활성이 감소될 수 있다. 개선된 효능 또는 활성은 예를 들어 효소가 원래 효소보다 더 높은 선택성 및(또는) 활성, 바람직하게는 적어도 20%를 초과, 매우 특히 바람직하게는 약 30%를 초과하는 활성을 가짐을 의미한다.
본 발명에 따른 PSE의 변형이 상기 변형된 단백질을 포함하는 미세 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효능에 직접 영향을 줄 수 있는 일련의 메카니즘이 존재한다. 섬모류, 조류 또는 진균류의 배양물로부터 미세 화학물질 화합물을 대규모로 얻는 것은, (배양된 세포의 바이오매스로부터의 추출과는 대조적으로) 이러한 화합물이 세포 배지로부터 쉽게 단리될 수 있기 때문에 세포가 목적하는 화합물을 분비하는 경우에 상당히 향상된다. 그렇지 않다면, 세포가 생체내의 특정 부분에 어떤 종류의 농축 메카니즘으로 화합물을 저장하는 경우에 정제가 향상될 수 있다. PSE를 발현시키는 식물에서, 증가된 운반은 식물 조직 및 식물 기관내의 보다 양호한 분포를 초래할 수 있다. 세포로부터 미세 화학물질을 배출하는 운반체 분자의 수 또는 활성을 증가시키면 세포외 배지중에 존재하는 생산된 미세 화학물질의 양을 증가시킬 수 있으며, 따라서 수획 및 정제 또는, 식물의 경우 보다 효율적인 분포를 촉진시킬 수 있다. 대조적으로, 적합한 생합성 경로에 있어서 보조인자, 전구체 분자 및 중간체의 양을 증가시키는 것은 1종 이상의 미세 화학물질을 효율적으로 과다생산하는데 필요하다. 탄소 공급원 (즉, 당), 질소 공급원 (즉, 아미노산, 암모늄 염), 포스페이트 및 황 등의 영양분의 유입에 관여하는 운반체 단백질의 수 및(또는) 활성을 증가시키는 것은 생합성 과정중에서 이용가능한 영양분에 대한 모든 제한을 없애기 때문에 미세 화학물질의 생산을 증가시킬 수 있다.PUFA 등의 지방산 및 PUFA를 포함하는 지질은 미세 화학물질 그 자체로 바람직하다. 이러한 화합물의 생합성에 관여하는 본 발명에 따른 1종 이상의 PSE의 활성을 최적화하거나 또는 이들의 수를 증가시키거나, 또는 이러한 화합물의 파괴에 관여하는 1종 이상의 PSE의 활성을 파괴하는 것은 따라서 섬모류, 조류, 식물, 진균, 효모 또는 다른 미생물에서 지방산 및 지질 분자의 수율, 생산 및(또는) 생산 효능을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 1종 이상의 PSE 유전자를 조작하여, 마찬가지로 조류, 식물, 섬모류 또는 진균으로부터 1종 이상의 목적하는 미세 화학물질의 생산에 간접적으로 영향을 주는 변형된 활성을 갖는 PSE를 생성시킬 수 있다. 정상적인 생화학 대사 과정은 예를 들어 이러한 대사 과정을 활성적으로 파괴할 수 있는 다수의 폐 생성물 (예를 들어, 과산화수소 및 다른 반응성 산소 종)을 생산한다 [예를 들어, 페록시니트라이트는 니트레이트 티로신 측쇄로 알려져 있으며, 따라서 활성 중심부에 티로신을 갖는 몇몇 효소를 실활화한다; Groves, J.T. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2);226-235]. 이러한 폐 생성물이 통상적으로 배출되는 동안, 대규모의 발효 생산에 사용되는 세포는 1종 이상의 미세 화학물질의 과다생산을 위해 최적화되며, 따라서 야생형 세포에 대하여 통상적인 것보다 더 많은 폐 생성물을 형성할 수 있다. 폐 생성물의 배출에 관여하는 본 발명에 따른 1종 이상의 PSE의 활성을 최적화하여, 세포의 생존성을 향상시키고 효율적인 대사 활성을 유지할 수 있다. 또한, 목적하는 미세 화학물질이 세포내에 다량 존재하는 것은 실제로 세포에 독성을 띨 수 있어서, 이러한 화합물을 분비하는 세포의 능력을 증가시키면 세포의 생존성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 PSE는 다양한 지질과 지방산 분자의 상대적인 양을 변화시키는 방식으로 조작될 수 있다. 이는 세포막의 지질 조성에 결정적인 영향을 줄 수 있다. 각 지질 유형이 다른 물리적인 특성을 가지기 때문에, 막의 지질 조성의 변화는 막 유동성을 상당히 변화시킬 수 있다. 막 유동성의 변화는 상기 언급한 바와 같이 폐 생성물 또는 생산되는 미세 화학물질의 배출 또는 요구되는 영양분의 유입을 변화시킬 수 있는 막을 통한 분자의 운반에 영향을 줄 수 있다. 막 유동성에서의 이러한 변화는 세포의 일체성에 결정적인 영향을 줄 수도 있으며; 비교적 더 약한 막을 갖는 세포는 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수 있는 비생물성 및 생물성 스트레스 조건에 보다 더 민감하다. 생성된 막이 미세 화학물질의 생산에 사용되는 배양물중에서 우세한 환경 조건에 대하여 보다 민감한 막 조성을 갖도록, 막 합성용 지방산 및 지질을 생산하는데 관여하는 PSE를 조작하여 보다 많은 세포를 생존 및 증식시킬 수 있다. 다수의 생산 세포는 세포 배양물로부터 미세 화학물질의 더 높은 수율, 더 많은 생산 또는 더 높은 생산 효능을 나타내는 것으로 입증되었다.
PSE에 대한 상기 언급된 돌연변이유발 전략은 미세 화학물질의 증가된 수율을 나타내지만, 이것만으로 한정되는 것은 아니고; 당업자라면 이러한 전략을 쉽게 변화시킬 수 있다는 것은 자명한 사실이다. 이러한 메카니즘을 본원에 개시된 메카니즘과 함께 이용하여, 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효능이 향상되도록 변이된 PSE 핵산 및 단백질 분자를 발현시키는 조류, 섬모류, 식물, 동물, 진균 또는 씨. 글루타미쿰 등의 기타 미생물을 생성하기 위해 본 발명에 따른 핵산 및 단백질 분자를 사용할 수 있다. 이러한 목적하는 화합물은 생합성 경로의 최종 생성물 및 자연 발생적인 대사 경로의 중간체를 포함하는 조류, 섬모류, 식물, 동물, 진균 또는 박테리아의 임의의 천연 생성물, 및 이러한 세포의 대사중에 자연적으로 발생되지는 않지만 본 발명에 따른 세포에 의해 생산되는 분자일 수 있다.
본 발명에 따른 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 유전자 구조물, 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 생물에서 PUFA가 생산되는 조건하에 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장시키는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 생물을 배양하는 것을 포함하는, PUFA의 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 생산되는 PUFA는 이들 생물이 증식하는 배양물 또는 외부로부터 이들 생물을 수획하는 단계, 및 수획된 물질을 유기 용매로 파괴 및(또는) 추출하는 단계에 의해 분리될 수 있다. 더 높은 PUFA 함량을 갖는 지질, 인지질, 스핑고지질, 당지질, 트리아실글리세롤 및(또는) 유리 지방산을 포함하는 오일은 이러한 용매로부터 단리될 수 있다. 높은 함량의 PUFA를 갖는 유리 지방산은 지질, 인지질, 스핑고지질, 당지질 및 트리아실글리세롤을 염기 또는 산 가수분해하여 분리할 수 있다. 높은 PUFA 함량이란 본 발명에 따른 연장효소를 코딩하는 다른 핵산을 갖지 않는 원래의 생물보다 PUFA 함량이 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 특히 바람직하게는 20% 이상, 매우 특히바람직하게는 40% 이상 많은 것을 의미한다.
이러한 방법에 의해 생산되는 PUFA는 바람직하게는 지방산 분자내에 2개 이상, 바람직하게는 3, 4, 5 또는 6개 이상, 특히 바람직하게는 3 또는 5개 이상의 이중 결합을 갖는 C18-, C20- 또는 C22-지방산 분자이다. 이러한 C18-, C20- 또는 C22-지방산 분자는 생물로부터 오일, 지질 또는 유리 지방산 형태로 분리할 수 있다. 적합한 생물의 예는 상기 언급한 것들이다. 바람직한 생물은 미생물, 동물 또는 식물, 특히 바람직하게는 식물 또는 조류, 매우 특히 바람직하게는 유전자전환 식물이다.
본 발명에 따른 한 실시양태는 상기 기재된 방법에 의해 제조된 오일, 지질 또는 지방산 또는 그의 분획, 특히 바람직하게는 PUFA를 포함하며 유전자전환 식물로부터 발생되는 오일, 지질 또는 지방산 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 오일, 지질 또는 지방산에 관한 것이다. 본 발명의 다른 실시양태는 본 발명에 따른 방법에 으해 생산되는 PUFA를 포함하고, 본 발명에 따른 핵산, 유전자 구조물 또는 벡터를 포함하는 유전자전환 식물로부터 유도되는 오일, 지질 또는 지방산 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추가의 실시양태는 상기 오일, 지질 또는 지방산 조성물의 사료 물질, 식료품, 화장제 또는 의약에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 유전자구조물, 본 발명에 따른 아미노산 서열, 본 발명에 따른 안티센스 핵산 분자, 본 발명에 따른 항체 및(또는) 조성물, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 길항제 또는 아고니스트 및(또는) 본 발명에 따른 오일, 지질 및(또는) 지방산, 또는 이들의 분획을 포함하는 킷트에 관한 것이다. 이 킷트는 본 발명에 따른 숙주 세포, 생물 또는 식물, 또는 이들의 부분, 수획될 수 있는 본 발명에 따른 식물의 부분, 또는 증식 물질, 또는 본 발명에 따른 길항제 또는 아고니스트를 포함할 수도 있다. 본 발명의 킷트의 성분은 적합한 용기내에 예를 들어 완충액 또는 다른 용액과 함께 또는 그들 중에 팩킹될 수 있다. 언급된 성분들 중 하나 이상을 하나의 동일한 용기내에 팩킹할 수 있다. 추가적으로 또는 다르게는, 언급된 성분들중 하나 이상을 예를 들어 고체 표면, 예를 들어 니트로셀룰로스 필터, 유리판, 칩, 나일론막 또는 마이크로타이터 플레이트상에 흡착시킬 수 있다. 이 킷트는 본원에 기재된 임의의 방법 및 실시양태에 있어서, 예를 들어 숙주 세포, 유전자전환 식물을 생산하고, 동종 서열을 검출하며, 길항제 또는 아고니스트 등을 확인하는 것 등에 사용될 수 있다. 또한, 이 킷트는 언급된 용도들 중 하나에 있어서 킷트를 어떻게 사용하는가에 대한 지침을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 설명되지만, 본 발명이 이것들로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 모든 참고문헌, 특허 출원서, 및 이 특허 출원서에 포함된 특허 및 공개 공보 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에 나타낸 서열, 그의 동족체, 유도체 또는 유사체를 갖는 신규 연장효소 (elongase) 유전자, 이러한 유전자 또는 그의 동족체, 유도체 및 유사체를 포함하는 유전자 구조물, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11, 또는 그의 동족체, 유도체 및 유사체를 갖는 연장효소 유전자를 포함하는 벡터 또는 유전자전환 (transgenic) 생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연장효소 유전자 서열 단독의 용도 또는 그와 다른 연장효소 및(또는) 다른 지방산 생합성 유전자와의 조합의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 서열 1 또는 그의 동족체, 유도체 및 유사체를 갖는 신규 연장효소 유전자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다가불포화 지방산의 제조 방법 및 오일, 특히 높은 함량의 불포화 지방산을 갖는 오일을 대량 생산하는 생물에 DNA를 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 2개 이상의 이중 결합을 갖는 높은 함량의 다가불포화 지방산을 포함하는 오일 및(또는) 지방산의 제조 및(또는) 2개 이상의 이중 결합을 갖는 높은 함량의 다가불포화 지방산을 포함하는 트리아실글리세롤의 제조에 관한 것이다.
