KR20010052350A

KR20010052350A - 식물에서 외래도입유전자를 발현시키는 방법 그 조성물

Info

Publication number: KR20010052350A
Application number: KR1020007012725A
Authority: KR
Inventors: 알란 엘 크리츠; 마이클 에이취 루페티; 데일 에이 보이리스
Original assignee: 데칼브 제네틱스 코오퍼레이션
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2001-06-25
Also published as: CA2328129C; WO1999058659A9; JP2002533057A; ES2301239T3; US6635806B1; DK1076706T3; CN1310760A; US7256283B2; US20080271212A1; US20050250938A1; MX236322B; AR020075A1; ATE385518T1; ID27936A; US7803928B2; TR200100104T2; EP1076706A2; WO1999058659A3; DE69938101T2; MXPA00011199A

Abstract

옥수수를 포함하는 단자엽 식물에서 외래도입유전자를 발현시키는 조성물 및 그 방법을 설명한다. 본 발명에서, 형질변환을 위해 Coix 속의 식물에서 취한 단자엽-상동성 서열을 이용하면 유전자 침묵을 피할 수 있다. 이와 같은 외래도입유전자 서열에는 Coix 프로모터, 인헨서, 코딩 서열 및 종료물질이 포함된다. 옥수수에서 유도된 외래도입유전자를 적절히 대체하면, 옥수수에서 발현시킬 수 있는데 이는 상동성에 기초한 유전자 침묵이 외래도입유전자 발현을 제한하거나 효과적으로 제거할 수 있다.

Description

식물에서 외래도입유전자를 발현시키는 방법 그 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSION OF TRANSGENES IN PLANTS}

2. 관련 기술의 설명

분자생물학 분야가 최근에 상당히 발전되어, 과학자들은 동물 및 식물의 생식질을 조절할 수 있는 능력이 급격히 강화되었다. 예를 들면, 특정 유전자형을 조절하는 유전자 예를 들면, 곤충에 항생제 및 살충제 저항성을 부여하는 유전자를 특정 생식세포질내에 위치시키고, 그로부터 분리하였다. 한 유기체로부터 분리된 유전자를 취하여, 또 다른 유기체로 도입시키는 능력이 더 중요하다. 이와 같은 형질변환은 유전자를 제공받는 것과는 상이한 동물 문(phylum), 속(genus), 종(species)으로부터 수용 유기체를 얻을 경우에도, 이와 같은 형질변환이 가능하다(이형 형질변환).

여러 가지 유전공학 기술을 이용하여 외생 유전자를 도입시킴으로써 식물의 게놈에 원하는 특징으로 유전공학적으로 만드는 시도가 있어왔다.

아그로박테리움(Agrobacterium) 감염(Nester et al., 1984), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-중개된 DNA 수용(Lorz et al., 1985), 원형질의 전기천공(Fromm et al., 1986), 미소 투사물 포격(Klein et al., 1987)등을 포함하는 여러 방법으로, 수용 식물 세포가 새로운 DNA를 취할 수 있다.

전술한 일부 기술을 이용하여 거의 일상적으로 식물을 형질변환시켜왔지만, 외생 DNA를 발현시키는 것은 다소 문제가 있다. 직면하게 되는 가장 심각한 문제 중에 하나는 "공동-억제(co-suppression)"으로 알려진 현상이다. 이 용어는 상동성 외래도입유전자를 도입시킨 후에, 외생 유전자의 유전자 발현이 저해되는 것을 설명하는 신조어로써(Jorgensen, 1990), 피튜니아(Petunia)에서 찰콘 합성효소(CHS)에서 처음으로 설명된 바 있다(Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). 그러나, 이와 같은 공동-억제는 CHS에서만 볼 수 있는 특징이 아니라, 형질변환된 식물에서 볼 수 있는 일반적인 현상이다. 개별적인 형질변환체에서 다양한 정도로 공동-억제가 나타나지만, 일부 식물에서는 관련된 위치에서 무효한 표현형이 만들어질 정도로 발생한다.

여러 형질변환된 식물 시스템에서 상동성에 의존하는 "유전자 침묵(gene silencing)" 현상이 나타났는데, 이는 적어도 부분적으로 상동성이 있는 외래도입유전자(들)과 상동성 내생 서열의 다수의 복사체가 관계한다(Jorgensen, 1995; Matzke and Matzke, 1995; Meyer, 1995). 다양한 침묵을 구별하는 가장 기초적인 특징은 관찰된 비활성이 전사 또는 전사후 수준에서 발생되는지, 그리고, 상호작용하는 서열사이에 상동성 부분으로 결정될 수 있는 지가 된다. 프로모터의 상동성으로 인하여 대개 전사 침묵이 발생된다(Neuhuber et al., 1994).

프로모터 상동성-의존성 유전자 침묵은 전사를 간섭하고, 일부의 경우에는 이상-돌연변이의 원인이 되어, 유전자 발현에 유전적인 변화를 유도하거나 외래도입유전자의 분리후에도 지속되는 DNA 변형을 유도한다(Lindbo et al., 1993; Jorgensen, 1995; Matzke and Matzke, 1995; Park et al., 1996). 유전자 발현에서 이와 같은 변화의 원인에 대해서는 아직 밝혀지지 않았지만, 상동성 길이 및 상호작용 서열의 위치등에 의해 침묵이 영향을 받는 것으로 알려져 있다.

노팔린 합성효소 프로모터의 경우에, 300bp 상동성 부분으로도 담배에서 공동-억제를 충분히 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Matzke et al., 1993). 또한노팔린 합성효소 프로모터에 상동성 부분을 가지는 H₂로 알려진 내생 서열은 노팔린 합성효소 프로모터에 의해 작동되는 강력한 유전자 침묵물질이다(Matzke et al., 1993; Matzke et al., 1994). 이는 침묵 및 표적 위치에서 노팔린 합성효소 프로모터가 쌍을 이루고, 침묵물질에 의해 자생적으로 수득된 것과 유사한 정도로 표적 복사체상에 메틸화를 부과하는 것과 관련된 것으로 보인다(Matzke et al., 1994). 공동-억제의 가장 효과적인 예로는 CaMV의 19S 및 35S 프로모터에 의해 각각 작동되는 두 개 유전자를 가지는 외래도입유전자 삽입체를 운반하는 담배주이다. 두 개 프로모터에 연결된 이들 두 유전자가 억제되고, 이 위치는 적어도 90bp의 공통의 상동성 부분을 제공하는 새로 도입된 구조체를 trans-비활성화시킨다(Vaucheret,1993).

전사 침묵은 특히 농업분야의 생명공학 기술에서 문제가 되는데, 특정 외래도입유전자의 발현에 가장 유용한 프로모터의 대부분이 숙주 게놈에 고유한 것이다. 이는 농업에서 가장 중요한 것 중에 하나인 옥수수에서도 마찬가지이다. 원하는 발현 프로파일을 가지는 몇 가지 옥수수 프로모터에는 Adh와 슈크로즈 합성효소 유전자의 프로모터와 같은 구성 옥수수 프로모터(Walker et al., 1987; Yang and Russell, 1990), 옥수수 제인 및 광 수확 복합체 프로모터과 같은 조직-특이적인 프로모터(Conkling et al., 1990; Simpson, 1986), 옥수수 열 쇼크 단백질과 같은 유도성 프로모터(Odell et al., 1985)등이 포함된다.

따라서, 식물 특히, 옥수수와 같은 농업적으로 중요한 단자엽 식물에서 내생 유전자를 발현시키는 개선된 방법이 당분야에 절실하다. 특히, 과학자들이 상동성 서열의 공동-억제와 관련된 문제를 피하면서 단자엽 프로모터의 원하는 특징을 개발할 수 있는 방법이 요구된다. 농업적으로 중요한 단자엽 종에 고유한 프로모터에 적절한 대안이 부족한 것이 현행 기술의 한계이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명은 한 특정은 단자엽 식물에서 유전자를 발현시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 선택된 유전자를 제공하고; (b) Coix 프로모터에 연결된 상기 유전자로 구성된 구조체를 준비하고; (c) 이와 같은 구조체를 이용하여 수용 단자엽 세포를 형질변환시키고; (d) 상기 유전자를 발현시키는 단자엽 식물을 재생하는 단계로 구성된다. 형질변환 단계에는 식물을 안정적으로 형질변환시킬 수 있는 임의 방법이 포함되는데, 여기에는 미소 투사물 포격, PEG 중개된 원형질 형질변환, 전기천공, 탄화실리콘 섬유 중개된 형질변환 또는 Agrobacterium-중개된 형질변환등이 포함된다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 형질변환 단계는 구조체로 구성된 DNA로 미소투사물을 피복하고, 미소투사물을 수용 세포와 접촉시키는 것으로 된 미소투사물 포격으로 구성된다.

형질변환된 식물에서 발현되기를 원하는 임의 유전자가 될 수 있는데, 예를 들면, 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등이 포함된다. 본 발명의 특정 구체예에서, Coix의 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70등에서 선택된 유전자의 프로모터이다. Coix 프로모터는 감마 코익신(coixin) 프로모터이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 상기에서 설명하는 방법에 따라 단자엽 식물을 준비하고; (b) 식물 자체 또는 제 2 식물과 식물을 교배하는 단계로 구성된 방법을 이용하여 후손을 만드는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 식물을 개량하는 방법을 제공하는데, 이는 (a) 상기에서 설명하는 방법에 따라 준비된 단자엽 식물의 임의 세대 식물 후손을 얻고; (b) 식물자체와 또는 제 2 식물과 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 단자엽 식물에서 유전자 침묵을 예방하는 방법을 제공하는데; (a)단자엽 식물의 프로모터와 상동성인 Coix 프로모터를 확인하고; Coix 프로모터를 클로닝하고; (c) 선별된 유전자에 Coix 프로모터가 연결된 것으로 구성된 구조체를 준비하고; (d) 단자엽의 수용 세포에 구조체를 형질도입시키고; (e) 수용 세포로부터 유전자를 발현시키는 식물을 재생시키는 것으로 구성된다. 단자엽 식물은 쌀, 밀, 보리, 호밀, 사탕수수 및 옥수수를 포함하는 임의 단자엽 식물이 될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서는 단자엽 식물은 옥수수이다.

형질변환 단계는 식물 게놈으로 DNA를 도입시키는 임의 방법으로 구성되는데, 예를 들면, 미소 투사물 포격, PEG 중개된 원형질 형질변환, 전기천공, 탄화실리콘 섬유 중개된 형질변환 또는 Agrobacterium-중개된 형질변환등을 포함한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 형질변환 단계는 구조체로 구성된 DNA로 미소투사물을 피복하고, 미소투사물을 수용 세포와 접촉시키는 것으로 된 미소투사물 포격으로 구성된다. 선별된 유전자로는 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자(박테리아, 바이러스, 곰팡이 또는 선충류), 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등이 포함된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70, 올레오신등에서 선택된 유전자로부터 얻는 것이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 확인 단계는 단자엽 프로모터 또는 인접 서열에서 취한 DNA를 Coix DNA에 하이브리드시키는 것으로 구성된다. Coix의 DNA는 게놈 DNA 클론 라이브러리로 구성된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, Coix 프로모터를 확인하는 단계는 PCR^TM로 구성된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 상기에서 설명하는 방법에 따라 단자엽 식물을 준비하고; (b) 식물 자체 또는 제 2 식물과 식물을 교배하는 단계로 구성된 방법을 이용하여 후손을 만드는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 옥수수 발현 벡터를 준비하는 방법을 제공하는데; (a) 원하는 발현 프로파일을 가지는 단자엽 프로모터를 확인하고; (b) 옥수수 프로모터에 상동성인 Coix 프로모터를 분리시키고; (c) 선별된 유전자에 연결된 Coix 프로모터로 구성된 발현벡터를 작제하는 것으로 구성된다. 본 발명의 특정 구체예에서는 단자엽 식물은 쌀, 밀, 보리, 호밀, 사탕수수 및 옥수수를 포함하는 임의 단자엽 식물이 될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서는 단자엽 식물은 옥수수이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서는 선별된 유전자로는 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자에서 선별된 성질을 인코드한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는 단자엽 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70, 올레오신에서 선별된 유전자에서 얻는다.

본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:8의 핵산 서열에서 분리할 수 있는 분리된 감마 코익신 프로모터를 제공한다. 또한, 본 발명에서는 SEQ ID NO:8의 약 80 내지 894개 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 분리된 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 분리된 핵산 서열은 SEQ ID NO:8의 약 222개 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성되거나 SEQ ID NO:18의 핵산 서열로 구성된다. 분리된 핵산 서열은 서열 SEQ ID NO:8의 412개 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성되거나 또한 SEQ ID NO:19의 핵산 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 감마 코익신 단백질 또는 펩티드를 인코드하는 분리된 DNA를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예, DNA 단편은 SEQ ID NO:16에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 인코드한다. DNA 단편은 또한, SEQ ID NO:16의 약 100개 내지 603개 또는 약 350개 내지 약 603개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 SEQ ID NO:11의 핵산 서열에서 분리할 수 있는 분리된 감마 코익신 종료물질을 제공한다. 코익신 종료물질은 SEQ ID NO:11의 약 80개 내지 약 412개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 구체예에서, 종료물질은 SEQ ID NO:11의 약 200개 내지 약 412개 또는 약 325개 내지 412개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다. 종료물질은 SEQ ID NO:11의 핵산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는 SEQ ID NO:17의 핵산 서열에서 분리할 수 있는 Coix 올레오신 3 종료물질을 제공한다. 본 발명에서는 SEQ ID NO:17의 약 50개 내지 약 377개 또는 약 120개 내지 약 377개 또는 약 220개 내지 약 377개 또는 약 300개 내지 약 377개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 분리된 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 한 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:17의 핵산 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 측면은 감마 코익신 프로모터로 구성된 선별된 DNA를 가지는 수정한 형질변환된 식물을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 감마 코익신 프로모터는 SEQ ID NO:8로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:8의 약 80개 내지 약 894개, 또는 약 222개 내지 약 894개, 또는 약 412개 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 분리된 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19의 핵산 서열로 구성된다. 프로모터는 임의 외생 유전자에 작동가능하도록 연결될 수 있는데, 이와 같은 유전자로는 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등이 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 감마 코익신 프로모터로 구성된 선별된 DNA를 가지는 수정한 형질변환된 식물을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 감마 코익신 단백질 또는 펩티드를 인코드하는 유전자는 SEQ ID NO:16에 의해 인코드된 폴리펩티드를 인코드한다. 감마 코익신을 인코드하는 유전자는 SEQ ID NO:16의 약 100개 내지 603개 또는 약 350개 내지 약 603개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다. 본 발명의 추가 구체예에서, 감마 코익신을 인코드하는 유전자는 SEQ ID NO:16의 핵산 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 감마 코익신 종료물질로 구성된 선별된 DNA로 구성된 수정된 형질변환된 식물을 제공한다. 본 발명의 구체예에서, 감마 코익신 종료물질은 SEQ ID NO:11에서 분리할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 감마 코익신 종료물질은 SEQ ID NO:11의 약 80개 내지 약 412개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 약 200개 내지 약 412개 또는 약 325개 내지 412개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 감마 코익신 종료물질은 SEQ ID NO:11의 핵산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 Coix 올레오신 3 종료물질로 구성된 선별된 DNA로 구성된 수정된 형질변환된 식물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서는 Coix 올레오신 3 종료물질은 SEQ ID NO:17에서 분리할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 종료물질은 SEQ ID NO:17의 약 50개 내지 약 377개 또는 약 120개 내지 약 377개 또는 약 220개 내지 약 377개 또는 약 300개 내지 약 377개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된다. 본 발명의 한 구체예에서, 종료물질은 SEQ ID NO:17의 핵산 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기에서 설명하는 임의 식물의 임의 세대의 후손 식물을 제공하는데, 이때 식물은 선택된 DNA로 구성된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 식물은 쌀, 밀, 보리, 사탕수수, 옥수수에서 선택된 단자엽 식물이 된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 식물은 담배, 토마토, 감자, 콩 및 목화에서 선택된 쌍자엽 식물이 된다.

본 발명의 또 다른 특징에 있어서, 본 발명의 외생 DNA를 유전시킬 수 있는 본 발명의 수정된 형질변환된 식물 또는 이의 형질변환된 후손끼리 또는 다른 제 2 식물과 교배하여 식물을 번식하는 방법을 제공한다.

1. 발명의 분야

본 발명은 전반적으로 형질변환된 식물에 관계한다. 좀더 구체적으로는 본 발명은 식물에서 외래도입유전자(transgene)를 발현시키는 방법 및 그 조성물에 관계한다.

다음의 도면은 본 출원의 일부분으로, 본 발명의 특정 측면을 설명하기 위함이다. 본 발명은 여기에서 제시하는 특정 구체예의 설명과 이들 도면을 참고로 하면 더 잘 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 플라스미드 pDPG844의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 894bp 프로모터(SEQ ID NO:8), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 2는 플라스미드 pDPG845의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 894bp 프로모터(SEQ ID NO:8), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 3은 플라스미드 pDPG846의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 412bp 프로모터(SEQ ID NO:19), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 4는 플라스미드 pDPG847의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 412bp 프로모터(SEQ ID NO:19), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 5는 플라스미드 pDPG848의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 222bp 프로모터(SEQ ID NO:18), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 6은 플라스미드 pDPG849의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자의 222bp 프로모터(SEQ ID NO:18), GUS 리포터 유전자의 코딩 서열, nos 종료물질로 구성된 발현 카세트이다.

도 7은 플라스미드 pDPG869의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자에서 취한 894bp 프로모터(SEQ ID NO:8), 쌀의 악티날 인트로놀, 감마 코익신 유전자의 코딩 서열(SEQ ID NO:16), 감마 코익신 종료물질(SEQ ID NO:11)로 구성된다.

도 8은 옥수수, 사탕수수 및 Coix의 유전자를 인코드하는 감마-프로라민의 프로모터 부분의 서열을 비교한 것이다. 세 개 서열에서 동일한 뉴클레오티드를 짙게 표시하였다. 옥수수, Coix, 사탕수수 프로모터 서열은 감마 제인(SEQ ID NO:23), 감마 코익신(SEQ ID NO:8); 감마 카피린(SEQ ID NO:22)으로 각각 나타내었다.

도 9는 플라스미드 pDPG851의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자에서 취한 894bp 프로모터(SEQ ID NO:8), 쌀의 악티날 인트로놀, 감마 코익신 유전자의 코딩 서열(SEQ ID NO:16), nos 종료물질로 구성된다.

도 10은 플라스미드 pDPG862의 지도이다. 플라스미드에는 감마 코익신 유전자에서 취한 894bp 프로모터(SEQ ID NO:8), 쌀의 악티날 인트로놀, 감마 코익신 유전자의 코딩 서열(SEQ ID NO:16), nos 종료물질로 구성된다.

도 11은 플라스미드 pDV108의 지도이다. 구제에는 감마 코익신 종료물질(SEQ ID NO:11)을 포함한다.

본 발명은 유전자 침묵을 제거하거나 감소시킨 외래도입유전자 발현 방법을 제공함으로써 선행기술의 단점을 극복한다. 본 발명은 유전자 침묵을 제한시키는데 충분한 차이점을 가지면서도 숙주 게놈의 것과 유사한 발현 프로파일을 가지는 단자엽에서 외생 유전자를 발현시키기 위한 프로모터를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서는 본 발명에 의해 제공되는 프로모터는 Coix 속에서 얻은 것이다. Coix 으로부터 유도된 프로모터는 옥수수 뿐만아니라 밀, 쌀, 보리, 호밀, 사탕수수와 같은 다른 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물에도 유용하다.

공동-억제, 센스 억제, 센스 공동-억제라고도 불리는 유전자 침묵 현상은 고유의 상동성 복사체를 가지는 서열을 도입할 경우에 유전자 발현을 감소시키거나 제거하는 것이다(Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). 유전자 침묵은 외래도입유전자의 조절 또는 코딩 부분에서 작용하고, 흔히 침묵된 부분의 메틸화반응과 관련된다. 농업 생명공학 분야에서, 조절 부분의 침묵은 많은 내생 프로모터가 외래도입유전자의 발현에 특히 유용한 성질을 가지는 경우에 특히 문제가 된다.

발명자는 본 발명의 유용성은 프로모터에 추가하여, Coix 의 요소로 구성된 발현 벡터를 만드는 것에 이른다고 생각하고 있다. 특히, 유전자 침묵을 피하고, 외래도입유전자 요소 및 고유 서열간에 상동성과 관연된 다른 문제점등이 Coix이외의 단자엽에서 발현되는 외래도입유전자에 Coix를 이용하여 피할 수 있다고 본다. 예를 들면 옥수수 유전자에 상동성인 코딩 부분은 옥수수에서는 효과적으로 발현되는 반면에, 고유 옥수수 유전자는 침묵하게 된다. 이는 Coix로부터 인헨서 요소 및 종료물질이 특히 유용한 것으로 보고 있다.

1. 본 발명에 이용할 프로모터

본 발명에는 옥수수와 같은 단자엽에서 외생 유전자를 발현시키기 위해 Coix 속의 프로모터를 이용하는 것을 포함한다. 이와 같은 프로모터는 Coix로부터 de novo로 분리하거나 또는 공지의 단자엽 프로모터의 유전적 정보를 기초하여 분리할 수 있다. Coix 프로모터를 확인하는데 특히 유용한 것으로 발명자가 생각하는 효과적인 방법은 옥수수 유전자 또는 프로모터에서 유도된 프라이머 또는 프로브를 이용하여 Coix에서 상동성 서열을 분리하는 것이다.

(i) 프로모터의 예시

유용한 프로모터에는 Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985에서 설명하는 유도성, 바이러스성, 합서, 구성 프로모터와, 일시적으로 조절된, 공간적으로 조절된, 그리고 공간-일시적으로 조절된 프로모터(Chau et al., 1989)등이 포함된다. 프로모터는 형질변환된 식물 세포 또는 형질변환된 식물의 전사 활성이 코딩 부분으로 가게하는 능력에 대해 선별된다. Coix 프로모터를 분리하는데 특히 유용한 것으로 간주되는 옥수수 서열의 일부예로는 Adh(Walker et al., 1987; Paul and Ferl, 1991; Genbank Accession No. S45022); 슈크로즈 합성효소(Yang ＆ Russell,1990); cab(Sullivan et al., 1989, Genbank Accession No.X14794); PEPCase(Hudspeth ＆ Grula, 1989; Yanagisawa and Izui, 1989, Genbank Accession Nos. X14579, X14581, X14580); R 유전자 복합체 관련된 유전자(Chandler et al., 1989; Consonni et al., 1993, Genbank Accession No. X67619; Radicella et al., 1991, Genbank Accession Nos. X57276, S48027)등이 포함된다. 다른 단자엽 예를 들면 쌀 악틴 프로모터의 서열(Genbank Accession No. S44221)이 유용할 수도 있다.

조직-특이적인 프로모터를 분리하기 위한 유전자의 예로는 곡물 슈크로즈 합성효소 I(Yang et al., 1990); 곡물 알코올 디하이드로게나제 I(Vogel et al., 1989; Dennis et al., 1984, Genbank Accession Nos. X04049, X00581); 곡물 광 수확 복합체(Simpson, 1986; Bansal et al., 1992, Genbank Accession No. M87020); 곡물 열 쇼크 단백질(Odell et al., 1985; Rochester et al., 1986, Genbank Accession No. X03714); 옥수수 제인(Reina et al., 1990, Genbank Accession No. X53514; Kriz et al., 1987, Genbank Accession No. X05911; Wandelt and Feix, 1989; Genbank Accession No. X14334; Langridge and Feix, 1983, Genbank Accession No. K00543; Reina et al., 1990, Genbank Accession No. X53515); 글로블린-I(Belanger and Kriz et al., 1991; Genbank Accession Nos. L22344, S22295); 찰콘 합성효소 유전자(Franken et al., 1991; Genbank Accession No. X60204)등이 된다.

다른 유사한 공지의 옥수수 서열에는 뿌리 세포 프로모터(Conkling et al., 1990) 및 조직 특이적인 인헨스(Fromm et al., 1989)등이 포함된다. 유도성 프로모터의 예로는 ABA- 및 팽압 유도성 프로모터 및 옥신-결합 단백질 유전자의 프로모터(Scwob et al., 1993; Genbank Accession No. L08425)등이 포함된다. 이형성 프로모터를 분리하는데 이용할 수 있는 다른 공지의 옥수수 서열에는 UDP 글루코즈 플라보노이드 그릴코실-트란스퍼라제 유전자(Ralston et al., 1988; Genbank Accession Nos. X07940; Y00616);MPI 프로테아네제 저해물질 유전자(Cordero et al., 1994; Genbank Accession No. X78988); 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 유전자(Genbank Accession No. U45859; Kohler et al., 1995, Genbank Accession No. L40803; Quigley et al., 1989, Genbank Accession No. X15408; Martinez et al., 1989, Genbank Accession No. X15596) 및 엽록체 유전자의 프로모터(Genbank Accession No. X86563)등이 포함된다.

다음의 표 1에서는 옥수수 및 다른 단자엽에서 발현을 위한 Coix 서열을 분리하기 위해 본 발명에서 고려하는 유전자 요소를 나열한 것이다. 이와 같은 여러 요소를 이용하여 하기에서 지적한 것과 같은 발현 벡터를 준비할 수 있다.

표 1a

표 1b

a. 지적한 프로모터는 옥수수 형질변환에 이용

b. 지적인 인트론 인헨스는 옥수수 형질변환에 이용

c. Coix 프로모터를 분리하여 옥수수 형질변환에 이용

d. Coix 단백질 코딩 서열(CDS)를 분리하여, 옥수수 형질변환에 이용

(ii) Coix로부터 상동성 서열의 클로닝

본 발명의 일부는 옥수수 유전자 또는 이의 인접부분에서 유도된 프로브 또는 프라이머를 이용하여 Coix 속으로부터 조절 부분을 분리하는 것과 관련된다. 프로브 또는 프라이머는 클론된 옥수수 DNA로 구성되거나 또는 DNA 서열 데이터를 기초하여 합성할 수 있다. 또는, 프로모터는 옥수수이외의 다른 종 단, 옥수수 및 Coix와 상당히 근접한 관계의 종에서 유도된 서열을 이용하여 분리할 수 있다. Coix에 있는 이형성 프로모터를 확인하는데 유용한 것으로 보이는 다른 종에는 호밀, 밀, 보리, 귀리, 사탕수수, 쌀와 같은 단자엽 식물이 포함된다.

여기에서 정의한 것과 같은 프로모터는 주형-의존성 과정에 있는 초기 핵산 합성을 프라이밍할 수 있는 임의 핵산을 포함한다. 일반적으로 프라이머는 길이가 10개 내지 20개 염기쌍의 올리고뉴클레오티드이나, 더 긴 서열도 이용할 수 있다. 프라이머는 이중 가닥 또는 단일 가닥이 될 수 있지만, 단일 가닥이 더 적절하다. 프로브는 프라이머로 작용할 수는 있지만, 다르게 정의된다. 프라이밍을 할 수 있지만, 프로브는 표적 DNA 또는 RNA에 결합하도록 고안되고, 증폭 과정에서는 이용할 필요가 없다.

적절한 구체예에서, 프라이머 또는 프로브는 장사능활성 종(³²P,¹⁴C,³⁵S,³H); 형광물질(로다민, 플로로레신); 항원(바이오틴, 스트렙토아비딘, 디고시제닌); 화학적발광물질(루시페라제)등으로 라벨시키거나 또는 효소에 직접 공액(알칼린 포스포타제)시킨다.

프로브 또는 프라이머를 준비한 후에, 이형 프로모터를 클로닝하는 제 1 단계는 적절한 클론 라이브러리를 준비하여 스크리닝하는데, 이 경우에는 Coix의 게놈 DNA 라이브러리가 된다. 스크리닝은 옥수수 프로모터 서열 또는 유전자 또는 관련 유전자의 DNA 서열로부터 고안된 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드반응에 기초한다. 이와 같은 스크리닝 프로코톨은 당업자에 공지의 것이고, Sambrook et al.(1989)에서 상세히 설명하고 있다.

1. 주형 의존성 증폭

주형 의존성 증폭 방법 예를 들면, PCR은 옥수수-상동성 또는 Coix로부터 다른 서열을 분리하는 효과적인 수준이 된다. 특히, 프라이머는 상동성 서열의 유전자 정보를 기초로하여 고안하는데, 이는 Coix 프로모터로 구성된 핵산 서열을 주형 의존성 증폭하는데 이용할 수 있다. 여러 가지 주형 의존성 공정은 주어진 주형 샘플에 존재하는 서열을 증폭시키는데 이용할 수 있다. 가장 잘 알려진 증폭 방법중에 하나는 폴리메라제 사슬 연쇄 반응(이라 PCR^TM라고 칭함)으로 이는 미국 특허 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159에서 잘 설명하고 있다.

간단하게 설명하면, PCR^TM에서 두 개 프라이머 서열은 표식 서열의 마주하는 상보 가닥에 있는 부분에 상보적인 두 개 프라이머 서열을 만든다. 과량의 데옥시뉴클레오시드 3인산염을 반응 혼합물에 DNA 폴리메라제 예를 들면 Taq 폴리메라제와 함께 첨가한다. 샘플에 표식 서열이 존재한다면, 프라이머는 표식에 결합하여 폴리메라제에 의해 프라이머는 뉴클레오티드를 첨가하면서 표식 서열을 따라 연장된다. 반응 혼합물의 온도를 조절함으로써, 연장된 프라이머가 표식으로부터 해리되어 반응 생성물을 만들고, 과량의 프라이머는 표식과 반응 생성물에 결합하고, 공정을 반복한다.

역전사효소 PCR^TM증폭 과정을 실시하여, 증폭된 mRNA양을 정량화할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사시키는 방법은 공지된 것으로 Sambrook et al.(1989)에서 설명하고 있다. 역전사를 위한 또 다른 방법은 열에 안정한 RNA-의존성 DNA 중합효소를 이용하는 것이다. 이와 같은 방법은 1990년에 출원된 PCT/WO90/07641에서 설명하고 있다. 폴리메라제 사슬 연쇄 반응 방법도 당분야에 공지된 것이다.

증폭을 위한 또 다른 방법은 리게이즈 사슬 반응("LCR")으로 이는 EP 0 320 308에서 설명하고 있다. LCR에서, 두 개 상보적인 프로브 쌍을 준비하고, 표적 서열 존재하에서 각 쌍이 접하는 표적의 마주하는 상보가닥에 결합하게 된다. 리게이즈 존재하에서, 두 개 프로브 쌍이 연결되어 단일 단위를 만든다. 온도를 PCR^TM와 같이, 교환시키, 결합된 결찰 단위가 표적으로부터 해리되도록 하고, 이것이 과량의 프로브 쌍의 결찰에 "표적 서열"로 작용하도록 한다. 미국 특허 4,883,750에서는 표적 서열에 프로브 쌍을 결합시키기 위한 LCR와 유사한 방법에 대해 설명하고 있다.

본 발명의 또 다른 증폭 방법으로 Qbeta Replicase(PCT/US87/00880에서 설명)를 이용할 수 있다. 이 방법에서, 표적에 상보적인 부분을 가지는 RNA의 복제 서열을 RNA 폴리메라제 존재하에 샘플에 첨가하였다. 폴리메라제는 감지될 복제 서열을 복사한다.

등온 증폭 방법(이는 한 가닥의 제한 효소 부위에 뉴클레오티드 5'-[α-티오]-트리포스페이트를 포함하는 표적 분자를 증폭시키는데 엔도뉴클레아제 및 리게이즈를 이용함)이 본 발명의 핵산을 증폭시키는데 이용할 수 있다(Walker et al., 1992).

가닥 치환 증폭(SDA)은 여러번의 가닥 치환 및 합성을 하게 되는 증, 니크 해독과 같은 핵산의 등온 증폭을 실행하는 또 다른 방법이 된다. Repair Chin Reation(RCR)이라고도 불리는 유사한 방법은 증폭을 위한 표적이 되는 부분에 몇 개의 프로브를 어닐시키고, 4개 염기중 2개만 존재하는 수복 반응을 실시한다. 다른 두 개 염기는 용이한 감지를 위해 바이오티닐화된 유도체 형으로 첨가한다. 유사한 방법이 SDA에 이용된다. 고리형 프로브 반응(CPR)을 이용하여 표적 특이적인 서열을 감지할 수 있다. CPR에서, 비-특이적인 DNA의 3' 및 5' 서열을 가지고, 특정 RNA의 중간 서열을 가지는 프로브를 샘플에 있는 DNA에 하이브리드시킨다. 하이브리드 반응시에 반응물은 RNase H로 처리하고, 프로브 생성물은 절단루에 방출되는 별개 생성물로 확인된다. 고유 주형은 또 다른 사이클링 프로브에 어닐시키고, 반응을 반복한다.

GB 2 202 328 및 PCT/US89/01025에서 설명하는 또 다른 증폭 방법을 본 발명에 이용할 수 있다. 전자의 경우에, "변형된" 프라이머를 PCR^TM-형 의존성, 주형-의존성, 효소-의존성 합성에 이용한다. 프라이머는 포집 부분(가령, 바이오틴) 또는 감지 부분(효소)을 이용하여 라벨시켜 변형시킨다. 후자의 경우에 라벨된 과량의 프로브를 샘플에 첨가한다. 표적 서열 존재하에서, 프로브가 결합하고, 촉매적으로 절단된다. 절단 후에, 표적 서열은 과량의 프로브에 의해 결합된 고유 형으로 방출된다. 라벨된 프로브가 절단되면서 표적 서열이 존재하는 것을 알린다.

다른 핵산 증폭 과정에는 전사계 증폭 시스템(TAS)이 포함되는데, 이에는 핵산 서열계 증폭(NASBA) 및 3SR(Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT/WO88/10315)이 포함된다. NASBA에서, 핵산은 표준 페놀/클로로포름 추출, 임상적인 샘플의 열 변성, 용해 완충액으로 처리, DNA 및 RNA의 분리를 위한 미니스핀 컬럼, RNA의 염화 구아니디늄 추출에 의해 준비할 수 있다. 이와 같은 증폭 기술은 표적 특이적인 서열을 가지는 프라이머에 어닐링시키는 것이다. 중합후에, DNA/RNA 하이브리드는 RNaseH로 절단시키고, 이중 가닥의 DNA 분자는 다시 열 변성시킨다. 어느 경우이건 간에, 단일 가닥의 DNA는 제 2 표적 프라이머의 첨가 및 중합반응에 의해 완전히 이중 가닥으로 된다. 그 다음 이중 가닥의 DNA 분자는 T7 및 SP6와 같은 RNA 중합효소에 의해 다중으로 전사된다. 등온 사이클 반응에서, RNA's는 단일 가닥의 DNA로 역전사되고, 이는 다시 이중 가닥 DNA로 변환된 다음 T7 또는 SP6와 같은 RNA 중합효소와 다시 전사시킨다. 절두형이건 완전한 형이건 생성된 생성물은 표적 특이적인 서열이다.

EP 0 329 822에서는 핵산 증폭 과정에 대해 설명하는데, 주기적으로 단일 가닥의 RNA("ssRNA"),ssDNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 합성하여, 본 발명에 이용할 수 있다. ssRNA는 제 1 프라이머 올리고뉴클레오티드의 주형인데 이는 역전사효소(RNA-의존성 DNA 중합효소)에 의해 연장된다. 그 다음 생성된 DNA:RNA 이중나선으로부터 리보뉴클레아제 H(DNA 또는 RNA와 이중나선을 이루는 RNA에 특이적인 RNase H, RNase)을 이용하여 RNA를 제거한다. 생성된 ssDNA는 제 2 프라이머의 주형으로 여기에는 RNA 폴리메라제 프로모터(T7 RNA 폴리메라제) 서열이 포함된다. 이와 같은 프라이머는 DNA 폴리메라제(가령, 대장균(E. coli) DNA 폴리메라제 I의 "Klenow" 단편)로 연장시켜, 이중 가닥 DNA("dsDNA") 분자를 만드는데, 이는 프라이머사이에서 고유 RNA의 서열과 동일하고, 말단에 프로모터 서열이 첨가되었다. 이와 같은 프로모터 서열을 적절한 RNA 폴리메라제가 이용하면, DNA의 많은 RNA 복사체를 만들 수 있다. 그 다음 이와 같은 복사체를 사이클에 넣고 매우 빠른 증폭을 유도할 수 있다. 적절한 효소를 선택하면, 이와 같은 증폭은 각 주기에서 효소를 첨가하지 않고도 등온상에서 실행할 수 있다. 이 공정의 주기 특징 때문에 시작 서열은 DNA 또는 RNA 형으로 선택되어야 한다.

PCT/WO89/06700에서는 표적 단일 가닥 DNA("ssDNA")에 프로모터/프라이머 서열을 하이브리드시키고, 서열의 많은 RNA 복사체를 전사시키는 핵산 서열 증폭 과정에 대해 설명한다. 이 과정은 주기적인 것이 아닌데, 즉, 새로운 주형이 생성된 RNA 전사체로부터 만들어지지 않는다. 다른 증폭 방법에는 "RACE" 및 "one-sided PCR^TM"(Frohman, 1990; Ohara et al., 1989)등이 포함된다.

생성된 디-올리고뉴클레오티드 서열을 가지고, 따라서 디-올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 핵산 존재하에서 두 개 또는 그이상의 올리고뉴클레오티드 결찰에 기초한 방법을 본 발명의 증폭 단계에 이용할 수 있다(Wu et al., 1989).

증폭 후에, 한 단계 또는 다른 단계에서, 특정 증폭이 발생되었는지를 결정하기 위해 주형으로부터 증폭 생성물과 과량의 프라이머를 분리시키는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 증폭 생성물은 표준 방법을 이용하여(Sambrook et al., 1989), 아가로즈, 아가로즈-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리시킬 수 있다.

또는, 효과적으로 분리시키기 위해 크로마토그래피 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 크로마토그래피 방법은 아주 많은데, 흡착; 분리, 이온-교환, 분자 거름 및 컬럼, 페이퍼, 박층, 기체 크로마토그래피등을 포함하여 이들을 상당히 특화시킬 수 있다(Freifelder, 1982).

생성물을 눈으로 확인하여, 표식 서열의 증폭을 확인한다. 일반적으로 확인하는 방법은 에티디움 브로마이드로 착색을 하여 UV 광에서 볼 수 있다. EH는 증폭 생성물에 방사능 또는 형광라벨된 뉴클레오티드로 라벨된 경우에 증폭 생성물을 X-선 필름에 노출시키거나 분리후에 적절한 자극 스펙트럼하에서 볼 수 있다.

한 구체예에서, 눈으로 확인하는 것을 간접적으로 할 수 있다. 증폭 생성물을 분리한 후에, 라벨된 핵산 프로브를 증폭된 표식 서열에 접촉시킨다. 프로브는 염색체와 공액되나 방사능라벨될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 프로브는 항체 또는 바이오틴과 같은 결합짝에 공액되고, 결합쌍의 다른 멤버는 감지가능한 부분을 가진다.

또 다른 구체예에서 감지는 라벨된 프로브에 의해 이루어진다. 관련된 기술은 당분야에 공지의 것이고, 분자생물학 책(Sambrook et al., 1989)에서 많이 찾아 볼 수 있다. 예를 들면, 크로모포러 또는 방사능라벨된 프로브 또는 프라이머로 증폭동안에 또는 증폭후에 표적을 확인할 수 있다.

