ES2301239T3

ES2301239T3 - Procedimientos y composiciones para la expresion de transgenes en plantas.

Info

Publication number: ES2301239T3
Application number: ES99923112T
Authority: ES
Inventors: Alan L. Kriz; Michael H. Luethy; Dale A. Voyles
Original assignee: DeKalb Genetics Corp
Current assignee: DeKalb Genetics Corp
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2019-05-14
Also published as: TR200100104T2; DK1076706T3; US7256283B2; US20090199307A1; IN2000DE00321A; US6635806B1; US7803927B2; US20090013423A1; WO1999058659A3; JP2002533057A; US20080271212A1; WO1999058659A9; MXPA00011199A; KR20010052350A; EP1076706B1; ZA200006576B; CA2328129A1; IL139568A0; EP1076706A2; CN1310760A

Abstract

Un procedimiento de prevención de la silenciación del gen dependiente de la homología del promotor en una planta monocotiledónea tal como arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y maíz pero diferente de Coix, el procedimiento comprende las etapas de: (a) proporcionar un promotor de la coixina gamma que comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8; (b) preparar una construcción que comprende dicho promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado, en el que dicho gen que se puede seleccionar es preferiblemente un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedad fúngica, un gen de resistencia a enfermedad viral, un gen de resistencia a enfermedad bacteriana, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o calidad del grano, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede rastrear, un gen marcador negativo que se puede seleccionar, un gen que afecta a las características agronómicas de las plantas, o un gen de resistencia al ambiente o estrés . (c) transformar una célula receptora a partir de una planta monocotiledónea distinta de de Coix con dicha construcción, en la que dicha etapa de transformación preferiblemente comprende bombardeo de microproyectiles, electroporación, transformación mediada por filtro de carburo de silicio, o transformación mediada por Agrobacterium, y (d) regenerar una planta que expresa dicho gen a partir de dicha célula receptora, mediante el cual dicha planta no exhibe la silenciación del gen.

Description

Procedimientos y composiciones para la expresión de transgenes en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la expresión de transgenes en plantas. Más específicamente, se refiere a un procedimiento para prevenir la silenciación de genes dependientes de la homología del promotor en plantas.

1. Descripción de la técnica relacionada

Los avances recientes en biología molecular han potenciado de manera notable la capacidad de los científicos de manipular el plasma germinal de animales y plantas. Los genes que controlan fenotipos específicos, por ejemplo, polipéptidos particulares que prestan resistencia a insectos antibióticos e insectos, se han localizado dentro de cierto plasma germinal y aislado a partir de él. Incluso más importante ha sido la capacidad de coger los genes que se han aislado a partir de un organismo e introducirlos en otro organismo. Esta transformación se puede llevar a cabo incluso cuando el organismo receptor es de diferente filum, género o especie de la que dona el gen (transformación
heteróloga).

Se han realizado intentos para modificar genéticamente los caracteres en los genomas de plantas mediante la introducción de genes exógenos usando numerosas técnicas de ingeniería genética. La incorporación de ADN nuevo por las células vegetales receptoras se han llevado a cabo mediante la inclusión de infección por Agrobacterium (Nester et al., 1984), incorporación de ADN mediada por polietilen glicol (PEG) (Lorz et al., 1985) electroporación de protoplastos (Fromm et al., 1986) y bombardeo de microproyectiles (Klein et al., 1987).

Aunque alguna de las técnicas anteriormente mencionadas han hecho transformaciones de plantas casi rutinariamente, la expresión de ADN exógeno ha sido más dificultosa. Uno de los problemas más graves que se ha encontrado es un fenómeno conocido como "co-supresión". Este término se inventó para describir la inhibición de la expresión de genes de un gen endógeno después de la introducción de un transgen homólogo (Jorgensen, 1990), y se describió primero para el gen de la chalcona sintasa (CHS) en Petunia (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Sin embargo, la co-supresión no es única para la CHS, y parece que es un fenómeno general que afecta a las plantas transgénicas. El grado de co-supresión varía para los transformantes individuales, pero en algunas plantas, pueden tener lugar hasta tal grado que un fenotipo se produce para los loci implicados.

Numerosos sistemas de plantas transgénicas han mostrado el fenómeno "silenciación de genes" dependiente de homología que puede implicar o bien múltiples copias de al menos transgenes parcialmente homólogos o un transgen y una secuencia endógena homóloga (Jorgensen, 1995; Matzke y Matzke, 1995; Meyer, 1995). La característica del mecanismo más fundamental que distingue diversos casos de silenciación es si la inactivación observada se produce a nivel de la transcripción o después de la transcripción, y esto se determina a su vez por la región de homología entre la secuencia de interacción. La silenciación de la transcripción se produce en gran medida como resultado de homología del promotor (Neuhuber et al., 1994).

La silenciación del gen dependiente de la homología del promotor interfiere con la transcripción, y algunas veces provoca paramutaciones, que conduce a los cambios que se pueden heredar en la expresión génica y/o modificaciones de ADN que persisten después de la segregación del transgen (Lindbo et al., 1993; Jorgensen, 1995; Matzke y Matzke, 1995; Park et al., 1996). La causa de tales cambios en la expresión génica se entienden de manera escasa pero se sabe que esta silenciación está influenciada por la longitud de la homología y por la posición de las secuencias que interactúan.

En el caso del promotor de la nopalina sintasa, se encontró que una región de 300 pares de bases de homología era suficiente para mediar la co-supresión en tabaco Matzke et al., 1993). Se ha encontrado que una secuencia endógena conocida como H2, que tiene homología con el promotor de la nopalina sintasa, es un potente silenciador de genes dirigidos por el promotor de la nopalina sintasa (Matzke el al., 1995; Matzke el al., 1994. esto se cree que implica el apareamiento de las copias del promotor de la nopalina sintasa en los loci de silenciación y dianas, seguido la imposición de la mutilación sobre la copia diana hasta un grado similar al adquirido de manera autónoma por el silenciador (Matzke el al., 1994). El ejemplo más eficaz de la co-supresión es una línea de tabaco que lleva una inserción de transgen con dos genes dirigidos por el promotor 19S y 35S del CaMV, respectivamente. Ambos genes, unidos a los dos parámetros están suprimidos, y este locus trans-inactiva las construcciones introducidas recientemente que proporciona al menos 90 pares de bases de la homología común (Vaucheret, 1993).

La silenciación de la transcripción es particularmente dificultosa para los biotecnólogos de agricultura porque muchos de los promotores más útiles para la expresión de un transgen particular y nativos para el genoma del huésped. Esto es especialmente verdad para una de los más importantes cultivos de la agricultura, el maíz. Los ejemplos de varios promotores de maíz con los perfiles de expresión deseables incluyen promotores de maíz constitutivos afines tales como los genes de de Adh y sacarosa sintasa (Walker et al.,1987; Yang y Russell, 1990), promotores específicos de tejidos tales como los promotores del complejo que recogen el maíz zein y ligero (Conking et al., 1990; Simpson, 1986), y los parámetros inducibles tales como de la proteína de choque térmico de maíz (Odell et al., 1985).

Por lo tanto, existe, una gran necesidad en la técnica de procedimientos mejorados para la expresión de genes endógenos en plantas, y particularmente en plantas monocotiledóneas importantes desde el punto de vista agronómico tal como maíz. Particularmente, son necesarios procedimientos que permitan a los científicos beneficiarse de las características deseables de los promotores de monocotiledóneas, que incluso evitan los problemas asociados a la co- supresión de secuencias homólogas. La tecnología actual está limitada a este respecto por la pérdida de alternativas suficientes a los promotores que son nativos a las especies monocotiledóneas importantes desde el punto de vista agronómico.

Sumario de la invención

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de prevención de la silenciación de los genes dependientes de homología del promotor en una planta monocotiledónea, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) proporcionar un promotor de la coixina gamma que comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8; (b) preparar una construcción que comprende dicho promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado; (c) transformar una célula receptora a partir de una planta monocotiledónea distinta de de Coix con dicha construcción; y (d) regenerar una planta que expresa dicho gen a partir de dicha célula receptora, mediante el cual dicha planta no exhibe la silenciación del gen. En particular las realizaciones de la invención la planta monocotiledónea es una planta seleccionada entre el grupo constituido por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz. La etapa de transformación puede comprender: cualquier procedimiento capaz de transformar de manera estable una planta que incluye, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles, transformación mediada por PEG de protoplastos, electroporación, transformación mediada por fibras de carburo de silicio, transformación mediada por Agrobacterium. En una realización preferida de la invención la etapa de transformación comprende bombardeo de microproyectiles mediante revestimiento de microproyectiles con ADN que comprende la construcción y poner en contacto las células receptoras con los microproyectiles.

El gen puede ser potencialmente cualquier gen que se desea que se exprese en una planta transgénica que incluye un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede rastrear, un gen marcador que se puede seleccionar negativo, un gen que afecta a las características agronómicas de las plantas, y un gen de resistencia al ambiente o estrés. El promotor Coix es un promotor de la coixina gamma es un promotor de la coixina gamma.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de la progenie que comprende las etapas de (a) preparar una planta monocotiledónea de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente; y (b) cruzar la planta con una segunda planta o consigo misma.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de mejora de plantas que comprende las etapas de (a) obtener una planta progenie de cualquier generación de una planta monocotiledónea preparada de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, en los que la planta progenie comprende dicha construcción; y (b) cruzar la planta con ella misma o una segunda planta.

El promotor de la coixina gamma aislado, por ejemplo el que se puede aislar a partir de la secuencia de de SEQ ID NO: 8 y comprende entre aproximadamente 80 y 894 nucleótidos contiguos de la SEQ IN NO 8. En otra realización la secuencia de ácido nucleico aislada comprende entre aproximadamente 222 y aproximadamente 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8 y puede además comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18. La secuencia de ácidos nucleicos aislada también puede comprender entre aproximadamente 412 y aproximadamente 894 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 8, y todavía puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 19.

La etapa (d) del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 proporciona una planta transgénica fértil que comprende un ADN seleccionado, comprendiendo dicho ADN seleccionado un promotor de la coixina gamma. En particular el promotor de la coixina gamma se puede aislar a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones el promotor comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende entre aproximadamente 80 y aproximadamente 894, aproximadamente 222 y aproximadamente 894, o aproximadamente 412 y aproximadamente 894 de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO 8. En todavía otra realización, el promotor comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18; o la SEQ ID NO: 19. El promotor se puede unir de manera operativa a cualquier gen exógeno, que incluye un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o calidad de cereal, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxinas, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede rastrear, un gen que se puede seleccionar negativo, un gen que afecta a las características agronómicas de la planta, y un gen de resistencia al ambiente o estrés.

El procedimiento de producción de progenie proporciona una planta progenie de cualquier generación de cualquiera de las plantas descritas anteriormente, en la que la planta comprende dicho ADN seleccionado. En particular, la planta es una planta monocotiledónea seleccionada entre el grupo constituido por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz. En una realización, la planta monocotiledónea es maíz.

Todavía en otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de mejora de plantas que comprende el cruce de una planta transgénica fértil de la invención, o una progenie transgénica de la misma que ha heredado un ADN exógeno de la invención, consigo misma o con una segunda planta.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor con referencia a uno más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de la realización específica presentada en este documento.

Fig. 1: Mapa del plásmido pDPG844. El plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), la secuencia codificadora del gen indicador GUS y el terminador nos.

Fig. 2: Mapa del plásmido pDPG845. La construcción contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de arroz, la secuencia codificante del gen indicador GUS y el terminador nos.

Fig. 3: Mapa del plásmido pDPG846. El plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 412 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 19), el intrón 1 de la actina 1 de arroz, la secuencia codificadora del gen indicador de GUS, y el terminador nos.

Fig. 4: Mapa del plásmido pDPG847. El plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 412 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 19), la secuencia codificadora del gen indicador (GUS), y el terminador nos.

Fig. 5: Mapa del plásmido pDPG848. El plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 222 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 18), el intrón de la actina 1 de arroz, el gen indicador GUS, y el terminador nos.

Fig. 6: Mapa del plásmido pDPG849. El plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 222 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 18), la secuencia codificante de un gen indicador (GUS) y el terminador nos.

Fig. 7: Mapa del plásmido pDPG869. La construcción contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la secuencia codificante del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16), y el terminador de la coixina gamma (SEQ ID NO 11).

Fig. 8: Secuencia de comparación de las regiones promotoras de prolamina gamma que codifica los genes de maíz, sorgo, y Coix . Los nucleótidos idénticos en tres secuencias están indicados por sombras. Las secuencias de promotor de maíz, Coix y sorgo se indican como zein gamma (SEQ ID NO 23), coixina gamma (SEQ ID NO 8) y la kafirina gamma(SEQ ID NO 22); respectivamente.

Fig. 9: Mapa del plásmido pDPG851. La construcción contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la secuencia codificante del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16), y el terminador nos.

Fig. 10: Mapa del plásmido pDPG862. La construcción contiene un módulo de expresión que consta de un promotor de secuencia de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la secuencia codificante del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16), y el terminador nos.

Fig. 11: Mapa del plásmido pDV108. La construcción contiene el terminador de la coixina gamma (SEQ ID NO 11).

Descripción detallada de la invención

La invención actual supera las deficiencias en la técnica anterior proporcionando procedimientos para la expresión de transgenes que eliminan o disminuyen la silenciación de los genes. La presente invención es significativa porque proporciona promotores para la expresión de genes exógenos en plantas monocotiledóneas que tienen perfiles de expresión similares a los del genoma del huésped, todavía que se distinguen lo suficiente en secuencia para limitar la silenciación de los genes. En las realizaciones particulares de la invención, los promotores proporcionados por r la invención son del género Coix. Los promotores derivados de Coix serán especialmente útiles en maíz, así como otras plantas monocotiledóneas, tales como trigo, arroz, cebada, centeno, sorgo y caña de azúcar así como en especies de plantas dicotiledóneas.

El fenómeno de silenciación de genes, que también se ha mencionado anteriormente como co-supresión, supresión de sentido positivo, y co-supresión de sentido positivo, es la disminución o eliminación de la expresión génica tras la introducción de las secuencias que tienen copias homólogas nativas (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). La silenciación génica puede actuar como regiones regula Coix.doras y/o codificantes de un transgen, y está asociada frecuentemente con la mutilación de la región silenciada. En el campo de la biotecnología agrícola, la silenciación de las regiones reguladoras es especialmente problemática porque muchos promotores endógenos tienen características particularmente útiles para la expresión transgénica.

Se contempla específicamente por los inventores que la utilidad de la invención actual se puede extender hasta la creación de los vectores de expresión que comprenden elementos de Coix además de los promotores. En particular, se contempla que la anulación de la silenciación de los genes y otros problemas asociados a la homología entre elementos transgénicos y secuencias nativas se pueden evitar mediante el uso de las secuencias Coix en transgenes expresados en plantas monocotiledóneas distintas de Coix. Por ejemplo, las regiones codificantes homólogas a los genes de maíz se podrían expresar de manera eficaz en maíz, mientras que el gen de maíz nativo se silenciaría. También se consideran especialmente útiles elementos potenciadores y terminadores de Coix.

I. Promotores para uso con la invención

La invención actual abarca el uso del promotor de la coixina gamma del género Coix para la expresión de un gen exógeno en las plantas monocotiledóneas tal como maíz. Tal promotor se puede aislar de novo a partir de Coix, o de manera alternativa, se puede aislar basándose en la información genética de promotores de plantas monocotiledóneas conocidos. Un medio particularmente eficaz contemplado por el inventor para la identificación del promotor de la coixina gamma comprende el uso de cebadores o sondas derivados de genes de maíz para aislar secuencias homólogas de Coix.

(i) Promotores ejemplares

Los promotores útiles incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos como se describe en (Poszkowski et al., 1989, Odell et al., 1985), regulados temporalmente, regulados espacialmente, y regulados temporalmente espacialmente (Chan et al., 1989). Un promotor se selecciona para determinar su capacidad para dirigir la célula vegetal transformada o actividad de transcripción de la planta a la región codificante. Algunos ejemplos de secuencias de maíz se consideran especialmente útiles para el aislamiento de promotores de Coix Incluyen los de Adh (Walter et al., 1987; Paul y FERL, 1991, Nº de acceso del banco de genes S45022), sacarosa sintasa (Yang y Russell, 1990), cab (Sullivan et al., 1989, Nº de Acceso del Genbank x14794), PEPCase (Hudspeth y Grula, 1989, Yanagisawa y Izui, 1989; Números de acceso del Genbank X14579, X14581, X14580) y genes asociados al complejo de genes R (Chandler et al., 1989; Consonni et al., 1993, Nº de acceso del genbank X67619; Radicella et al., 1991, Números de acceso del Genbank X52276, S48027). Las secuencias de otras plantas monocotiledóneas, por ejemplo, el promotor de actin de arroz (Número de acceso del Genbank S44221, también pueden ser útiles.

Los genes ejemplares para el aislamiento de promotores específicos de tejidos son la sacarosa sintasa 1 de maíz (Yang et al., 1990), alcohol deshidrogensa de maíz, (Vogel et al., 1989, Dennos et al., 1984, Números de acceso del Genbank X04049, X00581); el complejo que recoge el maíz ligero (Simpson, 1986; Bansal et al., 1992. Número de acceso del Genbank M87020;), proteína de choque por calor de maíz (Odell et al., 1985; Rochester et al., 1986, Número de acceso del Genbank X03714) maíz zein (reina et al., 1990, Número de acceso del Genbank X53514; Kriz et al., 1987, Número de acceso del Genbank X05911; Wandelt y Foix, 1989; Número de acceso del Genbank X14334; Langride y Feix, 1983; Número de acceso del Genbank X00543; Reina et al., 1990, Número de acceso del Genbank X53513; globulina - 1 (Belanger y Kriz et al., 1991; Números de acceso del Genbank L22344, L22295), y los genes de la chalcone sintasa (Franken et al., 1991; Número de acceso del Genbank X60204).

Otras secuencias similares de maíz conocidas incluyen promotores de células de raíz (Conkling et al., 1990), y potenciadores específicos de tejidos (Fromm et al., 1989). Los ejemplos de promotores que pueden inducir incluyen los promotores que pueden inducir ABA y turgencia y el promotor del gen de la proteína de unión a auxina (Scwob et al., 1993; Número de acceso del Genbank L08425). Todavía otras secuencias de maíz conocidas que se pueden usar para aislar promotores heterólogos incluyen el gen de la UDP glucosa glicosil transferasa (ralston et al., 1988; Números de acceso del Genbank X07940, Y00616); gen inhibidor de la proteinasa (Cordero et al., 1994; Número de acceso del Genbank X78988), gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Número de acceso del Genbank U45859; Kohler et al., 1995, Número de acceso del Genbank L40803; Quigley et al., 1989, Número de acceso del Genbank X115408; Martínez et al., 1989, Número de acceso del Genbank X15596), así como los de los genes de cloroplastos (Número de acceso del Genbank X86563).

Los elementos genéticos ejemplares contemplados específicamente por los inventores actuales para el aislamiento de las secuencias de Coix para la expresión en maíz y otras plantas monocotiledóneas se enumeran a continuación, en la Tabla 1. Un número de estos elementos se han usado por los inventores actuales para la preparación de los vectores de expresión, como se indica a continuación.

TABLA 1 Secuencias ejemplares para el aislamiento de elementos genéticos de Coix

1

2

3

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a, \+ promotor indicado que se ha usado para la transformación de
maíz.\cr  b, \+ potenciador de intrón indicado que se ha usado para
la transformación de maíz.\cr  c, \+ promotor  Coix  que se ha
aislado y usado para la transformación de maíz.\cr  d, \+
 \begin{minipage}[t]{138mm} proteína  Coix  que codifica la
secuencia (CDS) que se ha aislado y usado para la transformación de
maíz.
\end{minipage} \cr}

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ii) Clonación de secuencias homólogas a partir de Coix

Parte de la invención actual implica el aislamiento de las proteínas reguladoras del género Coix mediante el uso de sondas o cebadores derivados de genes de maíz o sus secuencias flanqueantes. Las sondas o cebadores se pueden componer o clonar directamente de ADN de maíz clonado, o como alternativa, se puede preparar de manera sintética basándose en los datos de las secuencias de ADN. De manera adicional, los promotores se pueden aislar usando las secuencias que se derivan de una especie diferente de maíz, pero que está aún relacionada con maíz y Coix. Otras especies se consideran particularmente útiles para la identificación de promotores heterólogos en Coix incluyen plantas monocotiledóneas tales como centeno, trigo, cebada, avena, sorgo, arroz, y caña de azúcar.

El término cebador como se usa en el presente documento significa que abarca cualquier ácido nucleico que es capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente del molde. Típicamente los cebadores son oligonucleótidos de entre diez y doce pares de bases de longitud, pero se pueden empelar secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma de doble hebra o de una sola hebra, aunque se prefiere la de una sola hebra. Las sondas se definen de manera diferente, aunque pueden actuar como cebadores. Las sondas, aunque quizás son capaces de cebar, se diseñan para unirse al ADN o ARN diana y necesitan usarse en un proceso de amplificación.

En realizaciones preferidas, las sondas o cebadores están marcadas con especies radiactivas (^{33}P, ^{14}C, ^{35}S, ^{3}H, u otra etiqueta), con un fluoróforo (rodamina, fluoresceína), un antígeno (biotina, estreptavidina, digoxigenina), o un agente quimioluminiscente (luciferasa) o conjugación directa con enzimas (fosfatasa alcalina).

Después de la preparación de las sondas o cebadores la primera etapa en la clonación de promotores heterólogos típicamente implica la preparación y selección de una genoteca apropiada de clones, tal como en el caso presente, una genoteca de ADN genómica de Coix. La selección se puede basar en al hibridación de sondas de oligonucleótidos, diseñados a partir de una consideración de partes de la secuencia de promotores de maíz, o a partir de l as secuencias de ADN del gen o genes relacionados. La operación de tales protocolos de selección es bien conocida por los expertos en la técnica y se describe en detalle más adelante y en la bibliografía de síntesis, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989).

1. Amplificación dependiente de molde

Los procedimientos de amplificación dependientes de molde, por ejemplo PCR, representan un medio eficaz para el aislamiento de secuencias homólogas de maíz u otras de Coix. En particular los cebadores se pueden diseñar basándose en la información genética a partir de secuencias homólogas, que se pueden usar para la amplificación dependiente del molde de ácidos nucleicos que comprenden promotores Coix. Un número de procedimientos dependiente de molde están disponibles para amplificar las secuencias presentes en una muestra de molde dada. Uno de los mejores procedimientos de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (llamada PCR ^{TM}) que se describe en detalle en la patente de Estados Unidos número 4.683.195; patente de Estados Unidos número 4.683.202 y patente de Estados Unidos número 4.800.159.

En resumen, en la PCR ^{TM}, se preparan dos secuencias de cebadores para que sean complementarias a las regiones en las hebras complementarias opuestas de la secuencia de marcador. Un exceso de desoxinucleósido trifosfatos se añade a la mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si la secuencia de marcador está presente en una muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa provocará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia de los marcadores mediante la adición en los nucleótidos. Mediante el aumento y disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar productos de reacción y se repite el procedimiento.

Un procedimiento de amplificación de PCR ^{TM} de transcriptasa inversa se puede realizar con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Los procedimientos de transcripción inversa de ARN en ADNc son bien conocidos y se describen en Sambrook et al., (1989). Los procedimientos alternativos para la transcripción inversa utilizan ADN polimerasas termoestables dependientes de ARN. Estos procedimientos se describen en el documento PCT/WO90/07641 presentado el 21 de diciembre de 1990. Las metodología de la reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en la técnica.

Otro procedimiento para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), descrito en el documento EP 0 320 308. En LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en la presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a hebras complementarias opuestas de la diana de manera que están cerca. En la presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. Mediante la ciclación de la temperatura, como en PCR ^{TM}, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y sirven como "secuencias diana" para el ligamiento de pares de sonda en exceso. La patente de Estados Unidos nº 4.883.750 describe un procedimiento similar a LCR para la unión de pares de sondas a una secuencia diana.

Qbeta Replicasa, descrita en el documento PCT/US87/00880, también se puede usar como aún otro procedimiento de amplificación en la presente invención. En este procedimiento, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de una diana se añade a una muestra en la presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que después se puede detectar.

Un procedimiento de amplificación isotérmico, en el que las endonuclesas de restricción y ligasas se usan para lograr la amplificación de moléculas diana que contienen el nucleótido 5'-[\alpha-tio]-trifosfatos en una hebra de un sitio de restricción también puede ser útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención (Walter et al., 1992).

La Amplificación de Desplazamiento de Hebra (SDA) es otro procedimiento de llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos isotérmicas que implica múltiples rondas de desplazamiento y síntesis de hebra, es decir, traducción nick. Un procedimiento similar, llamado Reacción en Cadena de Reparación (PCR), implica la hibridación de varias sondas por toda la región dirigida para la amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que solamente están presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases se pueden añadir como derivados biotinilados para la detección fácil. Se usa un planteamiento similar en SDA. Las secuencias específicas diana también se pueden detectar usando una reacción de sonda cíclica (CPR). En la CPR, una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una secuencia intermedia de ARN específico se hibrida a ADN que está presente en una muestra. Tras la hibridación, la reacción se trata con ARNasa II, y los productos de la sonda identificada como productos distintos que se liberan después de la digestión. El molde original se hibrida a otra sonda de ciclación y la reacción se repite.

Todavía otros procedimientos de amplificación en el documento GB 2 202 308 y en el documento PCT/US89/01025 se pueden usar de acuerdo con la presente invención. En la solicitud anterior, se usan cebadores "modificados" en una síntesis de tipo PCR ^{TM}, dependiente de molde y enzima. Los cebadores se pueden modificar mediante el etiquetado con, un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima). En la aplicación posterior, un exceso de sondas marcadas se añade a la muestra. En la presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde de manera catalítica. Después de la escisión, la secuencia diana se libera intacta para que se una por exceso de sonda. La escisión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia diana.

Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), que incluyen la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NSABA) y 3SR (Kwoh et al., Gingeras et al., documento PCT/WO88/10315. En NASBA los ácidos nucleicos se pueden preparar para la amplificación mediante extracción convencional por fenol/cloroformo, desnaturalización por calor de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y columnas de minispin para el aislamiento de ADN y ARN o extracción por cloruro de guanidio de ARN. Estas técnicas de amplificación implican la hibridación de un cebador que tiene secuencias específicas de diana. Después de la polimerización, ADN/ARN se hibrida y se digiere con la ARNasa H con moléculas de ADN de doble hebra se desnaturalizan por calor otra vez. En cualquier caso el ADN de una sola hebra se prepara con doble hebra mediante la adición de un segundo cebador específico de diana, seguido de polimerización. Las moléculas de ADN de doble cadena después se transcriben de manera múltiple mediante una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. En una reacción cíclico isotérmica, los ARN se transcriben de manera inversa en ADN de una sola hebra, que después de convierte en ADN de doble hebra, y después se transcribe una vez más con una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, si están rotos o completos, indican secuencias diana especificas diana.

El documento EP 329 822 describe un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que implica de manera cíclica la síntesis de ARN de una sola cadena (ssADN''), el ssADN y ADN de doble cadena (dsADN) que se puede usar de acuerdo con la presente invención. El ssARN es un molde para un primer oligonucleótido cebador, que se alarga mediante transcriptasa inversa (ADN polimerasa de pendiente de ARN). Después se retira el ARN del ADN :
ARN dúplex resultante por la acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica de ARN en dúplex con cualquier ADN o ARN). El ssADN resultante es un molde para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (que se ejemplifica por la ARN polimerasa de T7) 5' a su homología al molde. Este cebador después se extiende mediante la ADN polimerasa (que se ejemplifica por el fragmento grande "Klenow" de ADN polimerasa I de de E. coli, que da como resultado una molécula ADN de doble hebra ("dsADN"), que tiene una secuencia idéntica al ARN original entre los cebadores y que tienen de manera adicional, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor se puede usar mediante la ARN polimerasa apropiada para preparar muchas copias de ARN del ADN. Después estas copias pueden volver a entrar en el ciclo que conduce a una amplificación muy rápida. Con la elección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede hacer de manera isotérmica sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este procedimiento, la secuencia de partida se puede elegir para que esté en la forma de o bien ADN o
ARN.

El documento PCT/WO89/06700 describe un esquema de amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos basándose en la hibridación de una secuencia de promotor/cebador a una ADN de una sola cadena diana ("ssADN") seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir no se producen nuevos moldes a partir de las transcripciones de ARN resultantes. Otros procedimientos de amplificación incluyen "RACE" y "PERT ^{TM} unilateral" (Forman, 1990; Ohara et al., 1989).

Los procedimientos basados en el ligamiento de dos (o más) oligonucleótidos en la presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificando por lo tanto el di-oligonucleótido, también se puede usar en la etapa de amplificación de la presente invención (Wu et al., 1989).

Después de la amplificación, normalmente es deseable en una fase u otra, separar el producto de amplificación del molde y el exceso de cebador con el propósito de determinar si se ha producido la amplificación específica. En una realización, los productos de amplificación se separan mediante gel de electroforesis de agarosa, agarosa - acrilamida o gel de poliacrilamida usando procedimientos convencionales (Sambrook, et al., 1989).

Como alternativa se pueden emplear técnicas cromatográficas para efectuar la separación. Existen muchos tipos de cromatografía que se pueden empelar en la presente invención: adsorbió, partición, intercambio iónico y tamices moleculares, y muchas técnicas especializadas para su uso que incluyen, columna, columna, papel, capa fina y cromatografía de gas (Freifelder, 1982).

Se pueden visualizar los productos con el fin de confirmar la amplificación de las secuencias de marcador. Un procedimiento de visualización típica implica la tinción de un gel con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV. De manera alternativa, si los productos de amplificación están marcados de manera integral con nucleótidos marcados con radio o de manera fluorométrica, los productos de amplificación se pueden exponer después a película de rayos X o visualizarse en los espectros de estimulación apropiados, después de la preparación.

En una realización, la visualización se logra de manera indirecta. Después de la separación de los productos de amplificación se pone en contacto una sonda de ácido nucleico marcada con la secuencia de marcador amplificada. La sonda preferiblemente se conjuga a un cromóforo pero puede estar marcada radiactivamente. En otra realización la sonda se conjuga a una pareja de unión tal como un anticuerpo de biotina y el otro miembro de la pareja de unión lleva un resto detectable.

En otra realización, la detección es mediante una sonda marcada. Las técnicas implicadas son bien conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en muchos libros convencionales sobre protocolos moleculares Sambrook et al., 1989). Por ejemplo, cromóforos o sondas o cebadores marcados radiactivamente identifican la diana durante o después de la amplificación.

Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.279.721 que describe un aparato y procedimiento para la electroforesis automática y transferencia de ácidos nucleicos. El aparato permite electroforesis y transferencia sin la manipulación extrema del gel y es ideal para de manera adecuada llevar a cabo procedimientos de acuerdo con la presente invención.

Además, los productos de amplificación descritos anteriormente se pueden someter a análisis de secuencia para identificar tipos específicos de variaciones que usan técnicas de análisis de secuencias convencionales. Dentro de ciertos procedimientos, el análisis exhaustivo de genes se lleva a cabo mediante análisis se secuencia que usan conjuntos de cebadores diseñados para la secuenciación óptima (Pignon et al., 1994). La presente invención proporciona procedimientos mediante los cuales se pueden usar cualesquiera de estos tipos de análisis.

2. Transferencia de Southern/Northern

Las técnicas de transferencia representan otros procedimientos que con bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden emplear para la identificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la transferencia de Southern se puede usar para aislar un segmento de ADN que contiene un promotor candidato de Coix útil en la expresión de genes de maíz. En particular, mediante la hibridación de una sonda de ADNc de maíz a clones de ADN genómico de una planta Coix se pueden aislar clones que incluyen la región de los promotores del gen correspondiente. Como alternativa, la secuencia del mismo promotor se puede usar como una sonda para identificar de manera directa promotores de Coix homeólogos.

La transferencia de Southern implica el uso de ADN como una diana. Cada uno proporciona tipos diferentes de información, aunque la transferencia de ADNc es análoga, en muchos aspectos, a la transferencia o especies de ARN. En resumen, se usa una sonda para dirigir una especie de ADN o ARN que se ha inmovilizado sobre una matriz adecuada, a menudo un filtro de nitrocelulosa. Las diferentes especies se deben separar de manera espacial para facilitar el análisis. Esto a menudo se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de especies de ácidos nucleicos seguido de "transferencia" sobre el filtro.

Posteriormente, la diana transferida se incuba con una sonda (usualmente marcada) en condiciones que promueven la desnaturalización y rehibridación. Ya que la sonda se diseña al par de bases con la diana, la sonda unirá una parte de la secuencia diana en condiciones de renaturalización. La sonda no unida después se retira y la detección se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente.

3. Tecnología de chip

Se han contemplado de manera especial por el presente inventor las tecnologías de ADN basadas en chip tales como las descritas por Hacia et al., (1996) y Shoemaker et al., (1996). En resumen, estas técnicas implican procedimientos cuantitativos para analizar grandes cantidades de genes de manera rápida y precisa. Por genes de etiquetado con los oligonucleótidos o uso de disposiciones de sondas fijas, se puede emplear tecnología de chip para segregar moléculas diana como disposiciones de alta densidad y selección de estas moléculas en la base de hibridación (Pease et al., 1994; Fader et al., 1991).

(iii) Aislamiento de novo de promotores Coix

La presente invención contempla el uso de la coixina gamma que se ha aislado sin el uso de sondas o cebadores derivados de promotores de otras especies. Los medios para la clonación de promotores y su construcción en vectores adecuados para la transformación y expresión de genes exógenos en maíz se conoce en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Los tipos de promotores de Coix se consideran que son especialmente útiles para la expresión transgénica en maíz son aquellos que se expresan a altos niveles de una manera constitutiva o no constitutiva. Los promotores deseables no constitutivos incluyen aquellos que se expresan en un tejido y/o de manera específica temporal, o que se pueden inducir. Por de manera temporal específica, significa un promotor que dirige la expresión en uno o más períodos de desarrollo específicos.

Una primera etapa típica en la clonación de un promotor comprende la identificación de un gen diana que se expresa de la manera deseada, es decir, de manera constitutiva o específica de manera temporal del tejido. Un medio eficaz para esto comprenderá la preparación de una genoteca de ADNc a partir de uno o más tejidos diana identificados, y la identificación de altos clones de copia allí. Serán particularmente ventajosos los clones de ADNc que se representan en gran medida, incluso para los cuales el número de copias de genes es bajo. El clon de ADNc se usa después para aislar ADN genómico que comprende las regiones que flanquean 5' la secuencia de codificación, que incluye la región del promotor, usando técnicas de selección de genotecas convencionales conocidas por los expertos en la técnica (véase Sambrook et al., 1989).

Un procedimiento preferido para la clonación de los promotores es el uso de la técnica "PCR de supresión" descrita por ejemplo, en Siebert et al., 1995. Este procedimiento permite la amplificación de PCR de las secuencias no clonadas y desconocidas mientras que se conoce una secuencia de anclaje específica gen. Usando esta técnica una secuencia conocida tal como una secuencia de ADNc homóloga u homeóloga, se puede usar para clonar elementos reguladores de flanqueo que incluyen promotores, potenciadores o terminadores.

1. Cuantificación de la expresión génica con RT - PCR ^{TM} relativa cuantitativa

La transcripción inversa (RT) de ARN a ADNc seguido de la PCR ^{TM} cuantitativa (RT - PCR ^{TM}) se puede usar para determinar las concentraciones relativas de especies de ARNm específico aislado a partir de las plantas. Determinando que la concentración de una especie de ARNm específico varía, se muestra que el gen que codifica la especie de ARNm específico se expresa de manera diferencial. De esta forma, los promotores candidatos se pueden identificar y seleccionar de manera rápida a partir de Coix para uso en la construcción de los vectores de expresión para la transformación de maíz.

En la PCR ^{TM}, el número de moléculas del DNA objetivo amplificado se incrementa en un factor que se acerca a dos con cada ciclo de reacción hasta que algunos agentes llegan a ser limitantes. Después de esto, la velocidad de amplificación llega a disminuir de manera creciente hasta que no hay incremento en la diana amplificada entre ciclos. Si se representa un gráfico en el que el número de ciclos en el que el número de ciclos está sobre el eje X y el log de la concentración del ADN diana amplificado está sobre el eje Y, se forma una línea curva con forma característica conectando los puntos representados gráficamente. Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante. Esto se dice que es una parte lineal de la curva. Después de que un reactivo se hace limitante, la pendiente de la curva comienza a disminuir y eventualmente llega a cero. En este momento la concentración del ADN diana amplificado se hace asintótico para algún valor fijo. Esto se dice que es la parte plana de la curva.

La concentración del ADN diana en la parte lineal de la amplificación de PCR ^{TM} es directamente proporcional a la concentración de partida de la diana antes de que comience la reacción. Determinando la concentración de los productos amplificados del ADN diana en las reacciones de PCR ^{TM} que han contemplado el mismo número de ciclos y están en sus intervalos lineales, es posible determinar la concentración relativa de la secuencia específica diana en la mezcla de ADN original. Si las mezclas de ADN son los ADNc sintetizados a partir de los ARN de los diferentes tejidos o células, las abundancias relativas del ARNm específico para las que la secuencia diana se derivó se pueden determinar por los respectivos tejidos o células. La proporcionalidad directa entre la concentración de los productos de PCR ^{TM} y las abundancias

\hbox{de ARNm
relativas es solamente  verdad en el intervalo lineal de la reacción
de la PCR  ^{TM} :}

La concentración final del ADN lineal en la parte plana de la curva se determina por la capacidad de los reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original del ADN diana. Por lo tanto, la primera condición que se debe reunir antes de que las abundancias relativas de una especie de ARNm se puedan determinar por RT - PCR ^{TM} para una colección de poblaciones de ARN es que las concentraciones de los productos amplificados por PCR ^{TM} se pueden muestrear cuando las reacciones de PCR ^{TM} están en la parte lineal de sus curvas.

La segunda condición que se debe reunir para un estudio de RT - PCR ^{TM} para determinar con éxito las abundancias relativas de una especie de ARNm particular es que las concentraciones relativas de los ADN c que se pueden amplificar se deben normalizar hasta algún estándar independiente. El objetivo de un estudio de RT - PCR ^{TM} es determinar la abundancia de una especie de ARNm particular para el promedio de abundancia de todas las especies de ARNm en la muestra.

La mayoría de los protocolos para la PCR ^{TM} competitiva utilizan patrones de PCR ^{TM} que son aproximadamente tan abundantes como la diana. Estas estrategias son eficaces si los productos de de las amplificaciones de PCR ^{TM} se muestrean durante sus fases lineales. Si los productos se muestrean cuando las reacciones se aproximan a la fase plana, entonces el producto menos abundante se llega a representar en exceso de manera relativa. Las comparaciones de las abundancias relativas hechas para diferentes muestras de ARN diferentes, tales como es el caso cuando se examinan las muestras de ARN para determinar la expresión diferencial, se llega a distorsionar de tal forma que se hacen diferencias en las abundancias relativas de los ARN parecen menos lo son en realidad. Éste no es un problema significativo si el patrón interno es mucho más abundante que la diana. Si el patrón interno es más abundante que la diana, entonces las comparaciones directas lineales se pueden realizar entre las muestras de ARN.

La anterior descripción describe consideraciones teóricas para un ensayo de RT - PCR ^{TM} para tejidos de plantas. Los problemas inherentes en las muestras de los tejidos de plantas son las que son de cantidad variable (que hacen una problemática de normalización), y que son de calidad variable (necesitando la coamplificación de un control interno fiable, preferiblemente de mayor tamaño que la diana). Ambos problemas se superan si la RT - PCR ^{TM} se realiza como una RT - PCR ^{TM} cuantitativa relativa con un patrón interno en el que el patrón interno es un fragmento de ADNc amplificable que es mayor que el fragmento de ADNc diana y en el que abundancia de la ARNm que codifica el patrón interno es aproximadamente 5 - 100 veces mayor que el ARNm que codifica la diana. Este ensayo mide la abundancia relativa no la abundancia absoluta de las especies de ARNm respectivas.

Se pueden realizar otros estudios usando un ensayo de RT - PCR ^{TM} cuantitativa relativa con un protocolo estándar externo. Estos ensayos muestrean los productos PCR ^{TM} en la parte lineal de las curvas de amplificación. El número de ciclos de la PCR ^{TM} que son óptimos para muestreo se pueden determinar empíricamente para cada fragmento de ADNc diana. Además, los productos de transcriptasa inversa para cada población de ARN aislado de las diversas muestras se deben normalizar cuidadosamente para concentraciones iguales de los ADN que se pueden amplificar. Esta consideración es muy importante ya que el ensayo mide la abundancia absoluta de ARNm. La abundancia absoluta de ARNm se puede usar como una medida de la expresión génica diferencial solamente en las muestras normalizadas. Aunque las determinaciones empíricas para el intervalo lineal de la curva de amplificación y normalización de de las preparaciones de ADNc son procedimientos tediosos y requieren tiempo largo, los ensayos de RT - PCR ^{TM} resultantes pueden ser superiores a los derivados del ensayo de RT - PCR ^{TM} cuantitativa relativa con un patrón interno.

Una razón para esta ventaja es que sin el patrón/competidor interno, todos los reactivos se pueden convertir en un solo producto de PCR ^{TM} en el intervalo lineal de la curva de amplificación, incrementando de esta manera la sensibilidad del ensayo. Otra razón es que con solamente un producto de la PCR ^{TM}, la exposición del producto sobre un gel de electroforesis u otro procedimiento de exposición se hace menos complejo, tienen menos fondo y es más fácil de interpretar.

2. Aislamiento del promotor no dirigido

Igual que los promotores de clonación en una diana, la manera específica mediante la identificación primera de un gen con un perfil de expresión deseado, se pueden clonar los promotores de Coix utilizando una estrategia de selección "a ciegas". Por ejemplo, se puede generar un gran número de vectores que comprenden un gen marcador que se puede seleccionar o rastrear unido a segmentos al azar de ADN de Coix. Tales vectores se pueden preparar mezclando y ligando partes del ADN del gen marcador digerido por restricción y ADN genómico total de Coix, y la clonación del ADN en un vector adecuado. Como alternativa, se puede usar una construcción de "jinete sin cabeza" en la que un sitio de clonación precede directamente a un gen marcador que por otra parte carece de un promotor. En este caso, el gen marcador se expresará solamente cuando un promotor se clona en el sitio de clonación. Una vez construidos, los vectores se pueden usar para transformar un gran número de células de maíz. Mediante la selección de transformantes que expresan el gen marcador se pueden identificar promotores de Coix novedosas capaces de dirigir la expresión en maíz.

(iv) Ensayos de promotores

Una vez clonado, la identidad y/o utilidad del promotor se puede confirmar mediante la secuenciación y/ o ensayos de expresión. Para las plantas, el ensayo de expresión puede comprender un sistema que utiliza células embrionarias o no embrionarias, o como alternativa, plantas enteras. Una ventaja de uso de ensayos celulares es que no se requiere la regeneración de grandes números de plantas, sin embargo, los sistemas se limitan porque la actividad del promotor en las células no regeneradas pueden no correlacionarse directamente con la expresión en una planta. De manera adicional, en general no son factibles los ensayos de tejido o promotores específicos de desarrollo.

La muestra biológica a ensayar puede comprender ácidos nucleicos aislados de las células o cualquier material vegetal de acuerdo con las metodologías convencionales (Sambrook et al., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN fraccionado o de células enteras. Cuando se usa el ARN, se puede desear convertir el ARN en un ADN complementario. En una realización, el ARN es ARN de células enteras. En otro es un ARN poli-A. Normalmente, se amplifica el ácido nucleico.

Dependiendo del formato, el ácido nucleico específico de interés se identifica en la muestra directamente usando la amplificación con un segundo ácido nucleico conocido después de la amplificación. A continuación, el producto identificado se detecta. En ciertas aplicaciones, la detección se puede realizar por medios visuales (por ejemplo, tinción con bromuro de etidio de un gel). Como alternativa, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto mediante quimioluminiscencia, centelleo grafía radiactiva de etiqueta marcada radiactivamente o fluorescente o incluso mediante un sistema que usa señales de impulso eléctricas o térmicas (Affymax Technology; Bellus, 1994).

Después de la detección, se pueden comparar los resultados observados en una planta dada con un grupo de referencia estadísticamente significativa de plantas de control no transformadas. Típicamente, las plantas de control no transformadas serán de un fondo genético similar a las plantas transformadas. De este forma, es posible detectar diferencias en la cantidad o tipo de la proteína detectada en diversas plantas transformadas. Como alternativa, los cultivos o células clonados, por ejemplo, callo o un embrión inmaduro, se puede comparar con otras muestras de células.

Como se ha indicado, la variedad de ensayos diferentes se contemplan en la selección de células o plantas de la presente invención y promotores asociados. Estas técnicas se pueden usar en casos para detectar tanto la presencia como la expresión de los genes particulares así como trasposiciones que se pueden producir en la construcción de genes. Las técnicas incluyen pero no se limitan a, hibridación fluorescente in situ (FISH), secuenciación de ADN directa, análisis de electroforesis en gel de campo por pulsos (PFGE), transferencia de Southern o Northern, análisis de conformación de una sola cadena (SSCA), ensayo de protección de ARNasa, oligonucleótido específico de alelo, (ASO), análisis de transferencia por puntos, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, RFLP y PCR ^{TM} SSCP.

Cuando se ha aislado un clon que comprende un promotor de acuerdo con la presente invención se contempla que se puede desear delimitar las regiones promotoras esenciales dentro del clon. Un medio eficaz para esto comprende el análisis de supresión. En el análisis de supresión, se preparan una serie de construcciones, conteniendo cada una de ellas una parte diferente del clon (un subclon), y estas construcciones después se rastrean para detectar la actividad del promotor. Un medio adecuado para detectar la actividad es unir las construcciones del promotor suprimido a un marcador que se puede seleccionar o rastrear, y para aislar solamente aquellas células que expresan el gen marcador. De esta manera, se identifican numerosas construcciones de promotor suprimido que todavía retienen la actividad del promotor. El segmento más pequeño que se requiere para la actividad del promotor se identifica por medio de esto mediante la comparación de las construcciones seleccionadas. Este segmento se puede después usar para la construcción de vectores para la expresión de genes exógenos.

II. Procedimientos para preparar promotores con mutagénesis

Se contempla específicamente por el inventor que se puede someter a mutagénesis un promotor de la coixina gamma para mejorar de manera potencial la utilidad del promotor para la expresión de transgenes en maíz. La mutagénesis de promotores de Coixin se puede llevar a cabo al azar y los promotores sometidos a mutagénesis seleccionados para la utilidad en un procedimiento de ensayo por error. Como alternativa, secuencias particulares que proporcionan un promotor Coix con características de expresión deseables se pueden identificar y estas secuencias o similares introducidas en promotores de maíz mediante mutación. Además del maíz, se pueden someter a mutagénesis para que se proporcionen con las características deseables de un promotor Coix. Por ejemplo, se puede someter a mutagénesis un promotor de arroz, avena, sorgo, cebada, o trigo para proporcionar el promotor sometido a mutagénesis con la utilidad potenciada para la expresión de transgenes en maíz.

Los medios para la mutagénesis de un segmento de ADN que codifica un promotor de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las modificaciones a tales regiones del promotor se pueden realizar mediante procedimientos de mutagénesis al azar, o específica del sitio. La región del promotor se puede modificar alterando su estructura mediante la adición o supresión, de uno o más nucleótidos de la secuencia que codifica la región del promotor no modificada correspondiente.

La mutagénesis se puede realizar de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica tal como y no se limitan a la síntesis de un oligonucleótido que tiene una o más mutaciones dentro de al secuencia de una región particular del promotor. En particular, la mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de mutantes de promotores mediante la mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica además proporciona una habilidad capaz de preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, la incorporación de una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes mediante el uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de las mutaciones deseadas, así como, un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia del promotor de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresión que está alterada.

En general, la técnica de la mutagénesis específica de sitio se conoce bien en la técnica, como se ejemplifica mediante diversas publicaciones. Como se apreciará, la técnica típicamente emplea un vector de fago que existe tanto en la forma de una sola hebra como de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente y su uso en general se conoce bien por los expertos en la técnica. Los plásmidos de doble hebra también se emplean de manera rutinaria en la mutagénesis dirigida al sitio que elimina la etapa de transferencia del gen de interés de un plásmido a un fago.

En general, la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con el presente documento se realiza obteniendo primero un vector de una sola cadena o fusión aparte de dos hebras de un vector de dos cadenas que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la región promotora deseada o péptido. Un cebador de de oligonucleótidos que lleva la secuencia mutada deseada se prepara, en general de manera sintética. Este cebador después se hibrida con el vector de una sola cadena, y se sometió a las enzimas de polimerización de ADN tal como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli con el fin de completar la síntesis de la hebra que lleva la mutación. De este modo, se forma un dúplex heterogéneo en el que una hebra codifica la secuencia no mutada original y la segunda hebra lleva la mutación deseada. Este vector dúplex heterogéneo después se usa para transformar o transfectar células apropiadas, tales como células de maíz, y las células se seleccionan para que incluyan vectores recombinantes que llevan la disposición de secuencias mutadas. Se concibe un esquema de selección genética por Kunkel et al, (1987) para enriquecer los clones que incorporan el oligonucleótido mutagénico. Como alternativa, el uso de PCR ^{TM} con enzimas termoestables comercialmente disponibles tales como la Tag polimerasa se pueden usar para incorporar un cebador de oligonucleótido mutagénico en un fragmento de ADN amplificado que después se puede clonar en un vector de clonación o expresión apropiados. Los procedimientos de mutagénesis mediados por PCR ^{TM} de Tomic et al., (1990) y Upender et al., (1995) proporcionan dos ejemplos de tales protocolos. Una PCR ^{TM} que emplea una ligasa termoestable además de una polimerasa termoestable también se puede usar para incorporar un oligonucleótido mutagénico fosforilado en un fragmento de ADN amplificado que después se puede clonar en un vector de clonación o expresión apropiado. El procedimiento de mutagénesis descrito por Michael (1994) proporciona un ejemplo de tal
protocolo.

La preparación de las variantes de secuencias de los segmentos de ADN que codifican el promotor seleccionado que usa mutagénesis dirigida al sitio se proporciona como un medio de producción de especies potencialmente útiles y no significa que sea limitante ya que existen otras formas en las que se pueden obtener las variantes de secuencia de las secuencias de ADN. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia de promotor deseada se puede tratar con agentes mutagénicos, tales como hidoxilamina, para obtener las variantes de secuencias.

Como se usa en el presente documento, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio" se refiere a procedimientos dependientes del molde y propagación mediada por el vector que da como resultado un incremento de la concentración de una molécula de ácido nucleico específica con relación a su concentración inicial, o un incremento en la concentración de una señal detectable, tal como amplificación. Como se usa en el presente documento el término "procedimiento de mutagénesis dirigida al oligonucleótido" también se pretende que se refiera a un procedimiento que implica la extensión dependiente del molde de una molécula de cebador. El término procedimiento dependiente del molde se refiere la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra sintetizada recientemente del ácido nucleico se dicta mediante las reglas bien conocidas del apareamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson y Ramstad, 1987). Típicamente, las metodologías mediadas por vector implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Los ejemplos de tales metodologías se proporcionan por la patente de Estados Unidos Nº 4.237.224. Están disponibles numerosas procedimientos dependientes del molde para amplificar las secuencias diana de interés presentes en una muestra, tales procedimientos se conocen bien en la técnica y se describen en el presente documento a continuación más adelante.

III. Transformación

Existen muchos procedimientos para transformación de segmentos de ADN en células, pero no todas son adecuadas para la distribución de ADN a las células de plantas. Los procedimientos adecuados para uso en la presente invención se cree que incluyen de manera virtual cualquier procedimiento mediante el que el ADN se puede introducir en una célula, tal como mediante la distribución directa de ADN tal como mediante la transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirurulleh et al., 1993), mediante la captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985), mediante electroporación (patente de Estados Unidos nº 5.384.253), mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990, patente de Estados Unidos Nº 5.307.523, y la patente de Estados Unidos Nº 5.464.765, mediante la transformación mediada por Agrobacterium (patente de Estados Unidos Nº 5.591.616 y la patente de Estados Unidos Nº 5.562.055, y mediante la aceleración de partículas revestidas de ADN (patente de Estados Unidos Nº 5.550.318; patente de Estados Unidos Nº 5.538.877; y la patente de Estados Unidos Nº 5.538.880, etc. Por medio la aplicación de las técnicas tales como éstas, las células de maíz así como las de virtualmente cualquier especie vegetal se puede transformar de manera estable, y estas células desarrolladas en plantas transgénicas. En ciertas realizaciones, los procedimientos de aceleración se prefieren e incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles y similares.

(i) Electroporación

Cuando se desea introducir ADN por medio de electroporación, se contempla que el procedimiento de Kryzek et al., (patente de Estados Unidos Nº 5.384.253) será particularmente ventajoso. En este procedimiento, ciertas enzimas que degradan las paredes, tales como enzimas que degradan pectina, se emplean para hacer las células receptoras más susceptibles a la transformación mediante la electroporación que las células no tratadas. Como alternativa, las células receptoras son más susceptibles a la transformación por golpes mecánicos.

Para efectuar la transformación mediante electroporación, se puede emplear o bien tejidos que pueden desintegrar, tales como cultivo en suspensión de células o callo embrionario o como alternativa se pueden transformar embriones inmaduros u otro tejido organizado directamente. En esta técnica, se pueden degradar parcialmente las paredes celulares de las células mediante su exposición a las enzimas que degradan pectinas (pectoliasas) o por golpeo mecánico de una manera controlada. Los ejemplos de algunas especies que se han transformado por electroporación de células intactas incluyen maíz (patente de Estados Unidos Nº 5.384.253; D'Halluin et al., 1992; Rhodes et al., 1995), trigo (Zhoun et al., 1993), tomate (Hou y Lin, 1996), soja (Christou et al., 1987), y tabaco (Lee et al., 1989).

También se pueden empelar protoplastos para la transformación por electroporación de planta (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). Por ejemplo, la generación de plantas de soja transgénicas de protoplastos derivados de cotiledón está descrita por Dhir y Widholm en la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 9217598. Otros ejemplos de especies para los que se han descrito transformación de protoplastos que se han descrito incluyen, cebada (Lazzerri, 1995), sorgo (Battraw et al., 1991), maíz (Bhattacharjee et al., 1997), trigo (He et al., 1994), tomate (Tsukada, 1998), y soja (Dhir et al., 1992).

(ii) Bombardeo de microproyectiles

Un procedimiento preferido para la distribución de los segmentos de ADN de transformación a las células vegetales de acuerdo con la invención es bombardeo de microproyectiles (patente de Estados Unidos Nº 5.550.318; patente de Estados Unidos Nº 5.538.880; patente de Estados Unidos Nº 5.610.042, y solicitud PCT WO 94/09699). En este procedimiento, se pueden revestir las partículas con ácidos nucleicos y distribuirse en las células mediante una fuerza de propulsión. Las partículas ejemplares incluyen las que comprenden tungsteno, platino, y preferiblemente, oro. Se contempla que en algunos casos la precipitación de ADN en las partículas metálicas no serían necesarias para la distribución de ADN a una célula receptora que usa bombardeo de microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas pueden contener ADN en lugar de estar revestidas con ADN. Por lo tanto, se propone que las partículas revestidas con ADN pueden incrementar el nivel de distribución de ADN mediante bombardeo de partículas pero no son necesarios por ellos mismos.

Una realización ilustrativa de un procedimiento para la distribución de ADN en células de maíz mediante aceleración en el Sistema de Distribución de Partículas Biolistic, que se puede usar para la propulsión de partículas revestidas con ADN o células a través de un filtro, tal como un filtro de acero inoxidable o Nytex en una superficie de filtro cubierta con células de plantas monocotiledóneas cultivadas en suspensión. Este filtro dispersa las partículas de manera que no se distribuyen a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que un filtro que interviene entre el aparato proyectil y las células que se van a bombardear reduce el tamaño de los agregados de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación reduciendo el daño infringido a las células receptoras mediante los proyectiles que no son demasiado grandes.

Las técnicas de bombardeo de microproyectiles se pueden aplicar de manera amplia, y se pueden usar para transformar de manera virtual cualquier especie vegetal. Los ejemplos de especies para los que se han transformado por bombardeo de microproyectiles incluyen las especies de plantas monocotiledóneas tales como maíz (Solicitud PCT WO 95/06128), cebada (Ritala et al., Hensgens et al., 1993), trigo (patente de Estados Unidos Nº 5.563.055, arroz (Hensgens et al., 1993), avena (Torber et al.,1995; Torber et al.,1998), arroz (Hensgens et al., 1993), azúcar de caña (Bower et al., 1992), y sorgo (Casa et al, 1993; Hagio et al., 1991), así como un número de plantas dicotiledóneas que incluyen tabaco (Tomes et al., 1990; Buising y Benbow, 1994), soja (patente de Estados Unidos Nº 5.322.783), girasol (Knittel et al., 1994), cacahuete (Singsit et al., 1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (VanEck et al., 1995), y legumbres en general (patente de Estados Unidos Nº 5.563.055).

Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como alternativa, embriones inmaduros u otras células diana se pueden disponer sobre medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se posicionan a una distancia apropiada debajo de la placa de parada de macroproyectiles. Si se desea, uno o más de los filtros se pueden posicionar entre el dispositivo de aceleración y las células, a bombardear.

(iii) Transformación mediada por Agrobacterium

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema aplicable de manera amplia para introducir genes en células vegetales debido a que el ADN se puede introducir en tejidos de plantas enteros, por lo tanto derivando la necesidad de regeneración de una planta intacta de un protoplasto. El uso de vectores de integración de plantas mediado por Agrobacterium para introducir ADN en las células vegetales se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, los procedimientos descritos por Fraley et al, (1985), Roger et al., (1987)y la patente de Estados Unidos nº 5.563.055).

La transformación mediada por Agrobacterium es más eficaz en las plantas dicotiledóneas el procedimiento preferible para la transformación de plantas dicotiledóneas, que incluyen Arabidopsis, tabaco, tomate, y patata. De hecho, aunque la transformación mediada por Agrobacterium se ha usado de manera rutinaria con plantas dicotiledóneas durante numerosos años, solamente ha llegado a ser recientemente aplicable a plantas monocotiledóneas. Ahora se han preparado las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium que son aplicables en casi todas las plantas monocotiledóneas. Por ejemplo, las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium se aplica ahora a arroz (Hiei et al., 1997; Zhang et al., 1997; patente de Estados Unidos Nº 5.591.616), trigo (McCormac et al., 1998), cebada (Tingay et al., 1997; McCormac et al., 1998), y maíz (Ishidia et al., 1996).

Los vectores de transformación de Agrobacterium son capaces de replicación en E. coli así como en Agrobacterium, permitiendo las manipulaciones convenientes como se describe en (Klee et al., 1985). Además los recientes avances en tecnología en vectores para la transferencia de genes mediadas por Agrobacterium han mejorado la disposición de genes y sistios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diversos genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos (Rogers et al., 1987) tienen regiones de múltiples engarces convenientes flanqueados por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes que codifican polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes propósitos. Además, el Agrobacterium que contiene genes Ti tanto armados como desarmados se pueden usar para las transformaciones. En aquellas cepas de plantas donde es eficaz la transformación mediada por Agrobacterium, es el procedimiento de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia del gen.

(iv) Otros procedimientos de transformación

La transformación de los protoplastos vegetales se puede logar usando procedimientos basados en la precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilen glicol, electroporación, y las combinaciones de estos tratamientos (véase por ejemplo, Portrikus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Omirulleh et al., 1993; Fromm et al., 1986, Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987, Marcotte et al., 1988).

La aplicación de estos sistemas a diferentes cepas de plantas depende de la capacidad de regenerar la cepa de planta particular de los protoplastos. Se han descrito los procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimara et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986; Omirulleh et al., 1993 y la patente de Estados Unidos Nº 5.508.184). Los ejemplos del uso de de la transformación de la captación directa de protoplastos de cereales incluyen la transformación de arroz (Ghost - Biswas et al., 1994), sorgo (Battraw y Hall, 1991), cebada (Lazerri, 1995), avena (Zheng y Edwards, 1990) y maíz (Omirulleh et al., 1993).

Para transformar las cepas de plantas que no se pueden regenerar de manera exitosa a partir de protoplastos, se pueden utilizar otras formas de introducir ADN en las células o tejidos intactos. Por ejemplo, se puede efectuar la regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes como se describe en (Vasil, 1989). También, se puede usar transformación mediada por fibra de carburo de silicio con o sin protoplastina (Kaeppler, 1990; Kaeppler et al., 1992; patente de Estados Unidos nº 5.563.055). La transformación con esta técnica se lleva a cabo mediante la agitación de las fibras de carburo de silicio conjuntamente con las células en una solución de ADN. El ADN de manera pasiva entra a medida que la célula se perfora. Esta técnica se ha usado de manera exitosa con, por ejemplo, el maíz de los cereales de plantas monocotiledóneas)Solicitud PCT WO 95/06128; Thompson, 1995) y arroz (Nagatani, 1997).

IV. Optimización de bombardeo por microproyectiles

Para la transformación por bombardeo por microproyectiles de acuerdo con la presente invención se pueden optimizar tanto los parámetros físicos como biológicos. Los factores físicos son aquellos que implican la manipulación del precipitado de ADN/microproyectil o los que afectan la trayectoria y velocidad de tanto los macro- o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicados en la manipulación de las células antes e inmediatamente antes después del bombardeo, tal como el ajuste osmótico de las células diana para ayudar a aliviar el trauma asociado a bombardeo, la orientación de un embrión inmadura u otro tejido diana con relación a la trayectoria de las partículas, y también la naturaleza del ADN de transformación, tal como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se cree que las manipulaciones antes del bombardeo son especialmente importantes para la transformación exitosa de los embriones inmaduros.

De acuerdo con lo anterior se contempla que se puede desear ajustar diversos parámetros de bombardeo a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Se puede desear particularmente ajustar los parámetros físicos tales como concentración de ADN, distancia de hueco, distancia de trayectoria, distancia de tejido, y presión de helio. Si además se contempla que la calidad de helio puede efectuar la transformación eficaz. Por ejemplo diferencias en eficiencias de transformación pueden mostrar entre los bombardeos que usan helio de calidad industrial (99,99% puro) o helio ultra puro (99,999%), aunque no está actualmente claro que sea más ventajoso para uso en bombardeos. También se pueden optimizar los factores de reducción de trauma (TRF) modificando las condiciones que influencian el estado fisiológico de las células receptoras y que por lo tanto pueden influir en las eficacias de transformación e integración. Por ejemplo, el estado somático, hidratación de tejido y la fase de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras se puede ajustar para una transformación óptima.

Tanto los parámetros físicos como biológicos se pueden dirigir para la optimización adicional de la transformación balística. Los factores físicos son aquellos que implican la manipulación del precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan las trayectorias y velocidad de o bien los macro- o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de células inmediatamente antes y después del bombardeo. Las condiciones de cultivo del bombardeo previo, tales como ambiente osmótico, parámetros de bombardeo, y la configuración de plásmido se han ajustado para producir los números máximos de los transformantes estables.

(i) Parámetros físicos 1. Distancia de hueco

El encaje variable (macro soporte) se pude ajustar para variar la distancia entre el disco de ruptura y el macroproyectil, es decir, la distancia de hueco. Esta distancia se puede variar entre 0 y 2 cm. Los efectos predichos de un hueco más corto son un incremento de velocidad de tanto los macro- como microproyectiles, una incremento de onda de choque (que conduce a la interferencia de tejidos e incremento del trauma en tejidos), y una penetración más profunda de microproyectiles. Las distancias de hueco más largas tendrían efectos opuestos pero pueden incrementar la viabilidad y por lo tanto el número total de transformantes estables recuperados

2. Distancia de trayectoria

El encaje fijado (contenido dentro del encaje variable) se puede variar entre 0,5 y 2,25 cm en incrementos de 0,5 cm mediante la colocación de anillos espaciadores para ajustar la ruta de la trayectoria que atraviesa el macroproyectil. Las rutas de trayectoria corta permiten una mayor estabilidad del microproyectil en la trayectoria pero reduce la velocidad global de los microproyectiles. El incremento de estabilidad en la trayectoria incrementa, por ejemplo, el número de focos GUS centrados. Las mayores distancias de trayectoria (hasta algún punto) incrementan la velocidad pero también se incrementa la inestabilidad en la trayectoria. Basándose en la observaciones, se recomienda que los bombardeos típicamente se hacen con una longitud de la ruta en la trayectoria de aproximadamente 1,0 cm y 1,5 cm.

3. Distancia de tejidos

La colocación de tejidos dentro de la cámara del disparo pueden tener efectos significativos en la penetración de microproyectiles. El incremento de la ruta de trayectoria de los microproyectiles disminuirán la velocidad y trauma asociado con la onda de choque. Una disminución en la velocidad también dará como resultado la penetración menos profunda de los microproyectiles.

4. Presión de helio

Mediante la manipulación del tipo y número de los discos de ruptura, la presión se puede variar entre 400 psi (2757,9 kPa) y 2000 psi (13790 kPa) dentro del tubo de aceleración de gas. La presión óptima para la transformación estable se ha determinado que está entre 1000 psi (6894,8 kPa) y 1200 psi (8273,7 kPa).

5. Revestimiento de microproyectiles

Para el bombardeo de microproyectiles, se podrá unir (por ejemplo "revestimiento") ADN a los microproyectiles de manera que se distribuye a células receptoras en una forma adecuada para su transformación. A este respecto, al menos alguno de los ADN de transformación debe estar disponible para la célula diana para que se produzca la transformación, mientras que al mismo tiempo durante la distribución del ADN se debe unir al microproyectil. Por lo tanto, la disponibilidad del ADN de transformación del microproyectil puede comprender la inversión física de enlaces entre el ADN de transformación y el microproyectil después de la distribución del microproyectil a la célula diana. Esto no es necesario que sea el caso, como disponibilidad para que una célula diana se pueda producir como resultado de la ruptura de segmentos no unidos de ADN o de otras moléculas que comprenden la unión física al microproyectil. La disponibilidad se puede además producir como resultado de enlaces entre el ADN de transformación y otras moléculas, que están o bien unidas directamente o indirectamente al microproyectil. Además se contempla que la transformación de una célula diana se puede producir mediante la recombinación directa entre el ADN de transformación y el ADN genómico de la célula receptora. Por lo tanto como se usa en el presente documento, un microproyectil "revestido" será uno que sea capaz de usarse para transformar una célula diana, en la que el ADN de transformación se distribuirá a la célula diana, incluso será accesible para la célula diana de manera que se puede producir la transformación.

Se puede usar cualquier técnica para crear microproyectiles que permiten la distribución de ADN de transformación a las células diana. Los procedimientos para el revestimiento de microproyectiles que se han demostrado que funcionan bien con la invención actual se han descrito específicamente en el presente documento. El ADN se puede unir a partículas de microproyectiles que usan técnicas alternativas, sin embargo. Por ejemplo, las partículas se pueden revestir con estreptavidina y ADN y con cadenas de nucleótidos biotinilados que se pueden escindir con tiol de larga cadena. El ADN se adhiere a las partículas debido a la interacción de estreptavidina - biotina, pero se libera en la célula mediante la reducción del enlace tiol mediante la reducción de los agentes presentes en la célula.

Como alternativa, las partículas se pueden preparar en la funcionalización de la superficie de una partícula de óxido de oro, que proporcionan grupos amina libres. El ADN, una carga fuerte negativa, se une a las partículas funcionarizadas. Además, las partículas cargadas se pueden depositar en las disposiciones controladas sobre la superficie de discos de trayectoria mylar usados en el dispositivo PDS- 1000 Biolistics, facilitando por lo tanto la distribución controlada de las partículas distribuidas al tejido diana.

Como se ha descrito anteriormente, además se proporciona que la concentración de ADN usada para revestir microproyectiles pueden influir en la recuperación de los transformantes que contienen una sola copia del transgen. Por ejemplo, una menor concentración de ADN puede no necesariamente cambiar la eficacia de la transformación, pero en su lugar puede incrementar la proporción de episodios de inserción de una sola copia. A este respecto, aproximadamente entre 1 ng y 2000 de ADN de transformación se puede usar por cada 1,8 mg de microproyectiles de partida. En otras realizaciones de la invención, aproximadamente entre 2,5 ng y 1000 ng, entre 2,5 ng y 750 ng, entre 2,5 ng y 500 ng, entre 2,5 ng y 2750 ng, entre 2,5 ng y 100 ng, o entre 2,5 ng y 50 ng de ADN de transformación se puede usar por cada 1,8 mg de los microproyectiles de partida.