실시예 1: 일반적인 방법
a) 일반적인 클로닝 방법:
클로닝 방법, 예를 들어 제한 절단, 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 핵산의 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 전달, DNA 단편의 연결, 이. 콜라이 및 효모 세포의 형질전환, 박테리아의 배양 및 재조합 DNA의 서열 분석은 문헌 (Sambrook et al. [(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6] or Kaiser, Michaelis and Mitchell [(1994), "Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3])에 기재된 바와 같이 수행하였다. 클로렐라 (Chlorella) 또는 파에오닥틸룸 (Phaeodactylum) 등의 조류의 형질전환 및 배양은 문헌 (El-Sheekh [(1999), Biologia Plantarum 42:209-216] or Apt et al. [(1996) Molecular and General Genetics 252 (5):872-9])에 기재된 바와 같이 수행하였다.
b) 화학물질
본원에 달리 지시되지 않는 한, 사용된 화학물질은 Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) 및 Sigma (Deisenhofen)사로부터 분석 등급 품질의 것으로 구입하였다. 하기 텍스트에 언급된, Milli-Q 워터 시스템 물 정제 유닛 (Millipore, Eschborn)으로부터의 순수한 발열물질-무함유 물을 H2O로서 사용하여 용액을 제조하였다. 제한 엔도뉴클레아제, DNA-변형 효소 및 분자 생물학 키트는 AGS (Heidelberg), Amersham (Brunswick), Biometra (Gottingen), Boehringer (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New EnglandBiolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) 및 Stratagene (Amsterdam, Netherlands)사로부터 구입하였다. 달리 지시되지 않는 한, 이들은 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
c) 세포체
본 연구는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)을 통해 균주 번호 ATCC26185 (트라우스토키트리움)를 트라우스토키트리움 균주로 사용하거나, 또는 크립테코디니움의 경우 프로바솔리-길라드 내셔날 센터 포 컬쳐 오브 마린 피토플랑크톤 (Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton; CCMP, West Boothbay Harbour, ME, USA)으로부터의 균주 배양 번호 CCMP316를 사용하여 수행하였다. 암 조건하의 25 ℃에서, 바닥으로부터 공기가 유입되는 유리관에서 조류를 배양하였다. 다른 것으로, 트라우스토키트리움을 문헌 (Singh & Ward (1997, Advances in Microbiology, 45, 271-311))에 상세히 기재된 바와 같이 배양하였다.
크립테코디니움에 사용되는 배양 배지는 10%의 유기 배지로 보충한 f/2 배양 배지이었다 (Guillard, R.R.L. [1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith, W.L. and Chanley, M.H. (Eds.) Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60.]. 이 배지는 다음 성분들을 포함하였다:
(인공) 염수 995.5 ml, NaNO3(75 g/l) 1 ml, NaH2PO4(5 g/l) 1 ml, 미량 금속 용액 1 ml, Tris/Cl (pH 8.0) 1 ml, f/2 비타민 용액 0.5 ml.
미량 금속 용액: Na2EDTA (4.36 g/l), FeCl3(3.15 g/l).
주요 미량 금속: CuSO4(10 g/l), ZnSO4(22 g/l), CoCl2(10 g/l), MnCl2(18 g/l), NaMoO4(6.3 g/l).
f/2 비타민 용액: 비오틴 10 mg/l, 티아민 200 mg/l, 비타민 B12 0.1 mg/l.
유기 배지: 아세트산나트륨 (1 g/l), 글루코스 (6 g/l), 숙신산나트륨 (3 g/l), 박토 (Bacto)-트립톤 (4 g/l), 효모 추출물 (2 g/l).
d) 이끼류 (= 식물체)
이 연구에 있어서, 함부르크 대학의 유전자 연구부 집단으로부터 피스코미트렐라 파텐스 (Hedw.) B.S.G. 종의 식물을 사용하였다. 이들은 종 16/14로부터 유래하였으며, H.L.K 화이트하우스 (Gransden Wood, Huntingdonshire (England))에 의해 수집되어 문헌 (Engel, 1968, Am J Bot 55, 438-446)의 방법에 의해 하나의 스포어로부터 서브클로닝되었다. 식물의 번식은 스포어를 사용하여 배우체 (gametophyte)를 재생하여 수행하였다. 사상체 (protonema)는 반수체 (haploid) 스포어로부터 엽록체-풍부한 클로로네마 (chloronema) 및 엽록체-고갈된 카울로네마 (caulonema)로 발생하여, 약 12일 후에 버딩하였다. 이러한 버드 (bud)는 안테리디아 (antheridia) 및 아케고니아 (archegonia)를 갖는 배우자 (gametophore)로 성장하였다. 수정에 의해 짧은 강모 (seta) 및 스포어 캡슐을 갖는 2배체(diploid) 홀씨체 (sporophyte)를 생성하였으며, 여기서 마이오스포어 (meiospore)가 성숙하였다.
e) 식물 배양
식물은 25 ℃의 공기 온도 및 55 μmolㆍs-1ㆍm-2의 광 강도 (백색 광; Philips TL 65W/25 형광 튜브)에서 16/8 시간의 명/암 대역으로 조절된 환경의 캐비넷에서 성장하였다. 레스키 (Reski) 및 아벨 (Abel)의 변형된 크놉 (knop) 배지 (1985, Planta 165, 354-358), 또는 1% 옥소이드 (Oxoid) 아가를 사용하는 고상 크놉 배지 (Unipath, Basingstoke, England)를 사용하여 이끼를 액체 배양으로 배양하였다.
RNA 및 DNA 단리에 사용된 사상체 (protonemata)를 폭기 액체 배양으로 배양하였다. 사상체는 9일마다 세분하였으며, 새 배양 배지로 옮겼다.
f) 피토프토라 인페스탄스의 배양
먼저, 피토프토라 인페스탄스의 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 이를 위해, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Rockville, USA)으로부터 균주 ATCC 48886을 분양받을 수 있었다. 균주 ATCC 48886에 대하여 설명된 배양 프로토콜의 변형으로, 피토프토라 스포어를 냉각된 이차 증류수로 세척하고, 냉동기에서 6시간 동안 유지하여 홀씨형성 (sporulation)을 유도하였다. 그 후, 이 물질을 완두 배지로 옮겼다. 이를 위해, 많이 냉동시킨 완두 (Iglu, 인근 슈퍼마켓에서 구입가능) 150 g을 무균 조건 및 물 1 리터의 조건하에 20분 동안 고압증기멸균하였다. 이 물질을 궤도 진탕기 (200 rpm)상에서 실온의 100 ml 들이 플라스크중에서 배양하였다. 2일 후에, 2개의 플라스크를 여과하고, 모르타르 및 막자를 사용하여 여액 잔류물을 액체 질소중에서 분쇄하고, 4일 후에 2개의 플라스크 각각마다 이 과정을 반복하였다.
실시예 2: 혼성화 실험을 위한 식물 및 미생물, 예를 들어 트라우스토키트리움 및 크립테코디니움의 전체 DNA 분리
전체 DNA의 분리에 대한 상세한 것은 신선한 1 그램의 식물체의 처리를 참고한다.
CTAB 완충액: 2% (w/v) N-아세틸-N,N,N-트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB); 100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA.
N-라우릴사르코신 완충액: 10% (w/v) N-라우릴사르코신; 100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 20 mM EDTA.
식물체 또는 크립테코디니움 또는 트라우스토키트리움 세포체를 모르타르에서 액체 질소하에 분쇄하여 미세 분말을 얻고, 2 ml 용량의 에펜도르프 (Eppendorf) 용기로 옮겼다. 이어서 동결된 식물체를 1 ml의 분해 완충액 (CTAB 완충액 1 ml, N-라우릴사르코신 완충액 100 ml, β-메르캅토에탄올 20 ml 및 프로테이나제 K 용액 10 ml, 10 mg/ml) 층으로 덮고, 지속적으로 진탕하면서 60 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 균질물을 2개의 에펜도르프 용기 (2 ml)내에 분배하고, 동 부피의 클로로포름/이소아밀알콜 (24:1)로 진탕하여 2회 추출하였다. 상 분리를 위해, 각 경우마다 8000 ×g로 실온 (= 실온이란 약 23 ℃를 의미함)에서 15분 동안 원심분리를 수행하였다. 이어서, 빙냉 이소프로판올을 사용하여 DNA를 -70 ℃에서 30분 동안 침전시켰다. 침전된 DNA를 4 ℃ 및 10,000 g에서 30분 동안 퇴적 (sediment)시키고, TE 완충액 180 ml 중에 재현탁시켰다 (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). 추가의 정제를 위해, DNA를 NaCl (최종 농도: 1.2 M)로 처리하고, 두배 부피의 순수 에탄올을 사용하여 -70 ℃에서 30분 동안 다시 침전시켰다. 70% 에탄올을 사용하여 세척 단계를 수행한 다음, DNA를 건조시키고, 이어서 H2O + RNase (최종 농도: 50 mg/ml) 50 ml 중에 용해시켰다. DNA를 4 ℃에서 밤새 용해시키고, 이어서 RNase 절단을 37 ℃에서 1시간 동안 수행하였다. 이 DNA를 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 3: 식물 및 미생물 (크립테코디니움 및 트라우스토키트리움)로부터의 총 RNA 및 폴리 (A) + -RNA의 분리
문헌 (Logemann et al (1987, Anal. Biochem. 163, 21))에 기재된 방법에 의해 아마인 및 평지 등의 식물로부터 총 RNA를 분리하였다. 이끼로부터의 총 RNA는 GTC 방법 (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359)을 이용하여 사상체 조직으로부터 얻을 수 있었다.
크립테코디니움 및 트라우스토키트리움으로부터의 RNA 분리:
조류의 동결 샘플 (-70 ℃)을 액체 질소하의 빙냉 모르타르중에서 분쇄하여 미세 분말을 얻었다. 균질 배지 (소르비톨 12.024 g, 1M Tris-HCl, pH 9 (0.2 M) 40.0 ml; 5 M NaCl (0.3 M) 12.0 ml, 250 mM EDTA 8.0 ml, EGTA 761.0 mg, 10% SDS 40.0 ml은 H2O와 함께 200 ml을 구성하였으며, pH를 8.5로 조정함) 2배 부피, 및0.2%의 메르캅토에탄올을 함유하는 페놀 4배 부피를 40 내지 50 ℃에서 동결 세포 분말에 가하면서 완전히 혼합하였다. 이어서, 2배 부피의 클로로포름을 가하고, 혼합물을 15분 동안 강력 교반하였다. 혼합물을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 수상을 페놀/클로로포름 (2 vol/2 vol)에 이어서 클로로포름으로 추출하였다.