전술한 것의 한 가지 예를 들면, U.S. Patent No. 5,279,721에서는 자동화된 전기영동 장치 및 방법 그리고 핵산을 전달하는 방법에 대해 설명한다. 장치로 전기영동을 하고, 블랏팅을 아여 본 발명에 따른 방법을 실행할 수 있다.

또한, 상기에서 설명하는 증폭 생성물은 서열 분석을 하여, 표적 서열 분석 기술을 이용하여 다양한 종류의 변수를 확인한다. 특정 방법에서, 최적의 서열화를 위해 고안된 프라이머 세트를 이용하여 서열 분석을 실행한다(Pignon et al., 1994). 본 발명은 임의 분석 또는 모든 형태의 분석을 이용할 수 있는 방법을 제공한다.

2. 서든/노든 블랏팅

블랏팅 기술은 당분야에 공지된 다른 방법으로 이를 이용하여 본 발명에서 이용하는 핵산을 확인할 수 있다. 예를 들면, 서든 블랏팅을 이용하여, 옥수수 유전자를 발현시키는데 유용한 권장물질인 Coix 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 분리시킬 수 있다. 특히, 옥수수의 cDNA 프로브를 Coix 식물의 게놈 DNA 클론에 하이브리드시켜, 상응하는 유전자의 프로모터 부분을 포함하는 클론을 분리시킬 수 있다. 또는 프로모터 자체 서열을 프로브로 이용하여 상동성 Coix 프로모터를 바로 확인할 수 있다.

서든 블랏팅은 표적으로 DNA를 이용하는데 비하여, 노던 블랏팅은 표적으로 RNA를 이용한다. 각각은 다른 정보를 제공하지만, cDNA 블랏팅은 많은 부분에서 블랏팅 또는 RNA 종에 유사하다. 간략하게 설명하면, 프로브를 이용하여 적절한 매트릭스 즉, 나티르셀룰로오즈 필터상에 고정된 DNA 또는 RNA종을 표적으로 한다. 여러 다른 종은 공간적으로 분리시켜 분석한다. 이는 핵산의 겔 전기영동 및 필터상에서의 "블랏팅"으로 실시된다.

연속하여, 블랏팅된 표적을 변성 및 재하이브리드 반응을 촉진시키는 조건하에서 프로브(통상 라벨된)와 배양시킨다. 프로브는 표적과 염기쌍을 이루도록 되어 있기 때문에, 프로브는 재변성 조건하에서 표적의 일부에 결합할 것이다. 결합안된 프로브를 제거하고, 상기에서 설명하는 것과 같은 감지를 실시한다.

3. 칩 기술

본 발명에서는 Hacia et al.(1996) 및 Shoemaker et al.(1996)에서 설명하는 것과 같은 칩에 기초한 DNA 기술에 대해 설명한다. 간략하게 설명하면 이와 같은 기술은 많은 유전자의 수를 신속하고 정확하게 분석하는 정량적인 방법이다. 유전자에 고정된 프로브 배열을 이용하거나 올리고뉴클레오티드로 태그하여, 칩 기술을 이용함으로써 고밀도 배열로 표적 분자를 분리시키고, 하이브리드 반응에 기초하여 이와 같은 분자들을 스크리닝하는 것이다(Pease et al., 1994; Fodor et al., 1991).

(iii) De novo Coix 프로모터 분리

본 발명은 다른 종의 프로모터에서 유도된 프로브 또는 프라이머를 이용하지 않고 분리된 Coix 프로모터를 이용한다. 옥수수에서 형질변환 및 외생 유전자를 발현시키기 위해 프로모터 및 이들의 구조체를 적절한 벡터로 클로닝하는 수단은 당업자에 공지의 것으로, Sambrook et al., 1989에서 잘 설명하고 있다. 옥수수에서 외래도입유전자 발현에 특히 유용한 것으로 간주되는 Coix 프로모터 타입은 구성 또는 비-구성적인 방식으로 높은 수준에서 발현되는 것이 된다. 바람직한 비-구성 프로모터에는 조직에서 발현되는 것 또는 일시적으로 특이적인 방식으로 발현되는 즉 유도성 프로모터가 된다. 일시적인 특이성이란 한 가지 이상의 특정 발생 기간에서 발현을 지시하는 프로모터를 말한다.

프로모터를 클로닝하는 일반적인 제 1 단계는 원하는 방식 즉, 구성적으로 또는 조직/일시적 특이성으로 발현되는 표적 유전자를 확인하는 것이다. 이에 효과적인 방법은 한 가지 이상의 확인된 표적 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 준비하고, 그 안에 많은 복제 클론을 확인하는 것이다. 특히 유익한 점은 유전자 복사체의 수는 적은데 비하여 cDNA 클론이 바로 제공된다는 것이다. 그 다음 cDNA 클론을 이용하여 당업자에 공지된 표준 라이브러리 스크리닝 기술로 프로모터 부분을 포함하는 5' 부분 인접한 코딩 서열로 구성된 게놈 DNA를 분리한다(see Sambrook et al., 1989).

프로모터를 클로닝하는 적절한 방법은 Siebert et al., 1995에서 설명하는 "억제 PCR"을 이용하는 것이다. 이 방법은 유전자 특이적인 고정 서열을 알고 있으면 클론안된 그리고 모르는 서열을 PCR 증폭시킬 수 있다. 이와 같은 서열을 이용하여, 상동성 또는 상동성 cDNA 서열과 같은 공지의 서열을 이용하여, 프로모터, 인헨서, 종료물질을 포함하는 측면에 있는 조절 원소를 클론한다.

1. 상대적인 정량적인 RT-PCR^TM로 유전자 발현의 정량화

식물로부터 분리된 특정 mRNA의 상대적인 농도를 측정하기 위해 RNA에서 RNA에서 cDNA로 역전사(RT)후, 상대적인 정량화 PCR^TM(RT-PCR^TM)를 시킨다. 특정 mRNA 종의 농도 변화를 결정하기 위해, 특정 mRNA 종을 인코드하는 유전자가 차등적으로 발현된다는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 방식으로, 옥수수 형질변환을 위한 발현 벡터 작제에 이용하기 위해, Coix로부터 추천 프로모터를 신속하게 확인하고, 스크리닝한다.

PCR^TM에서, 증폭된 표적 DNA 분자의 수는 일부 시약이 제한될때까지 반응의 모든 주기에서 2에 근접하는 인자에 의해 증가된다. 그 다음, 주기간에 증폭된 표적에 증가가 없을 때까지, 증폭 비율은 점점더 감소된다. 주기 수를 X출에 증폭된 표적 DNA의 농도를 Y축으로 하는 그래프를 플롯하였을 경우에, 플롯된 점을 서로 연결하면 특징적인 곡선이 형성된다. 제 1 주기가 시작될 때, 선기울기는 양성이고 일정하다. 이는 곡선에서 선형 부분을 말하는 것이다. 시약을 제한하게 된 후에는 선의 기울기는 감소되어 결국에는 0이 된다. 이 점에서 증폭된 표적 DNA의 농도는 일정 고정된 값에 점근 곡선이 된다. 즉, 곡선의 고원 부분을 말하는 것이다.

PCR^TM증폭의 선형 부분에서 표적 DNA의 농도는 반응이 시작되기 전에 표적의 시작 농도에 직선상으로 비례한다. 동일한 수의 주기를 완료하고, 선형 부분에 있는 PCR^TM반응에서 표적 DNA의 증폭된 생성물의 농도를 결정함으로써, 고유 DNA 혼합물에서 특정 표적 서열의 상대적인 농도를 결정하는 것이 가능하다. DNA 혼합물이 상이한 조직 또는 세포로부터 분리된 RNA에서 합성된 cDNA인 경우에, 표적 서열이 유도된 특정 mRNA의 상대적인 풍부량은 각 조직 또는 세포에 대해 결정할 수 있을 것이다. PCR^TM생성물의 농도 및 상대적인 mRNA 풍부성사이에 직접적인 비례는 PCR^TM반응의 선형 부분만 해당된다.

곡선의 고원 부분에 있는 표적 DNA의 최종 농도는 반응 혼합물에 있는 시약의 이용성으로 결정하는데, 이는 표적 DNA의 원래 농도와는 무관하다. 따라서, RNA 집단을 수집하기 위해 RT-PCR^TM에 의해 mRNA종의 상대적인 풍부성을 결정하기 전에 직면하는 제 1 조건은 PCR^TM반응이 곡선의 선형 부분에 있을 때, 증폭된 PCR^TM생성물의 농도를 샘플링해야 한다는 것이다.

특정 mRNA종의 상대적인 풍부성을 성공적으로 결정하기 위해, RT-PCR^TM연구에서 해야할 제 2 조건은 증폭가능한 cDNAs의 상대적인 농도를 일부 독립적인 기준에 맞추어 표준화시켜야 한다는 것이다. RT-PCR^TM연구의 목적은 샘플에 있는 모든 mRNA종의 평균 풍부성에 대한 특정 mRNA종의 풍부성을 결정하는 것이다.

경쟁 PCR^TM에 대한 대부분의 프로토콜은 대략 표적과 유사한 양으로 존재하는 내부 PCR^TM표준을 이용하다. 이런 전략은 PCR^TM증폭의 산물을 선형단계동안 샘플링하는 효과적이다. 반응이 정체 단계에 접근하는 시기에 산물을 샘플링하면, 수적으로 적은 산물이 상대적으로 과다발현된다. 분화발현에 대하여 RNA 샘플을 검사할 때와 같이, 다수의 상이한 RNA 샘플에 대하여 실시한 상대적 양의 비교하는 경우, 이런 비교의 결과는 RNA의 상대적 양의 차이가 실제보다 줄어드는 방향으로 왜곡된다. 내부 기준의 양이 표적보다 훨씬 많은 경우에는 이것은 그다지 문제가 되지 않는다. 내부 기준의 양이 표적보다 훨씬 많은 경우, RNA 샘플사이에서 선현 비교를 실시할 수 있다.

상기에서 식물 조직에 대한 RT-PCR^TM분석을 이론적으로 살펴보았다. 식물 조직 샘플에 내재된 문제는 이들의 양이 변하고(표준화에 문제야기), 이들의 성질이 변한다는(믿을만한 내부 기준, 가급적 표적보다 큰 내부 기준의 보조발현 필요) 점이다. 이들 문제는 내부 기준을 보유한 상대적 정량 RT-PCR^TM으로 RT-PCR^TM

를 실시하여 극복하는데, 여기서, 내부기준은 표적 cDNA 단편보다 크고, 내부 기준을 인코드하는 mRNA의 양은 표적을 인코드하는 mRNA의 양보다 대충 5-100배 더 많다. 이런 분석에서는 개별 mRNA 종류의 절대 양이 아닌 상대적 양을 측정한다.

다른 연구는 외부 기준 프로토콜을 보유한 좀더 일반적인 상대적 정량 RT-PCR^TM분석을 이용하여 실시할 수 있다. 이들 분석에서, 증폭 곡선의 선형 영역에서 PCR^TM산물을 샘플링한다. 샘플링에 최적인 PCR^TM사이클의 회수는 각 표적 cDNA 단편에 대하여 경험적으로 결정해야 한다. 또한, 다양한 조직 샘플로부터 분리한 각 RNA 개체군의 역전사효소 산물은 각 농도의 증폭가능한 cDNA에 대하여 조심스럽게 표준화시켜야 한다. 이런 고려는 이런 분석에서 절대 mRNA 양을 측정하기 때문에 특히 중요하다. 절대 mRNA 양은 표준화된 샘플에서만 분화 유전자 발현의 수치로서 사용할 수 있다. 증폭 곡선의 선형 범위의 경험적 결정과 cDNA 개체군의 표준화는 지루하고 시간이 많이 소모되긴 하지만, RT-PCR^TM분석의 결과는 내부 기준을 보유한 상대적 정량 RT-PCR^TM분석에서 유도한 결과보다 우수할 수 있다.

이런 장점의 한가지 이유는 내부 기준/경쟁물질이 없는 경우 모든 시약이 증폭곡선의 선형 범위에서 단일 PCR^TM산물로 전환되고, 따라서, 분석의 감수성을 증가시킬 수 있다는 점이다. 다른 이유는 하나의 PCR^TM산물을 보유하는 경우, 전기영동 겔에서 산물의 전시 또는 다른 전시 방법이 덜 복잡해지고, 배경이 줄어들어 해석하기가 용이하다는 점이다.

2. 비-표적화된 프로모터 분리

먼저 원하는 발현 프로파일을 보유한 유전자를 동정하는 표적화된 특정 방식으로 프로모터를 클로닝할 수 있을 뿐만 아니라, "삿건(shotgun)" 선별 전략을 이용하여 Coix프로모터를 클론할 수 있다. 가령, Coix DNA의 임의 분절에 결합된 선태가능 또는 선별가능 마크 유전자를 포함하는 다수의 벡터를 만들 수 있다. 이런 벡터는 제한 절단된 마크 유전자 DNA의 일부와 Coix 전체 게놈 DNA를 혼합하고 결찰시키고, DNA를 적당한 벡터에 클론시켜 만들 수 있다. 대안으로, "헤드리스 호스먼(headless horseman)"구조체를 사용할 수 있는데, 여기서, 클로닝 위치는 프로모터가 결핍된 마크 유전자의 직전에 위치한다. 이런 경우에, 마크 유전자는 프로모터가 클로닝 위치에 클론되는 경우에만 발현되게 된다. 일단 작제된 이들 벡터를 사용하여 다수의 옥수수 세포를 형질전환시킬 수 있다. 마크 유전자를 발현하는 형질전환체를 수거하여 옥수수에서 발현을 감독할 수 있는 신규한 Coix 프로모터를 동정한다.

(iv) 프로모터의 분석

일단 클론된 프로모터의 성분 또는 유용성은 서열 분석 또는 발현 분석으로 확인할 수 있다. 식물의 경우, 발현 분석은 배세포 또는 비-배세포, 또는 대안으로 전체 식물을 이용하는 시스템으로 구성된다. 세포분석을 이용할 때의 장점은 다수 식물의 재생산이 필요하지 않다는 점이지만, 이 시스템은 비-재생산된 세포상의 프로모터 활성이 식물에서 발현과 직접 상관관계를 갖지 않을 수도 있다는 점에서 제한적이다.

분석하는 생물샘플은 표준 방법(Sambrook et al., 1989)에 따른 임의의 식물 물질의 세포로부터 분리한 핵산으로 구성된다. 핵산은 게놈 DNA, 또는 분취된 또는 전체 세포 RNA다. 전체 RNA를 사용하는 경우, RNA를 상보성 DNA로 전환시키는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, RNA는 전체 세포 RNA이고, 다른 구체예에서, RNA는 폴리-A RNA이다. 일반적으로, 핵산은 증폭한다.

형태에 따라, 관심있는 특정 핵산은 증폭을 직접 이용하여 또는 증폭후 제 2의 공지된 핵산으로 샘플에서 동정한다. 다음, 동정된 산물을 검출한다. 특정 예에서, 검출은 시각적 수단(예, 겔의 에티디움 브로마이드 염색)으로 실시할 수 있다. 다른 검출방법에는 형광, 방사성라벨 또는 형광라벨의 방사성 섬광조영, 또는 전기 또는 열충격 신호(Affymax Technology; Bellus, 1994)를 이용한 시스템을 통한 산물의 간접적인 확인이 포함된다.

검출이후, 임의의 식물에서 관찰된 결과와 비-형질전환된 컨트롤 식물의 통계학적 유의성 그룹과 비교한다. 일반적으로 비-형질전환된 컨트롤 식물은 형질전환된 식물과 유전적 배경이 유사하다. 이런 방식으로, 다양한 형질전환된 식물에서 검출된 단백질의 양과 종류의 차이를 검출할 수 있다. 대안으로, 세포, 예를 들면, 유합세포 또는 비성숙 배아의 클론 배양물을 다른 세포 샘플과 비교한다.

지시한 바와 같이, 본 발명의 세포 또는 식물과 연관된 프로모터의 선별에는 다수의 상이한 분석을 고려할 수 있다. 이런 기술들을 사용하여 세포 유전자의 존재와 발현 및 유전자 구조체상에 일어나는 재배열을 검출할 수 있다. 이런 기술에는 형광 in situ 하이브리드형성(FISH), 직접 DNA 서열분석, 펄스된 필드 겔 전기영동(PFGE)분석, 서든 또는 노잔 블라팅, 단일-가닥 변환 분석(SSCA), RNAse 보호분석, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO), 닷 블랏 분석, 변성 구배 겔 전기영동, RFLP, PCR^TM-SSCP이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다.

프로모터를 포함하는 클론을 본 발명에 따라 분리하는 경우, 클론내 필수 프로모터 영역의 범위를 정하는 것을 생각해 볼 수 있다. 이를 위한 효과적인 방법은 결실이다. 결실 분석에서, 일련의 구조체를 만드는데, 각각은 클론의 상이한 영역(서브클론)을 보유하고, 이후 각 구조체는 프로모터 활성에 대하여 선별한다. 활성을 선별하는 적절한 방법은 결실된 프로모터 구조체를 선별가능 또는 선택가능 마크에 부착시키고, 마크유전자를 발현하는 세포를 분리하는 것이다. 이런 방식으로, 프로모터 활성을 보유하는 다수의 상이한 결실 프로모터 구조체를 동정할 수 있다.

II 돌연변이된 프로모터를 만드는 방법

본 발명자는 Coix 프로모터를 돌연변이시켜 옥수수에서 외래도입유전자의 발현을 위한 프로모터의 유용성을 상당히 향상시킬 수 있을 것으로 생각하였다. Coix 프로모터의 돌연변이 유발은 임으로 실시하고, 돌연변이된 프로모터는 시행착오 과정에서 유용성을 선별할 수 있다. 대안으로, 원하는 발현 특성을 보유한 Coix 프로모터를 제공하는 특정 서열을 확인하고, 이들 또는 유사한 서열을 돌연변이를 통해 옥수수 프로모터에 도입할 수 있다. 옥수수이외에, 다른 종에서 얻은 프로모터를 돌연변이시켜 Coix 프로모터의 유익한 특성을 보유한 프로모터를 제공할 수 있다. 가령, 쌀, 귀리, 사탕수수, 보리 또는 밀에서 얻은 프로모터를 돌연변이시켜 옥수수에서 외래도입유전자 발현에 대하여 강화된 향상된 유용성을 보유한 돌연변이된 프로모터를 제공할 수 있다.

본 발명의 프로모터를 인코드하는 DNA 분절을 돌연변이시키는 방법은 당업자에게 공지된 것이다. 이런 프로모터 영역에 대한 변형은 임으로, 또는 특정-부위 돌연변이 유발로 실시할 수 있다. 프로모터 영역은 상응하는 비-변형된 프로모터 영역을 인코드하는 서열의 하나 또는 복수의 뉴클레오티드의 부가 또는 결실을 통해 구조를 변형시킬 수 있다.

돌연변이 유발은 당분야에 공지된 기술중 하나에 실시할 수 있는데, 이런 기술에는 특정 프로모터 영역의 서열내 하나 또는 복수의 돌연변이를 보유한 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것이 포함되지만, 이에 국한시키지 않는다. 특히, 특정부위 돌연변이 유발은 기본 DNA의 특정 돌연변이를 통한 프로모터 변이체의 제조에 유용한 기술이다. 이 기술은 또한, 하나 또는 복수의 핵산서열 변화를 DNA에 도입함으로써 서열 변이체를 만들고 시험할 수 있는 능력을 제공한다. 특정부위 돌연변이 유발은 원하는 돌연변이의 DNA 서열 및 인접한 다수의 뉴클레오티드를 인코드하는 특정 올리고뉴클레오티드를 이용한 변이체의 생산을 가능하게 하고, 이를 통해, 가로지르는 결실 접합부의 양 측면에서 안정된 이중나선을 형성할 만큼 충분한 크기와 서열 복합성을 보유한 프라이머 서열을 제공한다. 일반적으로, 17 내지 75개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 프라이머가 적절한데, 10 내지 25개 또는 그 이상의 잔기는 변형되는 서열의 접합부 양 측면에 위치한다.

일반적으로, 특정 부위 돌연변이 유발 기술은 당분야에 공지된 것으로, 다양한 간행물에서 예시하고 있다. 인지하는 바와 같이, 이 기술에는 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥형으로 존재하는 파이지 벡터가 사용된다. 특정 부위 돌연변이 유발에 유용한 전형적인 벡터에는 M13 파아지와 같은 벡터가 포함된다. 이들 파아지는 상업적으로 구할 수 있고, 이들의 용도는 당업자에게 공지된 것이다. 이중 가닥 플라스미드 또한, 특정부위 돌연변이 유발에 사용하는데, 상기 플라스미드를 사용하면, 플라스미드에서 얻은 관심있는 유전자를 파아지로 옮기는 단계가 필요없다.

일반적으로, 이 글에서 특정부위 돌연변이 유발은 먼저 단일 가닥 벡터를 수득하거나, 또는 서열내 원하는 프로모터 영역 또는 펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 보유하는 이중 가닥 벡터의 이중 가닥을 분리시켜 실시한다. 원하는 돌연변이된 서열 보유한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 합성하여 만든다. 이후, 이 프라이머는 단일-가닥 벡터에 어닐링시키고, 대장균(E. coli) 중합효소 I Klenow 단편 DNA 중합화 효소에 처리하여 돌연변이-보유 가닥의 합성을 완성시킨다. 따라서, 이형이중나선은 한 가닥이 원래의 비-돌연변이된 서열을 인코드하고, 제 2 가닥이 원하는 돌연변이를 보유하는 경우에 형성된다. 이후, 이 이형이중나선 벡터를 이용하여 적당한 세포, 예를 들면, 옥수수 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시키고, 돌연변이된 서열을 보유한 재조합 벡터를 함유하는 세포를 선별한다. 유전자 선별 계획은 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 통합한 클론의 양을 증가시키기 위해서 Kunkel et al.(1987)이 고안한 것이다. 대안으로, 상업적으로 구매가능한 열안정성 효소(예, Taq 중합효소)를 이용한 PCR^TM로, 돌연변이 올리고뉴클레오티드 프라이머를 증폭된 DNA 단편에 통합시키는데, 상기 DNA 단편은 이후, 적당한 클로닝 또는 발현 벡터에 클론시킬 수 있다. PCR^TM-매개된 돌연변이 유발 과정(Tomic et al.(1990), Upender et al.(1995))은 이런 프로토콜의 2가지 예를 제공한다. 열안정성 중합효소이외에 열안정성 리가제를 이용한 PCR^TM을 사용하여, 인산화된 돌연변이 올리고뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편에 통합하는데, 상기 DNA 단편은 이후, 적당한 클로닝 또는 발현 벡터에 클론시킨다. Michael(1994)이 제시한 돌연변이 유발 과정은 이런 프로토콜의 한 예이다.

특정부위-돌연변이유발을 유발을 이용한 선별된 프로모터-인코드한 DNA 분절의 서열 변이체 제조는 잠재적으로 유용한 종을 생산하는 수단으로 제시하지만, 이에 한정하지 않는데, 그 이유는 DNA 서열의 서열 변이체를 수득할 수 있는 다른 방법이 존재하기 때문이다. 가령, 원하는 프로모터 서열을 인코드하는 재조합 벡터는 돌연변이 작용제, 예를 들면, 하이드록시아민을 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다.

이 글에서, "올리고뉴클레오티드 위주의 돌연변이유발 과정"은 주형-의존한 과정과 벡터-매개된 증식을 의미하는데, 이를 통해, 초기 농도에 비하여 특정 핵산 분자의 농도가 증가하거나, 또는 증폭과 같은 탐지가능한 신호의 농도가 증가한다. 이 글에서 "올리고뉴클레오티드 위주의 돌연변이유발 과정"은 또한, 프라이머 분자의 주형-의존한 확대를 포함하는 과정을 의미한다. 주형-의존한 과정은 RNA 또는 DNA 분자의 핵산합성을 의미하는데, 여기서, 새롭게 합성된 핵산가닥의 서열은 공지된 상보성 염기쌍 규칙에 따른다(Watson and Ramstad, 1987). 일반적으로, 벡터 매개된 방법에는 핵산 단편의 DNA 또는 RNA 벡터로의 도입, 벡터의 단세포성 증폭, 증폭된 핵산 단편의 수거가 포함된다. 이런 방법의 예는 U.S. 특허 No. 4,237,224에서 제시하는데, 상기 자료는 여기에 참고문헌으로 한다. 샘플에 존재하는 관심있는 표적서열을 증폭시키기 위하여 다수의 주형 의존한 과정을 이용할 수 있는데, 이런 방법은 당분야에 공지된 것으로, 하기에 자세히 설명한다.

III 형질전환

DNA 분절을 세포로 형질전환시키기 위한 다수의 방법이 있지만, 모든 방법이 DNA를 식물세포에 전달하는데 적합한 것은 아니다. 본 발명에 사용할 수 있는 방법에는 DNA를 세포로 도입할 수 있는 거의 모든 방법이 포함되는데, 이런 방법의 예로는 원핵질체의 PEG-매개된 형질전환에 의한 DNA의 직접 전달(Omirulleh et al., 1993), 건조/저해-매개된 DNA 흡입(Potrykus et al., 1985), 에렉트로포레이션(U.S. Patent No. 5,384,253), 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반(Kaeppler et al., 1990; U.S. Patent No. 5,302,523; U.S. Patent No. 5,464,765), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환(U.S. Patent No. 5,591,616; U.S. Patent No. 5,563,055), DNA 피복된 입자의 가속화((U.S. Patent No. 5,550,318; U.S. Patent No. 5,538,877; U.S. Patent No. 5,538,880)를 들 수 있다. 이런 기술의 적용을 통해, 옥수수와 실제적으로 거의 모든 식물 종은 안정적으로 형질전환시키는데, 이들 세포는 유전자도입 식물로 성장한다. 특정 구체예에서, 가속화 방법이 선호되는데, 여기에는 미소투사물 투하가 포함된다.

(i) 에렉트로포레이션

에렉트로포레이션으로 DNA를 도입하려는 경우, Krzyzek(U.S. Patent No. 5,384,253)등의 방법이 특히 바람직한 것으로 생각된다. 이런 방법에서, 특정 세포벽-분해효소, 예를 들면, 펙틴-분해 효소를 사용하여, 비처리된 세포보다 표적 수용세포가 형질전환에 더 민감하도록 만든다. 대안으로, 수용세포는 기계적 상처로 형질전환에 민감하도록 만든다.

에렉트로포레인션에 의한 형질전환을 실행시키기 위하여, 세포의 현탁액 또는 배유합세포와 같은 연약한 조직을 이용하거나, 또는 비성숙 또는 다른 조직화된 조직을 직접 형질전환시킨다. 이 기술에서, 선택된 세포의 세포벽을 펙턴-분해 효소(펙토릴라제)에 노출시키거나 또는 조절된 방식의 기계적 상처로 세포벽의 일부를 분해시킨다. 손상되지 않은 세포의 에렉트로포레이션에 의해 형질전환되는 종의 예에는 옥수수(U.S. Patent No. 5,384,253; D'Halluin et al., 1992; Rhodes et al., 1995), 밀(Zhou et al., 1993), 토마토(Hou and Lin, 1996), 대두(Christou et al., 1987), 담배(Lee et al., 1989)가 포함된다.

식물의 에렉트로포레인션 형질전환을 위해 원핵질체를 사용할 수도 있다(Bates, 1994; Lazzeri, 1995). 가령, 자엽-유래한 원형질체의 에렉트로포레이션에 의한 유전자도입 대두 식물의 발생은 Dhir와 Widholm이 제시한다(Intl. Patent Appl. Publ. No. WO 9217598). 원형질체 형질전환이 기술되고 있는 다른 종의 예에는 보리(Lazerri, 1995), 귀리(Battraw et al., 1991), 옥수수(Bhattacharjee et al., 1997), 밀(He et al., 1994), 토마토(Tsukada, 1989), 대두(Dhir et al., 1992)가 포함된다.

(ii) 미소투사물 투하

본 발명에 따라 형질전환 DNA 분절을 식물세포에 전달하는 적절한 방법은 미소투사물 투사(U.S. Patent No. 5,550,318; U.S. Patent No. 5,538,880; U.S. Patent No. 5,610,042; PCT Application WO 94/09699)다. 이 방법에서, 입자는 핵산으로 피복하고 추진력으로 세포에 전달한다. 입자의 예는 텅스텐, 플랜티늄, 금으로 구성된 입자들이다. 일부 경우에, 금속입자로의 DNA 침전은 미소투사물 투사를 이용한 DNA의 수용세포 전달에는 불필요하다. 하지만, 입자는 DNA로 피복하기 보다는 DNA를 함유하도록 하는 방안을 생각해 볼 수 있다. 따라서, DNA-피복된 입자 자체가 아닌 입자 투하를 통하여 DNA 전달의 수준을 증가시키는 방안을 제안한다.

가속화로 DNA를 옥수수 세포로 전달하는 방법의 구체예는 유전자 주입 전달 장치(Biolistics Particle Delivery System)인데, 이 장치는 DNA 또는 세포로 피복된 입자를 추진시켜 망(예, 스테인레스 또는 Nytex 망)에 통과시킨 후, 현탁액에서 배양한 단자엽 식물 세포로 덮혀 있는 필터표면에 DNA 또는 세포를 전달하는데 사용할 수 있다. 망은 입자를 분산시키고, 이들 입자가 응집된 상태로 수용세포에 전달되지 않도록 한다. 투사물 장치와 투하될 세포사이의 망은 투사물 응집체의 크기를 감소시켜 너무 큰 투사물에 의한 수용세포에 대한 피해를 감소시킴으로써 더 높은 빈도의 형질전환에 기여한다.

미소투사물 투하 기술은 광범위하게 응용되고 있는데, 실제적으로 거의 모든 종을 형질전환시키는데 사용한다. 미소투사물 투하에 의해 형질전환된 종의 예에는 옥수수(PCT Application WO 95/06128), 보리(Ritala et al., 1994; Hensgens et al., 1993), 밀(U.S. Patent No. 5,563,055), 쌀(Hensgens et al., 1993), 귀리(Torbet et al., 1995; Torbet et al., 1998), 호밀(Hensgens et al., 1993), 사탕수수(Bower et al., 1992), 사탕수수(Casa et al., 1993; Hagio et al., 1991)와 같은 단자엽 및 담배(Tomes et al., 1990; Buising and Benbow, 1994), 대두(U.S. Patent No.5,322,783), 해바라기(Knittel et al. 1994), 땅콩(Singsit et al., 1997), 목화(McCabe and Martinell, 1993), 토마토(VanEck et al. 1995), 전반적인 콩류(U.S. Patent No. 5,563,055)와 같은 쌍자엽이 포함된다.

투하를 위해, 현탁액상의 세포는 필터 또는 고형 배양배지에 농축시킨다. 대안으로, 비성숙 배또는 다른 표적 세포는 고형 배양배지에 정렬시킨다. 투하할 세포는 미소투사물 정지판 아래에 적당한 거리를 두고 위치시킨다. 원하는 경우, 가속장치와 투하할 세포사이에 하나 또는 복수의 망을 위치시킬 수 있다.

(iii) 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 전달은 유전자를 식물세포에 도입하기 위하여 애용되는 시스템인데, 그 이유는 DNA를 전체 식물 조직에 도입할 수 있어, 원형질체로부터 식물을 재생시킬 필요가 없기 때문이다. DNA를 식물세포에 도입하기 위한 벡터를 통합하는 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 식물의 이용은 당분야에 공지된 것이다. 이 방법은 Fraley et al.,(1985), Rogers et al., (1987), U.S. 특허 No. 5,563,055에서 제시한다.

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효과적인데, 아라비도프시스(Arabidopsis), 담배, 토마토, 감자를 비롯한 쌍자엽의 형질전환을 위한 바람직한 방법이다. 실제로, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환은 수년동안 쌍자엽 식물에 사용되었지만, 최근에는 단자엽 식물에도 적용되고 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환 기술의 진보로 인해, 지금은 거의 모든 단자엽 식물에 이 기술이 적용되고 있다. 가령, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환은 기술은 쌀(Hiei et al., 1997; Zhang et al., 1997; U.S. Patent No. 5,591,616), 밀(McCormac et al., 1998), 보리(Tingay et al., 1997; McCormac et al., 1998), 옥수수(Ishidia et al., 1996)에 적용되고 있다.

현재, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환 벡터는 전술한 바와 같이(Klee et al., 1985) 조작이 용이해 대장균(E.coli)과 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 복제에 사용할 수 있다. 또한, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 유전자 전달을 위한 벡터 분야에서의 기술적인 진보로 인해, 벡터상의 유전자와 제한위치의 배열이 향상되어, 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자를 발현하는 벡터를 용이하게 작제할 수 있게 되었다. 전술한 벡터(Rogers et al., 1987)는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접 발현을 위한 폴리아데닐화 신호와 프로모터가 측면에 위치하는 다중-링크 영역을 보유하여, 본 발명의 목젝에 적당하다. 또한, 무장된 또는 무장해제된 Ti 유전자를 보유한 아그로박테리움(Agrobacterium)을 형질전환에 사용할 수 있다. 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환이 효과적인 이들 식물 종에서, 유전자 전달의 쉽고, 한정된 성격으로 인해 선택되는 방법이다.

(iv) 다른 형질전환 방법

식물 원형질체의 형질전환은 칼슘 인산염 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 에렉트로포레이션, 이들 처리의 혼합에 기초한 방법을 이용하여 성취할 수 있다( Portrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Omirulleh et al., 1993; Fromm et al., 1986; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).

상이한 식물 균주에 이들 시스템을 적용하는 것은 원형질체로부터 특정 식물종을 재생시키는 능력 때문이다. 원형질체로부터 곡식을 재생시키기 위한 방법의 예는 기술되고 있다(Fujimara et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986; Omirulleh et al., 1993 and U.S. Patent No. 5,508,184). 곡식 원형질체의 직접 흡입 형질전환의 예에는 쌀(Ghosh-Biswas et al., 1994), 사탕수수(Battraw and Hall, 1991), 보리(Lazerri, 1995), 귀리(Zheng and Edwards, 1990), 옥수수(Omirulleh et al., 1993)의 형질전환이 포함된다.

원형질체로부터 재생할 수 없는 식물종을 형질전환시키기 위하여, 손상되지 않은 세포와 조직에 DNA를 도입하는 다른 방법을 사용할 수 있다. 가령, 비성숙 배또는 외식편으로부터 곡식의 재생은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다(Vasil, 1989). 또한, 실리콘 카바이드 섬유-매개된 형질전환은 원형질체 형성시켜 또는 원형질체 형성없이 사용한다(Kaeppler, 1990; Kaeppler et al., 1992; U.S. Patent No. 5,563,055). 이런 기술을 통한 형질전환은 DNA 용액에서 세포와 함께 실리콘 카바이드 섬유를 교반하여 성취한다. DNA는 세포에 구멍이 나면서 수동적으로 진입한다. 이런 기술은 단자엽 옥수수(PCT Application WO 95/06128; Thompson, 1995)와 쌀(Nagatani, 1997)에서 성공적으로 사용할 수 있다.

IV. 미소투사물 투하의 최적화

본 발명에 따른 미소투사물 투하 형질전환을 위해, 물리적, 생리적 변수는 최적화시킨다. 물리적 인자는 DNA/미소투사물 침전물을 조작하는 것과 관련된 인자 또는 거대-또는 미소투사물의 비행과 속도에 영향을 주는 인자다. 생물학적 인자에는 투하전과 투하직후 세포의 조작에 관여하는 모든 단계, 예를 들면, 투하와 관련된 외상을 완화시키기 위한 표적 세포의 삼투압 조정, 입자 궤도와 관련된 비성숙 배 또는 다른 표적 조직의 방향, 형질전환되는 DNA의 성격(예, 선형화된 DNA 또는 손상되지 않은 초나선 플라스미드)이 포함된다. 선-투하 조작은 비성숙 배아의 성공적인 형질전환을 위하여 특히 중요하다.

따라서, 조건을 완전히 최적화하기 위한 소규모 연구로, 다양한 투하 변수를 조정하는 것이 바람직하다. 특히, DNA 농도, 간격 거리, 비행 거리, 조직 거리, 헬륨압력과 같은 물리적 변수를 조정하는 것이 바람직하다. 또한, 헬륨의 등급도 형질전환 효율에 영향을 주게 된다. 가령, 비록 어떤 것이 투하에 좀더 이로운 지에 대해서는 알 수 없지만, 산업등급 헬륨(99.99% 순도) 또는 초고순도 헬륨(99.999% 순도)을 이용한 투하에서 형질전환 효율의 차이가 확인되고 있다. 수용세포의 생리상태에 영향을 주고, 따라서, 형질전환과 통합효율에 영향을 주는 조건을 변형시킴으로써 외상 감소 인자(TRFs)를 최적화할 수 있다. 가령, 삼투압 상태, 조직 수화와 계대배양 상태 또는 수용세포의 세포주기는 최적 형질전환을 위하여 조정할 수 있다.

투하를 위한 물리적, 화학적 변수는 투사 형질전환의 추가적인 최적화를 위해 처리할 수 있다. 물리적 인자는 DNA/마소투사 침전물 또는 거대-또는 미소투사물의 비행과 속도에 영향을 주는 것들을 조작하는 것과 관련된 인자다. 생물학적 인자에는 투사직전과 투사후의 세포의 조작에 관련하는 모든 단계가 포함된다. 투사전 배양 조건, 예를 들면, 삼투환경, 투사변수, 플라스미드 형태를 조정하여 최대수의 안정적인 형질전환체를 만든다.

(i) 물리적 변수

1. 간격 거리

변이 네스트(거대 홀드)는 파열디스크와 거대사추물간의 거리, 즉, 간격 거리를 변화시켜 조정할 수 있다. 이 거리는 0 내지 2 ㎝이다. 간격이 더 줄어들면, 거대추사물과 미소추사물의 속도가 증가하고, 충격파(조직 튀김과 조직외상 증가를 유도)가 증가하고, 미소투사물이 더 깊이 침투할 것으로 예상된다. 간격 길이가 더 길어지면, 반대로 생존능력이 증가하고, 따라서, 회수되는 안정적인 형질변환체의 전체 수가 증가할 것으로 예상된다.

2. 비행 거리

고정된 네스트(변이 네스트에 포함)는 거대추사물이 비행경로를 조정하는 스페어스 고리의 사전결정된 0.5㎝ 플레이스먼트 증가로 0.5 내지 2.25㎝사이에서 변화시킬 수 있다. 비행경로가 짧으면 비행중인 거대투사물의 안정은 증가하지만, 미소투사물의 전체적인 속도는 감소하게 된다. 비행에서 안정성이 증가하면, 중심부 GUS 좌위의 수가 증가하게 된다. 비행 거리가 길어지면(일정 지점까지), 속도는 증가하는 반면 비행 불안정성은 증가한다. 관찰한 것에 기초하여, 투사는 1.0 ㎝ 내지 1.5㎝의 비행 경로 길이로 실시하는 것이 바람직하다.

