ES2276475T5 - Producción de proteínas en semillas de plantas - Google Patents

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Description

Producci�n de proteínas en semillas de plantas
Fundamento de la invención
Expresi�n de proteínas heter�logas en semillas de plantas
La expresión de proteínas heter�logas en semillas de plantas ofrece la posibilidad, por ejemplo, de producir grandes cantidades de polip�ptidos recolectados con facilidad, y de expresar proteínas que mejoran la calidad de sus granos.
Discusiones de estos conceptos pueden encontrarse en la patente de EE.UU. No. 5.714.474 (“Producción de enzimas en semillas y sus usos”).
Prote�nas de reserva horde�nas
Las proteínas de reserva de las semillas de la cebada representan, aproximadamente, 8 a 15% del peso seco de los granos maduros de la cebada. Las principales proteínas de reserva de las semillas de la cebada son prolaminas solubles en alcohol, denominadas horde�nas, clasificadas en dos grupos principales, B y C, y dos grupos menores, D y y (Shewry, 1993). Dependiendo de los niveles de nitrógeno, estos 4 grupos representan, aproximadamente, 35 a 55% de la proteína total de las semillas de la cebada. Las horde�nas B y C representan, aproximadamente, 70 a 80% y 10 a 20%, respectivamente, de la fracción total de horde�nas, con pequeñas cantidades de horde�nas D (2-4%) y y (sin determinar con precisión). Las horde�nas B, D y y son prolaminas ricas en azufre mientras que las horde�nas C son prolaminas pobres en azufre (Bright y Shewry, 1983). Las horde�nas son sintetizadas coordinadamente en el tejido del endospermo amil�ceo en desarrollo (Giese et al., 1983; S0rensen et al., 1989). Estas horde�nas son transportadas conjuntamente en la traducción al lumen del retículo endopl�smico rugoso, con escisión simultánea del p�ptido señal, y son depositadas finalmente en los cuerpos prote�nicos (Cameron-Mills, 1980; Cameron-Mills y von Wettsein, 1980; Cameron-Mills y Madrid, 1989).
An�lisis genéticos realizados ponen de manifiesto que todas las horde�nas est�n codificadas por genes estructurales sobre el cromosoma 5 (1H) de la cebada; los lugares Hor1, Hor2, Hor3 y Hor5 sobre el cromosoma 5 codifican los polip�ptidos de las horde�nas C, B, D y y, respectivamente (Jensen et al., 1980; Shewry et al., 1980; Blake et al., 1982; Shewry et al., 1983; Shewry y Parmar, 1987). Los genes para las horde�nas B, C y D han sido aislados y caracterizados ( (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; S0rensen et al., 1996). Las horde�nas B y C est�n codificadas por familias multig�nicas que comprenden 10 a 20 miembros mientras que la horde�na D est� codificada por un solo gen (Brandt et al, 1985; Rasmussen y Brandt, 1986; S0rensen et al., 1996). La regulaci�n y expresión de estos promotores de horde�nas han sido estudiadas mediante ensayos de expresión transitoria (Entwistle et al., 1991; M�ller y Knudsen, 1993; S0rensen et al., 1996) en el endospermo de la cebada. Como ha sido determinado por estos ensayos usando fusiones de promotor-uidA, el promotor de la horde�na D es 3 a 5 veces más activo que los promotores de las horde�nas B y C ensayados (S0rensen et al., 1996) El promotor de la horde�na B ha sido estudiado también usando la transformación estable del tabaco con las fusiones de promotor-cat (Marris et al., 1988).
A�n cuando los genes para las horde�nas B, C y D han sido aislados y caracterizados, su regulaci�n y su expresión solamente han sido estudiadas en ensayos de expresión transitoria en la cebada y en el tabaco transformado establemente (Brandt et al., 1985; Forde et al., 1985; Marris et al., 1988; S0rensen et al., 1996)
En la cebada, el trigo y el maíz, las principales proteínas de reserva del tipo prolamina, altamente insolubles, son sintetizadas sobre polisomas estrechamente vinculadas con el retículo endopl�smico (ER) (Véase Seeds: Physiology of Development and Germination, 2� ed. compiladores Bewley y Black, Plenum Press, Nueva York, 1994). Las proteínas nuevamente sintetizadas atraviesan la membrana del ER hacia el lumen, donde se agregan en partículas pequeñas, que finalmente forman agregados y cuerpos prote�nicos de mayor tamaño (que pueden observarse en micrograf�as electrónicas).
En el trigo, dos tipos diferentes de cuerpos prote�nicos se acumulan independientemente dentro del endospermo en desarrollo: cuerpos de baja densidad que se desarrollan más pronto y cuerpos de alta densidad que se desarrollan más tarde y que son derivados desde el ER. Las proteínas de alta densidad se forman cuando la agregación de proteínas en el interior del lumen produce esfuerzo sobre la membrana y ocasiona su rotura. La membrana puede reconstituirse sin el agregado de proteína al cabo de un intervalo en el que el propio cuerpo prote�nico no est� unido por una membrana. En otros cereales además del trigo y la cebada, tales como el mijo, el arroz, el maíz y el sorgo, los cuerpos prote�nicos permanecen como entidades diferenciadas unidas a la membrana, incluso en las semillas maduras.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una planta monocotiled�nea transg�nica que comprende un promotor específico de la maduración de las semillas, y enlazada de modo operable a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiled�neas capaz de elegir como diana un polip�ptido enlazado a un cuerpo prote�nico de reserva en semillas monocotiled�neas, y una secuencia de DNA que codifica una proteína heter�loga de reserva, no de las semillas, en donde la secuencia de DNA est� enlazada de modo operable a dicha secuencia señal de DNA, según se define en las reivindicaciones que se acompañan.
La invención proporciona también semillas transg�nicas de estas plantas transg�nicas, que son útiles como fuente del polip�ptido expresado, o que pueden mejorar la calidad del grano.
En realizaciones particulares de la invención, las plantas transg�nicas proporcionadas son plantas monocotiled�neas transformadas establemente, por ejemplo plantas de cereales, tales como la cebada o el trigo. En realizaciones particulares la invención proporciona plantas de cebada transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen: Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptone, Klages y Baronesse. La invención proporciona también plantas de trigo transformadas establemente a partir de genotipos que incluyen. Anza, Karl, Bobwhite y Yecora Rojo.
La invención proporciona también semillas de plantas transformadas establemente que expresan en su semilla el polip�ptido seleccionado. El polip�ptido puede ser empleado para mejorar la calidad del grano o puede ser extraído de la semilla en el momento de máxima expresión o estabilidad para ser utilizado para otros fines.
Descripci�n breve de los dibujos
La Fig.1A es un diagrama esquemático de una estrategia de cuatro cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La Fig. 1B es un diagrama esquemático de una estrategia de tres cebadores para obtener productos quiméricos usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La Fig. 1C es un mapa de una construcción que incluye (desde 5’ a 3’), el promotor de la horde�na B1, la secuencia señal de la horde�na B1, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3’ de nos.
Las Figs. 2A y B muestran alineaciones de construcciones que comprenden el promotor de la horde�na B1, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3’ de nos con (2A) o sin (2B) la secuencia señal de la horde�na B1.
La Fig. 3 muestra la secuencia de los ácidos nucleicos del promotor de la horde�na B1 y la secuencia señal de lo horde�na B1 de 57 pares de bases (subrayada).
La Fig. 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de la horde�na D y la secuencia señal de la horde�na D de 63 pares de bases (subrayada).
La Fig. 5 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada maduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la horde�na B1, el gen uidA, y la secuencia de terminación de 3’ de nos o bien con (+SS) o sin (-SS) la secuencia señal de la horde�na B1.
La Fig. 6 es un diagrama de barras que muestra la actividad de GUS en semillas de cebada inmaduras que expresan construcciones que comprenden el promotor de la horde�na B1, el gen uidA y la secuencia de terminación de 3’ de nos o bien con (+SS) o sin (-SS) la secuencia señal de la horde�na B1.
La Fig. 7 es una fotomicrograf�a electrónica en la que una inmunose�al es específica de cuerpos prote�nicos en el endosperma inmaduro que expresa GUS de una línea que ha sido transformada con la construcción de DNA de la horde�na B1-uidA que contiene la secuencia del p�ptido señal del extremo amino terminal de 19 amino�cidos.
Lista de secuencias
Las secuencias de los ácidos nucleicos y de los amino�cidos que se indican en la lista de secuencias que se acompaña, se muestran usando las abreviaturas literales estándar para las bases de los nucleótidos, y el código de tres letras para los amino�cidos. Solamente se expone una de las cadenas de cada secuencia de ácidos nucleicos, pero ha de entenderse que la cadena complementaria est� incluida mediante cualquier referencia a la cadena expuesta.
La Seq. I.D. N� 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor y de la secuencia señal de la horde�na B1 de la cebada.
La Seq I.D. No. 2 muestra la secuencia de amino�cidos de la secuencia señal de la horde�na B1 de la cebada.
La Seq. I.D. No. 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor y de la secuencia señal de la horde�na D de la cebada.
La Seq. I.D. No. 4 muestra la secuencia de amino�cidos de la secuencia señal de la horde�na D de la cebada.
Las Seq. I.D. Nos. 5-16 muestran cebadores de PCR usados para amplificar las moléculas de ácidos nucleicos, según se describe en esta memoria.
Descripci�n detallada de la invención
i.
Abreviaturas y definiciones
A.
Abreviaturas
HMW: peso molecular alto
5 CAT: cloranfenicol acetil transferasa
GUS: 1-glucuronidasa
uidA: gen de 1-glucuronidasa
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PEG: polietilenglicol
10 Medio MS: medio de Murashige y Skoog
CIM: medio de inducción de callo
IIM: medio de incubaci�n intermedia
RM: medio de regeneración
2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiac�tico
15 BAP: 6-bencilaminopurina
2iP: N6-(2-isopentil)adenina
GFP: proteína fluorescente verde
CaMV: virus del mosaico de la coliflor
rbcS: subunidad pequeña de RUBISCO (D-ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa)
20 B. Definiciones
A menos que se indique de otro modo, los términos y expresiones técnicos se emplean según el uso convencional. Definiciones de términos y expresiones comunes en biología molecular pueden encontrarse en Genes V de Lewin publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9): Kendrew et al. (compiladores), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A Meyers
25 (compilador), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Con objeto de facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones de términos y expresiones:
Promotor: Una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de una proteína. Esta definición incluye no
30 solo moléculas que poseen las secuencias protot�picas, sino también promotores procedentes de homólogos g�nicos. También est�n incluidas moléculas que difieren de las moléculas protot�picas descritas en variaciones menores. Tales secuencias variantes pueden ser producidas por manipulación de la secuencia de nucleótidos de un promotor utilizando procedimientos estándar.