수상의 생성된 부피를 4 M 아세트산나트륨 (pH 6) 1/20배 부피 및 (빙냉) 이소프로판올 1배 부피로 처리하고, 핵산을 -20 ℃에서 침전시켰다. 혼합물을 10,000 g에서 30분 동안 원심분리하고, 상등액을 흡입 제거하였다. 이후에, 70% EtOH로의 세척 및 또 다른 원심분리 단계를 수행하였다. 침전물을 Tris 보레이트 완충액 (80 mM Tris 보레이트 완충액, 10 mM EDTA, pH 7.0) 중에 용해시켰다. 이어서, 상등액을 1/3배 부피의 8 M LiCl로 처리하고, 혼합하고, 4 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 재원심분리 후에, 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 원심분리하고, 침전물을 RNase-무함유 물 중에 용해시켰다.
제조자의 프로토콜의 지시에 따라 다이나 비즈 (Dyna Beads; 등록상표) (Dynal, Oslo, Finland)를 사용하여 폴리 (A)+-RNA를 분리하였다.
RNA 또는 폴리(A)+-RNA 농도를 결정한 다음, 1/10배 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.6) 및 2배 부피의 에탄올을 가하여 RNA를 침전시키고, -70 ℃에서 보관하였다.
분석을 위해, RNA 분획 20 ㎍을 포름알데히드를 포함하는 1.5% 농도의 아가로스 겔 중에서 분리하고, 나일론 막 (Hybond, Amersham)으로 옮겼다. 문헌 (Amasino, (1986) Anal. Biochem. 152, 304)에 기재된 바와 같이 특이적 전사체를 검출하였다.
피토프토라 인페스탄스로부터의 총 RNA 및 폴리-(A) + RNA의 분리:
제조자의 지시에 따라 RNeasy 식물 총 RNA 키트 (Quiagen, Milden) 및 그중에 포함된 완충액을 사용하여 총 RNA를 얻었다. 이와 같이 얻어진 총 RNA로부터, 제조자의 지시에 따라 Promega (Heidelberg)로부터 RNA 분리 시스템 III에서 폴리 어트랙트 (Poly Attract)를 사용하여 폴리-(A)+RNA를 분리하였다.
실시예 4: cDNA 라이브러리의 구성
피스코미트렐라, 크립테코디니움 및 트라우스토키트리움으로부터 각각 cDNA 라이브러리를 구성하기 위해, 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (Roche, Mannheim, Germany) 및 올리고-d(T) 프라이머를 사용하여 제1 가닥의 합성을 수행하고, 제2 가닥의 합성은 12 ℃ (2 시간), 16 ℃ (1 시간) 및 22 ℃ (1 시간)에서 DNA 폴리머라제 I, 클레노브 (Klenow) 효소와 함께 인큐베이션하고, RNAse H로 절단하여 수행하였다. 65 ℃ (10 분)에서 인큐베이션하여 반응을 켄칭하고, 이어서 얼음으로 옮겼다. 37 ℃ (30 분)에서 T4 DNA 폴리머라제 (Roche, Mannheim)를 사용하여 이중 가닥 DNA 분자를 블런트-말단으로 만들었다. 페놀/클로로포름 및 세파덱스 (Sephadex) G50 스핀 칼럼으로 추출하여 뉴클레오티드를 제거하였다. T4 DNA 리가제 (Roche, 12 ℃, 밤새)를 사용하여 EcoRI/XhoI 어댑터 (Pharmacia, Freiburg,Germany)를 cDNA 말단에 라이게이션하고, XhoI으로 재절단하고, 폴리뉴클레오티드 키나제 (Roche, 37 ℃, 30 분)와 함께 인큐베이션하여 인산화하였다. 이 혼합물을 저-융점 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 제조자의 재료를 사용하고 그의 지시에 따라 기가팩 골드 키트 (Gigapack Gold kit)(Stratagene, Amsterdam, the Netherlands)를 사용하여, 300 염기쌍 이상의 DNA 분자를 겔로부터 용출시키고, 페놀로 추출하고, Elutip D 칼럼 (Schleicher and Schull, Dassel, Germany) 상에 농축하고, 벡터 암 (arm)에 라이게이션시키고, 람다-ZAPII 파아지 또는 람다-ZAP-발현 파아지내에 패키징하였다.
피토프토라 인페스탄스에 대한 cDNA 라이브러리의 구성은 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 5: DNA 서열분석 및 컴퓨터 분석
표준 방법, 특히 ABI PRISM 빅 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리엑션 키트 (Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany)를 사용하는 쇄 종결 방법에 의한 DNA 서열분석에 있어서, 실시예 4에 기재된 cDNA 라이브러리를 사용하였다. cDNA 라이브러리로부터의 플라스미드 분리 후에, 생체내 크기 절단 및 아가 플레이트상의 DH10B의 재형질전환을 통해 각각의 랜덤 클론을 서열분석하였다 (재료 및 프로토콜에 대한 세부사항: Stratagene, Amsterdam, the Netherlands). 제조자의 프로토콜에 따라 Qiagen DNA 제조 로보트 (Qiagen, Hilden)를 사용하여, 암피실린을 보충한 루리아 (Luria) 브로쓰 (문헌 (Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN0-87969-309-6) 참조) 중에서 밤새 배양한 이. 콜라이 배양물로부터 플라스미드 DNA를 준비하였다. 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열화 프라이머를 사용하였다:
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3'
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'
Bio-Max (Munich, Germany)사에서 시판되는 EST-MAX 표준 소프트웨어 패키지를 사용하여 서열을 프로세싱하고 기록하였다. BLAST 프로그램 (Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)을 사용하는데 있어서, 비교 알고리즘을 이용하고 탐색 서열을 사용하여, 동종 서열을 검색하였다. 피스코미트렐라 파텐스 이끼 연장효소의 검색 서열과 상동성을 갖는 크립테코디니움 및 트라우스토키트리움으로부터의 한 서열의 특징을 보다 상세히 규명하였다.
실시예 6a: 피스코미트렐라 파텐스 Pp_PSE1 유전자와의 비교에 의한 Tc_PSE1 및 Tc_PSE2 (Tc = 트라우스토키트리움) 유전자, 및 Cc_PSE1 및 Cc_PSE2 유전자 (Cc = 크립테코디니움 코니)의 확인
본 발명에 따른 Pp_PSE1 이끼 연장효소 (명칭: 표 2 참조)의 전장 서열을 TBLASTN 검색 알고리즘에서의 서열 비교를 위해 사용하였다.
MEVVERFYGE LDGKVSQGVN ALLGSFGVEL TDTPTTKGLP LVDSPTPIVL GVSVYLTIVI
GGLLWIKARD LKPRASEPFL LQALVLVHNL FCFALSLYMC VGIAYQAITW RYSLWGNAYN
PKHKEMAILV YLFYMSKYVE FMDTVIMILK RSTRQISFLH VYHHSSISLI WWAIAHHAPG
GEAYWSAALN SGVHVLMYAY YFLAACLRSS PKLKNKYLFW GRYLTQFQMF QFMLNLVQAY
YDMKTNAPYP QWLIKILFYY MISLLFLFGN FYVQKYIKPS DGKQKGAKTE.
이끼 연장효소 Pp_PSE1 CDNA의 완전한 뉴클레오티드 서열은 약 1200 bp로 구성되어 있다. 이 서열은 이론치 분자량이 33.4 Da인, 290개의 아미노산을 코딩하는 873 bp의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이 단백질 서열은 효모에서 중간 쇄 길이를 갖는 지방산의 연장에 요구되는 사카로마이세스 세레비지아의 유전자 산물, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아의 유전자 산물과 단지 38.5%의 동일성 및 48.3%의 유사성을 갖는다 (Toke & Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 271, 18413-18422).
EST 서열 CC001042041R, TC002034029R 및 TC002014093R은 피스코미트렐라 파텐스 연장효소 (표 2 참조), PSE1 유전자와의 초기의 약한 상동성으로 인해 다른 후보 유전자들 중에서 표적 유전자로 우선적으로 고려되었다. 도 5는 Pp_PSE1 펩티드 서열과 발견된 서열과의 비교 결과를 보여준다. 이것은 본 발명에 따른 서열 3의 핵산 서열 (유전자명: TcPSE1, 발명자의 데이타베이스 번호: TC002034029R)의 부분이다. 문자는 동일한 아미노산을 나타내며, + 기호는 화학적으로 유사한 아미노산을 나타낸다. 본 발명에 따라 발견되는 모든 서열의 동일성 및 상동성은 표 3의 요약에서 볼 수 있다.
클론 TC002034029R로부터의 완전한 cDNA 단편의 서열화는 오픈 리딩 프레임에서 첫번째 염기로 시작하는 693개 염기쌍의 서열을 생성시켰다. 이 서열은 서열 3으로부터 번역되는 염기쌍 위치중 염기쌍 위치 586-588에 종결 코돈을 가지며 서열 4에 나타낸 195개 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코딩한다. 클론 TC002014093R은 도 7의 서열 배열로부터 볼 수 있는 바와 같은 실제적으로 완전한 연장효소 폴리펩티드를 포함한다. 선은 동일한 아미노산을 나타내며, 콜론 및 점은 화학적으로 교환가능한, 즉 화학적으로 동등한 아미노산을 나타낸다. 배열은 헤니코프 앤 헤니코프 (Henikoff & Henikoff)의 BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스 ((1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)를 사용하여 수행하였다. 사용된 파라메타: 갭 웨이트: 8; 평균 매치: 2.912, 길이 웨이트: 2, 평균 미스매치: -2.003.
또한, 서열 배열에 의해 제2 EST를 확인하였다. 발견된 서열을 갖는 Pp_PSE1 펩티드 서열의 배열은 도 6에 나타나 있다. 선택된 파라메타 중에서 상동성이 몇개의 아미노산으로 제한되기는 하지만, 이는 PUFA 특이적 연장효소의 고도로 보존된 영역을 의미한다. 따라서, 완전히 클로닝된 단편의 서열이 결정된다.
클론 TC002014093R의 완전한 cDNA 단편의 서열화는 오픈 리딩 프레임내에서 첫번째 염기로 출발하는 955 염기쌍으로 이루어진 서열을 생성시켰다. 이는 본 발명에 따른 서열 5를 의미한다. 이 서열은 서열 6에서 본 발명에 따라 나타낸 염기쌍 위치 892-894의 종결 코돈을 갖는 297개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를코딩한다.
서열 PpPSE1을 사용하여 Cc_PSE1 유전자를 코딩하는 크립테코디니움 코니 EST CC001042041R을 확인하였다. 본 발명에 따라 서열 7로 나타낸 단리된 EST CC001042041R은 염기쌍 708개의 길이이고, 214개의 아미노산을 코딩하며 위치 643-645에서 종결 코돈을 갖는, 첫번째 염기로부터 642개의 염기쌍으로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임을 갖는다. 종결 코돈까지의 아미노산 서열은 본 발명에 따른 서열 8에 나타나 있다.