3. 조직 거리

건 체임버내 조직의 위치는 미소투사물 침투에 상당한 영향을 줄 수 있다. 미소투사물의 비행 경로가 증가되면, 속도 및 충격파와 관련된 외상이 감소하게 된다. 또한, 속도가 감소하면, 미소투사물의 침투가 얇아진다.

4. 헬륨 압력

파열 디스크의 형태와 수를 조작함으로써, 압력은 가스 가속화 튜브내에서 400 내지 2000 psi로 변화시킬 수 있다. 안정적인 형질전환을 위한 최적 압력은 1000 내지 1200 psi로 결정한다.

5. 미소투사물의 피복

미소투사물 투하를 위해, DNA는 미소투사물에 부착("피복")시켜, 형질전환에 안정적인 형태로 수용세포에 전달한다. 이런 측면에서, 형질전환 DNA의 적어도 일부는 형질전환의 표적세포가 되어야 하고, 동시에 전달동안 DNA는 미소투사물에 부착되어야 한다. 따라서, 미소투사물로부터 형질전환 DNA의 이용가능성에는 미소투사물이 표적세포에 전달된 후, 형질전환 DNA와 미소투사물사이 결합의 물리적 반전이 포함될 수 있다. 하지만, 표적에 대한 이용가능성은 DNA의 비결합 분절 또는 미소투사물에 물리적 부착되는 다른 분자의 파열의 결과로 발생하기 때문에, 이것이 반드시 필요한 것은 아니다. 이용가능성은 형질전환 DNA와 다른 분자사이 결합의 파열로 인해 발생할 수 있는데, 상기 DNA와 분자는 미소투사물에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 또한, 표적 세포의 형질전환은 형질전환 DNA와 수용세포의 게놈 DNA사이의 직접적인 재조합으로 발생할 수 있다. 그런 이유로, 이 글에서 "피복된" 미소투사물은 형질전환 DNA를 표적세포에 전달되거나 또는 표적 세포에 용이하게 접근하도록 하여 형질전환이 발생하도록 한다는 점에서, 표적 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있다.

형질전환 DNA를 표적세포에 전달할 수 있는 미소투사물을 피복하기 위한 임의의 기술을 사용한다. 본 발명에 적합한 미소투사물 피복 방법은 여기에 구체적으로 제시한다. 하지만, DNA는 다른 기술을 사용하여 미소투사물 입자에 결합시킬 수 있다. 가령, 입자는 스트렙타비딘 및 긴 사슬 티올 절단가능 비오틴화된 뉴클레오티드 사슬로 라벨된 DNA 말단으로 피복할 수 있다. DNA는 스트렙타비딘-비오틴 상호작용으로 인해 입자에 부착되고, 세포에 존재하는 환원제를 통해 티올 결합이 감소되어 세포에서 방출된다.

대안으로, 입자는 금 산화물 입자의 표면을 기능화하여, 자유 아민기를 제공하도록 만들 수 있다. 강한 음전하를 보유한 DNA는 기능화된 입자에 결합하게 된다. 또한, 대전된 입자는 PDS-1000 투사 장치에서 마일라 플라이어 디스크의 표면에 조절배열 형태로 침전되어, 표적 조직에 전달될 입자의 조절분산을 용이하게 한다.

전술한 바와 같이, 미소투사물을 피복하기 위하여 사용된 DNA의 농도는 외래도입유전자의 단일 복사본을 보유한 형질전환체의 수거에 영향을 줄 것으로 예상된다. 가령, 낮은 농도의 DNA는 형질전환의 효능을 변화시키지는 못하지만, 대신에 단일 복사본 삽입 현상의 비율을 증가시킬 수 있다. 이런 측면에서, 1.8㎎의 출발 미소투사물당 대략 1 ng 내지 2000 ng의 형질전환 DNA를 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 1.8㎎의 출발 미소투사물당 2.5ng 내지 1000ng, 2.5ng 내지 750 ng, 2.5ng 내지 500ng, 2.5ng 내지 250ng, 2.5ng 내지 100ng, 2.5ng 내지 50ng의 형질전환 DNA를 사용할 수 있다.

다양한 다른 방법을 사용하여 형질전환 효능을 증가시키거나 또는 저-복사본 형질전환 현상의 상대적 비율을 증가시킬 수 있다. 가령, 본 발명자는 알칼린 포스파타제 또는 형질전환이전 DNA 말단을 절두시키는 약물로 형질전환 DNA의 말단을 수식하는 방안을 고려하고 있다. 또한, 불활성 담체 DNA를 형질전환 DNA에 포함시켜, 사용한 DNA의 전체량을 줄이지 않고 효과적인 형질전환 DNA 농도를 낮출 수 있다. 이들 기술은 U.S. 특허 출원 No. 08/995,451(1997. 12. 22 출원)에서 자세히 제시하는데, 상기 공개공보는 여기에 참고문헌으로 한다.

(ii) 생물학적 변수

배양 조건과 다른 변수가 표적 세포의 생리상태에 영향을 줄 수있고, 형질전환과 통합 효율에 심대한 영향을 줄 수 있다. 먼저, 투사 작용은 조직의 노화를 유발할 수 있는 에틸렌의 생산을 촉진할 수 있다. 항에틸렌 화합물을 처머가하여 형질전환 효능을 증가시킬 수 있다. 둘째, 세포주기의 특정 시점은 도입될 DNA의 통합에 좀더 적절할 것으로 예상된다. 따라서, 세포 배양물을 동조화시켜 형질전환체의 생상빈도를 향상시킬 수 있다. 가령, 동조화는 냉동 처리, 아미노산 고갈 또는 다른 세포 사이클-정지 약물을 이용하여 성취할 수 있다. 셋째, 조직 수화의 정도 또한, 투사와 관련된 외상의 양 및 세포벽을 침투하는 미소투사물의 능력에 기여할 수 있다.

입자 궤도와 관련된 배 또는 다른 표적 조직의 위치와 방향 또한, 중요하다. 가령, PDS-1000 투사 장치는 표적 페트리접시의 표면위에서 입자를 균일하게 확산시키지는 못한다. 평판 중심부에서 입자의 속도는 페트리 접시 중심부로부터 더 먼 거리에서 입자속도보다 더 빠르다. 따라서, 접시의 중심부(" 죽음지대"로 지칭)를 피하도록 하기 위하여, 페트리접시에서 표적 조직의 위치를 정하는 것이 바람직하다. 식물을 재생시킬 가능성이 가장 큰 조직을 입자 흐름쪽으로 향하게 하는 것이 바람직할 것으로 예상된다. 가령, 비성숙 배의 배반은 최대 배발생 잠재력을 보유한 세포로 구성되고, 따라서, 입자흐름쪽으로 향하게 해야 한다.

또한, 약간의 원형질분리를 일으킨 효모세포에서 형질전환 효능이 증가하는 것으로 보고되었다(Armaleo et al., 1990). 여기서, 세포의 변형된 삼투압상태는 미소투사물의 침투와 관련된 외상을 감소시키는 도움을 주는 것으로 가정하였다. 또한, 형질전환 측면에서 성장과 세포 사이클 단계가 중요하다.

1. 삼투압 조정

삼투압 선-처리는 원형질분리된 세포의 팽압 감소로 인한 투사관련 손상을 상당히 감소시킬 수 있는 것으로 알려지고 있다. 이전의 연구에서, 일시적으로 GUS를 발현하는 세포의 수가 새로운 배지와 삼투압 조정된 배지로 계대배양된 후, 증가하였다(PCT Application WO 95/06128). 더 짧은 시간보다 90분간의 처리시간동안 GUS 발현 좌위의 수가 훨씬 증가하는 것으로 밝혀졌다. 90분동안 500 mOSM/㎏ 배지에서 배양한 세포는 컨트롤보다 3.5배 증가된 임시 GUS 좌위를 보였다. 가급적, 비성숙 배는 12% 자당을 함유한 배양배지에 투사하기 4-5시간전에 선배양한다. 12% 자당에서 제 1 배양은 투사후 16-24시간동안 실시하였다. 대안으로, Ⅱ형 세포는 투사이전 3-4시간동안 0.2M 만니톨에서 선처리한다. 1-6시간동안 다른 삼투활성 용질로 세포를 선처리하는 것 또한, 바람직할 것으로 예상된다.

2. 플라스미드 형태

일부 경우에, 대장균(E.coli)과 같은 박테리아 숙주에서 플라스미드 벡터의 유지에 필요한 DNA 서열, 예를 들면, 항생제 저항성 유전자 및 DNA 원핵 복제기점을 보유하지 않은 옥수수 세포에 DNA를 전달하는 것이 바람직한데, 상기 저항성 유전자에는 앰피실린, 카나마이신, 테트라사이클린 저항성 유전자가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 이런 경우에, 형질전환 DNA를 보유한 DNA 단편은 형질전환이전에 정제한다. 전형적인 정제 방법은 녹는점이 낮은 1.2% 아가로즈 겔에서 겔 전기영동하고, 이후, 6-10배 과다한 ris-EDTA 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 70℃-72℃)에서 겔 조작을 녹여 아가로즈 겔로부터 수거하고; 냉동 및 해동(37℃)하고; 아가로즈겔을 원심분리하여 펠렛하는 것이다. 이후, Qiagen Q-100 칼럼을 사용하여 DNA를 정제한다. DNA의 효과적인 수거를 위하여, 칼럼의 유속은 40 ㎖/hr로 조정한다.

분리된 DNA 단편은 다양한 전기용출 기술, 아가로즈의 효소절단 또는 DNA와 유리 비드(예, Gene Clean)의 결합을 이용하여 아가로즈 겔로부터 수거할 수 있다. 또한, HPLC 또는 자석입자를 사용하여 DNA 단편을 분리할 수 있다. DNA 단편 분리에 대한 대안으로, 플라스미드 벡터를 제한 효소로 절단하고, 이 DNA를 발현 캐세트 단편의 사전 정제없이 옥수수 세포에 전달할 수 있다.

V. 형질전환을 위한 수용세포

조직배양은 배지와 조절환경을 필요로 한다. "배지"는 시험관내, 다시 말하면, 완전 생체의 외부에서 세포를 성장시키는데 사용하는 다수의 영양 혼합물을 의미한다. 일반적으로, 배지는 다수 세포형의 성잘을 위해 필요한 다양한 종류의 성분(염, 아미노산, 성장조절물질, 당, 버퍼)으로 구성된 현탁액이다. 하지만, 각각의 특이적 세포형은 성장을 위한 특정 범위의 성분 비율 및 최적 성장을 위한 좀더 특이적인 범위의 처방을 필요로 한다. 세포 성장률은 상기 세포형을 성장시키는 배지의 배열로 개시된 배양물에서 다양하게 나타난다.

영양배지는 액체로 만들지만, 고형토대를 제공할 수 있는 물질에 액체를 첨가하여 고형화시킬 수 있다. 이런 목적에는 아가가 가장 일반적으로 사용된다. Bactoagar, Hazelton 아가, Gelrite, Gelgro는 조직배양중인 식물세포의 성장에 적합한 고형지지체다.

일부 세포형은 액체 현탁액 또는 고체 배지에서 성자하고 분화한다. 이 글에서 밝힌 바와 같이, 옥수수 세포는 현탁액 또는 고체 배지에서 성장시키지만, 현탁 배양한 식물을 재생시키려면 발달의 일정 시점에서 액체 배지를 고체 배지로 바꾸어야 한다. 배양중인 세포의 분화 형태와 정도는 사용한 배지형태와 환경(예, pH)뿐만 아니라, 배지의 형태(고체 또는 액체)에도 영향을 받는다. 표2는 수용세포의 생성과 식물 재생을 유용한 다양한 배지의 조성물을 보여준다.

수용 세포 표적에는 분열조직 세포(새싹의 정점(U.S. Patent 5,736,369), Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형 유합조직 포함), 비성숙 배, 생식세포(소포자, 화분, 정자, 난세포)가 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 번식력있는 식물이 재생될 수 있는 임의의 세포는 수용세포로서 유용할 것으로 생각된다. Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형 유합조직은 조직 공급원에서 시발되는데, 이런 유합조직에는 비성숙 배, 묘목의 정상 분열조직 세포, 소포자등이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 유합조직으로서 증식할 수 있는 세포 또한, 유전자 형질전환을 위한 수용세포가 된다. 본 발명은 비성숙 배를 형질전환시키고, 이후 번식력있는 유전자도입 식물을 재생시키는 기술을 제공한다. 비성숙 배를 형질전환시키는 경우, 수용세포 배양물의 장기간 발육이 불필요하다. 화분 및 이의 전구물질인 소포자는 유전자 돌연변이를 위한 수용세포 또는 수정동안 통합되는 외래 DNA를 도입하는 벡터로서 기능할 수 있다. 직접 화분 형질전환으로 세포 배양의 필요성을 회피할 수 있다. 분열조직 세포(즉, 지속적인 세포 분화를 할 수 있고, 식물의 생장점(예, 뿌리 끝, 간세포 정점, 곁가지 싹)에서 일반적으로 발견되는 비분화된 세포학적 외형으로 특징지어지는 식물세포)는 수용 식물 세포의 대표적인 다른 형태다. 이들의 비분화된 성장 및 기관 분화와 분화전능 능력으로 인해, 하나의 형질전환된 분열조직 세포는 전체 형질전환된 세포로 획복될 수 있다. 실제로, 배발생 현탁배양액은 시험관내에서 분열조직 세포 시스템이 되어, 배지 환경에 의해 조절되는 비분화된 상태에서 지속적으로 세포분화할 수 있는 능력을 계속 보유할 것으로 예상된다.

원하는 DNA 분절로 형질전환시키기 위한 수용세포 역할을 할 수 있는 배양된 식물 세포에는 곡식 세포를 비롯한 임의의 세포, 좀더 구체적으로, 옥수수(Zea mays L) 세포가 포함된다. 체세포는 다양한 형태로 존재한다. 배발생 세포는 배형성을 통해 식물을 재생시키기 위한 체세포의 일종이다. 비-배발생 세포는 이런 방식으로 대응하지 않는 세포다. 비-배발생 세포의 예는 블랙 멕시칸 스위트(BMS) 곡식 세포다.

본 발명에서, 예를 들면, 형질전환을 위한 수용세포로서 유용한 배발생 옥수수 유합조직과 현탁배양액의 개발은 U.S. 특허 No. 5,134,074와 U.S. 특허 No. 5,489,520에서 기술하였는데, 이들 공개공보는 여기에 참고문헌으로 한다.

세포 개체군내에서 수용세포의 양을 증가시키는 특정 기술을 사용할 수 있다. 가령, Ⅱ형 유합조직 발달 및 이후의 연약한 배발생 조직의 수동 선별과 배양으로 미소투사물 형질전환에 사용할 수 있는 수용세포의 양을 증가시킨다. 특히, 이 글에서 밝힌 배지를 이용한 현탁 배양으로 임의의 개체군에서 수용세포 대 비-수용세포의 비율을 향상시킬 수 있다. 수용세포를 선별하기 위하여 사용하는 수동 선별 기술에는 세포 형태와 분화를 평가하거나, 또는 다양한 물리적 또는 생물학적 수단을 사용하는 것이 포함된다. 냉동 보존 또한, 수용세포를 선별하는 방법중의 하나다.

수용세포의 수동 선별, 예를 들면, Ⅱ형 유합조직의 표면으로부터 배발생 세포를 선별하는 것은 배양(고제 배지 또는 현탁액에서 배양하는 가에 상관없이)이전에 수용세포의 양을 증가시키는데 사용하는 수단중의 하나다. 적절한 세포는 세포 무리의 표면에 위치한 세포들인데, 이들은 분화의 결핍, 크기, 밀집된 세포질로 확인할 수 있다. 일반적으로, 적절한 세포는 분화가 덜 된 또는 분화가 이루어지지 않은 세포다. 따라서, 세포질이 밀집되고, 높은 핵 대 세포질 비율로 액포가 존재하지 않고, 크기가 작고(10-20 ㎛), 지속적인 분화와 체세포 전배(proembryo)를 형성할 수 있는 세포를 확인하고 선별하는 것이 바람직하다.

이런 세포를 확인하는 다른 수단을 또한, 사용할 수 있다. 가령, 에반스 블루와 같은 염료를 사용하는 것인데, 상기 염료는 상대적으로 비-투과성 막을 보유한 세포(예, 배발생 세포)에 의해 배제되고, 상대적으로 분화된 세포(예, 뿌리-모양 세포와 뱀 세포(뱀과 형태가 유사))에 의해 흡입된다.

수용세포를 확인하는 다른 수단에는 배발생 세포의 동질효소 마크, 예를 들면, 글루타메이트 탈수소효소를 사용하는 것이 포함되는데, 상기 동질효소는 세포화학적 얼룩으로 검출할 수 있다(Fransz et al., 1989). 하지만, 글루타메이트 탈수소효소를 비롯한 동질효소 마크를 사용하는 경우, 상대적으로 높은 대사활성을 보유한 비-발생세포(예,뿌리 모양 세포)로부터 약간의 가양성이 야기될 수 있으므로 조심해야 한다.

(i) 형질전환을 위한 수용 세포 배양

옥수수 세포의 배양물을 제조하고 냉동보존 하는 능력은 본 발명에서 형질전환을 위한 세포를 재생적으로 준비하는 수단을 제공한다는 점에서 중요하다. 다수의 상이한 매체가 이전에 개발되었는데, 본 발명의 다양한 측면을 실행하기 위하여 사용할 수 있다. 다음의 표(표2)에서 본 발명의 이들 측면을 실행하기 위한 본 발명자가 선호하는 배지 조성물을 제공한다.

표 2a

표 2b

표 2c

표 2d

표 2e

표 2f

표 2g

표 2h

표 2i

표 2j

표 2k

표 2l

표 2m

표 2n

형질전환에 사용할 수 있는 다수의 전형적인 옥수수 배양물은 PCT 출원 WO 95/06128에서 제시하는데, 상기 공개공보는 여기에 참고문헌으로 한다.

(ii) 배지

본 발명의 특정 구체예에서, 수용세포는 배지에서 성장시킨 후에 선별한다. 사용되는 배양 세포는 고형 지지체 또는 액체 현탁액에서 성장시킬 수 있다. 어느 경우에든, 영양은 배지 형태와 조절된 환경에서 세포에 제공한다. 다양한 아미노산, 염, 당, 성장조절물질, 비타민으로 구성된 다수의 조직 배양배지가 있다. 본 발명의 실시에 사용하는 배지의 대부분은 일부 유사한 성분(표2)를 보유하지만, 생각한 용도에 따라 성분의 조성과 비율은 달라지게 된다. 가령, 다양한 세포형은 한가지 이상 유형의 배지에서 생장하지만, 성장배지에 따라 상이한 성장률과 형태를 보이게 된다. 일부 배지에서, 세포는 생존하지만, 분화하지 못한다.

식물세포의 배양에 적합한 다양한 형태의 배지가 기술되고 있다. 이런 배지의 예로는 N6 배지(Chu et al. (1975))와 MS 배지((Murashige and Skoog, 1962))를 들 수 있지만, 이들에 국한시키지 않는다. 높은 암모니아/질산염 비율을 보유한 MS와 같은 배지는 형태발생 능력의 상실을 촉진한다는 점에서 수용세포의 재생을 상쇄시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 한편, N6 배지는 다소 낮은 암모니아/질산염 비율을 보유하고, 지속적으로 분화할 수 있는 전배발생 상태에서 세포를 유지시켜 수용세포의 재생을 촉진할 것으로 예상된다.

(iii) 유지

세포 배양물의 유지 방법은 형질전환을 위한 수용세포 공급원으로서의 이들의 유용성에 기여한다. 새로운 배양배지로 전이시키기 위한 세포의 수동선별, 새로운 배양배지로의 전이 빈도, 배양배지의 조성, 환경인자(광 성질과 양 및 온도포함)는 수용세포의 공급원으로 유용한 유합조직 또는 현탁배양액을 유지하는데 중요한 인자다. 상이한 배양조건에서 유합조직을 변형시키는 것은 배양물내 수용세포의 양을 증가시키는데 도움이 될 것으로 예상된다. 가령, 세포는 현탁배양액에서 배양시키고, 일정한 간격으로 고체배지로 이전하는 방안을 생각해 볼 수 있다. 고체 배지에서 일정기간 성장시킨 후, 세포는 수동적으로 선별하여 액체 배양배지로환원시킬 수 있다. 새로운 배양 배지로 전이시키는 단계를 반복하여 수용세포의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 세포배양물을 1.9mm 체에 통과시키는 것은 유합조직 또는 현탁배양액의 연함을 유지하는데 유용하고, 형질전환가능 세포의 양을 증가시키는데 효과적일 것으로 예상된다.

(iv) 냉동보존 방법

냉동보존은 연장된 배양 기간과 관련된 해로운 효과를 제거하면서, 이후 이용할 공지된 형질전환가능 세포 배양물을 유지하고 보존할 수 있기 때문에 중요하다.

세포 현탁액과 유합조직은 이전에 알려진 방법(Finkle, 1985; Withers ＆ King, 1979)을 변형하여 냉동보관할 수 있다. 냉동보존 프로토콜은 사전-냉동된(0℃) 농축 냉동보존 혼합물을 사전-냉각된(0℃)세포에 점진적으로 첨가하는 것으로 구성된다. 혼합물은 이 기간내내 0℃로 유지시킨다. 첨가된 냉동보존제의 부피는 세포 현탁액(1:1 첨가)의 초기 부피에 상응하고, 냉동보존 첨가제의 최종 농도는 10% 디메틸 술폭시드, 10% 폴리에틸렌 글리콜(6000 MW), 0.23 M 프롤린, 0.23 M 글루코스이다. 혼합물은 30분동안 0℃에서 평형을 유지시키는데, 이때, 세포현탁액/냉동보존 혼합물은 2 ㎖ 폴리에틸렌 cryo-바이얼에 1.5㎖ 부분용액(0.5 ㎖ 압축된 세포부피)으로 나누었다. 튜브는 0.5℃/분 내지 -8℃로 냉각하고, 얼음 핵형성을 위해 이 온도에서 유지시켰다.

일단 세포외 얼음 형성이 시각적으로 확인된 후, 튜브는 0.5 ℃/분으로 -8℃ 내지 -35℃까지 냉각시켰다. 이들은 45분동안 이 온도에서 유지시킨다(전체 세포응집동안 균등한 냉동-유도된 탈수를 담보하기 위해). 이 시점에서, 세포는 삼투압 부피의 대부분을 상실하여(즉, 세포에는 자유수가 거의 남아있지 않다), 저장을 위해 안정적으로 액체 질소에 넣을 수 있다. -35℃ 내지 -196℃ 범위의 급속한 냉각으로 세포에 남아았는 자유수가 부족해짐에 따라 크게 조직화된 얼음 결정은 ??에서 형성되지 않게된다. 세포는 액체 질소에 저장하는데, 상기 액체 질소는 세포를 효과적으로 고착화시키고 장기간 저장이 해롭지 않은 시점까지 대사과정을 지연시킨다.

세포외 용액의 해동은 액체질소로부터 cryo-튜브를 제거하고, 대략 2분동안 42℃ 멸균수에서 휘저음으로써 달성하였다. 튜브는 마자막 얼음 결정이 녹은 직후, 열을 차단하여, 조직의 가열을 예방한다. 세포 현탁액(냉동보존 혼합물내)은 필터에서 피펫하고, BMS 세포층(회복동안 영양효과를 제공하는 영양공급 층)에 올려 놓는다. 냉동보존 용액은 피펫팅으로 제거한다. 배양배지는 삼투압 강도를 증가시킨 유합조직 증식 배지로 구성된다. 냉동보존물은 용액이 필터를 통하여 확산되고, 영양이 회복세포로 상향확산됨에 따라 천천히 희석된다. 일단, 해동된 세포의 연속된 성장이 관찰되면, 성장조직은 새로운 배양배지로 옮겼다. 현탁배양액의 시발이 필요한 경우, 세포 덩어리는 세포질량이 다시 증가한 직후(일반적으로 1 내지 2주내), 액체 현탁배지에 환원시켰다. 대안으로, 세포는 고체 유합조직 증식배지에서 배양하였다. 배양물은 액체에서 다시 자리잡게 한후(추가로 1 내지 2주내), 형질전환 실험에 사용하였다. 원하는 경우, 이전에 냉동보존된 배양물은 저장을 위해 한번 더 냉동시킬 수 있다.

VI. 안정적으로 형질전환된 옥수수의 생산과 특성화

외인성 DNA를 수용세포에 전달한 후, 다음 단계는 추가 배양과 식물 재생을 위한 형질전환된 세포를 동정하는 것에 관한다. 전술한 바와 같이, 형질전환체를 동정하는 능력을 향상시키기 위하여, 관심있는 발현 가능한 유전자로서 선별가능 또는 선택가능 마크 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 이런 경우에, 세포를 선택적 약물에 노출시켜 잠재적으로 형질전환된 세포 개체군을 일반적으로 분석하거나, 또는 원하는 마크 유전자 성질에 대하여 세포를 선별한다.

(i) 선별

DNA는 임의의 실험에서 아주 작은 퍼센터의 표적 세포에만 도입되는 것으로 여겨진다. DNA를 흡수하고, 이를 게놈에 통합하는 세포를 동정하기 위한 효율적인 시스템을 제공하기 위하여, 안정적으로 형질전환된 세포를 선별하는 수단을 사용할 수 있다. 이런 수단의 전형적인 예는 정상적으로 저해되는 일부 약물, 예를 들면, 항생제 또는 제초제에 저항성을 공여하는 마크 유전자를 숙주세포에 도입하는 것이다. 사용할 수 있는 항생제의 예로는 아미노글리코시드 항생제(네오마이신, 카나마이신, 파르로마이신) 또는 항생 히그로마이신을 들 수 있다. 아미노글리코시드 항생제에 대한 저항성은 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 효소, 예를 들면, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 또는 NPT Ⅰ에 의해 공여되고, 히그로마이신에 대한 저항성은 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제에 의해 공여된다.

잠재적으로 형질전환된 세포는 이후, 선택적 약물에 노출시킨다. 생존 세포 개체군은 일반적으로, 저항성-공여 유전자가 통합되고, 충분한 수준으로 노출되어, 세포생존이 가능해진 세포다. 세포는 외인성 DNA의 안정적인 통합을 확인하기 위하여 추가로 시험할 수 있다. 이 글에서 제시한 기술을 이용하여, 40%이상 투사된 배에서 형질전환체를 만들 수 있다.

바람직한 선별 약물로서 제시되고 있는 제초제는 광범위한 범위의 제초제인 비알라포스(bialaphos)이다. 비알라포스는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터 만들어진 삼펩티드 항생제로, 포스피노트리신(PPT), L-글루타민산의 유사체, 2개의 L-알라닌 잔기로 구성된다. 세포내 펩티다제에 의한 L-알라닌 잔기의 제거직후, PPT는 방출되는데, 이것은 암모니아 동화와 질소대사에 관여하는 중추 효소인 글루타민 합성효소(GS)의 강력한 저해물질이다(Ogawa et al., 1973). 제초제 Liberty^TM에서 활성성분인 합성 PPT 또한, 선별 약물로서 효과적이다. 식물에서 PPT에 의한 GS의 저해는 암모니아의 급속한 축적과 식물 세포의 죽음을 야기한다.

비알라포스를 생산하는 미생물과 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 다른 종또한, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT)를 합성하는데, 상기 효소는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에서 bar 유전자에 의해 인코드되고, 스트렙토마이세스 비리도크로모진(Streptomyces viridochromo genes)에서 pat 유전자에 의해 인코드된다. 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT)를 인코드하는 제초제 저항성 유전자의 용도는 DE 3642 829 A에서 제시하는데, 여기서, 유전자는 스트렙토마이세스 비리도크로모진(Streptomyces viridochromo genes)에서에서 분리된다. 박테리아 공급원 미생물에서, 이 효소는 자가독소를 예방하는 PPT의 자유 아미노기를 아세틸화시킨다(Thompson et al., 1987). bar 유전자는 클론하고(Murakami et al., 1986; Thompson et al., 1987), 유전자도입 토마토, 담배, 감자(De Block, 1987), Brassica(De Block, 1989), 옥수수(U.S. Patent No. 5,550,318)에서 발현시켰다. 이전의 보고서에서, 저항성 유전자를 발현하는 일부 유전자 도입 식물은 온실에서 PPT와 비알라포스의 상업적 제조를 완전한 저항성을 보였다.

본 발명의 실시에서 형질전환된 세포계의 선별에 유용한 제초의 전형적인 예는 광범위한 범위의 제초제인 글리포세이트다. 글리포세이트는 방향족 아미노산 행합성 경로에서 활성을 나타내는 EPSPS 효소의 작용을 저해한다. 이런 효소의 저해로 인해, 아미노산 페닐알라닌, 티로신, 트립토판과 이들의 이차 대사 유도체의 고갈을 유발한다. U.S. 특허 No. 4,535,060에서, EPSPS에 대한 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 유전자, aroA에 글리포세이트 저항성을 공여하는 EPSPS 돌연변이의 분리를 설명한다. EPSPS 유전자는 옥수수로부터 클론하고, 글리포세이트 aroA 유전자에서 발견되는 것과 유사한 돌연변이를 시험관내에서 도입하였다. 글리포세이트 저항성 EPSPS 효소를 인코드하는 변이체 유전자는 국제 출원 WO 97/4103에서 기술한다. 글리포세이트 저항성을 공여하는 가장 특징적인 변이체 EPSPS는 잔기 102와 106에서 아미노산 변화를 포함하지만, 다른 돌연변이 또한, 유용할 것으로 예상된다(PCT/WO97/4103).

bar-비알라포스 또는 EPSPS-글리포세이트 선별계를 사용하기 위하여, 투사된 조직은 비-선택성 배지에서 0-28일동안 배양하고, 이후, 1-3 ㎎/ℓ 비알로포스 또는 1-3 mM 글리포세이트를 적당히 함유한 배지에 옮겼다. 1-3 ㎎/ℓ 비알로포스 또는 1-3 mM 글리포세이트가 일반적으로 선호되긴 하지만, 0.1-50 ㎎/ℓ 비알로포스 또는 0.1-50 mM 글리포세이트가 본 발명의 실시에 유용할 것으로 예상된다. 조직은 투사를 위한 임의의 세공성 불활 고형 또는 반-고형 지지체에 위치시킬 수 있는데, 상기 지지체에는 필터와 고체 배양배지가 포함되나, 이들에 국한시키지 않는다. 비알로포스와 글리포세이트는 형질전환체의 선별에 적합한 약물의 예로서 제시하지만, 본 발명의 기술은 이들에 국한시키지 않는다.

또한, 제초제 DALAPON(2,2-디클로로프로피온산)이 형질전환된 세포의 동정에 유용할 것으로 예상된다. 2,2-디클로프로피온산 디할로게나제(deh)는 2,2-디클로로프로피온산의 제초활성을 불활화시키고, 따라서, 디할로게나제 효소를 인코드하는 유전자를 발현하는 세포 또는 식물에 제초제 저항성을 공여한다(Buchanan-Wollaston et al., 1992; PCT Application WO 95/06128; U.S. Patent No. 5,508,468; U.S. Patent No. 5,508,468).

대안으로, 특정 아미노산 유사체, 예를 들면, 5-메틸트립토판 또는 6-메틸안트라닐레이트에 저항성을 공여하는 안트라닐레이트 합성효소를 인코드하는 유전자를 선별가능 마크 유전자로 사용할 수 있다. 안트라닐레이트 합성효소의 선별가능 유전자로서의 이용은 U.S. 특허 No. 5,508,468와 U.S. 특허 출원 08/604,789에서 기술한다.

선별가능 마크 성질의 예는 옥수수의 R-좌위 조절하에 생산되는 적 색소이다. 이 색소는 이 단계에서 성장을 뒷받침할 수 있는 영양배지를 함유한 고형 지지체에서 세포를 배양하고, 물든 콜로니(세포의 가시적인 응집체)로부터 세포를 선별하여 검출할 수 있다. 이들 세포는 현탁액 또는 고체배지에서 추가로 배양한다. R-좌위는 투사된 비성숙 배로부터 형질전환체의 선별에 유용하다. 유사하게, C1와 B 유전자를 도입시키면 물든 세포와 조직이 생성되게 된다.

루시페라제는 본 발명의 범주에서 선별가능한 마크로서 사용할 수 있다. 기질 루시페린의 존재하에 루시페라제를 발현하는 세포는 발광계수기(또는 액체 신틸레이션 계수기)내 사진 또는 x-레이 필름에서, 암시를 강화하는 장치로 또는 고도 광민감성 비디오 카메라(광자 계수 카메라)로 검출할 수 있는 광을 방출한다. 이들 분석 모두 비파괴적이고, 형질전환된 세포는 동정후 추가로 배양할 수 있다. 광자 계수 카메라는 특히, 귀중한데, 그 이유는 루시페라제를 발현하는 특이적 세포 또는 세포군을 동정하고, 실시간으로 이들을 조작할 수 있기 때문이다. 사용할 수 있는 다른 선별가능 마크는 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자다(Sheen et al., 1995).

또한, 선별가능 및 선택가능 마크를 복합하여, 형질전환된 세포의 동정에 사용할 수 있다. 일부 세포 또는 조직형에서, 비알로포스 또는 글리포세이트와 같은 선별 약물은 형질전환된 세포를 분명하게 인식할 수 있을 만큼 충분한 치사작용을 제공하지 못하거나, 또는 형질전환체 또는 비형질전환체를 동시에 비선택적으로 저해하여 선별기술을 무력화시킬 수도 있다. 100% 저해를 유발하는 농도이하의 성정 저해 화합물(예, 비알로포스 또는 글리포세이트)을 이용하여 선별하고, 이후, 루시페라제와 같은 선별가능 마크 유전자의 발현을 위한 성장 조직을 선별하면, 한번의 선별로는 다루기 힘든 세포 또는 조직형으로부터 형질전환체를 수거할 수 있을 것으로 예상된다. 선택과 선별을 병행하면, 더 광범위한 세포와 조직형에서 형질전환체를 동정할 수 있다.

(ii) 재생과 종자 생산

선택성 약물에 대한 노출을 이겨낸 세포 또는 선별분석에서 양성으로 나타난 세포는 식물의 재생을 뒷받침하는 배지에서 배양할 수 있다. 한 구체예에서, MS와 N6 배지는 성장 조절물질과 같은 추가 물질을 포함시켜 변형할 수 있다(표2 참조). 이런 목적에 적절한 성장 조절물질은 디캄바 또는 2,4-D이다. 하지만, NAA, NAA + 2,4-D 또는 피클로람을 비롯한 다른 성장 조절물질을 사용할 수 있다. 이런 방식의 배지 개선는 특정 발달단계에서 세포의 성장을 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 충분한 조직이 식물 재생을 개시할 때까지 또는 여러 번의 수동선별후 조직의 형태가 재생에 적합해질 때까지(적어도 2주), 조직은 성장 조절물질을 함유한 기본 배지에 유지시키고, 이후, 배양체의 성숙을 유도하는 배지로 옮긴다. 배양물은 매 2주마다 이 배지에 옮긴다. 발아는 성장 조절물질 결핍된 배지로 옮겨야 하는 시간을 나타낸다.

선별 또는 선택으로 동정하고, 재생을 뒷받침하는 적당한 배지에서 배양한 형질전환된 세포는 이후, 식물로 성숙시킨다. 발달하는 식물단편은 토양없는 식물 성장 혼합물로 옮기고, 85% 상대습도, 600 ppm CO₂, 25-250 마이크로에인스테인 m^-2s^-1의 광의 환경조절된 체임버에서 경화시킨다. 식물은 가급적, 성장 체임버 또는 온실에서 성숙시킨다. 식물은 시발조직에 따라 형질전환체를 확인한 지 6주 내지 10달후 재생시킨다. 재생동안, 세포는 조직 배양 용기내 고체 배지에서 성장시킨다. 이런 용기의 예로는 페트리 접시와 식물 Cons.를 들 수 있다. 재생 식물은 가급적, 19 내지 28℃에서 재생시킨다. 재생 식물은 발아와 뿌리 발달 단계에 이른 후, 추가 성장과 시험을 위해 온실로 옮긴다.

하지만, 형질전환된 식물에서 중핵은 중핵 발달의 중단과 식물의 조기 노화로 인해 배 구제를 때때로 필요로 한다는 점은 주의한다. 발달중인 배를 구제하기 위하여, 이들은 수분 10-20일후 표면-비감염된 중심부로부터 절개하고, 배양한다. 이 단계에 사용하는 배지는 MS 염, 2% 자당, 2.5 g/ℓ 아가로즈로 구성된다. 배 구제에서, 큰 배(3mm 길이이상으로 정의)는 적당한 배지에서 직접 발아시킨다. 이 보다 작은 배는 10^-5M 아브시스산과 함께 상기 성분을 함유한 배지에서 1주일 동안 배양하고, 이후, 발아를 위한 성장 조절물질-무 배지로 옮겼다.

후손은 형질전환된 식물로부터 수거하고, 적당한 기질을 식물 일부(예, 잎)에 국소적으로 도포하여 외인성 발현가능 유전자의 발현을 검사하였다. bar 형질전환된 식물의 경우에, 형질전환된 양친 식물(R_O)과 이들의 임의 후손 세대는 제초제 Basta를 잎에 국소적으로 도포한 후, 시험관내 효소 분석에서와 같이 식물에 기능적 PAT 활성이 존재하면 비알라포스-무관한 괴사를 보이는 것으로 밝혀졌다. 검사한 모든 PAT 양성 후손은 bar를 보유하는데, 이것은 상기 효소의 존재와 비알로포스에 대한 저항성이 마크 유전자의 생식세포계를 통한 전파와 연관한다는 것을 입증한다.

(iii) 특성화

재생 식물에서 외인성 DNA 또는 "외래도입유전자"의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 분석을 실시할 수 있다. 이런 분석에는 "분자생물학적 분석"(예, 서든과 노잔 블라팅 및 PCR^TM); "생화학적 분석"(예, 면역학적 수단(ELISA와 웨스턴 블라트) 또는 효소 기능으로 단백질 산물의 존재 검출); 식물 일부 분석(예, 잎 또는 뿌리 분석); 전체 재생된 식물의 표현형 분석이 포함된다.

1. DNA 통합, RNA 발현과 유전

당업자에게 공지된 기술을 이용하여 외인성 유전자의 존재를 결정하기 위하여 유합조직 세포계 또는 임의의 식물 일부로부터 게놈 DNA를 분리한다. 세포에서 서열의 재배열 또는 결실로 인해 손상되지 않은 서열이 항상 존재하지는 않는다는 점에 주의한다.

본 발명의 방법을 통해 도입된 DNA 요소의 존재는 중합효소 연쇄반응(PCR^TM)으로 결정할 수 있다. 이런 기술을 이용하여 DNA의 개별 단편을 증폭하고, 겔 전기영동으로 검출한다. 이런 분석으로 유전자가 안정된 형질전환체에 존재하는지를 결정할 수는 있지만, 도입된 유전자의 숙주세포 게놈으로의 통합을 입증할 수는 없다. 하지만, DNA는 PCR^TM분석을 통해 유전자의 존재를 보여주는 모든 형질전환체의 게놈에 통합되어 있다는 것을 경험적으로 알 수 있다. 또한, PCR^TM기술을 이용하여, 형질전환체가 게놈상의 상이한 위치로 도입되는 외인성 유전자를 보유했는 지, 다시 말하면, 형질전환체가 독립된 공급원에서 나왔는 지를 결정할 수는 없다. PCR^TM기술을 이용하여, 도입된 유전자에 인접한 숙주 게놈 DNA의 단편을 클론하는 것이 가능할 것으로 예상된다.