Promotor de horde�nas: Una secuencia de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de una proteína de horde�na en
35 las semillas de una planta. Los ejemplos específicos suministrados describen el uso de las secuencias de promotores procedentes de los genes de las horde�nas B1 y D de la cebada. Las secuencias de ácidos nucleicos de los genes de las horde�nas B1 y D de la cebada, protot�picos, se indican en las Seq.I.D. Nos. 1 y 3, respectivamente, as� como en las Figs. 3 y 5, respectivamente. La región del promotor excluye aquellos nucleótidos que codifican la secuencia señal (las secuencias subrayadas que se indican en las Figs. 3 y 4). Los expertos en la técnica podrán apreciar que la
40 longitud de la región del promotor puede ser también mayor o menor que la secuencia representada. Por ejemplo, una secuencia de 5’ adicional desde la región aguas arriba del gen de horde�na puede añadirse a la secuencia del promotor, o pueden separarse bases desde las secuencias representadas. Sin embargo, cualquier secuencia del promotor de horde�nas debe ser capaz de dirigir la transcripción de una secuencia ligada operablemente en semilla de planta. La capacidad de un promotor de horde�na de la cebada para dirigir la transcripción de una proteína en una
45 semilla de una planta puede verificarse fácilmente ligando de modo operable la secuencia del promotor a un marco de lectura abierto (ORF) (que codifica, preferiblemente, una proteína fácilmente detectable) tal como el marco de lectura abierto de GUS, introduciendo la construcción que resulta en una planta y verificando luego la expresión de la proteína en las semillas de la plante, según se describe en detalle más adelante. El promotor de horde�na conferir� expresión específica de maduración de semilla, lo que significa que la expresión de la proteína codificada por el ORF ligado de modo operable ser�, por lo general, por lo menos el doble (determinada en base a la actividad) en semillas de plantas transfectadas establemente , en comparación con la producida en otros tejidos tales como hojas. Más habitualmente, el promotor de horde�na producir� en semillas una expresión que es, por lo menos, 5 veces mayor que la expresión en otros tejidos de la planta. La expresión de la proteína en las semillas ser� específica de maduración de semilla.
Secuencia señal de horde�na (SS): Los inventores han descubierto que la inclusión de una secuencia señal de horde�na B1 o D en conjunción con un promotor de horde�na proporciona una expresión mejorada en las semillas, de ciertas proteínas heter�logas. En particular, la expresión de una proteína en semillas inmaduras mejora grandemente cuando el ORF que codifica la proteína es ligado de modo operable a un promotor de horde�na y a una secuencia señal de horde�na, a ambos, en comparación con una construcción equivalente en la que la secuencia señal de horde�na est� ausente.
La secuencia señal de horde�na comprende, típicamente, aproximadamente los primeros 15-25 amino�cidos del marco de lectura abierto del gen de horde�na, más habitualmente aproximadamente 18-21 amino�cidos. Las secuencias de nucleótidos y de amino�cidos de las secuencias señal de horde�na de los genes protot�picos de las horde�nas B1 y D de la cebada, se indican en las Seq. I.D. 1-4. Los expertos en la técnica podrán apreciar que si bien estas secuencias señal particulares se utilizan en los ejemplos que se describen más adelante, la invención no se limita a estas secuencias protot�picas específicas.
Identidad de secuencias: La semejanza entre dos secuencias de ácidos nucleicos, o dos secuencias de amino�cidos, se expresa en términos de la semejanza entre las secuencias, a lo que se hace referencia de otro modo como identidad de secuencias. La identidad de secuencias se mide en términos de tanto por ciento de identidad (0 semejanza u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias.
En la técnica son bien conocidos métodos de alineación de secuencias para efectuar las comparaciones. Diversos programas y algoritmos de alineación han sido descritos por Smith y Waterman (1981); Needleman y Wunsch (1970); Pearson y Lipman (1988); Higgins y Sharp (1988); Higgins y Sharp (1989); Corpet et al., (1988); Huang et al., (1992); y Pearson et al., (1994). Alschul et al., (1994) presentan una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homologías.
El Instrumento Básico de Investigación de Alineaciones Locales del NCBI (NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)) (Altschul et al., 1990) puede obtenerse de varias procedencias, incluyendo el Centro Nacional de Información de Biotecnolog�a (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para usar en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblasx. Puede accederse a ellos en htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Una descripción de como determinar la identidad de secuencias usando este programa se encuentra disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
Oligonucle�tido: Una secuencia lineal de polinucle�tidos de una longitud de hasta aproximadamente 100 bases de nucleótidos.
Vector: Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula huésped, con lo que produce una célula huésped transformada, Un vector puede incluir secuencias de ácidos nucleicos que le permitan replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicaci�n. Un vector puede incluir también uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.
Transformada: Una célula transformada es una célula en la se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular. Tal como se emplea en esta memoria, el término “transformación” engloba todas las técnicas mediante las que una molécula de ácido nucleico pudiera ser introducida en una célula tal, incluyendo transfecci�n con vectores virales, transformación con vectores plasm�dicos e introducción de DNA simple por electroporaci�n, lipofecci�n y aceleración de partículas, e incluye transformantes tanto transitorios como estables.
Aislado: Un componente biológico “aislado” (tal como un ácido nucleico o una proteína o un org�nulo) que ha sido
sustancialmente separado o purificado partiendo de otros componentes biológicos de la célula del organismo en la que los componentes existen de modo natural, es decir, otros DNA y RNA, proteínas y org�nulos, cromos�micos y extracromos�micos Los ácidos nucleicos y las proteínas que han sido “aislados” incluyen ácidos nucleicos y proteínas que se han purificado mediante métodos estándar de purificación. El término incluye también ácidos nucleicos y proteínas que se han preparado mediante expresión recombinante en una célula huésped as� como también ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
Ligada de modo operable: Una primera secuencia de ácidos nucleicos est� ligada de modo operable con una segunda secuencia de ácidos nucleicos cuando la primera secuencia de ácidos nucleicos est� colocada en relación funcional con la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor est� ligado de modo operable con una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de DNA ligadas de modo operable est�n contiguas y cuando es necesario unir dos regiones que codifican proteínas, est�n situadas en el mismo marco de lectura.
Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es uno que tiene una secuencia que no ocurre de modo natural o posee una secuencia que ha sido obtenida mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia por otra parte, separados. Esta combinación artificial se consigue frecuentemente mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos de ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.
cDNA (DNA complementario): Un fragmento de DNA que carece de segmentos no codificantes, internos (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El cDNA es sintetizado en el laboratorio mediante transcripción inversa a partir de RNA mensajero extraído de células.
ORF (marco de lectura abierto): Una serie de tripletes de nucleótidos (codones) que codifican amino�cidos sin codones de terminación. Estas secuencias habitualmente son traducibles en un p�ptido.
Planta transg�nica: Tal como se usa en esta memoria, esta expresión se refiere a una planta que contiene material genético recombinante que no se encuentra normalmente en plantas de este tipo y que ha sido introducido en la planta en cuestión (o en progenitores de la planta) mediante manipulación humana. As� pues, una planta que se cultiva partiendo de una célula vegetal en la que se ha introducido por transformación DNA recombinante, es una planta transg�nica, como lo son todos los vástagos de esa planta que contienen el transgeno introducido (tanto si se ha sido producido sexual como asexualmente).
La expresión “planta transg�nica” incluye, asimismo, partes de plantas, incluyendo el fruto, las semillas y el polen.
La presente invención es aplicable a plantas monocotiled�neas incluyendo, pero no limitado a ellas, monocotiled�neas gramíneas tales como el trigo (Triticum spp), el arroz (Oriza spp.), la cebada (Hordeum spp.), la avena (Avena spp), el centeno (Secale spp.), el maíz (Zea mays), el sorgo y el mijo (Pennisettum spp.). Por ejemplo, la presente invención puede ser empleada con genotipos de cebada incluyendo, aunque no limitado a ellos, Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages y Baronesse , y con genotipos del trigo incluyendo, aunque no limitado a ellos, Yecora Rojo, Bobwhite, Karl y Anza. En general, la invención es particularmente útil en cereales.
Maduraci�n de las semillas: Maduración de las semillas o desarrollo de los granos se refiere al período que se inicia con la fertilización en la que reservas alimenticias metabolizables (por ejemplo, proteínas, lípidos, almidón, etc.) son depositadas en la semilla en crecimiento, en particular en órganos de almacenamiento de la semilla, incluyendo el endospermo, la testa, la capa de aleurona, el embrión y el epitelio escuteliforme, dando como resultado el agrandamiento y llenado de la semilla, y que finaliza con la desecaci�n de la semilla.
Inducible: Se caracteriza por un promotor que est� regulado por la presencia o ausencia de una molécula pequeña; el término incluye tanto inducción directa como indirecta.
Promotor específico de la maduración de las semillas: Un promotor inducido durante la maduración de las semillas, por ejemplo, aumentado en 25% o más durante la maduración de la semillas.
Secuencia señal/conductora/diana/de transporte: Una secuencia de polip�ptidos del extremo amino terminal o del extremo carboxilo terminal que es eficaz para situar al mismo tiempo que la traducción o después de la traducción, el polip�ptido o la proteína a la que est� unida a otro cuerpo de almacenamiento de proteínas. Un ejemplo en la cebada es la secuencia señal de horde�na B1 o D.
Secuencia de procesamiento terminal o de terminación: Una secuencia de DNA situada en 3’ respecto a la región
codificante que hace que la RNA polimerasa termine la transcripción de un gen, y se disocie desde el DNA. Un ejemplo es la secuencia de terminación de 3' de nos. Una secuencia de terminación puede ocurrir también durante el procesamiento posterior a la transcripción de mRNA in vivo, como indicación de que una molécula de mRNA precursora debe ser escindida proporcionando una especie madura de mRNA que ser� traducida. Un segmento que contiene una señal de procesamiento terminal puede ser obtenida comparando cDNA que codifica un producto expresado en el endospermo que codifica el mismo producto, identificando con ello el término 3’ del cDNA. Mediante el aislamiento de un segmento de DNA gen�mico que comprende 50 a 100 pares de bases sobre cualquiera de los
dos lados del término 3’, se asegura la obtención de un segmento con la señal de procesamiento terminal
Cuerpo prote�nico: Estructura intracelular que contiene proteínas dentro de una estructura membranosa unitaria. En algunos casos se alude a esta estructura como una vacuola.
Prote�na de reserva de semillas: una proteína vegetal end�gena que es sintetizada y que se acumula durante la maduración de la semilla, se almacena en el grano seco y se moviliza durante la maduración. Tales proteínas se almacenan frecuentemente en el cuerpo prote�nico de una semilla de una planta. Ejemplos de tales proteínas de reserva incluyen araquina, avenina, cocosina, conarquina, concocosina, conglutina, conglicinina, convicina, crambina, cruciferina, cucurbitina, edestina, excelesina, gliadina, gluten, glitenina, glicinina, heliantina, horde�na, kafirina, leg�mina, napina, orizina, penisetina, faseolina, psofocarpina, secalina, vicilina, vicina y ze�na.