PSE1 유전자 산물과의 유사성뿐 아니라, 효모에서 중간 쇄 길이의 지방산의 연장에 요구되는 사카로마이세스 세레비지아 연장효소 (sce elo 1P)와의 유사성은 또한 문헌 (Toke & Martin, 1996, Isolation and characterization of a gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 271, 18413-18422)을 참고할 수 있다. 표 3은 본 발명에 따른 연장효소들 서로에 대한 동일성 및 상동성, 및 이들과 피스코미트렐라 파텐스 및 효모 연장효소와의 동일성 및 상동성을 보여준다. 이 데이타는 위스콘신 패키지 (Wisconsin Package) 버전 10.0이라는 소프트웨어 (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc., USA)의 서브프로그램으로서 GAP 프로그램을 사용하여 얻어진 것이다.
동일성/상동성 Tc_PSE1 TC_PSE2 Pp_PSE1 Sce elo 1P
Cc_PSE1 47.1% / 40.2% 50.6% / 43.5% 38.5% / 29.4% 45.1% / 33.5%
Tc_PSE1 100 / 100 n.d. 43.2% / 32.7% 41.9% / 29.9%
Tc_PSE2 41.7% / 29.5% 100 / 100 39.2% / 30.0 35.4% / 27.8%
특히, 도 5 내지 10은 하기 서열 모티프를, 높은 상동성 영역 및 그로부터 유도되는 상응하는 컨센서스 서열로서 유도하는데 사용될 수 있으며, 아미노산을 3개의 염기쌍 코돈으로 역으로 번역함으로써, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 신규 연장효소를 단리하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 형성시킨다. 이들은 구체적으로 도 10에 나타낸 서열 모티프이다. 이러한 모티프는, 두개의 올리고뉴클레오티드와 함께, 다른 연장효소 단편을 단리하기 위한 PCR 실험에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 유도하는데 사용될 수 있다. 이를 위해, 통상적으로 정의된 5'-3' 가닥과 매치하는 하나의 올리고뉴클레오티드, 및 아래쪽의 3'-5' 가닥과 매치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드를 구성 및 합성하는 것이 편리하다. 이는 한정된 수의 프라이머 조합을 형성하며, 이는 가능한 변이체의 치환 (permutation)에 의해 제한된다.
이 경우, 전사체 푸울 (pool), 예를 들어 올리고 dT (12-20) X (여기서, X는 G, C 또는 T일 수 있음)에 대한 특이성을 허용하는 마지막 염기에 의해 올리고 dT-프라이머 및 그의 변이체를 사용할 수도 있다. 또한, 제2 염기 올리고 dT (12-20) XY (여기서, X는 G, C 또는 A이며, Y는 A, G, C 또는 T일 수 있음)가 사용될 수 있다.
상기 언급된 서열은 17- 내지 20-머 올리고뉴클레오티드가 유도될 수 있도록 하며, 이는 프라이머 조합 및 실험 파라메타, 예를 들어 온도 프로그램 및 Mg 이온 농도 등을 변화시킴으로써 유전자 단편을 단리하는데 사용될 수 있다. 생성된 프라이머 단편은 적합한 벡터내에 클로닝될 수 있으며, 생성된 클론의 서열은 신규 연장효소를 확인하는 통상의 방법에 의해 결정할 수 있다.
실시예 6b: 피토프토라 인페스탄스로부터의 cDNA 클론의 단리
이끼 피스코미트렐라 파텐스 (ATCCC 48886)로부터의 PUFA 연장효소에 대한 상동성을 이용하여, PI001002014R로 명명된, 피토프토라 인페스탄스로부터의 cDNA 클론을 랜덤하게 서열화된 cDNA로부터 확인하였다. 이 클론은 지금까지 확인된 PUFA 연장효소와는 상이한 도 8에 나타낸 컨센서스 모티프 MyxYYF를 포함하며, 쓰레오닌 라디칼은 가변성 아미노산 x로 밝혀졌다. 이러한 추가의 변형은 PCR 프라이머를 유도하는데 사용될 수 있다.
실시예 7: 혼성화에 의한 유전자의 확인
(TC002034029R-11 iGenTc-PCE1)
유전자 서열은 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리로부터 동종 또는 이종 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.
동종 유전자 (즉, 상동성인 전장 cDNA 클론 또는 동족체)는 예를 들어 cDNA 라이브러리를 사용하여 핵산 혼성화를 통해 단리될 수 있으며; 이 방법은 특히 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 및 서열 11에서 기능적으로 활성인 전장 유전자를 단리하는데 사용될 수 있다. 목적 유전자의 빈도에 따라, 100,000 내지 1,000,000개의 재조합 박테리오파지를 플레이팅하고, 나일론 막으로 옮겼다. 알칼리로 변성한 다음, 예를 들어 UV 가교결합에 의해 DNA를 막에 고정하였다. 혼성화는 고 엄격 조건하에 수행하였다. 혼성화 및 세척 단계는 1M NaCl의 이온 농도 및68 ℃의 온도의 수용액 중에서 수행하였다. 혼성화 프로브는 예를 들어 방사활성 (32P-) 닉 (nick)-전사로 표지하여 생성시켰다 (High Prime, Roche, Mannheim, Germany). 신호는 오토라디오그라피에 의해 검출되었다.
관련성은 있지만 동일하지는 않은, 부분적으로 상동성 또는 이종성인 유전자는 저 엄격 혼성화 및 세척 조건을 이용하여 상기 기재된 방법과 유사하게 확인할 수 있다. 수성 혼성화의 경우, 이온 농도는 일반적으로 1M NaCl로 유지되었으며, 온도는 68 ℃에서 42 ℃로 점차적으로 낮추었다.
각 도메인, 예를 들어 10 내지 20개의 아미노산과 단지 상동성을 나타내는 유전자 서열의 단리는 합성의 방사성표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 방사성표지된 올리고뉴클레오티드는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 두 상보적 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 인산화하여 생성시킨다. 상보적 올리고뉴클레오티드를 혼성화하고, 서로 라이게이션하여 콘카테머 (concatemer)를 형성하였다. 이중 가닥 콘카테머를 예를 들어 닉-전사에 의해 방사성표지한다. 혼성화는 일반적으로 저 엄격 조건하에 고농도의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한다.
올리고뉴클레오티드 혼성화 용액:
6 ×SSC
0.01 M 인산나트륨
1 mM EDTA (pH 8)
0.5% SDS
100 ㎍/ml 변성된 연어 정액 DNA
0.1% 건조 무지방 밀크
혼성화 동안, 온도는 계산된 올리고뉴클레오티드 온도 미만 5 내지 10 ℃로 또는 실온으로 단계적으로 낮춘 다음 (달리 지시되지 않는 한, RT는 모든 실험에서 약 23 ℃이다), 세척 단계 및 오토라디오그라피를 수행하였다. 세척은 매우 낮은 엄격조건에서, 예를 들어 4 ×SSC를 사용하여 3회의 세척 단계를 수행하였다. 보다 상세한 것은 문헌 (Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel, F.M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons)에 기재되어 있다.
유전자명 Tc_PCE1_1을 갖는 클론 TC002034029R-11은 트라우스토키트리움 유래의 연장효소의 전장 서열이며, 따라서 서열 3 및 서열 4의 클론 TC002034029R보다 더 길다. 이 클론은 상기 (실시예 7) 기재된 혼성화 방법을 이용하여 단리하였다. 이것은 염기쌍 위치 43-45의 출발 코돈 및 염기쌍 위치 856-858의 종결 코돈을 갖는, 271개의 아미노산을 코딩하는 염기쌍 1050개 길이의 DNA 서열이다.
실시예 8: 항체를 사용한 발현 라이브러리의 스크리닝에 의한 대상 유전자의 확인
재조합 단백질을 생성시키기 위해, 예를 들어 이. 콜라이 cDNA 서열을 사용하였다 (예를 들어, Qiagen QIAexpress pQE 시스템). 이어서, 일반적으로 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 (Qiagen)에 의해 재조합 단백질을 친화성-정제하였다. 그 후, 예를 들어 토끼를 면역화하는 표준 기술을 이용하여 특이적 항체를 형성하는데 있어서 재조합 단백질을 사용하였다. 이어서, 문헌 (Gu et al., (1994) BioTechniques 17:257-262)에 기재된 바와 같이, 재조합 항원으로 예비포화된 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 항체를 친화성-정제하였다. 그 후, 이 항체를 사용하여 면역학적 스크리닝에 의해 발현 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있었다 (Sambrook, J., et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel, F.M., et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
실시예 9: 식물 형질전환용 플라스미드
식물 형질전환에서는 pBinAR 등의 바이너리 (Binary) 벡터를 사용할 수 있다 (Hofgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230). 바이너리 벡터는 cDNA를 T-DNA내에 센스 또는 안티센스 방향으로 라이게이션하여 제작할 수 있다. cDNA의 5'의 식물 프로모터는 cDNA 전사를 활성화한다. 폴리아데닐화 서열은 cDNA의 3'에 위치한다.
조직-특이적 프로모터를 사용하여 조직-특이적 발현을 달성할 수 있다. 예를 들어, 종자-특이적 발현은 나핀 (napin) 또는 LeB4 또는 cDNA 5'의 USP 프로모터에서의 클로닝에 의해 달성할 수 있다. 임의의 다른 종자-특이적 프로모터 요소를 사용할 수도 있다. CaMV-35S 프로모터는 모든 식물에서 구성적 발현에 사용될수 있다.
발현되는 단백질은 신호 펩티드를 사용하여 세포내 구획, 예를 들어 플라스티드, 미토콘드리아 또는 소포체내에 표적화할 수 있다 (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). 신호 펩티드를 cDNA와 함께 정확한 리딩 프레임내의 5'에 클로닝하여 융합 단백질의 세포내 위치화를 달성하였다.
실시예 10: 아그로박테리움의 형질전환
아그로박테리움-매개된 식물 형질전환은 예를 들어 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell, Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383-396) 또는 LBA4404 (Clontech)을 사용하여 수행할 수 있다. 형질전환은 표준 형질전환 기술에 의해 수행할 수 있다 (Deblaere et al., Nucl. Acids. Tes. 13 (1984), 4777-4788).
실시예 11: 식물 형질전환
표준 형질전환 및 재생 기술을 이용하여 아그로박테리움-매개된 식물 형질전환을 수행할 수 있다 (Gelvin, Stilton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 pp. ISBN 0-8493-5164-2).
예를 들어, 자엽 (cotyledon) 또는 하이포코틸레돈 (hypocotyledon) 형질전환에 의해 평지를 형질전환시킨다 (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989)238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). 아그로박테리아 및 식물의 선택을 위한 항생제의 사용은 형질전환에 사용된 바이너리 벡터 및 아그로박테리아 균주에 따라 달라진다. 평지의 선택은 통상적으로 선택가능한 식물 마커로서 카나마이신을 사용하여 수행된다.
아마인 (리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum))에서 아그로박테리움-매개 유전자 전달은 예를 들어 문헌 (Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285)에 기재된 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 콩의 형질전환은 예를 들어 문헌 (EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) 또는 EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University of Toledo))에 기재된 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
입자충격법, 폴리에틸렌-글리콜-매개 DNA 수용 또는 실리콘 카르보네이트 섬유 기술을 이용한 식물 형질전환은 예를 들어 문헌 (Freeling and Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York)에 기재되어 있다.