DNA의 숙주 게놈 통합의 파지티브 증거와 형질전환체의 독립된 정체는 서던 하이브리드 형성 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 이 기술을 이용하여, 숙주 게놈에 도입된 특정 DNA 서열과 인접한 숙주 DNA 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 임의 형질전환체의 서던 하이브리드형성 패턴은 형질전환체의 특성을 검증하는 역할을 한다. 또한, 서든 하이브리드형성을 통하여, 고분자량 DNA에서 도입 유전자의 존재를 설명할 수 있다, 다시 말하면, 도입 유전자가 숙주 세포 게놈에 통합되었는 지를 입증할 수 있다. 서든 하이브리드형성 기술은 PCR^TM을 이용하여 획득된 정보, 예를 들면, 유전자의 존재를 제시할뿐만 아니라, 게놈으로의 통합을 입증하고 각 개별 형질전환체를 특성화시킨다.

서든 하이브리드형성 기술의 변형인 닷트 또는 슬랏 블랏 하이브리드형성을 이용하여, PCR^TM에서 유래한 동일 정보, 예를 들면, 유전자의 존재를 구할 수 있다.

PCR^TM과 서든 하이브리드형성 기술을 모두 이용하여, 후손으로의 외래도입유전자 전달을 입증할 수 있다. 대개의 경우에, 임의 형질전환체에 대한 특징적인 서든 하이브리드형성 패턴은 하나 또는 복수의 멘델리안(Mendelian) 유전자(Spencer et al., 1992)로 후손에서 분리되는데, 이것은 외래도입유전자의 안정적인 유전을 암시한다.

DNA 분석 기술은 식물의 임의 부분에서 분리된 DNA을 이용하여 실시하는 반면, RNA는 특정 세포 또는 조직형에서만 발혀되고, 따라서, 이들 조직으로부터 분석용 RNA를 만드는 것이 필요하다. 또한, PCR^TM은 도입된 유전자로부터 만들어진 RNA의 검출과 정량에 사용할 수 있다. PCR^TM의 적용시, 역전사효소와 같은 효소를 이용하여 RNA를 DNA로 역전사시키고, 이후, 통상적인 PCR^TM기술을 이용하여 DNA를 증폭시키는 것이 필요하다. 대개의 경우, PCR^TM기술은 유용하긴 하지만 RNA 산물의 완전성을 입증하진 못한다. RNA 산물의 성격에 관한 정보는 노잔 블라팅으로 구할 수 없다. 이 기술은 RNA 종의 존재를 입증하고, RNA의 완전성에 대한 정보를 제공한다. 또한, RNA 종의 존재 또는 부재는 닷트 또는 슬랏 블랏 노잔 하이브리드형성을 이용하여 결정할 수 있다. 이들 기술은 노잔 블라팅의 변형으로, RNA 종의 부재 또는 존재만을 입증한다.

2. 유전자 발현

노잔 블라팅과 PCR^TM은 의문나는 유전자를 검출하는데 사용할 수 있지만, 유전자가 발현되는 지에 대한 정보를 제공하지는 못한다. 발현은 통합된 유전자의 단백질 산물을 확인하거나 또는 이들의 발현으로 얻어진 표현형 변화를 평가하여 특이적으로 확인하여 평가할 수 있다.

특이적 단백질의 생산과 확인을 위한 분석은 물리적-화학적, 구조적, 기능적 또는 다른 단백질의 성질을 이용한다. 독특한 물리적-화학적 또는 구조적 성질을 통하여, 단백질은 전기영동과정(예, 고유 혹은 변성 겔 전기영동 또는 등전접 공초점) 또는 크로마토그래피 기술(예, 이온 교환 또는 겔 배제 크로마토그래피)로 분리하고 확인할 수 있다. 개별 단백질의 독특한 구조는 특이적 항체를 이용한 ELISA 분석과 같은 형태로 이들의 존재를 검출할 수 있는 기회를 제공한다. 웨스턴 블라팅과 같은 병합 방식은 좀더 특이적으로 사용되는데, 여기서, 항체는 전기영동 기술에 의해 분리된 개별 유전자 산물을 위치를 파악하는데 사용한다. 관심있는 산물의 정체를 절대적으로 확인하기 위하여, 정제후 아미노산 서열분석에 의한 평가와 같은 추가의 기술을 사용할 수 있다. 이들 과정이 가장 공통적으로 사용되긴 하지만, 다른 과정도 사용할 수 있다.

또한, 분석 과정은 기능성, 특히, 특이적인 기질과 산물을 포함하는 특이적인 화학반응을 촉매하는 효소의 능력으로 단백질의 발현을 확인하는데 사용할 수 있다. 이들 반응 이후에, 기질의 손실 또는 물리적 혹은 화학적 과정에 의한 반응 산물의 재생을 제공하고, 정량한다. 이런 예는 분석할 효소만큼 다양한데, 여기에는 포스피노트리신과¹⁴C-acetyl CoA로부터 방사성라벨되고 아세틸화된 포스피노트리신의 생산이후의 PAT 효소활성, 또는 안트라닐레이트의 형광손실후 안트라닐레이트 합성효소 활성에 대한 분석이 포함된다.

유전자 산물의 발현은 대부분 발현의 표현형 결과를 평가하여 결정한다. 이들 분석은 다양한 형태를 취하는데, 이런 형태에는 화학 조성물에서 변화 분석, 구조 또는 식물의 생리학적 성질이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 화학적 조성물은 아미노산 조성을 변화시키고, 아미노산 분석으로 검출할 수 있는 효소 또는 저장단백질을 인코드하는 유전자의 발현으로, 또는 근접 적외선 반사율 분광광도법으로 분석할 수 있는 전분 분량을 변화시키는 효소로 변형시킬 수 있다. 구조적 변화에는 더 커진 신장과 더 두꺼워진 줄기가 포함된다. 식물 또는 식물 일부분의 가해진 처리에 대한 반응에서 대부분의 변화는 생물분석이라고 하는 조심스럽게 조절된 조건하에서 평가한다.

VII. 본 발명 식물의 번식

본 발명의 구조체를 이용한 특정 표현형의 직접 형질전환이외에, 본 발명의 구조체를 보유한 식물을 구조체가 없는 제 2 식물을 교잡하여 본 발명의 식물을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에는 본 발명에 따라 형질전환된 세포로부터 직접 재생된 식물뿐만 아니라, 상기 식물의 후손이 포함된다. 이 글에서 "후손"은 본 발명에 따라 만들어진 양친 식물의 임의 후대를 의미한다. 이 글에서 제시한 출발 식물계에 상대적인 하나 또는 복수의 추가된 외래도입유전자을 보유한 식물계를 제공하는 "교잡"은 본 발명의 외래도입유전자를 포함하는 공여 식물계와 출발계를 교잡하여 본 발명의 외래도입유전자를 한 식물계에 통합시키는 기술로 정의한다. 이를 달성하기 위하여, 일반적으로 다음의 단계를 실시한다:

(a) 제 1 양친 식물(출발계)과 제 2 양친 식물(본 발명의 외래도입유전자를 포함하는 공여 식물계)의 종자를 심는다;

(b) 제 1 양친 식물과 제 2 양친 식물의 종자를 꽃을 맺는 식물로 성장시킨다;

(c) 제 1 양친 식물의 암꽃과 제 2 양친 식물의 화분을 수분시킨다;

(d) 암꽃을 보유한 양친 식물에서 생산된 종자를 수거한다;

역교잡은 다음의 단계로 실시한다:

(a) 원하는 유전자, DNA, 서열 또는 요소를 보유한 제 1 유전형 식물과 원하는 유전자, DNA, 서열 또는 요소가 결핍된 제 2 유전형 식물을 교잡한다;

(b) 원하는 유전자, DNA, 서열 또는 요소를 보유한 하나 또는 복수의 후손 식물을 선별한다;

(c) 후손 식물과 제 2 유전형의 식물을 교잡한다;

(d) 제 1 유전형 식물의 원하는 유전자, DNA, 서열 또는 요소를 제 2 유전형 식물로 전이시키기 위하여 (b)와 (c) 단계를 반복한다.

DNA 요소의 식물 유전형으로의 유전질 침투는 역교잡 전환 과정의 결과로 정의한다. DNA 서열이 유전질 침투된 식물 유전형은 역교잡 전환된 유전형, 계통, 동계 또는 하이브리드로 칭한다. 유사하게, 원하는 DNA 서열이 결핍된 식물 유전형은 비전환된 유전형, 계통, 동계 또는 하이브리드로 칭한다.

VIII. 식물 외래도입유전자 조성

본 발명에서 특히 향상된 점은 마크 유전자와 다른 것들을 비롯한 외래도입유전자를 발현하는 향상된 방법을 제공한다는 점이다. 이런 외래도입유전자는 특정 단백질 또는 폴리펩티드 산물의 발현을 감독하는 유전자일뿐만 아니라, 비-발현성 DNA 분절, 예를 들면, 직접적인 자신의 위치를 보유하지 않는 Ds와 같은 트랜스포손일 수도 있다. 이 글에서 "발현가능 유전자"는 RNA(예, mRNA, 안티센스 RNA)로 전사될 수 있는 또는 관심있는 성질로서 단백질로 번역될 수 있는 임의의 유전자로, 여기에는 선택가능, 선별가능 또는 비-선별가능 마크 유전자가 포함된다. 본 발명에서, 마크 유전자가 아닌 발현가능 유전자를 마크 유전자와 병행하여 사용하는 경우 형질전환을 위한 동일 또는 상이한 DNA 분절상의 개별 유전자를 사용할 수 있을 것으로 예상한다. 후자의 경우에, 상이한 벡터를 수용세포에 동시전달하여 동시형질전환을 최대화시킨다.

수용세포에 전달하는 특정 DNA의 선택은 형질전환의 목적에 따라 달라지게 된다. 곡식 식물의 형질전환의 주목적중의 하나는 상업적으로 바람직하고 농업적으로 중요한 성질을 식물에 추가시키기 위한 것이다. 이런 성질에는 제초제 저항성 또는 내성; 곤충 저항성 또는 내성; 질병 저항성 또는 내성(바이러스, 박테리아, 진균, 선충류); 스트레스 내성 또는 저항성(예, 가뭄, 열, 한기, 냉기, 과도한 습기, 염 스트레스에 대한 저항성 또는 내성); 산화 스트레스; 향상된 산출율; 음식 함량과 구성; 외형; 웅성 수정; 드라이다운(drydown); 안전성; 출산력; 전분 성질; 기름 함량과 품질등이 포함되지만, 이들에 국한시키지 않는다. 이런 원하는 성질을 공여하는 하나 또는 복수의 유전자, 예를 들면, 제초제 저항성을 인코드하는 유전자를 통합할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 하나이상의 유익한 외래도입유전자로 수용세포를 형질전환시키는 방안을 제시한다. 하나 또는 복수의 외래도입유전자는 개별 외래도입유전자-인코딩 벡터, 또는 하나 또는 복수의 유전자 코딩 서열을 통합하는 단일 벡터를 이용한 단일 형질전환 현상으로 제공할 수 있다. 물론, 원하는 경우에, 제초제, 곤충, 질병(바이러스, 박테리아, 진균, 선충류) 또는 가물 저항성, 웅성 수정, 드라이다운, 안정성, 출산력, 전분 성질, 기름 함량과 품질을 공여하는 외래도입유전자, 또는 산출율 또는 영양 질을 향상시키는 외래도입유전자와 같은 전술한 외래도입유전자를 2개이상 사용할 수도 있다.

임의의 형질전환기술로 거의 모든 DNA 조성물을 도입하고, 궁극적으로 번식력있는 유전자도입 식물을 생산하는 것은 당분야에 공지된 것이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 벡터의 작제는 본 공개공보(예, Sambrook et al., 1989; Gelvin et al., 1990)에 비추어 당업자에게 공지된 것이다. 본 발명의 기술은 따라서, 임의의 특정 DNA 서열에 국한시키지 않는다. 가령, 사용되는 벡터와 플라스미드 형태상의 DNA 분절 또는 선형 DNA 분절은 일부 경우에 식물에서 발현되는 DNA 요소만을 보유한다.

특정 구체예에서, 단자엽 형질전환에 복제-콤피던트 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 이런 벡터에는 밀 난쟁이 바이러스(WDV) "셔틀" 벡터(예, pW1-11와PW1-GUS)가 포함된다(Ugaki et al., 1991). 이들 벡터는 대장균(E.coli)과 옥수수 세포에서 자발적으로 복제할 수 있고, 따라서, 유전자도입 세포에 전달되는 DNA를 검출하기 위한 향상된 감수성을 제공한다. 복제벡터는 Ac, Ds 또는 Mu와 같은 트랜스포손 요소에서 얻은 DNA 서열이 측면에 위치한 유전자의 전달에 유용하다. 옥수수 게놈내 이들 요소의 전위는 DNA 복제를 필요로 하는 것으로 알려지고 있다(Laufs et al., 1990). 또한, 전위가능 요소는 박테리아에서 플라스미드 벡터의 선별과 유지에 필요한 요소, 예를 들면, 항생제 저항성 유전자와 DNA 복제기점이 결핍된 DNA 단편을 도입하는데 유용할 것으로 예상된다. 또한, Ac, Ds 또는 Mu와 같은 전위가능 요소는 능동적으로 원하는 DNA의 통합을 촉진하고, 따라서, 안정적으로 형질전환된 세포의 빈도를 증가시킬 것으로 예상된다.

또한, 2개이상의 벡터로 식물 또는 식물 세포를 동시-형질전환시키는 것이 필요한 경우, 동시-형질전환은 마크와 관심있는 다른 유전자를 보유한 벡터를 이용하여 성취할 수 있다. 대안으로, 상이한 벡터, 예를 들면, 플라스미드는 관심있는 상이한 유전자를 보유하도록 하고, 수용세포에 동시 전달할 수 있다. 이런 방법을 이용하는 경우, 마크가 도입된 세포의 일부는 관심있는 다른 유전자를 흡수할 것으로 추정된다. 따라서, 마크에 의해 선별된 모든 세포가 세포에 동시전달된 관심있는 다른 유전자를 발현하는 것은 아니다.

식물세포의 형질전환에 사용되는 벡터, 플라스미드, 코스미드, YAC(효모 인공 크로모좀), BAC(박테리아 인공 크로모좀), 다른 DNA 분절는 일반적으로, 세포에 도입되기 원하는 cDNA 또는 유전자를 포함한다. 이들 DNA 구조체는 원하는 경우, 프로모터, 증폭제, 폴리링크 또는 조절 유전자와 같은 구조를 포함할 수 있다. 세포도입을 위해 선택된 DNA 분절 또는 유전자는 생성된 재조합 세포에서 발현되어 선별가능 또는 선택가능 성질이 나타내거나 또는 재생된 식물에 향상된 표현형을 부여하는 단백질을 종종 인코드한다. 하지만, 항상 이런 것은 아니고, 본 발명에는 또한, 비-발현된 외래도입유전자를 통합하는 유전자도입 식물이 포함된다. 본 발명에 사용하는 벡터에 포함될 가능성이 높은 적절한 성분은 다음과 같다.

(i) 조절 요소

본 발명에 따라 만들어진 구조체는 일반적으로, 옥수수 또는 다른 단자엽에서 유전자 침묵을 제한하는 프로모터를 포함한다. 이런 경우, 프로모터는 외래도입 유전자 발현이 필요한 단자엽이외의 종에서 분리할 수 있다. 적절한 구조체는 일반적으로, Coix 속에서 얻은 프로모터를 포함한다. 프로모터는 새로 Coix로부터 분리하거나, 또는 데이터에 기초하여 공지된 유전자 또는 프로모터로부터 분리할 수 있다. Coix에서 얻은 프로모터의 분리에 특히 유용할 것으로 예상되는 공지된 단자엽 유전자와 프로모터의 예는 전술하였다.

프로모터이외에, 다른 유형의 요소가 유전자 발현을 조절할 수 있다. 이런 요소중의 하나는 전사개시위치와 코딩 서열의 출발위치(비번역된 리드서열)사이의 DNA서열이다. 리드 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는데, 리드 서열을 편집하여 최적 또는 소-최적 서열을 예상하고, "공통"과 적절한 리드서열을 만들었다(Joshi, 1987). 적절한 리드서열에는 부가된 유전자의 최적 발현을 감독할 것으로 예상되는 서열을 보유한 리드 서열, 다시 말하면, mRNA 안정성을 증가 또는 유지시키고 부적절한 번역개시를 예방하는 적절한 공통 리드 서열이 포함된다. 이런 서열의 선택은 본 공개공보에 비추어 당분야에 공지된 것이다. 식물에서 고도로 발현되는 유전자에서 유래한 서열이 가장 바람직하다.

전사 증폭제 또는 복수의 증폭제를 사용하여 발현을 증가시킬 수 있다. 이들 증폭제는 진핵세포에서 기능하는 프로모터상의 전사출발위치의 5'에서 발견되지만, 코딩서열에서 5' 또는 3' 선행 또는 역행방향으로 삽입할 수 있다. 일부 경우에, 이들 5' 증폭요소는 인트론이다. 증폭제의 예로는 CaMV 35S 프로모터, 옥토핀 합성효소 유전자(Ellis et al., 1987), 쌀 액틴 1 유전자, 옥수수 알코올 디하이드로게나제 유전자, 옥수수 주름 1 유전자, 비-식물 진핵생물(예, 효모; Ma et al., 1988)에서 얻은 프로모터를 들 수 있다.

ocs 증폭제 요소를 보유하는 벡터가 본 발명에 따라 특이적으로 사용될 것으로 예상될 것으로 예상된다. 이 요소는 처음에, 아그로박테리움(Agrobacterium)의 옥토핀 합성효소(ocs) 유전자에서 얻은 16 bp 패린드롬 증폭제로 확인되었고(Ellis et al., 1987), 10개이상의 프로모터상에 존재하다(Bouchez et al., 1989). ocs 요소와 이런 요소의 다수 복사본과 같은 증폭제 요소를 사용하여, 단자엽 형질전환에 적용된 인접한 프로모터들의 전사수준을 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다.

하나이상의 유전자로 구성된 거대 DNA 서열의 도입이 바람직하다. 이런 서열은 도입은 박테리아 또는 효모 인공 크로모좀(각각, BACs 또는 YACs), 또는 식물 인공 크로모좀의 사용으로 용이하게 할 수 있다. 가령, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환에 대한 BAC의 사용은 Hamilton등(1996)이 기술하였다.

궁극적으로, 단자엽 게놈에 도입하기 위한 가장 적절한 DNA 분절은 원하는 성질(예, 에이커당 산출량 증가)을 인코드하는 상동성 유전자 또는 유전자 페밀리이고, 본 발명에 따른 신규한 프로모터 또는 증폭제의 조절하에 도입한다. 조직 특이적 조절 영역은 이런 관점에서 특히 유용하다. 실제로, 본 발명의 특정 용도는 조직-특이적 방식으로 표적화되는 외래도입유전자를 포함하는 형질전환체를 생산하는 것이다. 가령, 곤충 저항성 유전자는 윤생체 및 유럽 곡식 천공충(ECB)의 제 1과 제 2 부화의 표적이 되는 경령/초(sheath) 조직에서 특이적으로 발현된다. 유사하게, 뿌리벌레에 대한 특이적인 활성을 보유한 단백질을 인코드하는 유전자는 뿌리 조직을 직접 표적으로 하도록 할 수 있다. 또한, 곡식의 영양조성에 영향을 주는 특정 유전자의 발현은 종자, 예를 들면, 배젖 또는 배를 표적으로 해야 한다.

유전자도입 식물에서 유전자 발현의 조직-특이적 표적화에 사용하는 벡터는 조직-특이적 프로모터를 보유하고, 또한, 증폭제 서열과 같은 다른 조직-특이적 조절요소를 포함한다. 본 발명에 따라 특정 식물 조직에서 특이적 또는 향상된 발현을 주도하는 프로모터는 본 공개공보에 비추어 당업자에게 공지된 것이다.

또한, 조직 특이적 발현은 유전자 산물이 바람직하지 않은 조직에서만 발현되는 안티센스 유전자와 복합된 구조적으로 발현된 유전자(모든 조직)를 도입하여 기능적으로 성취할 수 있다. 가령, 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis (Bt))에서 얻은 결정 독소 단백질을 코딩하는 유전자는 도입하여 구조 프로모터, 예를 들면, Coix에서 얻은 액틴 프로모터를 이용하여 모든 조직에서 발현시킨다. 또한, 하나이상의 프로모터로부터 얻은 요소를 결합시킨 프로모터가 유용할 것으로 예상된다. 가령, U.S. 특허 No. 5,491,288에서, 히스톤 프로모터와 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터를 결합시키는 것을 제시한다. 옥수수 중핵에서 Bt 유전자의 안티센스 전사체를 제인 프로모터를 이용하여 발현시키면, 종자에서 Bt 단백질의 축적을 예방할 수 있다. 따라서, 도입된 유전자에 의해 인코드된 단백질은 중핵을 제외한 모든 조직에 존재하게 된다.

대안으로, 본 발명에 따라 사용하기 위하여, Coix로부터 얻은 신규한 조직-특이적 프로모터 서열을 수득하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 관련된 조직으롤부터 cDNA 클론을 먼저 분리하고, 노잔 블라팅을 이용하여 상기 조직에서 특이적으로 발현되는 클론을 확인한다. 이상적으로, 사본수는 많지 않지만, 유전자 산물이 특정 조직에서 상대적으로 풍부하게 존재하는 유전자를 동정하는 것이 바람직하다. 이후, 상응하는 게놈 클론의 프로모터와 조절요소는 당업자에게 공지된 분자생물학 기술을 이용하여 위치를 파악한다.

조직-특이적 프로모터를 확인하기 위한 다른 유용한 방법은 분화 전시이다(U.S. Patent No. 5,599,672). 분화 전시에서, mRNA는 상이한 조직형과 비교한다. 일부 특정 조직형 또는 일단의 조직형에만 존재하는 mRNA종을 확인함으로써, 조직 특이적 방식으로 발현되는 상응 유전자를 확인할 수 있다. RNA는 역전사효소로 역전사시켜 cDNA를 만들고, 상기 cDNA는 전장 유전자를 보유한 클론을 분리하는데 사용한다. 이 글에서 구체적으로 밝힌 바와 같이, cDNA는 억제 PCR을 이용하여, 각각의 유전자로부터 상동체 혹은 상동성 프로모터, 증폭제 또는 전사종지신호를 분리하는데 사용할 수 있다.

유전자도입 식물에서 일부 유전자의 발현은 특정조건하에서만 바람직할 것으로 예상된다. 가령, 가뭄과 같은 환경 스트레스 인자에 대한 저항성을 공여하는 특정 유전자의 발현은 실제 스트레스 조건하에서만 바람직하다. 또한, 식물 발달과정동안 이런 유전자의 발현은 해로운 효과를 줄 것으로 예상된다. 환경에 반응하는 유전자가 다수 존재하는 것으로 알려져 있다. 가령, 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제를 인코드하는 rbcS와 같은 일부 유전자의 발현은 광색(photochrome)으로 매개되는 광으로 조절할 수 있다. 다른 유전자는 2차 자극으로 유도할 수 있다. 가령, 아브시스산(ABA)의 합성은 물 스트레스를 비롯한 특정 환경 인자로 유도한다. 다수의 유전자가 ABA에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다(Skriver and Mundy, 1990). 또한, 곤충 포식에 저항성을 공여하는 유전자의 발현은 실제 곤충 만연한 조건하에서만 바람직하다. 따라서, 일부 원하는 성질의 경우, 유전자도입 식물에서 유전자의 유도성 발현이 바람직하다.

본 발명의 구체예에서, 유전자도입 식물에서 유전자의 발현은 식물의 발달동안 특정 시기에만 바람직하다. 발달 시간은 주로 조직 특이적 유전자 발현과 연관한다. 가령, 제인 저장 단백질의 발현은 수분후 10일쯤에 배젖에서 시작된다.

또한, 세포내 DNA 자체를 표적으로 하는 것이 유용할 것으로 예상된다. 가령, 도입된 DNA가 핵을 표적으로 하도록 하는 것이 유익한데, 그 이유는 이것이 형질전환의 빈도를 증가시키기 때문이다. 핵 자체에서, 부위 특이적 통합을 달성하기 위하여 유전자를 표적으로 하는 것이 유익하다. 가령, 세포에서 형질전환을 통하여 도입된 유전자가 기존의 유전자를 대체하도록 하는 것이 유익하다.

(ii) 전사종결신호

구조체는 일반적으로, 전사를 종결시키고 생성된 mRNA의 폴리아데닐화를 가능하게 하는 신호로서 작용하는 3'말단 DNA 서열과 함께 관심있는 유전자를 보유한다. 가장 적절한 3' 요소는 아그로박테리움 투메파시엔(Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 합성효소 유전자(3'말단)(Bevan et al., 1983)에서 얻은 요소, 아그로박테리움 투메파시엔(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토핀 합성효소 유전자에서 얻은 T7 전사체의 전사종지신호, 감자 또는 토마토에서 얻은 프로테아제 저해물질 I이나 II 유전자의 3'말단일 것으로 예상된다. 원하는 경우, Adh 인트론 1(Callis et al., 1987), 자당 합성효소 인트론(Vasil et al., 1989) 또는 TMV 오메가 요소(Gallie, et al., 1989)와 같은 조절요소를 포함할 수 있다. 대안으로, 전사종지신호는 프로모터 서열에 대하여 전술한 바와 같이 Coix로부터 본 발명에 따라 분리할 수 있다.

특히, 적절한 종료물질은에서 Coix 분리한것들이 된다. 예를 들면, 감마 코익신 종료물질 및 Coix 올레오신 3 종료물질이 된다. 하기 실시예 2와 3에서는 이들 종료물질의 클로닝에 대해 설명한다. 예를 들면, 서열 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO:17에서 각 감마 코익신 및 올레오신 3 종료물질의 핵산 서열을 나타낸다.

(iii) 운반 및 시그날 펩티드

저항 유전자의 코딩 서열에 결합되는 서열은 초기 해독 생성물에서 해독후에 제거되고, 세포내 또는 세포외 막을 통하여 또는 이쪽으로 단백질을 운반하는 소위 운반(이는 공포, 소포, 플라스티드 또는 다른 세포내 기관으로) 또는 시그날 서열(이는 통상 망상내피, 골지체, 세포막의 외측으로)로 불리는 것이다. 단백질을 세포의 안팍의 격실로 운반함으로써, 이와 같은 서열은 단백질 분해로부터 보호하여, 이들 유전자 생성물이 축적되는 것을 증가시킨다. 이와 같은 서열은 또한, 유전자의 코딩 서열에 부착된 상당히 발현되는 유전자의 mRNA 서열을 추가할 수 있도록 한다. 리보좀에 의해 해독되는 mRNA는 네이크 mRNA보다는 안정적이기 때문에, 이 유전자앞에 해독가능한 mRNArk 존재함으로써, 유전자로부터 mRNA 전사체의 전반적인 안정성을 증가시킨다. 운반 및 시그날 서열은 통상적으로 초기 해독 생성물에서 해독후에 제거되기 때문에, 이들 서열을 이용하면, 최종 폴리펩티드에 나타나지 않는 여분의 해독된 서열을 추가할 수 있다. 또한, 단백질의 안정성을 증가시키기 위해, 특정 단백질의 운반을 운반할 필요가 있다(미국 특허 5,545,818).

또한, 형질변환된 식물의 세포내로 특정 유전자 생성물을 세포내 표적화시키거나 또는 세포외 환경으로 직접적으로 단백질을 표적화시키는 경우에 벡터를 작제하여 이용할 수 있다. 특정 유전자의 코딩 서열에 운반 또는 시그날 펩티드 서열을 인코드하는 DNA 서열을 결합시키면 된다. 생성된 운반 또는 시그날 그는 단백질을 특정 세포내 또는 세포외 목적지로 각 단백질을 운반하여, 해독후에 제거될 수 있을 것이다.

이와 같은 용도의 특정 예로는 돌연변이 EPSPS 단백질과 같은 살충제 저항성을 제공하는 단백질을 세포질이외의 엽록체와 같은 특정 기관으로 향하게 하는 것이다. 예를 들면, rbcS 운반 펩티드를 이용하여(이는 미국 특허 5,728,925에 설명된 엽록체 운반 펩티드 또는 미국 특허 5,510,471에서 설명하는 최적화된 운반 펩티드), 색소체-특이적인 표적 단백질을 제공하는 것이다. 또한, 미토콘드리아에 수컷 불임성에 저항성인 특정 유전자를 표적화시키거나 또는 세포외 공간에 식물성 변인 유기체에 저항성인 유전자를 표적화시키거나 또는 공포에 단백질을 표적화시킬 수도 있다. 추가 용도로는 색소체에 아미노산 생합성 또는 오일 생합성에 관계되는 효소를 향하게 할 수 있다. 이와 같은 효소에는 디하이드로디피콜린산 합성효소가 포함되는데, 이는 사료에 리신 함량을 증가시키는 역할을 한다.

(iv) 표적 유전자

형질변환체를 확인하는 능력을 개선시키기 위해, 관심이 되는 발현가능한 유전자에 추가하여 선택가능한 또는 스크리닝가능한 표식 유전자를 이용할 수 있다. "표식 유전자"는 표식 유전자를 발현하는 세포에 뚜렷한 표현형을 제공하여, 표식을 가지지 않는 세포로부터 이와 같은 형질변환된 세포를 구별할 수 있도록 하는 유전자이다. 이와 같은 유전자는 표식이 화학적인 수단 가령, 선택성 물질을 이용하여(예를 들면, 살충제, 항생제등) 선??할 수 있는 형질을 부여하는지 또는 관찰 또는 테스트(가령, "그린 형광 단백질")를 통하여 형질을 간단하게 확인할 수 있는 지에 따라 선별성 또는 스크리닝가능한 표식으로 분류할 수 있다. 물론, 본 발명에서 이용할 수 있는 적절한 표식 유전자는 당업자가 인지할 수 있을 것이다.

선별가능한 또는 스크리닝가능한 표식 유전자에는 형질변환된 세포에 대해 확인 또는 선별가능한 수단으로 분비가 감지되는 "선별가능한 표식"을 인코드하는 유전자도 포함된다. 예를 들면, 항체 상호작용에 의해 확인할 수 있는 분비가능한 항원을 인코드하는 표식, 또는 이들의 촉매 활성에 의해 감지할 수 있는 분비가능한 효소를 인코드하는 표식이 포함된다. 분비가능한 단백질에는 ELISA에 의해 감지할 수 있는 작은 확산가능한 단백질; 세포외 용액에서 감지가능한 작은 활성의 효소(가령, α-아밀라제, β-락타마제, 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제); 세포벽에 삽입 또는 포집되는 단백질(가령, 익스텐신 또는 담배 PR-S의 발현 단위에서 볼 수 있는 것과 같은 리더 서열을 포함하는 단백질등으로 분류될 수 있다.

선택가능한 분리성 표식에 대해서, 세포벽에 격리될 수 있는 단백질을 인코드하는 유전자, 이들 단백질에는 독특한 에피토프를 포함하는 것이 특히 유익하다. 이와 같은 분비된 항원 효식은 이상적으로는 식물 조직에서 수준이 낮은 에피토프 서열, 효과적인 발현 및 혈장 막을 통과하는 표적화되는 프로모터-리더 서열을 이용하여, 세포 벽에 결합되어 항체에 접근할 수 있는 단백질을 만든다. 독특한 에피토르를 포함하도록 변형된 정상적으로 분비된 단백질은 이와 같은 요구조건을 만족시킬 수 있다.

이와 같은 방법으로 변형되는데 적합한 단백질에는 엑스텐신 또는 하이드록시프롤린 풍부한 글리코단백질(HPRG)이다. 옥수수 HPRG(Steifel et al., 1990)를 이용하는 것이 적절한데, 그 이유는 분자 생물학, 발현 및 단백질 구조에 대해 잘 알려져 있기 때문이다. 그러나, 익스텐신 및 글리신이 풍부한 벽 단백질중 하나(Keller et al., 1989)를 항원성 부위를 추가시키는 변형시켜, 스크리닝가능한 표식을 만들 수 있다.

분비가능한 스크리닝가능한 표식의 한 가지 구체예에는 뮤린의 인터루킨1-β(IL-1-β)의 프로부분의 15개 잔기 에피토프를 포함하도록 변형된 벽 단백질 HPRG을 인코드하는 옥수수 서열을 이용하는 것이다. 그러나, 실제 감지가능한 에피토프를 이와 같은 구체예에 이용할 수 있는데, 당분야에 공지된 상당히 다양한 항원:항체 복합체에서 선별할 수 있다. IL-1β또는 임의 다른 단백질 또는 에피토프 부분에서 유도된 독특한 세포외 에피토프는 발색성 또는 형광 어쥬번트와 결합한 항체 라벨링을 이용하여 바로 감지할 수 있다.

1. 선택성 표식

본 발명과 연관하여 다양한 선택성 표식 유전자를 이용할 수 있는데, 예를 들면, neo 유전자(Potrykus et al., 1985)이는 카나마이신 저항성을 인코드하여, 카나마이신, G418, 파라모마이신을 이용하여 선벽할 수 있고; bar 유전자-바아라포스 저항성을 부여하는 유전자; 돌연변이 EPSP 합성효소 단백질(Hinchee et al., 1988)-글리포스페이트 저항성을 부여하는 유전자; Klebsiella ozaenae의 bxn와 같은 니트릴라제 유전자-이는 브롬옥시닐에 저항성을 부여하는 유전자(Stalker et al., 1988); 이미다롤린, 설포닐우레아 또는 다른 ALS 저항성 화학물질에 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 합성효소 유전자(ALS)(European Patent Application 154,204, 1985); 제토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자(Thillet et al., 1988); 살충제 달라폰에 저항성을 제공하는 달라폰 디할로게나제 유전자 또는 5-메틸 트립토판에 저항성을 부여하는 돌연변이된 안트라닐레이드 합성효소 유전자등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 돌연변이 EPSP 합성효소를 이용할 경우에, 적절한 염색체 운반 펩티드; CTP(미국 특허 5,188,642); OTP(미국 특허5,633,448); EPSPS 유전자(PCT Application WO 97/04103)를 결합시켜, 추가 이익을 얻을 수 있다.

형질변환체를 선뱍하는데 있어서, 시스템에서 이용할 수 있는 선택가능한 표식 유전자의 구체예에는 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제 효소를 인코드하는 유전자 가령, Streptomyces hygroscopicus 로부터 bar 유전자 또는 Streptomyces viridochromogenes로부터 pat 유전자와 같은 유전자가 될 수 있다. 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제(PAT)는 살충제 비알라포스, 포스피노트리신(PPT)에 있는 활성 성분을 비활성화시킨다. PPT는 글루타민 합성효소를 방해하여(Murakami et al., 1986; Twell et al., 1989), 암모니아가 급격하게 축적되어, 세포를 죽게한다.

본 발명을 실행하는데 있어서, 비알포스 저항성 유전자를 이용하는 경우에, 발명자는 이 목적을 위해 특히 유용한 유전자로써, Streptomyces(ATCC No. 21,705)에서 수득할 수 있는 bar 유전자 또는 pat 유전자라는 것을 발견하였다. bar 유전자의 클로닝은 Murakame et al., 1986; Thompson et al., 1987에서 설명하는데, 식물에서 bar 유전자를 이용하는 것과 같다(De Block et al., 1987; De Block et al., 1989; U.S. Patent No. 5,550,318).

2. 스크리닝가능한 표식

이용할 수 있는 스크리닝가능한 표식에는 β-글루쿠로니다제 또는 다양한 색원체 기질로 알려진 효소를 인코드하는 uidA 유전자(GUS); 식물 조직에서 안토시아닌 색소(붉은 색)의 생산을 조절하는 생성물을 인코드하는 R-위치 유전자(Dellaporta et al., 1988); 다양한 색원체 기질로 알려진(PADAC, 발색성 세팔로스포린) 효소를 인코드하는 β-락탐메이즈 유전자(Sutcliffe, 1978); 색원체 차테콜로 변환시키는 카테콜 디옥시게나제를 인코드하는 xylE 유전자(Zukowsky et al., 1983); α-아밀라제 유전자(Ikuta et al., 1990); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시키고, 이를 다시 응축시켜, 용이하게 감지할 수 있는 화합물 멜라닌을 형성하게 하는 효소를 인코드하는 티로시나제 유전자(Katz et al., 1983); 색원체 기질로 알려진 효소를 인코드하는 β-갈락토시다제 유전자; 생체 발광 감지를 할 수 있는 루시페라제(lux) 유전자(Ow et al., 1986); 칼슘-감응성 생체발광 감지에 이용될 수 있는 에퀴린 유전자(Prasher et al., 1985); 그린 형광 단백질을 인코드하는 유전자(Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al., 1996; Tian et al., 1997; WO 97/41228)등이 포함된다.

옥수수 R 유전자 복합체의 유전자가 특히 스크리닝가능한 표식으로 유용하다고 볼 수 있다. 옥수수에 있는 R 유전자 복합체는 대부분의 씨 및 식물 조직에서 안토시아닌 색소 생산을 조절하는 작용을 하는 단백질을 인코드한다. 옥수수 균주는 한 개 또는 최고 4개까지의 R 대립형질을 가지는데, 이들이 복합되어 발생 및 조직 특이적인 방식으로 색소를 조절한다. 따라서, 이와 같은 세포로 도입된 R 유전자는 붉은 색 색소를 발현되도록 하여, 안정적으로 결합된 경우에, 시각적으로 붉은 섹터로 기록할 수 있다. 옥수수 주에 안토시아닌 생합성 결로의 효소 중간생성물(C2, A1, A2, Bz1, Bz2)을 인코드하는 우성 대립형질 유전자를 가지고, R 위치에는 열성 대립형질을 가지는 경우에, 임의 세포를 R로 형질변환시킬 경우에, 붉은 색 색소가 형성된다. 예를 들면, rg-Stadler 대립형질을 가지는 Wisconsin 22, TR112, K55 유도체 가령, r-g, b, P1등이 될 수 있다. 또는, C1 및 R 대립형질을 함께 임의 유전자형 옥수수를 이용할 수도 있다.

R 유전자 조절 부분을 키메라 구조체에 이용하는 경우에 키메라 유전자의 발현을 조절하는 기작을 제공할 수 있다는 것이다. 다른 위치가 아닌 R 위치에 상당히 다양한 표현형 발현이 있는 것으로 공지되어 있다(Coe et al., 1988). 구조 R 유전자에 5' 말단 부분에서 수득한 조절 부분은 곤충 저항성, 살충제 내성 또는 다른 코딩 부분의 유전자 발현을 시키는데 유익할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 다양한 R 유전자 족중 임의 구성원을 성공적으로 이용할 수 있는데, 예를 들면, P, S, Lc등이 된다. 그러나, 가장 적절한 것은 Sn이다(특히 Sn:bol3). Sn은 R 유전자 복합체의 우성 구성원으로, 이는 R 및 B 위치와 유사한 기능을 하는데, Sn은 특정 묘목, 식물 세포에서 안토시아닌 색소의 조직 특이적인 침착을 조절하여, 이들의 표현형은 R과 유사하다.