II.
Expresi�n de proteínas específica de las semillas usando construcciones de promotor de horde�na/secuencia señal de horde�na.
a.
Construcciones
Presentamos construcciones recombinantes que son adecuadas para obtener expresión de alto nivel de un polip�ptido especificado, en semillas de plantas. Las construcciones pueden representarse, en general, como Ph-hSS-X , en cuya representación Ph es un promotor de horde�na, hSS es una secuencia señal de horde�na de cebada B1 o D y X es una molécula de ácido nucleico que codifica el polip�ptido especificado. Cada uno de estos tres
componentes est� ligado de modo operable al próximo, es decir, el promotor de horde�na est� ligado el extremo 5’ de
la secuencia que codifica la secuencia señal de horde�na, y la secuencia señal de horde�na est� ligada de modo
operable a la secuencia X. La construcción contiene también, habitualmente, secuencias reguladoras de 3’, tales como la región de 3’, de Nos.
Las características de promotores de horde�nas y secuencias señal se han descrito anteriormente. Los genes de horde�nas B1 y D han sido descritos por Brandt et al., (1985) y S0rensen et al., (1996). Cuando el promotor es Ph, el polip�ptido “X” puede ser cualquier polip�ptido heter�logo de reserva no de semilla. Los polip�ptidos X que pueden ser expresados en semillas de plantas según se describe en esta memoria, como parte de una construcción, P-SS-X
o Ph-SS-X, incluyen proteínas tales como proteínas terapéuticas humanas (por ejemplo, eritropoyetina, activador del plasmin�geno tisular, uroquinasa y prouroquinasa, hormonas del crecimiento, citoquinas, factor VIII, epoyetina-a, factor estimulante de las colonias de granulocitos, anticuerpos, vacunas, etc.), o proteínas más específicas de plantas tales como enzimas para la biosíntesis del almidón (por ejemplo, ADP glucosapirofosforilasa. EC 2.7.7.27; almidón sintasa, EC 2.4.1.21; y enzima de ramificación, R,Q) y proteínas específicas de las semillas tales como las que confieren valor nutritivo mejorado a las semillas. ácidos nucleicos que codifican tales proteínas son bien conocidos en la técnica. La región codificante para una proteína tal puede ser modificada de tal modo que se ajuste más estrechamente al uso del cod�n preferido predispuesto para una célula huésped particular.
Otras proteínas heter�logas de reserva no de semilla codificadas por el gen quimérico incluyen polip�ptidos que forman ep�topos inmunol�gicamente activos y enzimas que catalizan la conversión de metabolitos intracelulares, con la consiguiente acumulación de metabolitos seleccionados en las células.
La casete de expresión o genes quiméricos en el vector transformante poseen típicamente una región de terminación de la transcripción en el extremo opuesto desde la región reguladora de la iniciación de la transcripción. La región de terminación de la transcripción puede estar asociada, normalmente, con la región de iniciación de la transcripción procedente de un gen diferente. La región de terminación de la transcripción puede seleccionarse, en particular para la estabilidad del mRNA, para mejorar la expresión. Regiones de terminación de la transcripción ilustrativas incluyen la secuencia de terminación de NOS procedente del pl�smido Ti de Agrobacterium y la secuencia de terminación de la a-amilasa del arroz.
Colas de poliadenilaci�n se añaden comúnmente también a la casete de expresión para optimizar altos niveles de transcripción y la apropiada terminación de la transcripción, respectivamente.
M�todos estándar de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, pueden ser empleados para producir estas construcciones.
b. Principios generales de transformación de plantas
La introducción en plantas de la construcción Ph – HSS – X se consigue, típicamente, utilizando técnicas estándar. El enfoque básico consiste en clonar la construcción en un vector de transformación que se introduce después en células de la planta mediante una cualquiera de varias técnicas (por ejemplo, electroporaci�n) y se seleccionan las plantas de la progenie que contienen la construcción introducida. Preferiblemente, la totalidad o parte del vector de transformación se integra de modo estable en el genoma de la célula de la planta. A la parte del vector de transformación que se integra en la célula vegetal y que contiene la secuencia Ph-hSS-X introducida (el “transgeno” intoducido) puede hacerse referencia como la casete de expresión recombinante.
La selección de plantas de la progenie que contienen el transgeno introducido puede llevarse a cabo basándose en la detección de la expresión de la proteína X o de semillas, o determinando la resistencia mejorada a un agente químico (tal como un antibiótico) como resultado de la inclusión de un gen marcador seleccionable dominante incorporado en el vector de transformación.
Las bibliografías técnicas y científicas est�n repletas de ejemplos de la modificación de características de plantas llevada a cabo con éxito, por transformación con secuencias de ácidos nucleicos clonados. Ejemplos seleccionados que sirven para ilustrar el conocimiento de este campo de la tecnología, incluyen:
Patente de EE.UU. No. 5.571.706 (“Plant Virus Resistance Gene and Methods”)
Patente de EE.UU. No. 5.677.175 (“Plant Pathogen Induced Proteins”) Patente de EE.UU. No. 5.510.471 (“Chimeric Gene for the Transformation of Plants”)
Patente de EE.UU. No. 5.750.386 (“Pathogen-Reistant Transgenic Plants”)
Patente de EE.UU. No. 5.597.945 (“Plants Genetically Enhanced for Disease Resistance”)
Patente de EE.UU. No. 5.589.615 (“Process for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional Value 5 Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins”)
Patente de EE.UU. No. 5.750.871 (“Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species”)
Patente de EE.UU. No. 5.268.526 (“Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants”)
Patente de EE.UU. No. 5.780.708 (“Fertile Transgenic Corn Plants”)
Patente de EE.UU. No. 5.538.880 (“Method For Preparing Fertile Transgenic Corn Plants”)
10 Patente de EE.UU. No. 5.773.269 (“Fertile Transgenic Oat Plants”)
Patente de EE-UU. No. 5.736.369 (“Method For Producing Transgenic Cereal Plants”)
Patente de EE.UU. No. 5.610.042 (“Methods For Stable Transformation of Wheat”).
Estos ejemplos incluyen descripciones de selección de vectores de transformación, de técnicas de transformación y de la preparación de construcciones destinadas a expresar un transgeno introducido. A la luz de lo anteriormente
15 expuesto y de la provisión en esta memoria de construcciones Ph-hSS-X, resulta evidente que los expertos en la técnica ser�n capaces de introducir estas construcciones en plantas con objeto de producir plantas que expresan en sus semillas la proteína (X) deseada.
c. Tipos de plantas
Las construcciones Ph-hSS-X pueden ser expresadas convenientemente en una amplia variedad de plantas
20 monocotiled�neas obteniendo una expresión de polip�ptidos seleccionados, específica de las semillas, Se supone que la invención es particularmente aplicable a plantas monocotiled�neas de cereales que incluyen cebada, trigo, arroz, centeno, maíz, mijo, sorgo y forraje de avena y hierbas de césped. En particular, los métodos de transformación descritos en esta memoria permitirán que la invención sea usada con genotipos de la cebada que incluyen Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Golden Promise, Steptoe, Klages y Baronesse, y genotipos de
25 trigo, importantes desde el punto de vista comercial, que incluyen Yecora Rojo, Bobwhite, Karl y Anza.
d. Construcción de vectores
Varios vectores recombinantes, adecuados para la transfecci�n estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transg�nicas, han sido descritos con inclusión de los descritos por Pouwels et al., (1987), Weissbach y Weissbach (1989), y Gelvin et al., (1990). Típicamente, los vectores de transformación de plantas incluyen uno o más 30 ORFs bajo el control de la transcripción de secuencias reguladoras de 5’ y 3’ y un marcador seleccionable dominante. La selección de secuencias reguladoras de 5’ y 3’ adecuadas, para las construcciones de la presente invención, se ha discutido anteriormente. Genes de marcadores seleccionables dominantes que permiten la selección fácil de transformantes, incluyen lo que codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina y espectinomicina) y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo,
35 fosfinotricina acetiltransferasa).
e. Técnicas de transformación y regeneración
M�todos de transformación y regeneración de células de plantas tanto monocotiled�neas como dicotiled�neas son conocidos, y la técnica de transformación apropiada ser� determinada por el técnico. La elección del método variar� con el tipo de planta que ha de ser transformada; los expertos en la técnica podrán reconocer la adecuabilidad de 40 métodos particulares para tipos dados de plantas. Los métodos adecuados pueden incluir, aunque no se limita a ellos: electroporaci�n de protoplastos de plantas, transformación con mediación de liposomas; transformación con mediación de polietilenglicol (PEG), transformación usando virus; microinyecci�n de células vegetales; bombardeo de células vegetales con micro-proyectiles; infiltración en vacío; y transformación con mediación de Agrobacterium tumefaciens (AT). Procedimientos operatorios t�picos para transformar y regenerar plantas figuran descritos en los
45 documentos de patentes citados al comienzo de esta sección.
f. Selección de plantas transformadas
Despu�s de la transformación y regeneración de plantas con el vector de transformación, se seleccionan habitualmente las plantas transformadas usando un marcador seleccionable dominante incorporando en el vector de transformación. Típicamente, tal marcador comunica resistencia a antibióticos o a herbicidas a las pl�ntulas procedentes de las semillas de las plantas transformadas, y la selección de transformantes puede conseguirse exponiendo las pl�ntulas a concentraciones apropiadas del antibiótico.
Una vez seleccionadas las plantas transformadas y cultivadas hasta madurez para permitir el establecimiento de
semillas, las semillas pueden ser recolectadas y analizadas para determinar la expresión de polip�ptido “X”
expresado.
III. Uso de polip�ptidos expresados en las semillas.
Las células transformadas como se ha indicado anteriormente, se usan para regenerar plantas, y las semillas procedentes de las plantas se dejan madurar, típicamente en el campo, con la producción subsiguiente de proteína heter�loga en las semillas.
Los polip�ptidos expresados en las semillas utilizando los métodos descritos en esta memoria, pueden ser recolectados desde las semillas en cualquier punto una vez comenzada la expresión de la proteína. Es decir, no es necesario que las semillas hayan sufrido maduración antes de la recolección. Las proteínas expresadas pueden ser aisladas a partir de las semillas, si se desea, mediante métodos convencionales de purificación de proteínas. Por ejemplo, la semilla puede ser molida y después de ello sometida a extracción con un medio de extracción acuoso u orgánico, seguido de purificación de la proteína extra�a extraída. Alternativamente, dependiendo de la naturaleza de la proteína expresada y del uso a que se destina, las semillas pueden ser utilizadas directamente sin purificación de la proteína expresada.
Existen diferencias en los tipos de acumulación de diferentes polip�ptidos o diferentes fracciones dentro de la semilla. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de GUS con la línea transg�nica GPDhGN-6-9-6 alcanza el máximo en aproximadamente 20 días, mientras que la expresión de GUS en la línea GPBhGN-4-34-7-1-2 es mayor a los 1014 días que a los 20 días. Estos diferentes tipos de expresión pueden ser verificados y los p�ptidos pueden ser extraídos en el momento en que se espera la expresión máxima..
Cuando la proteína ha sido elegida como objetivo para una vacuola de reserva de proteína, la vacuola puede ser fraccionada primeramente a partir de un homogeneizado de células de semilla, y después fraccionado hasta obtener la proteína deseada en forma enriquecida o purificada.
IV. Sistemas de expresión alternativos
Los sistemas de expresión descritos en los ejemplos que figuran más adelante, est�n basados en el sistema de promotor/secuencia señal de horde�na de la cebada B1. Sin embargo, los expertos en la técnica podrán apreciar que la invención no se limita a este sistema particular.
Las construcciones que emplean tales secuencias pueden representarse como:
P-X � P-SS, en las que X es el polip�ptido que ha de ser expresado (que puede ser una proteína no vegetal o especifica no de semillas o una proteína de reserva no de planta, P es un promotor específico de la maduración de semillas, SS es una secuencia señal que elige como objetivo un polip�ptido ligado a un cuerpo prote�nico en el que se almacena la proteína.
El promotor P es un promotor específico de la maduración de semillas. Un promotor es específico de las semillas si su expresión en la semilla de una planta es por lo menos diez veces mayor que en las hojas o en la raíces de la planta, cuando el promotor es expresado del modo más activo durante la maduración de las semillas, y se considera específico del endospermo si su expresión en el endospermo es por lo menos cinco veces mayor que en otros tejidos de la semilla cuando el promotor es expresado del modo más activo durante el desarrollo de las semillas. Además de los promotores de horde�nas de la cebada, promotores procedentes de genes que codifican; una glutelina, orizina o prolamina del arroz; una gliadina o glutenina del trigo; ze�na o glutelina de maíz; glutelina de la avena; kafirina del sorgo; penisetina del mijo; o secalina del centeno.
Con objeto de aumentar los niveles de un polip�ptido expresado, la proteína se acumula en una posición subcelular en la que el polip�ptido est� protegido de prote�lisis (es decir, que la degradación proteol�tica del polip�ptido est� reducida un 10% por lo menos, más típicamente un 25% por lo menos y lo más t�pico, 50% por lo menos). Como resultado, el polip�ptido se expresa en forma de un polip�ptido de fusión que comprenda, en el mismo marco de lectura , la secuencia codificante para el polip�ptido, y la secuencia codificante para un p�ptido (a lo que se alude indistintamente como una secuencia (o p�ptido) señal, conductora, de transporte o diana) lo que ocasiona que la proteína de fusión sea dirigida conjuntamente con la traducción o después de la traducción hacia un cuerpo de
reserva de proteína en una semilla monocotiled�nea. El p�ptido señal est� situado, preferiblemente, en el extremo 5’ � 3’ de la proteína de fusión. Además de los p�ptidos señal de las horde�nas de la cebada B1 y D, la invención puede
utilizar un p�ptido señal de la glute�na del arroz.
El p�ptido señal puede ser escindido mediante enzimas celulares conjuntamente con la traducción o después de la traducción. Alternativamente, si el p�ptido señal no es escindido, el polip�ptido de fusión puede ser escindido después de la purificación del polip�ptido de fusión, si se desea. Para este fin, puede introducirse una secuencia de amino�cidos entre el p�ptido señal y la proteína heter�loga para facilitar la escisión enzim�tica o química para separar el p�ptido señal.
Los que ejemplos que figuran seguidamente sirven para ilustrar la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de construcciones Ph-hSS-X
Se emple� la reacción en cadena de la polimerasa para producir construcciones para introducir en plantas. Los métodos empleados fueron variantes de los descritos por Higuchi et al., (1990), Horton et al., (1990), Pont-Kingdon et al., (1994) y Lefebvre et al., (1995). Los métodos fueron empleados para producir una construcción Ph-hSS-X en la que Ph era el promotor de la horde�na B1 específico del endospermo de la cebada, hSS era la secuencia señal de la horde�na B1 de la cebada y X era el ORF de 1-glucuronidasa (uidA; gus) de Escherichia coli. La construcción incluía, además, la secuencia de terminación de 3’ de la nopalina sintasa (nos). Se usaron dos métodos de construcción de PCR : un método de cuatro cebadores ilustrado en la Fig. 1A y un método de tres cebadores ilustrado en la Fig. 1B.
Todas las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un termociclador (MJ Research Inc.) usando DNA polimerasa de Pfu recombinante (Stratagene) en un volumen de reacción de 100 !l. El tampón de reacción contenía Tris-HCl 20 mM (pH 8,2), KCl 10 mM, (NH4)2SO4 6 mM, MgCl2 2 mM, Triton-X-100 0,1%, BSA sin nucleasa, 10 !g/ml y 50 !M de cada desoxirribonucle�sido trifosfato. Las condiciones de la PCR fueron 25 ciclos de 94�C durante 1 min, 55�C durante 1 min y 72�C durante 2 min, con una etapa final de extensión a 72�C durante 7 min.
Las estrategias de la PCR recombinante se indican en la Figura 1. Los dos cebadores que se solapan fueron: 5’-GCGGCAACAAGTACATTGCATTACGTCCTGTAGAAACCCCA-3’ (cebador BC) (Seq. I.D. N� 5) y 5’-TGGGGTTTCTACAGGACGTAATGCAATCGTACTTGTTGCCGC-3’ (cebador cb) (Seq.I.D. No. 6);
La secuencia del cebador cb es el complemento inverso del cebador BC. Estos cebadores contienen parte de la secuencia codificante de uidA y parte de la secuencia codificante del p�ptido señal procedente del promotor de horde�na B1. Los dos cebadores externos eran: 5’-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG-3’ (cebador A) (Seq. I.D. No. 7) y 5’-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’ (cebador d) (Seq.I.D. No. 8) cada uno de ellos con un sitio único de enzima de restricción (subrayado), Hind III y EcoR I, respectivamente.
Los fragmentos Bhorss (promotor de la horde�na B1 que contiene la secuencia del p�ptido señal) y uidAnos (secuencia codificante de uidA más la secuencia de terminación de 3’ de nos) se obtuvieron usando las condiciones siguientes de PCR.
(1) Para Bhorss, 20 ng de molde (el clon gen�mico de horde�na B1 que contiene el pl�smido 2-4/Hind III, Brandt et al., 1985) y 40 pmol de los cebadores A y cb se mezclaron con 100 !l de tampón de PCR 1X (Stratagene), (II) Para uidAnos, 20 ng de molde (el pl�smido pDMC201.4 que contiene uidA y nos sin promotor (McElroy et al., 1995); el gen uidA fue derivado del pl�smido pGUSN358->S modificado mediante mutag�nesis dirigida al sitio para estudios de objetivo vacuolar (Farrell et al., 1990) y 40 pmol de los cebaddores BC y d fueron mezclados con 100 !l de tampón de PCR 1X. Después de añadir 2,5 unidades de DNA polimerasa de Pfu, las mezclas de reacción fueron cubiertas con 50 !l de aceite mineral.
En la estrategia de cuatro cebadores, los dos productos principales de la PCR en la primera reacción fueron 0,49 kb para el Bhorss y 2,07 kb para el uidAnos. Una parte alícuota de los dos primeros conjuntos de reacciones de PCR se diluyó 50 veces sin purificación en gel y 5 !l de productos diluidos fueron utilizados directamente como moldes para la segunda reacción de PCR. Cuarenta pmol de cebadores externos (cebadores A y b) y 2,5 unidades de DNA polimerasa de Pfu fueron añadidos a 100 !l de tampón de PCR 1X. Para la estrategia de tres cebadores, se produjo en la primera reacción un fragmento más corto de Bhorss de 0,49 kb y este primer producto de la PCR (denominado megacebador) se diluyó 50 veces. Para la segunda reacción de PCR, cinco !l del megacebador de Bhorss diluido (Bhorss), veinte ng de molde (pDMC201.4) y 40 pmol de cebadores externos (A y d) se mezclaron hasta un volumen final de 100 !l con tampón de PCR 1X.
El segundo conjunto de reacciones de PCR usando ambas estrategias modificadas de tres y cuatro cebadores produjo un fragmento de 2,56 kb que contenía los fragmentos de DNA Bhorss y uidAnos (Fig. 1C). Se obtuvo una cantidad más pequeña del producto quimérico usando la estrategia de 3 cebadores con relación a la estrategia de 4 cebadores. Se llev� a cabo una tercera reacción de PCR obteniendo cantidades suficientes del producto quimérico para el bombardeo con microproyectiles. El producto de la PCR procedente de la estrategia de 3 cebadores se diluyó 50 veces; 5 !l de este producto diluido se añadieron como molde a 40 pmol de los cebadores A/d en el seno de 100 !l de tampón de PCR 1X. Los productos quiméricos finales, amplificados en un volumen final de 2 X 100 !l (2 reacciones) procedentes de ambas estrategias de 3 cebadores y 4 cebadores, fueron purificados en un gel de agarosa al 0,7% usando el kit de extracción de gel QIAquick (Quiagen Inc.). Los fragmentos de DNA purificados fueron elu�dos en 50 !l de tampón TE 1X, analizados mediante digestión con enzimas de restricción y utilizados en experimentos de bombardeo con microproyectiles sin subclonaci�n posterior para el ensayo de estrategias de construcción de DNA.
Ejemplo 2: Ensayos transitorios en células de cebada
Antes del bombardeo con microproyectiles, espigas de cebada (variedad de primavera Golden Promise) que contenían embriones inmaduros (15-25 días después de la polinizaci�n) fueron esterilizadas con agente de blanqueo al 20% (v/v) (hipoclorito sádico al 5,25%) durante 10-15 minutos y enjuagadas brevemente 3 x 5 minutos con agua estéril
Se separ� as�pticamente, a mano, el endospermo de cada uno de los embriones y se colocaron “lado acanalado hacia abajo” sobre medio basal MS (Murashige y Skoog) (8) suplementado con maltosa, 30 mg/l, tiamina.HCl, 1,0 mg/l, mio-inositol, 0,25 mg/l, hidrolizado de caseína, 1,0 g/l y prolina, 0,69 mg/l, y se solidific� con Phytagel” (Sigma), 3,5 g/l. El bombardeo de DNA se llev� a cabo utilizando partículas de oro de 1 !m (Analytical Scientific, Inc.) recubiertas con 12,5 !l de los fragmentos de DNA elu�dos (aproximadamente 1-2 !g) empleando las modificaciones siguientes de un procedimiento operatorio publicado (Lemaux et al., 1996). Las partículas de oro y otros componentes necesarios para la precipitación fueron reducidos a mitad de volumen. El precipitado de DNA/microproyectil se resuspendi� en 36 !l de etanol absoluto; 15 !l de la suspensión se usaron por bombardeo en un dispositivo Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad) a 7584 kPa. El tejido del endospermo bombardeado fue incubado a 24�1�C en oscuridad durante 1 día y teñido para determinar la actividad de GUS (Jefferson et al., 1987). Los resultados (no indicados) mostraron expresión de GUS en el tejido del endospermo y son concordantes con el hecho de que la construcción de DNA quimérico producida mediante las reacciones de PCR antes descritas, est� dentro de lo previsto permitiendo con ello la obtención de un producto g�nico de uidA funcional. Después de la confirmación in vivo de la funcionalidad, el producto quimérico fue subclonado en un vector, confirmado posteriormente mediante secuenciaci�n del DNA y usado para la transformación estable de cebada con objeto de estudiar el objetivo en la proteína.
Ejemplo 3: Expresión estable de construcciones Ph-X en la cebada (para referencia)
Materiales y Métodos
Plantas
La variedad de primavera, de dos filas, de cebada, Golden Promise, fue cultivada en cámaras de cultivo según se ha descrito anteriormente (Wan y Lemaux 1994; Lemaux et al., 1996).
Acidos nucleicos
El pl�smido p16 (S0rensen et al, 1996) contiene la cadena principal de pUC18 con el gen de la 1-glucuronidasa (uidA;gus) controlado mediante 550 bp del promotor de la horde�na B1 específico del endospermo de la cebada y terminado por la señal de poliadenilaci�n de 3’ de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, nos. El pl�smido pD11-Hor3 (Sorensen et al, 1996) contiene uidA bajo el control de 434 bp del promotor de la horde�na D y la secuencia de terminación de nos. El pAHC20 (Christensen y Quail, 1996) contiene bar inducido por el promotor de ubiquitina del maíz, primer intr�n y terminado por el extremo 3’ nos. Ambas de estas construcciones incluyen promotores de horde�nas pero no incluyen una secuencia señal de horde�nas. Por tanto, son construcciones del tipo: Ph-X. El pAHC25 (Christensen y Quail, 1996) consiste en uidA y bar, cada uno de ellos bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz (Ubil) y primer intr�n y terminado en nos.
M�todos de transformación
Se obtuvieron líneas transg�nicas estables de cebada que contenían horde�na B1-uidA y horde�na D-uidA, siguiendo las modificaciones de un protocolo publicado (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Las modificaciones fueron requeridas para la transformación de genotipos comerciales de cebada, y el método descrito en esta memoria puede ser usado para transformar genotipos comerciales de monocotiled�neas incluyendo la cebada y el trigo que son recalcitrantes a la transformación usando los métodos publicados (por ejemplo los genotipos de cebada Harrington, Morex, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages y Baronesse y los genotipos del trigo Anza, Karl, Bobwhite y Yecora Rojo).
Plantas de cebada donantes de embriones inmaduros fueron cultivadas en el suelo, en condiciones reguladas, en cámaras de crecimiento según se ha descrito (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996). Embriones zig�ticos inmaduros fueron esterilizados en la superficie, colocados sobre medio DBC2 con el lado del escutelo hacia abajo, e incubados a 24 � 1�C. Los tejidos regenerativos fueron mantenidos durante 3-4 semanas y después cortados en trozos pequeños (aproximadamente de 3 a 5 mm), hechos pasar a medio DBC2 de nueva aportación, y cultivados en condiciones de luz débil. Después de un período adicional de tres semanas, los sectores encallecidos verdes fueron cortados en trozos pequeños (de 3 a 5 mm aproximadamente) y hechos pasar a medio DBC2 de nueva aportación. Los tejidos regenerativos verdes fueron mantenidos sobre el medio DBC2 con subcultivo a intervalos de 3-4 semanas.
Para el bombardeo, tejidos regenerativos verdes (de 3 a 5 mm aproximadamente, de 4 meses) fueron colocados en oscuridad a 24 � 1�C durante 1 día, y hechos pasar después a medio DBC2 que contenía manitol 0,2 M y sorbitol 0,2
M. Cuatro horas después del tratamiento con el osmoticum, los tejidos verdes fueron bombardeados según ha sido descrito por Lemaux et al.,(1996) con partículas de oro (Analytical Scientific Instruments, Alameda, CA) revestidas con pAHC25, una mezcla de pAHC20 y p16 (relación molar 1:2), o una mezcla de pAHC20 y pD11-Hor3 (relación molar 1:2). Al cabo de 16-18 horas después del bombardeo, los tejidos verdes fueron hechos pasar a medio DBC2 sin osmoticum y cultivados a 24 � 1�C bajo condiciones de luz débil (aproximadamente 10 !&, 16 h de luz).
Despu�s de un período inicial de cultivo de 3 a 4 semanas en medio no selectivo, cada fragmento de tejido verde fue dividido en 1 a 2 trozos (de 4 a 5 mm aproximadamente, dependiendo del tamaño del fragmento de tejido original) y hechos pasar a medio DBC2 suplementado con 5 mg/L de bialafos para efectuar la selección de bar. Se seleccionaron tejidos verdes sobre medio DBC2 y tejidos de 4 mm a 5 mm fueron subcultivados a intervalos de 3 a 4 semanas. Los callos resistentes al bialafos fueron regenerados sobre medio FHG (Hunter 1998) que contenía 1 mg/lLde 6-bencilaminopurina (BAP) y 3 mg/L de bialafos. Los retoños regenerados fueron transferidos a cajas Magenta que contenían medio de enraizamiento (medio de inducción de callo, sin fitohormonas) que contenía 3 mg/L de bialafos. Cuando los retoños alcanzaron la parte superior de la caja, las pl�ntulas fueron pasadas al suelo y cultivadas hasta madurez en el invernadero.
El medio DBC2 usado para la transformación est� basado en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con maltosa, 30 g/L, tiamina.HCl 1,0 mg/L, mio-.inositol 0,25 g/L, hidrolizado de caseína 1,0 g/L, prolina 0,69 g/L, y solidificado con 3,5 g/L de Phytagel (Sigma, St. Louis, MO). El medio se suplement� adicionalmente con 2,5 mg/L de la auxina vegetal ácido 2,4-diclorofenoxiac�tico (2,4-D), 0,1 mg/L de la citoquinina vegetal 6-bencilaminopurina (BAP) y cobre 5 !M (al estado de sulfato de cobre). Se encontr� que se requería la presencia de la elevada cantidad de cobre y la relación de auxina alta/citoquinina baja para la generación eficiente del material regenerativo verde procedente de los genotipos de la cebada y del trigo que, de otro modo, son recalcitrantes a la transformación. Sin embargo, la composición del medio DBC2 puede variarse dependiendo del genotipo particular que haya de ser transformado. Los ingredientes principales del medio est�n comprendidos dentro de los intervalos siguientes: una auxina en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/l hasta aproximadamente 5 mg/L, una citoquinina en una concentración de 0 mg/L hasta aproximadamente 5 mg/L y cobre en una concentración de aproximadamente 0,1 !M hasta aproximadamente 50 !M (y más típicamente aproximadamente 1 a 10 !M). Puede obtenerse una transformación más eficiente cuando se emplea maltosa en el medio como fuente de carbono en una concentración de hasta aproximadamente 60 g/L, más típicamente, aproximadamente 30 g/L (o bien en lugar de sacarosa o en mezcla con ésta).
La tinción histoqu�mica para determinación de GUS fue efectuada (Jefferson et al. 1987) usando ácido 5-bromo-4cloro-3-indoxil-1-D-glucur�nico (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO). Las muestras fueron incubadas durante la noche a 37�C en tampón de ensayo de GUS.
Las medidas cuantitativas de la actividad de GUS fueron llevadas a cabo por el método de Jefferson et al., (1987) usando como sustrato 4-metilumbeliferil-1-D-glucuronida (MUG) (Sigma, St. Louis, MO). Partiendo de líneas homozig�ticas se aisl� un único endospermo inmaduro 10-14, 20 y 30 días después de polinizaci�n o a partir de endospermo maduro, se congel� en nitrógeno líquido y se tritur� en el seno de tampón de extracción de GUS; cada tratamiento tuvo 4 replicados. Después de centrifugar se utilizaron los sobrenadantes para determinar la actividad de GUS. Se midió la fluorescencia de la 4-metilumbeliferona (4-MU) (Sigma, St. Louis, MO) en un minifluor�metro dedicado TKO 100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) en una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Las proteínas fueron extraídas como se ha descrito anteriormente (Jefferson, 1987); Jefferson et al., 1987) y se midieron las concentraciones de proteína de los extractos según Bradford (1976) usando reactivo de Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA).
Para determinar la sensibilidad a herbicidas de las plantas T0 y su progenie, se aplicó en forma de capa a una sección del limbo de la hoja en la fase de 4 a 5 hojas, usando una torunda de algodón, una solución al 0,25% (v/v) de solución de Basta™ (concentración de partida, 200 g/L de fofinotricina, Hoechst AG. Frankfurt, Alemania) más Tween 20 al 0,1%. Las plantas fueron calificadas 1 semana después de la aplicación del herbicida.
El DNA gen�mico total procedente de callos independientes o tejidos de hojas independientes, fue purificado según ha sido descrito por Dellaporta (1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA gen�mico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA gen�mico fueron amplificados mediante PCR usando el conjunto de cebadores, UIDA1 (5’-AGCGGCCGCATTACGTCCTGTAGAAACC-3’) (Seq. I.D. No. 9) y UID2R (5’-AGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTG-3’) (Seq. I.D. No. 10). La presencia de bar se ensay� usando el conjunto de cebadores, BAR5F (5’-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3’) (Seq. I.D. No. 11) y BAR1R (5’-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3’) (Seq. I.D. No. 12) (Lemaux et al., 1996). Las fueron realizadas con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 !l. Veinticinco !l del producto de la PCR con colorante de carga, fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% con bromuro de etidio, y se fotografi� usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores UIDA era consistente con un fragmento de uidA intacto; un fragmento interno de 0,34 kb fue obtenido con los cebadores BAR. Para realizar análisis de hibridación de DNA, 10 !g de DNA gen�mico total procedente de tejido de las hojas de cada línea fueron sometidos a digestión con EcoRI y BamHI, se separ� sobre un gel de agarosa al 1,0%, se transfirió a una membrana Zeta-Probe GT (Bio-Rad, Hercules, CA) y se hibrid� con una sonda radiomarcada, específica de uidA, siguiendo las indicaciones del fabricante. El fragmento XbaI de 1,8 kb conteniendo uidA fue purificado usando un kit de extracción de gel QIAEX (QIAGEN, Chatsworth, CA) y marcado con a-32P-dCTP usando cebadores aleatorios.
Resultados
Veintid�s líneas independientes de callo de cebada transformadas de modo estable, que contenían fusiones de promotor de horde�na B1-uidA � de horde�na D-uidA, se obtuvieron en una primera serie de transformaciones. Trece líneas eran regenerables, siete transformantes de horde�na B1-uidA y seis transformantes de horde�na D-uidA. Se aisl� DNA gen�mico desde el callo de transformantes regenerables. Se llev� a cabo análisis de PCR usando los cebadores UIDA y BAR. La amplificación por PCR dio por resultado un fragmento de uidA intacto de 1,8 kb y un fragmento de bar interno de 0,34 kb, en la progenie T1. Del tejido de las hojas deT0 de las 13 líneas ensayadas, sin embargo, uno (GPDhGN-22) no produjo un fragmento, amplificado por PCR, para uidA (Tabla 2). Después de hibridación Southern de DNA gen�mico procedente de tejido de las hojas de los 7 transformantes de horde�na B1uidA y los 6 transformantes de horde�na D-uidA, doce de las trece líneas transformadas produjeron los fragmentos de fusión esperados de horde�nas-uidA de 2,35 kb � 2,25 kb. La línea restante (GPDhGN-22) no produjo fragmento alguno de hibridación con uidA, aun cuando esta línea contenía las bandas de hibridación de bar de tamaño apropiado (los resultados no est�n indicados).
Diferentes tejidos procedentes de transformantes estables fueron ensayados para determinar la actividad histoqu�mica de GUS. Se apreci� una fuerte expresión de GUS en los tejidos de endospermo transformados con ambos promotores de horde�nas B1 y D, pero no en tejidos del embrión, el ovario, el estigma y la antera, ni en los tejidos de las hojas. Se observ� en todos los tejidos expresión de GUS bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz (Ubil) ; no se observ� expresión de GUS en el testigo sin transformar. Las raíces y retoños de germinación procedentes de las semillas de T1 de los transformantes de fusión de promotores de horde�nas B1 � D-uidA, tampoco tenían actividad histoqu�mica de GUS observable (resultados no indicados).
Las actividades relativas de las construcciones de horde�na B1- y D-uidA fueron determinadas mediante análisis fluorom�trico de GUS en extractos de semillas en crecimiento y maduras de líneas homozig�ticas (Tabla 1). Las actividades específicas de GUS inducidas por el GUS inducido por el promotor de B1 tenían niveles máximos de expresión a los 10 a 20 días después de la polinizaci�n. El promotor de la horde�na D mostr� un tipo de desarrollo con actividades específicas máximas a los 20 a 30 días despue�s de la polinizaci�n.
La actividad enzim�tica de la fosfinotricina acetiltransferasa (PAT, producto de bar) y GUS, en plantas T0 y su progenie, se ensay� aplicando a las hojas en forma de capa Basta, para PAT, y mediante ensayo histoqu�mico para GUS. El tejido de la hoja procedente de plantas T0 de las trece líneas independientes puso de manifiesto resistencia a Basta (Tabla 2). En la progenie T1 siete de las trece líneas ensayadas para uidA y bar mostraron un tipo de segregación 3:1 para la expresión de GUS (Tabla 2). De las seis líneas restantes, una línea (GPDhGN-6) tenía una relación de segregación de 43:2 para la expresión de GUS; otra línea (GPDhGN-22) expresaba PAT pero no contenía uidA, otra línea (GPBhGN-13) no contenía ni uidA ni bar, y tres líneas (GPBhGN-2, GPDhGN-12 y GPDhGN-14) eran estériles. El endospermo de T1 procedente de todas las líneas transg�nicas de T0 fértiles que tenían señales positivas de hibridación de DNA para uidA [fragmentos de 2,35 kb y 2,25 kb para los genes de horde�na B1-uidA y de horde�na D-uidA, respectivamente, puso de manifiesto fuerte actividad de GUS (Tabla 2) excepto GPBhGN-13 y GPDhGN-14. El gen bar había sido transmitido de modo estable a la progenie T1 de todas las líneas fértiles excepto la GPBhGN-13; se obtuvo una línea homozig�tica de expresión estable (GPDhGN-16) (Tabla 2). La expresión de uidA inducida por el promotor de la horde�na B1 o de la horde�na D había sido heredada también de modo estable en la progenie T2 de las 7 líneas independientes ensayadas (GPBhGN-4, -7, -12, -14 y GPDhGN-6, -11 y 16) (Tabla 1). La expresión del gen uidA estaba transmitida de modo estable en una línea ensayada en la generación T5 (GPBhGN-4), en las dos líneas ensayadas en T4 (GPBhGN-7 y GPDhGN-16), 3 líneas en T3 (GPBhGN-12, GPDhGN-6 y –11), 1 línea en T2 (GPBhGN-14) y 1 línea en T1 (GPBhGN-3) (Tabla 1). Se obtuvieron líneas transg�nicas homozog�ticas que expresaban uidA de modo estable, de los casos GPBhGN-4, -7. GPDhGN-6 y -16 (Tablas 1 y 2).
Tabla 2.- Actividades específicas de GUS en semillas de cebada transg�nica en desarrollo y maduras.
Actividad de GUS (pmol/min/mg de proteína
D�as después de la polinizaci�n
10-14 20 30 madura
L�nea transg�nica
GPBhGN-4-34-7-1-2
3514 � 1326 2309 � 454 1313 � 340 106 � 37
GPDhGN-6-9-6
402 � 363 3812 � 969 2806 � 949 281� 52
Testigo no transg�nico
80 + 31 81 � 23 26 � 13 43 � 9
La actividad de GUS se determin� por análisis fluorom�tricos de extractos de proteínas procedentes del endospermo en desarrollo y maduro de líneas homozig�ticas. Los valores de la actividad de GUS representan la media � la desviación típica de cuatro ensayos repetidos para cada uno de los tratamientos.
Las líneas GPBhGN-4-34-7-1-2 y GPDhGN-6-9-6 son líneas homozig�ticas transformadas con construcciones de horde�na-B1-uidA (p16) y horde�na D-uidA (pD11-Her3), respectivamente, que producen las semillas de T5 y T3, respectivamente.
Ejemplo 4: Comparación de la expresión en semillas de plantas de cebada transformadas de modo estable con las construcciones Ph-hss-X � Ph-X
Para determinar el efecto de la secuencia señal de horde�nas sobre los niveles de expresión de proteínas, plantas de
5 cebada fueron transformadas con construcciones en la que el promotor de la horde�na B1 estaba ligado operablemente al gen uidA o bien con la secuencia señal de la horde�na B1 (construcción pdBhssGN5-6) o bien sin la secuencia señal (construcción pdBhGN1-2) como ilustra la Fig. 2. Los detalles y los resultados de estos procedimientos de ensayo se describen más adelante.
Materiales y Métodos
10 Pl�smidos
Se prepararon dos construcciones de DNA que contenían el promotor de la horde�na B1 y la región de codificación de gus con o sin la secuencia del p�ptido señal, para ensayar la funcionalidad de las fusiones de promotor de la horde�na B1-gus y estudiar su objetivo:
(1) pdBhssGN5-6 (con secuencia señal, Fig. 2�): La construcción de DNA quimérico que contiene el promotor de
15 horde�na B1-secuencia señal-uidA-nos, producida usando los métodos de PCR descritos en el Ejemplo 1, fue sometida a digestión con HindIII y SnaB1, y el fragmento HindIII/SnaB1 fue ligado en el pl�smido pDMC201.4 digerido con HindIII/SnaB1 (McElroy et al., 1995) generando el pl�smido pdBhssGN5-6. El pl�smido pDMC201.4 contiene uidA y nos sin promotor; el gen uidA fue derivado del pl�smido pGUSN358->S modificado mediante mutag�nesis dirigida al sitio para estudios de elección de diana vacuolar (Farrell y Beachy, 1990). El fragmento
20 amplificado por PCR (promotor de horde�na B1 con su secuencia de p�ptido señal más la región de unión con el uidA
de 5’) del producto quimérico fue confirmado mediante secuenciaci�n del DNA.
(2) pdBhCN1-2 (sin secuencia señal, Fig. 2B): cebadores Bhor3 (5’-cgcatgcGTGCAGGTGTATGAGTCATT-3’) (Seq.I.D. No. 13) y Bhor2R (5’-ccctccagaAGTGGATTGGTGTTAACT-3’) (Seq.I.D. No. 14) conteniendo los sitios SphI y XbaI, cada uno de ellos con un sitio único de enzima de restricción (letras minúsculas), respectivamente, 25 fueron usados para la amplificación de la región 5’ de la horde�na B1 de 0,55 kb usando el pl�smido p16 que contenía el promotor de horde�na B1-uidA-nos (S0rensen et al., 1996) como molde. El fragmento amplificado por PCR de 0,55 kb fue sometido a digestión con SphI y XbaI y ligado en pUC19 sometido a digestión con SphI/XbaI generando el pBhor-1-Se prepar� el pBhGN-1 reemplazando el promotor CaMV35S en p35SGN-3 (que contenía promotor CaMV35S-uidA-nos) con el fragmento SphI/XbaI horde�na B1 procedente de pBhor-1. El fragmento HindIII/SnaBI
30 procedente de pBhGN-1 fue repuesto con el fragmento HindIII/SnaBI en pDMC201.4 generando pdBhGN1-2. As�, la región de flanqueo de horde�na B1 de 5’ de 120 bp estaba suprimida en el pdBhssGN5-6 y en el pdBhGN1-2.
Las dos construcciones de DNA quimérico resultantes fueron introducidas en tejidos del endospermo de la cebada inmaduros usando bombardeo con microproyectiles para realizar ensayos de expresión g�nica estable. Los métodos de determinación de transformación estable, tinción y cuantificación de GUS y sensibilidad a Basta, se realizaron
35 según se describe en el Ejemplo 3.
Aislamiento de DNA gen�mico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación de transferencia de DNA
El DNA gen�mico procedente de callos o tejidos de hojas, independientes, fue purificado según se ha descrito (Dellaporta, 1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA gen�mico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA gen�mico fueron amplificados mediante PCR usando el conjunto de cebadores UIDA1 y UID2R. El conjunto de cebadores , Bhor8 (5’-GAAGAGATGAAGCCTGGCTAC-3’) (Seq.I.D. No. 15) y GUS5516 (5’-CGATCCAGACTGAATGCCCACAGG-3’) (Seq. I.D. No.16) se us� para distinguir entre el promotor de horde�na B1 con y sin la secuencia señal. Es de esperar un producto híbrido de 229 bp procedente de la construcción que contienen el promotor de horde�na B1 con la secuencia señal, mientras que se espera un producto de PCR de 178 bp procedente de la construcción que contiene el promotor de horde�na B1 sin la secuencia señal. La presencia de bar fue ensayada usando el conjunto de cebadores, BAR5F y BAR1R (Lemaux et al., 1996). La amplificación se llev� a cabo con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 !l. Veinticinco !l del producto de PCR con colorante de carga fueron sometidos a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8%, con bromuro de etidio, y se fotografi� usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores de UIDA era consistente con la presencia de un fragmento de uidA intacto; se produjo un fragmento interno de 0,34 kb con los cebadores de BAR. Para los análisis de hibridación de DNA, 10 !g de DNA gen�mico total procedente del tejido de las hojas de cada una de las líneas, fue sometido a digestión con HindII y SacI, separados sobre un gel de agarosa al 1,0%, transferidos a membrana Zeta-Probe GT (Bio-Rad, Hercules, CA) e hibridados con una sonda radiomarcada específica de uidA, siguiendo las indicaciones del fabricante. El fragmento XbaI de 1,8 kb que contenía uidA, procedente de pB1221, fue purificado usando el kit de extracción de gel QIAEX (QIAGEN, Chatsworth, CA) y marcado con a-32P-dCTP usando cebadores aleatorios.