실시예 12: 식물 형질전환용 플라스미드
pBinAR 등의 바이너리 벡터를 식물 형질전환에 사용할 수 있다 (Hoefgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221-230). 바이너리 벡터는 cDNA를 T-DNA내에 센스 또는 안티센스 방향으로 라이게이션하여 제작할 수 있으며, 식물 프로모터는 cDNA 전사를 활성화한다. 폴리아데닐화 서열은 cDNA의 3'에 위치한다. 조직-특이적 발현은 조직-특이적 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 나핀 또는 LeB4 또는 cDNA 5'의 USP 프로모터내에 클로닝하여 종자-특이적 발현을 달성할 수 있다. 임의의 다른 종자-특이적 프로모터 요소를 사용할 수도 있다. CaMV-35S 프로모터는 모든 식물에서 구성적 발현을 위해 사용될 수 있다. 특히, 식물에서의 대사 경로를 모방하기 위해 다수개의 발현 카세트를 연속으로 구성하여 연장효소 및 불포화효소를 코딩하는 유전자를 바이너리 벡터내에 클로닝할 수 있다.
발현 카세트내에서, 신호 펩티드를 사용하여 발현되는 단백질을 세포 구획, 예를 들어 플라스티드, 미토콘드리아 또는 소포체로 표적화할 수 있다 (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423). 신호 펩티드를 cDNA와 함께 정확한 리딩 프레임내에 클로닝하여 융합 단백질의 세포내 위치화를 달성한다.
실시예 13: 생체내 돌연변이유발
이. 콜라이 또는 다른 미생물 (예를 들어, 바실루스 (Bacillus) 종 또는 사카로마이세스 세레비재애 등의 효모)을 통해 플라스미드 DNA (또는 임의의 다른 벡터 DNA)를 계대배양함으로써 미생물의 생체내 돌연변이유발을 수행할 수 있는데, 이 때 이들이 유전자 정보를 통합하여 보유하는 능력은 상실되어 있다. 통상의 변이체 종들은 DNA 복구 시스템에 대한 유전자 (예를 들어, mutHLS, mutD 및 mutT 등; 참고문헌으로는, 문헌 (Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM: Washington)을 참조)에서의 변이를 갖는다. 이러한 종들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 균주의 사용은 예를 들어 문헌 (Greener, A., and Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34)에 예시되어 있다. 미생물이 선별되고 시험된 다음, 변이된 DNA 분자는 바람직하게는 식물로 전달된다. 유전자전환 식물은 본원의 실시예 부분에 나타낸 다양한 예에 따라 생성된다.
실시예 14: 형질전환된 생물에서 재조합 유전자 산물의 발현 연구
형질전환된 숙주 생물에서 재조합 유전자 산물의 활성을 전사 및(또는) 번역 수준에서 측정하였다.
유전자의 전사량 (이는 유전자 산물의 번역에 이용가능한 RNA의 양을 나타냄)을 결정하는 적합한 방법은 하기에 구체적으로 나타낸 노던 블롯 (문헌으로는, 문헌 (Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) 또는 상기 실시예 부분에 언급된 문헌을 참조)을 수행하는 것이며, 여기서 목적 유전자와 결합하도록 설계된 프라이머는 검출가능한 표지 (일반적으로 방사활성 표지 또는 화학발광 표지)로 표지되어, 생물 배양물중의 총 RNA가 추출되고 겔상에 분리되고 적합한 매트릭스로 전달되고 이러한 프로브와 함께 인큐베이션되는 경우, 프로브의 결합 및 결합 정도는 이 유전자에 대한 mRNA의 존재 및 양을 나타낸다. 이러한 형질전환은 형질전환된 유전자의 전사 정도를 나타낸다. 총 세포 RNA는 여러가지 방법에 의해 세포, 조직 또는 기관으로부터 제조할 수 있으며, 이들 모두는 예를 들어 문헌 (Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326)의 방법과 같이 당업계에 공지되어 있다.
노던 혼성화:
RNA 혼성화의 경우, 총 RNA 20 ㎍ 또는 폴리(A)+-RNA 1 ㎍을, 문헌 (Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304))에 기재된 바와 같이 포름알데히드를 사용하여 1.25% 농도의 아가로스 겔 중에서 겔 전기영동에 의해 분리하고, 10 x SSC를 사용하여 모세관 인력 (capillary attraction)에 의해 양으로 하전된 나일론 막 (Hybond N+, Amersham, Brunswick)으로 전달하고, UV 광에 의해 고정하고, 혼성화 완충액 (10% 덱스트란 술페이트 w/v, 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg 청어 (herring) 정액 DNA)을 사용하여 68 ℃에서 3시간 동안 예비혼성화하였다. DNA 프로브를 예비혼성화 단계 동안 알파-32P-dCTP (Amersham, Brunswick, Germany)를 사용하여 Highprime DNA 표지 키트 (Roche, Mannheim, Germany)로 표지하였다. 표지된 DNA 프로브를 동일한 완충액 중에 68 ℃에서 밤새 가한 다음, 혼성화를 수행하였다. 세척 단계는 68 ℃에서 2 x SSC를 사용하여 15분 동안 2회 및 1 x SSC, 1% SDS를 사용하여 30분 동안 2회 수행하였다. 실링된 필터를 -70 ℃에서 1 내지 14일 동안 노출시켰다.
표준 기술, 예를 들어 웨스턴 블롯 (예를 들어, 문헌 (Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) 참조)은 이러한 mRNA에 의해 번역되는 단백질의 존재 또는 상대적인 양을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법에서, 총 세포 단백질을 추출하고, 겔 전기영동에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 등의 매트릭스로 전달하고, 목적하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 등의 프로브와 함께 인큐베이션한다. 이러한 프로브는 일반적으로 쉽게 검출될 수 있는 화학발광 또는 비색 표지로 제공된다. 관찰되는 표지의 존재 및 양은 세포내에 존재하는 목적하는 변형된 단백질의 존재 및 양을 나타낸다.
실시예 15: 목적하는 단백질의 생산에 있어서 재조합 단백질의 영향 분석
식물, 진균, 조류, 섬모류에서 또는 목적하는 화합물 (예를 들어, 지방산)의 생산에서 유전자 변형의 효과는 변형된 미생물 또는 변형된 식물을 적합한 조건 (예를 들어, 상기 기재된 조건)에서 증식시키고, 목적하는 생성물 (즉, 지질 또는 지방산)의 증가된 생산에 대하여 배지 및(또는) 세포 성분을 분석하여 결정할 수 있다. 이러한 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 스펙트로스코피, 박막 크로마토그래피, 각종 염색법, 효소 및 미생물적 방법, 및 분석 크로마토그래피, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, 문헌 (Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and pp. 443-613, VCH Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Chapter III "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., and Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Chapter 11, Vol. 1-27, VCH Weinheim; and Dechow, F.J.(1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications)을 참조한다).
상기 언급한 방법 이외에, 문헌 (Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, and Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145))에 기재된 바와 같이 식물체로부터 식물 지질을 추출한다. 지질 또는 지방산의 정성 및 정량 분석은 문헌 (Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 pp. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) under the title: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN)에 기재되어 있다.
발효의 최종 산물을 측정하는 것 이외에, 중간체 및 부산물 등의 목적하는 화합물을 생산하는데 사용되는 대사 경로의 다른 성분을 분석하여 화합물의 전체적인 생산 효율을 결정할 수 있다. 분석 방법은 배지에서 영양분 (예를 들어, 당, 탄수화물, 질소 공급원, 포스페이트 및 기타 이온)의 양을 측정하는 것, 바이오매스 조성 및 증식 측정, 생합성 경로의 통상의 대사산물의 생산 분석, 및 발효 동안에 생성되는 기체의 측정을 포함한다. 이러한 측정에 대한 표준 방법은 문헌 (Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, Ed., IRL Press, pp. 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773)) 및 이들문헌에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
한가지 예는 지방산의 분석이다 (약자: FAME, 지방산 메틸 에스테르; GC-MS, 기체-액체 크로마토그래피/매스 스펙트로메트리; TAG, 트리아실글리세롤; TLC, 박막 크로마토그래피).
지방산 산물의 존재에 대한 명백한 검출은 분석 표준 방법: GC, GC-MS 또는 TLC에 의해 재조합 생물을 분석하여 달성할 수 있으며, 이들 방법은 여러 경우 문헌 (Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth edition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, gas chromatography/mass spectrometry methods, Lipide 33:343-353)에 기재되어 있다.
분석되는 물질은 초음파처리, 유리 분쇄기로의 분쇄, 액체 질소 및 분쇄 또는 다른 이용가능한 방법에 의해 분리할 수 있다. 분리 후에, 물질을 원심분리해야 한다. 침전물을 증류수에 재현탁시키고, 100 ℃에서 10분 동안 가열하고, 빙냉시키고, 재원심분리시킨 다음, 90 ℃에서 1시간 동안 2% 디메톡시프로판을 함유하는 메탄올 중 0.5M 황산에서 추출하여, 트랜스메틸화된 지질을 생성하는 가수분해된 오일 및 지질 화합물을 형성한다. 이러한 지방산 메틸 에스테르는 석유 에테르 중에서 추출하며, 170 ℃ 내지 240 ℃의 온도 구배에서 20분 동안 및 240 ℃에서 5분 동안 모세관 칼럼 (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 미크론, 0.32 mm)을 사용하여 마지막으로 GC 분석한다. 생성되는 지방산 메틸 에스테르의 존재는 상업적으로 이용가능한 표준 (즉, 시그마)을 이용하여 정해져야 한다.
표준을 이용할 수 없는 지방산의 경우, 그의 존재는 유도체화 이후 GC/MS 분석을 통해 입증되어야 한다. 예를 들어, 삼중 결합을 갖는 지방산의 위치화는 4,4-디메톡시옥사졸린 유도체 (Christie, 1998, 상기 참조)로의 유도체화 이후에 GC/MS를 통해 입증되어야 한다.
실시예 16: 이종 미생물계의 발현 구조물
균주, 배양 조건 및 플라스미드
신규 피스코미트렐라 파텐스 연장효소, 예를 들어 PpPSE1을 서브클로닝하는데 이. 콜라이 균주 XL1 Blue MRF' kan (Stratagene)을 사용하였다. 기능적으로 이러한 유전자를 발현시키기 위해, 본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지아 균주 INVSc 1 (Invitrogen Co.)을 사용하였다. 이. 콜라이를 37 ℃에서 루리아-베르티니 (Luria-Bertini) 브로쓰 (LB, Duchefa, Haarlem, the Netherlands) 중에서 배양하였다. 필요한 경우, 암피실린 (100 mg/리터)을 첨가하고, 1.5% 아가 (w/v)를 고상 LB 배지에 가하였다. 에스. 세레비지아를 30 ℃에서 YPG 배지 또는 우라실이 없는 완전 최소 배지 (CMdum; see: Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.B., Coen, D.M., and Varki, A. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) 중에서 2% (w/v)의 라피노스 또는 글루코스와 함께 배양하였다. 고상 배지의 경우, 2% (w/v)의 박토 (Bacto)(등록상표) 아가 (Difco)를 가하였다. 클로닝 및 발현에 사용된 플라스미드는 pUC18 (Pharmacia) 및 pYES2 (Invitrogen Co.)이었다.
실시예 17: PUFA-특이적 피스코미트렐라, 크립테코디니움 및 트라우스토키트리움 연장효소의 클로닝 및 발현
본 발명에 따른 서열의 전장 유전자를 실시예 7에 기재된 바와 같이 단리하고 하기 예시된 바와 같이 처리할 수 있다. 구체적인 발현 예가 용도에 대하여 나타나 있다.