본 발명에 이용할 수 있는 스크리닝가능한 효식으로는 lux 유전자에 의해 인코드되는 개똥벌레 루시페라제이다. 형질변환된 세포에 lux 유전자가 존재하는 경우에 X-선 필름, 신틸레이션 카운터, 형광 분광광도계, 저광 비디오 카메라, 광자 카운팅 카메라 또는 다중웰 발광측정기를 이용하여 감지할 수 있다. 이와 같은 시스템은 조직 배양 플레이트 또는 전체 식물 스크리닝에서 생체발광에 대해 집단적으로 스크리닝하기 위해 개발될 수 있다. 그린 형광 단백질을 인코드하는 유전자가 특히 유용한 리포터로 보고 있다(Sheen et al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al., 1996; Tian et al., 1997; WO 97/41228). 그린 형광 단백질이 발현된 것은 특정 파장의 광을 조사한 후에 세포 또는 식물에서 형광으로 볼 수 있다.

(v) 단자엽식물의 변형을 위한 외래도입유전자

본 발명에서 특히 중요한 진보는 표식유전자에 추가하여, 또는 이외에 식물 세포에서 유전자의 효과적인 발현을 위한 방법 및 조성물을 제공한다는 것이다. 이와 같은 외래도입유전자는 특정 단백질 또는 폴리펩티드 생성물을 발현시키는 것이나 이들이 비-발현성 DNA 단편 가령, 이들의 전치에는 관여하지 않는 Ds와 같은 트랜스포존이 될 수도 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "발현가능한 유전자"는 RNA로 전사되어(가령, mRNA, 안티센스 RNA) 또는 단백질로 해독되어 관심이 되는 형질을 발현시키는 임의 유전자이나, 이들을 선별가능한, 스크리닝가능한 또는 비-선별성 표식 유전자로 제한시키지는 않는다. 또한, 본 발명은 표식 유전자를 필요로하지 않는 발현가능한 유전자를 표식 유전자와 복합하여, 형질변환을 위한 동일한 또는 다른 DNA 단편상에서 별도 유전자를 이용할 수도 있다. 후자의 경우에 다른 벡터가 수용 세포로 동시에 운반되어, 공동-형질변환을 최대화시킨다.

수용 세포로 운반될 특정 DNA 단편은 형질변환의 목적에 따라 달라진다. 곡식의 형질변환의 주요 목적중에 하나는 상업적으로 유용한, 농경적으로 중요한 형질을 식물에 추가하는 것이다. 이와 같은 형질에는 살충제 저항성 또는 내성; 곤충 저항성 또는 내성; 질병 저항성 또는 내성(바이러스, 박테리아성, 곰파이, 선충류); 스트레스 저항성 또는 내성 예를 들면, 가뭄, 열, 동상, 냉동, 과도한 수분, 염등이 될 수 있고; 산화성 스트레스; 건조; 직립성; 다산성; 전분의 양과 질; 오일의 양과 질; 단백질의 양과 질; 아미노산의 조성물등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 이와 같은 바람직한 형질(들)을 부여하는 한 가지 이상의 유전자 가령, 살충제 저항성을 인코드하는 유전자를 결합시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 한 개 이상의 외인성 유전자를 수용 세포로 형질변환시키는 것을 고려한다. 여기에서 이용된 것과 같이 "외인성 유전자"는 동일한 내용으로 숙주 게놈에서는 정상적으로는 발견되지 않는 유전자를 말하는 것이다. 숙주 게놈 이외의 다른 종에서 분리하거나 또는 숙주 게놈으로부터 분리하였으나, 변형안된 교유 유전자에서 발현되는 것과는 다른 한 개 이상의 조절 부분이 연결된 것을 의미한다. 두 개 이상의 외인성 유전자를 별개의 외래도입유전자 인코딩 벡터를 이용하거나 또는 두 개 이상의 유전자 코딩 서열이 결합된 한 개 벡터를 이용하여 한번의 형질변환으로 공급할 수 있다. 예를 들면, 수렴성, 발산성 또는 공동선형 방향의 bar 및 aroA 발현 단위를 가지는 플라스미드가 바람직하다. 또한, Bt 곤충 저항성 유전자와 같은 유전자와 pinⅡ와 같은 프로테아제 저해물질 유전자와 복합하여 또는 bar 유전자가 상기 유전자와 복합시킬 수 있다. 물론, 임의 두 개 이상의 외래도입유전자 가령, 살충제, 곤충, 질환(바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성, 선충류) 또는 가뭄 저항성, 수컷 불임성, 건조, 직립성, 다산성, 전분 성질, 오일 양과 질, 또는 수득율의 증가 또는 영양소의 질과 관련된 외래도입유전자를 이용할 수 있다.

1. 살충제 저항성

포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제(bar 및 pat), 글리콜레이드 내성 EPSP 합성효소 유전자, 글리포스페이트 산화환원효소를 인코드하는 글리포스페이트 분해 효소 유전자 gox, deh(다라폰을 비활성화시키는 디할로게나제 효소를 인코드); 살충제 저항성(설포닐우레아 및 이미다졸리논), 아세틸락테이드 합성효소, bxn 유전자(브로모옥시닐을 분해하는 니트릴라제 효소를 인코드)등이 형질변환에 이용될 수 있는 살충제 저항성 유전자의 좋은 예가 된다. 포스피노트리신 아세틸트란스퍼라제(PAT) 효소를 인코드하는 bar 및 pat 유전자는 살충제 포스피노트리신을 비활성화시켜, 글루타민 합성효소를 저해하는 화합물로부터 보호할 수 있다. 효소 5-에놀피루빌쉬키메이트 3-포스포페이트 합성효소(EPSP 합성효소)는 살충제 N-(포스포노메틸)글리신(글리포스페이트)에 의해 정상적으로 저해된다. 그러나, 유전자는 글리포스페이트-저항성 EPSP 합성효소를 인코드하는 것으로 공지된다. 이와 같은 유전자는 특히 단자엽 형질변환에 유용하다. deh 유전자는 달라폰 디할로게나제 효소를 인코드하여, 살충제 달라폰에 저항성을 부여한다. 특이적인 니트릴라제 효소를 인코드하는 bxn 유전자는 브로모옥시닐을 살충제에 분해되지 않는 생성물로 변환시키는 효소를 인코드한다.

2. 곤충 저항성

도입될 수 있는 잠재적인 곤충 저항성 유전자는 Bacillus thuringiensis 결정 독소 유전자 또는 Bt 유전자이다(Watrud et al., 1985). Bt 유전자는 European Corn Borer(ECB)와 같은 레피도프테안 또는 콜레프테란 해충에 저항성을 제공한다. 이와 같은 구체예에 이용할 수 있는 적절한 Bt 독소 유전자에는 CryⅠA(b) 및 CryⅠA(c) 유전자를 포함한다. 해충의 생장 또는 발생에 영향을 줄 수 있는 다른 종의 B. thuringiensis 에서 얻은 내독소 유전자도 이에 이용할 수 있다.

여기에서 설명하는 형질변환과정에 이용할 수 있는 적절한 Bt 유전자는 이들의 코딩 서열을 변형시켜, 식물 특히 옥수수에서 발현을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 보인다. 합성 유전자를 준비하는 방법은 당분야에 공지된 것으로, 예를 들면 미국 특허 5,500,365 및 5,689,052에서 잘 설명하고 있다. 이와 같은 변형된 Bt 독소 유전자의 예로는 합성 Bt CryⅠA(b) 유전자(Perlak et al., 1991) 및 합성 CryⅠA(c) 유전자(1800b이라고 칭함(PCT 출원 WO 95/06128)을 포함한다. 당분야에 공지된 다른 다른 Bt 독소 유전자의 일부 예를 다음의 표 3에 나타내었다.

표 3a

표 3b

표 3c

http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html

프로테아제 저해물질은 곤충 저항성을 제공하여(Johnson et al., 1989), 식물 형질변환에 유용하다. 토마토 또는 감자에서 얻은 프로테아제 저해물질 II 유전자 pinⅡ가 특히 유용한 것으로 보인다. 좀더 유익하게는 pinⅡ유전자와 Bt 독소 유전자를 복합하여 이용하는 것인데, 이들의 복합 효과는 살충 활성에 시너지 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 곤충 소화계의 저해물질을 인코드하는 또는 저해물질의 생산하는 효소 또는 공인자를 인코드하는 유전자가 유용하다. 이와 같은 집단은 밀 및 보리에서 볼 수 있는 것과 같은 오리자시스타틴 및 아밀라제 저해물질이 된다.

또한, 렉틴을 인코드하는 유전자는 추가 또는 다른 살충성 성질을 부여한다. 렉틴(원래는 피토헤마글루티닌이라고 불림)는 다양한 종의 적혈 세포를 응집시킬 수 있는 능력을 가지는 다가 탄수화물 결합 단백질이다. 렉틴은 최근에 바구미, ECB, 뿌리벌레에 대해 활성이 있는 살충성 물질로 확인된 바 있다(Murdock et al., 1990; Czapla ＆ Lang, 1990). 유용한 것으로 간주되는 렉틴 유전자는 보리 및 맥아 아글루티닌(WGA) 및 쌀의 렉틴(Gatehouse et al., 1984)이 되고 WGA가 가장 적절하다.

해충으로 도입되었을 때, 곤충에 저항하여 큰 또는 작은 폴리펩티드 가령, 세포 용해 펩티드, 펩티드 호르몬 및 독소 및 독물과 같은 펩티드를 생산을 조절할 수 있는 유전자가 본 발명의 또 다른 측면이 된다. 예를 들면, 특정 해충에 대항하는 청소년기 호르몬 에스테라제가 발현되면, 살충 활성을 가지게 되어 변형이 중단된다(Hammock et al., 1990).

곤충 표피의 완전성에 영향을 주는 효소를 인코드하는 유전자를 발현시키는 형질변환된 옥수수 또한 본 발명의 또 다른 측면이 된다. 이와 같은 유전자에는 치티나제, 프로테아제, 리파제 및 니코마이신을 생산하는 유전자, 치틴 합성을 저해하는 화합물, 곤충에 저항성이 있는 옥수수 식물을 생산하는 것으로 보이는 임의 유전자를 도입시키는 것이 포함된다. 곤충의 탈피에 영향을 주는 활성을 인코드하는 유전자, 예를 들면, 엑디스테로이드 UDP-글루코실 트란스퍼라제 생산에 영향을 주는 유전자도 본 발명의 범위에 속한다.

해충에 대해 숙주 식물의 영향소 질을 감소시키는 화합물을 생산하는 효소를 인코드하는 유전자도 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면 스테롤 조성을 변형시켜 식물에서 살충 활성을 증가시킬 수 있다. 스테롤은 곤충의 음식으로부터 수득되는 것으로 호르몬 합성 및 막 안정성에 이용된다. 따라서, 신규한 유전자 즉, 원하지 않는 스테롤의 생산을 직접적으로 촉진시키거나 원하는 스테롤을 원하지 않는 형으로 변환시키는 유전자를 발현시킴으로써 식물의 스테롤 조성물을 변형시켜 곤충 생장 및 발생에 음성적인 효과를 제공하여 식물에 살충 활성을 가지도록 하는 것이다. 리폭시게나제는 자연 발생 식물 효소로써 곤충에 항-영양 효과를 나타내어, 곤충의 영영소의 질을 감소시키는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 구체예는 곤충 사료에 저항성을 가지는 리폭시게나제 활성을 강화시킨 형질변환된 식물에 관계한다.

Tripsacum dactyloides는 특정 해충 특히 곡식 뿌리 해충에 저항성을 가지는 풀 종류이다. 해충에 독이 되는 단백질을 인코드하는 유전자 또는 해충에 독이 되는 화합물의 생합성에 관계하는 단백질을 인코드하는 유전자를 Tripsacum로부터 분리시켜, 이와 같은 신규한 유전자가 해충에 저항성을 부여하는데 유용할 수 있다. Tripsacum에 해총 저항성은 유전적인 것에 기초하는데, 그 이유는 이와 같은 저항성이 성 교배를 통하여 Zea mays로 전달되기 때문이다(Branson and Guss, 1972). 또한 다른 곡식 단자엽 또는 쌍자엽 식물 종에는 해충데 독이되는 단백질을 인코드는 유전자를 가지고 있어, 해충에 저항성이 있는 곡식 식물을 생산하는데 유용하다.

살충 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질을 인코드하는 유전자를 외래도입유전자로 이용할 수 있다. 이와 같은 유전자에는 뿌리해충 억제물질로 이용될 수 있는 동부 트립신 저해물질(CpTⅠ; Hilder et al., 1987); 곡식 뿌리해충 억제물질로 특히 유용한 것으로 증명된 아베르멕틴을 인코드하는 유전자(Avermectin and Abamectin., Campbell, W.C., Ed., 1989; Ikeda et al., 1987); 리보좀 비활성화 단백질 유전자; 식물 구조를 조절하는 유전자등이 포함된다. 항-곤충 항체 유전자 및 식물의 외부에 비-독성 살충제(사전-살충제)적용시켜, 식물의 내부에서 독성이 있는 살충제로 전환시킬 수 있는 효소를 인코드하는 유전자등을 포함하는 형질변환된 옥수수도 고려할 수 있다.

3. 환경 또는 스트레스 저항성

신규한 유전자의 발현을 통하여, 가뭄, 과도한 수분, 동상, 냉동, 고온, 염, 산화 스트레스등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 환경적인 스트레스에 대해 곡식이 내성을 가지도록 개량시키도록 할 수 있다. Winter Flounder(Cutler et al., 1989)에서 설명하는 것과 같은 "항-냉동("antifreeze") 단백질 또는 이로부터 유도된 합성 유전자를 도입함으로써, 어는 온도에 대해 저항성을 증가시키는 장점을 실현시킬 수 있다. 클로로플라스트에 글리세롤-3-인산염 아세틸트란스퍼라제의 발현을 증가시키면, 동상에 대한 내성이 증가된다(Wolter et al., 1992). 산화 스트레스에 대한 저항성(강한 빛을 수반한 고온 조건)은 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 발현으로 제공할 수 있고(Gupta et al., 1993), 글루타티온 환원효소에 의해 개선될 수 있다(Bowler et al., 1992). 이와 같은 전략으로 새로운 출현 상황에 내성을 가질 수 있고, 좀 이른 성숙화 구역에 더 높은 수확율을 가지고독 성술기를 연장시킬 수 있다.

식물의 수분 함량, 전체 잠재 수분, 삼투압, 팽압에 우호적으로 영향을 주는 신규한 유전자를 발현시켜, 식물이 가뭄에 내성을 가지는 능력을 가오하시킬 수 있다. 여기에서 언급한 것과 같이, "가뭄 저항성" 및 "가뭄 내성"은 정상적인 환경과 비교하였을 경우에 물의 이용성이 감소됨으로써 유도되는 스트레스에 저항성 또는 내성을 증가시키고, 식물이 물이 적은 환경에서도 생존하고 기능할 할 수 있는 능력을 가지도록 한다. 본 발명의 한 측면에서, 삼투압에 활성을 가지는 용질 가령 폴리올 화합물을 생합성을 인코드하는 유전자를 발현시키면 가뭄에 대해 보호할 수 있을 것이다. 이 범위내에서, 만니톨-L-포스페이트 디하이드로게나제(Lee and Saier, 1982) 및 트레할로즈-6-포스페이트 합성효소(Kaasen et al., 1992)을 인코드하는 유전자가 있다. 세포에서 고유 포스포타제의 연속적인 작용 또는 특정 포스포타제의 도입 및 공동 발현에 의해 이와 같이 도입된 유전자로 인하여, 만니톨 및 트레할로즈가 각각 축적되어, 이들은 스트레스 영향을 완화시키는 보호 화합물로써 알려져 있다. 형질변환된 담배에 만니톨이 축적을 증명하였고, 이의 주요 결과는 이와 같은 대사물질을 높은 수준으로 발현시키는 식물이 제공되는 삼투 스트레스에 내성이 있다는 것을 알 수 있다(Tarczynski et al., 1992, 1993).

유사하게, 효소의 기능(가령, 알라노핀 또는 프로피온산) 또는 막의 일체성(가령, 알라노핀)을 보호하는데 있어서 다른 대사물질의 효과에 대한 기록이 있고(Loomis et al., 1989), 따라서, 이와 같은 화합물의 생합성을 인코드하는 유전자의 발현으로 만니톨에 상보적으로 또는 유사한 방식으로 가뭄에 대해 저항성을 부여할 수 있다. 삼투압적으로 활성이 있는 또는 가뭄 또는 건조동안에 일부 직접적인 보호 효과를 제공하는 자연 발생 대사물질의 다른 예로는 푸락토즈, 에리트리톨(Coxson et al., 1992), 솔비톨, 둘시톨(Karsten et al., 1992), 글루코실글리세롤(Reed et al., 1984; ErdMann et al., 1992), 슈크로즈, 스타키오즈(Koster and Leopold, 1988; Blackman et al., 1992), 라피노즈(Bernal-Lugo and Leopold, 1992), 프롤린(Rensburg et al., 1993), 글리신 베타인, 온니톨 및 피니톨(Vernon and Bohnert, 1992)등이 포함한다. 스트레스를 받는 동안에 상기에서 언급한 삼투적으로 활성이 있는 화합물 및 이와 같은 화합물을 조절하는 것과 같은 유전자를 도입시켜 발현시킴으로써, 지속적으로 수관의 생장 및 재생성을 증가시킬 수 있다. 삼투적으로 활성이 있는 폴리올 화합물의 합성을 촉진시키는 것으로 현재 적절한 유전자는 만니톨-1-인산염 디하이드로게나제, 트레할로즈-6-인산염 합성효소, 미노이노시톨 O-메틸트란스페라제와 같은 효소를 인코드하는 것이다.

특정 단백질의 발현으로 가뭄에 대한 내성이 증가될 수 있다. 배발생후기 단백질의 세 종류는 이들의 구조적인 유사성으로 분류되었다(Dure et al., 1989). 세 가지 종류의 LEAs가 씨를 성숙시키는 것으로 설명된 바 있다. 이와 같은 3가지 종류의 LEA 단백질에서 Type-Ⅱ(dehydrin-type)는 식물성 식물 부분에서 일반적으로 가뭄 또는 건조에 대한 내성과 관련이 있다(i.e. Mundy and Chua, 1988; Piatkowski et al., 1990; Yamaguchi-Shinozaki et al., 1992). 최근에, 담배에서 Type-Ⅲ LEA(HVA-1)의 발현이 식물의 키, 성숙도, 가뭄에 대한 내성에 영향을 준다는 것을 알았다(Fitzpatrick, 1993). 쌀에서, HVA-1 유전자가 발현되면, 물이 부족하거나 염분에 대한 내성에 영향을 주었다(Xu et al., 1996). 세가지 LEA에서 얻은 구조 유전자의 발현은 가뭄에 대해 내성을 준다. 물에 대한 스트레스를 받는 동안에 유도되는 다른 타입의 단백질에는 티올 프로테아제, 알도라제 및 막통과 트렌스포터등이 포함되는데(Guerrero et al., 1990), 이들은 가뭄 스트레스동안에 다양한 보호성 및 복구성 기능을 부여한다. 지질 생합성 및 막 조성물에 영향을 주는 유전자는 식물에서 가뭄 저항성을 부여하는데 유용하다.

가뭄 저항성을 개선시키는 이들 유전자의 대부분이 상보적인 작용 방식을 가진다. 따라서, 이와 같은 유전자를 복합하면, 옥수수에서 가뭄 저항성을 개선시키는데 있어서 추가 또는 시너지 효과를 가질 수 있다. 이들 유전자의 대부분이 어는 것에 대한 내성(또는 저항성)을 개선시키고, 냉동 및 가뭄동안에 발생되는 물리적인 스트레스는 원래 유사한 것으로, 유사한 방식으로 완화될 수 있다. 이와 같은 유전자의 구조적인 발현을 통하여 유익한 점을 제공할 수 있는데, 이와 같은 신규한 유전자를 발현시키는 적절한 수단이 팽압에 의해 유도되는 프로모터(가령, Guerrero et al., 1990 and Shagan et al., 1993에서 설명하는 팽압에 의해 유도되는 유전자에 대한 프로모터)를 이용하는 것이다. 이와 같은 유전자의 공간적 그리고 시간적으로 발현하는 패턴에 의해 곡식이 스트레스에 대해 더 잘 견딜 수 있도록 한다.

토양을 건조시킴으로써 물 추출물을 증가시키게 하는 특정 형태학적인 형질과 관련된 유전자를 발현시키도 유익하다. 예를 들면 뿌리 특징을 변형시키는 유전자의 도입 및 발현으로 물의 섭취를 강화시킬 수 있다. 또한, 스트레스를 받는 동안데 재생성을 강화시키는 유전자를 발현시키는 것도 가치있다. 예를 들면, 꽃가루 흐름의 동시성 및 암컷 꽃 부분의 수용성 예를 들면 수염을 개선시키는 유전자를 발현시키는 것도 유익하다. 또한, 스트레스 동안에 낟알 발육정지를 최소화시키는 유전자를 발현시키면, 수확할 낟알이 증가되어 가치가 있다.

생산량을 결정하는데 있어서 물의 전반적인 역할을 고려하면, 옥수수에 신규한 유전자를 도입 발현시킴으로써 물의 이용성을 효과적으로 하여, 토양의 물 이용성이 제한되지 않는 경우에도 전반적으로 기능을 개선시킬 수 있다. 옥수수가 물 이용성, 생산 안정성 또는 생산의 지속성과 관련하여 전범위의 스트레스에 대해 물의 이용을 최대로 할 수 있는 유전자를 도입하는 것이 가능하다.

4. 질병 저항성

옥수수와 같은 단자엽 식물에 유전자를 도입시켜 질병에 대해 저항성을 증가시킬 수 있다는 제의가 있다. 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 선충류에 의한 질병에 자항성을 만들 수 있다. 이는 도입된 유전자의 발현을 통하여 진균독을 생산하는 유기체를 조절하는 것이 가능하다는 것이다.

신규한 유전자의 발현을 통하여 바이러스에 저항성을 만들 수 있다. 예를 들면, 형질변환된 식물에서 바이러스성 피복 단백질을 발현시켜 바이러스 및 다른 관련된 바이러스에 의해 식물의 감염에 저항성을 부여한다(Cuozzo et al., 1988, Hemenway et al., 1988, Abel et al., 1986). 필수적인 바이러스성 기능에서 표적이 되는 안티센스 유전자가 발현되어 바이러스에 저항성을 부여하는 것으로 보인다. 예를 들면, 바이러스성 핵산의 복제를 담당하는 유전자에서 표적이 되는 안티센스 유전자는 복제를 저해하여 바이러스에 대한 저항성을 유도한다. 안티센스 유전자를 이용하여 다른 바이러스성 기능과의 간섭이 증가되어 바이러스에 대한 저항성이 증가된다. 또한, 다른 방법 가령, 위성 바이러스를 이용하나 이에 국한되지 않는 방법을 통하여 바이러스에 저항성을 가지는 것도 가능하다. 본 발명에 따르면 형질변환된 식물에서 저항성을 가질 수 있는 바이러스 및 바이러스와 유사한 질병을 표 4에 예시하였다.

표 4a

표 4b

신규한 유전자 도입을 통하여, 박테리아 및 곰팡이에 의한 질병에 저항성을 증가시킬 수 있다. 형태학적 특징으로써, "펩티드 항생제", 병인 관련(PR) 단백질, 독소 저항성, 숙주 병원체 상호작용에 영향을 주는 단백질을 인코드하는 유전자가 유용한 것으로 보인다. 펩티드 항생제는 박테리아 및 다른 미생울의 생장을 저해하는 폴리펩티드 서열이다. 예를 들면, 체크로핀(ceropins) 및 마가이닌(mahainins)과 같은 펩티드 종류는 많은 종류의 박테리아 및 곰팡이의 생장을 저해한다. 옥수수와 같은 단자엽 식물에서 PR 단백질이 발현되면, 박테리아성 질환에 저항성을 부여할 수 있을 것으로 보인다. 이와 같은 유전자는 숙주 식물에 병인체 공격후에 도입할 수 있는데, 이들은 적어도 5가지 종류의 단백질로 분류할 수 있다(Bol, Linthorst, and Cornelissen, 1990). PR 단백질에는 β-1,3-글루카네이즈, 치티나제, 오스모틴 및 질병 유기체에 대해 식물에서 저항성 기능을 할 수 있는 것으로 보이는 다른 단백질등이 포함된다. 항곰팡이 성질을 가지는 다른 유전자도 확인되었는데, 예를 들면, UDA(stinging nettle lectin) 및 헤베인(hevein)(Broakaert et al., 1989; Barkai-Golan et al., 1978)등이 있다. 특정 식물 질환은 식물독소를 생산하는 원인이 된다. 식물독소를 분해할 수 있거나 비활성화시킬 수 있는 효소를 인코드하는 신규한 유전자를 발현시켜, 이와 같은 질병에 대한 저항성을 얻을 수 있다. 숙주 식물 및 병인체간에 상호작용을 변경시키는 신규한 유전자의 발현으로 숙주 식물의 조직으로 질병 유기체가 침투하는 능력을 감소시키는데, 예를 들면, 잎 표피의 옥스성을 증가시키거나 다른 형태학적인 특징을 증가시킨다. 본 발명에 따라 형질변환된 식물에 저항성을 유도시킬 수 있는 노균병을 포함하여 박테리아성 진균성 질병의 예를 다음의 표 5, 6, 7에 나타내었다.

표 5

표 6

표 7a

표 7b

표 7c

표 7d

옥수수를 포함하는 많은 식물에서 식물에 기생하는 선충류가 질병의 원인이 된다. 신규한 유전자의 발현을 통하여 이들 유기체에 대해 곡류 식물이 저항성을 가질 수 있도록 할 수 있다. 선충류가 숙주 식물을 인지하거나 숙주 식물에 부착하는 능력을 변화시키거나 식물이 단백질과 같은 선충류를 죽일 수 있는 화합물을 생산할 수 있도록 하여, 선충류의 질병이 만연하는 것을 조절할 수 있을 것으로 보인다. 본 발명에 따라 형질변환된 식물에서 저항성을 도입시킬 수 있는 선충류와 관련된 질병은 다음의 표 8에 나타내었다.

표 8

5. 진균독 감소/제거

옥수수와 같은 단자엽 식물에 관련된 곰팡이로 인하여 아플라톡신 및 휴모니신을 포함하는 진균독이 생산된다는 것은 곡식을 무용지물로 하는 주요 인자가 된다. 이와 같은 곰팡이 유기체는 식물의 생장을 간섭하거나 생장을 간섭하는 질병의 원인이 되는 것은 아니지만, 이들은 동물에 독이 되는 화학물질(진균독)을 생산한다. 이와 같은 곰팡이의 생장을 저해하면, 이와 같은 독소 물질의 합성이 감소되고 따라서, 진균독 오염으로 인한 곡식의 손실을 줄일 수 있다. 또한, 곰팡이의 생장을 간섭하지 않고, 진균독의 합성을 저해할 수 있도록 옥수수와 같은 단자엽 식물로 신규한 유전자를 도입시킬 수도 있다. 또한, 진균독이 독성을 나타내지 못하도록 할 수 있는 효소를 인코드하는 신규한 유전자를 발현시키면, 곡식의 진균독 오염을 감소시킬 수 있을 것이다. 상기 기작중 임의의 것으로 곡식에서 진균독을 감소시킬 수 있다.

6. 곡식 조성물 및 품질

유전자를 단자엽 식물 특히 옥수수와 같은 상업적으로 중요한 곡식으로 도입시켜, 곡식을 생장시킴으로써 곡식을 개량할 수 있다. 이와 같은 방법으로 생산되는 신규한 형질변환된 식물의 범위는 곡식의 특정 사용 목적에 따라 달라진다.

옥수수의 최대 용도는 사료 및 음식이다. 곡식의 조성물을 변형시키는 유전자를 도입시키면 곡식 또는 사료의 가치를 상당히 개선시킬 수 있다. 옥수수 곡식의 주요 성분은 전분, 단백질, 오일이다. 옥수수의 이들 주요 성분 각각을 수준 및 조성물 변화시켜 개량시킬 수 있다. 몇 가지 예를 들어 설명하지만, 가능한 방대한 목록을 제공하지는 않는다.

옥수수를 포함하는 곡식 낟알의 단백질은 돼지, 가금류, 사람에게 공급하였을 경우에 사료 및 음식으로 부적합하다. 이들 종의 음식물에 필수적인 몇 가지 아미노산이 결손되어, 곡식에 보충물을 추가로 공급해야한다. 제한된 아미노산에는 리신, 메티오닌, 트립토판, 트레오닌, 발린, 아르기닌, 히스티딘등이 포함된다. 일부 아미노산은 음식 조물성물에 다른 것을 투입한 후에도 제한될 수 있다. 예를 들면, 곡식에 리신 요구를 맞추기 위해 콩을 보충하였을 경우에, 메티오닌이 제한된다. 씨 및 곡식에서 이와 같은 필수 아미노산의 수준은 아미노산의 생합성을 증가시키고, 아미노산의 분해를 감소시키고, 단백질에서 아미노산 저장을 증가시키고 또는 씨 또는 곡식에 아미노산의 운반을 증가시키는 유전자를 도입시키는 기작에 의해 상승될 수 있으나, 이와 같은 기작에 한정시키지는 않는다.

아미노산의 생합성을 증가시키는 한 가지 기작은 아미노산의 생합성 결로를 하향조절하는 유전자를 도입하여, 식물이 생산될 수준을 절절하게 더 이상 조절할 필요가 없데 된다. 이는 경로의 아미노산 생성물의 수준에 의해 정상적으로 조절되는 아미노산 생합성 경로에서 규체를 하지 않거나 회피함으로써 이루어진다. 예를 들면, 리신 및 트레오닌 생산을 증가시키기 위한 아스파라토카이나제 또는 디하이드로디피콜린산(DHDP)-합성효소 및 트립토판 생산을 증가시키기 위한 안트라아닐레이트 합성효소의 통제되지 않는 상태를 인코드하는 유전자 도입이 그 예가 된다. 아미노산 이화작용을 감소시키기 위해서는 효소 리신-케토글루타레이트 환원효소와 같은 이와 경로에서 단계를 촉매하는 효소를 인코드하는 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 DNA 서열을 도입시키는 것이다. 씨의 배 또는 싹에 아미노산 생합성에 관련된 유전자 발현을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 색소체 운반 펩티드 서열을 이용하여 색소체에 단백질을 표적으로하는 아미노산 생합성에 관련된 단백질을 인코드하는 유전자가 바람직할 것이다.

곡식의 단백질 조성물을 변경시켜, 고유 단백질의 발현을 상승시키고, 빈약한 조성물을 가지는 단백질의 발현을 감소시키고, 고유 단백질의 조성물을 변화시키고 또는 우수한 조성물을 가지는 완전히 새로운 단백질을 인코드하는 유전자를 도입시키는 것을 포함하는 다양한 방식에서 아미노산의 균형을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 제인 족의 여러 저장 단백질의 발현을 감소시키는 DNA를 도입시키는 것도 포함된다. 이와 같은 DNA는 제인 단백질의 발현에 손상을 주는 또는 opaque-2 유전자 생성물과 같은 제인 발현 조절물질의 발현에 손상을 주는 리보자임 또는 안티센스 서열을 인코드할 수 있다. 또한 곡식의 단백질 조성물을 공동-억제 현상을 통하여 변형시킬 수도 있는데, 예를 들면, 형질변환을 통하여 도입된 동일한 구조 유전자 또는 유전자 단편의 발현을 통하여 내생 유전자의 발현을 저해시키는 것이다(Goring et al., 1991). 또한, 도입된 DNA는 제인을 분해하는 효소를 인코드할 수 있다. 좀더 바람직한 아미노산 조성물을 가지는 단백질을 증가시키거나 전분과 같은 다른 주요 씨 구성성분을 증가시키면, 제인 발현을 감소시킬 수 있다. 또는, 글로블린 단백질중에 하나 또는 옥수수의 10kD 델타 제인, 20kD 델타 제인 또는 27kD 감마 제인과 같은 적절한 아미노산 조성물 가지는 고유 단백질의 코딩 서열 및 및 단백질의 발현을 상승시키도록 고안된 프로모터 또는 다른 조절 서열로 구성된 키메라 유전자를 도입시킬 수 있다. 이와 같은 유전자의 코딩 서열에는 필수 아미노산에 대한 추가 또는 치환 코돈을 포함할 수 있다. 다른 종에서 얻은 코딩 서열 또는 씨의 아미노산 조성물을 강화시키도록 고안된 완전한 특이적인 펩티드 서열을 인코드하는 부분적으로 또는 전적으로 합성된 서열을 이용할 수 있다. 씨의 배젖에 우수한 조성물을 가지는 단백질을 인코드하는 이와 같은 외래도입유전자를 발현시키는 것을 표적으로 하는 것이 바람직하다.

옥수수의 오일 함량을 변화시키는 유전자를 도입시키는 것도 가치가 dLT다. 오일 함량을 증가시키면 식품 및 사료에 이용할 수 있는 씨의 밀도 및 대사가능한-에너지 함량을 증가시키게 된다. 도입된 유전자는 지방산 또는 지질 생합성에서 속도-제힌 또는 조절된 단계를 제거하거나 감소시키는 효소를 인코드할 수 있다. 이와 같은 유전자에는 아세틸-CoA 카르복실라제, ACP-아세틸트란스퍼라제, β-케토아실-ACP 합성효소 및 다른 공지의 지방산 생합성 활성을 인코드하는 것이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 다른 가능성은 아실 운반 단백질과 같은 효소 활성을 보유하지 않는 단백질을 인코드하는 유전자이다. 오일에 있는 지방산의 균형을 변화시키는 유전자를 도입시켜 좀더 건강하거나 또는 영양이 있는 사료를 제공할 수 있다. 도입된 DNA에는 지방산 생합성에 관련된 효소의 발현을 차단하는 서열을 인코드하여 하기에서 설명하는 곡식에 있는 지방산 비율을 변경시킬 수 있다. 발명자가 생각하는 오일 조성물 형질이 변경된 형질변환된 식물을 만드는데 이용할 수 있는 특정한 유전자의 다른 예로는 2-아세틸트란스퍼라제, 올레오신, 피루베이트 디하이드로게나제 복합체, 아세틸 CoA 합성효소, ATP 이스테이드 라이아제, ADP-글루코즈 피로포스포릴라제, 카르니틴-CoA-아세틸-CoA 셔틀 유전자등이 포함된다. 색소체 운반 펩티드 서열을 이용하여, 오일 생합성에 관련된 유전자를 발현시키는 것을 표적으로 하는데, 바람직하게는 씨 싹에서 발현되도록 한다.

분지 정도를 증가시켜, 전분의 대사를 소에서 지연시켜 전분의 이용성을 개선시킴으로써 곡식에 있는 전분 성분의 영양 가치를 강화시키는 유전자를 도입시킬 수 있다. 전분 생합성에 관련된 유전자를 씨의 배젖에서 발현되도록 할 수 있다.

곡식의 주요 구성분에 영향을 주는 것이 외에도, 음식 또는 사료로 이용할 수 있는 곡식의 다른 영양소 또는 다른 품질 측면의 다양성에 영향을 줄 수 있는 유전자를 도입할 수도 있다. 예를 들면, 곡식의 색소를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 일부 동물 사료에서는 노란색 색소를 강화시키거나 안정화시키는 것이 바람직할 수도 있고, 색소 생산의 속도-제한 단계를 제거함으로써 산토필 및 카로텐의 생산을 강화시킬 수 있는 유전자를 도입시키면 된다. 이와 같은 유전자는 피토엔 합성효소, 피토엔 불포화효소, 리코펜 합성효소의 또 다른 형을 인코드할 수도 있다. 또는, 많은 음식물을 생산하는데에는 색소가 없는 흰색 곡식이 바람직하여, 핵소 생산 경로를 차단하는 또는 제거하는 DNA를 토입시키면 된다.

곡식의 대부분의 인산 함량은 피틴산염 형으로, 이는 1개 위장을 가진 동물에서는 대사되지 않는 인산저장형이다. 따라서, 씨 인산염의 이용성을 증가시키기 위해서는 씨에 있는 피틴산염의 양을 줄이고, 자유 인산염의 양을 증가시키는 것이 바람직하다. 또는, 곡식 씨에서 1개 위장을 가진 동물의 위산 시스템에 있는 pH에 의해 활성화시켜, 피틴산염으로부터 인산염을 방출하는 유전자를 발현시킬 수 있다.

주로 옥수수 또는 다른 곡식으로 구성된 음식 또는 사료에는 충분한 양의 비타민이 포함되어 있지 않고, 따라서, 적절한 영양치를 제공하기 위해서는 보충을 해야한다. 씨에서 비타민 A, E, B₁₂, 콜린 비타민의 생합성을 강화시키는 유전자를 도입시키는 것을 계획할 수 있다. 옥수수 곡식에는 적절한 영양치의 미네랄도 충분히 보유하지 못하고 있다. 인산, 황, 칼슘, 망간, 아연, 철을 포함하는 화합물의 축적 또는 이용성에 영향을 주는 유전자가 가치있다. 피틴산 생산을 감소시키는 유전자 또는 피틴산 분해를 강화시키는 효소 피타제를 인코드하는 유전자를 도입시킬 수 있다. 이와 같은 유전자는 음식물에서 이용할 수 있는 인산염의 수준을 증가시키고, 미네랄 인산을 보충해야할 필요를 줄여준다.

식품 또는 사료용으로 옥수수 또는 다른 곡식을 개량하는 여러 가지 다른 예를 설명할 수도 있다. 개선점은 곡식에만 한정된 것이 아니라 목초용 곡식의 유용성도 개선시킬 수 있다. 리기닌 생산을 변형시킬 서열을 포함하여, 소에서 우수한 사료에 관계하는 "갈색 잎맥" 표현형을 나타내는 DNA를 도입시켜 실행할 수 있다.

음식 또는 사료의 가치를 직접적으로 개선하는 것에 추가하여, 곡식의 프로세싱을 개선시키고, 프로세싱으로 인한 생성물의 가치를 개선시키는 유전자를 도입시킬 수 있다. 곡식을 프로세싱하는 주요 방법은 습식제분이다. 담그는 시간을 줄이는 것과 같이 프로세싱의 효과 및 비용을 줄이는 신규한 유전자의 발현을 통하여 옥수수를 개량시킬 수 있다.

습식제분 생성물의 가치를 개량시키는데에는 전분, 오일, 곡식 글루텐 또는 곡식글루텐 사료의 량과 질을 변화시키는 것이 포함된다. 전분 생합성에서 속도 제한 단계를 확인 및 제거하거나 또는 곡식에서 다른 성분의 수준을 감소시킴으로써 전분의 비율을 증가시켜 전분을 상승시킬 수 있다. 전자의 예로는 조절활성이 변형된 ADP-글루코즈 피로포스포릴라제 효소를 인코드하는 유전자 또는 더 높은 수준으로 발현되는 유전자를 도입시키는 것이다. 후자의 예로는 낟알 발생 후기 단계동안에 발현되는 단백질 또는 오일 생합성의 선택적인 저해물질이 포함될 수 있다.