También se pueden usar diversos procedimientos para incrementar la eficacia de transformación y/o incremento de la proporción relativa de los episodios de transformación de baja copia. Por ejemplo, los inventores contemplan el ADN de transformación de modificación final con la fosfatasa alcalina o un agente que terminará el ADN romo antes de la transformación. Incluso además un ADN vehículo inerte se puede incluir con el ADN de transformación, por lo tanto reduciendo la concentración de ADN de transformación sin la reducción de la cantidad global usada. Estas técnicas se describen además en solicitud de la patente de Estados Unidos Nº de serie 08/995.451, presentad el 22 de diciembre de 1997.

(ii) Parámetros biológicos

Las condiciones de cultivo y otros factores puede influir en el estado fisiológico de las células diana y pueden tener profundos efectos en las eficacias de transformación e integración. Primero, el acto de bombardeo puede estimular la producción de etileno que podría conducir al envejecimiento del tejido. La adición de compuestos antietileno pueden incrementar las eficacias de transformación. Segundo, se propone que ciertos puntos en el ciclo celular pueden ser más apropiados para la integración del ADN introducido. Por lo tanto, la sincronización de los productos celulares pueden potenciar la frecuencia de producción de transformantes. Por ejemplo, se puede lograr la sincronización usando tratamiento por frío, reducción del alimento de aminoácidos, u otros agentes que detienen el ciclo celular. Tercero, el grado de hidratación de tejidos también puede contribuir a la cantidad de trauma asociado al bombardeo así como la capacidad de los microproyectiles para penetrar las paredes celulares.

La posición y orientación de un embrión u otro tejido diana con relación a la trayectoria de la partícula también puede ser importante. Por ejemplo el dispositivo biolistics PDS-1000 no produce una difusión uniforme de las partículas sobre la superficie de una placa petri diana. La velocidad las partículas en el centro de la placa es mayor que la velocidad de las partículas a distancias más lejanas del centro de la placa petri. Por lo tanto, es ventajoso estimular el tejido diana en la placa petri de manera que se evite el centro de la placa, denominada por algunos como la "zona de muerte". Además, la orientación del tejido diana con relación a la trayectoria de las dianas también puede ser importante. Se contempla que es deseable orientar el tejido lo más probablemente para regenerar una planta hacia la corriente de las partículas. Por ejemplo el escutelo de un embrión inmaduro comprende las células del mayor potencial embriogénico y por lo tanto se debe orientar hacia la corriente de las partículas.

También se ha reseñado que las células de levaduras ligeramente lisadas el plasma permiten incrementar las eficacias de transformación (Armaleo et al., 1990). Se ha propuesto la hipótesis que el estado osmótico alterado de las células ayudaba a reducir el trauma asociado a la penetración de los microproyectiles. De manera adicional, la fase del crecimiento y ciclo celular puede ser importante con relación a la transformación.

1. Ajuste osmótico

Se ha sugerido que el tratamiento previo osmótico puede reducir de manera potencial la lesión asociada a bombardeo como resultado de la reducción de la presión de turgencia de la célula lisada el plasma. En un estudio previo, el número de células que expresa de manera transitoria GUS se incrementó después del subcultivo tanto en medio reciente como en medio ajustado de manera osmótica (solicitud PCT WO 95/06128. Los tiempos de tratamiento de 90 minu mostraron mayores números de focos que expresan GUS que los tiempos más cortos. Las células incubadas en medio 500 mOSM/Kg durante 90 minutos mostró un incremento de aproximadamente 3,5 veces más en focos transitorios GUS que el control. Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan previamente durante 4 - 5 horas antes del bombardeo en medio de cultivo que contiene sacarosa al 12%. Un segundo cultivo en sacarosa al 12% se realiza durante 16 - 24 horas después del bombardeo. Como alternativa, las células de tipo II se tratan previamente sobre manitol 0,2 M durante 3 - 4 horas antes del bombardeo. Se contempla que el tratamiento previo de clas células con otros solutos activos de manera osmótica durante un período de 1 - 6 horas también puede ser deseable.

2. Configuración de plásmidos

En algunos casos, será deseable administrar ADN a células de maíz que no contienen secuencias de ADN necesarias para el mantenimiento en el vector plásmido en el huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli; tales como genes resistentes a antibióticos, que incluye, pero no se limita a resistencia a amplicilina, kanamicina, y tetraciclina, los orígenes procarióticos de la replicación de ADN. En tales casos, un fragmento de ADN que contiene el ADN de transformación se puede purificar antes de la transformación. Un procedimiento ejemplar de purificación es la electroforesis en gel sobre un gel de agarosa de temperatura de fusión por debajo de 1,2%, seguido de la recuperación a partir del gel de agarosa mediante la fusión de sílices de gel en un exceso de 6 - 10 veces de tampón Tris - EDTA (Tris - HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, 70ºC - 72ºC), congelación y descongelación (37ºC); sedimentar la agarosa por centrifugación. Después se puede usar una columna Quiagen Q-100 para la purificación del ADN. Para la recuperación eficaz del ADN se puede ajustar el flujo de la columna a 40 ml/hora.

Los fragmentos de ADN aislados de ADN se pueden recuperar a partir de los ges de agarosa usando una diversidad de técnicas de electroelución, digestión por enzimas de la agarosa o unión de ADN a cabeceras de vidrio (por ejemplo, Gene Clean. Además también se puede usar HPLC y/o uso de partículas magnéticas para aislar los fragmentos de ADN. Como alternativa para el aislamiento de los fragmentos de ADN, se puede digerir un vector plásmido con una enzima de restricción y este fragmento de ADN se distribuye a células de maíz sin purificación previa del fragmento del módulo de expresión.

V. Células receptoras para la transformación

El cultivo de tejido requiere medios y ambientes controlados. "Medios" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se usan para desarrollar células in vitro, que está, fuera del organismo vivo intacto. El medio usualmente es una suspensión de diversas categorías de ingredientes (sales, aminoácidos, reguladores de crecimiento, azúcares, tampones) que se requieren para el desarrollo de la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, cada tipo de célula específico requiere un intervalo específico de proporciones de ingredientes para el desarrollo, e incluso un intervalo más específico de fórmulas para el desarrollo óptimo. La velocidad del desarrollo celular también variará entre cultivos iniciados con la disposición de medios que permiten el desarrollo de ese tipo de células.

Los medios nutrientes se preparan en forma de un líquido, pero se puede solidificar mediante la adición líquido a materiales capaces de proporcionar un soporte sólido. El agar es el más comúnmente usado para este propósito. Bactoagar, agar Hazelton, Gelrite, y Gelgro son tipos específicos de soporte sólido que son adecuados para el desarrollo de células vegetales en el cultivo de tejidos.

Algunos tipos de células se desarrollarán y dividirán o bien en suspensión líquida o en medios sólidos. Como se ha descrito en el presente documento, las células de maíz se desarrollarán en suspensión o sobre un medio sólido, mediante la regeneración de plantas a partir de los cultivos en suspensión requiere la transferencia de medios líquidos a sólidos en algún momento del desarrollo. El tipo y grado de la diferenciación de las células en cultivo estará afectada no solamente por el tipo de medio usado y por el ambiente, por ejemplo, pH, pero también si el medio es sólido o líquido. La Tabla 2 ilustra la composición de diversos medios útiles para la creación de células receptoras y para la regeneración vegetal.

Las dianas de las células receptoras incluyen, pero no se limitan a, células de meristemo, que incluye en ápice de la raíz (patente de Estados Unidos Nº 5.736.369), callo de Tipo I, Tipo II y Tipo III, embriones inmaduros, y células de gametos tales como microesporas, polen, esperma y células de huevos. Se contempla que cualquier célula a partir de las cuales se puede regenerar una planta fértil es útil como una célula receptora. El callo de Tipo I, Tipo II y Tipo III se puede iniciar a partir fuentes de tejidos que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, meristemos aplicales de plantas de semillero, microesporas y similares. Aquellas células que son capaces de proliferar como callo son también células receptoras para la transformación genética. La presente invención proporciona técnicas para la transformación de embriones inmaduros y la regeneración posterior de plantas transgénicas fértiles. La transformación de embriones inmaduros obvia la necesidad del desarrollo a largo plazo de los cultivos de células receptoras. Polen, así como sus células precursoras, microesporas, pueden ser capaces de de funcionar como células receptoras para la transformación genética, o como vectores que llevan el ADN foráneo para la incorporación durante la fertilización. La transformación del polen directa obvia la necesidad de cultivo de células. Las células de meristemo (es decir, células vegetales capaces de la división celular continuada y se caracteriza por la aparición citológica no diferenciada, que normalmente se encuentra en los puntos de crecimiento o tejidos en las plantas tales como puntas de raíz, ápices del tallo, brotes laterales, etc) pueden representar otro tipo de célula vegetal receptora. Debido a su crecimiento no diferenciado y capacidad de diferenciación y totipotencia de órganos, se puede recuperar una sola célula de meristemo transformada como una planta total transformada. De hecho, se propone que los cultivos embriogénicos en suspensión pueden estar en un sistema de células de meristemos in vitro, que retienen una capacidad para la división celular continuada en un estado no diferenciado, controlado por el ambiente del medio.

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Las células vegetales cultivadas que pueden servir como células receptoras para la transformación con los segmentos de ADN deseados pueden ser cualesquiera células vegetales que incluyen células de maíz, y más específicamente, células de Zea mays L. Las células somáticas son de diversos tipos. Las células embriogénicas son un ejemplo de células somáticas que se pueden inducir para regenerar una planta a través de la formación de embrión. Las células no embriogénicas son las que típicamente son ciertas células de maíz Dulce Mejicano Negro (BMS).

El desarrollo de los callos de maíz embriogénicos y cultivos de suspensión útiles en el contexto de la presente invención, por ejemplo, como células receptoras para la transformación, de ha descrito en la patente de Estados Unidos nº 5.134.074; y la patente de Estados Unidos nº 5.489.520.

Se pueden usar ciertas técnicas que enriquecen células receptoras dentro de una población de células. Por ejemplo, el desarrollo de callo del Tipo II, seguido de la selección manual y cultivo de tejido, friable, embriogénico, en general da como resultado un enriquecimiento de las células receptoras para uso en, la transformación de microproyectiles. Los cultivos en suspensión, que usan de manera particular los medios descritos en el presente documento, puede mejorar la relación de células receptoras a no receptoras en cualquier población dada. Las técnicas de selección manuales que se pueden emplear para seleccionar las células receptoras pueden incluir por ejemplo, determinación de la morfología y diferenciación de células, o se pueden usar medios físicos o biológicos. La crioconservación también es un procedimiento de selección de células receptoras.

La selección manual de las células receptoras, por ejemplo, mediante las células embriogénicas a partir de la superficie de un callo de Tipo II, es un medio que se puede usar en un intento de enriquecer las células receptoras antes del cultivo (si se cultivan sobre un medio sólido o en suspensión). Las células preferidas pueden ser aquellas localizadas en la superficie de un grupo celular, y se puede además poder identificar por su carencia de diferenciación, su tamaño y citoplasma denso. Las células preferidas en general serán aquellas que están menos diferenciadas, o todavía no están destinadas a la diferenciación. De este modo, se puede desear identificar y seleccionar aquellas células que son densas desde el punto de vista citoplásmico, relativamente no vacuolazas con una relación alta de núcleo a citoplasma (por ejemplo, determinada por las observaciones citológicas), pequeñas en tamaño (por ejemplo, 10 - 20 \mum), y capaz de la división sostenida y formación proembionaria somática.

Se propone que también se puedan emplear otros medios para identificar tales células. Por ejemplo, mediante el uso de tintes, tal como azul de Evans, que son expulsados por las células con las membranas relativamente no permeables, tales como células embriogénicas, y se toman por las células relativamente diferenciadas tales como las células de tipo raíz y células de serpiente (así llamadas debido a la apariencia de tipo serpiente).

Otro medio posible de identificación de las células incluyen el uso de marcadores de isozima de células embriogénicas, tales como glutamato deshidrogenasa que se puede detectar mediante cepas histoquímicas (Fransz et al., 1989). Sin embargo, se debe advertir que el uso de marcadores de isozima que incluyen la glutamato deshidrogenasa puede conducir en algún grado de positivos falsos de células no embriogénicas tales como células de raíz que no obstante tienen una actividad relativamente alta metabólica.

(i) Cultivo de células para que sean receptoras de la transformación

La capacidad de preparar y criopreservar los cultivos de células de maíz es importante para ciertos aspectos de la presente invención, porque proporciona un medio para preparar de manera reproducible y exitosa células para la transformación. Se han desarrollado previamente una diversidad de tipos diferentes de medios y se pueden emplear para llevar a cabo diversos aspectos de la invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Medios de cultivo de tejidos que se usan para el desarrollo del callo del Tipo II, desarrollo de cultivos en suspensión y regeneración de células vegetales (particularmente células de maíz)

5

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13

14

Se ha desarrollado un número de cultivos de maíz ejemplares que se puede emplear para la transformación y se describen en la solicitud PCT WO 95/06128.

(ii) Medios

En ciertas realizaciones de la presente invención, se pueden seleccionar células receptoras después del crecimiento en cultivo. Cuando se emplea, las células cultivadas se pueden desarrollar o bien sobre soportes sólidos o en la forma de suspensiones líquidas. En cualquier otro caso, se pueden proporcionar nutrientes a las células en la forma de medio, y condiciones ambientales controladas. Existen muchos tipos de medios de cultivo que comprenden diversos aminoácidos, sales, azúcares, reguladores de crecimiento y vitaminas. La mayoría de los medios empleados en la práctica de la invención tendrán algunos componentes similares (véase la tabla 2), pero pueden diferir en la composición y proporciones de sus ingredientes dependiendo de la aplicación particular contemplada. Por ejemplo, diverso tipos de células que usualmente crecen en más de un tipo de medios, mostrarán diferentes velocidades de crecimiento y diferentes morfologías, dependiendo de los medios de crecimiento. En algunos medios, las células sobreviven pero no se dividen.

Diversos tipos de medios adecuados para el cultivo de células vegetales se han descrito previamente. Los ejemplos de estos medios incluyen, pero no se limitan a, el medio N6 descrito por Chu et al (1975) y medio MS (Murashige y Skoog, 1962). Se ha descubierto que el medio tal como MS que tiene una alta relación de amoníaco /nitrato con contraproductivas para la generación de las plantas receptoras ya que promueven la pérdida de de la capacidad morfogenética. El medio N6, por otra parte tienen una relación algo inferior de amoníaco /nitrato, y se contempla que promueve la generación de las células receptoras manteniendo las células en un estado proembriónico capaz de las divisiones mantenidas.

(iii) Mantenimiento

El procedimiento de mantenimiento de los cultivos de células puede contribuir a su utilidad como fuentes de células receptoras para la transformación. La selección manual de las células para la transferencia a medio de cultivo reciente, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo reciente, composición de medio de cultivo, y factores ambientales que incluyen, pero no se limitan a, calidad y cantidad de luz y temperatura son todos factores importantes para mantener el callo y/o cultivos en suspensión que son útiles como fuentes de células receptoras. Se contempla la alternativa de callo entre las condiciones de cultivo diferentes puede ser beneficioso en el enriquecimiento de las célula receptoras en un cultivo. Por ejemplo, se propone que las células se pueden cultivar en cultivos en suspensión, pero que se transfieren al medio sólido a intervalos regulares. Después de un período de crecimiento sobre medio sólido las células se pueden seleccionar manualmente para regresar al medio de cultivo. Se propone que mediante la repetición de esta secuencia de transferencias al medio de cultivo reciente es posible enriquecer células receptoras. También se contempla que el paso de los cultivos de células a través de un tamiz de 1,9 mm es útil en el mantenimiento de la friabilidad de de un callo o cultivo en suspensión y puede ser beneficioso en el enriquecimiento de las células que se pueden transformar.

(iv) Procedimientos de criopreservación

La criopreservación es importante debido a que permite que se mantenga y preserve un cultivo de células que se puede transformar para uso futuro, mientras que se elimina los efectos acumulativos perjudiciales asociados a los períodos de cultivo extendidos.

Las suspensiones de células y callos se conservan por criogenización usando modificaciones de los procedimientos, reseñados anteriormente (Frinkle, 1985; Withers y King, 1979). El protocolo de la conservación por criogenización comprende la adición de una mezcla enfriada previamente (0ºC) concentrada por etapas durante un período de una a dos horas a las células enfriadas previamente (0ºC). El volumen de los protectores de criogenización añadidos era igual al volumen inicial de la suspensión celular (adición 1:1), y la concentración final de los aditivos protegidos por criogenización era sulfóxido de dimetilo al 10%; polietilen glicol al 10% (6000 de PM), prolina 0,23 M y glucosa 0,23 M y glucosa 0,23 M. la mezcla se dejó que se equilibrara a 0ºC durante 30 minutos, tiempo durante el que la suspensión de células/protegida por criogenización se dividió en alícuota de 1,5 ml (volumen de células empaquetadas 0,5 ml) en crio viales de polietileno de 2 ml. Los tubos se enfriaron a 0,5ºC/minuto hasta -8ºC y se mantuvieron a esta temperatura para la nucleación en hielo.

Una vez que se ha confirmado visualmente la formación de hielo extracelular los tubos se enfriaron A 0,5ºC/minuto entre -8ºC y -35ºC. Se mantuvieron a esta temperatura durante 45 minutos (para asegurar la deshidratación uniforme inducida por congelación mediante los grupos de células).

En este punto, las células habían perdido la mayoría de su volumen osmótico (es decir, existe poco agua libre que quede en el interior de las células), y se podrían sumergir en nitrógeno líquido para almacenamiento. La escasez del agua libre remanente en las células junto con las altas velocidades de enfriamiento rápidas desde -35ºC a -196ºC evitaban que se formaran en las células grandes cristales de hielo organizados. Las células se almacenan en nitrógeno líquido, que inmoviliza de manera eficaz las células y ralentiza los procesos metabólicos hasta el punto en el que el almacenamiento a largo plazo no fuera perjudicial.

La descongelación de la solución extracelular se llevó a cabo retirando el tubo de criogenización del nitrógeno líquido y agitándolo en agua estéril a 42ºC durante aproximadamente 2 minutos. El tubo se retiró del calor inmediatamente después de que los últimos cristales de hielo se hayan fundido para evitar el calentamiento del tejido. La suspensión de células todavía en la mezcla protectora de criogenización) se pipeteó sobre un filtró, quedando una capa de células BMS (la capa de alimento que proporcionó un efecto de alimentación durante la recuperación). La solución protectora de criogenización se retira mediante pipeteo. El medio de cultivo comprendía un medio de proliferación de callo con un incremento de resistencia osmótica. La dilución del protector de criogenización se produjo lentamente a medid que los solutos se difundían hacia fuera a través del filtró y los nutrientes se difundían de manera ascendente hacia las células recuperadas. Una vez que se apreció el posterior crecimiento de las células descongeladas, se transfirió el tejido que se desarrolla al medio de cultivo reciente. Si se deseaba el inicio de un cultivo de suspensión, los grupos de células se volvían transferir al medio de suspensión líquido tan pronto como se haya recuperado la suficiente masa celular (usualmente entre 1 y 2 semanas). Como alternativa, se cultivaron las células sobre medio de proliferación de callo sólido. Después de que se reestableció el cultivo en líquido (entre 1 y 2 semanas adicionales), se usó para experimentos de transformación. Cuando se desee, los cultivos conservado por criogenización previamente se pueden congelar de nuevo para almacenamiento.

VI. Producción y caracterización de maíz transformado de manera estable

Después de efectuar la administración de ADN exógeno a las células receptoras, las siguientes etapas en general se refieren a la identificación de las células transformadas para el cultivo adicional y regeneración de la planta. Como se ha mencionado en el presente documento, con el fin de mejorar la capacidad de identificar los transformantes, se puede desear emplear un gen marcador que se pueda seleccionar y rastrear como, o además de, el gen que se puede expresar de interés. En este caso, se ensayaría en general la población de células transformada potencialmente mediante la exposición de las célula a un agente o agentes selectivos, o se podrían seleccionar las células para el carácter del gen marcador deseado.

(i) Selección

Se cree que al ADN se introduce solamente en un pequeño porcentaje de células diana en cualquier experimento. Con el fin de proporcionar un sistema eficaz para la identificación de las células que reciben ADN e integrarlo en sus genomas se puede emplear un medio para seleccionar aquellas células que se transformen de manera estable. Una realización ejemplar de tal procedimiento es introducir en la célula huésped, un gen marcador que confiera resistencia a algún agente normalmente inhibidor, tal como un antibiótico o herbicida. Los ejemplos de antibióticos que se pueden usar incluyen los antibióticos aminoglicósidos neomicina, kanamicina y paromomicina, o el antibiótico higromicina. Se confiere resistencia a los antibióticos aminoglicósidos mediante las enzimas aminoglicósitos fosfotransferasas tales como la neomicin fosfofosfotransferasa II (NPT II) o NPT I, mientras que la resistencia a higromicina se confiere mediante la higromicin fosfotransferasa.

Las células potencialmente trasformadas se exponen al agente selectivo. En la población de las células supervivientes estarán aquellas en las que, en general, el gen que confiere resistencia se ha integrado y expresado a niveles suficientes para permitir la supervivencia de la célula. Las células se pueden ensayar además para confirmar la integración estable del ADN exógeno. Usando las técnicas descritas en el presente documento, mayor que 40% de embriones bombardeados pueden producir transformantes.

Un herbicida que se ha sugerido como un agente reselección deseable es el herbicida de amplio espectro bialafos. El bialafos es un antibiótico tripeptídico producido por Streptomyces hygroscopicus y está compuesto por fosfinotricin (PPT) un análogo del ácido L-glutámico, y dos restos de L-alanina. Tras la retirada de la L-alanina. Tras la retirada de los restos de L-alanina mediante las peptidasas intracelulares la PPT se libera y es un potente inhibidor de la glutamina sintasa (GS), una enzima central implicada en la asimilación de amoníaco y metabolismo de nitrógeno (Ogawa et al., 1973). La PFT sintética, el ingrediente activo en el herbicida Liberty ^{TM} es también eficaz como un agente de selección. La inhibición de GS en plantas por la PPT provoca la acumulación rápida de amoníaco y la muerte de las células vegetales.

El organismo que produce bialafos y otras especies del género Streptomyces también sintetiza una enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT) que está codificada por el gen bar en Streptomyces hygroscopicus y el gen par en Streptomyces viridochromogenes. El uso del gen de resistencia a herbicida que codifica la fosfinotricin acetil transferasa (PAT) se menciona en el documento DE 3462 829 A, en el que el gen se aísla a partir de Streptomyces viridochromogenes. En el organismo de la fuente bacteriana, esta enzima acetila el grupo amino libre de PPt evitando la autotoxicidad (Thompson et al., 1987). El gen bar se ha clonado (Murakami et al., 1986; Thompson et al., 1987), y expresado en tabaco transgénico, tomate, patata (De Block, 1987) Brassica (De Block, 1989) y maíz (patente de Estados Unidos nº 5.550.318). En reseñas anteriores, algunas plantas transgénicas que expresan el den de resistencia fueron completamente resistentes a las formulaciones comerciales de la PPT y bialafos en
invernadero.

Otro ejemplo de herbicida que es útil para la selección de líneas celulares transformadas en la práctica de la invención es el herbicida de amplio espectro glifosato. El glifosato inhibe la acción de la enzima EPSPS que es activa en la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos. La inhibición de esta enzima conduce a la privación de los aminoácidos fenilalanina, tirosina, y triptófano y los metabolitos secundarios derivados de los mismos. La patente de estados unidos Nº.535.060 describe el aislamiento de las mutaciones de la EPSPS que confiere resistencia a glifosato en el gen de Salmonella typhimurium para EPSPS, aroA. El gen EPSPS se clonó a partir de Zea mays y las mutaciones similares a las encontradas en un gen aroA resistente a glifosato se introdujeron in vitro. Los genes mutantes que codifican las enzimas EPSPS a glifosato se describen en, por ejemplo, la patente internacional WO 97/4103. El gen de EPSPS mutante mejor caracterizado que confiere resistencia a glifosato comprende cambios de aminoácidos en los restos 102 y 106, aunque se anticipa que también serán útiles otras mutaciones (documento PCT/WO97/41103).

Para usar el sistema selectivo bar-bialafos o el EPSPS-glifosato, se cultiva tejido bombardeado durante 0 - 28 días en medio no selectivo y posteriormente se transfiere a un medio que contiene entre 1 - 3 mg/l de bialafos o glifosato 1 - 3 mM según sea apropiado. Aunque los intervalos de 1 - 3 mg/l de bialafos o glifosato 1 - 3 mM serán los preferidos, se propone que los intervalos de 0,1 - 50 mg/l de bialafos o glifosato 0,1 - 50 mM serán de utilidad en al práctica de la invención mM. El tejido se pueden colocar en cualquier soporte poroso, inerte, sólido o semisólido para el bombardeo, que incluyen pero no se limitan a filtros y medio de cultivo sólido. Bialafos y glifosato se proporcionan como ejemplos de agentes adecuados para la selección de transformantes, pro la técnica de esta invención no se limita a ellos.

Además se contempla que el herbicida DALAPON, ácido 2,2- dicloropropiónico, puede ser útil para la identificación de células transformadas. La enzima ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (deh) inactiva la actividad herbicida del ácido 2,2-dicloropropiónico y por lo tanto confiere resistencia a herbicida sobre las células o plantas que expresan un gen que codifica la enzima deshalogenasa (Buchanan - Wollaston et al., 1992; solicitud PCT WO 95/06128; patente de Estados Unidos nº 5.508.468; patente de Estados Unidos 5.508.468.

Como alternativa, un gen que codifica una antranilato sintasa gen que confiere resistencia a ciertos análogos de de aminoácidos, por ejemplo, 5-metiltrptófano o 6-metilantranilato, puede ser útil como un gen marcador. El uso de un gen de antranilato sintasa como un marcador que se puede seleccionar se describió en la patente de Estados Unidos nº 5.508.468; y la solicitud de la patente de Estados Unidos nº 08/604.789.

Un ejemplo de un carácter marcador que se puede rastrear es el pigmento rojo producido bajo el control del locus R en maíz. Este pigmento se puede detectar cultivando las células en un soporte sólido que contiene medio nutriente capaz de soportar el crecimiento en esta fase y seleccionar las células a partir de las colonias que están pigmentadas (agregados visibles de células). Estas células se pueden cultivar además, o bien en suspensión o en un medio sólido. El locus R es útil para la selección de transformantes a partir de embriones inmaduros de bombardeo. De una manera similar, al introducción de los genes C1 y B da como resultado células pigmentadas y/o tejidos.

La enzima luciferasa se puede usar como un marcador que se puede rastrear en el conetexto de la presente invención. En la presencia del sustrato luciferina, las células que expresan la luciferaza emiten luz que se puede detectar sobre una película fotográfica o de rayos X, en un luminómetro (o contador de centelleo líquido), mediante dispositivos que potencian la visión nocturna, o mediante una cámara de vídeo altamente sensible a la luz, tal como una cámara que cuenta fotones. Todos estos ensayos son no destructivos y las células transformadas se pueden cultivar además después de la identificación. La cámara que cuenta fotones es especialmente valiosa ya que permite que se identifiquen células específicas o grupos de células que expresan luciferasa y las manipulan en tiempo real. Otros marcadores que se pueden rastrear que se puede usar es el gen que codifica la proteína fluorescente verde (Sheen et al.,
1995).

Además se contempla que las combinaciones de marcadores que se pueden rastrear y seleccionar serán útiles para la identificación de células transformadas. En algún tipo de célula o tejido, un agente de selección tal como bialafos o glifosato, puede o bien no proporcionar suficiente actividad destructora para limpiamente reconocer las células transformadas o puede provocar sustancial inhibición no selectiva de transformantes y no transformantes indistintamente, provocando de esta manera que la técnica de selección no sea eficaz. Se propone que la selección con un compuesto de inhibición de crecimiento, tal como bialafos o glifosato a concentraciones por debajo de las que provocan el 100% de inhibición seguido del rastreo del tejido de crecimiento para la expresión de un gen marcador que se puede rastrear tal como luciferasa permitiría que se recuperaran transformantes de los tipos de células o tejidos que no son capaces de seleccionarse solos. Se propone que las combinaciones de selección y rastreo puede permitir identificar transformantes en una variedad más amplia de tipos de células y tejidos.

(ii) Regeneración y producción de semillas

Las células que sobreviven a la exposición del agente selectivo, o células que se han catalogado positivas en un ensayo de rastreo, se puede cultivar en medio que soporta la regeneración de las plantas. En una realización ejemplar, los medios MS y N6 se pueden modificar (véase la Tabla 2) incluyendo sustancias adicionales tales como reguladores de crecimiento. Un regulador de crecimiento preferido para tales propósitos es dicamba o 2,4- D. Sin embargo se pueden emplear otros reguladores, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o quizás, incluso picloram. La mejora de los medios de estas o formas similares se ha encontrado que facilitan el crecimiento de las células en las fases de desarrollo específicas. El tejido se puede mantener en un medio básico con reguladores de crecimiento hasta que esté disponible tejido suficiente para comenzar los esfuerzos de regeneración de plantas, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido para la regeneración, al menos 2 semanas, después se transfieren a medios que conducen a la maduración de embrioides. Los cultivos se transfieren cada dos semanas sobre este medio. El desarrollo de los brotes señalará el tiempo para transferir al medio que acrece de reguladores de
crecimiento.

Las células transformadas, identificadas por selección o rastreo y cultivadas en un medio apropiado que soporta la regeneración, se les dejará después madurar en las plantas. Las plántulas que se desarrollan se transfieren a medio de crecimiento de plantas sin tierra, y se endurecen, por ejemplo, en una cámara controlada ambientalmente a aproximadamente 85% de humedad relativa, 600 ppm de CO_{2}, 25 - 250 micoeinsteins m^{-2} s^{-1} de luz. Las plantas preferiblemente maduran o bien en una cámara de crecimiento o en invernadero. Las plantas se regeneran entre aproximadamente 6 semanas y 10 meses después de que se identifica un transformante, dependiendo del tejido inicial. Durante la regeneración, se desarrollan las células sobre medio sólido en recipientes de cultivo de tejidos. Las realizaciones ilustrativas de tales recipientes son placas petri y recipientes de plantas. Las plantas que se están regenerando preferiblemente se desarrollan a aproximadamente 19 a 28ºC. Después de que las plantas que se están regenerando han alcanzado la fase de desarrollo de brote y raíz, se pueden transferir a invernadero para desarrollo adicional y ensayo.

Sin embargo, hay que destacar, que los granos de las plantas transformantes pueden ocasionalmente requerir rescate de embriones debido al cese del desarrollo del grano y envejecimiento prematuro de las plantas. Para rescatar los embriones que se están desarrollando, se escinden de los granos desinfectados en la superficie 10 - 20 días después de la polinización y cultivarse. Una realización del medio usado para cultivar en esta fase comprende sales de MS, sacarosa al 2%, y 5,5 g/l de agarosa. En el rescate de embriones, los embriones grandes (definidos por ser mayores que 3 mm de longitud) se hacen germinar directamente en un medio apropiado. Los embriones más pequeños que esos se pueden cultivar durante 1 semana sobre un medio que contiene el ingrediente anterior junto con ácido abscísico 10^{-5} M y después transferirse a medio sin reguladores de crecimiento para la germinación.

La progenie se puede recuperar a partir de las plantas transformadas y ensayarse para evaluar la expresión del gen exógeno que se puede expresar mediante la aplicación localizada de un sustrato apropiado a las partes de plantas tales como hojas. En el caso de las plantas transformadas bar, se encontró que las plantas transformadas precursoras (R_{O}) y su progenie de cualquier generación ensayada no mostraban ninguna necrosis relacionada con bialafos después de la aplicación localizada de herbicida Basta a las hojas, si existía actividad funcional PAT en las plantas como se determina mediante un ensayo enzimático in vitro. Toda la progenie positiva PAT ensayada contenía bar, confirmando que la presencia de la enzima y la resistencia a bialafos estaban asociadas a la transmisión a través de la línea germinal del gen marcador.

(iii) Caracterización

Para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgen (es)" en las plantas que se están regenerando, se puede realizar una diversidad de ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares", tales como transferencia de Southern y Northern y al PCR ^{TM}; ensayos "bioquímicos" tales como la detección de la presencia de un producto proteico, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISA y transferencias de Western) o mediante función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces, y también, analizando el fenotipo de la planta regenerada entera.

1. Integración de ADN, expresión de ARN y herencia

El ADN genómico se puede aislar a partir de líneas celulares de callos o cualquier parte de planta para determinar la presencia del gen exógeno mediante el uso de técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Hay que destacar que las secuencias intactas no siempre estarán presentes en, presumiblemente debido a la transposición o supresión de secuencias en la célula.

La presencia de elementos de ADN introducidos mediante los procedimientos de esta invención se pueden determinar por la reacción en cadena de al polimerasa (PCR ^{TM}. Usando está técnica se amplifican fragmentos discretos de ADN y se detectan mediante electroforesis de gel. Este tipo de análisis permite que se determine si un gen está presente en un transformante estable, pero no proporciona la integración del gen introducido en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, es al experiencia del inventor, que el ADN se ha integrado en el genoma de todos los transformantes que demuestran la presencia del gen a través del análisis de la PCR ^{TM}. Además, no es posible usar las técnicas de PCR ^{TM} para determinar si los transformantes tienen genes exógenos introducidos en sitios diferentes en el genoma, es decir, si los transformantes son de origen independiente. Se contempla que el uso de las técnicas de la PCR ^{TM} haría posible clonar fragmentos del ADN geonómico huésped adyacente a un gen introducido.

La prueba positiva de integración de ADN en el genoma huésped y las identidades independientes de transformantes se puede determinar usando la técnica de hibridación de Southern. Usando esta técnica secuencias de ADN que se introdujeron en el genoma huésped y que flanquean las secuencias de ADN huésped se pueden identificar. Por lo tanto el patrón de hibridación de Southern de un transformante dado sirve como un identificador característico del transformante. Además es posible mediante la hibridación de Southern demostrar la presencia de genes introducidos en ADN de alto peso molecular, es decir, confirmar que el gen introducido se ha integrado en el genoma de la célula huésped. La técnica de la hibridación de Southern proporciona información que se obtiene usando la PCR ^{TM}, por ejemplo, la presencia de un gen, pero también demuestra la integración en el genoma y caracteriza cada transformante individual.