A) 이끼 연장효소 Pp_PSE1에 의한 지방산의 연장:
효모에서의 발현의 경우, PUFA-특이적 연장효소 (PSE1) 유전자를 코딩하는 피. 파텐스 cDNA 클론 PpPSE1 (종래의 데이타베이스 서열 명칭: 08_ck19_b07, 새로운 명칭: pp001019019f)을 먼저, 매우 효율적인 번역을 위해 BamHI 제한 부위 및 효모 컨센서스 서열 (Kozak, M. (1986) 점 돌연변이는 진핵 리보좀에 의한 번역을 조절하는 AUG 개시 코돈을 플랭킹하는 서열을 형성한다. Cell 44, 283-292)이 출발 코돈 다음에 위치하고, BamHI 제한 부위가 종결 코돈을 플랭킹하도록 변형시켰다. 오픈 리딩 프레임을 증폭시키기 위해, 그의 5' 및 3' 말단에 상보적인 프라이머쌍을 합성하였다.
폴리머라제 연쇄 반응에 의해 서열 1에 나타낸 본 발명에 따른 서열의 유전자를 pYES내에 클로닝하여 플라스미드 pYPp_PSE1을 형성시켰다:
다음 올리고뉴클레오티드를 PCR 실험에서 사용하였다.
Ppex6: ggatccacataatggaggtcgtggagagattc
Ppex6r:ggatcctcactcagttttagctccttttgc
Pfu DNA (Stratagene) 폴리머라제와 함께 써모사이클러 (thermocycler)에서 매트릭스로 클론 PP001019019F의 플라스미드 DNA를 사용하여 96 ℃에서 3분, 96 ℃에서 30초의 25 사이클, 55 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 1분, 72 ℃에서 10분의 1 사이클의 온도 프로그램으로 PCR 반응을 수행하였다.
증폭된 DNA 단편의 정확한 크기는 아가로스 TBE 겔 전기영동에 의해 확인하였다. QIAquick 겔 추출 키트 (QIAGEN)를 사용하여 증폭된 DNA를 겔로부터 추출하고, Sure 클론 라이게이션 키트 (Pharmacia)를 사용하여 pUC18내에 먼저 클로닝하였다. 이와 같이 클로닝된 단편을 BamHI으로 절단하고 pYES내에 라이게이션하여 pYPp_PSE1을 형성하였다. 단편 배열은 HindIII에 의해 확인하였다. 이. 콜라이 XL1 Blue MRF' kan의 형질전환 후에, 형질전환체의 DNA 미니프리퍼레이션 (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313)을 수행하고, BamHI 제한 분석에 의해 양성 클론을 확인하였다. 클로닝된 PCR 산물의 서열은 ABI PRISM 빅 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리엑션 키트 (Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(Perkin-Elmer, Weiterstadt)를 사용하여 재서열분석하여 확인하였다.
DNA 맥시프리퍼레이션 (maxipreparation)에 있어서 뉴클레오본드 (Nucleobond; 등록상표) AX 500 플라스미드 DNA 추출 키트 (Macherey-Nagel, Duringen)를 사용하여 하나의 클론을 증식시켰다.
변형된 PEG/리튬 아세테이트 프로토콜 (Ausubel et al., 1995)에 의해 대조군으로 pYPp_PSE1 또는 pYES2를 사용하여 사카로마이세스 INVSc1을 형질전환시켰다. 2% 글루코스를 함유하는 CMdum-아가 플레이트상에서의 선별 후에, 앞서 언급한 바와 같은 추가의 배양 및 기능적 발현을 위해 형질전환체 및 pYES2 형질전환체를 선별하고, 배지중의 다양한 지방산을 공급하였다.
i) 삽입된 단편이 없는 pYES 플라스미드로 형질전환되거나 또는 250 ㎛ 헥사데카트리에노산 (16:3△7c,10c,13c)을 공급한 후에 Pp-PSE1 유전자 (몰% 데이타)를 발현시키는 효모의 지질 패턴.
ii) 삽입된 단편이 없는 pYES 플라스미드로 형질전환되거나 또는 500 ㎛ 피놀렌산 (18:3△6c,9c,12c)을 공급한 후에 Pp-PSE1 유전자 (몰% 데이타)를 발현시키는 효모의 지질 패턴.
iii) 삽입된 단편이 없는 pYES 플라스미드로 형질전환되거나 또는 500 ㎛ 스테아리돈산 (18:4△6c,9c,12c,15c)을 공급한 후에 Pp-PSE1 유전자 (몰% 데이타)를 발현시키는 효모의 지질 패턴.
iv) 삽입된 단편이 없는 pYES 플라스미드로 형질전환되거나 또는 500 ㎛ 리놀렌산 (18:2△9c,12c)을 공급한 후에 Pp-PSE1 유전자 (몰% 데이타)를 발현시키는 효모의 지질 패턴.
B) 트라우스토키트리움 연장효소에 의한 지방산의 연장
효모에서의 발현을 위해, PUFA-특이적 연장효소 (PSE) 유전자를 코딩하는 서열 3의 트라우스토키트리움 cDNA 클론 (Tc_PSE2)을 먼저, 그가 기능적으로 활성인 폴리펩티드를 구성하는 방식으로 변형시켰다. 이를 위해, 단백질의 N-말단을 DNA 수준에서 피스코미트렐라 파텐스 연장효소로부터의 적은 결실 염기에 의해 42 염기쌍을 연장시켰다. 그러나, 단지 서열에 대하여 정확한 리딩 프레임내에 출발 코돈을 부가하는 것도 가능하다.
하기 올리고뉴클레오티드를 PCR 실험에서 사용하였다.
pTCPSE2-5': aaaggatccacataatggaggtcgtggagagattctacggtgagttggatggga
agGTCATTTCGGGCCTCGACC
pTCPSE2-3': aaggatccctgagttttagctcccttttgctttcc
또한, 두 올리고뉴클레오티드는 매우 효율적인 발현을 번역을 위해 BamHI 제한 부위 및 효모 컨센서스 서열을 포함한다 (Kozak, M. (1986) 점 돌연변이는 진핵세포 리보좀에 의한 번역을 조절하는 AUG 개시 코돈을 플랭킹하는 서열을 형성한다. Cell 44, 283-292).
Pfu DNA (Stratagene) 폴리머라제와 함께 써모사이클러 (thermocycler)에서 매트릭스로 플라스미드 DNA를 사용하여 96 ℃에서 3분, 96 ℃에서 30초의 25 사이클, 55 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 3분, 72 ℃에서 10분의 1 사이클 및 4 ℃에서 정지의 온도 프로그램으로 PCR 반응을 수행하였다.
증폭된 DNA 단편의 정확한 크기는 아가로스 TBE 겔 전기영동에 의해 확인하였다. QIAquick 겔 추출 키트 (QIAGEN)를 사용하여 증폭된 DNA를 겔로부터 추출하고, Sure 클론 라이게이션 키트 (Pharmacia)를 사용하여 탈인산화된 벡터 pUC18의 SmaI 제한 부위내에 라이게이션하여 pUC-하이브리드-Tc_PSE2를 형성하였다. 이. 콜라이 XL1 Blue MRF' kan의 형질전환 후에, 24 암피실린-내성 형질전환체의 DNA 미니프리퍼레이션 (Riggs, M.G., & McLachlan, A. (1986) A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313)을 수행하고, BamHI 제한 분석에 의해 양성 클론을 확인하였다. 클로닝된 PCR 산물의 서열은 ABI PRISM 빅 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 리엑션 키트 (Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(Perkin-Elmer, Weiterstadt)를 사용하여 재서열분석하여 확인하였다.
pUC-PSE1 및 pUC-하이브리드-Tc_PSE2의 플라스미드 DNA를 먼저 BamHI으로 절단하고, 얻어진 단편을 탈인산화된 효모/이. 콜라이 셔틀 벡터 pYES2의 BamHI 제한 부위내에 라이게이션하여 pY2 하이브리드-Tc_PSE2를 생성하였다.
이. 콜라이의 형질전환 및 형질전환체로부터의 DNA 미니프리퍼레이션 후에, HindIII로 절단하여 벡터내의 DNA 단편을 확인하였다. DNA 맥시프리퍼레이션에 있어서 뉴클레오본드 (등록상표) AX500 플라스미드 DNA 추출 키트 (Macherey-Nagel, Duringen)를 사용하여 하나의 클론을 증식시켰다. 변형된 PEG/리튬 아세테이트 프로토콜 (Ausubel et al., 1995)의 방법에 의해 pY2PSE1, pYES2, pY2-하이브리드-Tc_PSE2 및 pYES2를 사용하여 사카로마이세스 INVSc1을 형질전환시켰다. 2% 글루코스를 함유하는 CMdum 아가 플레이트 상에서의 선별 후에, 각 경우에서 4개의 pY2PSE1 형질전환체 (pY2PSE1a-d), pY2-하이브리드-Tc_PSE2 형질전환체 (pY2-하이브리드-Tc_PSE2 1a-d) 및 하나의 pYES2 형질전환체를 추가의 배양 및 기능적 발현을 위해 선택하였다.
효모에서 연장효소 활성의 기능적 발현
예비배양:
유전자전환 효모 클론 (pY2-하이브리드-Tc_PSE2 1a-d, pYES2)을 사용하여 2% (w/v) 라피노스를 함유하는 CMdum 액체 배지 20 ml을 접종하고, 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)가 1.5 내지 2에 도달할 때까지 30 ℃에서 200 rpm으로 3일 동안 배양하였다.
주배양:
발현을 위해, 2% 라피노스 및 1% (v/v) 테르기톨 (Tergitol) NP-40를 함유하는 CMdum 액체 배지 20 ml에 지방산 기질을 보충하여 최종 농도가 0.003% (w/v)에 이르게 하였다. 배지에 OD600이 0.05인 예비배양물을 접종하였다. 2% (w/v) 갈락토스를 사용하여 0.2의 OD600에서 16시간 동안 발현을 유도하고, 이 때 0.8 내지 1.2의 OD600에서 배양물을 수획하였다.
지방산 합성
전체 지방산을 효모 배양물로부터 추출하고, 가스 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 이를 위해, 5 ml 배양물의 세포를 원심분리 (1000 x g, 10 분, 4 ℃)에의해 수획하고, 100 mM NaHCO3, pH 8.0로 1회 세척하여 잔류 배지 및 지방산을 제거하였다. 지방산 메틸 에스테르 (FAMEs)를 제조하기 위해, 세포 침전물을 1M 메탄올성 H2SO4및 2% (v/v) 디메톡시프로판으로 80 ℃에서 1시간 동안 처리하였다. FAMEs를 석유 에테르 2 ml로 2회 추출하고, 100 mM NaHCO3, pH 8.0로 1회 및 증류수로 1회 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기 용매를 아르곤 스트림하에 증발시키고, FAMEs를 석유 에테르 50 ㎕ 중에 용해시켰다. 연소 이온화 검출기를 구비한 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard) 6850 가스 크로마토그래프로 ZEBRON ZB Wax 모세관 칼럼 (30 m, 0.32 mm, 0.25 ㎛; Phenomenex) 상에서 시료를 분리하였다. 오븐 온도는 70 ℃ (1분간 유지)에서 시작하여, 20 ℃/분의 속도로 200 ℃에 이어서 5 ℃/분의 속도로 250 ℃ (5분간 유지) 및 마지막으로 5 ℃/분의 속도로 260 ℃로 프로그래밍하였다. 운반 기체로는 질소를 사용하였다 (70 ℃에서 4.5 ml/분). FAME 표준 (SIGMA)의 보유 시간과 비교하여 지방산을 확인하였다.