전분의 성질은 아밀로즈에 대한 아밀로펙틴의 비율을 변화시키거나 전분 분자의 크기를 변화시키거나 이들의 분지 패턴을 변화시켜 유익하게 변형시킬 수 있다. 이와 같은 광범위한 성질은 젤라틴화 온도, 젤라틴화에 제공되는 열, 필름 및 반죽의 투명도, 유동성등의 성질등을 포함하나 이에 국한되지 않는 성질을 변형키닐 수 있다. 성질을 변형시키기 위해서는 미립-결합 또는 가용성 전분 합성효소 활성 또는 분지화 효소 활성을 인코드하는 유전자를 단독으로 또는 복합하여 도입시키는 것이다. 안티센스 구조체와 같은 DNA를 이용하여 이들 효소의 내생 활성 수준을 감소시킬 수 있다. 도입된 유전자 또는 구조체는 전분 생합성 및 전분 미립 발생에서 특정 간격으로 발현되는 시간을 조절하는 조절 서열을 보유할 수 있다. 또한, 전분 분자의 포도당 부분의 in vivo 유도 또는 다른 변형을 가져올 유전자를 도입시켜 발현시키는 것도 가치있다. 임의 분자의 공유 부착을 계획할 수 있는데, 전분 과립에서 적절한 기질의 접근성 및 유도성을 촉매하는 효소가 존재할 경우에 한정된다. 중요한 유도의 예로는 이온 전하의 도입을 통하여 전분의 성질에 영향을 주거나 in vitro 유도화 부위를 제공하는 아민, 카르복실 또는 인산염 기와 같은 기능기를 첨가하는 것이 포함된다. 다른 변형으로는 하이드록실 기를 잃어버리는 것과 같은 포도당에 직접적인 변화 또는 알데히드 또는 카르복실기로 산화되는 등의 변화가 포함된다.

오일은 곡식의 습식제분의 또 다른 생성물로써, 이들의 가치는 유전자의 도입 및 발현으로 개량될 수 있다. 습식제분으로 추출되는 오일의 양을 상기에서 설명한 식품 및 사료에서와 같은 방법으로 상승시킬 수 있다. 오일 성질을 변형시키 생산에서 이들의 행동을 개선시키고, 요리 오일, 쇼트닝, 윤활제 또는 다른 오일-유도된 생성물에 이용할 수 있고, 음식과 관련된 분야에 이용할 경우에 이의 건강에 대한 기여도를 개선시킬 수 있다. 추출시에 새로운 지방산을 합성하여 이를 화학 합성의 시발 물질로 작용할 수 있다. 오일에 있는 지방산의 형, 수준 또는 지질의 배열을 변화시키면, 오일 성질을 변화시킬 수 있다. 또한, 신규한 지방산을 합성을 촉매할 수 있는 효소를 인코드하는 유전자를 첨가하거나 이를 가지는 지질을 첨가하거나 또는 전구물질의 수준을 가능한한 줄이면서 고유 지방산의 수준을 증가시키면 된다. 또는, 지방산 생합성 단계를 지연시키거나 차단하는 서열을 도입시키면 전구물질 지방산 중간생성물이 증가된다. 첨가될 유전자에는 탈포화효소, 에폭시다제, 하이드라타제, 디하이드라타제 및 지방산 중간생성물과 관련된 반응을 촉매하는 다른 효소등이 포함된다. 차단될 촉대 단계로는 스테라으산에서 올레인산으로의 탈포화 및 올레인산에서 리놀레인산으로의 불포화로 스테아르 및 올레인산의 축적을 증가시키는 것이 대표적이다. 또 다른 예로는 연장 단계를 차단하여 C₈내지 C₁₂포화된 지방산을 축적시키는 것이다.

신규한 곡류 식물을 얻기 위해 유전자를 도입시키면 다른 주요 곡물 습식제분 생성물, 곡물 글루텐 가루 및 곡물 글루텐 사료를 개선시킬 수 있다. 대표적인 가능성에는 음식 및 사료의 가치를 개선시키기 위해 상기에서 설명하는 것이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.

또한, 기존의 곡식에서 전혀 생산되지 않는 또는 동일한 수준에서 생산되지 않는 유용한 생물학적 화합물의 생산 또는 제조에 이용한 곡식 식물을 고려할 수 있다. 이와 같은 화합물을 생산하는 신규한 곡식은 곡식 형질변환 방법을 이용하여 유전자를 도입시키고, 발현시키면 가능하다. 가능한 배열에는 단백질, 핵산, 1차 및 중간 대사물질, 탄수화물 고분자와 같은 임의 유기체에서 현재 생산하는 임의 생물학적 화합물이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 식물에 의해 화합물을 생산하고, 수확 또는 프로세싱시에 추출하여, 제약, 향료, 산업상효소와 같은 임의 현재 인지하고 있는 유용한 목적에 이용할 수 있다.

형질변환된 식물에서 도입된 유전자에 의해 인코드할 수 있는 곡식의 성질 또는 형질의 범위는 γ-제인 합성을 강화시키는 유전자를 도입시켜, 건조 제분에 의해 처리하였을 때, 수출용 또는 더 큰 입자 크기를 위해 분해 감응성이 적은 곡식, 과피의 두께를 증가시키는 유전자를 통하여, 튀는 성질 및 팽창 용적이 개선된 팝콘, 색소 생산 경로 및 알코올 음요의 질을 향상시키는 것에 관련된 효소의 발현을 효과적으로 차단하는 유전자를 도입하여 식용으로 이용하기 위한 흰색 낟알을 가지는 곡식, 사탕 옥수수에 슈렁켄 1 유전자(슈크로즈 합성효소를 인코드) 또는 슈렁켄 2 유전자(ADPG 피로포스포릴라제를 인코드)와 같은 향에 영향을 주는 유전자를 도입한 사탕 옥수수등이 포함된다.

7. 식물의 농경 특징

곡물을 생장할 때를 결정하는 인자중 두 개는 생장 계절동안에 평균 하루의 온도 및 서리가 내릴 때 까지의 시간이 된다. 곡물이 생장가능한 지역내에서, 성숙하여 수확할 수 있는 최대 시간상에는 다양한 제한효소가 있다. 최대 생산을 할 수 있는데 필요한 시간안에 성숙할 수 있는 능력 및 수확가능한 수분 함량을 가지도록 건조되는 능력등에 의해, 특정 지역에서 생장하게 되는 곡식을 선별한다. 따라서, 다른 생장 위치에서 성숙도를 다양하게 가지는 곡식을 개발하였다. 수확을 할 수 있을 정도로 건조될 필요와는 별도로, 수확후에 추가 건조에 요구되는 필요한 에너지의 양을 최소로하기 위해 들에서 최대로 건조시키는 것이 바람직하다. 낟알이 더 적절하게 건조될수록, 생장 및 낟알을 채우는데 이용되는 시간이 더 많다. 성숙 및 건조에 영향을 주는 유전자를 확인하여, 형질변환 기술을 이용하여 곡식주에 도입시켜, 여러 다른 생장 위치 또는 동일한 생장 위치를 가지나 수확시에 수분의 비율에 대해 수확율이 개선될 수 있도록 적응시킨 새로운 곡식 변이체를 만들 수 있다. 식물 발생 조절에 관련된 유전자 예를 들면, 곡식에서 확인된 리굴루레리스 및 거친 잎집 유전자와 같은 유전자를 발현시키는 것이 유익하다.

입성 및 다른 식물 생장 특징이 개선시키는 유전자를 단자엽식물에 도입시키는 것을 생각해볼 수 있다. 더 강한 줄기, 개선된 뿌리 시스템 또는 이삭이 떨어지는 것을 예방하거나 감소시킬 수 있는 신규한 유전자를 발현시키면 농부에게는 상당히 가치있는 것이 된다. 광의 분포 및 차단을 증가시킴으로써 전체 광동화 이용성을 증가시키는 유전자를 도입시켜 발현시키는 것이 유익하다. 또한, 광합성의 효율을 증가시키는 유전자 및 잎 수관의 효율을 증가시키는 유전자를 발현시키면 낟알의 생산성이 증가될 수 있을 것이다. 곡식에서 피토크롬 유전자 발현이 유익할 수 있다. 이와 같은 유전자가 발현되면, 정단 우성을 감소시키고, 식물에 반-왜소증을 부여하고, 그늘 내성을 증가시킬 수 있다(U.S. Patent No. 5,268,526). 이와 같은 방법은 들에서 식물 집단을 증가시켜줄 수 있다.

계절 말에 식물성 노화기를 지연시키면, 낟알로 동화되는 흐름을 증가시켜 수확율을 증가시킨다. "녹색 유지"와 관련된 또는 노화를 지연시키는 임의 유전자를 곡식내에서 과다 발현시키는 것이 유익하다. 예를 들면, 노랗게 되지 않는 돌연변이가 Festuca pratensis(Davies et al., 1990)에서 확인되었다. 이와 같은 유전자 및 다른 유전자를 발현시켜, 클로로필의 조기 분해를 방지하여, 수관기능을 유지시킬 수 있다.

8. 영양물 이용

이용가능한 영양소로 이용하는 능력은 옥수수와 같은 단자엽 식물의 생장에서 제한 인자가 된다. 신규한 유전자를 도입시킴으로써, 영양소 섭취의 변형, 극단의 pH 내성, 식물을 통하여 유통, 저장소 및 대사 활성의 이용성을 변화시키는 것이 가능하다. 이와 같은 변화로 인하여 옥수수와 같은 식물이 좀더 효율적으로 이용가능한 영영소를 이용할 수 있다. 예를 들면, 식물에 현재 정상적으로 존재하고, 영양소를 이용하는 것과 관계하는 효소의 활성을 증가시키면 영양소 이용성이 증가될 것이다. 또한 곡식 식물에 의한 질소 이용성을 증가시키는 것이 바람직하다. 옥수수에서 글루타메이트 디하이드로게나제의 발현, 가령 대장균(E. coli)의 gdhA 유전자는 유기 화합물에서 질소 고정을 증가시켜준다. 또한, 곡식에서 gdhA의 유전자발현으로 과량의 암모니아가 글루타메이트에 결합하여, 암모니아의 독을 제거함으로써 살충제 글루포시네이트에 대한 저항성을 강화시킨다. 좀더 복합한 분자 예를 들면 거대분자로부터 영향 가치가 있는 성분을 방출시키는 효소와 같은 기존에는 접근하지 못한 영양소를 이용가능하도록 만드는 신규한 유전자를 발현시키는 것을 고려할 수 있다.

9. 수컷 불임성

하이브리드 씨을 생산하는데 있어서, 수컷의 불임성이 유용하다. 신규한 유전자를 발현시킴으로써 수컷 불임성을 만들 수 있다는 것이다. 예를 들면, 수컷의 개화 및 배우체의 발생을 간섭하는 단백질을 인코드하는 유전자를 발현시켜, 수컷에 불임성을 줄 수 있다는 것을 확인한 바 있다. 형질변환된 담배 및 평지씨의 꽃밥에서 발현하는 키메라 리보뉴클레아제 유전자를 이용하여 수컷의 불임성을 유도하였다(Mariani et al., 1990).

세포질의 수컷 불임성을 제공하는 여러 가지 돌연변이가 옥수수에서 개발되었다. T-세포질로 불리는 한 가지 돌연변이는 남쪽 곡식 잎 마름병에 감응성과 관련된다. TURF-13(Levings, 1990)로 저정한 DNA 서열이 T-세포질과 관련이 있는 것으로 확인된 바 있다. 형질변환을 통하여 TURF-13를 도입함으로써 질병 감응성으로부터 수컷 불임성을 분리시키는 것이 가능하다는 것이다. 육종 및 낟알 생산을 위해 수컷의 번식력을 복원시킬 필요가 있을 때에는 수컷의 번식력을 복원시키는 유전자를 도입시키면 된다.

10. 네가티브 선택가능한 표식

선별가능한 형질을 인코드하는 유전자를 도입시켜 원하지 않은 연결된 유전자를 제거할 수 있다. 두 개 이상의 유전자를 공동 형질변환에 의해 도입시켰을 때, 유전자는 숙주의 염색체에 함께 연결되어 있을 것이다. 식물에서 곤충에 저항성을 부여하는 Bt 유전자를 인코드하는 유전자를 선택성 표식으로 유용하여, 식물에서 살충제 Liberty^??에 대해 저항성을 부여하는 bar 유전자와 함께 식물로 도입시킬 수 있다. 살충제 Liberty^??에 저항성을 가지는 곤충 저항성 식물을 만드는 것은 바람직하지 못하다. 전체 식물 부분에서 bar 유전자의 발현을 원하지 않는 조직에서 발현되는 안티센스 bar 유전자를 도입시킬 수 있다. bar 유전자가 발현되어 선택성 표식으로 이용될 수 있지만, 전체 식물에 살충제 저항성을 부여하는데에는 이용할 수 없다. bar 안티센스 유전자ms 네가티브 선택성 표식이다.

유전자 표적화를 통하여 발생된 훌륭한 상동성 재조합의 형질변환체 집단을 스크리닝하는데 네가티브 선별이 필요할 수도 있다. 예를 들면, 상동성 재조합은 세포에서 기존에 발현되는 유전자의 비활성화를 통하여 확인할 수 있다. 네오마이신 포스포트란스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ)에 대한 안티센스 유전자는 담배(Nicotiana tabacum) 및 Arabidopsis thaliana(Xiang. and Guerra, 1993)에서 네가티브 선택성 표식으로 조사된 바 있다. 예를 들면, 센스 및 안티센스 NPT Ⅱ 유전자를 형질변환에 의해 식물로 도입시키고, 생성된 식물은 항생제 카나마이신에 감응성이 된다. 숙주 세포 염색체로 안티센스 NPT Ⅱ 유전자 부위에서 결합되어, 안티센스 유전자를 비활성화시킨 도입된 유전자는 식물이 카나마이신 및 다른 아미노글리코시드 항생제에 저항성을 가지도록 한다. 따라서, 드문 부위-특이적인 재조합을 항생제 저항성에 대해 스크리닝하여 확인할 수 있다. 유사하게, 비활성화되었을 경우에 화합물에 대해 저항성을 부여하는, 식물에 고유한 또는 형질변환에 의해 도입된 임의 유전자를 네가티브 선별성 표식으로 이용할 수 있다.

다른 방식에서도 네가티브 선별성 표식이 이용될 수 있다. 한 가지 응용 부분은 형질변환된 주를 작제하는데, 이때 연결안된 부위로 전치를 위해 선택할 수 있다. 태그 과정에서, 동일한 염색체상에 유전적으로 연결된 부위로 이동가능한 요소를 이동시키는 것은 흔한 일이다. 연결안된 위치로 전치가 일어난 희귀한 식물을 회수하기 위한 선택성 표식으로 이용할 수 있다. 예를 들면, 이 목적에는 표소 시토신 디아미네이즈를 이용할 수 있다(Stouggard, 1993). 이와 같은 효소 존재하에서, 화합물 5-플로오르시토신은 5-플로오로우라실로 변환되고, 이는 식물 및 동물 세포에 독성이 있다. 전치가능한 요소가 효소 시토신 디아미네이즈에 대한 유전자에 연결된 경우에, 생성된 식물이 5-플로오르시토신에 저항성이 되는 전치 과정을 선별함으로써 연결안된 부위로의 전치에 대해 선별할 수 있다. 부계 식물 및 연결된 부위에 전치를 가지는 시물은 5-플로오르시토신에 여전히 감응성이다. 5-플로오르시토신에 대한 저항성은 전치가능한 요소 및 시토신 디아미네이즈 유전자의 유전적인 분리를 통하여 시토신 디아미네이즈 유전자를 상실하였기 때문이다. 식물에 특정 화합물에 대해 감응성을 부여하는 단백질을 인코드하는 다른 유전자도 유용하다. 예를 들면, Agrobacterium tumefaciens의 T-DNA 유전자 2는 α나프텔렌 아세트아미드(NAM)가 α-나프탈렌 아세트산(NAA)으로 변환되는 것을 촉매하는 단백질을 인코드하여, 식물에서가 고농도의 NAM에 감응성을 가질 수 있도록 한다(Depicker et al., 1988).

트랜스포존 태그 주를 작제하는데 네가티브 선택성 표식이 유용하다. 예를 들면, Ac, Master Mu, En/Spn과 같은 자생 전치가능한 요소에 네가티브 선택가능한 표식을 함으로써, 자생 요소가 게놈에 안정적으로 통합안된 형질변환체를 선택할 수 있다. 예를 들면 자생 요소의 일시적인 발현이 Ds와 같은 결손 전치성 요소의 전치를 in trans 활성화시키는 것은 바람직하나, 자생 요소의 안정적인 결합은 바람직하지 않다는 것이다. 결손 요소를 안정화시키는데에는 즉, 전치를 방지하기 위해서는 자생 요소가 존재하는 것은 바람직하지 못하다. 그러나, 식물에서 자생 전치가능한 요소의 안정적인 통합이 바람직한 경우에, 네가티브 선택성 표식이 존재함으로써 육종 과정동안에 자생 요소를 제거하는 것이 가능할 수 있다.

(vi) 비-단백질-발현 서열

1. RNA-발현

식물의 표현형에는 영향을 주는 기능을 하는 RNA 전사체를 발현시키나 단백질로 해독시키지 않는 목적으로 곡식 및 다른 단자엽으로 DNA를 도입시킬 수 있다. 두가지 예로는 리보자임 활성을 가지는 안티센스 RNA 및 RNA이다. 이들은 고유 및 도입된 식물 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 기능을 할 수 있다.

전사되었을 때, 표적이 되는 메신져 RNA의 전부 또는 일부에 상보적인 안티센스 RNA를 생산하는 유전자를 작제하거나 분리할 수 있다. 안티센스 RNA는 메신져 RNA의 폴리펩티드 생성물의 생산을 줄인다. 폴리펩티드 생성물은 식물 게놈에 의해 인코드되는 임의 단백질이 될 수 있다. 전술한 유전자를 안티센스 유전자라고 한다. 안티센스 유전자는 형질변환방법에 의해 식물로 도입될 수 있어, 관심이 되는 선택된 단백질의 발현을 감소시키는 신규한 형질변환된 식물을 만들 수 있다. 예를 들면, 단백질은 식물에서 반응을 촉매시키는 효소가 될 수 있다. 효소 활성을 감소시키면, 식물에서 효소적으로 합성되는 화합물 가령, 지방산, 아미노산, 탄수화뭏, 핵산등을 포함하는 반응 생성물을 줄이거나 제거할 수 있다. 또는, 단백질은 제인과 같은 저장 단백질 또는 구조 단백질이 될 수 있는데, 이들의 발현이 감소됨으로써 씨에 아미노산 조성물 또는 식물의 형태학적인 변화를 유도할 수 있다. 상기 언급한 것은 실시예를 통하여 가능하나 이것이 전체 범위의 응용 부분을 나타내는 것은 아니다.

전사되었을 때 RNA 효소, 리보자임을 생산하여, 엔도리보뉴클레아제로 작용하여 선택된 서열을 가지는 RNA 분자의 절단을 촉매하는 유전자를 작제하거나 분리시킬 수 있다. 선택된 메신져 RNA를 절단함으로써 이들에 의해 인코드된 폴리펩티드 생성물의 생산을 줄일 수 있다. 이와 같은 유전자를 이용하여 이를 보유하는 신규한 형질변환된 식물을 준비할 수 있다. 형질변환된 식물에는 안티센스 RNAs에 의해 영향을 받는 상기 언급한 폴리펩티드를 포함하나 이에 국한되지 않는 폴리펩티드 수준이 감소되어있다.

유전자를 도입시켜, 공동-억제 기작에 의해 고유 유전자 생성물의 발현 수준이 감소된 신규한 형질변환된 식물을 만들 수 있다. 담배, 토마토, 페튜니아(Goring et al., 1991; Smith et al., 1990; Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990)에서 고유 유전자의 센스 전사체의 발현으로 안티센스 유전자에서 볼 수 있었던 것과 같은 유사한 방식으로 고유 유전자의 발현을 줄이거나 제거할 수 있다. 도입된 유전자는 표적이 되는 고유 단백질의 전부 또는 일부분을 인코드하나 고유 단백질의 수준을 감소시키기 위해 해독이 요구되지는 않는다.

2. 비-RNA-발현

Ds, Ac, Mu와 같은 전치가능한 요소를 포함하는 DNA 요소를 유전자에 삽입하여 돌연변이를 일으킨다. 이와 같은 DNA 요소를 삽입하여, 유전자를 비활성(또는 활성화)시켜, 특정 형질을 "테그"시킨다. 이 경우에, 전치가능한 요소가 태그된 돌연변이의 불안정성의 원인이 되지는 않는데, 그 이유는 이들 요소의 유용성은 게놈으로 이들이 이동하는 능력에 의존하지 않기 때문이다. 일단 원하는 형질이 테그되면, 도입된 DNA 서열을 이용하여, 상응하는 유전자를 클론시키는데, 예를 들면, PCR 유전자 클로닝 기술(Shapiro, 1983; Dellaporta et al., 1988)과 함께 PCR프라이머로 도입된 DNA 서열을 이용한다. 일단 확인되면, 특정 형질의 전체 유전자(조절 및 제어 부분 포함)를 분리하여 클론시키고 조절할 수 있다. 유전자 태그를 목적으로 유기체내로 도입되는 DNA 요소의 이용성은 DNA 서열과는 무관하고, DNA 서열의 임의 생물학적 활성과도 무관한데, 예를 들면 RNA로 전사 또는 단백질로 해독된다. DNA 요소의 순수한 기능은 유전자의 DNA 서열을 파괴시키는 것이다.

신규한 합성 서열을 포함하는 발현안된 DNA 서열을 세포에 도입하여, 이들 세포, 식물 및 씨가 "라벨"되도록 한다. 숙주 유기체에 내생 유전자의 기능을 파괴하는 라벨 DNA 요소가 필수적인 것은 아닌데, 그 이유는 이와 같은 DNA의 순수한 기능은 유전자의 기원을 확인하는 것이기 때문이다. 예를 들면, 식물로 독특한 DNA 서열을 도입하여 이와 같은 DNA 요소가 라벨된 소스의 것에서 나온 것으로 모든 세포, 식물 및 이들 세포의 후손을 확인할 수 있다. 라벨 DNA를 포함하면 라벨안된 생시겟포질로부터 유도된 생식세포질로부터 라벨을 소유하는 생식세포질를 구별할 수 있다.

도입될 수 있는 또 다른 가능한 요소는 매트릭스 부착 부분 요소(MAR)인데 예를 들면 닭 라이소자임 A 요소(Stief, 1989)로 이는 원하는 발현가능한 유전자주변에 위치하여 유전자의 전반적인 발현에 영향을 주고, 식물 게놈으로 결합시켜 위치 의존성 효과를 줄일 수 있다(Stief et al., 1989; Phi-Van et al., 1990).

IX. 부위 특이적인 결합 또는 외래도입유전자의 절단

본 발명에서는 본 발명에 의해 준비된 외래도입유전자의 부위 특이적인 결합 또는 절단을 위한 기술을 이용하는 것에 대해 설명한다. 부위 특이적인 결합 또는 절단의 장점은 이를 이용할 경우에 통항의 형질변환 기술과 연관되어, 외래도입유전자는 일반적으로 숙주 게놈에 무작위로 결합되고, 다중 복사체로 결합되는 등의 문제점을 해결할 수 있다. 숙주 세포의 게놈으로 도입된 DNA가 무작위로 삽입되는 경우에, 외부 DNA가 필수 유전자에 삽입되면 죽을 수도 있다. 또한, 주변 게놈 DNA에 의한 "위치 효과"에 의해 외래도입유전자의 발현이 영향을 받을 수 있다. 또한, 여러 복사체 외래도입유전자를 형질변환시키는데 있어서, 유전자 침묵, 재조합 및 예상하지 않은 유전등의 어려움으로 인하여, DNA 서열 한 개 복사체만을 삽입하고자 하는 경우에 삽입된 DNA의 복사체 수를 조절할 필요가 있다.

식물에서 상동성 재조합으로 외래도입유전자의 부위 특이적인 결합 또는 절단할 수 있다(U.S. Patent No. 5,527,695). 두 개 서열이 서로 상호작용하여(재조합) 새로운 재조합 DNA 종을 형성하는 것과 같이 유사한 뉴클레오티드 서열을 가지는 임의 DNA 서열간에 반응이 상동성 재조합이 된다. 상동성 재조합의 빈도는 공유한 뉴클레오티드 DNA 서열의 길이가 증가할수록 증가되고, 원형의 플라스미드 분자보다는 선형화된 플라스미드 분자에서 그 비율이 더 높다. 동일성이 적은 두 개 DNA 서열간에 상동성 재조합이 발생할 수도 있으나, 재조합 빈도는 두 개 서열의 차이가 클수록 감소된다.

숙주 세포의 내생 서열과 상동성을 보유하는 서열에 관심이 되는 DNA 분자를 연결함으로써 상동성 재조합으로 도입된 DNA 서열을 표적으로 할 수 있다. 일단, DNA가 세포로 들어가면, 두 개의 상동성 서열이 상호작용하여, 도입된 DNA를 상동성 게놈 DNA 서열이 위치하는 부위로 삽입된다. 따라서, 도입된 DNA에 포함된 상동성 서열의 선택으로 상동성 재조합에 의해 도입된 DNA가 결합되는 부위를 결정할 수 있다. 예를 들면 원하는 DNA 서열이 숙주 식물 세포의 단일 복사체 유전자에 상동성을 공유하는 DNA 서열에 연결된 경우에, 관심이 되는 DNA 서열을 한 개의 특정 부위에서만 상동성 재조합을 통하여 삽입시킬 수 있다. 그러나, 원하는 DNA 서열이 숙주 진핵 세포의 다중 복사체에 상동성을 공유하는 DNA 서열에 연결된 경우에, 관심이 되는 DNA 서열은 유전자 복사체가 위치한 특정 부위 각각에서 상동성 재조합에 의해 삽입될 수 있다.

한가지 상호 재조합(도입된 DNA 전체 길이가 삽입됨) 또는 이중 상호 재조합(두개 재조합 과정사이에 위치한 DNA만 삽입됨)을 통한 상동성 재조합에 의해 숙주 게놈으로 DNA가 삽입될 수 있다. 예를 들면, 선택된 유전자가 위치하는 게놈 부위로 외부 유전자를 삽입시키고자 하는 경우에 도입된 DNA는 선택된 유전자에 상동성 서열을 가지고 있어야 한다. 그 다음 단일 상동성 재조합으로 인하여, 도입된 DNA 전체 서열이 선택된 유전자에 삽입될 수 있다. 또는 선택된 유전자에 상동성인 DNA 서열을 관심이 되는 DNA 서열의 각 말단의 측면에 위치시킴으로써, 이중 재조합을 실시한다. 따라서, 게놈의 상동성을 공유하는 두 개 부분사이에 위치한 DNA 서열만을 게놈으로 결합시키게 한다.

상동성 재조합을 통하여 특정 게놈 부위로 도입된 서열을 표적 삽입시킬 수 있지만, 고등 진핵세포에서 무작위 삽입과 비교하였을 경우에 상동성 재조합이 상대적으로 드물다. 식물 세포에서 외부 DNA 분자는 세포의 게놈에서 상동성 서열을 발견하고, 0.5-4.2X10^-4의 빈도로 재조합될 수 있다. 따라서, 상동성 재조합에 의해 결합된 도입된 DNA 서열을 포함하는 임의 형질변환된 세포에는 무작위로 결합된 도입 DNA 서열의 많은 복사체를 포함할 수 있다. 따라서, 삽입된 DNA의 복사체 수의 조절 및 위치를 유지하기 위해서는, 이와 같이 무작위로 삽입된 DNA 서열을 제거할 수 있다. 이와 같은 무작위 삽입체를 제거하는 한 가지 방법은 부위 특이적인 재조합 효소 시스템을 이용하는 것이다. 일반적으로 부위 특이적인 재조합 효소 시스템은 세가지 요소로 구성된다; DNA 서열의 두 개 쌍(부위-특이적인 재조합 서열); 특정 효소(부위 특이적인 재조합 효소). 부위-특이적인 재조합효소는 두 개의 부위특어적인 재조합 서열사이에만 재조합이 발생되도록 촉매한다.

본 발명에서는 여러 가지 다른 부위 특이적인 재조합 효소 시탸을 이용할 수 있는데, 박테리오파아지 P1의 Cre/lox 시스템(U.S. Patent No. 5,658,772); 이스트의 FLP/FRT 시스템(Golic and Lindquist, 1989); 파아지 Mu의 Gin 재조합효소(Maeser et al., 1991); 대장균의 Pin 재조합효소(Enomoto et al., 1983); pSR1 플라스미드의 R/RS 시스템(Araki et al., 1992)등이 포함된다. 박테리오파아지 P1 Cre/lox 및 이스트의 FLP/FRT 시스템에는 외래도입유전자의 부위 특이적인 결합 또는 절단에 이용할 수 있는 두 개 시스템으로 구성된다. 이들 시스템에서 재조합효소(Cre 또는 FLP)는 이들의 각 부위-특이적인 재조합 서열(lox 또는 FRT)과 특이적으로 상호작용하여 사이에 든 서열을 열전시키거나 절단한다. 이들 두 개 시스템의 각 서열은 상대적으로 짧다(lox의 경우에는 34bp; FRT의 경우에는 47bp). 따라서, 형질변환 벡터로 이용하기에 편리하다.

FLP/FRT 재조합효소 시스템은 식물 세포에서 효과적으로 기능을 하는 것으로 설명된다. 옥수수 및 쌀의 원형질에서 FLP/FRT 시스템을 실행 실험에서는 FRT 부위 구주 및 존재하는 FLP 단백질의 양이 절단 활성에 영향을 주는 것으로 나타났다. 일반적으로, 짧고 불완전한 FRT 부위로 완전한 전장 FRT 부위와 비교하였을 때 절단 생성물이 더 많이 축적된다. 시스템은 옥수수 원형질에서 분자내 그리고 분자간 반응을 촉매하는데, 이는 DNA 절단 및 삽입 반응에 이용할 수 있다는 것을 나타낸다. 재조합 반응은 가역적으로 이와 같은 가역성으로 각 방향에서 반응의 효율을 절충시킨다. 부위-특이적인 재조합 서열의 구조를 변경시키는 것 또한 이와 같은 상황을 치유하는 한 가지 방법이다. 부위-특이적인 재조합 서열을 돌연변이시켜, 재조합 반응의 생성물이 역반응의 기질로 더 이상 인지되지 않도록 하여 결합 또는 절단 과정을 안정화시킨다.

Cre-lox 시스템에서, 박테리오파아지 P1에서, loxP 부위사이에 재조합은 Cre 재조합효소 존재하에서 발생된다는 것을 발견하였다(see, e.g., U.S. Patent No. 5,658,772). 이와 같은 시스템을 이용하여, 이스트 게놈으로 도입된 두 개 lox 부위사이에 위치하는 유전자를 절단하였다(Sauer, 1987). Cre는 이스트의 유도성 GAL1 프로모터에서 발현되는데, 이와 같은 Cre 유전자는 자생 복제가능한 이스트 벡터상이 위치한다.

lox 위치가 비대칭적인 뉴클레오티드 서열이기 때문에, 동일한 DNA 분자에 위치한 lox 위치는 서로 동일한 또는 반대 방향을 가질 수 있다. 동일한 방향에서 lox 위치사이에 재조합으로 두 개 lox 위치사이에 위치한 DNA 단편이 결손되고, 고유 DNA 분자의 생성된 단부를 연결하게 된다. 결손된 DNA 단편은 원형의 DNA 분자를 만든다. 고유 DNA 분자 및 생성된 원형 DNA 분자에는 각 한 개의 lox 부위를 가지낟. 동일한 DNA 분자상에 반대 방향에서 lox 부위간에 재조합이 일어나면, 두 개 lox 부위사이에 위치한 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열이 역전된다. 또한, 두 개의 다른 DNA 분자에 위치한 lox 위치의 전단에서 DNA 단편의 상호 교환이 발생할 수 있다. 이와 같은 모든 재조합 과정은 Cre 코딩 부분의 생성물에 의해 촉매를 받는다.

X. 단백질의 정제

본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 외래도입유전자에 의해 인코드된 단백질을 정제하는 것이 바람직하다. 또는 분리된 단백질을 인코드하는 유전자를 클론하기 위해 또는 유전자의 프로모터에 의한 발현을 위한 일환으로 고유 단백질을 식물로부터 분리한다. 단백질이 일단 존재하면, 단백질을 서열화시키고, 유전자의 코딩 서열을 유추한다. 유추된 DNA 서열을 기초하여 프로브 또는 프라이머를 만들 수 있어, 이에 상응하는 유전자를 효과적으로 클로닝할 수 있다.

단백질 정제 기술은 당분야에 공지된 것이다. 이와 같은 기술은 세포 환경을 거칠게 분취하여 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분취물로 하는 것이 포함된다. 다른 단백질로부터 폴리펩티드를 분리한 경우에 관심이 되는 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동기술을 이용하여 추가 정제하여, 부분적인 또는 완전한 정제를 할 수 있다. 순수한 펩티드를 준비하는데 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 압출 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 포커스등이 있다. 펩티드를 정제하는데 특히 효과적인 방법은 신속한 단백질 액상 크로마토그래피 또는 HPLC가 된다.

단백질 정제에 이용할 수 있는 다양한 기술은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 황산암모니움, PEG, 항체등을 이용한 침전, 열 변성후 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트, 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피; 등전점 포커스; 겔 전기영동 및 이와 같은 그리고 다른 기술과 복합하는 것 등이 포함된다. 일반적으로 당분야에 공지된 것과 같이, 다양한 정제 단계를 실행하는 순서를 바뀔 수 있고, 특정 단계는 생략하여도, 실제 정제된 단백질 또는 펩티드를 준비하는데 적절한 방법이 될 수 있다.

단백질 또는 펩티드는 대부분의 정제된 상태로 제공해야한다는 일반적인 규정은 없다. 또한, 다소 덜 정제된 생성물도 특정 구체예에서는 이용할 수 있다. 몇가지 정제단계를 이용하거나 동일한 전반적인 정제 과정을 다소 다른 형태로 이용하면, 부분적 정제를 실시할 수 있다. 예를 들면, HPLC 장치를 이용하여 실행한 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피로 낮은 압력의 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술보다 "-배" 정제된 것을 얻을 수 있다. 상대적으로 정제도가 낮은 방법이 단백질 생성물의 전체 회수 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 유익할 수도 있다.

여러 다른 조건의 SDS/PAGE상에서 폴리펩티드가 이동하는 것이 다양하고 일부 경우에서는 상당히 차이가 난다는 것은 알려진 것이다(Capaldi et al., 1977). 여러 가지 다른 전기영동 조건하에서, 정제된 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 외견상 분자량은 변할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

HPLC는 독특한 해리 피크를 가지는 매우 신속라게 분리되는 특징이 있다. 매우 미세한 입자 및 고압을 이용하여 적절한 유속을 유지시키면서 실시하는 것이다. 몇 분 내지 몇 시간안에 분리가 이루어진다. 또한, 입자가 매우 작거나 보이드 볼륨이 배드 볼륨의 매우 작은 부분이 되는 조밀하게 패킹되기 ??문에, 매우 소량의 샘플만으로 가능하다. 또한, 밴드가 상당히 좁기 때문에 샘플이 거의 희석되지 않아 샘플 농도를 매우 높게 할 필요가 없다.

겔 크로마토그래피 또는 분자 거름 크로마토그래피는 분자 크기를 기초로하는 분류형 크로마토그래피 형태이다. 겔 크로마토그래피의 이론은 작은 구멍을 포함하는 비활성 물질로 준비된 컬럼으로 분자가 컬럼을 통과할 때 이들의 크기에 따라 분자가 구멍을 통과하거나 지나감으로써 작은 분자와 큰 분자를 분리할 수 있다. 입자를 이루는 재질이 분자를 흡수하지 않는 한, 흐름 속도를 결정하는 유일한 인자는 크기가 된다. 따라서, 분자의 모양이 상대적으로 일정하다면, 분자는 크기가 감소하는 순으로 컬럼으로부터 용출된다. 겔 크로마토그래피는 다른 크기의 분자를 분리하는데 있어서, 우수한 방법은 아닌데, 그 이유는 이와 같은 분리는 pH, 이온 강도, 온도등의 모든 다른 인자와는 무관하기 때문이다. 또한 흡착이 없고, 구역 퍼짐이 적고, 용출 용적은 분자양에 관련된다.

친화성 크로마토그래피는 분리된 기질과 이에 특이적으로 결합하는 분자간에 특정한 친화력에 기초하는 크로마토그래피 과정이다. 이는 수용체-리간드형 상호작용이 된다. 비용해성 매트릭스상에 결합짝을 공유결합시켜 컬럼 물질을 합성한다. 그 다음 컬럼 물질은 용액에서 기질을 특이적으로 흡수할 수 있다. 결합이 일어나지 않도록 조건을 변화시키면서(가령, pH, 이온강도, 온도등) 용출시킬 수 있다.

탄수화물을 포함하는 화합물을 정제하는데 유용한 치노하력 크로마토그래피는 렉틴 친화력 크로마토그래피이다. 렉틴은 다양한 폴리사카라이드 및 당단백질에 결합하는 기질이다. 렉틴은 통상적으로 시아노겐 브로마이드에 의해 아가로즈에 결합된다. 세포로즈에 결합된 콘카나발린 A가 이용될 수 있는 이와 같은 종류의 제 1 재료로써 다른 렉틴이외에 폴리사카라이드 및 당단백질을 분리하는데 널리 이용되어왔다. 다른 렉틴에는 N-아세틸 글루토자미닐 잔기정제 및 Helix pomatia 렉틴을 정제하는데 이용된 렌틸 렉틴, 맥아 아글루티닌을 포함한다. 렉틴 자체는 탄수화물 리간드를 가지는 친화력 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 락토즈를 이용하여 아주까리 씨 및 땅콩으로부터 렉틴을 정제하고; 말토즈는 렌즈콩 및 잭 콩으로부터 렉틴을 추출하는데 이용되고; N-아세틸-D 갈락토자민은 대두에서 렉틴을 정제하는데 이용되고, N-아세틸 글루코자미닐은 맥아의 렉틴에 결합하고; D-갈락토자민은 클램으로부터 랙틴을 얻는데 이용되고, L-퓨코즈는 로터스의 렉틴에 결합할 수 있다.

매트릭스는 심각한 정도로 분자를 흡수하지 않고, 광범위한 화학, 물리 열적 안정성을 가지는 기질이 된다. 리간드는 이의 결합 성질에 영향을 주지않는 방식으로 결합되어야 한다. 리간드는 상대적으로 견고한 결합을 제공해야 한다. 또한, 샘플 또는 리간드를 분해시키지 않고 기질을 용출시켜야 한다. 친화성 크로마토그래피의 가장 흔한 형태중에 하나는 면역친화성 크로마토그래피이다. 본 발명에 이용하는데 적합한 항체는 다음과 같이 만들 수 있다.

XI. 정의

외생 유전자; 주어진 숙주 게놈에는 정상적으로 존재하지 않고, 유전자 자체는 숙주 게놈에 고유한 것이나, 왜생 유전자는 한가지 이상의 다른 조절 요소의 추가 또는 결손으로 변형된 고유 유전자로 구성된다. 본 발명자가 본 발명에 특히 유용한 것으로 간주하는 한가지 외생 유전자는 Coix속에서 취한 프로모터에 연결된 옥수수 유전자로 구성된 것이다.

발현; 폴리펩티드를 생산하기 위해, 구조 유전자와 같은 코딩 DNA 서열에 의해 실시되는 전사 및 해독을 포함하는 세포내 복합 공정을 말한다.

후손; 씨 또는 이의 식물을 포함하는 임의 후속 세대를 말하는 것으로 특정 부계 식물 또는 부계 식물 세트로부터 유도된 것이다.

프로모터; RNA A폴리메라제가 특이적으로 결합하여, 이들 유전자의 RNA 합성(전사)을 개시하는 구조 유전자에 대해 발현 조절 요소를 제공하는 DNA 서열 또는 DNA 서열 집단에 인지 부위

발생; 식물 세포(가령 식물의 원형질 또는 외식편)으로부터 식물을 생장시키는 과정.

선택된 DNA; 숙주 게놈으로 도입되는 DNA 단편. 적절하게 선택된 DNA에는 한가지 이상의 외생 유전자 및 숙주 세포에서 외생 유전자를 발현시키는 요소, 프로모터 및 종료물질이 포함된다. 선별된 DNA와 한가지 이상의 인헨서 요소가 포함될 경우에 유익하다.

형질변환; 세포 또는 원형질로 외생 DNA 서열 또는 구조(가령 벡터 또는 발현 카세트)를 도입시키는 공정, 이에 의해 외생 DNA는 염색체에 결합되거나 자체 복제할 수 있다.

형질변환된 세포; 세포로 외생 DNA 분자를 도입시켜 세포의 DNA를 변경시킨 세포

외래도입유전자; 숙주 게놈으로 도입되는 DNA 단편. 외래도입유전자는 숙주 세포 또는 여기에서 발생된 식물에 형질변환안된 세포 또는 식물에 상응하는 관연된 신규한 표현형을 제공한다. 외래도입유전자는 단백질, RNA만을 인코드하고, 전사안되는 또는 해독안되는 부분은 인코드하지 않는다. 개별 식물에는 형질변환 또는 식물의 부계로부터 유전에 의해 외래도입유전자를 제공할 수 있다.

형질변환된 세포; 형질변환된 세포에서 발생된 또는 유도된 임의 세포, 여기에는 형질변환된 식물 세포에서 유도된 식물, 잎, 뿌리, 줄기, 체세포 또는 형질변환된 식물에서 수득한 재생(생식)세포와 같은 것이 포함된다.

형질변환된 식물; 형질변환된 식물 세포 또는 원형질에서 유도된 임의 세대의 식물 또는 후손을 말하는 것으로 식물 DNA에는 동일한 종의 고유의 형질변환안된 식물에 원해 존재하지 않는 도입된 외생 DNA를 포함한다. 형질변환된 식물에는 추가로 형질변환된 식물에 고유한 서열을 포함할 수 있는데, 단, "외생 유전자"는 유전자 기술을 이용하여 변형되어 유전자의 발현 수준 및 패턴을 변경시킬 수 있다.

운반 펩티드; 세포내에 특정 기관 또는 다른 위치로 폴리펩티드를 행하게 할 수 있는 폴리펩티드 서열.

벡터; 숙주에서 복제할 수 있는 DNA 분자로써, 부착된 단편의 복제를 위해 또 다른 DNA 단편에 연결된다. 플라스미드가 대표적인 벡터 또는 세포로 신규한 유전자를 운반시키는데 이용되는 DNA 분자이다. 플라스미드는 독립적인 안정한 자체 복제할 수 있는 DNA 조각이다.

XII. 실시예

다음의 실시예에는 본 발명의 적절한 구체예를 설명하는 것이 포함된다. 당업자는 본 발명을 잘 실행하기 위해 본 발명자가 발견한 기술을 제시하는 실시예를 설명한다. 그러나, 당업자는 본 발명에 비추어, 설명된 구체예에서 많은 변화가 있을 수 있고, 이와 같은 변화는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 유사한 또는 동일한 결과를 얻을 수 있다. 좀더 구체적으로는, 화학적 그리고 생리학적으로 관련된 특정 시약을 여기에서 설명하는 시약에 대체하여 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다. 이와 같은 모든 유사한 치환 및 변형에 대해 당업자는 인지할 수 있을 것이다.

실시예 1

Coix로부터 상동성 서열의 클로닝

Coix lacryma-jobi 씨(PI 320865)를 USDA/ARS Plant Introduction Station, Ames, IA로부터 구하였다. 이는 발아하여, 몇 주간 온실에서 생장시켰다. 다음의 과정에 따라 2-3주령된 잎에서 게놈 DNA를 준비하였다. 얼인 잎 조직(2g 생물량)을 액화 질소하에서 유리 막대를 이용하여 미세한 분말로 간다. 분말화된 조직은 8㎖ 추출 완충액(100mM Tris, pH 8.0; 50mM EDTA; 1% v/v SDS; 500mM NaCl)로 혼합시키고, 60℃로 예열한 다음, 60℃에서 45분간 배양시킨다. 그 다음 샘플은 2.5 ㎖ 얼음으로 냉각한 5M 아세테이트 칼륨과 혼합하고, 얼음위에서 20분간 둔다. 단백질 응집물은 3750rpm에서 20분간 원심분리시켜 제거하고, 상청액은 Miracloth 층을 통하여 붇고, 5㎖ 이소프로필 알코올과 혼합시켜 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNA는 3750rpm에서 15분간 원심분리시켜 수집하고, 상청액은 펠렛화된 DNA로부터 따라낸다음, 튜브를 5분간 뒤집어 잔류 상청액이 펠렛으로부터 빠져나오도록 한다. DNA는 50mM Tris, pH 8.0, 10mM EDTA, 3㎕ RNase(10 ㎎/㎖ stock)을 포함하는 300㎕ 물로 재현탁시킨다. 다시 50㎕ 4.4M 아세테이트 암모니움(pH 5.2)으로 혼합하고, 350㎕ 이소프로필 알코올로 혼합하고, 14,000rpm에서 10분간 원심분리시켜, DNA를 침전시킨다. DNA 펠렛은 750㎕ 80%v/v 에탄올로 세척하고, 10분간 뒤집어 배수시킨다. DNA는 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA를 포함하는 200㎕ 물로 재현탁시킨다. PCR 주형으로 이용할 게놈 DNA 라이브러리는 제조업자의 지시에 따라 Genome Walker PCR 키트(Clontech, Palo Alto, CA)를 이용하여 만든다.

감마 코익신 단백질 코딩 서열의 5'에 위치한 DNA 단편은 다음과 같이 PCR 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같이 만든다; gCoix5' nest2 (SEQ ID NO:1); gCoix5' nest3(SEQ ID NO:2)-이들은 각각 공개된 감마 코익신 서열(Genbank Accession number X59850)의 267-288 및 26-53 위치에 상응한다. AP1(SEQ ID NO:3) 및 AP2(SEQ ID NO:4)로 지정한 프라이머를 이용하고, 이는 "Genome Walker" 키트(Clontech)에 제공한다. 프라이머 서열은 다음과 같다;

gCoix5' nest2= CTGGAACTGGAACGGGCTTGGA

gCoix5' nest3= GCGAGGGCAACGAGCAGCACCTTCATGG

AP1= GTAATACGACTCACTATAGGGC

AP2= ACTATAGGGCACGCGTGGT

PCR 반응은 다음과 같이 실시한다; 우선 Long Template PCR 시스템(Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN))을 이용하는데, 이때 제조업자의 지시를 따르나, 단 각 반응에는 350μM dNTP's, 500nM 각 프라어머, 50mM Tris-HCl, pH 9.2; 14mM (NH₄)₂SO₄, 3.0mM MgCl₂, 2㎕(〈 25 ng) 주형 DNA(Genome Walker library)를 포함하는 것이 다른 점이다. 처음 이용된 프라이머는 gCoix5' nest2 및 어뎁터 프로모터 AP1이다. 다음의 주기 조건을 이용하는데, 이때 가열된 뚜껑이 있는 MJ Research PTC-100 thermocycler가 사용된다.

95℃-1분. 1 cycle

94℃-30초.

72℃-3분. 7 cycles

94℃-30초.

67℃-3분. 32 cycles

67℃-4분. 1 cycle

4℃-hold

이 반응의 생성물은 1:25로 물과 희석시키고, 2㎕를 제 2 회 증폭반응의 주형으로 이용한다. 프라이머는 gCoix5' nest3 및 어뎁터 프라이머 AP2로 교환한다. 다른 변화는 주가 과정 자체로 다음과 같다;

95℃-1분. 1 cycle

94℃-30초.

72℃-3분. 5 cycles

94℃-30초.

67℃-3분. 20 cycles

67℃-4분. 1 cycle

4°-hold

겔 전기영동 및 밴드 절단으로 적절한 크기의 밴드(500bp 또는 이보다 큼)를 분리시켜, 제조업자의 지시에 따라(Invitrogen, Carlsbad, CA), 플라스미드 벡터 pCR2.1로 클론시킨다. 통상의 올리고뉴클레오티드 또는 벡터-선형화된 프라이머 및 ABI 염료-데옥시 서열화 키트(Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Norwalk, CT)를 이용하여 DNA를 서열화시키고, 서열화 반응은 ABI Prism 373 DNA 서열화기(Perkin-Elmer, Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. PCR 생성물의 3' 단부 및 5' 단부의 서열을 얻은 후에, 프라이머는 통상의 제한효소 절단 부위를 가지도록 고안하여, 증폭 및 게놈 DNA에서 바로 감마 코익신 프로모터의 클로닝을 하도록 한다. 프라이머 gcx-1000seq5'xho(SEQ ID NO:5), gcx-1pcr3'xba(SEQ ID NO:6) 및 gcx-1pcr3'nco(SEQ ID NO:7)를 합성하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다;

gcx-1000seq5'xho= GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG

gcx-1pcr3'xba= GGTCTAGAGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT

gcx-1pcr3'nco= GGCCATGGGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT

감마 코익신 프로모터 증폭은 High Fidelity PCR Kit(Boehringer Mannheim)를 이용하여, gcx-1pcr3'nco 및 gcx-1000seq5'xho 프라이머로 실행하였다. 반응 혼합물에는 200ng Coix 게놈 DNA 주형, 200μM dNTPs, 500nM 각 프라이머, 5㎕ 10X buffer #2를 포함한다. 가열된 뚜껑이 있는 MJ Research PTC-100 thermocycler를 이용하여 실행한 각 주기 조건은 다음과 같다;

95℃-2분. 1 cycle

94℃-1분.

56℃-1분.

72℃-1분. 32 cycles

72℃-4분.

4℃-hold

증폭 후에, 암플리콘을 NcoI 및 XhoI으로 절단시켜, GUS 발현 벡터 pDPG827 (mcs/GUS/nos in pSP72 backbone; Promega Corp., Madison, WI)에 클로닝시킨다. 전체 프로모터 삽입체 뿐만 아니라 삽입 연결부를 서열화시키고, 벡터는 pDPG844(도1)라고 한다. 그 다음 통상의 올리고뉴클레오티드 또는 벡터-선형화된 프라이머 및 ABI 염료-데옥시 서열화 키트(Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Norwalk, CT)를 이용하여 DNA 서열화시킨다. 서열화 반응은 ABI Prism 373 DNA 서열화기(Perkin-Elmer, Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 프로모터 삽입체의 서열은 SEQ ID NO:8에 제공한다.

gcx-1pcr3'xba 및 gcx-1000seq5'xho 프라이머를 이용하여 감마 코익신 프로모터 단편을 나란하게 증폭시킨다. 증폭 생성물은 XbaI 및 XhoI으로 절단시키고, 이를 GUS 발현 벡터 pDPG828(mcs/rice Actin intronI/GUS/nos in pSP72)에 결찰시킨다. 삽입체 접합부 및 전체 삽입체를 서열화시키고, 벡터는 pDPG845(도 2)라고 한다.

플라스미드 pDPG846(도.3) 및 pDPG847(도4)를 작제하기 위해, High Fidelity PCR Kit(Boehringer Mannheim) 및 gcx-1pcr3'xba(SEQ ID NO:6), gcx-(400)pcr5'xho(SEQ ID NO:24) 프라이머를 이용하여 감마 코익신 프로모터 증폭을 실시하였다. 증폭 생성물은 XbaI 및 XhoI로 절단하고, GUS 발현 벡터 pDPG827 (mcs/GUS/nos in pSP72 backbone) 및 pDPG828(mcs/rice Actin1 intron1/GUS/nos pSP72에 결찰시켜, 각각 pDPG847 및 pDPG846라고 한다. 삽입체 접합부 및 전체 삽입체를 서열화시키고, 프로모터 삽입체의 서열은 SEQ ID NO:19에 제공한다.

플라스미드 pDPG848(도.5) 및 pDPG849(도.6)는 pDPG846 및 pDPG847 작제와 나란하게 작제된다. 감마 코익신 프로모터 단편은 High Fidelity PCR Kit (Boehringer Mannheim) 및 프라이머 gcx-1pcr3'xba(SEQ ID NO:6), gcx-(220)pcr5'xho(SEQ ID NO:25)를 이용하여 PCR 증폭시킨다. 증폭된 생성물은 XbaI 및 XhoI으로 절단시키고, GUS 발현 벡터 pDPG827(mcs/GUS/nos in pSP72 backbone) 및 pDPG828(mcs/rice Actin1 intron1/GUS/nos in pSP72)에 결찰시켜, 각각 pDPG849 및 pDPG848를 만든다. 삽입체 접합부 및 전체 삽입체를 서열화시키고, 프로모터 삽입체의 서열은 SEQ ID NO:18에 제공한다. gcx-(400)pcr5'xho 및 gcx-(220)pcr5'xho의 서열은 하기와 같고, 각 SEQ ID NO:24 및 SEQ ID NO:25에 제공된다;

gcx-(400)pcr5'xho GGCTCGAGTAAGTATGCAGGA

gcx-(220)pcr5'xho GGCTCGAGCACTCGGCTTGCT

실시예 2

감마 코익신 종료물질와 코딩 서열의 분리 및 pDPG869의 작제

감마 코익신 프로모터를 분리하는데 이용된 Genome Walker kit 및 게놈 DNA 라이브러리를 감마 코익신 종료물질 서열을 분리시키는데에도 이용할 수 있다. 모든 PCR 농도 및 주기 조건은 프로모터 분리에 이용된 것과(실시예 1) 동일하게 유지한다. 한 가지 변화는 코익신-특이적인 프라이머를 이용한다는 것이다. 제 1 라운드의 PCR은 프라이머 gcx5'pcr2(SEQ ID NO:9) 및 AP1를 이용하고, 제 2 라운드는 프라이머 gCoix3'nest2(SEQ ID NO:10) 및 AP2를 이용하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다;

gcx5'pcr2= (CTCAGCCCCAGCAGCCACATCCA)

gCoix3'nest2= (GTGCGGGCAGCCAATGACAAGTC)

증폭된 생성물은 겔 전기영동 및 적절한 크기의 밴드를 잘라내어, 밴드 용출 하여 분리시키고, 제조업자의 지시에 따라(Invitrogen, Carlsbad, CA), DNA를 벡터 pCR2.1에 클론시켜, 서열화시킨다. 감마 코익신 종료물질을 포함하는 클론은 DV108(도.11)라고 하고, 종료물질의 서열은 SEQ ID NO:11에 제공한다.

감마 코익신 단백질 코딩 서열을 얻기 위해, PCR 증폭을 실시하여, 감마 코익신 유전자의 코딩 서열 및 프로모터를 포함하는 증폭 생성물을 분리한다. 증폭은 프라이머 gcx-1000seq5'xho(SEQ ID NO:12) 및 gCoix3'pcr(SEQ ID NO:13)를 이용하여 실시하는데, 프라이머 서열은 다음과 같다;

gcx-1000seq5'xho= GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG

gCoix3'pcr= TCAGTACTGGGCACCGCCGGC

증폭을 적정화시키기 위해, "Master Amp" 키트(Epicentre Technologies, Madison, WI)를 이용한다. 완충액 D 및 Robocycler(Stratagene) 프로그램을 이용하여, 프로모터/코딩 증폭 생성물의 서열을 얻을 수 있다.

94℃-2분. 1 cycle

94℃-1분.

73℃-1분.

72℃-1분. 32 cycles

72℃-4분. 1 cycle

6°-hold

이와 같은 앰플리콘을 pCR2.1로 클론시킨다. 이와 같은 플라스미드 구조를 주형으로 이용하여 그 다음 PCR 전략은 별도의 반응 산물로써 코딩 서열 및 프로모터를 얻는 것이다. 다음의 프라이머 gCoix5'pcr+4(SEQ ID NO:14) 및 gCoix3'pcr+sac(SEQ ID NO:15)는 코딩 서열만을 증폭시키도록 고안된 것이다.

gCoix5'pcr+4= AAGGTGCTGCTCGTTGCCCTC

gCoix3'pcr+sac= GGGAGCTCTCAGTACTGGGCACCGCCGGC

이들 프라이머는 상기 나타낸 Genebank 서열의 염기 31-51 및 607-627에 상응한다. 프라이머 gCoix5'pcr+4를 이용하면, 감마 코익신 단백질의 시작 코돈이 없는 증폭 생성물을 얻는다. High Fidelity PCR(Boehringer Mannheim), 100pg 플라스미드 주형, 500nM 각 프라이머, 1x Buffer 1, 200 μM dNTP, 3mM(최종농도) MgCl₂로 된 반응 혼합물을 이용한다. 가열된 뚜껑이 있는 MJ Research PTC-100 thermocycler를 이용한 각 주기 조건은 다음과 같다;

95℃-2분. 1 cycle

94℃-1분.

62℃-1분.

72℃-1분. 32 cycles

72℃-4분. 1 cycle

4℃-hold

이 반응 생성물은 겔 전기영동 및 밴드 절단으로 정제하고, SacI으로 처리하여, pDPG845에 클론시킨다. 플라스미드 pDPG845는 NcoI으로 처리하고, 연속하여 2unit Klenow 효소 및 각 최종 농도가 0.2mM이 되도록 dNTP를 첨가하여 Klenow로 5' 돌출부를 메운다. 이로써, 감마 코익신 단백질 코딩 서열의 5' 단부에 ATG 코돈을 바로 결찰시켜, 감마 코익신의 완전한 오픈 리딩 프레임을 복원시킨다. 벡터는 SacI로 처리하여, GUS 코딩 서열을 제거함으로써 감마 코익신 코딩 서열의 3' 단부에 필적하는 부위만을 남긴다. 준비된 pDPG845 벡터 및 감마 코익신 코딩 서열을 서로 결찰시켜, 새로운 벡터 pDPG851(도9)를 얻는다.

pDPG851의 nos 종료물질을 감마 코익신 종료물질로 대체시키기 위해, 발현 카세트를 좀더 적합한 벡터 즉, pDPG851pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA)로 이동시킨다. 이는 pBK-CMV를 ScaⅠ(blunt)으로 처리하고, pDPG851를 XhoI 및 ClaI으로 처리하고, 5' 돌출부는 Klenow(2units Klenow, 0.2mM 각 dNTP)로 처리하여 실행한다. pDPG851 카세트 및 pBK-CMV 기본 구조를 겔 정제한다. 두 개 플라스미드를 결찰시켜, pDPG862(도10)를 만든다.

감마 코익신 종료물질을 pDPG862에 있는 감마 코익신 코딩 서열의 3'단부에 클론시킨다. 이는 우선 nos 종료물질을 제거하고, 하기에서 지적한 단계를 실행하여 정제된 코익신 종료물질을 그 자리에 클로닝시키면 된다. 감마 코익신 코딩 서열에는 보고된 Genbank 서열의 620-625위치에 ScaI 부위를 가진다. 이 제한 효소 부위(Genome Walker procedure과정에 의해 수득된 코딩 서열의 부분으로써 pDPG862 및 DV108에 있는)을 ScaI 및 NotI으로 처리한다. 그 다음, pDPG862 기본 구조에서 실시한 것과 같이, 감마 코익신 종료물질 서열을 겔 정제한다. 이들 두 개 단편을 결찰시켜, pDPG869(도.7)를 만든다. 감마 코익신 코딩 서열의 서열은 SEQ ID NO:16에서 제공한다. 이들 유전자 구조체 각각은 실시예 5와 6에서 설명하는 것과 같이 옥수수의 재생 세포로 입자 포격에 의해 도입시킬 수 있다.

실시예 3

Coix 올레오신 3 종료 물질의 분리

실시예 1과 2에서 프로모터 및 종료물질 서열을 분리시키는데 이용된 Genome Walker kit 및 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 Coix 올레오신 3 종료물질을 분리시킨다. 모든 PCR 농도 및 주가 조건은 이들 실시예에서 이용한 것과 동일하다. 단 한 가지 변화는 이용된 Coix 특이적인 프라이머에 있다. 제 1 라운드 PCR은 프라이머 cx-L3 3'nest1(SEQ ID NO:26) 및 AP1(SEQ ID NO:3)를 이용하고, 제 2 라운드는 프라이머 cx-L3 3'nest2(SEQ ID NO:27), cx-L3 3'nest3(SEQ ID NO:28), AP2(SEQ ID NO:4)를 이용하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다;

cx-L3 3'nest1 CGGGCTGATCCTGGCCGGCACCGT

cx-L3 3'nest2 GTGTTCTCCTGGATGTACAAGTAC

cx-L3 3'nest3 TCCAAGGCCCGCGACGTCAAGGA

증폭 생성물은 겔 전기영동 및 적절한 크기의 밴드(〉500 bp)를 잘라내고, 밴드를 용출시켜 분리하고, DNA를 벡터 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝 시키는 것은 제조업자의 지시에 따르며, 클론된 DNA는 상기에서 설명하는 것과 같이 서열화시킨다. Coix 올레오신 종료물질을 포함하는 클론을 DV112로 지정하였다. 올레오신 종료물질의 서열은 SEQ ID NO:17에 제공한다.

실시예 4

감마 코익신 프로모터 및 옥수수 및 사탕수수의 상동성 프로모터의 서열 비교

감마-프로라민은 Coix, 사탕수수 및 옥수수의 배유에 존재하는 씨 저장 단백질의 종류이다. 실시예 1에서 설명한 것과 같이 클론된 Coix(gamma Coixin, SEQ ID NO:8), 사탕수수의 상응하는 서열의 감마 프로라민 프로모터 부분(gamma kafirin, SEQ ID NO:22, Genbank Accession No. X62480) 및 옥수수의 상응하는 부분(gamma zein, SEQ ID NO:23, Genbank Accession No. X56117)산에 서열 유사성을 비교하기 위해 분석을 실시하였다. Gene Works DNA 분석 소프트웨어(Intelligenetics, Inc., Mountainview, CA)를 이용하여 해독 개신 코돈의 상류 894 뉴클레오티드를 배열하였다. 갭을 도입하여 배열하였다. 각 서열의 3' 최말단은 ATG 개시 코돈에 상응한다. 도 8과 표 9에서 비교 결과를 나타내었다. 분석에 따르면, 감마 코익신과 감마 카피린사이에는 65% 서열 상동성이 있고, 감마 코익신과 감마 제인간에는 63% 서열 상동성이 있는 것으로 나타났다. 이 결과는 세 가지 종 각각에 프로모터 부분이 상당히 다르다는 것을 말하는 것이다.

표 9

실시예 5

미소투사물 준비

미소투사물은 다음과 같이 준비하였다; 60㎎ 0.6㎛ 금 입자(BioRad, cat. no. 165-2262)를 1000㎕ 순수 에탄올에 첨가하고, 적어도 3시간동안 실온에 둔후에 -20℃에 저장하여 금 입자를 만든다. 멸균된 20 내지 35㎕ 금 입자 또는 좀더 적절하게는 30 내지 35㎕의 금 입자(30㎕에는 1.8㎎ 압자가 포함)를 최고 1분간 마이크로원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 1㎖ 멸균수를 튜브에 첨가하고, 1800-2000rpm에서 2-5분간 원심분리시킨다. 미소투사물 입자는 250ng 벡터 DNA를 포함하는 25-30㎕ DNA 용액에 재현탁시킨다.

220㎕ 멸균 수, 250㎕ 2.5M CaCl₂, 50㎕ 원액 스페르미딘(986㎕ 물에 14㎕ 스페르미딘)을 입자를 포함하는 용액에 첨가한다. 용액을 완전하게 혼합시키고, 얼음에 둔 후에, 4℃에서 10분간 교반시키고, 500rpm에서 5분간 원심분리시킨다. 상청액을 제거하고, 펠렛은 600㎕ 순수 에탄올에 재현탁시킨다. 500rpm에서 5분간 원심분리후에, 펠렛은 36-38㎕ 순수 에탄올에 다시 현탁시키고, 약 20초간 교반시키고, 20-30초간 초음파분쇄시킨다. 이 단계에서 입자는 통상적으로 2-5분간 두고, 상청액의 5-10㎕를 빼내어, 플라이어 디스크 표면에 분산시키고, 에탄올을 완전하게 건조시킨다. 또는, 재현탁 및 20~30초간 36㎕-38㎕에탄올에서 표반후에 입자를 바로 제거하고, 플라이어 디스크에 두고 건조시킨다. 포격 챔버는 실시전에 28 Hg를 배출시킨다. 그 다음, DuPont Biolistics PDS1000He 입자 포격 장치를 이용하여 약 1100psi의 헬륨 바람으로 입자 포격을 실시하였다.

실시예 6

Hi-Ⅱ 미숙 배의 포격

곡물의 유전자형 Hi-Ⅱ의 미숙 배아(길이가 1.2-3.0mm)를 수분후 10~12일 후에 Hi-Ⅱ의 표면 멸균된 온실에서 생장한 이삭으로부터 잘라낸다. Hi-Ⅱ 유전자형은 A188 × B73 교배(Armstrong et al., 1991)로부터 발생시켰다. 배양접시당 약 30개의 배를 변형된 N6 배지(1㎎/ℓ2,4-D, 100㎎/ℓ카제인 가수분해물질, 6mM L-프롤린, 0.5g/ℓ2-(몰폴린) 에탄설폰산(MES), 0.75g/ℓ MgCl_2,2% 슈크로즈을 포함하고, 2 g/ℓGelgro, pH 5.8(#735 medium)로 고형화시킴)상에서 플레이트시킨다. 배는 24℃에서 2~4일간 암상태에서 배양한다.

포격전 약 3~4시간에, 배아를 상기 배양 배지로 이동시키는데, 이때 슈크로즈의 농도는 3%에서 12%로 증가시킨다. 배아를 높은 삼투압 배지로 이동시키는 경우에, 접시의 중앙으로부터 1㎝ 상에서 시작하여, 동심원을 그리도록 배열함으로써, 이들의 근초 단부는 접시의 중앙으로 향하도록 된다. 통상적으로 플레이트상 25-35배아가 있을 경우에는 두 개의 동심원이 형성된다.

배를 포함하는 플레이트는 바닥에서 3번째 선반 즉, 정지 스크린 아래 5㎝정도 위치에 둔다. 1100 psi 파열 디스크를 이용하여 포격을 가한다. 각 배 플레이트에는 DuPont Biolistics PDS1000He 입자 총을 이용하여 1회 포격을 가한다. 포격 후에, 배는 하룻밤동안(16-24시간) 삼투압이 높은 배지(735, 12% 슈크로즈)에서 회수하고, 1㎎/ℓ 비알포스(#739, 735 plus 1㎎/ℓ bialaphos 또는 #750, 735 plus 0.2M 만니톨, 1㎎/ℓ비알포스)를 포함하는 선택 배지로 이동시킨다. 배는 24℃ 암 상태에서 유지한다. 3 내지 4주 후에, 초기 선별 플레이트상에 배의 약 90%가 일반적으로 Type Ⅱ 유합 조직을 형성하고, 이를 3㎎/ℓ비알포스(#758)를 포함하는 선택성 배지로 이동시킨다. 서든 분석을 이용하여 형질변환체를 분석하고, 유전자 발현 검사를 실행하였다. 표 10에서는 형질변환에 이용된 구조체 및 형질변환체의 수를 제공한다.

표 10

실시예 7

추정되는 프로모터 조절 원소의 결정

각 프로모터 서열내에 추정되는 조절 성분을 확인하는 것은 유사한 조직 특이적인 또는 발생학적으로 독특한 방식으로 발현되는 것으로 공지된 프로모터 서열과 비교하여 시작한다. 유사한 발현 패턴을 가지는 프로모터간의 공유하는 서열은 전사 인자의 결합을 위한 후보물질이고, 이는 발현 패턴을 부여하는 원소가 될 수 있다. 이와 같은 추정되는 조절 원소는 각 프로모터의 결손 분석 및 각 구조체에 기능적으로 부착된 리포터 유전자 검사에 의해 각 결손 구조체의 기능 분석으로 확인할 수 있다.

이와 같은 분석은 클론된 감마 코익신 프로모터상에서 실시한다. 실시예 4에서 설명한 것과 같이, 옥수수 감마 제인 및 사탕수수 감마 카피린 유전자 프로모터와 Coix 감마코익신 프로모터의 DNA 서열을 배열하면, 잠재적인 전사 인자 결합 부위가 되는 몇 가지 짧은 상동성 부분이 나타난다. 이들 부위중 몇 개는 사탕수수 저장 단백질 프로모터의 추정되는 조절 부분으로 이미 확인된 바 있다(Ottoboni et al., 1993; de Freitas et al., 1994). 4가지 추정되는 조절 부분이 확인되었다. 두 부분은 질소 상태에 반응하여 전반적인 프로모터 활성을 부여하는 것으로 보이고, 이들 부분은 GCN4-유사 부분으로 명한다. 두 개 추가 부분은 조직-특이적인 발현을 부여하여, 이는 프로라민-박스 결합 부분으로 명한다. 원소들은 해독 시작 부위에서 180 내지 700bp사이에 배열하고, 개시 메티오닌 코돈(-190bp)에 전단인 GCN4 박스, 프로라민 박스(-395bp), 제 2 GCN4 박스(-525bp), 마지막으로 제 2 프로라민 박스(-650bp)이 배열된다.

절두된 프로모터 서열은 412bp(SEQ ID NO:19) 및 222bp(SEQ ID NO:18)(해독개시 부위로부터의 거리)의 프로모터 단편을 만들어 추정되는 조직-특이적인 조절 원소를 특이적으로 제거되도록 되었다. 412bp 프로모터 단편에는 전단 GCN4 및 프로라민 모티프만을 포함하는 반면에, 222bp 단편에는 제거된 두 개 프로라민 박스 부분과 전단 GCN4 모티프만을 포함한다. 전체 길이의 감마 코익신 프로모터에 추가하여, 이와 같은 프로모터 단편을 GUS 리포터 유전자를 포함하는 벡터내로 클론시켜, 발현을 강화키는데, 이때는 쌀의 악틴 1을 이용할 수도 안할 수도 있다. 이와 같은 벡터를 pDPG844, 845, 846, 847, 848, 849라고 정하고, 이들의 작제는 상기에서 설명하였다. 각 구조체를 미숙한 옥수수 배에 포격을 가하고(실시예 6에서 설명), 식물은 외래도입유전자로써 각 프로모터:GUS 구조체를 포함하여 생성된다.

여러 가지 많은 상이한 발생 단계에서 모든 식물 조직에서 GUS 리포터 유전자가 발현되었는지를 이와 같은 외래도입유전자를 포함하는 식물에서 분석한다. 가장 짧은 프로모터 구조체(221bp, pDPG848, pDPG849)는 조직-특이적인 발현 패턴을 가지지 않는데 이는 이와 같은 프로모터는 프로라민-박스 조절 부분이 부족하기 때문인 것으로 보인다. 또한, 412bp의 프로모터 구조체 pDPG846 및 pDPG847는 조직-특이성을 보유하고 있지만, 전장의 프로모터 구조체(pDPG844 및 pDPG845)와 비교하였을 경우에는 발현 수준이 낮다.

실시예 8

Coix 프로모터를 이용하여 형질변환된 옥수수에서 α-제인 유전자의 센스 억제 및 억제의 제거

제인 유전자가 옥수수 프로모터에 의해 조절을 받는 경우에, 옥수수에 있는 센스 제인 발현 카세트의 발현으로 내생 옥수수 발현 억제가 유도되는 것을 볼 수 있었다. Coix 프로모터를 이용할 경우에 이와 같은 억제가 발생되지 않는다는 것을 설명하기 위해, 형질변환 연구를 실행하고, 옥수수 또는 Coix 프로모터에 의해 발현되는 구조체를 비교하였다. 이 연구는 다음과 같이 실시하였다.

옥수수 세포를 플라스미드 벡터 pDPG531에 형질되이비시키는데, 이 벡터는 옥수수 Z4 센스 코딩 부분에 연결된 옥수수 Z27 프로모터와 3' 부분에 노팔린 합성효소로 구성된다(이는 1996년 12월 9일자로 출원된 미국 특허 출원 08/763,704에서 설명). 벡터 SPZ4Ent로부터 약 960개 염기쌍을 잘라내고, 단부를 채워서 pDPG531를 만든다(1996년 12월 9일자로 출원한 미국 특허 출원 08/763,704). 기본적으로 전체 Z4 전사 단위가 SPZ4Ent에 포함되는데, 이때 총 960개 뉴클레오티드 삽입체를 가진다. Z4 유전자는 두 개의 Z4 서브클론 즉, pSPZ4R3' 및 pSPZ45'에서 다시 작제하였다. 모 벡터는 중간에 반복되는 Z4 서열의 뉴클레오티드 630에서 뉴클레오티드 1341까지의 3' 뉴클레오티드 서열의 713 뉴클레오티드를 포함하는 pSPZ4R3'이다. Z4 서열의 5' 단부를 SacI(삽입된 유전자의 외측에 있는 폴리링커 서열을 절단) 및 BamHi으로 처리하여 방출시키고, SacI(폴리링커 서열을 절단) 및 BamHI로 처리하여 얻을 수 있는 pSPZ45'의 5'서열을 포함하는 삽입체를 선형화된 pSPZ4R3'에 결찰시켜, 고유의 Z4 전사 단위를 재작제한다. 생성된 벡터는 프로모터와 종료물질사이에 유일한 NcoI 부위를 포함하는 pBSK(-)에 Z27프로모터::Nos 3' 부분 구조체로 구성된다. 벡터 및 삽입체는 모두 블런트 말단을 가지고 있어, 결찰시킨다. Z4 DNA 서열의 센스 방향을 가지는 클론을 확인하였다(pDPG531). pDPG531는 22kD 제인 단백질(α-제인)을 전사 및 해독할 수 있다. 플라스미드 pDPG531 및 pDPG165를 다음과 같이 공동-포격방법을 이용하여 옥수수 세포로 도입시킨다.

PCT 공고 WO 95/06128 및 1996년 12월 9일자로 출원된 미국 특허 출원 08/763,704에서 설명한 것과 같이 형질변환체를 만든다. 그 과정은 다음과 같다; 유전자형 A188 ×B73인 옥수수 식물을 HiⅡ옥수수 식물에 교배한다(Armstrong et al., 1991). 미숙한 배(길이가 1.2-2.0mm)을 수분후에 11~12일경에 표면 멸균된 온실에서 자란 이삭에서 잘라낸다. Hi-Ⅱ 유전자형은 미숙한 배로부터 타입 II의 고빈도 발명을 위해, A188 × B73 교배(Armstrong et al., 1991)로부터 발생시켰다. 배양접시당 약 30개의 배를 변형된 N6 배지(1㎎/ℓ2,4-D, 100㎎/ℓ카제인 가수분해물질, 6mM L-프롤린, 0.5g/ℓ2-(몰폴린) 에탄설폰산(MES), 0.75g/ℓ MgCl_2,2% 슈크로즈을 포함하고, 2 g/ℓGelgro, pH 5.8(#735 medium)로 고형화시킴)상에서 플레이트시킨다. 배는 24℃에서 2~4일간 암상태에서 배양한다.

포격전 약 4시간에, 배아를 상기 배양 배지로 이동시키는데, 이때 슈크로즈의 농도는 3%에서 12%로 증가시킨다. 배아를 높은 삼투압 배지로 이동시키는 경우에, 접시의 중앙으로부터 2㎝ 상에서 시작하여, 동심원을 그리도록 배열함으로써, 이들의 근초 단부는 접시의 중앙으로 향하도록 된다. 통상적으로 플레이트상 25-35배아가 있을 경우에는 두 개의 동심원이 형성된다. 배를 포함하는 플레이트는 바닥에서 3번째 선반 즉, 정지 스크린 아래 5㎝정도 위치에 둔다. 1100 psi 파열 디스크를 이용하여 포격을 가한다. 각 배 플레이트에는 DuPont Biolistics PDS1000He 입자 총을 이용하여 1회 포격을 가한다. 배는 하룻밤동안 삼투압이 높은 배지에서 회수한다.

하룻밤동안(16~24시간) 삼투압이 높은 배지(735, 12% 슈크로즈)상에서 회수한후에, 배를 1㎎/ℓ 비알포스(#739, 735 plus 1㎎/ℓ bialaphos 또는 #750, 735 plus 0.2M 만니톨, 1㎎/ℓ비알포스)를 포함하는 선택 배지로 이동시킨다. 배는 24℃ 암 상태에서 유지한다. 3 내지 4주 후에, 초기 선별 플레이트상에 배의 약 90%가 일반적으로 Type Ⅱ 유합 조직을 형성하고, 이를 3㎎/ℓ비알포스(#758)를 포함하는 선택성 배지로 이동시킨다. 비알포스 저항성 조직은 새로운 선별 배지(#758)에서 매 3주간 2차 배양한다. 형질변환된 배 유합조직을 재생 배양 배지로 옮긴다(MS 배양 배지(Murashige and Skoog, 1962), 0.91㎎/ℓ L-아스파라진, 1.4g/ℓ L-프롤린, 20g/ℓD-솔비톨, 0.04㎎/ℓ나프탈렌아세트산(NAA), 3㎎/ℓ6-벤질아미노퓨린을 포함). 세포는 이 배양 배지상에서 약 4주간 생장시키고, 약 2주마다 새로운 배지로 이동시킨다. 형질변환체를 MS0 배양 배지(첨가된 피토호르몬이 없이 MS 배지)로 옮긴다. 재생된 식물을 토양으로 옮긴다. 식물은 AW, CV, DJ로 지정한 옥수수 동종 번식주와 교배시킨다. Z27-센스 발현 카세트를 포함하는 씨는 opaque-2 돌연변이 낟알과 유사한 표현형으로 불투명하다. 세 개 Z27-Z4 센스 발현 카세트에서 식물을 재생하여, AW, CV, CN으로 지정한 동종번식주와 교배시킨다.

하기에서 설명하는 것과 같이 형질변환안된 옥수수 식물에 존재하는 α-제인 단백질과 Z27-Z4 센스 형질변환체에 존재하는 α-제인 단백질의 양을 코마시 블루 착색된 폴리아크릴아미드 겔상에서 비교하였다. 50㎎ 빻은 낟알을 0.5㎖ 70% 에탄올, 1% β-멀캅토에탄올에 재현탁시키고, 하룻밤동안 실온에서 30분간 추출한다. 샘플은 교반시키고, 12,000rpm에서 5분간 원심분리시킨다. 제인 단백질을 포함하는 50㎕를 빼내어 건조시킨다. 제인 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 로딩 완충액(1% β-멀캅토에탄올을 포함)에 50:1로 재현탁시킨다. 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리시켜, 코마시 블루로 착색시킨다.

결과에서 Z27-Z4 센스 형질변환체에 존재하는 α제인 단백질 수준이 상당히 감소된 것을 알 수 있다. 이와 같은 감소는 안티센스 형질변환에서도 이에 필적할 수준으로 관찰되었다. 센스 형질변환체에 있는 제인 단백질 농도가 기대이상으로 감소된 것에 추가하여, 제인 함량이 감소된 씨는 불투명한 표현형을 일반적으로 가지고, Z27 제인 수준 또한 감소되었다.

각 낟알에서 얻은 씨에서 리신 및 루이신 농도를 분석하였다. 다음과 같이 3개의 별개 형질변환된 주에서 유도한 성숙한 낟알에서 아미노산을 추출하였다. 50㎎의 빻은 곡식을 아르곤 기체하에서 11℃ 24시간동안 1㎖ 6N HCl에 가수분해시킨다. 샘플을 50㎖로 희석시키고, 0.45미크론 필터를 통하여 여과시킨다. 노르발린을 각 샘플에 첨가시켜, HPLC 분석전에 내부 표준으로 삼는다. Superlcosil LC-8 HPLC 컬럼상(Jarrett et al., 1986; Jones et al., 1983; AACC, 1995)상에서 아미노산을 분리시켰다. 한 개 낟알을 분석한 결과 형질변환된 것과 형질변환안된 낟알사이에는 유의성이 p〈0.05 수준으로 상당히 차이가 있는 것으로 나타났다. 한 형질변환체, KQ018에서 리신 및 루이신 후준은 동계 형질변환된 씨와 형질변환안된 씨에서 통계학적으로 동일하였다. 그러나, KQ012로 지정된 형질변환체에서는 리신 수준이 형질변환체에서 통계학적으로 증가되었고, 루이신 수준은 형질변환체에서 통계학적으로 상당히 감소되었다. 따라서, Z27 프로모터-Z4 센스 형질변환체는 안티센스 형질변환체에서 볼 수 있는 것과 유사한 씨 모양, 단백질 및 아미노산 조성 표현형을 가진다. 이는 상동성-의존성 유전자 침묵 결과로 발생되는 것으로 보인다.

옥수수 Z27 프로모터가 상동성 Coix 유전자의 Coix 프로모터로 대체된 경우에 상동성을 기초로 한 유전자 침묵이 발생되지 않는다는 것을 설명하기 위해, 플라스미드 벡터를 작제하는데, 이 구조는 Z27 유전자에 상동성인 Coix 유전자에서 분리한 프로모터로 구성된다. 이 프로모터는 Zea mays Z4 코딩 서열에 연결되어있다. 프로모터 서열은 실시예 1에서 설명하는 전략을 이용하여 분리하였다. 그 다음 Coix-프로모터-Z4 코딩 서열을 상기에서 설명하는 것과 같이 옥수수로 형질도입시킨다. 상기에서 설명하는 것과 같이 벡터를 포함하는 형질변환된 식물이 생성되고, 형질변환안된 동종과 교배시킨다. 그 다음 α-제인의 양을 측정하여, Coix에서 유도된 프로모터-Z4 구주 유전자 발현 카세트로 구성된 형질변환체에서 외래도입유전자 발현 감소가 없다는 것을 설명하였다. 또한, 고유 프로모터를 포함하는 형질변환체에 대해 Coix유도된 프로모터-Z4 구조 유전자 발현 카세트의 발현 증가는 Coix유도된 프로모터-Z4 구조 유전자 발현 카세트를 가지는 식물에서 불투명한 표현형이 없다는 것으로 설명된다. Coix유도된 프로모터-Z4 구조 유전자 발현 카세트 형질변환체에 있는 리신 및 루이신 농도를 분석하면 리신 수준이 증가되지 않았고, 루이신 수준이 감소되지 않았다는 것을 설명할 수 있는데, 이는 옥수수 Z27 프로모터를 이용할 경우와 마찬가지로 Coix에서 유도된 프로모터로 구성된 옥수수 형질변환체에서는 센스-공동 억제가 관찰되지 않았다는 것을 말하는 것이다.

실시예 9

H99 미숙 배 또는 유합조직의 형질변환 및 파로모마이신으로 선별

자체 또는 근친 수분시킨 온실에서 자란 H99 식물에서 옥수수 미숙 배(길이는 1.2-3.0mm, 수분 후 10-14일)를 분리시킨다. 미숙한 배는 735배지상에서 암상태로 27℃상에서 배양시킨다. 미숙한 배는 분리후 1~6일경에 포격을 가하거나 또는 포격에 이용되는 배 유합조직을 만들기 위해 배양시킨다. 배발생 유합조직을 연장시키고, 2~3주간격으로 새로운 735 배지로 2차 배양시켜 유지시킨다. 포격전에 배양된 배 또는 배발생 유합조직(약 2-4㎜ 덩어리로 나뉨)을 12% 슈크로즈를 포함하는 735배지상에서 3-6시간동안 옮긴다. 실시예 6에서 설명하는 것과 같은 포격후에, 조직 배양물은 하룻밤동안 배양시키고, 500㎎/ℓ파로모마이신을 포함하는 735배지로 옮긴다. 2-3주후에, 유합조직을 작은 조각(직경이 2-4mm)으로 나누고, 새로운 선별 배지로 옮긴다. 이와 같은 2차 배양 단계를 2-3주 간격으로 최고 15주까지 반복시키는데, 2차 배양을 지속하면, 건강하게 생장한 유합조직을 눈으로 선별할 수 있다.

파로모마이신 내성 유합조직은 2,4-D는 없으나, 3.52㎎/ℓBAP을 포함하는 735배지로 옮겨, 3-9일간 암상태에서 27℃상에서 생장시킨 다음, 100㎎/ℓ파로모마이신/Phytatrays(Sigma)을 포함하는 110배지((1/2X MS 염, 0.5㎎/ℓ티아민, 0.5㎎/ℓ니코틴산, 3% 슈크로즈, 3.6g/ℓGelgro, pH 5.8)로 옮긴다음 빛을 제공하면서 27℃상에서 배양시킨다. 3~6주후에 Phytatrays에서 발생된 식물을 토양으로 옮긴다. 식물은 생장실에 적응시키고, 온실에서 생장시켜 성숙시킨다.

실시예 10

감마 코익신 프로모터 제어하에서 GUS 리포터 유전자의 발현

표준 조직화학적 GUS 활성 착색

1) GUS 검사 완충액을 위해 원액 용액을 복합시킴;

페리시아나이드 칼륨 50 mM stock 1㎖

인산나트륨완충액 200 mM stock, pH 7.0 1㎖

EDTA 나트륨 10 mM stock,pH8.0 1㎖

트리톤 X-100 10% v/v stock 1㎖

2) 0.2 미크론 필터를 통하여 검사 완충액 혼합물을 필터 멸균시킨다.

3) 발색 기질은 N,N-디메틸포름아미드에 25㎎/㎖ 농도로 용해된 X-gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-베타-D-글루쿠로니드)이다.

4) 다음의 시약을 복합하여 작용 GUS 검사 용액을 준비한다.

인산나트륨완충액 200mM, pH 7.0 26㎖

GUS 검사 완충액 (상기 1단계부터) 9㎖

25㎎/㎖ stock 1.2㎖

5) 37℃에서 GUS 검사 혼합물에 조직을 배양시킨다. GUS 효소 활성을 포함하는 조직에서는 푸른 색이 나타난다. 조직은 필요하다면 실온에서 하룻밤동안 또는 더 긴 시간으로 배양시킨다.

실시예 7에서 설명하는 형질변환된 식물에서 얻은 낟알에서 GUS 유전자 발현에 대해 검사하였다. 27DAP를 통하여 수분후에(DAP) 9일경에 개별 R0 형질변환된 식물에서 낟알을 얻었다. 낟알 슬라이스를 24웰 미량적정 접시의 웰에 두고, Jefferson (Jefferson, R.A., 1987)에서 설명하는 방법에 따라 실온에서 GUS 검사 용액에 배양시킨다. GUS 활성을 나타내는 푸른 색은 0-4수준으로 기록한다(0은 푸른 색 착색이 없음; 4는 가장 강하게 착색)

식물중에서, 낟알에서 GUS 발현을 위한 RO 단계를 검사하여, 푸른색 착색을 관찰하였는데, GcxPro(900)/GUS/NOS 구조체의 경우에는 9개 식물중에서 5개 식물에서; GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS 구조체의 경우에는 9개 식물중에서 4개 식물에서; GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS 구조체의 경우에는 12개식물중에서 3개 식물에서; GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS 구조체의 경우에는 6개 식물중에서 2개 식물에서 푸른 색 착색이 관찰되었다(표 11). GcxPro(400)/GUS/NOS 또는 GcxPro(220)/GUS/NOS 구조체를 포함하는 검사된 식물에서 낟알에서 임의 푸른 색 착색이 나타나는 식물은 없었다.

낟알의 다른 부분에서 푸른 색 착색에 대해 공간적인 착색 패턴을 관찰할 수 있다. GcxPro(900)/GUS/NOS 식물의 낟알에서는 배유에서만 발현 패턴이 나타났는데, 대부분 전분 배유에서 착색이 있고, 일부 낟알에서는 호분에 착색이 한정되고; GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS 식물의 낟알에서는 전분 배유에서 주로 착색 패턴이 나타나고, 일부 낟알의 배에서는 광 제한된 착색이 나타나고, GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS 또는 GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS 식물에서 얻은 낟알에서는 배유 및 배에서 모두 착색이 나타나는데, 이는 배유-특이적인 발현 패턴을 상실하였다는 것을 말하는 것이다. GcxPro(400)/GUS/NOS 또는 GcxPro(220)/GUS/NOS 식물에서 얻은 낟알에서는 푸른 색 착색이 감지되지 않았다. GcxPro(900)/GUS/NOS 또는 GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS 외래도입유전자를 발현시키는 식물에서는 일시적으로 조절된 착색 패턴을 나타내는데, 오래된 씨에서는 어린 씨보다는 더 많이 푸른 색으로 착색되었다(표 12).

표 11

표 12a

표 12b

실시예 11

미소투사물 포격을 위한 일반적인 방법

미소투사물 포격에 이용되는 기술에 많은 변수는 당업자에 공지의 것으로 본 발명에서 유용한 것으로 보고 있다. 포격의 일반적인 과정에 대해서는 PCT 출원 WO 95/06128에서 설명하고 있다. 본 발명에서 이용하는 표적 조직의 예로는 미숙한 배, Tpye Ⅰ유합조직, Tpye Ⅱ 유합조직, Tpye Ⅲ 유합조직, 현탁 배양물, 분열조직(PCT Application WO 96/04392)등이 포함된다. 옥수수 형질변환에 특히 유용한 일부 유전자형에 대해 특징적으로 설명한 바 있다(WO 95/06128). 적절한 유전자형은 바로 형질변환될 수 있고, 수정이 가능한 형질변환된 식물을 생산하기 위해 재생할 수 있는 것이 된다.

미소투사물 가속 임의 방법을 이용하여 본 발명에 따라 식물 세포를 형질변환시킬 수 있다. 적절한 방법은 DuPont Biolistics PDS1000He 입자 포격 장치와 같은 기체에 의해 작동하는 입자 총이 된다. 포격하는 입자를 예로 들면 텅스텐, 금, 플라티늄등이 포함된다. 금 입자가 본 발명에 특히 유용한데, 0.6㎛ 또는 0.7㎛ 금 입자가 바람직하고, 0.6㎛ 금 입자가 가장 적절하다. 가장 적절한 입자는 DNA 피복된 것으로 평균 크기가 0.6㎛ 내지 1.0㎛이 된다.

여기에서 설명한 것과 같이, 임의 DNA 서열을 형질변환에 이용할 수 있다. 형질변환에 이용되는 DNA 단편에는 한 가지 이상의 선택가능한, 분비가능한 또는 스크리닝가능한 표식이 포함된다. 이와 같은 것의 많은 예들이 공지되어 있고, 여기에서도 설명하고 있다. 선택가능한 표식의 경우에는 선별은 고형 또는 액상 매체에서 이루어진다. 이용되는 DNA 단편에는 개별적으로 또는 다른 서열과 복합하여, 형질변환된 식물에 원하는 표현형을 부여할 수 있는 한 가지 이상의 유전자를 포함한다. 형질변환을 위한 유전자 및 서열이 형질변환된 식물에 부여하는 이에 상응하는 표현형에 대해서 여기에서 설명한다.

실시예 12

우수한 동종번식체로 유전자유입 및 하이브리드

역교배를 이용하여 출발 식물을 개선시킬 수 있다. 역교배는 한 소스로부터 특정 바람직한 형질을 동족번식체 또는 이와 같은 형질이 부족한 다른 식물로 전달할 수 있다. 예를 들면, 우수한 동족번식체(A)(재생 부모)를 문제가 되는 형질에 대한 적절한 유전자를 가지는 가령, 본 발명에 따라 준비된 구조체를 운반하는 제공자 동족번식체(비재생 부모)에 우선 교배시켜 실시한다. 우선 이와 같은 교배의 후손을 비-재생 부모로부터 전달되는 원하는 형질에 대해 생성된 후손에서 선별한 다음, 선택된 후손을 우위의 재생 부모(A)와 짝짓기를 한다. 5회 이상 역교배후에, 원하는 형질에 대해 선별되는 세대 후손은 전달되는 특징을 조절하는 위치에 반-접합체가 되나, 이는 거의 모든 다른 유전자에 대해 우수한 부모가 된다. 마지막 역교배 세대는 전달될 유전자에 대해 순수한 씨를 가지는 후손을 제공하기 위해, 적어도 한번 자가 수분되어야 한다.

따라서, 일련의 품종개량 조작을 통하여, 선별된 외래도입유전자는 한 주에서 추가 재조합 조작이 필요없는 완전히 다른 주로 이전된다. 외래도입유전자는 일반적으로 임의 다른 유전자로써 유전적으로 행동할 때 가치가 있고, 이는 임의 다른 곡식 유전자와 동일한 방식으로 품종개량 기술로 조작될 수 있다. 다른 동족번식체 식물을 교배시킴으로써, 다른 외래도입유전자 복합을 가지는 다수의 다른 하이브리드를 생산할 수 있다. 이와 같은 방식에서, 하이브리드와 연관된 바람직한 농경상의 성질을 가지고("하이브리드 생장력") 한 개이상의 외래도입유전자에 의해 부여되는 원하는 성질을 가지는 식물을 만들 수 있다.

실시예 13

표식이 지원하는 선별

유전자 표식을 이용하여 한 개 유전적인 배경으로부터 다른 것으로 본 발명의 한 가지 이상의 외래도입유전자를 유입시키는 것을 지원할 수 있다. 표식 지원된 선별로 통상적인 육종에 비하여 장점을 가질 수 있는데, 이는 표현형 변화에 의한 오류를 피할 수 있다. 또한, 유전적인 표식은 특정 교배의 개별 후손에 있는 우수한 생식세포질의 상대적인 정도에 대한 데이터를 제공한다. 예를 들면, 비-농경적으로 바람직한 유전적인 배경을 가지는 원하는 형질의 식물을 우수한 부모와 교배하는 경우에, 유전자 표식을 이용하여 관심이 되는 형질을 가지고, 원하는 생식세포질을 상대적으로 많이 가지는 후손을 선별할 수 있다. 이와 같은 방식에서 한 가지 이상의 형질을 특정 유전적인 배경으로 유입시키는데 요구되는 세대수를 최소화시킬 수 있다.

표식 지원된 육종의 과정에서, DNA 서열을 이용하여 원하는 농경적인 형질을 가져올 수 있다(Tanksley et al., 1989). 다음과 같이 표식 지원된 육종을 실시한다. 원하는 형질을 가지는 식물의 씨를 온실 또는 들에 있는 토양으로 옮긴다. 잎 조직을 임의 생장점에서 DNA를 준비하기 위해 식물에서 수확하는데 식물의 생존능력에 손상을 주지 않고, 식물에서 약 1g의 잎 조직을 회수한다. Shure et al.(1983)에서 설명하는 과정을 변형시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 묘목의 잎 조직 약 1g을 하룻밤동안 15㎖ 폴리프로필렌 튜브에서 얼린다. 냉동-건조된 조직을 유리막대를 이용하여 튜브안에서 빻는다. 분말로된 조직을 3㎖ 추출 완충액(7.0 요소, 0.35M NaCl, 0.05M Tris-HCl pH 8.0, 0.01M EDTA, 1% 사르코신)에 완전하게 혼합한다. 조직/완충액 균질물은 3㎖ 페놀/클로로포름으로 추출한다. 수용상은 원심분리로 분리시키고, 1/10 용적의 4.4M 아세테이트암모니움(pH5.2) 및 동량의 이소프로판올을 이용하여 2회 침전시켰다. 침전물은 75% 에탄올로 세척시키고, 100-500㎕ TE(0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA, pH 8.0)

게놈 DNA를 3배 과량의 제한효소로 처리하고, 0.8% 아가로즈(FMC)를 통하여 전기영동시키고, Nytran(Schleicher and Schuell)으로 옮기는데(Southern, 1975), 이때 10X SCP(20 SCP: 2M NaCl, 0.6M EDTA 이나트륨)을 이용한다. 필터는 0.02M 6X SCP, 10% 황화덱스트란, 2% 사르코신, 500㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA, 무작위 프라이밍에 의해 만든³²P-라벨된 프로브로 선하이브리드시킨다(Feinberg ＆ Vogelstein, 1983). 하이브리드된 필터는 30분간 65℃에서 2X SCP, 1% SDS로 세척하고, Kodak XAR5 필름을 이용하여, 자가방사사진을 찍는다. 원하는 형질에 유전적으로 연결된 유전적인 다형성을 이용하여 원하는 형질의 유무를 예측할 수 있다.

당업자는 식물 조직으로부터 DNA를 분리시키기 위해 많은 다른 방법이 있고, 동일한 결과를 만들기 위해 서든 하이브리드 반응에 대한 많은 다른 프로토콜이 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 자가방사사진후에 방사능활성 프로브를 서든 블랏으로 제거하고 상이한 프로브로 다시 프로브시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 방식으로 식물에 있는 다양한 외래도입유전자 각각을 확인할 수 있다. 또한, 당업자는 원하는 부분에서 다형성인 임의 유전자 표식을 이용하여 형질의 유무를 확인하고, 이와 같은 정보가 표식에 지원을 받는 육종에 이용할 수 있다는 것도 인지할 것이다.

서든 블랏의 각 라인은 한 식물에서 분리된 DNA를 나타낸다. 동일한 게놈 DNA 블랏상에서 프로브로써 유전자 삽입 과정을 다수 이용하여, 각 식물의 삽입 과정 조성물을 결정할 수 있다. 식물의 표현형에 대해 특정 삽입 과정의 기여도간에 상관관계를 확립할 수 있다. 원하는 복합 삽입과정을 포함하는 식물만이 성숙하게 되고, 이를 수분에 이용한다. 특정 외래도입유전자 삽입 과정에 상응하는 DNA 프로브가 식물 육종 과정동안에 유용한 표식이 되어 식물을 생장시키지 않고, 농경을 위한 식물을 검사할 필요없이, 특정 삽입과정을 확인하고 복합시킬 수 있다.

한가지 이상의 제한효소를 이용하여 1회 또는 복합하여 게놈 DNA를 절단할 수 있을 것이다. 당업자는 많은 다른 제한효소가 유용하고, 제한효소 선별은 프로브로 이용할 수 있는 외래도입유전자 삽입 과정의 DNA 서열 및 외래도입유전자 주변의 게놈에 있는 DNA 서열에 따라 달라진다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 프로브의 경우에, 형질변환에 이용되는 DNA에 하이브리드되는 DNA 또는 RNA 서열을 이용할 수 있다. 외래도입유전자 삽입 과정으로 확인가능한 하이브리드반응 후에 DNA 단편을 생산하는 제한효소를 선별한다. 따라서, 특정 유용한 제한효소는 원하는 형질 또는 특정 외래도입유전자에 유전적으로 연결된 다형성을 나타내는 것이 된다.

실시예 14

일반적인 검사 방법.

형질변환된 식물의 DNA 분석은 다음과 같이 실행하였다. 게놈 DNA는 Shure, et al., 1983에서 설명하는 과정을 변형시켜 분리시킬 수 있다. 약 1mg의 유합조직 또는 잎 조직을 빻아서, 액화질소하에서 미소 분말을 만드는데, 이때 몰라트 및 절구를 이용한다. 분말된 조직은 4㎖ 추출 완충액(7.0M 요소, 0.35M NaCl, 0.05M Tris-HCl pH 8.0, 0.01 M EDTA, 1%)으로 혼합한다. 조직/완충액 균질화물은 4㎖ 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 수용상은 원심분리에 의해 분리시키고, Miracloth를 통하여 통과시키고, 1/10 용적의 4.4M 아세테이트 암모니움(pH5.2), 동량의 이소프로판올을 이용하여 2회 침전시킨다. 침전물은 70% 에탄올로 세척시키고, 200-500㎖ TE(0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA, pH 8.0)에 재현탁시킨다.

형질변환된 세포에 있는 DNA 서열의 존재는 폴리메라제 사슬 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 감지할 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하여, 특정 DNA 단편을 증폭시키고, 아가로즈 겔 전기영동후에 감지할 수 있다. 예를 들면, 200 내지 1000ng 게놈 DNA를 반응 혼합물(10mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl₂, 50mM KCl, 0.1㎎/㎖ 젤라틴, 200μM 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0.5μM 각 전방 및 역 DNA 프라이머, 20% 글리세롤, 2.5unit Taq DNA 폴리메라제를 포함)에 첨가한다. 반응은 다음과 같이 열 주기 기계를 이용하여 실시한다; 94℃에서 3분, 94℃에서 1분, 5oeh에서 1분, 72℃에서 30초 주기를 39회 반복한 후, 72℃에서 5분. 각 반응 혼합물 20㎕를 3.5% NuSieve 겔에서 TBE 완충액(90mM Tris-borate, 2 mM EDTA)를 이용하여 50V에서 실시한다. 이 과정을 이용하여, 전방 프라이머CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC(SEQ ID NO:20) 및 역방 프라이머AAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGA(SEQ ID NO:21)를 이용하여, bar유전자가 존재하는 지를 감지할 수 있다.

포스피노트리신 아세틸 전이효소(PAT)가 존재하는 지를 감지하는 방법은 in vitro 효소 반응 및 TLC(WO 95/06128에서 설명)를 이용하는 것이다. 형질변환된 세포의 균질화물 및 형질변환되거나 비알포스 선별에 노출된 적이 없는 기준 세포에서 다양한 단백질 추출물을 준비하고, PPT 및¹⁴C-아세틸 Coenyme A로 배양하고, TLC를 하여 이 과정을 실행한다. 이 검사 결과에서는 PAT를 코드하는 bar유전자의 발현이 되었는지를 확인시켜주는 것이다.

서든 블랏 분석을 위해 게놈 DNA를 3배 과량의 제한효소로 처리하고, 0.8% 아가로즈(FMC)를 통하여 전기영동시키고, Nytran(Schleicher and Schuell)으로 20X SCP(20X SCP: 2M NaCl, 0.6M 이인산나트륨, 0.02M EDTA 이나트륨)을 이용하여 옮긴다. 프로브는³²P로 라벨시키는데, 이때는 무작위 프라이밍 방법을 이용한다(Boehringer Mannheim). 그리고 Quik-Sep^??스핀 컬럼(Isolab Inc., Akron, OH)을 이용하여 정제하였다. 필터는 65℃에서 6X SCP, 10% 황화덱스트란, 2% 사르코신, 500㎍/㎖ 헤파린에서 15분간 선하이브리드시킨다(Chomet et al., 1987). 그 다음 필터는 65℃에서 6X SCP(100㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA,³²P-라벨된 프로브를 포함)에서 하룻밤동안 하이브리드시킨다. 필터는 2X SCP, 1% SDS에서 30분간 65℃에서 세척하고, Kodak XAR5 필름을 이용하여 자가방사사진을 찍는다. 재하이브리드 반응을 위해, 필터를 10분간 증류된 H₂O에서 가열시켜, 제 1 프로브를 제거하고 상기에서 설명하는 것과 같이 선하이브리드시킨다.

실시예 15

형질변환된 곡식의 용도

식물 형질변환의 최종 목표는 인간에게 유용한 식물을 만드는 것이다. 이에 대해, 본 발명에 따라 창조된 형질변환된 식물을 생산자 또는 소비자에 가치있는 것으로 간주되는 것을 위해 이용할 수 있다. 예를 들면, 형질변환된 식물에서 씨를 수확하기를 원할 수 있다. 이 씨를 다시 다양한 목적에 이용할 수 있다. 씨는 들에 식물을 기르기 위해 농부에게 팔릴 수 있거나 동물 또는 인간에 음식으로 바로 시판될 수 있다. 또는, 씨 자체에서 생성물을 만들 수 있다. 씨로부터 만들 수 있는 산물에는 오일, 전분, 동물 및 인간의 음식, 약품 및 다양한 산업적인 생성물등이 포함된다. 옥수수 낟알을 인간이 소비하는 것에 추가하여, 옥수수의 식용에는 건식 및 습식 제분 산업이 포함된다. 옥수수 건식 제분의 주요 상품은 밀, 거친 가루 및 소맥분등이 된다. 옥수수의 습식-제분 산업으로 옥수수 전분, 옥수수 시럽, 식용 덱스트로즈를 제공할 수 있다. 옥수수 배로부터 옥수수 오일을 회수할 수 있는데, 이는 건식 및 습식-제분 산업의 부산물이다.

식물의 곡류 및 비-곡류 부분을 포함하는 옥수수는 가축류의 사료, 주로 식용소, 젖소, 돼지 또는 가금류의 사료로 광범위하게 이용된다. 옥수수의 산업적인 용도에는 습식-제분 산업에서 에탄올 및 옥수수 전분을 생산하는 것과 건식-제분 산업에서는 옥수수 소맥분을 제공하는 것이다. 옥수수 전분 및 소맥분의 산업상의 용도는 점도, 필름 형성, 접착성, 입자를 현탁시키는 능력등과 같은 기능성적인 성질에 기초한다. 옥수수 전분 및 소맥문은 종이 및 직물 산업에서도 이용할 수 있다. 다른 산업상의 용도에는 접착제, 건축재료, 주물 결합체, 세탁용 전분, 폭발물, 유정 머드, 다른 채광분야등이 포함된다. 옥수수 낟알이외의 다른 부분도 산업상에 이용할 수 있는데, 예를 들면 옥수수 줄기 및 껍질로 종이, 벽판을 만들고, 옥수수 속은 연료로 이용되거나 목탄을 만드는데 이용할 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 식물을 이용하는 다른 수단도 공지된 것으로 본 발명의 명세서로부터 당업자가 잘 인지할 수 있을 것이다. 곡식을 이용하는 특정 방법은 Sprague and Dudley(1988) 및 Watson and Ramstad(1987)에서 잘 설명하고 있다.

본 발명에서 설명하는 모든 조성물 및 방법은 본 명세서에 내용에 기초하여 과도한 실험없이 만들고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 적절한 구체예로 설명한 것으로 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 단계 또는 순서에서 다양한 변화를 실시할 수 있을 것이다. 특히 여기에서 설명하는 물질은 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 물질과 대체하여 유사한 또는 동일한 결과를 얻을 수 있을 것이다.

Claims

선택된 유전자를 발현시키는 Coix이외의 단자엽 식물을 준비하는 방법에 있어서,

(a) 선별된 유전자를 제공하고;

(b) Coix 프로모터에 작동가능하도록 연결된 유전자로 구성된 구조체를 준비하고;

(c) Coix이외의 단자엽 식물의 수용 세포를 (b)의 구조체로 형질변환시키고;

(d) 수용 세포에서 선별된 유전자가 발현된 단자엽 식물을 재생시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 단자엽 식물은 쌀, 밀, 귀리, 보리, 호밀, 사탕수수, 옥수수에서 선택된 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 단자엽 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 형질변환 단계는 미소 투사물 포격, PEG 중개된 원형질 형질변환, 전기천공, 탄화실리콘 섬유 중개된 형질변환 또는 Agrobacterium-중개된 형질변환등으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 미소 투하물 포격은 미소투하물에 상기 구조체로 구성된 DNA를 피복시키고, 수용 세포와 미소투하물을 접촉시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 선별된 유전자는 곤충 저항성 유전자, 곰팡이 질병 저항성 유전자, 바이러스성 질병 저항성 유전자, 박테리아성 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 진균독소 감소 유전자, 수컷 불임성 유전자, 선택성 표식 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등에서 선택된 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, Coix 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70, 올레오신등에서 선택된 유전자에 상동성인 Coix 유전자에서 취한 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, Coix 프로모터는 감마 코익신 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
후손을 생산하는 방법에 있어서,

(a) 제 1 항의 방법에 따른 단자엽 식물을 준비하고; 그리고

(b) 식물과 제 2의 식물 또는 자체와 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
식물 육종 방법에 있어서,

(a) 제 9 항의 방법에 따른 단자엽 식물을 준비하고; 그리고

(b) 식물과 제 2의 식물 또는 자체와 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
Coix이외의 단자엽 식물에서 유전자 침묵을 예방하는 방법에 있어서,

(a) Coix 프로모터를 제공하고;

(b) Coix 프로모터에 작동가능하도록 연결된 선별된 유전자로 구성된 구조체를 준비하고;

(c) Coix이외의 단자엽 식물의 수용 세포를 (b)의 구조체로 형질변환시키고;

(d) 수용 세포에서 선별된 유전자가 발현된 단자엽 식물을 재생시켜, 식물이 유전자 침묵을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 단자엽 식물은 쌀, 밀, 귀리, 보리, 호밀, 사탕수수, 옥수수에서 선택된 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 단자엽 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 형질변환 단계는 미소 투사물 포격, PEG 중개된 원형질 형질변환, 전기천공, 탄화실리콘 섬유 중개된 형질변환 또는 Agrobacterium-중개된 형질변환등으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 미소 투하물 포격은 미소투하물에 상기 구조체로 구성된 DNA를 피복시키고, 수용 세포와 미소투하물을 접촉시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 선별된 유전자는 곤충 저항성 유전자, 곰팡이 질병 저항성 유전자, 바이러스성 질병 저항성 유전자, 박테리아성 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 진균독소 감소 유전자, 수컷 불임성 유전자, 선택성 표식 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등에서 선택된 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, Coix 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70, 올레오신등에서 선택된 유전자에 상동성인 Coix 유전자에서 취한 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, Coix이외의 다른 단자엽 종의 유전자로부터 DNA 또는 이에 측면 서열에서 Coix얻은 DNA에 하이브리드시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, Coix 이외의 단자엽 종과 Coix 이외의 단자엽 식물은 동일한 종 구성원인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, Coix에서 얻은 DNA는 게놈 DNA 클론 라이브러리로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, Coix 프로모터를 제공하는 단계는 PCR^TM으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
후손을 생산하는 방법에 있어서,

(a) 제 11 항의 방법에 따른 단자엽 식물을 준비하고; 그리고

(b) 식물과 제 2의 식물 또는 자체와 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
식물 육종 방법에 있어서,

(a) 제 22 항의 방법에 따른 단자엽 식물을 준비하고; 그리고

(b) 식물과 제 2의 식물 또는 자체와 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
단자엽 발현 벡터를 준비하는 방법에 있어서,

(a) Coix이외의 단자엽으로부터 원하는 발현 프로파일을 가지는 제 1 프로모터를 확인하고;

(b) 제 1 프로모터에 상동성인 Coix 프로모터를 분리시키고;

(c) 선별된 유전자에 작동가능하도록 연결된 Coix 프로모터로 구성된 발현 벡터를 작제하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 단자엽 식물은 쌀, 밀, 귀리, 보리, 호밀, 사탕수수, 옥수수에서 선택된 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 단자엽 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 선별된 유전자는 곤충 저항성 유전자, 곰팡이 질병 저항성 유전자, 바이러스성 질병 저항성 유전자, 박테리아성 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 진균독소 감소 유전자, 수컷 불임성 유전자, 선택성 표식 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등에서 선택된 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, Coix 프로모터는 감마 제인, 올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70, 올레오신등에서 선택된 유전자에 상동성인 Coix 유전자에서 취한 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, Coix이외의 다른 단자엽 종의 유전자로부터 DNA 또는 이에 측면 서열에서 Coix얻은 DNA에 하이브리드시키는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, Coix에서 얻은 DNA는 게놈 DNA 클론 라이브러리로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, Coix 프로모터를 제공하는 단계는 PCR^TM으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
SEQ ID NO:8의 핵산 서열에서 분리가능한 감마 코익신 프로모터.
SEQ ID NO:8의 약 40 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 33 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 약 222 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 34 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 35 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 약 412 내지 약 894개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 36 항에 있어서, SEQ ID NO:19의 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
SEQ ID NO:11의 핵산 서열에서 분리가능한 감마 코익신 종료물질.
SEQ ID NO:11의 약 80 내지 약 412개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 39 항에 있어서, SEQ ID NO:11의 약 200 내지 약 412개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 40 항에 있어서, SEQ ID NO:11의 약 325 내지 약 412개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 41 항에 있어서, SEQ ID NO:11의 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
SEQ ID NO:17의 핵산 서열에서 분리가능한 Coix 올레오신 3 종료물질.
SEQ ID NO:17의 약 50 내지 약 377개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 44 항에 있어서, SEQ ID NO:17의 약 120 내지 약 377개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 44 항에 있어서, SEQ ID NO:17의 약 220 내지 약 377개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 46 항에 있어서, SEQ ID NO:17의 약 300 내지 약 377개의 연속하는 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
제 47 항에 있어서, SEQ ID NO:17의 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
선별된 DNA로 구성된 수정가능한 형질변환된 식물에 있어서, 선별된 DNA는 감마 코익신 프로모터로 구성된 것을 특징으로 하는 수정가능한 형질변환된 식물.
제 49 항에 있어서, 프로모터는 제 32 항의 핵산 서열, 제 33 항의 핵산 서열, 제 34 항의 핵산 서열, 제 35 항의 핵산서열, 제 36 항의 핵산서열로 구성된 집단에서 선택된 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 식물.
제 50 항에 있어서, 선별된 유전자는 곤충 저항성 유전자, 질병 저항성 유전자, 살충제 저항성 유전자, 곡식 조성물 또는 품질에 영향을 주는 유전자, 영양소를 이용하는 유전자, 진균독소 감소 유전자, 수컷 불임성 유전자, 선택성 표식 유전자, 스크리닝가능한 표식 유전자, 네가티브 선택성 표식 유전자, 식물의 농경 특징에 영향을 주는 유전자, 환경 또는 스트레스 저항성 유전자등에서 선택된 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 식물.
선별된 DNA로 구성된 수정가능한 형질변환된 식물에 있어서, 선별된 DNA는 감마 코익신 유전자에 고유한 것이 아닌 프로모터에 작동가능하도록 연결된 감마 코익신을 인코드하는 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 수정가능한 형질변환된 식물.
제 52 항에 있어서, 감마 코익신을 인코드하는 유전자는 SEQ ID NO:16의 핵산 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 식물.
선별된 DNA로 구성된 수정가능한 형질변환된 식물에 있어서, 선별된 DNA는 감마 코익신 종료물질로 구성된 것을 특징으로 하는 수정가능한 형질변환된 식물.
제 54 항에 있어서, 감마 코익신 종료물질은 제 39 항의 핵산 서열, 제 40 항의 핵산 서열, 제 41 항의 핵산 서열, 제 42 항의 핵산서열로 구성된 집단에서 선택된 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 식물.
선별된 DNA로 구성된 수정가능한 형질변환된 식물에 있어서, 선별된 DNA는 Coix 올레오신 3 종료물질로 구성된 것을 특징으로 하는 수정가능한 형질변환된 식물.
제 56 항에 있어서, 감마 코익신 종료물질은 제 44 항의 핵산 서열, 제 45 항의 핵산 서열, 제 46 항의 핵산 서열, 제 47 항의 핵산서열, 제 48 항의 핵산서열로 구성된 집단에서 선택된 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 식물.
제 49, 52, 54 또는 56항에 따른 식물의 임의 세대의 후손식물에 있어서, 후손 식물은 선별된 DNA로 구성된 것을 특징으로 하는 후손 식물.
제 49, 52, 54, 또는 56 항에 있어서, 식물은 쌀, 밀, 보리, 호밀, 사탕수수, 옥수수에서 선택된 단자엽식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 59 항에 있어서, 단자엽 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 식물.
제 49, 52, 54, 또는 56 항에 있어서, 식물은 담배, 토마토, 감자, 대두 및 목화에서 선택된 쌍자엽식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 49, 52, 54, 또는 56항에 따른 수정가능한 형질변환된 식물과 제 2 식물 또는 자체식물과 교배하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 식물 육종 방법.
올레오신 ole16, 글로블린1, 악틴1, 악틴 c1, 슈트로즈 합성효소, INOPS, EMB5, 글로블린2, b-32, ADPG-피로포스포릴라제, Ltp1, Ltp2, 올레오신 ole17, 올레오신 ole18, 악틴2, 화분 특이적인 단백질, 화분 특이적인 펙테이트 용해효소, 꽃밥 특이적인 단백질, 꽃밥 특이적인 유전자 RTS2, 화분 특이적인 유전자, 융단조직 특이적인 유전자 RAB24, 안트라닐레이트 합성효소 알파 소단위, 알파 제인, 안트라닐레이트 합성효소 베타 소단위, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소, Thi1, 알코올 디하이드로게나제, cab 결합 단백질, H3C4, RUBISCO SS 전분 분지화 효소, ACCase, 악틴3, 악틴7, 조절 단백질 GF'14-12, 리보좀성 단백질 L9, 셀롤로오즈 생합성 효소, S-아데노실-L-호모시스테인 하이드로라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-카이나제 수용체, 포스포글리세레이트 뮤타제, 뿌리-특이저인 RCc3 mRNA, 포도당-6-인산염 이소메라제, 피로포스페이트-퓨락토즈 6-포스페이트1포스포트란스퍼라제, 유비퀴논, 베타-케토아실-ACP 합성효소, 33kDa 포토시스템 II, 산소 방출 단백질, 69kDa 공포 ATPase 소단위, 메탈로티오넨형 단백질, 글리세르알데히드-3-인산염 디하이드로게나제, ABA- 및 원숙 유도성 유사 단백질, 페닐알라닌 암모니아 용해효소, 아데노신 삼인산염 S-아데노실-L-호모시스테인 하이드라제, α-튜블린, cab, PEPCase, R, 렉틴, 광 수확 복합체, 열 쇼크 단백질, 찰콘 합성효소, 제인, 글로블린-1, 옥신-결합 단백질, UDP 글루코즈 플라보노이드 글리코실-전이효소 유전자, MPI, 올레오신, 악틴, 오파크 2, b70에서 선택된 Coix 유전자를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.