Ensayo de marcado por el método del inmunooro
Endospermos inmaduros, transg�nicos y no transg�nicos, fueron recolectados aproximadamente 20 días después de la polinizaci�n usando un método de refrigeración de alta presión (McDonald, 1998). Los tejidos fueron embebidos en resina blanca y se efectu� el ensayo por el método inmunocitoqu�mico según se ha descrito anteriormente (Philip et al., 1998).
Resultados
An�lisis de PCR y de hibridación de transferencia de DNA de plantas transg�nicas
Para ensayar la funcionalidad de la secuencia del p�ptido señal del extremo amino terminal del promotor de la horde�na B1 y estudiar los mecanismos de elección de dianas, los presente inventores obtuvieron 10 líneas de cebada independientes transformadas de modo estable, que contenían o bien pdBhssGN5-6 o pdBhGN1-2. De éstas, tres líneas procedentes de cada construcción de DNA eran líneas expresadas conjuntamente con los genes uidA y bar. Se aisl� DNA gen�mico desde estos transformantes. Se efectu� análisis de PCR usando los cebadores UIDA y BAR. La amplificación por PCR dio por resultado fragmentos de uidA intactos de 1,8 kb e internos de bar de 0,34 kb. procedentes de seis líneas (Tabla 3). Se observ� una diferencia de tamaño de 51 bp entre los fragmentos amplificados desde los transformantes de horde�na B1-uidA con y sin la secuencia señal, lo que se justifica por la presencia de la secuencia señal en las líneas GPdBhGN-1, -2 y –16.
Expresi�n de horde�na-uidA en plantas transg�nicas
Semillas de T1 fueron ensayadas para determinar la actividad histoqu�mica de GUS. Se apreci� una fuerte expresión de GUS en los tejidos de endospermo transformados con ambos promotores de la horde�na-B1 con y sin la secuencia señal, pero no en los embriones. La expresión de GUS procedente de las dos construcciones de horde�na B1–uidA era muy evidente en el endospermo en desarrollo, en especial en las células periféricas de tejido del endospermo y de tejido del endospermo próximo al lado escutelar. El promotor de horde�na B1 con la secuencia señal tenía, todavía, una expresión más fuerte en el endospermo que la que tenía sin la secuencia señal. No se observ� expresión de GUS en los tejidos del testigo sin transformar.
Las actividades relativas de las construcciones de horde�na B1-uidA fueron determinadas mediante análisis fluorom�trico de GUS en extractos de semillas, en desarrollo y maduras, de líneas homozig�ticas. Las actvidades específicas de GUS inducidas por el promotor de horde�na B1 con la secuencia señal, eran más altas, tanto en las semillas en desarrollo como en la semillas maduras, que sin la secuencia señal (Figs. 6 y 7). En particular los tejidos de endospermo en desarrollo transformados con el promotor de horde�na B1 con la secuencia señal, tenían más de 30 veces la actividad de GUS, en comparación con el promotor de horde�na B1 sin la secuencia señal.
An�lisis de la progenie T0 a T2
La actividad enzim�tica de la fosfinotricina acetiltansferasa (PAT, producto de bar) y de GUS en plantas T0 y su progenie, fue ensayada por aplicación de Basta en forma de capa, a las hojas, para PAT y mediante análisis histoqu�mico para GUS. El tejido de hojas procedente de plantas T0 de las seis líneas independientes puso de manifiesto resistencia a Basta (Tabla 1). En la progenie T1 las seis líneas ensayadas para determinar uidA mostraban un tipo de segregación de 3:1 para la expresión de GUS. Los genes bar habían sido transmitidos también de modo estable a la progenie T1 de cinco líneas excepto la GPdBhssGN-10; la línea GPdBhssGN-10 no expres� PAT, Se obtuvieron líneas transg�nicas homozig�ticas que expresaban uidA de modo estable, de los 4 casos GPdBhGN-1, GPdBhssGN-7, -10 y –23.
Microscop�a electrónica y marcado con el método del inmunooro
La inmunose�al observada a nivel del microscopio electrónico, era específica de cuerpos prote�nicos en el endospermo inmaduro que expresa GUS, de la línea que había sido transformada con la construcción de DNA de horde�na B1-uidA que contenía la secuencia del p�ptido señal del extremo amino terminal, de 19 amino�cidos (Fig. 7).
Discusi�n
La investigación precedente ensaya la funcionalidad de los promotores de la horde�na B1 de la cebada, con y sin la secuencia del p�ptido señal del extremo amino terminal, de 19 amino�cidos, usando ensayos de expresión tanto transitoria como estable, en la cebada. En concordancia con estudios anteriormente realizados (M�ller y Knudesen, 1993); S0rensen et al., 1996), se observ� en el endospermo en desarrollo expresión transitoria de GUS bajo el control de la fusión de promotor de horde�na B1-uidA sin la secuencia señal , pero no en los embriones. El promotor de horde�na B1 con la secuencia señal puso de manifiesto el mismo tipo de expresión, pero con una mas fuerte expresión. El análisis por PCR confirm� la presencia de uidA y bar en el DNA gen�mico procedente de plantas T0 de 6 líneas diferentes transformadas de modo estable con promotores de horde�na B1 con y sin la secuencia señal.
Semillas de cebada en desarrollo y maduras, transformadas de modo estable, fueron caracterizadas en términos de especificidad de los tejidos y cadencia de la expresión de GUS inducida por el promotor de horde�na. Gus, inducido por ambos promotores de horde�na B1, con y sin la secuencia señal, era expresado exclusivamente en tejido del endospermo y no en otros tejidos. Además, la existencia de la secuencia señal con el promotor de horde�na B1, mejor� espectacularmente la expresión de GUS en el endospermo transg�nico en desarrollo. Este hecho est� en concordancia con los resultados de Fiedler y Conrad (1995) de que una proteína Fv de una sola cadena (scFv) de unión a ant�geno solamente era detectable en semillas de plantas de tabaco transformadas con construcciones que contenían una secuencia de p�ptido señal. Después de almacenamiento de semillas de tabaco transg�nicas, maduras, durante un año, a temperatura ambiente, no había pérdida de proteína scFV ni de su actividad de unión a ant�geno, mientras que en plantas transformadas con construcciones sin p�ptido señal no tuvo lugar acumulación de scFv ni en el fruto maduro ni en las semillas en desarrollo. Ellos suponían que la falta de expresión de la proteína de GUS en el citosol es resultado de la regulaci�n de la traducción o posterior a la traducción por las proteasas citos�licas, que degradan la proteína scFv si no entra en el camino secretorio. En contraste con ello, los niveles de mRNAs de GUS en las semillas en desarrollo y la actividad de GUS en las semillas maduras, eran consistentemente superiores en las líneas de tabaco transformadas que contenían la secuencia de amino�cidos del extremo amino terminal, de 32 amino�cidos, del gen de lectina específico del embrión de la soja en comparación con las que carecían de esta secuencia (Phillip et al., observación sin publicar). La expresión de GUS procedente de las dos construcciones de horde�na B1-uidA era muy evidente, en especial en las células periféricas de tejido de endospermo en desarrollo y el tejido de endospermo próximo al lado escutelar de la cebada transformada.
Pod�a esperarse que las plantas transg�nicas con un sitio único de integración transg�nica, dieran una relación de segregación para el transgeno (y su expresión) de 3:1. Las seis líneas dieron tal relación para la expresión de GUS. Se obtuvieron líneas transg�nicas homozig�ticas, que expresan GUS de modo estable desde 4 líneas.
La expresión de PAT inducida por el promotor de la ubiquitina del maíz había sido heredada también de modo estable en la progenie T1 de cinco líneas transg�nicas; sin embargo, una línea (GPdBhssGN-10) no mostraba expresión de PAT en la progenie T2.
Los resultados presentados en esta memoria indican que el promotor de la horde�na D y de la horde�na B1 pueden ser utilizados para desarrollar un sistema para limitar la expresión g�nica extra�a extraño exclusivamente al endospermo de las semillas de la cebada. Además, los resultados indican que el uso de plantas transformadas con un promotor específico de las semillas, con la secuencia señal, mejoraba espectacularmente la expresión transg�nica. Este hecho permite la creación de nuevas variedades de cultivos con fines indefinidos y farmacéuticos usando estrategias de elección de dianas vacuolares..
Ejemplo 5: Expresión específica del embrión (para referencia)
Este ejemplo utiliza el promotor Glb1 del maíz, con o sin deleci�n de una secuencia de flanqueo de 5’, fusionado al gen informador bacteriano, gen de la 1-glucuronidasa (uidA;gus), para demostrar la funcionalidad del promotor Glb1 del maíz en la cebada transg�nica, para la expresión específica del embrión.
Una variedad de cultivo de cebada, de primavera , de dos hileras, Golden Premise, se cultiv� en cámaras de cultivo según ha sido descrito anteriormente (Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996)
Pl�smidos
El ppGlb1GUS (Liu y Kriz, 1996), un pl�smido que contiene el gen informador uidA bajo el control del promotor de globulina (Glb1) específico del embrión del maíz y terminado en nos, se obtuvo de DEKALB Plant Genetics, Mystic, CT. El ppGlb1GUS se sometió a digestión con EcoRI separando una región de flanqueo de globulina de 5’, de 1,04 kb. El fragmento de EcoRI de 2,58 kb que contenía el promotor de globulina de 0,36 kb, la secuencia codificante uidA y la secuencia de terminación de 3’ de nos, fue ligado en el pUC19 digerido con EcoRI, generando el pdGlbGUS-6. Por tanto, la región de flanqueo de globulina de 5’, de 1,04 kb, estaba suprimida en el pdGlbGUS-6. Las dos construcciones de DNA quimérico anteriores fueron introducidas utilizando bombardeo con microproyectiles, en tejidos del endospermo inmaduro de la cebada para efectuar ensayos de expresión g�nica transitoria y estable.
Expresi�n g�nica transitoria de los genes uidA inducida por promotores de globulina
Espigas de aproximadamente 20 a 25 días después de la polinizaci�n fueron esterilizadas en la superficie durante 10 a 15 minutos con agente de blanqueo al 20% (hipoclorito sádico al 5,25%), seguido de 3 lavados con agua estéril. Los tejidos inmaduros de embriones y endospermos fueron separados as�pticamente y colocados con el escutelo hacia arriba sobre medio MS (Murashige y Skook, 1962) suplementado con 3,5 g/L de Phytagel (Sigma, St. Loius, MO) con
o sin tratamiento osm�tico (Cho et al., 1998b). Los tejidos fueron bombardeados usando una pistola Biolistic PDS1000 He (Bio-Rad, Hercuels, CA) a 7584 kPa con partículas de oro de 1,0 !m recubiertas o bien con ppGlb1GUS o bien con pdGlbGUS-6, según el protocolo de Lemaux et al., (1996) El tratamiento osm�tico incluye manitol 0,2 M y sorbitol 0,2 M para dar una concentración final de 0,4 M con pre-tratamiento de 4 h y post-tratamiento de 1 � 2 d..
Transformaciones estables de la cebada
Se obtuvieron líneas GP transg�nicas, estables, mediante bombardeo con micropart�culas esencialmente según ha sido descrito por Wan y Lemaux, 1994; Lemaux et al., 1996; y Cho et al., 1998a. Partículas de oro (1,0 !m) fueron recubiertas con 25 !g de pAHC20 y ppGlbGUS o pdGlbGUS-6 de relación molar 1:1, y se usaron en experimentos de bombardeo según se ha descrito anteriormente. El pl�smido pAHC20 (Christensen y Quail, 1996) contiene el gen de resistencia a herbicidas, bar, procedente de Streptomyces hygroscopicus bajo el control del promotor Ubil de la ubiquitina del maíz y primer intr�n y secuencia de terminación de 3’ de nos. Callos resistentes al Bialafos fueron regenerados sobre medio FHG (Hunter, 1988) que contenía 1 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP) y 3 mg/L de bialafos. Los retoños regenerados fueron hechos pasar a cajas Magenta que contenían medio de enraizamiento (medio de inducción de callo sin fitohormonas) que contenía 3 mg/L de bialafos. Cuando los retoños alcanzaron la parte superior de la caja, las pl�ntulas fueroon hechas pasar al suelo y se cultivaron hasta madurez en el invernadero.
An�lisis histoqu�mico y cuantitativo de la actividad de GUS
Se llev� a cabo tinción histoqu�mica para GUS usando ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-1-D-glucur�nico (X-gluc) (Gold Biotechnology, Inc., St. Louis, MO). Las muestras fueron incubadas durante la noche a 37�C en tampón de ensayo de GUS.
Aplicaci�n de herbicida
Para determinar la sensibilidad a herbicidas de plantas T0 y sus progenie, se aplicó en forma de capa a una sección del limbo de las hojas, en la fase de 4 a 5 hojas, utilizando una torunda de algodón, una solución al 0,25% (v/v) de solución de Basta™ (concentración de partida, 200 g/L de fofinotricina, Hoechst AG, Frankfurt, Alemania) más Tween 20 al 0,1%. Las plantas fueron calificadas 1 semana después de aplicar el herbicida.
Aislamiento de DNA gen�mico, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación de transferencia de DNA
DNA gen�mico total procedente de callos o tejidos de hojas, independientes, fue purificado según se ha descrito (Dellaporta, 1993). Para ensayar la presencia de uidA en el DNA gen�mico de líneas transformadas putativamente, 250 ng de DNA gen�mico fueron amplificados por PCR usando el conjunto de cebadores UIDA1(5’agcggccgcaTTACGTCCTGTAGAAACC-3’) y UID2R (5’-agagctcTCATTGTTTGCCTCCCTG-3’);cada uno con un sitio de enzima de restricción (letras minúsculas) para subclonar otra construcción de DNA que contenía el gen uidA (Cho et al., 1998a;b) La presencia de bar fue ensayada usando el conjunto de cebadores BAR5F (5’-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3’) y BAR1R (5’-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG-3’) (Lemaux et al., 1996). Las amplificaciones fueron realizadas con DNA polimerasa de Taq (Promega, Madison, WI) en una reacción de 25 !l (Cho et al., 1998a;b). Veinticinco !l del producto de la PCR con colorante de carga fueron sometidos a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% con bromuro de etidio y se fotografi� usando luz UV. La presencia de un fragmento de 1,8 kb con los cebadores UIDA era coherente con un fragmento intacto uidA; se produjo un fragmento interno de 0,34 kb con los cebadores BAR.
Resultados
Expresi�n g�nica transitoria de genes uidA de globulina
Para establecer inicialmente la funcionalidad del promotor de globulina específico del embrión del maíz, se usaron los pl�smidos ppGlb1GUS y pdGlbGUS-6 en ensayos transitorios que llevaron consigo bombardeo con microproyectiles de endospermos y embriones de cebada inmaduros, respectivamente. Se incluyeron dos testigos, un testigo negativo bombardeado con tampón TE1x y otro positivo bombardeado con pAHC25 conteniendo uidA bajo el control del promotor constitutivo de la ubiquitina del maíz. GUS inducido por los promotores de globulina específicos del embrión del maíz, fue expresado débilmente en el tejido del embrión, pero no, en absoluto, en el tejido del endospermo. La expresión de GUS inducida por las dos fusiones de promotor de globulina-uida fue más fuerte en embriones inmaduros de la cebada con tratamiento osm�tico que sin tratamiento osm�tico. El grado del expresión g�nica de uidA en embriones, inducida por el promotor de globulina sin someter a deleci�n (ppGlb1GUS , 1,4 kb) apareció
5 ligeramente más débil que el inducido por el promotor de globulina sometido a deleci�n (0,36 kb, pdGlbGUS-6). El tratamiento de ABA mejor� la expresión de GUS en embriones inmaduros sin tratamiento osm�tico, pero no con tratamiento osm�tico. El testigo negativo no manifest� expresión alguna de GUS.
Expresi�n específica de embriones en plantas transg�nicas
Para ensayar adicionalmente las construcciones Glb1 del maíz-uidA, se obtuvieron diez líneas de cebada
10 independientes transformadas de modo estable; 5 transformadas con el promotor de globulina sin someter a deleci�n y las otras cinco con promotor de globulina sometido a deleci�n. Se aisl� DNA gen�mico procedente de transformantes regenerables y se llev� a cabo el análisis por PCR. Los resultados de la amplificación por PCR de genes uidA y bar procedentes de DNA gen�mico extraído de tejidos de callo, mostraron que las líneas transg�nicas de la cebada daban por resultado la generación de ambos fragmentos, el de uidA intacto de 1,8 kb y el de bar interno
15 de 0,34 kb.
Diferentes tejidos procedentes de transformantes estables fueron ensayados para determinar la actividad histoqu�mica de GUS. Se puso de manifiesto una débil expresión g�nica de uidA exclusivamente en el tejido de embriones transformados con los promotores Glb1 del maíz, pero no en el tejido del endospermo. Por otra parte, se observ� en todos los tejidos expresión de GUS bajo el control del promotor de la ubiquitina del maíz) (UbiI); no se detect�
20 expresión de GUS en el testigo negativo.
An�lisis de plantas de cebada T0 y sus progenies transformadas con fusiones de horde�na B1 -uidA con y sin secuencia señal.
TABLA 3
bar
Pl�smidos usados Línea transg�nica
DNA PCR (T0)
Aplicaci�n de
Actividad de GUS
Resistencia a
Ploid�a (T0)
Comentarios
para el bombardeo de la cebada
uidA
Basta (T0)
en semillas de T1
Basta en plantas
(+:-)
T1 (:-)
pdBhGN-1-2 GPdBhGN-1
+
+
+
+ (47:25)
+ (19:2)
diploide
homozigosis +pAHC20 GPdBhGN-2 + + + + (11:3) + (22:10) tetraploide GPdBhGN-16 + + + + (61:31) + (39:0) tetraploide pdBhssGN-5-6 GPdBhssGN-7 + + + + (146:40) + (38:13) diplode homozigosis
+ pAHC20 GPdBhssGN-10 + + + + (136:41) -(0:45) diploide homozigosis GPdBhssGN-23
+
+
+
+ (148:42)
+ (7:21)
diploide
homozigosis
Referencias

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una planta monocotiled�nea transg�nica que comprende:
    (a)
    un promotor específico de la maduración de semillas seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, horde�nas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, ze�nas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno,
    (b)
    ligada funcionalmente a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiled�neas capaz de dirigirse a una diana de polip�ptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiled�neas en donde la señal de DNA se selecciona a partir de las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes para la glutelina del arroz, la horde�na D de la cebada y la horde�na B1 de la cebada, y
    (c)
    una secuencia de DNA que codifica una proteína heter�loga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA est� ligada funcionalmente a dicha secuencia señal de DNA.
  2. 2.
    La planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia líder del extremo N-terminal, específica de semillas monocotiled�neas.
  3. 3.
    La planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiled�nea se selecciona entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.
  4. 4.
    La planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiled�nea es arroz.
  5. 5.
    La planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiled�nea es cebada.
  6. 6.
    La planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, en la que la planta monocotiled�nea es trigo.
  7. 7.
    Una semilla transg�nica producida a partir de la planta monocotiled�nea transg�nica según la reivindicación 1, que comprende:
    (a)
    un promotor específico de la maduración de semillas seleccionado entre el grupo que consiste en promotores de glutelinas del arroz, orizinas del arroz, prolaminas del arroz, horde�nas de la cebada, gliadinas del trigo, glutelinas del trigo, ze�nas del maíz, glutelinas del maíz, glutelinas de la avena, cafirinas del sorgo, penisetinas del mijo y secalinas del centeno,
    (b)
    ligada funcionalmente a dicho promotor, una secuencia señal de DNA que codifica una secuencia específica de semillas monocotiled�neas capaz de dirigirse a una diana de polip�ptido ligado a un cuerpo de almacenamiento de proteínas en semillas monocotiled�neas en donde la señal de DNA se selecciona a partir de las secuencias señal comprendidas en el grupo que consiste en genes para la glutelina del arroz, la horde�na D de la cebada y la horde�na B1 de la cebada, y
    (c)
    una secuencia de DNA que codifica una proteína heter�loga de reserva, no de semillas, en la que la secuencia de DNA est� ligada funcionalmente a dicha secuencia señal de DNA.
  8. 8.
    La semilla transg�nica monocotiled�nea según la reivindicación 7, en la que la secuencia señal de DNA es una secuencia líder del extremo N-terminal, específica de semillas monocotiled�neas.
  9. 9.
    La semilla transg�nica monocotiled�nea según la reivindicación 7, en la que la semilla monocotiled�nea se selecciona entre el grupo que consiste en arroz, cebada y trigo.
  10. 10.
    La semilla transg�nica monocotiled�nea según la reivindicación 7, en la que la semilla monocotiled�nea es arroz.
  11. 11.
    La semilla transg�nica monocotiled�nea según la reivindicación 7, en la que la semilla monocotiled�nea es trigo.
  12. 12.
    La semilla transg�nica monocotiled�nea según la reivindicación 7, en la que la semilla monocotiled�nea es cebada.
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