다섯의 유전자전환 효모 균주의 지방산 패턴은 표 1에 몰%로 나타나 있다.
부가 및 수용된 γ-리놀렌산의 비율은 두꺼운 글씨로 인쇄된 숫자로, 연장된 생성물의 비율은 적색 숫자로, 그리고 연장된 γ-리놀렌산의 비율은 두꺼운 글씨 (마지막 줄)로 인쇄된 숫자로 강조하였다.
pYES2 (i/대조군) 및 pY2PSE1 (ii-iv c+d/ 각 경우에서 pY2PSE1A, pY2PSE1B, pY2PSE1C, pY2PSE1D로 형질전환됨)로 형질전환된 효모의 총 지질로부터의 FAMEs의 GC 분석은 도 2a-e에 나타나 있다. 분석을 위해, 유전자전환 효모를 γ-18:3의 존재하에 배양하였다. 표 1은 이들의 지방산 패턴을 몰%로 나타낸다. γ-18:3의 수용은 두꺼운 글씨로 인쇄된 숫자로 강조하였고, 연장 생성물 디호모-γ-리놀렌산 (20:3△8,11,14)은 밑줄을 그었으며, 비율 γ-18:3-연장 생성물 (또한, 몰%로 나타냄)은 두꺼운 글씨로 나타낸 숫자로 강조하였다 (마지막 줄). 시스-△6,9,12 C18:3의 DMOX 유도체의 구조 및 질량 스펙트럼은 도 3a+b에서 볼 수 있다. △8,11,14 C20:3의 DMOX 유도체의 구조 및 질량 스펙트럼은 도 4a+b에서 볼 수 있다.
결과는 γ-18:3가 모든 유전자전환 효모내에 다량으로 혼입되었음을 입증한다. pY2PSE1으로 형질전환된 모든 4개의 유전자전환 효모 클론은 가스 크로마토그램에서 다른 피크를 나타내었으며, 이는 보유 시간의 비교에 의해 20:3 △8,11,14으로 확인되었다. 가스 크로마토그래피/매스 스펙트로스코피는 이러한 실제를 확인할 수 있는 추가의 증거를 제공할 수 있다. 연장된 γ-18:3의 비율은 표 1에 나타낸 바와 같이 23.7 내지 40.5%이었다. 또한, 팔미트산 (16:0), 팔미톨레산 (16:1), 스테아르산 (18:0) 또는 올레산 (18:1 △9)에 대하여는 유의한 연장이 관찰되지 않았다.
확인된 생성물은 PpPSE1의 뉴클레오티드 서열이 이끼 피스코미트렐라 파텐스로부터 △6-선택적인 지방산 연장효소를 코딩하며, 이는 유전자전환 효모에서 신규 지방산의 형성을 초래함을 입증한다.
부가 및 수용된 지방산 기질의 비율을 상기와 같이 측정할 수 있으며, 연장효소 반응의 양과 질을 조사할 수 있다.
DMOX 유도체의 구조 및 질량 스펙트럼은 또한 이중 결합의 각 위치를 나타낸다.
광범위한 다른 지방산 (예를 들어, 아라키돈산 및 에이코사펜타에노 등)을 사용한 추가의 공급 실험을 수행하여 이러한 연장효소의 기질 선택성을 보다 상세히 확인할 수 있다.
실시예 18: 형질전환된 생물로부터 목적하는 생성물의 일반적인 단리
목적하는 생성물은 식물체 또는 진균, 조류, 섬모류, 동물 세포로부터 또는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 상기 설명된 배양물의 상등액으로부터 얻을 수 있다. 목적하는 생성물이 세포로부터 분비되지 않을 경우, 느린 원심분리에 의해 배양물로부터 세포를 수획할 수 있고, 기계적 힘 또는 초음파처리 등의 표준 기술에 의해 세포를 용해시킬 수 있다. 식물 기관은 기계적인 방법에 의해 다른 조직 또는 다른 기관으로부터 분리시킬 수 있다. 균일화한 다음, 세포 찌꺼기를 원심분리에 의해 제거하고, 목적하는 화합물을 추가로 분리하기 위해 가용성 단백질을 함유하는 상등액 분획을 보유하였다. 생성물이 목적 세포로부터 분비되는 경우, 느린 원심분리에 의해 배양물로부터 세포를 제거하고, 추가의 단리를 위해 상등액 분획을 보유하였다.
각 단리 단계로부터의 상등액 분획을 적합한 수지를 사용하여 크로마토그래피 처리하였는데, 목적하는 분자는 크로마토그래피 수지상에 보유되지만 시료중의 많은 오염물질은 그렇지 않거나, 또는 오염물질은 수지상에 보유되지만 시료는 그렇지 않았다. 원한다면 동일하거나 또는 다른 크로마토그래피 수지를 사용하여 이러한 크로마토그래피 단계를 반복할 수 있다. 당업자라면 특정 분자를 단리하기 위해 적합한 크로마토그래피 수지를 선택하는 것과 이들을 가장 효과적으로 사용하는 것을 잘 알 것이다. 단리된 생성물을 여과 또는 한외여과에 의해 농축시키고 가장 높은 안정성을 갖는 생성물의 온도에서 보관하였다.
다양한 종류의 단리 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 상기 단리 방법에만 국한되지 않는다. 이러한 단리 방법은 예를 들어 문헌 (Bailey, J.E., & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986))에 기재되어 있다.
단리된 화합물의 존재 및 순도는 당업계의 표준 기술에 의해 결정할 수 있다. 이들로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 스펙트로스코피 방법, 염색법, 박막 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석 또는 미생물학적 방법이 포함된다. 이러한 분석 방법의 검토를 위해서는, 문헌 (Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17)을 참조한다.
균등물
당업자라면 간단한 통상의 실험만으로도 본원에 기재된 본 발명에 따른 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (28)

  1. 식물 또는 조류 (algae)로부터 유래하며, 지방산내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  2. a) 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7에 나타낸 핵산 서열,
    b) 유전자 코드의 다의성에 따라 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7에 나타낸 서열로부터 유도되는 핵산 서열, 및
    c) 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하며 폴리펩티드의 효소 작용이 실질적으로 감소되지 않으면서 이와 아미노산수준에서 50% 이상의 상동성을 갖는, 서열 1, 서열 3, 서열 5 또는 서열 7에 나타낸 서열의 유도체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 연장하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 식물, 조류 또는 진균으로부터 유래하는 단리된 핵산.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 피스코미트렐라 (Physcomitrella), 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium) 또는 크립테코디니움 (Crypthecodinium)으로부터 유래하는 단리된 핵산.
  5. 하나 이상의 조절 신호에 기능적으로 연결된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 유전자 구조물.
  6. 제5항에 있어서, 유전자 발현이 조절 신호에 의해 증가되는 것인 유전자 구조물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산 서열 또는 제5항 또는 제6항의 유전자 구조물, 및 지방산 생합성 유전자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 핵산을 포함하는 유전자 구조물.
  8. 제7항에 있어서, 지방산 생합성 유전자를 코딩하는 핵산이 △19-, △17-, △15-, △12-, △9-, △8-, △6-, △5- 및 △4-불포화효소 (desaturase), 여러 히드록실라제, △12-아세틸레나제, 아실-ACP 티오에스테라제, β-케토아실-ACP-신타제 및 β-케토아실-ACP 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전자 구조물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 서열 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 구조물에 의해 코딩되는 아미노산 서열.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 구조물을 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 구조물, 또는 제10항의 벡터 중 하나 이상을 포함하는 생물.
  12. 제11항에 있어서, 미생물, 동물 또는 식물인 생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 유전자전환 (transgenic) 식물인 생물.
  14. 제1항 내지 제4항의 핵산들 중 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산의 상보체 서열을 포함하는 안티센스 핵산 분자.
  16. 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C16-, C18- 또는 C20-지방산을 탄소 원자 2개 이상 연장시키는 폴리펩티드를 코딩하는 제1항의 핵산, 제6항의 유전자 구조물 또는 제10항의 벡터를 포함하는 생물을, PUFA (다가불포화 지방산)가 생성되는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, PUFA의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법에 의해 제조되는 PUFA가 지방산 분자내에 2개 이상의 이중 결합을 갖는 C18-, C20- 또는 C22-지방산 분자인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, C18-, C20- 또는 C22-지방산 분자가 생물체로부터 오일, 지질 또는 유리 지방산 형태로 단리되는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물이 미생물, 동물 또는 식물인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생물이 유전자전환 식물인 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, C16-, C18- 또는 C20-지방산이 분자내에 이중 결합을 3개 갖는 지방산인 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 오일, 지질 또는 지방산, 또는 이들의 단편.
  23. PUFA를 포함하며 유전자전환 식물로부터 유래하는 오일, 지질 또는 지방산 조성물.
  24. 제23항에 있어서, PUFA가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 구조물, 제15항의 안티센스 핵산 분자 또는 제10항의 벡터를 포함하는 유전자전환 식물로부터 유래하는 것인 오일, 지질 또는 지방산 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 오일, 지질 또는 지방산 조성물의, 사료, 식료품, 화장제 또는 약제에 있어서의 용도.
  26. 제14항의 항체, 제15항의 안티센스 핵산 구조물, 제28항의 길항제 또는 아고니스트를 포함하는 조성물.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 구조물, 제15항의 안티센스 핵산 분자, 제14항의 항체, 제28항의 길항제 또는 아고니스트, 제26항의 조성물, 제9항의 아미노산 서열 및(또는) 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 오일, 지질 및(또는) 지방산, 또는 이들의 단편을 포함하는 키트.
  28. a) 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 후보 물질과 접촉시키는 단계;
    b) PSE (PUFA-특이적 연장효소) 활성을 시험하는 단계; 및
    c) 후보 물질의 부재하에 PSE 활성을 표준 활성과 비교하는 단계
    를 포함하고, 이 때 PSE 활성이 표준 활성보다 높은 경우 후보 물질이 아고니스트임을 알 수 있고 PSE 활성이 표준 활성보다 낮은 경우 후보 물질이 길항제임을 알 수 있는 것인, 연장효소의 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법.