Se contempla que el uso de las técnicas de hibridación de transferencia de puntos y rastros son modificaciones de las técnicas de hibridación de Southern y pueden obtener la misma información que se deriva de la PCR ^{TM}, por ejemplo, la presencia de un gen.

Tanto las técnicas de la PCR ^{TM} como de hibridación de Southern se pueden usar para demostrar la transmisión de de un transgen a la progenie. En la mayoría de los casos el patrón característico de la hibridación de Southern para un transformante dado se segregará en al progenie como uno o más genes Mendelianos (Spencer et al., 1992) indicando una herencia estable del transgen.

Mientras que las técnicas de análisis de ADN se pueden llevar a cabo usando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN solamente se expresará en células particulares o tipos de tejidos y por lo tanto será necesario preparar ARN para análisis a partir de estos tejidos También se pueden usar las técnicas de la PCR ^{TM} para la detección y cuantificación de ARN producido a partir de los genes introducidos. En esta aplicación de la PCR es primero necesario transcribir de manera inversa el ARN en el ADN, usando enzimas tales como la transcriptasa inversa, y después mediante el uso de técnicas convencionales de la PCR ^{TM} amplificar el ADN. En la mayoría de los casos las técnicas de la PCR ^{TM}, aunque útiles, no demostrarán la integridad del producto del ARN. La información adicional sobre la naturaleza del producto del ARN se puede obtener mediante la transferencia de Northern. Esta técnica demostrará la presencia de una especie de ARN y proporcionará información sobre la integridad del ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede determinar usando hibridaciones de Northern de transferencia de puntos o de rastros. Estas técnicas son modificaciones de transferencia de Northern y solamente demostrarán la presencia o ausencia de una especie de ARN.

2. Expresión de genes

Aunque la transferencia de Southern y la PCR ^{TM} se puede usar para detectar el gen (es) en cuestión, no proporcionan información de si el gen se expresa. La expresión se puede evaluar identificando de manera específica los productos proteicos de los genes introducidos o evaluando los cambios de fenotipo que se llevan a cabo por su expresión.

Los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas, pueden hacer uso de las propiedades físico - químicas, estructurales, funcionales, u otras de al proteína. Las propiedades físico - químicas o estructurales únicas permiten que las proteínas se separen identifiquen mediante procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis de gel nativa o desnaturalizante o localización isoleléctrica, o mediante técnicas cromatográficas tales como cromatografía de intercambio iónico o de exclusión de gel. Las estructuras únicas de las proteínas individuales ofrecen oportunidades para el uso de anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tales como un ensayo de ELISA. Las combinaciones de planteamientos se pueden emplear con incluso mayor especificidad tal como transferencia de Western en al que los anticuerpos se usan para localizar productos génicos individuales que se han separado mediante técnicas electroforéticas. Se pueden emplear técnicas adicionales para confirmar de manera absoluta la identidad del producto de interés tal como la evaluación mediante la secuenciación de aminoácidos después de la purificación. Aunque éstas están entre la mayoría de las empleadas comúnmente, se pueden usar adicionalmente otros procedimientos.

También se pueden usar procedimientos para identificar la expresión de proteínas mediante su funcionalidad especialmente la capacidad de las enzimas para catalizar reacciones químicas específicas que implican sustratos y productos específicos. A estas reacciones pueden seguir la proporción y cuantificación de la pérdida de los sustratos o la generación de los productos de las reacciones mediante procedimientos físicos o químicos. Los ejemplos como varían las enzimas a analizar y pueden incluir los ensayos para evaluar la actividad enzimática de PAT después de la producción de fosfinotricin acetilada marcada radiactivamente a partir de fosfinotricin y ^{14}C-acetil- CoA o para la actividad de la antrinilato sintasa después de la pérdida de la fluorescencia de antranilato, por nombrar dos.

Muy frecuentemente la expresión de un producto génico se determina evaluando los resultados fenotípicos de su expresión. Esos ensayos también pueden tomar muchas formas que incluyen pero no se limitan a analizar los cambios en las composiciones químicas, morfología, o propiedades fisiológicas de la planta. Las composiciones químicas se pueden alterar mediante la expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición de aminoácidos y se pueden detectar mediante análisis de aminoácidos, o mediante enzimas que cambian la cantidad de almidón que se pueden analizar mediante espectrometría de resistencia de infrarrojo próximo. Los cambios morfológicos pueden incluir un tamaño mayor o tallos más gruesos. Muy a menudo los cambios a las respuestas de las plantas o partes de las plantas a imponer tratamientos se evalúan en condiciones cuidadosamente controladas denominadas bioensayos.

VII. Cultivo de plantas de la invención

Además de la transformación directa de un genotipo particular con una construcción de acuerdo con la presente invención, las plantas de la invención se pueden preparar mediante cruzamiento de una planta que tiene una construcción de la invención a una segunda, planta que carece de la construcción. Por lo tanto la presente invención no solamente abarca una planta directamente regenerada a partir de las células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de dicha planta. Como se usa en el presente documento el término progenie significa la descendencia de cualquier generación de una planta precursora preparada de acuerdo con la presente invención. "Cruzamiento" de una planta para proporcionar una línea de plantas que tiene uno o más transgenes añadidos con relación a una línea de plantas, como se ha descrito en el presente documento, se define como las técnicas que dan resultado un transgen de la invención que se introduce en una línea de plantas cruzando una línea de partida con una línea de plantas donadora que comprende un transgen de la invención. Para lograr esto se deberían, en general, realizar las siguientes etapas:

(a): semillas de plantas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de plantas dadora que comprende un transgen de la invención) plantas precursoras;

(b): desarrollar las semillas de la primera y segunda plantas precursoras en las plantas que llevan flores:

(c): polinizar la flor hembra de la primera planta precursora con el polen de la segunda planta precursora; y

(d): recoger las semillas producidas sobre la planta precursora que lleva la flor femenina.

La conversión por retrocruzamiento se define en el presente documento como el procedimiento que incluye las etapas de:

(a): Cruzar una planta del primer genotipo que contiene un gen deseado. La secuencia de ADN o elemento con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado.

(b): Seleccionar uno o más plantas de la progenie que contiene el gen, secuencia de ADN o elemento deseado;

(c): Cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y

(d): Repetir las etapas (b) y (c) para el propósito de transferir dicho ge, secuencia de ADN o elemento deseado de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.

La introgresión de un elemento de ADN en un genotipo de planta se define como el resultado del procedimiento de la conversión por retrocruzamiento. Un genotipo de planta en el que una secuencia de ADN se ha introgresado se puede referir a un genotipo convertido por retrocruzamiento, línea cosanguínea, o híbrido. De manera similar un genotipo de planta que carece de dicha secuencia de ADN deseada también se puede referir a un genotipo, línea, cosanguíneo, o híbrido sin convertir.

VIII. Composiciones transgénicas de plantas

Un avance particularmente importante de la presente invención es que se proporcionan procedimientos mejorados para la expresión de transgenes que incluyen genes marcadores y otros. Tales transgenes serán a menudo genes que dirigen la expresión de una proteína particular o producto polipeptídico, pero también pueden ser no secuencias de ADN que no se pueden expresar, por ejemplo, transposones tales como Ds que dirigen su próxima transposición. Como se usa en el presente documento, un "gen que se puede expresar" es cualquier gen que es capaz de transcribirse en ARN (por ejemplo, ARNm, ARN no codificante, etc) o traducida en un proteína, expresada como un carácter de interés, o similares, etc, y no se limita a genes marcadores que se pueden seleccionar, rastrear o no seleccionar. La también contempla que, cuando tanto un gen que se puede expresar que no es necesariamente un gen marcador se emplea en combinación con un gen marcador, se puede emplear los genes separados sobre cualquiera de los segmentos de ADN iguales o diferentes para la transformación. En el último caso, los vectores diferentes se distribuyen de manera simultánea a células receptoras para maximizar la cotransformación.

La elección de los segmentos de de ADN particulares a distribuir en las células receptoras a menudo dependerán de los propósitos de la transformación. Uno de los principales propósitos de transformación de las plantas forrajeras es añadir algunos caracteres comercialmente deseables, agronómicamente importantes para la planta. Tales caracteres incluyen, pero no se limitan a, resistencia o tolerancia a herbicida, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia a enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos); tolerancia y/o resistencia a estrés, como se ejemplifica mediante la resistencia o tolerancia a la sequía, calor, frío, congelación, humedad excesiva, estrés por sal; estrés oxidante; incremento de producción; contenido y constitución de alimentos; apariencia física; esterilidad masculina; rapidez de secado; capacidad de resistencia; capacidad de proliferación; propiedades de almidón; cantidad y calidad de aceite; y similares. Se puede desear incorporar uno o más genes que confieren tal o tal (es) carácter (es), tales como, por ejemplo, un gen o genes que codifican resistencia a herbicidas.

En ciertas realizaciones, la presente invención contempla la transformación de una célula receptora con más de un gen ventajoso. Dos o más transgenes se pueden suministrar en un solo caso de transformación que usa o bien vectores que codifican transgenes distintos, o que usan un solo vector que incorpora dos o más secuencias codificadoras de genes. De hecho, se pueden emplear según se desee cuales quiera de dos o más transgenes de cualquier descripción, tal como las que confieren resistencia a herbicidas, insectos, enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos) o resistencia a la sequía, esterilidad masculina, rapidez de secado, capacidad de resistencia, capacidad de proliferación, propiedades de almidón, cantidad y calidad de aceite, o las que incrementan la calidad de producción o
nutricional.

Se conoce bien en la técnica que virtualmente cualquier composición de ADN se puede introducir con cualquier técnica de transformación para producir de manera última plantas transgénicas fértiles. La construcción del vector que se puede emplear junto con la presente invención se conoce bien por los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Gelvin et al, 1990). Las técnicas de la presente invención no se limitan de esta manera a cualesquiera de los ADN particulares. Por ejemplo, se pueden emplear los segmentos de ADN en la forma de vectores y plásmidos, o fragmentos de ADN lineales, en algunos casos que contienen solamente el elemento de ADN a expresar en la planta, y similares.

En ciertas realizaciones, se contempla que se puede desear emplear vectores virales competentes de replicación en la transformación de plantas monocotiledóneas. Tales vectores incluyen, por ejemplo, vectores de "lanzadera" del virus del trigo enano (WDF), tales como pW1-11 y PW1-GUS (Ugaki et al., 1991). Estos vectores son capaces de la replicación autónoma en células de maíz así como en E. coli, y como tales pueden proporcionar un aumento de sensibilidad para detectar el ADN administrado a células transgénicas. Un vector de replicación también puede ser útil para la administración de genes flanqueados por las secuencias de ADN a partir de elementos que se pueden transponer tales como Ac, Ds, o Mu. Se ha propuesto (Laufs et al., 1990) que la transposición de estos elementos dentro del genoma de maíz requiere la replicación de ADN. También se contempla que los elementos que se pueden transponder serían útiles para introducir fragmentos de ADN que carecen de los elementos necesarios para la selección y mantenimiento del vector plásmido en bacterias, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y los orígenes de la replicación de ADN. También se propone que el uso de un elemento que se puede transponder tal como Ac, Ds, o Mu promovería de manera activa la integración del ADN deseado y por lo tanto incrementaría la frecuencia de las células transformadas de manera estable.

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Además se contempla que se puede desear cotransformar las plantas sobre células de plantas con 2 o más vectores. La cotransformación se puede lograr usando un vector que contiene el gen marcador y otros genes de interés. Como alternativa, diferentes vectores, por ejemplo, plásmidos pueden contener los diferentes genes de interés, y los plásmidos se pueden administrar de manera simultánea a las células receptoras. Usando este procedimiento, se asume que un cierto porcentaje de células en el que se ha introducido el marcador, también han (ha) recibido el (los) otro (s) gen (es) de interés. De este modo, no todas las células seleccionadas mediante el marcador, expresará los otros genes de interés expresará los otros genes de interés que se han presentado a las células de manera simultánea.

Los vectores, plásmidos, cósmicos, YAC (cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y otros segmentos de ADN para uso en la transformación de células de plantas, por supuesto, en general comprenden el ADNc, gen o genes que se desea (an) para introducir en las células. Estas construcciones de ADN pueden además incluir las estructuras tales como promotores, potenciadores, engarces múltiples, o incluso genes reguladores según se desee. Los segmentos de ADN o gen elegidos para la introducción intracelular a menudo codificarán una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes, tales como las que darán como resultado un carácter que se puede rastrear o seleccionar y/o que impartirán un fenotipo mejorado a la planta regenerada. Sin embargo, éste no puede ser siempre el caso, y la presente invención también abarca plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Los componentes preferidos que se incluyen probablemente con vectores usados en la presente invención son como sigue:

(i) Elementos reguladores

Las construcciones preparadas de acuerdo con la presente invención en general incluirán un promotor que limita la silenciación de los genes en maíz u otra planta monocotiledónea. Como tal, este promotor se aislará a partir de una especie diferente de la planta monocotiledónea en la que se desea la expresión de transgen. Las construcciones preferidas en general incluirán un promotor del género Coix. Los promotores se pueden aislar de novo a partir de Coix, o como alternativa, se puede aislar basándose en los datos de genes o promotores conocidos. Los ejemplos de genes y promotores de plantas monocotiledóneas conocidos que se considera que son útiles de manera particular para el aislamiento de promotores a partir Coix se han descrito de manera específica en el presente documento
anteriormente.

Además de los promotores, otros tipos de elementos pueden regular la expresión génica. Uno de tales elementos es la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el comienzo de la secuencia de codificación, denominada la secuencia guía no traducida. La secuencia guía puede influir en la expresión génica y compilaciones de las secuencias guías se han elaborado para predecir las secuencias óptimas y subóptimas y generar "consenso" y secuencias guías preferidas (Joshi, 1987). Las secuencias guías preferidas están contempladas para que incluyan las que tienen secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, para incluir una secuencia guía de consenso preefriad que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARNm y prevenir el inicio inapropiado de la traducción. La elección de tales secuencias será bien conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Las secuencias que se derivan de los genes que se expresan en gran cantidad en plantas, y en maíz en particular, serán las más preferidas.

Los potenciadores o supresiones de la transcripción de los potenciadores se podrían usar para incrementar la expresión. Los potenciadores a menudo se encuentran en 5' del inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucarióticas, pero a menudo se pueden insertar en la orientación delantera o transversal 5' ó 3' de la secuencia codificadora. En algunos casos, estos elementos potenciadores en 5' son intrones. Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos del promotor CaMV 35S, genes de octopina sintasa (Ellis, et al., 1987), el gen de la actina 1 de arroz, el gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz, el gen de encogimiento del maíz y promotores de eucariotas no vegetales (por ejemplo, levadura; Ma et al., 1988).

Específicamente contemplados para uso de acuerdo con la presente invención son los vectores que incluyen el elemento potenciador de ocs. Este elemento se identificará primero como un potenciador palindrómico de 16 pares de bases del gen de la octopino sintasa (ocs) de Agrobacterium (Ellis et al., 1987), y está presente en la menos otros 10 promotores (Bouchez et al., 1989). Se propone que el uso de un elemento potenciador, tal como el elemento de ocs y particularmente copias múltiples del elemento, se pueden usar para incrementar el nivel de la transcripción de promotores adyacentes cuando se aplica en el contexto de la transformación de plantas monocotiledóneas.

Se contempla que la introducción de secuencias de ADN grandes que comprenden más de un gen puede ser deseable. La introducción de tales secuencias se puede facilitar mediante mediante el uso de cromosomas artificiales bacterianos o de levaduras (BACs o YACs, respectivamente), o sobre cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, el uso de BACs para la transcripción mediada por Agrobacterium se describió en Hamilton et al., (1996).

Por último, los segmentos de ADN más deseables para la introducción en un genoma de monocotiledóneas pueden ser genes homólogos o familias de genes que codifican un carácter deseado (por ejemplo, incremento de producción por acre (0,4047 Hectáreas)), y que se introducen bajo el control de los promotores o potenciadores novedosos de acuerdo con la presente invención. Las regiones reguladoras específicas de tejidos pueden ser particularmente útiles a este respecto. De hecho, se contempla que un uso particular de la presente invención puede ser la producción de transformantes que comprenden un transgen que está dirigido de una manera específica de tejidos. Por ejemplo, los genes resistentes a insectos se pueden expresar de manera específica en el verticilo y tejidos del cuello/vaina que son dianas para la primera y segunda generación, respectivamente, de oruga taladradora de maíz europeo (ECB). Del mismo modo, los genes que codifican las proteínas con actividad particular contra el gusano de la raíz se pueden dirigir directamente a los tejidos de la raíz. Además, la expresión de ciertos genes que afectan a la composición nutricional del grano se debe dirigir a la semilla, por ejemplo, embrión del endospermo.

Los vectores para uso en la dirección específica de tejido de la expresión de genes en plantas transgénicas incluirán típicamente promotores específicos de tejidos y también pueden incluir otros elementos de control específicos de tejidos tales como secuencias de potenciadores. Los promotores que dirigen la expresión específica o potenciada en ciertos tejidos de plantas de acuerdo con la invención se conocerán por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.

También se contempla que la expresión específica de tejidos se puede llevar a cabo de manera funcional introduciendo un gen expresado de manera constitutiva (todos los tejidos) en combinación con un gen no codificante que se expresa solamente en aquellos tejidos en los que el producto del gen no se desea. Por ejemplo, un gen que codifica la proteína de la toxina cristalina a partir de B. thurigiensis (Bt) se puede introducir de manera que se exprese en todos los tejidos usando un promotor constitutivo, por ejemplo con un promotor de actina de Coix. Además, se contempla que los promotores que comprenden elementos de más de un promotor pude ser útil. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.491.288 describe la combinación de un promotor del Virus de Mosaico de Coliflor con un promotor de histona. La expresión de una transcripción no codificante del gen de Bt en un grano de maíz, que usa por ejemplo un promotor zein, prevendría la acumulación de la proteína de Bt en la semilla. Por lo tanto la proteína codificada por el gen introducido estaría presente en todos los tejidos excepto el grano.

Como alternativa, se puede desear obtener secuencias de promotor específicas de tejidos novedosas de Coix para uso de acuerdo con la presente invención. Para lograr esto, se pueden aislar clones de ADNc a partir del tejido de referencia e identificar aquellos clones que se expresan de manera específica en ese tejido, por ejemplo, usando transferencia de Northern. De manera ideal, se desearía identificar un gen que no está presente en un alto número de copias, pero dicho producto génico es relativamente abundante en tejidos específicos. El promotor y elementos de control de los clones genómicos correspondientes se pueden después localizar usando las técnicas de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica.

Otro procedimiento útil para identificar los promotores específicos de tejidos es la representación visual diferencial (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.599.672. En la representación visual diferencial, los ARNm se comparan con diferentes tipos de tejidos. Mediante la identificación de las especies de ARNm que están presentes en solamente un tipo particular de tejido, o conjunto de tipos de tejidos, se pueden identificar los genes correspondientes que se expresan de una manera específica de tejidos. Los ARN se pueden transcribir mediante transcriptasa inversa para producir un ADNc, y el ADNc a su vez se usa para aislar clones que contienen los genes de longitud completa. Como se describe de manera específica en el presente documento, el ADNc también se puede usar para aislar promotores, potenciadores o terminadores homólogos o heterólogos del gen respectivo usando, por ejemplo, la PCR de
supresión.

Se contempla que la expresión de algunos genes en plantas transgénicas se deseará solamente en condiciones específicas. Por ejemplo, se propone que la expresión de ciertos genes que confieren resistencia a factores de estrés ambiental tales como sequía se desearán solamente bajo condiciones de estrés reales. Además se contempla que la expresión de tales genes durante todo el desarrollo de una planta puede tener efectos perjudiciales. Se sabe que existe un gran número de genes que responden al ambiente. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como rbcS, que codifican la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa, se regulan por la luz como se media a través de fotocromo. Otros genes se inducen mediante estímulos secundarios. Por ejemplo, síntesis de ácido abscísico (ABA) está inducida por ciertos factores ambientales, que incluyen pero no se limitan a estrés de agua. Se ha mostrado que un número de genes está inducido por ABA (Skriver y Mundy, 1990). También se anticipa que al expresión de los genes que confieren resistencia a la depredación por insectos se desearía solamente en condiciones de la infestación real. Por lo tanto, para algunos caracteres deseados, será deseable la expresión inducible de los genes en plantas
transgénicas.

Se propone que, en algunas realizaciones de la presente invención, será deseable la expresión de un gen en una planta transgénica solamente en un cierto período de tiempo durante el desarrollo de la planta. El programa de desarrollo está correlacionada frecuentemente con la expresión génica específica de tejidos. Por ejemplo, la expresión de las proteínas de almacenamiento se inicia en el endospermo aproximadamente 10 días después de la
polinización.

También se contempla que puede ser útil para dirigir en ADN él mismo dentro de una célula. Por ejemplo, puede ser útil dirigir el ADN introducido al núcleo ya que esto puede incrementar la frecuencia de la transformación. Dentro del propio núcleo sería útil dirigir un gen con el fin de lograr la integración específica de sitio. Por ejemplo, sería útil tener un gen introducido mediante el reemplazo de la transformación de un gen que existe en la célula.

(ii) Terminadores

Las construcciones incluirán de manera típica el gen de interés con una secuencia de ADN de extremo 3' que actúa como una señal para terminar la transcripción y permiten la poliadenilación del ARNm resultante. Los elementos en 3' más preferidos se contemplan para que sean aquellos del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (números del extremo 3') (Bevan et al., 1983), el terminador para el tránscrito de T7 del gen de la octopino sintasa de Agrobacterium tumefaciens, y el extremo 3' de los genes del inhibidor I o II de la proteasa de patata o tomate. Lo elementos reguladores tales como el intrón 1 de Adh (Callis et al., 1987), intrón de la sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989) o elemento omega de TMV (Gallie et al., 1989), se pueden además incluir cuando se desee. Como alternativa, el terminador se puede aislar de acuerdo con la invención a partir de Coix, como se ha descrito anteriormente para las secuencias de promotor.

Los promotores particularmente preferidos son aquellos que se han aislado de Coix. Por ejemplo, los terminadores de la coixina gamma y terminadores de oleosin 3 de Coix. La clonación de estos terminadores se describe más adelante, en el ejemplo 2 y ejemplo 3. Las secuencias de ácido nucleico de los terminadores de la coixina gamma y oleosin 3 se proporciona, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 17, respectivamente.

(iii) Péptidos de tránsito o de señal

Las secuencias que se agregan a las secuencias codificadoras del gen de resistencia, que se retiran después de la transcripción del producto de traducción inicial y que facilitan el transporte de la proteína en o mediante las membranas intracelulares o extracelulares se denominan secuencias de tránsito (usualmente en las vacuolas, vesículas, plástidos y otros orgánulos intracelulares) t y secuencias de señalización (usualmente al retículo endoplásmico, aparato de Golgi y fuera de la membrana celular). Facilitando el transporte de la proteína en los compartimentos dentro y fuera de la célula, estas secuencias pueden incrementar la acumulación del producto génico que las protege de la degradación proteolítica. Estas secuencias también permiten las secuencias adicionales de ARNm a partir de los genes altamente expresados a unirse a la secuencia codificadora de los genes. Ya que el ARNm que se está traduciendo por los ribosomas es más estable que el ARNm desnudo, la presencia del ARNm que se puede traducir en frente del gen puede incrementar la estabilidad global del tránscrito de ARNm a partir del gen y por lo tanto incrementa la síntesis del producto génico. Ya que las señales transitorias y de señal se retiran usualmente después de la traducción del producto de traducción inicial, el uso de estas secuencias permite la adición de secuencias extra traducidas que pueden no aparecer sobre el polipéptido final. Además se contempla que al dirección de ciertas proteínas puede ser deseable con el fin de potenciar la estabilidad de la proteína (patente de Estados Unidos Nº
5.545.818).

De manera adicional, los vectores se pueden construir y emplear en la dirección intracelular de un producto génico específico dentro de las células de una planta transgénica o en la dirección de una proteína al ambiente extracelular. En general esto se lleva a cabo uniendo una secuencia de ADN que codifica una secuencia peptídico de tránsito o de señal a la secuencia codificadora de un gen particular. El péptido de tránsito, o de señal transportará la proteína a un destino intracelular o extracelular respectivamente, y después de retirará de manera después de la
traducción.

Un ejemplo particular de tal uso se refiere a la dirección de una proteína que confiere resistencia a herbicida, tal como la proteína EPSPS mutante, a un orgánulo particular tal como el cloroplasto en lugar de al citoplasma. Esto se ejemplifica mediante el uso del péptido de tránsito rbcS, el péptido de tránsito de cloroplasto descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.728.925, o el péptido de tránsito optimizado descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.510.471, que confiere la dirección específica de plástico de proteínas. Además, puede ser deseable dirigir ciertos genes responsables de la estabilidad masculina a las mitocondrias, o para dirigir ciertos genes para la resistencia a organismos fitopatogénicos a los espacios extracelulares, o para dirigir proteínas a la vacuola. Un uso adicional se refiere a la dirección de las enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos o síntesis de aceite al plástico. Tales enzimas incluyen la síntesis de la ácido dihidropicolínico sintasa que puede contribuir a incrementar el contenido en lisina de un alimento.

(iv) Genes marcadores

Con el fin de mejorar la capacidad de identificar transformante, se puede emplear un gen marcador de interés que se puede seleccionar o rastrear como, o además de, el gen que se puede expresar. "Genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y de este modo permiten que tales células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar o bien un marcador que se puede seleccionar o que se puede rastrear, dependiendo de si el marcador confiere un carácter que se puede "seleccionar" mediante medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, o similares), o si es simplemente un carácter se puede identificar mediante la observación o ensayo, es decir, "rastreo" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde). Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores se conocen en la técnica y se pueden emplear en la práctica de la invención.

Incluidos dentro de los términos genes marcadores que se pueden seleccionar o rastrear son también genes que codifican un "marcador que se puede secretar" cuya secreción se puede detectar como un medio de identificación o selección para las células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno que se puede secretar que se puede identificar mediante la interacción de anticuerpos, o incluso las enzimas que se pueden secretar que se pueden detectar por su actividad catalítica. Las proteínas que se pueden secretar caen en un número de clases, que incluyen, proteínas pequeñas, que se pueden difundir detectables, por ejemplo, mediante ELISA; las pequeñas enzimas activas que se pueden detectar en una solución extracelular (por ejemplo, \alpha-amilasa, \beta-amilasa, fosfinotricin acetiltransferasa); y las proteínas que se insertan o están atrapadas en al pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia guía tal como la encontrada en la unidad de expresión de extensina o tabaco
PR-S).

Con relación a los marcadores que se pueden secretar y que se pueden seleccionar, el uso de un gen que codifica una proteína que se llega a secuestrar en la pared celular, y que dicha proteína incluye un epítope único se considera que es particularmente ventajosa. Tal marcador de antígeno secretado emplearía de manera ideal una secuencia de epítope que proporcionaría un bajo fondo en el tejido de plantas, una secuencia guía de promotor que impartiría la expresión eficaz y dirección a través de la membrana plasmática, y produciría la proteína que está unida en la pared celular todavía accesible a anticuerpos. Una proteína de la pared secretada de manera normal que se modifica para incluir un epítope único satisfacerla todos estos requerimientos.

Un ejemplo de una proteína adecuada para la modificación de esta manera es la glicoproteína rica en extensina, o hidroxiprolina (PGR). Se prefiere el uso de PGR de maíz (Steifel et al., 1990), ya que esta molécula está bien caracterizada en términos de biología molecular, expresión y estructura de la proteína. Sin embargo, cualquiera de la diversidad de las proteínas de la pared ricas en extensina, y/o glicina (Séller et al., 1989) se podrían modificar mediante la adición de un sitio antigénico para crear un marcador que se puede rastrear.

Una realización ejemplar de un marcador que se puede secretar y rastrear se refiere al uso de una secuencia de maíz que codifica la proteína de la pared PGR, que está modificada para incluir un epítope de 15 residuos de la pro-región de la interleuquina - 1\beta murina (IL-1-\beta). Sin embargo, virtualmente se puede emplear cualquier epítope detectable en tales realizaciones como se selecciona a partir de la variedad extremadamente amplia de combinaciones de antígeno : anticuerpo conocida por los expertos en la técnica. El epítope extracelular único, tanto si se deriva de IL-1-\beta o cualquier otra proteína o sustancia epitópica, se puede después detectar de manera sencilla usando el marcado de anticuerpos junto con los adjuntos cromogénicos o fluorescentes.

1. Marcadores que se pueden seleccionar

Se pueden usar muchos genes marcadores que se pueden seleccionar en relación con la presente invención que incluye, pero no se limita a, un gen neo (Potrykus et al., 1985) que codifica kanamicina, G418, paromomicina, etc.; un gen bar que confiere resistencia a bialafos, una proteína EPSP sintasa (Hinchee et al., 1988) que confiere la resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinil (Stalker et al., 1988); un gen de la acetolactato sintasa mutante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otros compuestos químicos que inhiben la las (Solicitud de Patente Europea 154.204, 1985); un gen DHFR de resistencia a metotrexato (Thillet et al., 1988), un gen de la dalapon deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon; o un gen de antranilato sintasa mutado que confiere resistencia a 5-metil triptófano. Donde se hémela un gen de la EPSP sintasa, se puede conseguir un beneficio adicional mediante la incorporación de un péptido de tránsito de cloroplasto, CTP (patente de Estados Unidos Nº 5.188.642) u OTP (patente de Estados Unidos Nº 5.633.448) y uso de un gen de EPSPS de maíz modificado (solicitud PCT WO 97/04103).

Una realización ilustrativa de los genes marcadores que se pueden seleccionar capaces de ser usados en los sistemas para seleccionar los transformantes son los genes que codifican la enzima fosfinotricin acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces hygroscopicus o el gen pat de Streptomyces viridochromogenes. La enzima fosfinotricin acetil transferasa (PAT) inactiva el ingrediente activo en el herbicida bialafos, fosfinotricin (PPT). La PPT inhibe la glutamina sintetasa, (Murakami et al., 1986; Twell et al., 1989) que provoca la rápida acumulación de amoníaco y muerte celular.

Cuando se desea emplear un gen de resistencia a bialafos en la práctica de la invención, el inventor ha descubierto que los genes particularmente útiles para este propósito son los genes bar o pat que se pueden obtener a partir de especies de Streptomyces (por ejemplo, ATCC Nº 21.705). La clonación del gen bar se ha descrito en el contexto de las plantas (De Block et al., 1987; De Block et al., 1989; la Patente de Estados Unidos Nº 5.550.318).

2. Marcadores que se pueden rastrear

Los marcadores que se pueden rastrear que se pueden emplear incluyen un gen de \beta-glucuronidasa o uidA (GOS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos; un gen del locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., 1988); un gen de la \beta-lactamasa (Sutcliffe, 1978), que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen de la \alpha-amilasa (Ikuta et al., 1990); un gen de tirosina (Katz et al., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa para formar el compuesto melanina fácilmente detectable; un gen de la \beta-galactosidasa, que codifica una enzima para la que existen sustratos cromogénicos, un gen de luciferasa (lux) (Ow et al., 1986), que permite la detección de la bioluminiscencia; un gen de aecuorina (Prasher et al., 1985) que se puede emplear en la detección de biluminiscencia sensible a calcio; o un gen que codifica la proteína fluorescente verde (Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reaichel et al., 1996; Tian et al., 1997; documento WO 97/41228).

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Los genes para el complejo del gen R de maíz se contempla n para que sean particularmente útiles como marcadores que se pueden rastrear. El complejo del gen R en maíz codifica una proteína que actúa para regular la producción de los pigmentos de antocianina en la mayoría de los tejidos de semilla y de plantas. Las variedades de maíz pueden tener una, o como mucho formar alelos R que se combinan para regular la pigmentación de una manera específica del desarrollo y del tejido. De este modo, un gen R introducido en tales células provocará la expresión de un pigmento rojo y, que se incorpora de manera estable, se puede puntuar de manera visual como un sector de color rojo. Si la línea de maíz lleva alelos dominantes para los genes que codifican los intermedios enzimáticos en la ruta de biosíntesis de antocianina (C2, A1, A2, Bz1 y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el locus R, la transformación de cualquier célula a partir de la línea con R dará como resultado la formación de pigmentos rojos. Las líneas ejemplares incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo rg-Stadler y TR112, un derivado K55 que es r-g, g, Pl. Como alternativa, cualquier genotipo de maíz se puede utilizar si los alelos C1 y R se introducen
conjuntamente.

Además se propone que las regiones reguladoras del gen R se pueden emplear en las construcciones quiméricas con el fin de proporcionar mecanismos para con la expresión de genes quiméricos. Se conoce e el locus R más diversidad de expresión fenotípica que en cualquier otro locus (Coe et al., 1988). Se contempla que las regiones reguladoras obtenidas a partir de las regiones 5' al gen estructural R sería valioso en la dirección de la expresión de los genes para, por ejemplo, resistencia a insectos, tolerancia a herbicidas u tras regiones que codifican las proteínas. Para los propósitos de la presente invención, se cree que cualquiera de los miembros de la familia del gen R se pueden emplear de manera exitosa (por ejemplo, P, S, Lc, etc). Sin embargo, el más preferido será en general Sn (particularmente Sn:bol3). Sn es un miembro dominante del complejo del gen R y es similar de manera funcional a los loci R y B porque Sn controla la deposición específica de tejido de los pigmentos antocianina en ciertas células de plántulas y de plantas, por lo tanto, su fenotipo es similar a R.

Un marcador que se puede rastrear adicional contemplado para el uso en la presente invención es la luciferasa de luciérnaga, codificada por el gen lux. La presencia del gen lux en las células transformadas se puede detectar usando, por ejemplo, película de rayos X, contador de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de baja luminosida, cámaras contadoras de fotones o luminometría de múltiples pocillos. También se contempla que este sistema se puede desarrollar para el rastreo de la población para luminescencia, tal como sobre placas de tejidos, o incluso para el rastreo de la planta entera. El gen que codifica la proteína fluorescente verde se contempla como un indicador útil de manera particular (Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al., 1996; Tian et al., 1997; documento WO 97/41228). La expresión de la proteína fluorescente verde se puede visualizar en una célula o planta como fluorescencia después de la iluminación por las longitudes de onda particulares de
luz.

(v) Transgenes para la modificación de plantas monocotiledóneas

Una ventaja particularmente importante de la presente invención es que se proporcionan procedimientos y composiciones para la expresión eficaz en células vegetales de genes además de, diferentes de, los genes marcadores. Tales como transgenes que a menudo serán genes que dirigen la expresión de una proteína particular o producto polipeptídico, pero que también pueden ser segmentos de ADN que no se pueden expresar, por ejemplo, transposones tales como Ds que no dirigen su propia transposición. Como se usa en el presente documento, un gen "que se puede expresar" es cualquier gen que es capaz de que se transcriba en el ARN (por ejemplo, ARNm, ARN no codificante, etc.) o se traduce en una proteína, que se expresa como un carácter de interés, o similares, etc., y no se limita a genes marcadores que se pueden rastrear o no seleccionar. La invención también contempla que, cuando un gen que se puede expresar que no es necesariamente un gen marcador se emplea en combinación con un gen marcador, se pueden emplear los genes separados en o bien el mismo o diferentes segmentos de ADN para la transformación. En el último caso, los vectores diferentes se distribuyen de manera simultánea a las células receptoras para maximizar la
cotransformación.

La elección de los segmentos de ADN particulares a distribuir a las células receptoras a menudo dependerán del propósito de la transformación. Uno de los principales propósitos de transformación de las plantas forrajeras es añadir algunos caracteres comercialmente deseables, agronómicamente importantes a la planta. Tales caracteres incluyen, pero no se limitan a, resistencia o tolerancia a herbicidas; resistencia o tolerancia a insectos; resistencia o tolerancia a enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos); tolerancia y/o resistencia a estrés, como se ejemplifica mediante la resistencia o tolerancia a la sequía, calor, frío, congelación, humedad excesiva, estrés por sal; estrés oxidante; incremento de producción; contenido y constitución de alimentos; apariencia física; esterilidad masculina; rapidez de secado; capacidad de resistencia; capacidad de proliferación; cantidad y calidad de almidón; cantidad y calidad de aceite; cantidad y calidad de proteína; composición de aminoácidos, y similares. Se puede desear incorporar uno o más genes que confieren tal o tal (es) carácter (es), tales como, por ejemplo, un gen o genes que codifican resistencia a herbicidas.

En ciertas realizaciones, la presente invención contempla la transformación de una célula receptora con más de un gen exógeno. Como se usa en el presente documento, un gen "exógeno" es un gen que normalmente se encuentra en el genoma huésped en un contexto idéntico. Por eso, se considera que el gen se puede aislar a partir de una especie diferente de la del genoma huésped, o como alternativa, se aísla del genoma huésped pero que se une de manera operativa a uno o más regiones reguladoras que difieren de las encontradas en el gen nativo no alterado. Dos o más genes exógenos también se pueden suministrar en un solo episodio de transformación usando o bien diferentes vectores que codifican vectores transgénicos, o usando un solo vector que incorpora dos o más genes que codifican secuencias. Por ejemplo, los plásmidos que llevan las unidades de expresión bar y aroA en orientación o bien convergente, divergente, o colineal se conseideran que son particularmente útiles. Además las combinaciones preferidas son las de un gen de resistencia a insectos, tales como un gen Bt, junto con un gen inhibidor de la proteasa tal como pin II, o el uso de bar en combinación con cualquiera de los genes anteriores. Por supuesto, cualquiera de dos o más transgenes de cualquier descripción, tales como los que confieren resistencia a herbicida, insectos, enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos) o resistencia a sequedad, esterilidad masculina, rapidez de secado, capacidad de resistencia, capacidad de proliferación; propiedades de almidón, cantidad y calidad de aceite o las que incrementan la producción o calidad nutricional se pueden emplear según se
desee.

1. Resistencia a herbicidas

Los genes que codifican la fosfinotricina acetiltransferasa (bar y pat), genes de la EPSP sintasa tolerantes a glifosato, el gen gor de la enzima que degrada glifosfato que codifica la glifosato oxidorreductasa, deh (que codifica una enzima deshalogenasa que inactiva dalapon), resistencia herbicidas (por ejemplo, sulfonilurea e imidazilinona) acetolactato sintasa, y genes bxn (que codifican una enzima nitrilasa que degrada bromoxinilo) son buenos ejemplos de los genes resistentes a herbicidas para uso en la transformación. Los genes bor y par codifican una enzima fosfinotricin acetiltransferasa (PAT), que inactiva el herbicida fosfinotricin y evita que este compuesto inhiba las enzimas glutamino sintetasa. La enzima 5-enolpiruvinilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSP sintasa), se inhibe normalmente por el herbicida N-(fosfometil)glicina (glifosato). Sin embargo, se conocen genes que codifican enzimas EPSP sintasa resistentes a glifosato. Estos genes se contemplan de manera particular para uso en la transformación de las plantas monocotiledóneas. El gen deh codifica la enzima dalapon deshalogenasa y confiere resistencia al herbicida dalapon. El gen bxn codifica una enzima nitrilasa específica que convierte bromoxinil en un producto de degradación no
herbicida.

2. Resistencia a insectos

Los genes de resistencia a insectos potenciales que se pueden introducir incluyen los genes de toxina de cristal de Bacillus thuringiensis o genes de BT (Watrud et al., 1985). Los genes Bt pueden proporcionar resistencia a las plagas de lepidópteros o coleópteros tales como la oruga taladradora de Maíz Europeo (ECB). Los genes de la toxina de BT preferidos para uso en tales realizaciones incluyen los genes Cry/A (b) y CryIA (c). Los genes de endotoxina de otras especies de B. thuringiensis que afectan al crecimiento o desarrollo de insectos también se puede emplear a este respecto.

Se contempla que los genes Bt preferidos para uso en los protocolos de transformación descritos en el presente documento en los que la secuencia codificadora se ha modificado para que efectúe un incremento de la expresión en las plantas, y más particularmente, en maíz. Los medios para preparar los genes de síntesis se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.500.365 y la patente de Estados Unidos Nº 5.689.052, cuyas descripciones se incorporan específicamente en el presente documento por referencia en su totalidad. Los ejemplos de tales genes de la toxina de Bt modificados incluyen un gen sintético CryA(b) de Bt (Perlak et al., 1991) y el gen sintético CryA(c) llamado 1800 b (Solicitus PCT WO 95/06128). Algunos ejemplos de otros genes de la toxina de Bt conocidos por los expertos en la técnica se proporcionan en la tabla 3 más
adelante.

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TABLA 3 Genes de la \delta-endotocxina de Bacillus thuringiensis

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TABLA 3 (continuación)

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TABLA 3 (continuación)

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: ^{a}Adaptado de:

: htp//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html.

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Los inhibidores de la proteasa también pueden proporcionar resistencia a insectos (Jonson et al., 1989), y de esta manera tendrán utilidad en la transformación de las plantas. El uso de un gen inhibidor II de la proteasa, pin II, de tomate o patata se contempla que sea particularmente útil. Incluso más ventajoso es el uso de un gen pin II en combinación con un gen de la toxina de Bt, cuyo efecto combinado se ha descubierto en la actividad insecticida sinérgica. Otros genes que codifican inhibidores del sistema digestivo de insectos, o los que codifican enzimas o los co-factores que facilitan la producción de inhibidores, también pueden ser útiles. Este grupo se puede ejemplificar mediante los inhibidores de orizacistina y amilasa tales como los de trigo y cebada.

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También, los genes que codifican lecitinas pueden conferir propiedades adicionales o alternativas insecticidas. Las lecitinas (originalmente denominadas fitohematoglutininas) son proteínas de unión de carbohidratos multivalentes que tienen la capacidad de aglutinar los glóbulos rojos de un intervalo de especies. Las lecitinas se han identificados recientememente como agentes insecticidas con actividad contra los gorgojos, ECB y gusano de la raíz (Murdock et al., 1990; Czapla y Lang, 1990). Los genes de lecitina que se contemplan que son útiles incluyen por ejemplo, aglutina de cebada y germen de trigo (WGA) y lecitinas de arroz (Gatehouse et al., 1984), siendo preferido
WGA.

Los genes que controlan la producción de polipéptidos grandes y pequeños activos contra insectos curando se introducen en las plaga de insectos, tales como por ejemplo, péptidos líticos, hormonas peptídicos y toxinas y venenos, forman otro aspecto de la invención. Por ejemplo, se contempla que la expresión de la hormona juvenil esterasa, que se dirige hacia las partes específicas de los insectos, también puede dar como resultado actividad insecticida, o quizás provocar el cese de la metamorfosis (Hammock et al, 1990).

Los genes que se expresan el maíz transgénico que codifican las enzimas que afectan a la integridad de la cutícula de los insectos forman todavía otro aspecto de la invención. Tales genes incluyen los que codifican, por ejemplo, quitinasa, proteasas, lipasas y también los genes para la producción de nikkromicina, un compuesto que inhibe la síntesis de la quitina, la introducción de cualquiera de las cuales se contempla para producir plantas de maíz resistente a insectos. Los genes que codifican las actividades que afectan a la muda de los insectos, tales como los que afectan a la producción de ecdisteroide UDP-glucosil transferasa, también cae dentro del alcance de los transgenes útiles de la presente invención.

Los genes que codifican las enzimas que facilitan la producción de los compuestos que reducen la calidad nutricional de la planta huésped a las plagas de insectos también están abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, puede ser posible conferir actividad insecticida sobre una planta mediante la alteración de su composición de esteroles. Los esteroles se obtienen por los insectos a partir de su dieta y se usan para la síntesis de hormonas y estabilidad de membranas. Por lo tanto las alteraciones en la composición de esteroles en plantas por la expresión de genes novedosos, por ejemplo los que promueven directamente la producción de esteroles no deseables o los que convierten los esteroles deseables en las formas no deseables, pueden tener un efecto negativo sobre el crecimiento y/o desarrollo de los insectos y por lo tanto dotar a la planta con actividad insecticida. Las lipooxigenasas son enzimas vegetales de origen natural que se ha mostrado que muestran efectos anti nutricional en los insectos y para reducir la calidad nutricional de su dieta. Por lo tanto, las realizaciones adicionales de la invención se refiere a plantas transgénicas con actividad lipooxigenasa potenciada que puede ser resistente a la alimentación de los
insectos.

Tripsacum dactyloides es una especie de pasto que es resistente a ciertos insectos, incluyendo el gusano de la raíz de maíz. Se anticipa que los genes que codifican las proteínas que son tóxicas para los insectos o están implicadas en la biosíntesis de los compuestos tóxicos para los insectos se aislarán de Tripsacum y que estos genes novedosos serán útiles confiriendo resistencia a los insectos. Se sabe que la base de la resistencia a insecto en Tripsacum es genérico, debido a que dicha resistencia se ha transferido a Zea mays mediante cruces sexuales (Branson y Guss, 1972). Además se anticipa que otras especies de cereales, monocotiledóneas o dicotiledóneas pueden tener genes que codifican proteínas que son tóxicas para los insectos que serían útiles para producir plantas de maíz resistentes a insectos.

Los genes adicionales que codifican las proteínas caracterizadas por tener actividad insecticida potencial también se pueden usar como transgenes de acuerdo con ello. Tales genes incluyen, por ejemplo, el inhibidor de la tripsina del garbanzo (CpTI; Hilder et al., 1987) que se puede usar como un impedimento para el gusano de la raíz, los genes que codifican avermectina (Avermectin y Abamectin, Campbell, W. C., Ed., 1989; Ikeda et al., 1987) que puede evidenciar utilidad particular como un impedimento para el gusano de la raíz; los genes de la proteína que inactivan los ribosomas; e incluso los genes que regulan las estructuras de las plantas. El maíz transgénico que incluye genes de anticuerpos contra insectos y los genes que codifican las enzimas que pueden convertir un insecticida no tóxico (pro-insecticida) aplicado al exterior de la planta en un insecticida en el interior de la planta también se
contemplan.

3. Resistencia al ambiente o estrés

La mejora de la capacidad del maíz para tolerar diversos estrés ambientales tal como, pero no se limita a, sequía, humedad en exceso, frío, congelación, alta temperatura, sal y estrés oxidante, también se puede efectuar mediante la expresión de genes novedosos. Se propone que se pueden obtener beneficios en términos de aumento de resistencia a las temperaturas de congelación mediante la introducción de una proteína "anticongelación" tal como el de Winter Flounder (Cutler et al., 1989) o sus derivados de genes sintéticos. La tolerancia al frío también se puede conferir mediante el aumento de expresión de la glicerol-3-fosfato acetiltransferasa en cloroplastos (Wolter et al., 1992). La resistencia a estrés oxidante (a menudo exacerbado por las condiciones tales como temperatura frías en combinación con las intensidades altas de luz) se pueden conferir mediante la expresión de la superóxido dismutasa (Gupta et al., 1993), y s puede mejorar mediante la glutatión reductasa (Bowler et al., 1992). Tales estrategias pueden permitir la tolerancia a la congelación en campos recientemente aparecidos así como la extensión de variedades de producción mayor de maduración tardía a zonas de maduración relativa más temprana.

Se contempla que la expresión de los genes novedosos que afectan favorablemente al contenido en agua de las plantas, potencial de agua total, potencial osmótico, y rigidez potenciará la capacidad de la planta a la tolerancia a la sequía. Como se usa en el presente documento, los términos "resistencia a sequía" y "tolerancia a sequía" se usan para referirse a un aumento de resistencia o tolerancia en plantas al estrés inducida por una reducción en la disponibilidad del agua, cuando se compara con las circunstancias normales, y la capacidad de la planta para funcionar y sobrevivir en ambientes con bajo contenido en agua. En este aspecto de la invención se propone, por ejemplo, que la expresión de los genes que codifican la biosíntesis de solutos osmóticamente activos, tales como los compuestos de poliol, pueden impartir protección contra la sequía. Dentro de esta clase están los genes que codifican la manitol-L-fosfato deshidrogenasa (Lee y Saier, 1982) y trehalosa-6-fosfato sintasa (Kaasen et al., 1992). Mediante la acción posterior de las fosfatasas nativas en la célula o mediante la introducción y expresión conjunta de una fosfatasa específica, estos genes introducidos darán como resultado la acumulación de o bien manitol o trehalosa, respectivamente, las cuales se han documentado bien como compuestos protectores capaces de mitigar los efectos de estrés. La acumulación de manitol en tabaco transgénico se ha verificado y los resultados preliminares indican que las plantas que expresan altos niveles de este metabolito son capaces de tolerar un estrés asmático aplicado (Tarozynski et al., 1992,
1993).

De manera adecuada, la eficacia de otros metabolitos en la protección de cualquier función enzimática (por ejemplo, alanopina o ácido propiónico) o integridad de la membrana (por ejemplo, alanopina) se ha documentado (Loomis et al., 1989), y por lo tanto la expresión de los genes que codifican la biosíntesis de estos compuestos podría conferir resistencia a la sequía de una manera similar a o complementaria al manitol. Otros ejemplos de metabolitos de origen natural que son osmóticamente activos y/o proporciones algún efecto protector durante la sequía y/o desecación incluyen fructosa, eritritol (Coxson et al., 1992), sorbitol, dulcitol (Karsten et al., 1992), glucosilglicerol (Reed et al., 1984; ErdMann et al., 1992)sacarosa, estaquiosa (Koster y Leopold, 1988; Blackmann et al., 1992), rafinosa (Bernal - Lugo y Leopold, 1992), prolina (Rensburg et al., 1993), glicina, betaína, ononitol y pinitol (Vernen y Bonhert, 1992). El crecimiento de la cubierta continuado e incremento del ajuste reproductor durante los momentos de estrés se aumentarán mediante la introducción y expresión de los genes tales como los que controlan los compuestos osmóticamente activos descritos anteriormente y otros de tales compuestos. Los genes actualmente preferidos que promueven la síntesis de un compuesto poliol osmóticamente activo son los genes que codifican las enzimas manitol-1-fosfato deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintasa y mioinositol 0-metiltransfe-
rasa.

Se contempla que la expresión de proteínas específicas también puede incrementar la tolerancia a la sequía. Se han asignado tres clases de Proteínas Embriogénicas Tardías basándose en las similitudes estructurales (véase Dure et al., 1989). Las tres clases de LEA se han mostrado en la maduración (es decir, desecación) de la semillas. Dentro de estos 3 tipos de proteínas de LEA, el Tipo II (tipo dehidrina) se han implicado en general en la tolerancia a la sequía y/o desecación en las partes vegetativas de las plantas (es decir, Mundy y Chua, 1988; Piatkowski et al., 1990; Yamaguchi - Shinozaki et al., 1992). Recientemente, la expresión de una LEA de Tipo III (HVA-1) en tabaco se encontró que influye en la altura de la planta, madurez y tolerancia a la sequía (Fitzpatrick, 1993). En arroz al expresión del gen HVA-1 influía en la tolerancia al déficit de agua y salinidad (Xu et al., 1996). La expresión de los genes estructurales para los tres grupos de LEA pueden por lo tanto conferir tolerancia a la sequía. Otros tipos de proteínas inducidas durante el estrés de agua incluían las tiol proteasas, aldolasas y transportadores de membranas (Guerrero et al., 1990), que pueden conferir diversas funciones protectoras y/o de tipo reparador durante el estrés a sequía. También se contempla que los genes que efectúan la biosíntesis de lípidos y por lo tanto la composición de las membranas también podría ser útil confiriendo resistencia a la sequía en la
planta.

Muchos de estos genes para mejorar la resistencia a la sequía tienen modos complementarios de acción. De este modo, se contempla que las combinaciones de estos genes podría tener efectos aditivos y/o sinérgicos en la mejora de la resistencia a la sequía en maíz. Muchos de estos genes también mejoran la tolerancia (o resistencia) a la congelación; el estrés físico que se contraía durante la congelación y sequía son similares en naturaleza y se pueden mitigar de una manera similar. Se puede conseguir beneficio mediante la expresión constitutiva de estos genes, pero los medios preferidos de expresión de estos genes novedosos pueden ser mediante el uso de un promotor que induce rigidez (tales como los promotores para los genes que inducen rigidez descritos en Guerreo et al., 1990 y Shagan et al., 1993 que se incorporan en el presente documento por referencia). Los patrones de expresión espaciales y temporales de estos genes pueden permitir al maíz que resista mejor el estrés.

Se propone que la expresión de los genes que están implicados con los caracteres morfológicos específicos que permiten el incremento de las extracciones de agua del suelo seco sería beneficioso. Por ejemplo, la introducción y expresión de los genes que alteran las características de la raíz pueden potenciar la captación de agua. También se contempla que la expresión de los genes que potencian el ajuste reproductor durante los momentos de estrés sería de valor significativo. Por ejemplo, la expresión de los genes que mejoran la sincronía del desprendimiento y receptividad de polen de las partes femeninas de las flores, es decir, sedas, sería de beneficio. Además se propone que la expresión de los genes que minimizan la absorción de grano durante los momentos de estrés incrementaría la cantidad de grano a cosechar y por lo tanto ser valioso.

Dado el papel global del agua en al determinación de la producción, se contempla la posibilidad de que el maíz utilice el agua más eficazmente, mediante la introducción y expresión de los genes novedosos, mejorará el comportamiento global incluso cuando la disponibilidad del agua del suelo no está limitada. Se puede producir la introducción de los genes que mejoran la capacidad del maíz de maximizar el uso del agua a través de un intervalo completo de estrés con relación a la disponibilidad del agua, estabilidad o consistencia de la producción del comportamiento de la producción.

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4. Resistencia a enfermedades

Se propone que el incremento de resistencia a las enfermedades se puede realizar mediante la introducción de los genes en las plantas monocotiledóneas tal como maíz. Es posible producir resistencia a las enfermedades provocadas por virus, bacterias, hongos y nemátodos. También se contempla que el control de los organismos que producen micotoxinas se pueden realizar mediante la expresión de los genes introducidos.

La resistencia a los virus se puede producir mediante la expresión de genes novedosos. Por ejemplo, se ha demostrado, que la expresión de una proteína de revestimiento global en una planta transgénica puede impartir resistencia a la infección de la planta mediante ese virus y quizás otros virus relacionados estrechamente (Cuozzo et al., 1988, Hemenway et al., 1988, Abel et al., 1986). Se contempla que la expresión de genes no codificantes dirigidos s la función viral esencial pueden impartir resistencia a dichos virus. Por ejemplo, un gen no codificante dirigido al gen responsable para la replicación de ácido nucleico viral puede inhibir la replicación y conducir a la resistencia al virus. Se cree que la interferencia con otras funciones virales mediante el uso de genes no codificantes también puede incrementar la resistencia a los virus. Además, se propone que puede ser posible lograr la resistencia a virus mediante otros planteamientos, que incluyen, pero no se limitan a, el uso de virus satélites. Los ejemplos de enfermedades de virus y de tipo virus, para las que se puede introducir resistencia en una planta transgénica de acuerdo con la presente invención, se muestran a continuación en la Tabla 4.

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TABLA 4 Enfermedades de virus y de tipo virus

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TABLA 4 (continuación)

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TABLA 4 (continuación)

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TABLA 4 (continuación)

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TABLA 4 (continuación)

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Se propone que el incremento de la resistencia a la enfermedad provocada por bacterias y hongos se puede realizar mediante la introducción de genes novedosos. Se contempla que los genes que codifican los llamados "antibióticos peptídicos", proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), resistencia a toxinas, y proteínas que afectan a las interacciones de patógenos tales como características morfológicas serán útiles. Los antibióticos péptidicos son secuencias de polipéptidos que son inhibidoras del crecimiento de bacterias y otros microorganismos. Por ejemplo, las clases de péptidos se refieren a cecropinas y magaininas que inhiben el crecimiento de muchas especies de bacterias y hongos. Se propone que al expresión de las proteínas de PR en plantas monocotiledóneas tales como maíz pueden ser útiles confiriendo resistencia a la enfermedad bacteriana. Estos genes se inducen después del ataque de patógeno en una planta huésped y se han dividido en al menos cinco clases de proteínas (Bol, Linthorst y Cornelissen, 1990). Se incluyen entre las proteínas de PR \beta-1, 3-glucanasas, quitinasas, y osmotina y otras proteínas que se cree que funcionan en la resistencia a las plantas en los organismos enfermos. Se han identificado otros genes que tienen propiedades antifúngicas, por ejemplo, UDA (lecitina de ortiga picante) y en el documento (Broakaert et al., 1989; Barkai - Golan et al., 1978). Se sabe que ciertas enfermedades de plantas están provocadas por la producción de de fitotoxinas. Se propone que la resistencia a estas enfermedades se lograrían mediante la expresión de un gen novedoso que codifica una enzima capaz de degradar o de otra manera inactivar la fitotoxina. También se contempla que la expresión de genes novedosos que alteran las interacciones entre la planta huésped y patógeno puede ser útil en la reducción de la capacidad del organismo enfermo que invaden los tejidos de las plantas huéspedes, por ejemplo, un incremento en la característica cérea de la cutícula de la hoja u otras características morfológicas. Los ejemplos de enfermedades bacterianas y fúngicas, que incluyen el oidio velloso, para las que se puede introducir resistencia a una planta transgénica de acuerdo con la presente invención, se enumeran a continuación, en las Tablas 5, 6
y 7.

TABLA 5 Enfermedades bacterianas de las plantas

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TABLA 6 Enfermedades fúngicas de las plantas

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TABLA 6 (continuación)

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TABLA 7 Oidio velloso de plantas

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 7 (continuación)

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Los nematodos parásitos de las plantas son una causa de enfermedad en muchas plantas, incluyendo el maíz. Se propone que sería posible preparar las plantas de maíz resistentes a estos organismos mediante la expresión de genes novedosos. Se anticipa que el control de las infestaciones por nematodos se llevaría a cabo alterando la capacidad de los nematodos de reconocer o unirse a una planta huésped y/o permitir que la planta produzca compuestos nematicidas, incluyendo pero sin limitación las proteínas. Los ejemplos de enfermedades de plantas asociadas a nematodos para las que se puede introducir resistencia en una planta transgénica de acuerdo con la invención se proporcionan a continuación, en la Tabla 8.

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TABLA 8 Nematodos parásitos

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TABLA 8 (continuación)

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5. Reducción/eliminación de micotoxinas

La producción de micotoxinas, que incluyen aflatoxina y fumoninisina, mediante hongos asociados a plantas monocotiledóneas tal como maíz es un factor significativo haciendo el grano no útil. Estos organismos fúngicos no provocan síntomas de enfermedad y/o interfieren con el crecimiento de la planta, pero producen compuestos químicos (micotoxinas) que son tóxicas para los animales. Se contempla que la inhibición del crecimiento de estos hongos reduciría la síntesis de estas sustancias tóxicas y por lo tanto reducen las pérdidas de grano debido a la contaminación de micotoxinas. También se propone que puede ser posible introducir genes novedosos en las plantas monocotiledóneas tal como maíz que inhibiría la síntesis de la micotoxina sin interferir con el crecimiento fúngico. Además, se contempla que la expresión de un gen novedoso que codifica una enzima capaz de hacer la micotoxina no tóxica sería útil con el fin de lograr una reducción de la contaminación con micotoxina del grano. El resultado de cualquiera de los mecanismos anteriores sería una presencia reducida de micotoxina en el grano.

6. Composición o calidad del grano

Se pueden introducir genes en las plantas monocotiledóneas, particularmente cereales comercialmente importantes tal como maíz, para mejorar el grano para el que el cereal se desarrolla principalmente. Se puede contemplar un amplio intervalo de plantas transgénicas novedosas producidas de esta manera dependiendo del uso final particular del
grano.

El mayor uso del grano de maíz es para pienso o alimentación. La introducción de genes que alteran la composición del grano puede potenciar en gran medida el valor del pienso o alimentación. Los componentes principales del grano de maíz son almidón, proteína, y aceite. Cada uno de estos componentes primarios del grano de maíz se puede mejorar alterando su nivel o composición. Se pueden mencionar varios ejemplos para propósitos ilustrativos, pero de ninguna manera proporcionan una lista exhaustiva de posibilidades.

La proteína de los granos de cereal que incluye maíz es subóptima para el propósito de pienso o alimentación especialmente cuando se alimentan a cerdos, y humanos. La proteína es deficiente en varios aminoácidos que son esenciales en la dieta de estas especies, requiriendo la adición de los suplementos al grano. La limitación de los aminoácidos esenciales puede incluir lisina, metionina, triptófano, treonina, valina, arginina, e histidina. Algunos aminoácidos llegan a ser limitantes solamente después de que el maíz se suplementa con otras entradas para las formulaciones de pienso. Por ejemplo, cuando el maíz se suplementa con harina de soja para cumplir los requerimientos de lisina la metionina llega a ser limitante. Los niveles de los aminoácidos esenciales en las semillas y grano puede elevarse mediante mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de genes para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos, disminuyen la degradación de los aminoácidos, incrementan el almacenamiento de aminoácidos en las proteínas, o incrementan el transporte de los aminoácidos a las semillas o grano.

Un mecanismo para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos es introducir genes que desregulan las rutas de biosíntesis de aminoácidos de manera que la planta no puede controlar más de manera adecuada los niveles que se producen. Esto se puede hacer mediante etapas de desregulación o desvío en la ruta biosintética de los aminoácidos que están normalmente regulados por los niveles del producto final de los aminoácidos de la ruta. Los ejemplos incluyen la introducción de los genes que codifican versiones desreguladas de las enzimas aspartoquinasas o la ácido dihidropicolínico (DHDP) - sintasa para incrementar la producción de lisina y treonina, y la antranilato sintasa para incrementar la producción de triptófano. La reducción del catabolismo de los aminoácidos se puede llevar a cabo mediante la introducción de secuencias de ADN que reducen o eliminan la expresión de los genes que codifican las enzimas que catalizan las etapas en las rutas catabólicas tal como la enzima lisina - cetoglutarato reductasa. Se anticipa que puede ser deseable dirigir la expresión de los genes con relación a la biosíntesis de aminoácidos al endospermo o embrión de la semilla.. Más preferiblemente, el gen se dirigirá al embrión. También será preferible para los genes que codifican las proteínas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos para dirigir la proteína a un plásmido que usa una secuencia de péptidos de tránsito de plástidos.

La composición proteica del grano se puede alterar para mejorar el equilibrio de los aminoácidos de una diversidad de formas que incluye la elevación de la expresión de las proteínas nativas, disminución de la expresión de aquellas con una pobre composición, cambiando la composición de las proteínas nativas, o introduciendo genes que codifican de manera completa nuevas proteínas que poseen una composición superior. Los ejemplos pueden incluir la introducción de ADN que disminuye la expresión de miembros de la familia zein de las proteínas de almacenamiento. Este ADN puede codificar las ribozimas o secuencias no codificantes dirigidas para alterar la expresión de las proteínas zein o la expresión de reguladores de la expresión de zein tal como el producto del gen opaco - 2. También se propone que la composición de proteína del grano se puede modificar mediante el fenómeno de la supresión conjunta, es decir, la inhibición de la expresión de un gen endógeno mediante la expresión de un gen estructural idéntico o fragmento del gen mediante la transformación (Goring et al., 1991). De manera adicional, el ADN introducido puede codificar enzimas que degradan zein. La disminución en la expresión de zein que se logran puede estar acompañada de incrementos en las proteínas con más composición de aminoácidos deseables o incrementos en otros constituyentes de semillas principales tales como almidón. Como alternativa, se puede introducir un gen quimérico que comprende una secuencia codificadora de una proteína nativa o composición adecuada de aminoácidos tal como para una de las proteínas de globulina o zein delta de 10 kD, zein delta de 20 kD, o zein gamma de 27 kD del maíz y un promotor u otra secuencia reguladora diseñada para elevar la expresión de dicha proteína. La secuencia codificadora de dicho gen puede incluir codones adicionales o de reemplazo para los aminoácidos esenciales. Además, una secuencia codificadora obtenida de otras especies, o, una secuencia sintética parcial o completa que codifica una secuencia única completa de péptidos diseñada para potenciar la composición de aminoácidos de la semilla se puede emplear. Se anticipa que puede ser preferible dirigir la expresión de estos transgenes que codifican las proteínas con una composición superior al endospermo de la semilla.

Puede ser valiosa la introducción de los genes que alteran el contenido en aceite del grano. Los incrementos de contenido en aceite puede dar como resultado incrementos en el contenido de energía metabolizable y densidad de las semillas para uso en el pienso y alimentación. Los genes introducidos pueden codificar enzimas que retiran o reducen las limitaciones de la tasa o etapas reguladas en la biosíntesis de ácidos grasos o lípidos. Tales genes pueden incluir, pero no se limitan a, los que codifican acetil-CoA carboxilasa, ACP-aciltransferasa, \beta-cetoacil ACP sintasa, más otras actividades biosintéticas de ácidos grasos bien conocidas. Otras posibilidades son los genes que codifican las proteínas que no poseen actividad enzimática tal como la proteína portadora de acilo. Se pueden introducir genes que alteran el equilibrio de los ácidos grasos presentes en el aceite que proporciona un forraje más sano o nutritivo. El ADN introducido también puede codificar secuencias que bloquean la expresión de las enzimas implicadas en la biosíntesis de los ácidos grasos, que alteran las proporciones o ácidos grasos presentes en el grano tal como se describe más adelante. Algunos otros ejemplos de los genes contemplados específicamente por los inventares para uso en la creación de plantas transgénicas con caracteres de composición en aceite alterados incluyen 2-acetiltransferasa, oleosina, complejo de piruvato deshidrogenasa, acetil CoA sintasa, ATP citrato liasa, ADP-glucosa pirofosforilasa, y los genes de los intermedios de carnitina-CoA-acetil-CoA. Se anticipa que la expresión de los genes relacionados con la biosíntesis de aceite se dirigirá al plástico, usando una secuencia de péptido de tránsito de plástido, y preferiblemente se expresa en el embrión de la semilla.

Los genes se pueden introducir que potencian el valor nutritivo del componente de almidón del grano, por ejemplo incrementando el grado de bifurcación, dando como resultado la utilización mejorada del almidón en vacas retrasando su metabolismo. Se anticipa que la expresión de los genes relacionados con la biosíntesis de almidón se dirigirá preferiblemente al endospermo de la semilla.

Además de afectar a los constituyentes principales del grano, se pueden introducir genes que afectan a una diversidad de otros aspectos nutritivos, de procesamiento u otros de calidad del grano usado para pienso o alimentación. Por ejemplo, la pigmentación del grano se puede aumentar o disminuir. La potenciación y estabilidad de la pigmentación amarilla es deseable en algunos piensos animales y se puede lograr mediante la introducción de los genes que dan como resultado la producción potenciada de xantofilas y carotenos mediante la eliminación de las etapas que limitan la tasa en su producción. Tales genes pueden codificar formas alteradas de las enzimas fitoeno sintasa, fitoeno desnaturasa, o licopeno sintasa. Como alternativa, el maíz blanco no pigmentado es deseable para la producción de muchos productos de alimentación y se puede producir mediante la introducción de ADN que bloquea o elimina las etapas en las rutas de producción de pigmentos.

La mayoría del contenido en fósforo del grano está en la forma de fitato, una forma de almacenamiento de fosfato que no se metaboliza por los animales monogástricos. Por lo tanto, con el fin de incrementar la capacidad del fosfato de la semilla, se anticipa que se deseará disminuir la cantidad de fitato en semilla e incrementar la cantidad de fósforo libre. Como alternativa, se puede expresar un gen en la semilla de maíz que se activará, por ejemplo, mediante pH, en el sistema gástrico de un animal monogástrico y liberará fosfato a partir de fitato, por ejemplo fitasa.

El pienso o alimento que comprende principalmente maíz u otros granos de cereal posee cantidades insuficientes de vitaminas y se debe suplementar para proporcionar un valor nutritivo adecuado. La introducción de genes que potencia la biosíntesis de vitaminas en semillas se puede contemplar incluyendo, por ejemplo, las vitaminas A, E, B_{12}, colina, y similares. El grano de maíz tampoco posee suficiente contenido mineral para el valor nutritivo óptimo. Serían valiosos los genes que afectan a la acumulación o disponibilidad de los compuestos que contienen fósforo, azufre, calcio, manganeso, cinc, y hierro entre otros. Un ejemplo puede ser la introducción de un gen que reducía la producción de ácido fítico o codificaba la enzima fitasa que potencia la ruptura de ácido fítico. Estos genes incrementarían los niveles de la fosfatasa disponible en la dieta, reduciendo la necesidad de suplemento con fosfato mineral.

Se pueden describir otros numerosos ejemplos de mejora de maíz u otros cereales para los propósitos de pienso y alimentación. Las mejoras pueden no necesariamente incluir el grano, pero pueden, por ejemplo, mejorar el valor del maíz para forraje. La introducción de ADN para llevar a cabo esto podría incluir las secuencias que alteran la producción de lignina tales como las que dan como resultado el fenotipo "vena central marrón" asociado al valor del pienso superior para el ganado.

Además para dirigir las mejoras en el valor del pienso o alimento, también se pueden introducir genes que mejoran el procesamiento de maíz y mejoran el valor de los productos que se producen a partir del procesamiento. El procedimiento principal del procesamiento del maíz es mediante molienda en húmedo. El maíz se puede mejorar mediante la expresión de genes novedosas que incrementan la eficacia y reducir el coste de procesamiento tal como disminuyendo el tiempo de remojo.

La mejora del valor de los productos molidos en húmedo puede incluir la alteración de la cantidad o calidad del almidón, aceite, maíz, harina de gluten, o los componentes del pienso de gluten de maíz. El incremento de almidón se puede lograr mediante la identificación y eliminación de las etapas que limitan la velocidad de la biosíntesis de almidón o disminuyendo los niveles de los otros componentes del grano que dan como resultado incrementos proporcionales en almidón. Un ejemplo de lo anterior puede ser la introducción de los genes que codifican las enzimas ADP-glucosa pirofosforilasas con la alteración de la actividad reguladora o que se expresan a un alto nivel. Los ejemplos de esto último pueden incluir inhibidores selectivos de, por ejemplo, biosíntesis de proteína o aceite que se expresa durante las fases últimas o desarrollo del grano.

Las propiedades del almidón se pueden alterar de manera beneficiosa cambiando la relación de amilasa a amilopectina, el tamaño de las moléculas de almidón, o su patrón de ramificación. Mediante estos cambios se puede modificar un amplio intervalo de propiedades que incluyen, pero no se limitan a, cambios en la temperatura de gelatinización, calor de gelatinización, claridad de películas y pastas, propiedades reológicas, y similares. Para llevar a cabo estos cambios en las propiedades, los genes que codifican la actividad de la sintasa de almidón unida a gránulo o soluble o la actividad de la enzima de ramificación se puede introducir sola o en combinación. El ADN tal como construcciones no codificantes también se pueden usar para disminuir los niveles de la actividad endógena de estas enzimas. Los genes o construcciones introducidos pueden poseer secuencias reguladoras que regulan su expresión a intervalos específicos en la biosíntesis de almidón y desarrollo de gránulos de almidón. Además, puede merecer la pena introducir y expresar genes que dan como resultado la derivación in vivo, u otra modificación, de los restos de glucosa de la molécula de almidón. Se puede contemplar la unión covalente de cualquier molécula, limitado solamente por la existencia de enzimas que catalizan las derivaciones y la accesibilidad de los sustratos apropiados en el gránulo de almidón. Los ejemplos de las derivaciones importantes pueden incluir la adición de grupos funcionales tales como aminas, carboxilos, o grupos fosfato que proporcionan sitios para las derivaciones posteriores in vitro o afectan las propiedades de almidón mediante la introducción de cargas iónicas. Los ejemplos de otras modificaciones pueden incluir los cambios directos de las unidades de glucosa tal como la pérdida de los grupos hidroxilo o su oxidación a los grupos aldehído o carboxilo.

El aceite es otro producto de molienda en húmedo de maíz, el valor del cual se puede mejorar mediante la introducción y expresión de los genes. La cantidad de aceite que se extraer mediante la molienda en húmedo se puede elevar mediante planteamientos como se describe para pienso y alimento anteriormente. Las propiedades de aceite también se pueden alterar para mejorar su comportamiento en la producción y uso de aceite para cocinar, grasa para freír, lubricantes u otros productos derivados de aceite o su mejora, atributos de salud cuando se usa en las aplicaciones relacionadas con los alimentos. Los ácidos grasos novedosos también se pueden sintetizar tras la extracción pueden servir como materiales de partida para la síntesis química. Los cambios en las propiedades del aceite se pueden lograr mediante alteración del tipo, o disposición de lípidos de los ácidos grasos presentes en el aceite. A su vez se puede llevar a cabo mediante la adición de genes que codifican enzimas que catalizan la síntesis de los ácidos grasos novedosos, y los lípidos que los poseen o mediante el incremento de los niveles de ácidos grasos nativos mientras posiblemente se reducen los niveles de los precursores. Como alternativa, se pueden introducir secuencias de ADN que ralentizan o bloquean las etapas de la biosíntesis de ácidos grasos que dan como resultado el incremento de los intermedios de ácidos grasos precursores. Los genes que se podrían añadir incluyen desaturasas, epoxidasas, hidratasas, deshidratasas, y otras enzimas que catalizan las reacciones que implican los intermedios de ácidos grasos. Los ejemplos representativos de las etapas catalíticas que se pueden bloquear incluyen la desnaturalización de ácido esteárico a oleico y ácido oleico a linolénico dando como resultado las acumulaciones representativas de los ácidos esteáricos y oleicos. Otro ejemplo es el bloqueo de las etapas de alargamiento que dan como resultado la acumulación de ácidos grasos saturados de C_{8} a C_{12}.

Las mejoras en los otros productos de molienda en húmedo de maíz principales, harina de gluten de maíz y pienso de gluten de maíz también se pueden conseguir mediante la introducción de genes para obtener plantas de maíz novedosas. Las posibilidades representativas incluyen pero no se limitan a los descritos anteriormente para la mejora del valor del alimento y pienso.

Además, se puede considerar adicionalmente que la planta de maíz a usar para la producción o fabricación de de los compuestos biológicos útiles que o bien no se producirán del todo, o no se producirán al mismo nivel, en la planta de maíz anteriormente. Las plantas de maíz novedosas que producen estos compuestos se hace posible mediante la introducción y expresión de genes mediante procedimientos de transformación de maíz. La vasta disposición de posibilidades incluyen pero no se limitan a cualquier compuesto biológico que se produce actualmente por cualquier organismo tales como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos primarios e intermedios, polímeros de carbohidratos, etc. Los compuestos se pueden producir por la planta, extraerse tras la recolección y/o procesamiento, y usarse para cualquier propósito reconocido actualmente tales como compuestos farmacéuticos, fragancias y enzimas industriales para mencionar unos pocos.

Las posibilidades adicionales para ejemplificar el intervalo de caracteres de grano o propiedades codificadas potencialmente por los genes introducidos en las plantas transgénicas incluyen grano con menos susceptibilidad a la ruptura para propósitos de exportación o tamaño de abrasivo mayor cuando se procesa mediante molienda en seco mediante la introducción de genes que potencian la síntesis de \gamma-zein, palomitas de maíz con una mejora en la calidad de formación de burbujas y volumen de expansión mediante los genes que incrementan el espesor del pericarpio, maíz con grano más blanco para uso alimentarios incluso la introducción de genes que bloquean de manera eficaz la expresión de las enzimas implicadas en las rutas de producción de pigmentos, y calidad mejorada de bebidas alcohólicas o maíz dulce mediante la introducción de genes que afectan al sabor tales como el gen shrunken 1 (que codifica la sacarosa sintasa) o el gen shrunken 2 (que codifica la ADPG pirofosforilasa) para el maíz dulce.

7. Características agronómicas de las plantas

Dos de los factores que determinan cuando el maíz se puede desarrollar son la temperatura diaria media durante la estación de desarrollo y la duración del tiempo entre heladas. Dentro de las áreas en las que es posible desarrollar maíz, existen diversas limitaciones en el tiempo máximo que permite el crecimiento hasta la maduración y que se recolecte. El maíz que se desarrolla en un área particular se selecciona por su capacidad de madurar y secar para reducir el contenido en humedad para que se pueda recolectar dentro del período requerido de tiempo con la producción máxima posible. Por lo tanto, el maíz de maduraciones variables se desarrolla para las diferentes localidades de crecimiento. Aparte de la necesidad de secar los suficientemente para permitir la recolección es deseable que tenga lugar un secado máximo en el campo para minimizar la cantidad de energía requerida para el secado adicional después de la recolección. También, cuanto más fácilmente se puede secar el grano, más tiempo hay disponible para el desarrollo y llenado del grano. Se considera que los genes que influyen en la maduración y/o secado se puede identificar e introducir en las líneas de maíz que usan técnicas de transformación para crear nuevas variedades de maíz adaptadas a los diferentes lugares de crecimiento o el mismo lugar de crecimiento, pero que tienen una mejora en la relación de producción a humedad en la recolección. La expresión de los genes que se implican en la regulación del desarrollo de la planta puede ser especialmente útiles, por ejemplo, los genes de "liguleless" y vaina rugosa que se han identificado en
maíz.

Se contempla que los genes se pueden introducir en las plantas monocotiledóneas que mejorarían las características de soporte y otras características de crecimiento de plantas. La expresión de los genes novedosos que confieren tallos más fuertes, mejora en los sistemas radiculares, o que previenen o reducen de la caída mazorca serían de gran valor para el agricultor. Se propone que sería ventajosa la introducción y expresión de los genes que incrementan la distribución de la luz y/o intercepción. Además, la expresión de los genes que incrementan la eficacia de la fotosíntesis y/o la cubierta de la hoja incrementaría además la productividad de los granos. Se contempla que puede ser ventajoso la expresión de un gen fitocromo en maíz. La expresión de tal gen puede reducir la dominancia apical, conferir semi enanismo en una planta, e incrementar la tolerancia a la sombra (Patente de Estados Unidos Nº 5.268.526). tales planteamientos permitirían el incremento de poblaciones de plantas en el campo.

El retraso en el envejecimiento vegetativo de la temporada incrementaría el flujo de asimilación en el grano y de esta manera incrementar la producción. Se propone que la sobre expresión de los genes en el maíz que se asocian al "verde permanente" o la expresión de cualquier gen que retrasa el envejecimiento sería ventajosa. Por ejemplo, se ha identificado un mutante de no amarillamiento en Festuca pratensis (Davies et al., 1990). La expresión de este gen así como otros puede prevenir la ruptura prematura de la clorofila y de esta manera la función de la cubierta.

8. Utilización de nutrientes

La capacidad de utilizar los nutrientes disponibles puede ser un factor limitante en el desarrollo de las plantas monocotiledóneas tal como maíz. Se propone que sería posible alterar la captación de nutrientes, extremos de tolerancia a pH, movilización a través de la planta, acumulaciones de almacenamiento, y disponibilidad para las actividades metabólicas mediante la introducción de genes novedosos. Estas modificaciones permitirían que una planta tal como maíz para utilizar de una manera más eficaz los nutrientes. Se contempla que un incremento en la actividad de, por ejemplo, una enzima que normalmente está presente en la planta y está implicada en la utilización de nutrientes implicaría la disponibilidad de un nutriente. Como ejemplo de tal enzima estaría la fitasa. Además se contempla que es deseable la potenciación del nitrógeno utilizado por la planta de maíz. La expresión de un gen de la glutamato deshidrogenasa en maíz, por ejemplo, los genes gdhA de E. coli, pueden conducir al incremento de la fijación de nitrógeno en los compuestos orgánicos. Además, la expresión de gdhA en maíz puede conducir a la resistencia potenciada al herbicida glufosinato mediante la incorporación de un exceso de amoníaco en glutamato, por lo tanto destoxificación del amoníaco. También se contempla que la expresión de un gen novedoso puede hacer que una fuente de nutrientes sea disponible que previamente no era accesible, por ejemplo, una enzima que libera un componente de valor nutritivo de más de una molécula compleja, quizás una macromolécula.

9. Esterilidad masculina

La esterilidad masculina es útil en la producción de semilla híbrida. Se propone que la esterilidad masculina se puede producir mediante la expresión de genes novedosos. Por ejemplo, se ha mostrado que la expresión de las genes que codifican las proteínas que interfieren con el desarrollo de la inflorescencia masculina y/o gametofito da como resultado la esterilidad masculina. Los genes de la ribonucleasa quimérica que se expresan en las anteras del tabaco transgénico y aceite de semilla de colza se ha demostrado que conduce a la esterilidad masculina (Mariani et al., 1990).

Se descubrieron numerosas mutaciones en maíz que confieren esterilidad masculina citoplásmica. En particular una mutación, denominada citoplasma T también se relaciona con la sensibilidad a la roya de hojas de maíz Southern. Una secuencia de ADN, denominada TURF-13 (Levings, 1993), se identificó que se correlaciona con el citoplasma T. Se propone que sería posible mediante la introducción de TURF-13 mediante transformación, para separar la esterilidad masculina de la sensibilidad a la enfermedad. Ya que es necesario ser capaz de de restablecer la esterilidad masculina para propósitos de mejora genética y para la producción de grano, se propone que se puedan introducir los genes que codifican el restablecimiento de la fertilidad masculina.

10. Marcadores que se pueden seleccionar negativos

La introducción de los genes que codifican los caracteres que se pueden seleccionar pueden ser útiles para la eliminación de genes unidos no deseables. Se contempla que cuando se introducen os o más genes conjuntamente mediante la transformación conjunta de manera que los genes se unirán conjuntamente en el cromosoma huésped. Por ejemplo, un gen que codifica un gen de Bt que confiere resistencia a insectos en la planta se puede introducir en una planta conjuntamente con un gen bar que es útil como un marcador que se puede seleccionar y confiere resistencia al herbicida Liberty ® en la planta. Sin embargo, puede no ser deseable tener una planta resistente a insectos que también es resistente al herbicida Liberty ®. Se propone que también se puede introducir un gen bar no codificante que se expresa en los tejidos en los que no se desea la expresión del gen bar, por ejemplo en las partes de plantas entera. Por lo tanto, aunque el gen bar se expresa y es útil como un marcador que se puede seleccionar, no es útil para conferir resistencia a herbicidas en la planta entera. El gen no codificante bar es un marcador que se puede seleccionar negativo.

También se contempla que la selección negativa es necesaria con el fin de rastrear una población de transformantes para los recombinantes homólogos generados mediante la dirección de los genes. Por ejemplo, un recombinante homólogo se puede identificar mediante la inactivación de un gen que se expresó previamente en la célula. El gen no codificante para neomicina fosfotransferasa II (NPT II) se ha investigado como un marcador que se puede seleccionar negativo en tabaco (Nicotiana tabacum) y Arabidopsis thaliana (Xiang, y Guerra, 1993). En este ejemplo, tanto los genes NPT II codificantes como no codificantes se introducen en una planta mediante la transformación y las plantas resultantes son sensibles al antibiótico kanamicina. Un gen introducido que se integra en el cromosoma de la célula huésped en el sitio del gen no codificante NPT II, e inactiva el gen no codificante, harán la planta resistente a kanamicina y otros antibióticos aminogicósidos. Por lo tanto, los antibióticos raros, específicos del sitio se pueden identificar mediante rastreo para resistencia a antibióticos. De manera similar, cualquier gen, nativo para la planta o introducido mediante la transformación, que cuando se inactiva confiere resistencia a un compuesto, puede ser útil como un marcador que se puede seleccionar negativo.

Se contempla que los marcadores que se pueden seleccionar negativos también pueden ser útiles de otras formas. Una aplicación es construir líneas transgénicas en las que se puede seleccionar la transposición a sitios no unidos. En el proceso de etiquetado es lo más común para el elemento que se puede transponder que se mueva a un sitio genéticamente se una en el mismo cromosoma. Sería útil un marcador que ser puede seleccionar para la recuperación de las plantas raras en las que la transposición se ha producido a un locus no unido. Por ejemplo, la enzima citosina desaminasa puede se útil para este propósito (Stouggard, 1993). En la presencia de esta enzima el compuesto 5-fluorocitosina se convierte 5-fluorouracilo que es tóxico para la planta y células animales. Si un elemento que se puede transponder se une al gen de la enzima citosina desaminasa, se puede seleccionar para la transposición a sitios no unidos mediante la selección de episodios de transposición en los que la planta resultante es ahora resistente a 5-fluorocitosina. Las plantas precursoras y plantas que contienen transposiciones a los sitios unidos permanecerán sensibles a 5-fluorocitosina. La resistencia a 5-fluorocitosina se debe a la pérdida del gen de la citosina desaminasa mediante la segregación genética del elemento que se puede transponder y el gen de la citosina desaminasa. Otros genes que codifican las proteínas que hacen que la planta sea sensible a un cierto compuesto también será útil en el contexto. Por ejemplo, el gen 2 de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens codifica una proteína que cataliza la conversión de \alpha-naftaleno acetamida (NAM) en ácido \alpha-naftaleno acético (NAA) hace que las células de las plantas sean sensibles a altas concentraciones de NAM (Depicker et al., 1988).

También se contempla que los marcadores que se pueden seleccionar negativos pueden ser útiles en la construcción de líneas de etiquetado de transposones. Por ejemplo marcando un elemento que se puede transponder autónomo tal como Ac, Master Mu, o En/SPn con un marcador que se puede seleccionar negativo, se pueden seleccionar transformantes en los que el elemento autónomo no se integra de manera estable en el genoma. Se propone que sería deseable, por ejemplo, cuando al expresión transitoria del elemento autónomo se desea para activar en trans la transposición de un elemento que se puede transponder defectuoso, tal como Ds, pero no se desea la integración estable del elemento autónomo. La presencia del elemento autónomo puede no ser deseado con el fin de estabilizar el elemento defectuoso, es decir, prevenirlo de una transposición posterior. Sin embargo, se propone que si se desea la integración estable de un elemento que se puede transponder autónomo en una planta la presencia de un marcador que se puede seleccionar negativo puede hacerlo posible para eliminar el elemento autónomo durante del proceso de mejora genética.

(vi) Secuencias que expresan no proteínas 1. Expresión de ARN

El ADN se puede introducir en maíz y otras plantas monocotiledóneas con el fin de expresar tránscritos de ARN que funcionan para afectar el fenotipo de las plantas todavía no traducidos en proteína. Dos ejemplos de ARN y ARN con actividad de ribozima. Ambos pueden servir las funciones posibles en la reducción o eliminación de la expresión de los genes de plantas nativos o introducidos.

Los genes se pueden construir o aislar, que cuando se transcriben, producen ARN no codificante que es complementario a todos (s) o parte (s) de un (os) ARN mensajero (s) dirigido (s). El ARN no codificante reduce la producción del producto polipeptídico del ARN mensajero. El producto polipeptídico puede ser cualquier proteína codificada por el genoma de la planta. Los genes anteriormente mencionados se denominarán genes no codificantes. Un gen no codificante se puede introducir de esta manera en una planta mediante procedimientos de transformación para producir una planta transgénica novedosa con la expresión reducida de una proteína seleccionada de interés. Por ejemplo la proteína puede ser una enzima que cataliza una reacción en la planta. La reducción de la actividad enzimática puede reducir o eliminar productos de la reacción que incluyen cualquier compuesto sintetizado de manera enzimática en la planta tales como ácidos grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y similares. Como alternativa, la proteína puede ser una proteína de almacenamiento, tal como una zein, o una proteína estructural, la disminución de la expresión que puede conducir a cambios en la composición de los aminoácidos de las semillas o cambio morfológicos de las plantas respectivamente. Las posibilidades citadas se proporcionan solamente a modo de ejemplo y no representan el amplio intervalo de aplicaciones.

Los genes también se pueden construir o aislar, cuando se transcriben producen enzimas de ARN, o ribozimas, que pueden actuar como endorribonucleasas y catalizan la escisión de las moléculas de ARN con secuencias seleccionadas. La escisión los ARN mensajeros seleccionados pueden dar como resultado la producción reducida de sus productos polipeptídicos codificados. Estos genes se pueden usar para preparar plantas transgénicas novedosas que los poseen. Las plantas transgénicas pueden poseer niveles reducidos de polipéptidos que incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos citados anteriormente que pueden estar afectados por el ARN no codificante.

También es posible que los genes se pueden introducir para producir las plantas transgénicas novedosas que han reducido la expresión de un producto génico nativo mediante un mecanismo de la supresión conjunta. Se ha demostrado en tabaco, tomate, y petunia (Goring et al., 1991; Smith et al., 1990; Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990) que la expresión del tránscrito codificante de un gen nativo reducirá o eliminará la expresión del gen nativo de una manera similar a la observada para los genes no codificantes. El gen introducido puede codificar toda o parte de la proteína nativa dirigida pero su traducción puede no ser requerida para la reducción de los niveles de su proteína nativa.

2. Expresión no ARN

Los elementos de ADN que incluyen los de los elementos que se pueden transponder tales como Ds, Ac, o Mu, se pueden insertar en un gen para provocar mutaciones. Estos elementos de ADN se pueden insertar con el fin de inactivar (o activar) un gen y por lo tanto "etiquetar" una unidad particular. En este caso el elemento que se puede transponder no provoca la inestabilidad de la mutación etiquetada, debido a la utilidad del elemento no depende de su capacidad para moverse en el genoma. Una vez que se ha etiquetado un carácter deseado, la secuencia de ADN introducido se puede usar para clonar el gen correspondiente, por ejemplo, usando la secuencia de ADN introducida como un cebador de PCR conjuntamente con las técnicas de clonación del gen de PCR (Shapire, 1983; Dellaporta et al., 1988). Una vez identificado (s) el (los) gen (es) entero (s) para el carácter particular, que incluye regiones de control o reguladores cuando se desea, se pueden aislar clonar y manipular según se desee. La utilidad de los elementos de ADN introducidos en un organismo para los propósitos de etiquetado de genes es independiente de la secuencia de ADN y no depende de cualquier actividad biológica de la secuencia de ADN, es decir, la transcripción en ARN o traducción en proteína. La única función del elemento de ADN es romper la secuencia de ADN de un gen.

Se contempla que las secuencias de ADN no expresado, que incluyen secuencias sintéticas novedosas, se pueden introducir en las células como "marcas" de propiedad de sus células y plantas y semillas. No sería necesario que un elemento de ADN con marca rompiera la función de un gen endógeno al organismo huésped, ya que la única función de este ADN sería identificar el origen del organismo. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de ADN única en una planta y este elemento de ADN identificaría todas las células, plantas, y progenie de estas células que han surgido de la fuente marcada. Se propone que la inclusión de los ADN marcados serían capaces de distinguir el plasma germinal de propiedad o plasma germinal derivado de ellos, a partir de plasma germinal no marcado.

Otro posible elemento que se puede introducir es un elemento de región unido a matriz (MAR) tal como el elemento de la lisozima A de pollo (Stief, 1989), que se puede posicionar alrededor de un gen que se puede expresar de interés para efectuar un incremento en la expresión global del gen y disminuir los efectos dependientes de la posición tras la incorporación en el genoma de la planta (Stief et al., 1989; Phi - Van et al., 1990).

IX. Integración específica de la escisión de transgenes

Se contempla de manera específica por los inventores que se pueden emplear técnicas para la integración o escisión específica del sitio de los transgenes preparados de acuerdo con la presente invención. Una ventaja de la integración o escisión específica del sitio es que se puede usar para superar los problemas asociados a las técnicas de transformación convencionales en las que los transgenes típicamente al azar se integran en un genoma huésped y en múltiples copias. Esta inserción al azar del ADN introducido en el genoma de las células huéspedes puede ser letal si el ADN foráneo se inserta en un gen esencial. Además, la expresión de un transgen puede estar influenciada por los "efectos de posición" provocados por el ADN genómico circundante. Además, debido a las dificultades asociadas a la transformación de múltiples copias transgénicas, que incluyen la silenciación de los genes, recombinación y herencia no predecible, es típicamente deseable para controlar el número de copias del ADN insertado, a menudo solamente deseando la inserción de una sola copia de la secuencia de ADN.

La integración o escisión específica del sitio de los transgenes o partes de los transgenes se puede lograr en las plantas mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.527.695, que se incorpora en el presente documento de manera específica por referencia en su totalidad). La recombinación homóloga es una reacción entre cualquier par de secuencias de ADN que tienen una secuencia similar de nucleótidos, cuando las dos secuencias interactúan (se recombinan) para formar una especie de ADN recombinante nueva. La frecuencia de recombinación homóloga se incrementa a medida que la longitud de las secuencias de ADN de nucleótidos compartidas aumenta y es mayor con las moléculas de plásmidos lineales que con las moléculas de plásmidos circulares. Se puede producir la recombinación homóloga entre dos secuencias de ADN que son menos que idénticas, pero la frecuencia de recombinación disminuye a medida que la divergencia entre las dos secuencias aumenta.

Las secuencias de ADN introducidas se pueden dirigir mediante la recombinación homóloga por la unión de una molécula de ADN de interés a las secuencias que comparten homología con las secuencias endógenas de la célula huésped. Una vez que el ADN entra en la célula huésped. Una vez que el ADN entra en la célula, las dos secuencias homólogas pueden interactuar para insertar el ADN introducido en el sitio donde se localizan las secuencias de ADN genómicas homólogas. Por lo tanto, la elección de las secuencias homólogas contenidas en el ADN introducido, determinará el sitio donde el ADN introducido se integra mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, si la secuencia de ADN de interés se limita a las secuencias de ADN que comparten la homología con una sola copia del gen de una célula vegetal huésped, la secuencia de ADN de interés se insertará mediante la recombinación homóloga en solamente ese sitio específico único. Sin embargo, si al secuencia de ADN de interés sed une a las secuencias de ADN que comparten homología con una copia múltiple del gen de la célula eucariótica huésped, después la secuencia del ADN de interés se puede insertar mediante la recombinación homóloga en cada uno de los sitios específicos donde se localiza una copia del gen.

El ADN se puede insertar en el genoma huésped mediante la reacción de recombinación homóloga que implica o bien una sola recombinación recíproca (que da como resultado la inserción de de la longitud entera del ADN introducido) o mediante una recombinación recíproca doble (que da como resultado la inserción de solamente el ADN localizado entre los dos casos de recombinación). Por ejemplo si se desea insertar un gen foráneo en el sitio del genoma donde se localiza un gen seleccionado, el ADN introducido debe contener secuencias homólogas al gen seleccionado. Un solo caso de recombinación homóloga después daría como resultado la secuencia de ADN introducida entera que se inserta en el gen seleccionado. Como alternativa, se puede lograr un caso de recombinación doble flanqueando cada extremo de la secuencia de ADN de interés (la secuencia que se propone que se inserte en el genoma) con las secuencias de ADN homólogas a al gen seleccionado. Un caso de recombinación homóloga que implica cada una de las regiones flanqueantes darán como resultado la inserción del ADN foráneo. De este modo solamente las secuencias de ADN localizadas entre las dos regiones que comparten homología genómica se llegan a integrar en el genoma.

Aunque las secuencias introducidas se pueden dirigir para la inserción en un sitio genómico específico mediante la recombinación homóloga en eucariotas superiores es un caso relativamente raro comparado con los casos de inserción al azar. En las células vegetales, las moléculas de ADN foráneos encuentran secuencias homólogas en el genoma de las células y se recombinan a aproximadamente 0,5 - 4,2 X 10 ^{-4}. De esta manera cualquier célula transformada que contiene una secuencia de ADN introducida integrada mediante la recombinación homóloga también probablemente contendrá numerosas copias de las secuencias de ADN introducidas integradas al azar. Por lo tanto, para mantener el control sobre el número de copias y la localización del ADN insertado, estas secuencias de ADN insertadas al azar se pueden eliminar. Una manera de eliminar estas inserciones al azar es utilizar un sistema de recombinasa específico del sitio. En general, un sistema de recombinasa específico del sitio consta de tres elementos: dos pares de secuencias de ADN (las secuencias de recombinación específicas del sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica del sitio). La recombinasa específica del sitio catalizará una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de recombinación específicas del sitio.

Se puede emplear un número de sistemas de recombinasa específica del sitio de acuerdo con la presente invención, incluyendo, pero sin limitación, el sistema Cre/lox del bacteriófago PI (patente de Estados Unidos Nº 5.658.772, que se incorpora de manera específica en el presente documento por referencia en su totalidad), el sistema FLP/FRT de levadura (Golic y Lindquist, 1989), la Gin recombinasa del fago Mu (Maeser et al., 1991), la Pin recombinasa de E. coli (Enomoto et al., 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki et al., 1992). El bacteriófago P1 Cre/lox y los sistemas de levaduras FLP/FRT constituyen dos sistemas particularmente útiles para la integración o escisión específica del sitio de los transgenes. En estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interactuarán de manera específica con su secuencia de recombinación específica del sitio (lox o FRT respectivamente) para invertir o eliminar las secuencias que intervienen. La secuencia de cada uno de estos dos sistemas es relativamente corta (34 pares de bases para lox y 47 pares de bases para FRT) y por lo tanto, conveniente para el uso con los vectores de transformación.

El sistema de la FLP/FRT recombinasa se ha demostrado que funciona de manera eficaz en las células vegetales. Los experimentos sobre el comportamiento del sistema FLP/FRT en tanto los protoplastos de maíz como de arroz indican que la estructura del sitio FRT, y cantidad de la proteína FLP presente, afecta a la actividad de la eliminación. En general, los sitios de FRT incompletos conducen a una acumulación mayor de los productos de eliminación que los sitios de FRT de longitud completa. Los sistemas pueden catalizar tanto las reacciones intra como intermolecular en los protoplastos de maíz, lo que indica su utilidad para la eliminación del ADN así como las reacciones de integración. La reacción de recombinación es reversible y esta reversibilidad puede comprometer la eficacia de la reacción en cada dirección. La alteración de la estructura de las secuencias de recombinación específicas del sitio es un planteamiento para remediar esta situación. La secuencia de recombinación específica del sitio se puede mutar de manera que el producto de la reacción de recombinación no se reconozca más como un sustrato para la reacción inversa, por lo tanto estabilizando el episodio de integración o exclusión.

En el sistema Cre - lox descubierto en el bacteriófago P1, la recombinación entre los sitios loxP se produce en la presencia de la Cre recombinasa (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 5.658.772). Este sistema se ha utilizado para eliminar un gen localizado entre dos sitios lox que se ha introducido en un genoma de levadura (Sauer, 1987). Cre se expresó a partir de un promotor GAL1 de levadura que se puede inducir y este gen Cre se localizó en un vector de levadura de replicación de manera autónoma.

Ya que el sitio lox es una secuencia asimétrica de nucleótidos, sitios lox en la misma molécula de ADN pueden tener la misma u opuesta orientación con relación entre sí, la recombinación entre los sitios lox en la misma orientación da como resultado una supresión del segmento de ADN localizado entre los dos sitios lox y una conexión entre los extremos resultantes de la molécula de ADN original. El segmento de ADN suprimido forma una molécula de ADN circular. La molécula de ADN original y la molécula de ADN circular resultante contiene cada una un solo sitio lox. La recombinación entre los sitios lox en orientaciones opuestas en la misma molécula de ADN da como resultado una inversión de la secuencia de nucleótidos del segmento de ADN localizado entre los dos sitios lox. Además, se puede producir el intercambio recíproco de los segmentos de ADN próximos a los sitios lox localizados en dos moléculas de ADN diferentes. Todos estos casos de recombinación se catalizan por es producto de la región codificadora Cre.

X. Purificación de las proteínas

Pueden ser deseables en las realizaciones particulares de la presente invención purificar las proteínas codificadas por los transgenes de la presente invención. Como alternativa, las proteínas nativas se pueden aislar a partir de una planta como parte de un esfuerzo para clonar un gen que codifica la proteína aislada, o el promotor que dirige la expresión del gen. Una vez que una proteína está a mano, la proteína se puede secuenciar y la secuencia codificadora del gen deducido. Se pueden producir sondas o cebadores basándose en la secuencia de ADN deducida, permitiendo por lo tanto la elongación pertinente del gen correspondiente.

Las técnicas de purificación de proteínas se conocen bien por los expertos en la técnica. Estas técnicas implican, a un nivel, el fraccionamiento en bruto del medio celular en las fracciones polipetídicas y no polipeptídicas. Habiendo separado el polipéptido de las otras proteínas, el polipéptido de interés se puede purificar además usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación práctica o completa (o purificación hasta la homogeneidad). Los procedimientos analíticos adecuados particularmente para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida, y localización isoeléctrica. Un procedimiento particularmente eficaz de la purificación de péptidos es la cromatografía líquida de proteína rápida. O incluso HPLG.

Son bien conocidas por los expertos en la técnica diversas técnicas adecuadas para uso en la purificación de proteínas. Éstas incluyen, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares o mediante desnaturalización por calor, después de centrifugación; etapas de cromatografía tales como intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxiapatita u afinidad, cromatografía; localización isoeléctrica; electroforesis en gel; y las combinaciones de estas y otras técnicas. Como en general se sabe en la técnica de se cree que el orden de llevar a cabo las diversas etapas de purificación se pueden cambiar, o se pueden omitir ciertas etapas, y todavía da como resultado un procedimiento adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente purificado.

No existe ningún requerimiento general para la que la proteína o péptido siempre se proporcionarán en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos menos purificados sustancialmente tendrán utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial se puede llevar a cabo mediante el uso de unas pocas etapas de purificación en combinación, o mediante la utilización de las formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC dará como resultado una mayor purificación "de veces" que la misma técnica que utiliza un sistema de cromatografía de baja presión. Los procedimientos que muestran un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteico, o manteniendo la actividad de una proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, en algunos casos de manera significativa con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al, 1977). Por lo tanto se apreciará que en condiciones diferentes de electroforesis, pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos purificados o parcialmente purificados.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se caracteriza por la rápida separación con la resolución extraordinaria de los máximos. Esto se logra mediante el uso de las partículas muy finas y alta presión para mantener un caudal adecuado. La separación se puede llevar a cabo en cuestión de minutos o como mucho una hora. Además se necesita un volumen muy pequeño de la muestra debido a que las partículas son tan pequeñas y empaquetadas tan próximas que el volumen vacío es una fracción muy pequeña del volumen del lecho. También, la concentración de la muestra no necesita ser muy grande debido a que las bandas son tan estrechas que es muy poca la dilución de la muestra.

La cromatografía en gel, o cromatografía por tamices moleculares, es un tipo especial de cromatografía de partición que se basa en el tamaño molecular. La teoría detrás de la cromatografía en gel es que la columna, que se prepara con partículas de una sustancia inerte que contiene poros pequeños, separa partículas mayores de las partículas más pequeñas ya que pasan a través de o alrededor de los poros, dependiendo de su tamaño. Mientras que el material de las partículas que se hacen no adsorben las moléculas, el único factor que determina el flujo es el tamaño. Por lo tanto, las moléculas se eluyen de la columna por la disminución de tamaño, mientras que la forma es relativamente constante. La cromatografía en gel es inmejorable para la separación de moléculas de tamaño diferente debido a que la separación es independiente de todos los factores tales como pH, resistencia iónica, temperatura, etc. Tampoco existe virtualmente ninguna adsorción, menos distribución de zonas y el volumen de elución se relaciona de una manera simple con el peso molecular.

Cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que depende de la afinidad específica entre un sustrato a aislar y la molécula que se puede unir a ella específicamente. Existe una interacción de tipo receptor - ligando. El material de la columna se sintetiza mediante acoplamiento covalente de una de las dos parejas de unión a una matriz insoluble. El material de columna después es capaz de adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución se produce mediante cambio de las condiciones a aquellas en las que la unión no se producirá (pH alterado, resistencia iónica, temperatura, etc).

Un tipo particular de cromatografía de afinidad útil en la purificación de carbohidrato que contiene compuestos es cromatografía de afinidad de lectina. Las lectinas son una clase de sustancias que se unen que se unen a una diversidad de polisacáridos y glicoproteínas. Las lectinas se acoplan usualmente a agarosa mediante bromuro de cianógeno. La conconavalina A acoplada a Sefarosa era el primer material de este tipo a usar y se ha usado de manera amplia en el aislamiento de polisacáridos y glicoproteínas diferentes de las lectinas que se han incluido son lentina de lenteja, aglutinina de germen de trigo que ha sido útil en la purificación de restos de N-acetil glucosaminil y lectina de Helix pomatia. Las propias lectinas se purifican usando cromatografía de afinidad con ligandos de carbohidratos. La lactosa se ha usado para purificar lectinas a partir de semilla de ricino y cacahuetes; la maltosa ha sido útil en la extracción de lectinas de lentejas o habichuela (canavalia, Canavalia ensiformis); N-acetil-D galactosamina se usa para purificar, lectinas; N-acetil glucosaminil que se une e a lectinas de germen de trigo; D-galactosamina se ha usado en la obtención de lectinas de las almejas y L-fucosa se unirá a las lectinas de loto.

La matriz debe ser una sustancia que ella misma no adsorbe las moléculas en cualquier grado significativo y que tiene un amplio intervalo de estabilidad química, física y térmica. El ligando se debe acoplar de tal forma que no afecte a sus propiedades de unión. El ligando también debe proporcionar una unión relativamente estrecha. Y debe ser posible eluir la sustancia sin destruir la muestra sobre el ligando. Una de las formas más comunes de cromatografía de afinidad es la cromatografía de inmunoafinidad. La generación de anticuerpos que sería adecuada para uso de acuerdo con la presente invención se describe más adelante.

XI. Definiciones

Gen exógeno: un gen que normalmente no está presente es un genoma huésped dado en la forma presente del gen exógeno. A este respecto, el propio gen puede ser nativo para el genoma humano, sin embargo, el gen exógeno comprenderá el gen nativo alterado mediante la adición o supresión de de uno o más elementos reguladores diferentes. Un tipo de gen exógeno contemplado por el inventor que es de utilidad particular en la presente invención comprende un gen de maíz unido de manera operativa a un promotor del género Coix.

Expresión: la combinación de los procesos intracelulares, que incluyen la transcripción y traducción que se lleva a cabo mediante la codificación de una molécula de ADN tal como un gen estructural que produce un polipéptido.

Progenie: cualquier generación posterior, que incluye las semillas y las plantas de la misma, que se deriva de una planta precursora particular o conjunto de plantas precursoras.

Promotor: un sitio de reconocimiento en una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que proporcionan un elemento de control de la expresión para un gel estructural y a dicho ARN. Una polimerasa se une de manera específica e inicia la síntesis de ARN (transcripción) del gen.

Regeneración: El proceso de crecimiento de una planta a partir de una célula de la planta (por ejemplo, protoplastos de la planta o explanta).

ADN seleccionado: Un segmento de ADN que se ha introducido en un genoma huésped. Los ADN seleccionados preferidos incluirán uno o más genes exógenos y los elementos para expresar un gen exógeno en una célula huésped, por ejemplo, un promotor y un terminador. El beneficio se puede conseguir incluyendo uno o más elementos potenciadores con el ADN seleccionado.

Transformación: Un procedimiento de introducción de una secuencia o construcción de ADN exógeno (por ejemplo, un vector o módulo de expresión) en una célula o protoplasto en el que ese ADN exógeno se incorpora en un cromosoma o es capaz de de la replicación autónoma.

Célula transformada: Una célula cuyo ADN ha sido alterado por la introducción de una molécula de ADN exógeno en dicha célula.

Transgen: Un segmento de ADN que se introduce en un genoma huésped. Los transgenes ejemplares proporcionarán la célula huésped, o las plantas regeneradas de la misma, con un fenotipo novedosos con relación a la célula o planta correspondiente no transformada. Los transgenes pueden codificar proteínas, ARN solamente o no transcribirse o traducirse. una planta individual se puede proporcionar con un transgen directamente mediante transformación o mediante la herencia de o ambos de los precursores de la planta.

Célula transgénica: Cualquier célula derivada o regenerada a partir de una célula transformada. Las células transgénicas ejemplares incluyen callos de plantas derivados de de una célula vegetal transformada y particularmente las células tales como hoja, raíz, tallo, por ejemplo, células somáticas, o células reproductivas (germinales) obtenidas a partir de una planta transgénica.

Planta transgénica: Una planta o progenie de cualquier generación posterior derivada de la misma, de una célula o protoplasto vegetal transformado, en el que el ADN de la planta contiene una molécula de ADN exógeno introducido que no está originalmente presente en una planta nativa, no transgénica de la misma cepa. La planta transgénica puede de manera adicional contener secuencias que son nativas para planta que se está transformando, pero donde el gen "exógeno" se ha alterado mediante medios tecnológicos de genes con el fin de alterar el nivel de la expresión de los genes.

Péptido de tránsito: Una secuencia de polipéptidos que es capaz de dirigir un polipéptido a un orgánulo particular u otra localización dentro de una célula.

Vector: Una molécula de ADN capaz de replicación en una célula huésped y/o a la que otro segmento de ADN se puede unir de manera operativa de manera que se lleve a cabo la replicación del segmento unido. Un plásmido es un vector ejemplar de una molécula de ADN usada para transportar nuevos genes al interior de las células. Un plásmido es un vector ejemplar que es una pieza de ADN independiente, estable, de autorreplicación.

XII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar las realizaciones preferidas de la invención. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el inventor funcionan bien en la práctica de la invención, y de este modo se pueden considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción, aprecian que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y todavía obtienen un resultado parecido o similar sin salirse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes descritos en el presente documento aunque se lograrían el mismo o similares resultados. Todos estos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

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Ejemplo 1

Clonación de secuencias homólogas de Coix

Semillas de Coix lacryma - jobi (documento PI 320865) se obtuvieron de la Estación de Introducción de Plantas USDA/ARS, Ames, IA. Se hicieron germinar las semillas y se dejó que se desarrollaran en el invernadero durante varias semanas. Se preparó el ADN genómico a partir de material de las hojas de de 2 - 3 semaans de edad de acuerdo con el siguiente protocolo. Tejido de hojas congelado (2 gramos de peso de carne) se molió en un polvo fino con una barra de vidrio en nitrógeno líquido. El tejido pulverizado se mezcló concienzudamente con 8 ml de de tampón de extracción (100 mM Tris, pH 8,0; 50 mM EDTA; % v/v de SDS; 500 mM NaCl), calentado previamente hasta 60ºC, seguido de una incubación a 45ºC a 60ºC. Después la muestra se mezcló con 2,5 ml de acetato de potasio 5 M enfriado en hielo y después se incubó en hielo durante 20 minutos. Se eliminaron los agregados de proteína mediante centrifugación a 3750 rpm durante 20 minutos y se purgó el sobrenadante mediante una capa de Miraxloth seguido de la precipitación de ADN mezclando con 5 ml de alcohol isopropílico. El ADN precipitado se recogió mediante centrifugación a 375 rpm durante 15 minutos. Se retiró mediante vertido el sobrenadante del ADN sedimentado y el tubo se invirtió durante 5 minutos para permitir que el sobrenadante residual se drenara del sedimento. El ADN se volvió a suspender en 300 \mul de agua que contenía 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA y 3 \mul de ARNasa (10 mg/ml de solución madre). El ADN se precipitó de nuevo mezclando con 50 \mul de un acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y 350 \mul de alcohol isopropílico, seguido de la centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento de ADN se lavó con 750 \mul de etanol al 80% v/v y después se dejó drenar mediante inversión durante 10 minutos. El ADN se volvió a suspender en 200 \mul de agua que contenía 10 mM Tris, pH 8,0 y 1 mM EDTA. Las genotecas de ADN genómico se prepararon, para uso como moldes de PCR, con el kit de Genoma Walter PCR (Clontech, Palo Alto, CA) se acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Un segmento de ADN localizado en 5' de la proteína de coixina gamma que codifica la secuencia se amplificó después por la PCR como sigue. Un conjunto encajado de cebadores de oligonucleótidos se prepararon diseñados, gCoix5' encaje2 (SEQ ID Nº 1) y gCoix5' encaje3 (SEQ ID Nº 2), que corresponde a las posiciones 267 - 288 y 26 - 53 respectivamente de la secuencia de coixina gamma publicada (Nº de acceso del Genbank X59850). Los cebadores denominados AP1 (SEQ ID Nº 3) y AP2 (SEQ ID Nº 4), también se usaron y se proporcionan en el kit "Genoma Walter" de (Clontech). La secuencia de los cebadores es como sigue:

gCoix5' encaje2 = CTGGAACTGGAACGGGCTTGGA

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gCoix5' encaje3 = GCGAGGGCAACGAGCAGCACCTTCATGG

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AP1 = GTAATACGACTCACTATAGGGC

AP2 = ACTATAGGGCACGCGTGGT

La PCR se realizó como sigue: Primero el Sistema de la PCR de Molde largo (Boehringer Manheim (Indianápolis, IN) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las excepciones siguientes, cada reacción contenía: 350 \muM de dNTPs 500 nM de cada cebador, 50 mM Tris - HCl, pH 9,2; 14 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 3,0 mM MgCl_{2} y 2 \mul (< 25 ng) de ADN de de molde de la genoteca de Genoma Walter. Los cebadores que se usaron primero fueron gCoix5' encaje2 y el cebador adaptador AP1. Se llevaron a cabo las siguientes condiciones de ciclación usando un termociclador MJ Research PTC-100 con una tapa caliente.

95º - 1 minuto. 1 ciclo

94º - 30 segundos

72º - 3 minutos. 7 ciclos

94º - 30 segundos

67º - 3 minutos. 32 ciclos

67º - 4 minutos. 1 ciclo

4º - mantenido

Los productos de esta reacción se diluyó después 1 : 25 con agua y se usaron 2 \mul como molde para una segunda ronda de amplificación. Los cebadores se cambiaron al conjunto encajado de gCoix5' encaje3 y el cebador adaptador AP2. Los únicos otros cambios estaban en el propia ciclación, que era como sigue:

95º - 1 minuto. 1 ciclo

94º - 30 segundos

72º - 3 minutos. 5 ciclos

94º - 30 segundos

67º - 3 minutos. 20 ciclos

67º - 4 minutos. 1 ciclo

4º - mantenido

Se aislaron las bandas de tamaño apropiado (500 pares de bases o mayores) mediante electroforesis en gel y escisión de bandas y se clonaron en el vector de plásmido pCR2.1, de acuerdo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carsbad, CA). La secuenciación de ADN se realizó usando los oligonucleótidos de costumbre o los cebadores localizados en el vector y el kit de secuenciación desoxi de tinte ABI (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems, Norwalk, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron las reacciones de secuenciación usando un secuenciador de ADN ABI Prism 373 (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems). Después de obtener la secuencia de los extremos 3' y 5' del producto de la PCR, se diseñaron los cebadores con los caracteres de la conveniente enzima de restricción convenientes para permitir la amplificación y posterior clonación del promotor de la coixina gamma directamente del ADN genómico. Se sintetizaron los cebadores gcs-1000 seq5'xho (SEQ ID Nº 5), gcs-1pcr3'xba (SEQ ID Nº 6) y gcs-1pcr3' neo (SEQ ID Nº 7). Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

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La amplificación del promotor de la coixina gamma se llevó a cabo después con los cebadores gcs-1pcr3' neo y gcs-1pcr3'xba usando el kit de la PCR High Fidelity (Boehringer Mannheim). La mezcla de reacción contenía 200 ng de molde de ADN genómico de Coix, 200 \muM dNTPs, 500 nM de cada cebador, y 5 \mul de 10X tampón nº 2. Las condiciones de ciclación llevadas a cabo con un termociclador MJ Research PCT-100 con una tapa caliente, fueron como sigue:

95º - 2 minutos. 1 ciclo

94º - 1 minuto.

56º - 1 minuto.

72º - 1 minuto. 32 ciclos

72º - 4 minutos.

4º - mantenido

Después de la amplificación, el amplicón se digirió con NcoI y XhoI para la clonación direccional en el vector de expresión de GUS pDGP827 (mcs/GUS/nos en la estructura central de pSP72; Promega Corp., Madison, WI). La inserción del promotor entero así como las uniones de inserción, se secuenciaron y el vector se designó pDPG844 (Fig. 1). Después se realizó la secuenciación del ADN usando los oligonucleótidos de costumbre o cebadores localizados ene l vector y el kit de secuenciación desoxi de tinte ABI (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems, Norwalk, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron las reacciones de secuenciación usando un secuenciador de ADN ABI Prism 373 (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems). La secuencia de la inserción del promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 8.

Se realizó una amplificación paralela del fragmento del promotor de la coixina gamma usando los cebadores gcs-1pcr3'xba y gcs-1000 seq5'xho. El producto de amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en el vector de expresión pDPG828 de GUS (mcs/rice Actin IntrónI/GUS/nos en la estructura central de pSP72). Las uniones de inserción así como la inserción entera se secuenciaron y se designó el vector pDPG845 (Fig. 2).

Para la construcción de los plásmidos pDPG846 (Fig. 3) y pDPG847 (Fig. 4), se realizó la amplificación del promotor de la coixina gamma usando el kit de la PCR High Fidelity (Boehringer Mannheim) (Boheringer Mannheim) y los cebadores gcx-1per3'xba (SEQ ID Nº 6) y gcx-(400)pcr5'xbo (SEQ ID Nº 24). El producto de amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en el vector de expresión pDPG827 de GUS (mcs/GUS/nos en la estructura central de pSP72) y pDPG828 (mcs/rice Actin IntrónI/GUS/nos en la estructura central de pSP72 para crear los vectores pDPG847 y pDPG846, respectivamente. Las uniones de la inserción y la inserción del promotor entero se secuenciaron para confirmar la construcción apropiada de los vectores. La secuencia de la inserción del promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 19.

Los plásmidos pDPG848 (Fig. 5) y pDPG849 (Fig. 6) se construyeron en paralelo a la construcción de pDPG846 y pDPG847. El fragmento del promotor de la coixina gamma se amplificó por PCR usando el kit de la PCR High Fidelity (Boehringer Mannheim). Y los cebadores gcs-1pcr3'xba (SEQ ID Nº 6) y gcs-(220)pcr5'xho (SEC ID Nº 25). El producto de amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en los vectores de expresión de GUS pDPG827 (mcs/GUS/nos en la estructura central de pSP72) y pDPG828 (mcs/rice Actin IntrónI/GUS/nos en la estructura central de pSP72 para crear los vectores pDPG849 y pDPG848, respectivamente. Las uniones de la inserción y la inserción del promotor entero se secuenciaron para confirmar la construcción apropiada de los vectores. La secuencia de la inserción del promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 18. Las secuencias de gcs- (400)pcr5'xho y gcs-(220)pcr5'xho se proporcionan más adelante en la SEQ ID nº 21 y la SEC ID Nº 25.

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Ejemplo 2

Aislamiento del terminador de la Coixina gamma y secuencia de codificación y construcción de pDPG869

El kit del Genoma de Walter y las genotecas de ADN genómico usados para aislar el promotor de la coixina gamma se usaron de manera adicional para el aislamiento de las secuencias del terminador de la coixina gamma. Todas las concentraciones de la PCR y condiciones de ciclación permanecían idénticas a las usadas para el aislamiento del promotor, (Ejemplo 1) para todas las rondas. Los únicos cambios estaban en los cebadores específicos de la coixina usados. La primera ronda de la PCR se realizó usando los cebadores gcx-5'pcr (SEQ ID Nº 9) y API, y la segunda ronda con los cebadores gCoix3' encaje2 (SEQ ID Nº 10) y AP2. La secuencia de los cebadores fue como
sigue:

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El producto de amplificación se separó mediante electroforesis de gel, seguido de la escisión de una banda de tamaño apropiado, elución de la banda y clonación del ADN en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció. Este clon que contenía el terminador de la coixina gamma, se designó DV108 (Fig 11). La secuencia del terminador se proporciona en la SEQ ID Nº 11.

Para obtener la secuencia de codificación de la proteína de de la coixina gamma, se usó la amplificación de la PCR para el aislamiento de un producto de amplificación que contenía tanto la secuencia de codificación como el promotor del gen de la coixina gamma. La amplificación se llevó a cabo usando los cebadores gcx-1000seq5'xho (SEQ ID 12) y gCoix3' pcrSEQ ID Nº 12) se proporcionan a continuación

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El kit "Master Amp" (Epicentre Technologies, Madison, WI) se usó para optimizar la amplificación. La secuencia del producto de amplificación del promotor/codificación se obtuvo usando el tampón D y el siguiente programa En un Robocycler (Stratagene).

94º - 2 minutos. 1 ciclo

94º - 1 minuto.

73º - 1 minuto.

72º - 1 minuto. 32 ciclos

72º - 4 minutos. 1 ciclo

6º - mantenido

Después el amplicón se clonó en pCR2.1. Usando esta construcción como un molde, se diseñó para obtener la secuencia de codificación y el promotor como productos de reacción separados. Se diseñaron los siguientes cebadores, gCoix 5' pcr+4 (SEQ ID Nº 14) y gCoix 3'pcr+ sac (SEQ ID Nº 15) para la amplificación de la secuencia de codificación sola:

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40

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Estos cebadores corresponden a las bases 31 - 51 y 607 - 627 respectivamente de la secuencia del Genbank anteriormente indicada. El uso del cebador gCoix 5' pcr+4 da como resultado un producto de amplificación que acrece del codón de inicio para la proteína de la coixina gamma. Se usó el kit de la PCR High Fidelity de Boehringer Mannheim con una mezcla de reacción de 100 pg del molde del plásmido, 500 nM de cada cebador 1X Tampón I y 200 \muM dNTP en una concentración final de MgCl_{2}. Las condiciones de ciclación, usando un termociclador MI Research PTC-100 con una tapa caliente, fueron como sigue:

94º - 2 minutos. 1 ciclo

94º - 1 minuto.

62º - 1 minuto.

72º - 1 minuto. 32 ciclos

72º - 4 minutos. 1 ciclo

4º - mantenido

Este producto de reacción después se purificó mediante electroforesis en gel y escisión de banda y se digirió con SacI para la clonación en pDPG845. El plásmido pDPG845 se preparó mediante digestión con NcoI y posterior llenado de la protuberancia en 5' con Klenow o mediante la adición de 2 unidades de la enzima Klenow y dNTPs hasta una concentración final de 0,2 mM cada una. Esto permitió la ligación directa del codón de partida ATG al extremo 5' se la secuencia de codificación de la proteína de la coixina gamma, restableciendo de esta manera el marco abierto de lectura completo de la coixina gamma. El vector después se digirió con SacI y se retiró la secuencia de codificación de GUS para dejar un sitio compatible para el extremo 3' de la secuencia de codificación de la coixina gamma. El vector pDPG845 preparado y la secuencia de codificación de la proteína de la coixina gamma se ligaron después conjuntamente para formar el nuevo vector denominado pDPG851 (Fig.
9).

Para facilitar el reemplazo del terminador nos en pDPG851 con el terminador de la coixina gamma, el módulo de expresión se movió a un vector más adecuado, por ejemplo pBK-CMV (Stratagene, la Jolla, CA). Esto se realizó digiriendo pBK-CMV con ScaI (romo) y pDPG851 con XhoI y ClaI con un relleno posterior de Klenow de las protuberancias en 5' (2 unidades de Klenow y 0,2 mM de cada dNTP). El módulo de pDPG851 y la estructura central de pBK-CMV se purificaron en gel. Después los dos plásmidos se ligaron para generar pDPG862 (Fig.
10).

El terminador de la coixina gamma se clonó en el extremo 3' de la secuencia de codificación de la coixina gamma en pDPG862. Esto se llevó a cabo primero retirando el terminador nos y después clonación de el terminador de la coixina purificada en su lugar realizando las etapa como se indica más adelante, la secuencia de codificación de la coixina gamma posee un sitio ScaI en la posición 620 - 625 de la secuencia del GenBank reseñada. Este sitio de restricción, que está presente en pDPG862 y DV108 como resultado de la porción de la secuencia de codificación obtenida por el procedimiento del Genoma Walter, se cortó con ScaI, así como con NotI. La secuencia del terminador de la coixina gamma se purificó después en gel así como la estructura central de pDPG862. Estos dos fragmentos se ligaron para generar pDPG869 (Fig. 7). La secuencia de la secuencia de codificación de la coixina gamma se proporciona en la SEQ ID Nº 16. Cada uno de estas construcciones de genes se introdujeron mediante bombardeo particular en las células que se pueden regenerar de maíz como se describe en el ejemplo 5 y 6 más
adelante.

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Ejemplo 3

Aislamiento del terminador de la Oleosina 3 de Coix

El kit del Genoma de Walter y las genotecas de ADN genómico usados para aislar las secuencias del promotor y terminador en los ejemplos 1 y 2 también se usaron para el aislamiento del terminador de la Oleosina 3 de Coix. Todas las concentraciones de la PCR y condiciones de ciclación permanecían idénticas a las usadas en los ejemplos, para todas las rondas. Los únicos cambios estaban en los cebadores específicos de la Coix que se usaron. La primera ronda de la PCR se realizó usando los cebadores cx-L3 3' encaje1 (SEQ ID Nº 26) y AP1 (SEQ ID Nº 3) y API, y la segunda ronda con los cebadores cx-L3 3' encaje2 (SEQ ID Nº 27), cx-L3 3' encaje3, SEQ ID Nº 28) y AP2. Las secuencias de los cebadores eran como sigue:

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Los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis de gel, seguido de la escisión de una banda de tamaño apropiado (> 500 pares de bases), elución de la banda y clonación del ADN en el vector pCR2.1 (Invitrogen) se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció como se ha descrito anteriormente. Este clon que contenía el terminador de la oleosina Coix, se designó DV12. La secuencia del terminador de oleosina se proporciona en la SEQ ID Nº 17.

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Ejemplo 4

Comparación de secuencias del promotor de la Coixina gamma y promotores homólogos de maíz y sorgo

Las prolaminas gamma son una clase de proteínas de almacenamiento de la semilla presentes en el endospermo de Coix, sorgo y maíz. Se llevó a cabo para determinar las secuencias de manera similar entre el promotor de prolamina gamma de Coix Coixina gamma, SEQ ID Nº 8), clonadas por los inventores como se describe en el ejemplo 1 y las regiones del promotor de prolamina de las secuencias correspondientes de sorgo (kafirina gamma, SEQ ID Nº 22, Nº de acceso del GenBank X62480), y maíz (zein gamma, SEQ ID Nº 23º de acceso del GenBank X56117). Se hicieron las alineaciones 894 nucleótidos cadena abajo del codón de inicio de la traducción usando el software de análisis de ADN GeneWorks (Intelligenetics, Inc., Mountainview, CA). Se introdujeron huecos para facilitar la alineación. El extremo más 3' de cada secuencia corresponde al codón de inicio ATG. Los resultados de la comparación se proporcionan en la Fig 8 y Tabla 9. Los análisis indican un 65% de identidad de secuencia entre la coixina gamma y la kafirina gamma y un 63% de identidad de secuencia entre la coixina gamma y la zein gamma. Estos resultados indicaban diferencias significativas entre las regiones promotoras en cada una de estas
especies.

TABLA 9 Identidad de secuencias de nucleótidos entre la prolamina gamma cadena arriba de las regiones en Coix, maíz y sorgo

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Ejemplo 5

Preparación de microproyectiles

Se prepararon los microproyectiles como sigue: se prepararon partículas de oro mediante la adición de 60 mg de partículas de oro de 0,6 \mum (BioRad, nº de catálogo 165 - 2262) a 1000 \mul de etanol absoluto e incubando durante al menos 3 horas a temperatura ambiente seguido de almacenamiento a -20ºC. Se centrifugaron en una microcentrífuga veinte a treinta y cinco \mul de las partículas de oro estériles y más preferiblemente 30 a 35 \mul de partículas de oro (30 \mul contienen 1,8 mg de partículas) durante hasta 1 min. Los sobrenadantes se retiraron y se añadió un mililitro de agua estéril al tubo, seguido de la centrifugación a 1800 - 2000 rpm durante 2,5 minutos. Las partículas de microproyectiles se volvieron a suspender en 25 - 30 \mul de solución de ADN que contenían aproximadamente 250 \mul de ADN vector.

Se añadieron después doscientos veinte mililitros de agua estéril, 250 \mul de CaCl_{2} 2,5 M y 50 \mul de solución madre de espermidina en 986 \mul de agua) a la solución que contenía la partícula. Después la solución se mezcló concienzudamente y se colocó en hielo, seguido de agitación en un aparato vortex a 4ºC durante 10 minutos y centrifugación a 500 rpm durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a suspender en sedimento en 600 \mul de etanol absoluto. Después de la centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos, el sedimento se volvió a suspender en 36 - 38 \mul de etanol absoluto, se agitó en un aparato vortex durante aproximadamente 20 segundos, y se sonicó durante 20 - 30 segundos. En esta fase las partículas se dejaron de manera típica sedimentar durante 2 - 5 minutos, después de lo cual se añadieron 5 - 10 \mul del sobrenadante y se dispensaron sobre la superficie de un disco con aletas y el etanol se dejó secar hasta sequedad completamente. Como alternativa, las partículas se retiraron directamente después de que se hayan vuelto a suspender y se agitaron en un aparato vortex durante 20 a 30 segundos en 36 \mul - 38 \mul de etanol, colocados en el disco con aletas y se dejó secar hasta sequedad como se ha hecho para el tratamiento de sedimentación. La cámara de bombardeo se evacuó después hasta aproximadamente 28 pulgadas de Hg (94,819 kPa) antes del bombardeo. Después las partículas se usaron para el bombardeo mediante un chorro de hielo de aproximadamente 1100 psi (7584,2 kPa) usando el dispositivo de bombardeo de partículas DuPont Bilistics PDS1000He.

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Ejemplo 6

Bombardeo de embriones inmaduros de Hi-II

Se escindieron embriones inmaduros (1,2 - 3,0 mm de longitud) del genotipo Hi-II de maíz a partir de espigas crecidas en invernadero, esterilizadas en la superficie de Hi-II 10 - 12 días después de la polinización. El genotipo Hi-II se desarrolló a partir de un cruce A188 x B73 (Armstrong et al., 1991). Aproximadamente 30 embriones por placa petri se sembraron mediante el eje hacia abajo sobre un medio N6 modificado que contenía 1 mg/ml de 2,4 D, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 6 mM L-prolina, 0,5 g/l ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), 0,75 g/l de MgCl_{2}, y sacarosa al 2% solidificado con 2 g/l de Gelgro, pH 5,8 (medio nº 735). Los embriones se cultivaron en la oscuridad durante dos a cuatro días a 24ºC.

Aproximadamente 3 - 4 horas antes del bombardeo, los embriones se transfirieron al medio de cultivo anterior con un incremento de la concentración de sacarosa de 3% a 12%. Cuando los embriones se transfirieron al medio osmótico alto se dispusieron en círculos concéntricos sobre la placa, comenzando a 1 cm del centro de la placa posicionada de tal manera que su extremo de coleorriza se orientó hacia el centro de la placa. Usualmente dos círculos concéntricos se formaron con 25 - 35 embriones por placa.

Las placas que contienen embriones se colocaron al nivel de un tercio a partir del fondo, 5 cm por debajo del filtro de parada. Las placas de ruptura a 1110 psi (7584,2 kPa) se usaron para bombardeo. Cada placa de embriones se bombardeó una vez con la pistola de partículas DuPont Biolistics PDS1000He. Después del bombardeo, a los embriones se les dejó recuperar en el medio osmótico alto (735, sacarosa al 12%) durante toda una noche (16 - 24 horas) y después se transfirieron al medio de selección que contenían 1 mg/ml de bialafos (nº 739, 735 más 1 mg/ml de bialafos o nº 750, 735 más 0,2 M manitol y 1 mg/ml de bialafos). Los embriones se mantuvieron en la oscuridad a 24ºC. Después de tres a cuatro semanas de la selección inicial aproximadamente 90% de los embriones típicamente formaban el callo de Tipo II y se transfirieron al medio selectivo que contenía 3 mg/ml de bialafos (nº 758). El análisis de Southern se puede usar para el análisis de transformantes y se pueden llevar a cabo ensayos de expresión génica. Las construcciones usadas para la

\hbox{transformación
y número de transformantes  se proporcionan más adelante, en la
tabla 10.}

TABLA 10 Transformantes obtenidos del bombardeo de embriones de maíz con construcciones que contienen secuencias de ADN Coix

43

Ejemplo 7

Determinación de los elementos reguladores del promotor putativo

La identificación de los elementos reguladores putativos dentro de cada secuencia del promotor se inicia mediante la comparación con las secuencias del promotor conocidas para expresarse de una manera específica del tejido o de manera progresiva única. Las secuencias que son compartidas entre los promotores con patrones de expresión similares son probablemente candidatos para la unión de los factores de transcripción y de esta manera son probablemente elementos que confieren patrones de expresión. La confirmación de estos elementos reguladores putativos se logra mediante análisis de supresión de cada promotor seguido del análisis funcional de cada construcción de supresión mediante ensayo de un gen indicador que está unido de manera funcional a cada construcción.

Tal análisis se llevaron a cabo sobre el promotor de la coixina gamma clonado. La alineación de la secuencia de ADN del promotor de la coixina gamma de Coix con los promotores de los genes de zein gamma de maíz y kafirina gamma de sorgo, llevada a cabo como se ha descrito en el ejemplo 4, revelaron varias regiones cortas de homología que representan los sitios de unión al factor de transcripción potencial. Varios de estos sitios también se han identificado de manera previa como regiones reguladoras putativas de promotores de la proteína de almacenamiento de sorgo (Ottoboni et al., 1993; de Freitas et al., 1994). Se identificaron cuatro regiones reguladoras putativas. Se predicen dos regiones que confieren la actividad del promotor general, potencialmente en respuesta al estatus del nitrógeno, y estas regiones se denominan regiones de tipo GCN4. Se predicen dos regiones adicionales para conferir la expresión específica de tejidos y se denominan regiones de unión de la casilla de prolamina. Los elementos se disponen entre 180 y 700 pares de bases a partir del sitio de partida de la traducción, siendo una casilla GCN4 la más próxima al codón de metionina de inicio (-190 pares de bases), seguido de una casilla de prolamina (- 395 pares de bases), una segunda casilla de GCN4 (- 525 pares de bases) y finalmente, una segunda casilla de prolamina (- 650 pares de bases).

Las secuencias de promotor truncadas se diseñaron para retirar de manera específica los elementos reguladores específicos de tejidos putativos mediante la generación de los fragmentos del promotor de 412 (SEQ ID Nº 19) y 222 pares de bases (SEQ ID Nº 18) (distancias entre el sitio de inicio de la traducción). El fragmento del promotor de 412 pares de bases incluye solamente los motivos de las casilla GCN4 y prolamina proximales, mientras que el fragmento de 222 pares de bases incluye solamente el motivo GCN4 proximal, con ambas regiones de las casillas de prolamina retiradas. De este modo los fragmentos del promotor, además del promotor de la coixina gamma de longitud completa, se clonaron en vectores que contenían el gen indicador de GDS, con y sin el intrón de la actina 1 de arroz que potencia la expresión. Estos vectores se han denominado pDPG844, 845, 846, 847, 848 y 849, y su construcción se ha descrito anteriormente. Cada construcción se bombardeó en los embriones de maíz inmaduros (como se ha descrito en el ejemplo 6) y se regeneraron las plantas que contenían cada una de las construcciones del promotor : GUS como transgenes.

Las plantas que contenían estos transgenes se analizaron para la expresión del gen indicador de GUS en todos los tejidos de plantas en muchas fases de desarrollo diferentes. Se predice que las construcciones más cortas del promotor (221 pares de bases, pDPG848 y pDPG849) no mostrarán los patrones de expresión específicos de tejidos ya que este promotor acrece de las regiones reguladoras de la casilla de prolamina. Se predice además que las construcciones del promotor de de 412 pares de bases pDPG846 y pDPG847) retendrán la especificidad del tejido, dirigirán los niveles inferiores de expresión cuando se comparan con las construcciones del promotor de longitud completa (pDPG844 y pDPG845).

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Ejemplo 8

Supresión codificante de un gen \alpha-Zein en maíz transgénico y eliminación de la supresión mediante el uso de los promotores de kCoix

La expresión de un módulo de expresión de zein codificante en maíz se ha mostrado que induce la supresión de la supresión de zein exógena si el gen de zein se controla mediante un promotor de maíz. Con el fin de demostrar que ninguna supresión se produciría si se usa un promotor de Coix, se pueden llevar a cabo estudios de transformación y realizar comparaciones entre las construcciones expresadas por maíz o promotores de Coix. Tales estudios se llevan a cabo como sigue.

Se transformaron células de maíz con el vector del plásmido pDPG531, que comprende un promotor Z27 unido de manera operativa a una secuencia que codifica ZA codificante de maíz y la región 3' de la nopalina sintasa, como se ha descrito en la patente de Estados Unidos Nº de serie 08/763.704, presentada el 9 de diciembre de 1996, cuya descripción se incorpora de manera específica en el presente documento por referencia en su totalidad. pDPG521 se preparó cortando un fragmento de aproximadamente 960 pares de bases del vector SPZ4Ent y llenando en los extremos (patente de Estados Unidos Nº de serie 08/763.704, presentada el 9 de diciembre de 1996). Esencialmente la unidad de transcripción Z4 entera está contenida en SPZ4Ent, con un tamaño de inserción total de 960 nucleótidos. El gen Z4 se volvió a construir a partir de los subclones Z4, pSPZ4R3' y pSPZ45. El vector precursor era pSPZ4R3', que contenía 713 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos en 3' de repetición en el medio a partir del nucleótido 630 al nucleótido 1341 de la secuencia ZA. El extremo 5' de la secuencia ZA se liberó mediante digestión con SacI (que escinde la secuencia de poliengarce fuera del gen insertado) y BamIII, y la inserción que contiene la secuencia en 5' de pSPZ45', obtenida mediante ScacI (que también escinde la secuencia de poliengarce) y la digestión por BamHI, se ligó al vector pSPZ4R3' linelizado, que da como resultado la reconstitución de la unidad de transcripción Z4 intacta. El vector resultante comprendía una construcción de la región del promotor Z27::Nos 3' en Pbs. (-) que contenía un único sitio de NcoI entre el promotor y terminador. Tanto el vector como la inserción eran de terminación roma y se ligaron. Los clones se identificaron con la orientación codificante de la secuencia de ADN de ZA (pDPG531). pDPG531 es capaz d transcribirse y traducirse en la proteína de zein de 22 kD (\alpha-zein). El plásmido pDPG531 y pDPG165 se introdujeron en las células de maíz mediante bombardeo conjunto como sigue.

Se regeneraron los transformantes como se describe en la publicación PCT WO 95/6128 y la patente de Estados Unidos Nº de serie 08/763.704, 9 de diciembre de 1996, cuyas descripciones se incorporan específicamente en el presente documento por referencia en su totalidad. El procedimiento era como sigue: plantas de maíz del genotipo A188 x B73 se cruzaron con plantas de maíz HI-II (Armstrong et al., 1991). Los embriones inmaduros (1,2 - 2,0 mm de longitud) se escindieron a partir de espigas crecidas en invernadero, esterilizadas en la superficie de Hi-II 11 - 12 días después de la polinización. El genotipo Hi-II se desarrolló a partir de un cruce A188 x B73 para el desarrollo de alta frecuencia del callo de tipo II de los embriones inmaduros (Armstrong et al., 1991). Aproximadamente 30 embriones por placa petri se sembraron mediante el eje hacia abajo sobre un medio N6 modificado que contenía 1 mg/ml de 2,4 D, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 6 mM L-prolina, 0,5 g/l ácido 2-((N-morfolino) etanosulfónico (MES), 0,75 g/l de MgCl_{2}, y sacarosa al 2% solidificado con 2 g/l de Gelgro, pH 5,8 (medio nº 735). Los embriones se cultivaron en la oscuridad durante dos a cuatro días a 24ºC.

Aproximadamente 4 horas antes del bombardeo, los embriones se transfirieron al medio de cultivo anterior con el incremento de la concentración de sacarosa de 3% a 12%. Cuando los embriones se transfirieron al medio osmótico alto se dispusieron en círculos concéntricos sobre la placa, comenzando a 2 cm del centro de la placa posicionada de tal manera que su extremo de coleorriza se orientó hacia el centro de la placa. Usualmente dos círculos concéntricos se formaron con 25 - 35 embriones por placa. Las placas que contienen embriones se colocaron al nivel de un tercio a partir del fondo, 5 cm por debajo del filtro de parada en la cámara de bombardeo. Se usaron las placas de ruptura a 1100 psi (7584,2 kPa). Cada placa de embriones se bombardeó una vez más. A los embriones se les dejó recuperar durante toda una noche sobre medio de alta resistencia osmótica antes del inicio de la selección.

Después de la recuperación sobre el medio osmótico alto (735, sacarosa al 12%) durante toda una noche (16 - 24 horas) después los embriones se transfirieron al medio de selección que contenían 1 mg/ml de bialafos (nº 739, 735 más 1 mg/ml de bialafos o nº 750, 735 más 0,2 M manitol y 1 mg/ml de bialafos). Los embriones se mantuvieron en la oscuridad a 24ºC. Después de tres a cuatro semanas de la selección inicial aproximadamente 90% de los embriones habían formado el callo de Tipo II y se transfirieron al medio selectivo que contenía 3 mg/ml de bialafos (nº 758). El tejido resistente a bialafos se subcultivó aproximadamente cada dos semanas en medio de selección reciente (nº 758). El callo embriogénico transformado se transfirió a medio de cultivo de regeneración (Murashige y Skoog, 1962), que contiene 0,91 mg/l de L-asparagina, 1,4 g/l de L-prolina, 20 g/l de D-sorbitol, 0,4 mg/l de ácido naftaleno acético (NAA) y 3 mg/l de 6-bencilaminopurina). Se desarrollaron las células durante aproximadamente cuatro semanas en este medio de cultivo con una transferencia al medio reciente a aproximadamente 2 semanas. Los transformantes se transfirieron posteriormente a medio de cultivo MSO (medio MS sin añadir fitohormonas). Las plantas regeneradas se transfirieron al suelo. Las plantas se cruzaron con las líneas de maíz reproducidas designadas AW, CV, y DI. La semilla que contenía el módulo de expresión codificante de Z27 era opaco en el fenotipo similar a los granos de los granos mutantes a opaco-2. Las plantas se regeneraron a partir de tres módulos de expresión Z27-ZA y se cruzaron a las líneas endogámicas AW, CV, y CN.

La cantidad de las proteínas \alpha-zein presentes en plantas de maíz no transformadas y transformantes codificantes Z27-Z4 se compararon sobre geles de poliacrilamida teñidas con azul de Comassie como se describe más adelante. Cincuenta miligramos de grano molido se suspendieron en 0,5 ml de de etanol al 70%, \beta-mercaptoetanol al 1% y se extrajeron a temperatura ambiente durante 30 minutos durante toda una noche. La muestra se agitó con un aparato vortex y se centrifugó a 10.00 rpm durante 5 minutos. Cincuenta microlitros del sobrenadante que contenía las proteínas zein se retiraron y se secaron. Se volvieron a suspender las proteínas zein en tampón de carga de gel de poliacrilamida 50:1 SDS que contenía \beta-mercaptoetanol al 1%. Se separó la proteína sobre geles de poliacrilamida SDS y se tiñeron con azul de Comassie.

Los resultados demostraron una sorprendente reducción en los niveles de las proteínas \alpha-zein presentes en los transformantes codificantes Z27-Z4. la reducción era comparable con la observada en los transformantes no codificantes. Además a la reducción no esperada en la congregación de la proteína zein en los transformantes codificantes, semillas con una reducción en el contenido de zein también mostraron en general el fenotipo opaco, y una reducción de 727 niveles de zein.

Las concentraciones de lisina y leucina se analizaron también en la semilla derivadas de granos individuales. Los aminoácidos se extrajeron a partir de granos maduros derivados de tres líneas transformadas independientes como sigue. Cincuenta miligramos de maíz de la harina de maíz molido se hidrolizó en 1 ml de HCl 6 N en gas de argón durante 24 horas a 110ºC. Las muestras se diluyeron hasta 50 ml y se filtraron a través de un filtro de 0,46 micrones. Se añadió norvalina a cada muestra como un patrón interno antes del análisis de HPLC. Se separaron los aminoácidos sobre una columna de HPLC Supercosil LC-8 (Jarret et al., 1986; Jones et al., 1983; AACC, 1995). Los resultados de los análisis de los granos individuales revelaron diferencias entre granos transformados y no transformados que eran significativas al nivel de pH de p < 0,05 de significación. En un transformante, denominado KQ018, los niveles de lisina y leucina eran estadísticamente los mismos en la semilla isogénica transformada y no transformada. Sin embargo, un transformante denominado KQ012, niveles de lisina se incrementaron de manera estadística en los niveles de transformante y leucina disminuyeron de manera estadística en el transformante. Por lo tanto se indica que los transformante codificantes del promotor Z27 - Z4 producían una morfología de la semilla, proteína, y fenotipo de la composición de aminoácidos similares a los observados en los transformante no codificantes. Esto se cree que se produce como resultado de la silenciación de genes dependiente de la homología.

Con el fin de demostrar que la homología basada en al silenciación de genes no se produce cuando el promotor Z27 de maíz se reemplaza con un promotor de Coix a partir del gen Coix homólogo, un vector de plásmido se construye de manera que comprenda un promotor aislado del homólogo del gen Coix al gen Z27, y este promotor está unido de manera operativa a la secuencia de codificación de Z4 de Zea Mays. La secuencia del promotor se aísla usando la estrategia descrita en el ejemplo 1. El vector de la secuencia de codificación de Z4 del promotor de Coix se transforma después en maíz como se ha descrito anteriormente. Las plantas transgénicas que contenían el vector se regeneran como se ha descrito anteriormente y se cruzaron con líneas endogámicas no transformadas. La cantidad de las \alpha-zeinas se miden después para demostrar una carencia de la reducción de la expresión de transgenes en los transformantes que comprenden el módulo de la expresión del gen estructural de Z4 del promotor derivado de Coix. Además, el incremento de la expresión del módulo de expresión del gen estructural de Z4 del promotor derivado de Coix con relación al promotor nativo que contiene los transformantes se demuestra mediante la carencia de un fenotipo opaco en la planta que tiene un módulo de expresión del gen estructural de Z4 del promotor derivado de Coix. El análisis de las concentraciones de lisina y leucina en los transformante del módulo de expresión del gen estructural de Z4 del promotor derivado de Coix también se lleva a cabo para demostrar que los niveles de lisina no se incrementan, indicando por lo tanto que la supresión conjunta codificante no se observa en los transformantes de maíz que comprenden un promotor derivado de Coix, como se observó usando el promotor Z27 de maíz.

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Ejemplo 9

Transformación de los embriones inmaduros de H99 o callo y selección con paromomicina

Los embriones inmaduros de maíz (1,2 - 3,0 mm, 10 - 14 días después de la polinización) se aíslan a partir de plantas H99 desarrolladas en invernadero que se han auto polinizados o polinizado por cruzamiento.

Se cultivan embriones inmaduros sobre el medio 735 en la oscuridad a aproximadamente 27ºC. Los embriones inmaduras o bien se bombardean 1 - 6 días después del aislamiento o se cultivan para producir callo embriónico que se uso para el bombardeo. Se expande el callo y se mantiene mediante subcultivo a intervalos de 2 - 3 semanas en medio reciente 735. Antes del bombardeo, los embriones cultivados o callo embriónico (subdividido en grupos de 2 - 4 mm) se transfieren a medio que contiene sacarosa al 12% durante 3 - 6 horas. Después del bombardeo, llevado a cabo como se ha descrito en el ejemplo 6, los cultivos de tejidos se incuban durante toda una noche y se transfieren a medio 735 que contienen 500 mg/l de paromomicina. Después de 2 - 3 semanas, el callo se subdivide en pequeñas partes (aproximadamente de 2 - 4 mm de diámetro) y se transfirieron a medio de selección reciente. De este modo la etapa de subcultivo se repite a intervalos de 2 - 3 semanas durante hasta aproximadamente 15 semanas después del bombardeo, con subdivisión y selección visual para callo sano y en desarrollo.

El callo tolerante a paromomicina se transfiere a medio 735 sin 2,4 D pero que contenía 3,52 mg/ml de BAP durante 3 - 9 días en la oscuridad a aproximadamente 27ºC y posteriormente se transfirió a medio 110 (1/2 X de sales de MS, 0,5 mg/l de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, sacarosa al 3%, 3,6 g/l de Gelgro, pH 5,8), que contenía 100 mg/l de paromomicina en Phytatrays (Sigma) y se cultivó a aproximadamente 27ºC a la luz. Las plántulas que se desarrollan en Phytatrays después de 3 - 6 semanas, se transfieren después al suelo. Las plántulas se aclimatas en una cámara de crecimiento y se desarrollan hasta madurez en el invernadero.

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Ejemplo 10

Expresión del gen indicador de GUS bajo control del promotor de la Coixina gamma Tinción de la actividad de GUS bioquímica convencional

1.: Soluciones de convencionales combinadas para el tampón de ensayo, se preparan de manera reciente:

Ferricianuro de potasio	solución madre 50 mM	1 ml
Ferricoanuro de potasio	solución madre 50 mM	1 ml
Tampón fosfato de sodio	solución madre 200 mM, pH 7,0	5 ml
EDTA de sodio	solución madre 10 mM, pH 8,0	1 ml
Triton-X100	solución madre 10% v/v	1 ml

2.: Filtrar de manera estéril la mezcla en tampón de ensayo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.

3.: El sustrato cromagénico es X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-Beta-D-glucuronida) que se disuelve en N, N-dimetilformamida a una concentración de 25 mg/ml.

4.: Preparar la solución de ensayo de GUS de trabajo mediante la combinación de los siguientes reactivos:

Tampón fosfato de sodio	200 mM, pH 7,0	26 ml
Tampón de ensayo de GUS	(de la etapa 1 anterior)	9 ml
Sustrato X-gluc	solución madre 25 mg/ml	1,2 ml.

5.: Incubar el tejido en la mezcla del ensayo GUS a 37ºC. El color azul aparecerá en el tejido que contiene la enzima de GUS activa. El tejido se puede incubar durante toda una noche o más a temperatura ambiente si es necesario.

Los granos de las plantas transgénicas descritos en el ejemplo 7 se ensayaron para la expresión del gen de GUS. Se obtuvieron los granos a partir de plantas transgénicas R0 de 9 días después de la polinización (DAP) a través de 27 DAP. Los granos se dividieron longitudinalmente con una cuchilla de afeitar. Las rodajas de los granos se colocaron en los pocillos de una placa de 24 pocillos de microvaloración y se incubaron en solución de ensayo de GUS a temperatura ambiente usando el procedimiento descrito por Jefferson (Jefferson, R. A., 1987). El color azul indicador de la actividad de GUS se registró usando una escala de 0 - 4 (0, sin tinción de color azul; 4, tinción intenso).

De las plantas ensayadas en la fase R0 para la expresión de GUS en los granos, se observó la tinción de azulen cinco de las nueve plantas que contenían la construcción GcxPro(900)/GUS/NOS, cuatro de nueve plantas que contenían la construcción GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS, tres de 12 plantas que contienen la construcción GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS, y dos de seis plantas que contienen la construcción GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS (TABLA 11). Ninguna de las plantas examinadas que contenían o bien la construcción GcxPro(400)/GUS/NOS o GcxPro(220)/GUS/NOS mostraron cualquier tinción en el grano.

El patrón de tinción espacial también se observó con respecto a la tinción de azul para las partes diferentes del grano. Los granos de las plantas de GcxPro(900)//GUS/NOS mostraron un patrón de expresión exclusivamente en el endospermo, con la mayoría de la tinción en el almidón del endospermo y la tinción limitada en la aleurona en algunos ganos; los granos de las plantas GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS mostraron un patrón de tinción principalmente en el almidón del endospermo y luz, tinción limitada en el germen en algunos granos; y los granos de las plantas GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS o GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS mostraron tinción tanto en el endospermo como germen, indicando una pérdida del patrón de expresión específico de endospermo. No fue detectable ninguna tinción de azul en los granos de las plantas o bien GcxPro(400)/GUS/NOS o GcxPro(220)/GUS/NOS. Las plantas que expresan o bien el transgen GcxPro(900)/GUS/NOS o GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS también mostró un patrón de tinción regulado temporalmente, con las semillas antiguas que mostraban un grado mayor de la tinción de azul que las semillas más jóvenes (Tabla 12).

TABLA 11 Frecuencia de plantas transgénicas gamma - coixina/GUS que muestran la actividad GUS en los tejidos del grano

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TABLA 12 Expresión de la actividad GUS en el desarrollo de los granos de las plantas transgénicas que contienen construcciones de coixina/GUS

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TABLA 12 (continuación)

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Ejemplo 11

Procedimientos generales para el bombardeo de microproyectiles

Muchas variaciones en las técnicas para el bombardeo de microproyectiles se conocen bien en la técnica y por lo tanto se consideran útiles en la presente invención. Los procedimientos ejemplares para el bombardeo se describen en, por ejemplo, la solicitud PCT WO 95/06128, que se incorporan de manera específica en el presente documento por referencia en su totalidad. Los ejemplos de los tejidos diana que se pueden usar en la presente invención incluyen embriones inmaduros, callo de tipo I, callo de Tipo II, callo de Tipo III, cultivos de suspensión y tejido meristemático (solicitud PCT WO 96/04392). Algunos genotipos que son especialmente útiles para la transformación de maíz se han descrito anteriormente específicamente, así como en, por ejemplo, la solicitud PCT WO 95/06128. Los genotipos preferidos serán aquellos que se pueden transformar de manera fácil y también se pueden regenerar para producir una planta transgénica fértil.

Cualquier procedimiento para la aceleración de las microproyectiles se puede usar de manera potencial para transformar célula vegetal en la presente invención. Un procedimiento preferido será una pistola de gas partículas de tal como el dispositivo de bombardeo de partículas PDS1000He. Las partículas ejemplares para el bombardeo incluyen los comprendidos por tungsteno, oro, platino, y similares. Las partículas de oro se consideran particularmente útiles en la presente invención, siendo preferidas las partículas de 0,6 \mum o 0,7 \mum y las más preferidas las partículas de 0,6 \mum. Las partículas más preferidas serán las revestidas por ADN y que tienen un tamaño medio entre 0,6 \mum y 1,0 \mum.

Como se ha descrito en el presente documento, se puede usar cualquier secuencia de ADN para la transformación. Los segmentos de ADN usados para la transformación incluirán de manera preferible uno o más marcadores que se pueden seleccionar, secretar o rastrear. Muchos ejemplos de tales se conocen bien en la técnica y se describen específicamente en el presente documento. En el caso de los marcadores que se pueden seleccionar, la selección puede estar en medio sólido o líquido. Los segmentos de ADN usados también preferiblemente incluirán uno o más genes que confieren o bien individualmente o en combinación con otras secuencias, un fenotipo deseado de las plantas transformadas. Los genes ejemplares para la transformación y los fenotipos correspondientes se pueden conferir estas secuencias a la planta transformada y se describen en el presente documento.

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Ejemplo 12

Introgresión de transgenes en las reproducciones e híbridos Elite

Se puede usar retrocruzamiento para mejorar una planta de parida. El retrocruzamiento transfiere un carácter deseable específico de una a otra planta endogámica u otra que carece del carácter. Esto se puede llevar a cabo por ejemplo, mediante, primero, cruzando una línea endogámica (A) (precursor recurrente) a un la planta de endogamia donante (no se requiere precursor), que lleva el (los) gen (genes) apropiado (s) para el carácter en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie de este cruce se selecciona primero en la progenie resultante para el carácter deseado a transferir desde el precursor no recurrente, después la progenie seleccionada se vuelve a cruzar con el precursor recurrente superior (A). Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento para el carácter deseado, la progenie es hemicicótica para los locus que controlan la característica que se está transfiriendo, pero son parecidos al precursor superior para la mayoría o casi todos los otros genes. La última generación de retrocruzamiento, se autofecundaría al menos una vez para proporcionar la progenie que son puras para la mejora genética del (de los genes) que se están transfiriendo, es decir, uno o más episodios de
transformación.

Por lo tanto, aunque una serie de manipulaciones de mejora genética, un transgen seleccionado se puede mover desde una línea a una línea completamente diferente sin la necesidad de manipulaciones de recombinación adicionales. Los transgenes son valiosos ya que se comportan típicamente de manera genética como cualquier otro gen y se puede manipular mediante técnicas de mejora genética de una manera idéntica a cualquier otro gen de maíz. Por lo tanto, se pueden producir líneas endogámicas que son de mejora genética verdadera para uno o más transgenes. Cruzando diferentes plantas endogámicas, se puede producir un gran número de híbridos diferentes con diferentes combinaciones de transgenes. De este modo, se pueden producir plantas que tengan las propiedades agronómicas deseadas asociadas frecuentemente a híbridos ("vigor híbrido") así como las características deseables impartidas por uno o más
transgen (es).

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Ejemplo 13

Selección asistida por marcador

Se pueden usar marcadores genéticos para ayudar a la introgresión de uno o más transgenes de la invención a partir de un fondo genético en otro. La selección asistida por marcador ofrece ventajas con relación a la mejora genética convencional ya que se puede usar para evitar errores provocados por las variaciones fenotípicas. Además, se pueden proporcionar datos de marcadores genéticos con relación al grado del plasma germinal de elite en la progenie individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con un carácter deseado que de otra manera tiene un antecedente no agronómicamente deseable se cruza con un precursor de élite, se pueden usar marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no solamente posee el carácter de interés pero también tienen una proporción relativamente grande del plasma germinal deseado. De esta forma el número de generaciones requeridas para introgresar uno o más caracteres en un fondo genético particular se minimiza.

En el proceso de mejora genética asistida por marcador, se usan secuencias de ADN para conseguir los caracteres agronómicos deseables (Tanksley et al., 1989) en el proceso de mejora genética de las plantas. La mejora genética asociada al marcador se puede llevar a cabo como sigue. Se plantas semillas de plantas con el carácter deseado a partir de la plantas para la preparación de de ADN en cualquier punto de crecimiento al que aproximadamente un gramo del tejido de las hojas se puede retirar de la planta sin comprometer la viabilidad de la planta. Se aísla el ADN genómico usando un procedimiento modificado de Shure et al (1983). Aproximadamente un gramo del tejido de las hojas de una plántula se liofiliza durante toda una noche en 15 ml de tubo de polietileno. El tejido seco congelado se muele hasta un polvo en el tubo usando una barra de vidrio. El tejido en polvo se mezcla concienzudamente con 3 ml de tampón de extracción (7,0 urea, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl ph 8,0, 0,01 M EDTA, sarcosina al 1%). Se extrae el homogenato de tampón/tejido con 3 ml de fenol/cloroformo. Se separa la fase acuosa mediante centrifugación, y se precipita dos veces usando 1/10 de volumen de acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lava con etanol al 75% y se vuelve a suspender en 100 - 500 \mul de TE (0,01 M Tris - HCl, 0,001 M EDTA, pH
8,0).

El ADN genómico se digiere después con un exceso de 3 veces de enzimas de restricción, se somete a electroforesis mediante agarosa al 0,8% (FMC), y se transfirió (Southren, 1975) a Nytran (Schleicher y Schuell) usando 10 X SCP (20 SCP; 2 M NaCl, 0,6 M fosfato disódico, 0,02 M EDTA disódico). Los filtros se hibridan previamente en 6 X SCP, sulfato de dextrano al 10%, sarcosina al 2%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonda marcada con ^{32}P generada mediante cebado al azar (Feinberg & Vogelstein, 1983). Los filtros hibridizados se lavan en 2 X SCP, SDS al 1% a 65º durante 30 minutos y se visualizó mediante autorradiografía usando película Kodak XAR5. Los polimorfismos genéticos que están unidos de manera genética a los caracteres de interés se usan en consecuencia para predecir la presencia o ausencia de los caracteres de interés.

Los expertos en la técnica reconocerán que existen muchas formas diferentes de aislar el ADN de tejidos de plantas y que existen muchos protocolos diferentes para la hibridación de Southern que producirá idénticos resultados. Los expertos en la técnica reconocerán que una banda de Southern se puede despojar de la sonda radiactiva después de la autorradiografía y volver a sondar con una sonda diferente. De esta manera se puede identificar cada uno de los diversos transgenes que están presentes en la planta. Además, los expertos en la técnica reconocerán que cualquier tipo de marcador genético que es polimórfico en la (s) región (es) de interés se puede usar para el propósito de identificar la presencia o ausencia relativa de un carácter, y que tal introducción se puede usar para la mejora genética asistida por marcador.

Cada carril de la banda de Southern representa ADN aislado de una planta. A través del uso de la multiplicidad de episodios de integración de genes como sondas sobre la misma banda de ADN genómica, la composición del episodios de integración de cada planta se pueden determinar. Las correlaciones se pueden establecer entre las contribuciones de episodios de integración particular al fenotipo de la planta. Solamente estas plantas que contienen una combinación deseada de episodios de integración se puede avanzar hasta la madurez y usarse para la polinización. Las sondas de ADN que corresponden a los episodios de integración de transgenes particulares son marcadores útiles durante el curso de la mejora genética de las plantas para identificar y combinar los episodios de integración particulares sin que tengan que crecer las plantas y ensayo de las plantas para el comportamiento agronómico.

Se espera que una o más enzimas de restricción se usarán para digerir el ADN genómico, o bien individualmente o en combinaciones. Los expertos en la técnica reconocerán que muchas enzimas de restricción diferentes serán útiles y la elección de las enzimas de restricción dependerá de la secuencia de ADN del episodio de integración de transgenes que se usa como una sonda y las secuencias de ADN en el genoma que rodea los transgenes. Para una sonda, se deseará el uso de secuencias de ADN o ARN que se hibridarán al ADN usado para la transformación. Se seleccionará una enzima de restricción que produce un fragmento de ADN después de la hibridación que se puede identificar como el episodio de integración de transgenes serán aquellos que revelen polimorfismos que están unidos de manera genético a transgenes específicos o caracteres de interés.

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Ejemplo 14

Procedimientos generales para los ensayos

El análisis de ADN de las plantas transformadas se realiza como sigue. El ADN genómico se aísla usando un procedimiento modificado de Shure et al., 1983. Aproximadamente un gramo de callo o de tejido de las hojas se muele hasta un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero y una mano de almirez. El tejido en polvo se mezcla concienzudamente con 4 ml de tampón de extracción (7,0 M urea, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl ph 8,0, 0,01 M EDTA, sarcosina al 1%). Se extrae el homogenato de tampón/tejido con 4 ml de fenol/cloroformo. Se separa la fase acuosa mediante centrifugación, se pasa a través de Miracloth y se precipita dos veces usando 1/10 de volumen de acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lava con etanol al 70% y se vuelve a suspender en 200 - 500 \mul de TE (0,01 M Tris - HCl, 0,001 M EDTA, pH
8,0).

La presencia de una secuencia de ADN en una célula transformada se puede detectar mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Usando esta técnica se pueden amplificar fragmentos específicos de ADN y detectar después de la electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, doscientos a 1000 ng de ADN genómico se añade a una mezcla de reacción que contiene 10 mM Tris - HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl_{2}, 50 mM KCl, 0,1 mg/ml de gelatina, 200 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP, 0,5 \muM de cada cebador directo e inverso de ADN, glicerol al 20%, y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa. Se lleva a cavo la reacción en una máquina de ciclación térmica como sigue: 3 minutos a 94ºC, 39 repeticiones del ciclo 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 30 segundos a 72ºC, seguido de 5 minutos a 72ºC. Veinte \mul de cada mezcla de reacción se desarrolla sobre un gel de NuSieve al 3,5% en tampón de TBE (90 mM Tris - borato, 2 mM EDTA) a 50V durante dos a cuatro horas. Usando este procedimiento, por ejemplo, se puede detectar la presencia del gen bar, usando el cebador directo CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC (SEQ ID Nº 20) y el cebador inverso AAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGA (SEQ ID Nº 21).

Un procedimiento para detectar la presencia de fosfinotricin acetil transferasa (PAT) implica el uso de una reacción enzimática in vitro seguido de cromatografía en capa fina, como se describe en la solicitud PCT WO 95/06128 (que se incorpora específicamente en el presente documento en su totalidad por referencia). El procedimiento se lleva a cabo preparando diversos extractos de proteína a partir de homogenatos de células potencialmente transformadas, y a partir de células de control que ni se han transformado ni expuesto a selección por bialafos, y después ensayando mediante incubación con PPT y ^{14}C-acetil Coenzima A seguido de cromatografía en capa fina. Los resultados de este ensayo proporcionan la confirmación de la expresión del gen bar que codifica la PAT.

Para el análisis de la banda de Southern se digiere el ADN genómico con un exceso de 3 veces de enzimas de restricción, se somete a electroforesis mediante agarosa al 0,8% (FMC), y se transfirió (Southren, 1975) a Nytran (Schleicher y Schuell) usando 10 X SCP (20 SCP; 2 M NaCl, 0,6 M fosfato disódico, 0,02 M EDTA disódico). Las sondas se marcan con ^{32}P usando el procedimiento de cebado al azar (Boehinger Mannheim) y se purifica usando columnas de giro Quick - Step ® (Isolab Inc., Akron, OH). Los filtros se hibridizan previamente a 65º en hibridizados se lavan en 6 X SCP, sulfato de dextriano al 10%, sarcosina al 2%, y 500 \mug/ml de heparina (Chomet et al., 1987) durante 15 minutos. Los filtros después se hibridizan durante toda una noche a 65ºC en 6 X SCP que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonda marcada con ^{32}P. Los filtros se lavan con 2 X SCP, SDS al 1% a 65ºC durante 30 minutos, y se visualizaron mediante autorradiografía usando película Kodak XAR5. Para la rehibridación, los filtros se someten a ebullición durante 10 minutos en H_{2}O destilada para retirar la primera sonda y después se hibridiza previamente como se ha descrito anteriormente.

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Ejemplo 15

Utilización de cultivos transgénicos

El último objetivo en la transformación de plantas es producir plantas que son útiles para el hombre. A este respecto, las plantas transgénicas creadas de acuerdo con la presente invención se pueden usar para cualquier propósito virtualmente que se considera valioso para el cultivador o para el consumidor. Por ejemplo, se puede desear recolectar semilla de las plantas transgénicas. Esta semilla se puede a su vez usar para una amplia diversidad de propósitos. La semilla se puede vender a los granjeros para plantar en el campo o se puede usar directamente como alimento, o bien para animales o para los seres humanos. Como alternativa, los productos se pueden preparar para la propia semilla. Los ejemplos de los productos que se pueden preparar a partir de la semilla incluyen, almidón, alimento animal de humano, compuestos farmacéuticos, y diversos productos industriales. Los usos alimentarios del maíz, además del consumo humano de granos de maíz, incluyen ambos productos de las industrias de molienda en seco o en húmedo. Los productos principales de la molienda en seco del maíz son partículas, sémola y harina. La industria de la molienda en húmedo del maíz puede proporcionar almidón de maíz, jarabes de maíz, y dextrosa para uso en alimentación. El aceite de maíz se recupera del germen de maíz, que es un subproducto de las industrias de molienda tanto en seco como en húmedo.

El maíz, que incluye tanto las partículas de grano como no grano de la planta, también se usa de manera extensiva como pienso de ganado, principalmente para el ganado vacuno, ganado de leche, cerdos, y aves. Los uso industriales de maíz incluyen la producción de etanol, almidón de maíz en la industria de molienda en húmedo y harina de maíz en la industria de la molienda en seco. Las aplicaciones industriales de almidón y harina de maíz se basan en las propiedades funcionales, tales como viscosidad, formación de película, propiedades adhesivas, y capacidad de suspender partículas. El almidón y harina de maíz tiene aplicación en las industrias del papel y textil. Otros usos industriales incluyen las aplicaciones en materiales adhesivos, de construcción, aglutinantes de fundición, almidones de lavandería, explosivos, lodos de los pozos de petróleo, y otras aplicaciones de minería. Las partes de las plantas diferentes del grano o maíz también se usan en la industria, por ejemplo, tallos y pajas se preparan en papel y tablero para tabiques y las mazorcas se usan para carburante y para hacer carbón. Otros medios para la utilización de las plantas, tales como los que se pueden realizar con la presente invención, se han conocido bien desde el punto de vista de diseño de agricultura y se conocen bien por los expertos de la técnica a la luz de la presente descripción. Los procedimientos específicos para la utilización del cultivo se puede encontrar en, por ejemplo, Sprague y Dudley (1988), y Watson y Ramstad (1987).

Referencias

Las referencias mencionadas a continuación se incorporan en el presente documento por referencia hasta el grado que suplementan, explican, proporcionan un antecedente para, o enseñar la metodología, técnicas, y/ o composiciones empleadas en el presente documento.

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<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA LA EXPRESIÓN DE TRANSGENES EN PLANTAS

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<130> DEKM: 158P

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<140> PRESENTADA CON EL PRESENTE DOCUMENTO

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<141> 11 de 05 de 1999

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<150> 09/078, 972

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<151> 14 - 05 - 1998

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<160> 28

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<170> Patent. In. Ver. 2.0

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<400> 8

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcagcccca gcagccacat cca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcggcagc caatgacaag tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctcgaggg accggttaca gcacaccact g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagtactgg gcaccgccgg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggtgctgc tcgttgccct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggagctctc agtactcggc accgccggc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 603

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcgagaca agcacggtca acttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagtccctgg aggcacaggg cttcaaga

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2647

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

55

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3704

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctcgagta agtatgcagg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctcgagca ctcggcttgc t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggctgatc ctggccggca ccgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgttctcct ggatgtacaa gtac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial. Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaaggccc gcgacgtcaa gga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Un procedimiento de prevención de la silenciación del gen dependiente de la homología del promotor en una planta monocotiledónea tal como arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y maíz pero diferente de Coix, el procedimiento comprende las etapas de:

(a) proporcionar un promotor de la coixina gamma que comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8;

(b) preparar una construcción que comprende dicho promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado, en el que dicho gen que se puede seleccionar es preferiblemente un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedad fúngica, un gen de resistencia a enfermedad viral, un gen de resistencia a enfermedad bacteriana, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o calidad del grano, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede rastrear, un gen marcador negativo que se puede seleccionar, un gen que afecta a las características agronómicas de las plantas, o un gen de resistencia al ambiente o estrés.

(c) transformar una célula receptora a partir de una planta monocotiledónea distinta de de Coix con dicha construcción, en la que dicha etapa de transformación preferiblemente comprende bombardeo de microproyectiles, electroporación, transformación mediada por filtro de carburo de silicio, o transformación mediada por Agrobacterium, y

(d) regenerar una planta que expresa dicho gen a partir de dicha célula receptora, mediante el cual dicha planta no exhibe la silenciación del gen.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho bombardeo de microproyectiles comprende las etapas de (i) revestimiento de microproyectiles con ADN que comprende la construcción y (ii) poner en contacto dichas células receptoras con dichos microproyectiles.

3. Un procedimiento de producción de progenie, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) preparar una planta de acuerdo con los procedimientos descritos en la reivindicación 1, en el que la planta comprende una construcción que comprende un promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado como se ha definido en la reivindicación 1 (b); y

(b) cruzar dicha planta con una segunda planta o consigo misma.

4. Un procedimiento de mejora de plantas, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) obtener una planta progenie de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 3, en el dicha planta progenie comprende la construcción como se ha definido en la reivindicación (3 (a); y

(b) cruzar dicha planta con ella misma o con una segunda planta.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el promotor de la coixina gamma tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 18, o SEQ ID Nº 19.