KR1020027010216A 2000-02-09 2001-02-08 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법 KR20020073580A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2000105973 DE10005973A1 (de) 2000-02-09 2000-02-09 Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE10005973.2 2000-02-09
DE10023893.9 2000-05-17
DE10023893A DE10023893A1 (de) 2000-05-17 2000-05-17 Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE10063387.0 2000-12-19
DE10063387A DE10063387A1 (de) 2000-12-19 2000-12-19 Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungestättigter Fettsäuren
PCT/EP2001/001346 WO2001059128A2 (de) 2000-02-09 2001-02-08 Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020073580A true KR20020073580A (ko) 2002-09-27

Family

ID=27213647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027010216A KR20020073580A (ko) 2000-02-09 2001-02-08 신규 연장효소 유전자 및 다가불포화 지방산의 제조 방법

Country Status (22)

Country Link
US (2) US7544859B2 (ko)
EP (1) EP1254238B1 (ko)
JP (1) JP4547122B2 (ko)
KR (1) KR20020073580A (ko)
CN (1) CN1247784C (ko)
AR (1) AR030051A1 (ko)
AT (1) ATE443146T1 (ko)
AU (2) AU3924401A (ko)
BR (1) BR0108198A (ko)
CA (1) CA2399349C (ko)
CZ (1) CZ20022502A3 (ko)
DE (1) DE50115107D1 (ko)
DK (1) DK1254238T3 (ko)
EE (1) EE200200443A (ko)
ES (1) ES2331228T3 (ko)
HU (1) HUP0300081A3 (ko)
IL (2) IL150414A0 (ko)
MX (1) MXPA02007078A (ko)
NO (1) NO20023757L (ko)
PL (1) PL207026B1 (ko)
PT (1) PT1254238E (ko)
WO (1) WO2001059128A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100747151B1 (ko) * 2007-01-11 2007-08-13 대한민국 곰팡이 유래 델타-6 불포화효소 유전자

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6677145B2 (en) * 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
EP2302060B1 (en) * 2002-03-16 2012-07-25 The University of York Desaturases
DE10219203A1 (de) * 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
CA2517253C (en) * 2003-02-27 2018-07-03 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids
EP2365063B1 (de) * 2003-03-31 2015-10-14 University Of Bristol Neue pflanzliche Acyltransferase spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren
US8008545B2 (en) * 2003-04-15 2011-08-30 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
EP1654368A2 (en) * 2003-08-01 2006-05-10 BASF Plant Science GmbH Process for the production of fine chemicals
CA3037924A1 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
MY140210A (en) * 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
ES2375363T3 (es) 2004-02-27 2012-02-29 Basf Plant Science Gmbh Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos.
JP4567047B2 (ja) 2004-02-27 2010-10-20 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法
CA3056110C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Surinder Pal Singh Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
DE602005023308D1 (de) 2004-06-04 2010-10-14 Fluxome Sciences As Stoffwechseltechnisch hergestellte zellen zur produktion mehrfach ungesättigter fettsäuren
US7550286B2 (en) 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US8685679B2 (en) * 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
WO2006064036A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Agfa Graphics Nv Ink circulation system for inkjet printing
DE102004063326A1 (de) * 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
AU2006249983B2 (en) * 2005-05-23 2011-03-17 Arcadia Biosciences, Inc. Safflower with elevated gamma-linolenic acid
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
KR20080071190A (ko) 2005-11-23 2008-08-01 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 델타-９ 일롱가제, 및 다중불포화 지방산 생성에 있어서의이들의 용도
CA2634164A1 (en) * 2005-12-28 2007-07-05 Dsm Ip Assets B.V. Method for the prediction of consumer acceptance of food containing oils
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
BRPI0716075A2 (pt) 2006-08-29 2013-08-06 Commw Scient Ind Res Org sÍntese de Ácidos graxos
ES2531391T3 (es) 2006-10-06 2015-03-13 Basf Plant Science Gmbh Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos
US20080125487A1 (en) * 2006-11-17 2008-05-29 Tapas Das Elongase gene and uses thereof
US8916361B2 (en) 2006-11-17 2014-12-23 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
EP2121934A2 (en) 2007-02-12 2009-11-25 E. I. Du Pont de Nemours and Company Production of arachidonic acid in oilseed plants
US8765422B2 (en) 2007-07-13 2014-07-01 Dsm Nutritional Products Ag D4 desaturases and D5 elongases
WO2009016208A2 (de) * 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
EP2231864B1 (en) * 2007-12-11 2017-05-24 Synthetic Genomics, Inc. Secretion of fatty acids by photosynthetic microorganisms
US9090902B2 (en) 2008-08-26 2015-07-28 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
BR122021003836B1 (pt) 2008-11-18 2022-02-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que não ocorre de forma natural, vetor e método para produzir óleo contendo ácidos graxos insaturados
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
CN102597242B (zh) 2009-06-08 2016-03-02 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 新脂肪酸延伸组合物及其用途
CA2768082C (en) 2009-07-17 2020-07-21 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and uses thereof
EP3121283B1 (en) 2009-08-31 2018-05-02 BASF Plant Science Company GmbH Regulatory nucleic acid molecules for enhancing seed-specific gene expression in plants promoting enhanced polyunsaturated fatty acid synthesis
CN102725405B (zh) * 2009-09-24 2015-08-19 国立大学法人九州大学 原生藻菌的转化方法
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
WO2011064183A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
US11236351B2 (en) 2010-05-17 2022-02-01 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC PUFAs in plants
CA2804925A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases from thraustochytrium species and uses thereof in fatty acid production
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
EP3150702B1 (en) 2011-06-19 2021-05-19 DNA Genotek, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
HUE033766T2 (en) 2012-06-15 2018-01-29 Commw Scient Ind Res Org Preparation of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
AU2013298113A1 (en) 2012-08-03 2015-01-29 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
CN105051189B (zh) * 2013-01-16 2019-08-06 Reg生命科学有限责任公司 具有改善特性的酰基-acp还原酶
CN105518133A (zh) 2013-07-05 2016-04-20 巴斯夫植物科学有限公司 基因表达或活性增强性元件
CA3241340A1 (en) 2013-12-18 2015-06-25 Grains Research And Development Corporation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
SG10201807736SA (en) * 2014-03-07 2018-10-30 Dna Genotek Inc Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
CN107257630A (zh) 2014-11-14 2017-10-17 巴斯夫植物科学有限公司 包含pufa的植物脂质的修饰
CA3026040A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 National Research Council Of Canada Winter aconite fatty acid elongase and uses thereof in the production of fatty acids
JP6908111B2 (ja) * 2017-06-30 2021-07-21 日本電気株式会社 予測装置、予測方法、予測プログラム、及び、遺伝子推定装置
WO2020168277A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cargill, Incorporated Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
EP4240144A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 BASF Plant Science Company GmbH Harvest management
CN117042596A (zh) 2021-03-25 2023-11-10 巴斯夫植物科学有限公司 肥料管理

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
US5504200A (en) * 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) * 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
EP0264166B1 (en) 1986-04-09 1996-08-21 Genzyme Corporation Transgenic animals secreting desired proteins into milk
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
GB8714772D0 (en) * 1987-06-24 1987-07-29 Efamol Ltd Essential fatty acid compositions
US4827591A (en) 1987-08-07 1989-05-09 Delaware Capital Formation, Inc. Manually operated clip attachment apparatus with movable gate and die
EP0397687B1 (en) 1987-12-21 1994-05-11 The University Of Toledo Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
DE3843628A1 (de) 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Wundinduzierbare und kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
KR920701453A (ko) 1989-03-17 1992-08-11 미리엄 디. 멕코나헤이 유전자발현의 외부조절
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
JPH04506155A (ja) 1990-03-16 1992-10-29 カルジーン，インコーポレイティド 初期種子形成において優先的に発現される新規配列およびそれに関連する方法
US5187267A (en) * 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
US5679881A (en) 1991-11-20 1997-10-21 Calgene, Inc. Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
DK0637339T3 (da) 1992-04-13 2001-12-03 Syngenta Ltd DNA-konstruktioner og planter, hvori de er inkorporeret
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
ES2222462T3 (es) 1993-12-28 2005-02-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Gen que codifica acido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta.
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
SE9400673L (sv) 1994-02-28 1995-01-23 Svenska Rotor Maskiner Ab Skruvkompressor med axialbalanseringsorgan, som utnyttjar olika trycknivåer samt förfarande för drift av en sådan kompressor
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
CA2203754C (en) 1994-10-26 2010-01-12 Douglas W. James, Jr. Fae1 genes and their uses
RU2192466C2 (ru) 1995-08-10 2002-11-10 Ратгерс Юниверсити Кодируемая ядерной днк система транскрипции в пластидах высших растений
DE19626564A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Hoechst Ag Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln
JP3792309B2 (ja) * 1996-08-30 2006-07-05 サントリー株式会社 不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
JP2001504325A (ja) 1996-09-27 2001-04-03 マキシジェン，インコーポレイテッド 回帰的配列シャフリングおよび選択による遺伝子治療の最適化のための方法
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
PT1598422E (pt) 1997-04-11 2013-04-03 Abbott Lab Métodos e composições para síntese de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa em plantas
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6307128B1 (en) 1997-06-03 2001-10-23 Miami University Fatty acid elongases
ES2276475T5 (es) 1997-09-30 2014-07-11 The Regents Of The University Of California Producción de proteínas en semillas de plantas
CA2321644A1 (en) 1998-03-11 1999-09-16 Novartis Ag Novel plant plastid promoter sequence
WO1999064616A2 (en) 1998-06-12 1999-12-16 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
US6403349B1 (en) * 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
WO2000023604A1 (de) 1998-10-21 2000-04-27 Celanese Ventures Gmbh Expressionsvektoren enthaltend regulative sequenzen aus stylonychia lemnae zur heterologen proteinexpression in eukaryontischen protisten und ein verfahren zur identifizierung solcher regulativen sequenzen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100747151B1 (ko) * 2007-01-11 2007-08-13 대한민국 곰팡이 유래 델타-6 불포화효소 유전자

Also Published As

Publication number Publication date
US7544859B2 (en) 2009-06-09
MXPA02007078A (es) 2003-03-27
AU3924401A (en) 2001-08-20
US20080160054A1 (en) 2008-07-03
CA2399349A1 (en) 2001-08-16
CA2399349C (en) 2017-04-04
ES2331228T3 (es) 2009-12-28
EP1254238B1 (de) 2009-09-16
PL207026B1 (pl) 2010-10-29
AU2001239244B2 (en) 2006-06-08
CN1247784C (zh) 2006-03-29
AR030051A1 (es) 2003-08-13
US8933300B2 (en) 2015-01-13
PL362905A1 (en) 2004-11-02
IL150414A (en) 2011-03-31
DK1254238T3 (da) 2009-11-30
BR0108198A (pt) 2003-03-25
HUP0300081A2 (en) 2003-05-28
HUP0300081A3 (en) 2005-11-28
US20040111763A1 (en) 2004-06-10
ATE443146T1 (de) 2009-10-15
CN1398300A (zh) 2003-02-19
WO2001059128A3 (de) 2001-12-20
WO2001059128A2 (de) 2001-08-16
DE50115107D1 (de) 2009-10-29
PT1254238E (pt) 2009-11-20
JP2003523746A (ja) 2003-08-12
NO20023757D0 (no) 2002-08-08
IL150414A0 (en) 2002-12-01
CZ20022502A3 (cs) 2002-10-16
JP4547122B2 (ja) 2010-09-22
EE200200443A (et) 2003-12-15
EP1254238A2 (de) 2002-11-06
NO20023757L (no) 2002-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2399349C (en) Novel elongase gene and method for producing multiple-unsaturated fatty acids
CA2442010C (en) New elongase gene and production of.delta. 9-polyunsaturated fatty acids
JP4490039B2 (ja) 高度不飽和脂肪酸の生産方法、新規な生合成遺伝子、ならびに新規な植物発現構築物
CA2474163C (en) Novel elongase gene and method for producing polyunsaturated fatty acids
AU2002310891A1 (en) New elongase gene and production of delta9-polyunsaturated fatty acids
DE10102338A1 (de) Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
Napier et al. New Elongase Gene And Production Of Delta-9-polyunsaturated Fatty Acids (Patent EP 1373519 B1)
DE10063387A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungestättigter Fettsäuren
DE10205607A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE10023893A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren
DE10005973A1 (de) Neues Elongasegen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid