MXPA00011199A - Metodos y composiciones para la expresion de transgenes en plan - Google Patents

Metodos y composiciones para la expresion de transgenes en plan

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la expresión de transgenes en planta monocotiledóneas, incluyendo maíz. En la invención, se evita el silenciamiento de genes mediante el uso de secuencias homólogas de plantas monocotiledóneas del género Coix para la transformación. En estas secuencias de transgenes se incluyen promotores, potenciadores, secuencias de codificación y terminadores de Coix. Es conveniente contar con alternativas de transgenes derivados de maíz para su expresión en maíz por cuanto el silenciamiento de genes basado en homologías puede limitar o eliminar de forma efectiva la expresión transgéni

Description

ÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA EXPRESIÓN DE TRANSGENES EN PLANTAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona en general con plantas transgénicas. Más específicamente, se relaciona con métodos y composiciones que expresan transgenes en plantas.
DESCRIPCIÓN DE LA T CNICA ANTERIOR Los avances recientes en la biología molecular han mejorado dramáticamente la capacidad de los científicos para manipular el germoplasma de animales y plantas. Se han localizado genes que controlan fenotipos específicos, por ejemplo, polipéptidos particulares que proveen resistencia a insectos, antibióticos y herbicidas, dentro de algunos germoplasmas y luego se aislaron a partir de los mismos. Aún más importante ha sido la capacidad de tomar los genes aislados de un organismo e introducirlos en otro organismo. Esta transformación se puede llevar a cabo aún cuando el organismo pertenece a un filum, a géneros o a especies diferentes del taxon del organismo que donó el gen (transformación heterologa) Se ha intentado manipular genéticamente las características deseadas en los genomas vegetales por medio de la introducción de genes exógenos utilizando una cantidad de técnicas de ingeniería genética La captación de ADN nuevo por parte de células vegetales receptoras se ha efectuado por medios que incluyen infección por Agrobacterium (Nester er al , 1984), captación de ADN mediada por po etileng col (PEG) (Lorz eí al , 1985), electroporación de protoplastos (From er al , 1986) y bombardeo con micropartículas (Klein et al , 1987) En tanto algunas de las técnicas mencionadas anteriormente han convertido a la transformación de plantas casi en una rutina, la expresión de ADN exógeno ha sido más dificultosa Uno de los problemas más senos que surgieron es un fenómeno conocido como "co-supresión" Este término fue acuñado para describir la inhibición de la expresión génica de un gen endógeno después de la introducción de un transgen homólogo (Jorgensen, 1990) y se describió por primera vez para el gen de la chalcona smtetasa (CHS) en Petunia (Napo et al , 1990, Van der Krol ef al , 1990) La co-supresion no es exclusiva de la CHS, no obstante, y parece ser un fenómeno general que afecta a las plantas transgénicas El grado de co-supresión varía para los transformantes individuales, pero en algunas plantas, se puede producir hasta tal grado que se obtiene un fenotipo nulo para los locí involucrados Numerosos sistemas de plantas transgenicas exhiben el fenómeno conocido como "silenciamiento de genes" dependiente de homología, que puede comprender múltiples copias de transgenes por lo menos parcialmente homólogos o bien, un transgen y una secuencia endógena homologa (Jorgensen, 1995, Matzke y Matzke, 1995, Meyer, 1995) La característica mecanicista fundamental que distingue los diversos casos de silenciamiento es si la inactivación observada tiene lugar a nivel de transcripción o post-transcnpción y esto se determina a su vez por la región de homología entre las secuencias que mteractuan El silenciamiento de la transcripción tiene lugar en gran parte como resultado de homología de promotores (Neuhuber ef al , 1994) El silenciamiento de genes promotores dependiente de homología interfiere con la transcripción, y a veces provoca paramutaciones, lo cual conduce a cambios heredables en la expresión génica y/o modificaciones de ADN que persisten después de la segregación del transgen (Lmdbo ef al , 1993, Jorgensen, 1995, Matzke y Matzke, 1995, Park ef al , 1996) La causa de dichos cambios en la expresión génica no está bien comprendida, pero se sabe que el silenciamiento está influenciado por la longitud de la homología y por la posición de las secuencias que interactúan En el caso del promotor de la nopalma sintetasa, se encontró que era suficiente una región de homología de 300 bp para mediar la cosupresión en tabaco (Matzke ef al , 1993) También se encontró que una secuencia endógena conocida como H2, que presenta homología con el promotor de la nopalma sintetasa, es un potente silenciador de genes dirigido por ei promotor de la nopalina sintetasa (Matzke et al , 1993, Matzke ef al , 1994) Se cree que esto involucra el apareamiento de copias del promotor de la nopalina sintetasa en los locí de silenciamiento y blancos, seguido de una imposición de metilacion sobre la copia blanco hasta un grado similar al adquirido de forma autónoma por el silenciador (Matzke ef al , 1994) El ejemplo más eficiente de cosupresión es una linea de tabaco que lleva un inserto transgénico con dos genes dirigidos por el promotor 19S y 35S de CaMV, respectivamente Ambos genes ligados a los dos promotores son suprimidos y este locus inactiva en frans a las construcciones recientemente introducidas que proveen por lo menos 90 bp de homología en común (Vaucheret, 1993) El silenciamiento de la transcripción resulta particularmente dificultoso para los biotecnólogos de la agricultura, por cuanto muchos de los promotores de mayor utilidad para la expresión de un transgen particular son nativos del genoma huésped Esto se cumple especialmente para uno de los cultivos más importantes de la agricultura, el maíz Los ejemplos de diversos promotores de maíz con perfiles de expresión convenientes incluyen promotores casi constitutivos de maíz, tales como los de los genes Adh y de la sacarosa sintetasa (Walker ef al , 1987, Yang y Russell, 1990), promotores específicos de tejidos, tal como los promotores de zeína y del complejo cosechador de luz de maíz (Conk ng ef al , 1990, Simpson, 1986) y promotores mducibles, tal como el de la proteína del shock de calor de maíz (Odell ef a/ , 1985) Persiste, por lo tanto, una necesidad en el arte de métodos mejorados para lograr la expresión de genes endógenos en plantas y, particularmente, en plantas monocotiledoneas de importancia agronómica, tal como el maíz En particular, se necesitan métodos que permitan que los científicos exploten las características deseables de los promotores de monocotiledóneas, evitando al mismo tiempo los problemas asociados con la cosupresión de secuencias homologas Actualmente, la tecnología está limitada en este sentido por la falta de alternativas adecuadas de promotores que son nativos de especies monocotiledóneas de importancia agronómica BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Por ello, un aspecto de la presente invención provee un método para expresar un gen en una planta monocotiledónea que comprende los pasos de (a) proveer un gen seleccionado, (b) preparar una construcción que contenga a dicho gen ligado operativamente a un promotor Coix, (c) transformar células monocotiledoneas receptoras con dicha construcción, y (d) regenerar una planta monocotiledónea que exprese dicho gen En realizaciones particulares de la invención la planta monocotiledónea es una planta seleccionada del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz El paso de transformación puede comprender cualquier método capaz de transformar una planta de forma estable incluyendo, por ejemplo, bombardeo con microparticulas, transformación de protoplastos mediada por PEG, electroporacion, transformación mediada por fibras de carburo de silicio o transformación mediada por Agrobactenum En una realización preferida de la invención, el paso de transformación comprende el bombardeo con micropartículas recubriendo microproyectiles con ADN que contiene a la construcción y poniendo las células receptoras en contacto con los microproyectiles El gen puede ser potencialmente cualquier gen que se quiera expresar en plantas transgenicas, incluyendo un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador rastreable, un gen marcador de selección negativa, un gen que afecta las características agronómicas de una planta o un gen de resistencia al estrés o al entorno En realizaciones particulares de la invención, el promotor Coix es el promotor de un gen seleccionado del grupo formado por gamma-zema, oleosina ole16, glubulinal , actinal , actina d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globul?na2, b-32, ADPG-pirofosfoplasa, Ltp1 , Ltp2, oleosma ole17, oleosina ole18, act?na2, proteína específica del polen, pectato asa especifica del polen, proteína especifica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen especifico de polen, gen específico del tapete, gen RAB24 específico del tapete, subunidad alfa de la antranilato smtetasa, alfa-zeina, subunidad beta de la antranilato smtetasa, dihidrodipicolmato smtetasa, Th?1 , alcohol deshidrogenasa, proteina de unión a cab, H3C4, enzima ramificadora del almidón RUBISCO SS, ACCasa, act?na3 act?na7, protema reguladora GF 14-12, proteina ribosomica L9, enzima biosintetica de celulosa, S-adenosil-L-homocistein hidrolasa, superoxido dismutasa, Receptor de la C-qumasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm RCc3 especifico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoacil-ACP sintetasa, fotosistema II de 33 kDa, proteina que libera oxigeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 kDa, proteina tipo metalotionema, gl?ceraldeh?do-3-fosfato deshidrogenasa, ABA- y protema tipo inductor de la maduración, femlalaninamoniaco liasa, adenosintpfosfatasa S-adenosil-L-homocistem hidrolasa a-tubulina, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteina de shock de calor, chalcona sintetasa, zema, globul?na-1 , proteina ligadora de auxina, gen de la UDL-glucosa flavonoide glicosil-transferesa, MPI oleosina actina, opaque 2 y b70 En una realización de la invención, el promotor Coix es un promotor de gamma-coixina En otro aspecto, la invención provee un método para producir una progenie que comprende los pasos de (a) preparar una planta monocotiledonea de acuerdo con los métodos descpptos anteriormente, y (b) cruzar la planta con una segunda planta o consigo misma En aun otro aspecto, la invención provee un método para criar plantas que comprende los pasos de (a) obtener una planta progenie de cualquier generación de una planta monocotiledónea preparada de acuerdo con los métodos descpptos antepormente, donde la planta progenie comprende dicha construcción, y (b) cruzar la planta consigo misma o con una segunda planta En aun otro aspecto más, la invención provee un método para impedir el silenciamiento de genes en una planta monocotiledónea que comprende los pasos de (a) identificar un promotor Coix que es homologo de un promotor de dicha planta monocotiledónea, (b) clonar dicho promotor Coix, (c) preparar una construcción que comprenda dicho promotor Coix ligada operativamente al gen seleccionado, (d) transformar una célula receptora de dicha monocotiledonea con dicha construcción, y (e) regenerar una planta que exprese dicho gen a partir de dicha célula receptora La planta monocotiledónea puede ser potencialmente cualquier planta monocotiledonea, incluyendo arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz En una realización de la invención, la monocotiledónea es maíz El paso de transformación puede comprender cualquier método adecuado para introducir ADN en un genoma vegetal, incluyendo bombardeo con microparticulas, transformación de protoplastos mediada por PEG, electroporacion, transformación mediada por fibras de carburo de silicio o transformación por Agrobacterium En una realización preferida de la invención, el paso de transformación comprende bombardeo con microparticulas por recubrimiento de microproyectiles con ADN que contiene dicha construcción y el contacto de dichas células receptoras con dichos microproyectiles El gen seleccionado puede incluir, por ejemplo, un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades (bacterianas, virales, fúngicas o por nematodes), un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de 5 nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un marcador de selección negativo, un gen que afecta las características agronómicas de una planta o un gen de resistencia al estrés o al entorno En una realización particular de la invención, el promotor proviene 10 de un gen seleccionada del grupo formado por gamma-zeína, oleosina ole16, globulmal , actinal , actina d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globul?na2, b-32, ADPG-pirofosfoplasa, Ltp1 , Ltp2, oleosina ole17, oleosina ole18, act?na2, proteína específica del polen, pectato liasa específica del polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen 15 específico de polen, gen específico del tapete, gen específico del tapete RAB24, subunidad alfa de la antranilato sintetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato sintetasa, dihidrodipicolinato sintetasa, Th?1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión a cab, H3C4, enzima ramrfícadora del almidón RUBISCO SS, ACCasa, act?na3, act?na7, proteína reguladora GF'14- 20 12, proteína pbosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L- homocisteín hidrolasa, superóxido dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfog cerato mutasa, ARNm RCc3 específico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, p?rofosfato-fructosa-6-fosfato-1 fosfotransferasa, ubiquitina, beta- cetoacil-ACP smtetasa, fotosistema II de 33 kDa, protema que libera oxigeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 kDa, protema tipo metalotioneina, gl?ceraldeh?do-3-fosfato deshidrogenasa ABA- y proteina tipo inductor de la maduración, fenilalanmamoniaco liasa, adenosintpfosfatasa S-adenosil-L-homocistein hidrolosa, a-tubuhna, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, protema de shock de calor, chalcona sintetasa, zeína, globul?na-1 , ABA, proteina hgadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide glicosil-transferasa, MPI, oleosina, actina, opaque 2, b70 y oleosina En realizaciones particulares de la invención, el paso de identificación comprende la hibpdizacion de ADN del promotor de monocotiledoneas, o secuencias flanqueadoras del mismo con ADN de Coix El ADN de Coix puede contener una biblioteca de clones de ADN genomico En otras realizaciones de la invención, el paso de identificación de un promotor Coix comprende PCR™ En aun otro aspecto mas, la invención provee un método para producir progenie que comprende los pasos de (a) preparar una planta monocotiledonea de acuerdo con los métodos descpptos anteriormente y (b) cruzar la planta con una segunda planta o consigo misma En aun otro aspecto mas, la invención provee un método para criar plantas que comprende los pasos de (a) obtener una planta progenie de cualquier generación de una planta monocotiledonea preparada de acuerdo con los métodos de la invención y (b) cruzar dicha planta consigo misma o con una segunda planta En aún otro aspecto mas, la invención provee un método para preparar un vector de expresión de maíz que comprende los pasos de (a) identificar un promotor de una monocotiledónea que posee un perfil de expresión conveniente, (b) aislar un promotor Coix que sea homologo de dicho promotor de maíz, y (c) construir un vector de expresión que contenga dicho promotor Coix ligado operativamente a un gen seleccionado En realizaciones particulares de la invención, la monocotiledónea se selecciona del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo, maíz En una realización preferida de la invención, la monocotiledónea es maíz En otras realizaciones de la invención, el gen seleccionado codifica una característica seleccionada del grupo formado por un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un marcador de selección negativo, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al entorno En otra realización de la invención, el promotor de la monocotiledónea es de un gen seleccionado del grupo formado por gamma-zeína, oleosina ole16, globulmal , actinal , actma d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globul?na2, b-32, ADPG-pirofosfonlasa, Ltp1 , Ltp2, oleosina ole17, oleosina ole18, act?na2, proteína específica del polen, pectato Nasa específica del polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen específico de polen, gen específico del tapete, gen específico del tapete RAB24, subunidad alfa de la antranilato sintetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato smtetasa, dihidrodipico nato sintetasa, Th?1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión de cab, H3C4, enzima ramificadora del almidón RUBISCO SS, ACCasa, act?na3, act?na7, proteína reguladora GF' 14-12, proteína pbosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, superóxido dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm RCc3 específico de raíz, glocosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoaceil-ACP sintetasa, fotosistema II de 33 kDa, proteína que libera oxígeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 kDa, proteína tipo metalotioneína, gl?ceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ABA- y proteina tipo inductor de la maduración, fenilalaninamoníaco liasa, adenosintpfosfatasa S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, a-tubulma, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteína de shock de calor, chalcona sintetasa, zeína, globul?na-1 , ABA, proteína gadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide ghcosil-transferasa, MPI, oleosina, actina, opaque 2, b70 y oleosina El paso de identificación, en una realización de la invención, comprende hibpdización de ADN de dicho gen de monocotiledónea, o secuencias flanqueadoras del mismo, con ADN de Coix, con lo cual el ADN de Coix puede contener una biblioteca de clones de ADN genomico En otra realización de la invención, el paso de identificar un promotor Coix comprende PCR™ Aun otro aspecto de la invención provee un promotor aislado de gamma-coixma, que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 8 La invención también provee una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 80 a 894 nucleotidos contiguos de la SEQ ID N° 8 En otra realización de la invención, la secuencia aislada de ácidos nucleicos comprende aproximadamente de 222 a 894 nucleotidos contiguos de la SEQ ID N° 8 y puede comprender ademas la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 18 La secuencia aislada de ácidos nucleicos también puede comprender aproximadamente de 412 a 894 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 8 y puede comprender adicionalmente la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N0 19 Aun otro aspecto de la invención provee un ADN aislado que codifica una proteina a un peptido gamma-coixina En realizaciones particulares de la invención el segmento de ADN codifica el pohpeptido codificado por la SEQ ID N° 16 El segmento de ADN también puede comprender aproximadamente de 100 a 603 o aproximadamente de 350 a 603 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 16 o puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 16 Aun otro aspecto de la invención provee un terminador aislado de gamma-coixina que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 El terminador de gamma-coixina también puede comprender aproximadamente de 80 a 412 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 En otras realizaciones de la invención, el terminador puede comprender aproximadamente de 200 a 412 o aproximadamente de 325 a 412 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 El terminador también puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 Aun otro aspecto de la invención provee un terminador Coix oleosina 3 que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 17 La invención también provee una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 50 a 377, aproximadamente de 120 a 377, aproximadamente de 220 a 377 o aproximadamente de 300 a 377 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos de la SEQ ID N° 17 En una realización de la invención, el acido nucleico comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 17 Aun otro aspecto de la invención provee una planta transgenica fértil que contiene el ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado comprende un promotor de gamma-coixina En realizaciones particulares de la invención, el promotor de gamma-coixina puede ser aislado de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 8 En otras realizaciones de la invención, el promotor comprende una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 80 a 894, aproximadamente de 222 a 894 o aproximadamente de 412 a 894 nucleotidos contiguos de la SEQ ID N° 8 En otras realizaciones adicionales de la invención, el promotor comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 8 la SEQ ID N° 18 o la SEQ ID N° 19 El promotor puede estar ligado operativamente a potencialmente cualquier gen exogeno, incluyendo un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un marcador de selección negativo, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al entorno Aun otro aspecto de la invención provee una planta transgenica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado comprende un gen que codifica gamma-coixina En realizaciones particulares de la invención, el gen que codifica gamma-corxina codifica el polipeptido codificado por la SEQ ID N° 16 En aun otras realizaciones de la invención, el gen que codifica gamma-coixina comprende aproximadamente de 100 a 603 o aproximadamente de 350 a 603 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 16 En otras realizaciones de la invención, el gen que codifica gamma-coixina comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 16 Aun otro aspecto de la invención provee una planta transgenica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado comprende un terminador de gamma-coixina En realizaciones particulares de la invención el terminador de gamma-coixina puede ser aislado de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 En otras realizaciones de la invención, el terminador de gamma-coixina comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 80 a 412, aproximadamente de 200 a 412 o aproximadamente de 325 a 412 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 En otras realizaciones de la invención, el terminador de gamma-coixina comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 11 Aun otro aspecto de la invención provee una planta transgenica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado comprende un terminador de Coix oleosina 3 En realizaciones particulares de la invención, el terminador de Coix oleosma 3 puede ser aislado de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 17 En otra realización de la invención, el terminador comprende aproximadamente de 50 a 377, aproximadamente de 120 a 377, aproximadamente de 220 a 377 o aproximadamente de 300 a 377 nucleotidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 17 En una realización de la invención, el terminador comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N° 17 Aún otro aspecto de la invención provee una planta progenie de cualquier generación de cualquiera de las plantas descritas anteriormente, donde la planta contiene dicho ADN seleccionado En realizaciones particulares de la invención, la planta es una planta monocotí ledónea seleccionada del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz En una realización de la invención, la monocotiledónea es maiz En otra realización de la invención, la planta es una planta dicotiledónea seleccionada del grupo formado por tabaco, tomate, papa, soja y algodón Aún otro aspecto de la invención provee un método para criar plantas que comprende cruzar una planta transgénica fértil de la invención, o una progenie transgénica de la misma que ha heredado un ADN exógeno de la invención, consigo misma o con una segunda planta BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención La invención se comprenderá mejor con referencia a una o más de estas figuras junto con la descripción detallada de las realizaciones específicas ofrecidas es este documento Figura 1 Mapa de plasmido pDPG844 El plasmido contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 894 bp del gen de la gamma-coixma (SEQ ID N° 8), la secuencia de codificación del gen informante GUS y el terminador nos Figura 2 mapa de plasmido pDPG845 La construcción contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 894 bp del gen de la gamma-coixma (SEQ ID N° 8), el mtronl de actinal de arroz, la secuencia de codificación del gen informante GUS y el terminador nos Figura 3 mapa del plasmido pDPG846 El plasmido contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 412 bp del gen de gamma-coixina (SEQ ID N° 19) el intronl de actinal de arroz, la secuencia de codificación del gen informante GUS y el terminador nos Figura 4 mapa del plasmido pDPG847 El plasmido contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 412 bp del gen de gamma-coixina (SEQ ID N° 19), la secuencia de codificación del gen informante GUS y el terminador nos Figura 5 mapa del plásmido PDPG848 El plásmido contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 222 bp del gen de gamma-coixma (SEQ ID N° 18), el mtrón de actinal de arroz, el gen informante GUS y el terminador nos Figura 6 mapa del plásmido PDPG849 El plásmido contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 222 bp del gen de gamma-coixma (SEQ ID N° 18), la secuencia de codificación del gen informante (GUS) y el terminador nos Figura 7 mapa del plásmido pDPG869 La construcción contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 894 bp del gen de la gamma-coixina (SEQ ID N° 8), el intrónl de actinal de arroz, la secuencia de codificación del gen de la gamma-coixma (SEQ ID N° 16) y el termmador de gamma-coixina (SQ ID N°, 11 ) Figuras 8-1 y 8-2 comparación de secuencias de regiones promotoras de cenes gue codifican oamma-prolamma de maíz, sorgo v Coix Los nucleótidos idénticos en tres secuencias se indican mediante un sombreado Las secuencias promotoras de maíz, Coix y sorgo están indicadas como gamma-zeína (SEQ ID N° 23), gamma-coixma (SQ ID N° 8) y gamma-kafipna (SEQ ID N° 22), respectivamente Figura 9 mapa del plásmido PDPG851 La construcción contiene un cásete de expresión que consta de un promotor de 894 bp del gen de la gamma-corxina (SQ ID N° 8), el intrónl actinal de arroz, la secuencia de codificación del gen de la gamma-coixina (SQ ID N° 16) y el term?nador nos Figura 10 mapa del plásmido pDPG862 La construcción contiene un cásete de expresión que consta de una secuencia promotora de 894 bp del gen de la gamma-coixina (SQ ID N° 8), el intronl de actinal de arroz, la secuencia de codificación del gen de la gamma-coixina (SQ ID N° 16) y el terminador nos F?gura 11 mapa del plasmido pDV108 La construcción contiene el terminador de gamma-coixma (SQ ID N° 11 ) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención supera las deficiencias del arte anterior mediante métodos para una expresión transgénica que elimina o disminuye el silenciamiento de genes La presente invención es significativa por cuanto provee promotores para la expresión de genes exogenos en monocotiledóneas, que presentan perfiles de expresión similares a los del genoma huésped, si bien son los suficientemente diferentes en cuanto a secuencia como para limitar el silenciamiento de genes En realizaciones de la invención, los promotores provistos por la invención pertenecen al género Coix Los promotores derivados de Coix serán de especial utilidad en maíz, asi como en otras monocotiledoneas, tal como trigo, arroz, cebada, centeno, sorgo y caña de azúcar, y también en especies de dicotiledóneas El fenómeno de silenciamiento de genes, que también se ha denominado co-supresion, supresión en el sentido del marco de lectura y co-supresión en el sentido del marco de lectura, es la disminución o eliminación de la expresión genica mediante la introducción de secuencias que poseen copias homologas nativas (Napoli et al , 1990, Van der Krol et al , 1990) El silenciamiento de genes puede actuar en regiones reguladoras y/o codificadoras de un transgen y frecuentemente es asociado con la metilacion de la región silenciada En el campo de la biotecnología agronómica, el silenciamiento de regiones reguladoras resulta especialmente problemático por cuanto muchos promotores endógenos presentan características que son de particular utilidad para la expresión transgenica Los inventores consideran específicamente que la utilidad de la presente invención se puede extender a la creación de vectores de expresión que comprendan elementos de Coix además de los promotores En particular, se considera que se puede evitar la prevención del silenciamiento de genes y otros problemas asociados con la homología entre los elementos del transgen y las secuencias nativas mediante el uso de secuencias Coix en los transgenes expresados en monocotiledóneas distintas de Coix Por ejemplo, las regiones de codificación homologas de genes de maíz se podrían expresar de forma eficiente en maíz, en tanto el gen nativo de maíz podría ser silenciado También se consideran de especial utilidad los elementos potenciadores y terminadores de Coix I Promotores que se pueden utilizar con la invención La presente invención abarca el uso de promotores del género Coix para la expresión de un gen exógeno en monocotiledóneas, tal como maíz Dichos promotores pueden ser aislados de novo a partir de Coix o, como alternativa, pueden ser aislados sobre la base de la información genética de promotores de monocotiledóneas conocidos Un medio particularmente eficiente contemplado por el inventor para la identificación de promotores de Coix comprende el uso de cebadores o sondas derivados de genes o promotores de maíz para aislar secuencias homologas a partir de Coix (I) Eiemplos de promotores Los promotores que son de utilidad incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos como describe (Poszkowski et al , 1989, Odell et al,, 1985), regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados esapacio-temporalmente (Chau et al , 1989) El promotor se selecciona por su capacidad para dirigir la actividad de transcripción de la región de codificación de las células vegetales transformadas o de la planta transgenica Algunos ejemplos de secuencias de maíz que se consideran de especial utilidad para el aislamiento de promotores de Coix incluyen los de Adh (Walker ef al , 1987, Paul y Ferl, 1991 , GenBank, N° de Acceso S45022), sacarosa sintetasa (Yang & Russell, 1990), cab (Sullivan ef al , 1989, GenBank, N° de Acceso X14794), PEPCasa (Hudspeth & Gruía, 1989, Yanagisawa y Izuí, 1989, GenBank, N°s de Acceso X14579, X14581 , X14580) y genes asociados al complejo del gen R (Chandler et al , 1989, Consonni et al , 1993, GenBank, N° de Acceso X67619, Radicella et al , 1991 , GenBank, N°s de Acceso X57276, S48027) Las secuencias de otras monocotiledoneas, por ejemplo, el promotor de actina de arroz (GenBank, N° de Acceso S44221 ), también pueden ser de utilidad Los ejemplos de genes para el aislamiento de promotores específicos de tejidos son el gen de la sacarosa sintetasa 1 de maíz (Yang ef al 1990), el alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Vogel ef al , 1989, Dennis ef al , 1984, GenBank, N°s de Acceso X04049, X00581 ), el complejo cosechador de luz de maíz (Simpson, 1986, Bansal ef al , 1992, GenBank, N° de Acceso M87020), la proteina de shock de calor de maíz (Odell ef al , 1985, Rochester ef al , 1986 GenBank, N° de Acceso X03714), la zeina de maíz (Reina ef al , 1990, GenBank, N° de Acceso X53514, Kpz et al , 1987, GenBank, N° de Acceso X05911 , Wandelt y Feíx, 1989, GenBank, N° de Acceso X14334, Langpdge y Feíx, 1983, GenBank, N° de Acceso K00543, Rema et al , 1990, GenBank, H° de Acceso X53515), la globul?na-1 (Belanger y Kpz ef al , 1991 , GenBank, N°s de Acceso L22344, L22295) y los genes de la chalcona smtetasa (Franken et al , 1991 , GenBank, N° de Acceso X60204) Otras secuencias de maíz similarmente conocidas incluyen los promotores de células de raíz (Conk ng ef al , 1990) y los potenciadores específicos de tejidos (Fro n ef al , 1989) Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los promotores inducibles con ABA y turgor y el promotor del gen de la proteina gadora de auxina (Scwob ef al , 1993, GenBank, N° de Acceso L08425) Aun otras secuencias de maíz conocidas que se pueden utilizar para aislar promotores heterologos incluyen el gen de la UDP-glucosa flavonoide ghcosil-transferesa (Ralston ef al , 1988, GenBank, N°s de Acceso X07940, Y00616), el gen del inhibidor de proteinasa MPI (Cordero ef al , 1994, GenBank, N° de Acceso X78988), el gen de la gl?ceraldeh?do-3-fosfato deshidrogenasa (GenBank, N° de Acceso U45859, Kohier et al , 1995, GenBank, N° de Acceso L40803, Quigley eí al 1989, GenBank, N° de Acceso X15408, Martínez ef al , 1989, GenBank, N° de Acceso X15596), asi como los de los genes de cloroplastos (GenBank, N° de Acceso X86563) Los ejemplos de elementos genéticos contemplados específicamente por los inventores de la invención para el aislamiento de secuencias Coix para su expresión en maíz y otras monocotiledoneas se enumeran a continuación, en el cuadro 1 Los inventores han utilizado una cantidad de estos elementos para la preparación de vectores de expresión, como se indica mas adelante CUADRO 1 Ejemplos de secuencias para el aislamiento de elementos genéticos de Coix a - el promotor indicado se utilizo para la transformación de maíz b - el potenciador mtrón indicador se utilizo para la transformación de maíz c - el promotor Coix fue aislado y usado para la transformación de maíz d - la secuencia de codificación de la protema Coix (CDS) fue aislada y usada para la transformación de maíz (n) Clonación de secuencias homologas de Coix Una parte de la presente invención comprende el aislamiento de regiones reguladoras del genero Coix mediante el uso de sondas o cebadores depvados de genes de maíz o secuencias flanqueadores de los mismos Las sondas o los cebadores pueden estar compuestos directamente por el ADN clonado de maíz o, como alternativa, se pueden preparar sintéticamente sobre la base de la secuencia de ADN Ademas, los promotores se pueden aislar usando secuencias que derivan de una especie distinta de maíz, pero que aún está cercanamente relacionada con maíz y Coix Otras especies que se consideran de particular utilidad para la identificación de promotores heterologos en Coix incluyen plantas monocotiledoneas tales como centeno, trigo, cebada, avena, sorgo, arroz y caña de azúcar El término cebador, tal como se define en este documento, pretende abarcar cualquier acido nucleico capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de templados Los cebadores son, típicamente, oligonucleotidos de diez a veinte pares de bases de longitud, pero también se pueden emplear secuencias mas largas Los cebadores pueden encontrarse en la forma de cadena simple o de cadena doble, si bien se prefiere la forma de cadena simple Las sondas se definen de manera diferente, si bien pueden actuar como cebadores Las sondas, aunque quizás puedan actuar como cebadores, se diseñan para que se puedan unir al ADN o ARN blanco y no es necesario emplearlas en un proceso de amplificación En realizaciones preferidas, las sondas o los cebadores están marcados con especies radioactivas (32P, 4C, 35S, 3H u otra marca), con un fluoroforo (rodamina, fluoresceína), un antígeno (biotma, estreptavidma, digoxigenma) o un agente quimioiuminiscente (luciferasa) o por conjugación directa con enzimas (fosfatasa alcalina) Después de la preparación de las sondas o los cebadores, el ppmer paso en la clonación de promotores heterologos comprende típicamente la preparación y búsqueda de una biblioteca de clones apropiada, tal como, en este caso, una biblioteca de ADN genomico de Coix La búsqueda se puede basar en la hibndizacion de sondas de oligonucleótidos, diseñadas sobre la base de porciones de la secuencia promotora de maíz o a partir de secuencias de ADN del gen o de genes relacionados La operación de dichos protocolos de búsqueda es bien conocida por los especialistas en la técnica y se describen con detalle más adelante y en la literatura científica, por ejemplo, en Sambrook ef al (1989), cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia 1 - Amplificación dependiente de un templado Los métodos de amplificación dependiente de un templado, por ejemplo PCR, representan un medio eficiente para el aislamiento de homólogos de maíz u otras secuencias de Coix En particular, se pueden diseñar cebadores, sobre la base de la información genética de secuencias homologas, que se pueden emplear en la amplificación dependiente de un templado de ácidos nucleicos que comprendan promotores Coix Existe una cantidad de procesos dependientes de templados para amplificar las secuencias presentes en una muestra de templado dada Uno de los métodos de amplificación mejor conocido es la reacción en cadena de la polimerasa (denominado PCR™) que se describe con detalle en la patente de E U A N° 4,683,195, patente de E U A N° 4,683,202, y patente de E U A N° 4,800,159, cuyos contenidos se incorporan por completo en este documento a modo de referencia Brevemente, en la PCR™ se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias de regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia marcadora Se agrega un exceso de trifosfatos deoxinucleosidos a la mezcla de reacción junto con una ADN pohmerasa, por ejemplo, Taq po merasa Si la secuencia marcadora esta presente en la muestra, los cebadores se unirán ai marcador y la polimerasa causara que los cebadores se extiendan junto con la secuencia marcadora por adición de nucleotidos El aumento y la disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, producen la disociación de los cebadores extendidos del marcador para formar productos de reacción, el exceso de cebadores se unirá al marcador y a los productos de reacción y se repite el proceso Se puede efectuar un procedimiento de amplificación por PCR™ con una transcpptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado Los métodos para efectuar una transcripción inversa de ARN en ADNc son bien conocidos y se describen en Sambrook ef al (1989) Los métodos alternativos de transcripción inversa emplean ADN polimerasas, dependientes de ARN termoestables Estos métodos se describen en la publicación PCT WO 90/07641 , presenta el 21 de diciembre, 1990 Las metodologías de reacción en cadena de la po merasa son bien conocidas en la técnica Otro método de amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ( LCR ), descrita en la publicación EP 0 320 308, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y, en presencia de la secuencia blanco, cada par se unirá a las cadenas complementarias opuestas del blanco de manera tal que quedan contiguas En presencia de la ligasa los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad Cuando se emplean ciclos de temperatura, como en la PCR™ , las unidades ligadas se disocian del blanco y entonces sirven como secuencias blanco para la ligación de un exceso de pares de sondas En la patente de los EE UU N° 4,883,750 se describe un método similar a la LCR para ligar pares de sondas a una secuencia blanco La Qbeta rep casa, descrita en la publicación PCT/US87/00880, también se puede utilizar como otro método de amplificación en la presente invención En este método, se agrega una secuencia replicada de ARN que posee una región completamente de la del blanco a una muestra en presencia de una ARN polimerasa La polimerasa copiara la secuencia replicada que entonces puede ser detectada El método de amplificación isotérmica, donde se utilizan endonucleasas y gasas de restricción para lograr la amplificación de moléculas blanco que contienen nucleotidos 5 [a-t?o]tpfosfatos en una cadena de un sitio de restricción, también puede ser de utilidad en la amplificación de los ácidos nucleicos en la presente invención (Walker ef al , 1992) La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) es otro método para llevar a cabo la amplificación isotérmica de acido nucleicos que involucra múltiples rondas de desplazamiento de cadena y síntesis, es decir, traducción nick Un método similar, denominado Reacción de Cadena Reparadora (RCR), comprende la alineación de vanas sondas en toda una región buscada como blanco para la amplificación, seguida de una reacción de reparación donde solamente dos de las cuatro bases están presentes Lasa otras dos bases se puede añadir como derivados biotmilados para una detección sencilla En la SDA se utiliza un enfoque similar Las secuencias también se pueden detectar utilizando una reacción con sonda cíclica (CPR) En la CPR, se hibpdiza una sonda que posee secuencias 3 y 5 de ADN no especifico y se hibpdiza un ARN especifico del medio con el ADN presente en la muestra Durante la hibpdizacion la reacción se trata con ARNasaH y los productos de la sonda identificados como productos distintos que generan una señal son liberados después de la digestión El templado original se alinea con otra sonda de ciclacion y se repite la reacción En la presente invención se pueden utilizar otros métodos de amplificación que se describen en la solicitud de patente del Reino Unido N° 2 202 328 y en la publicación de la solicitud de patente internacional N° PCT/US89/01025, cuyos contenidos se incorporan en este documento en su totalidad a modo de referencia En la primera solicitud mencionada, se utilizan cebadores modificados' en una síntesis dependiente de enzimas, con templado y tipo PCR™ Los cebadores se pueden modificar por marcación con una porción de captura (por ejemplo, biotma) y/o una porción detectora (por ejemplo, una enzima) En la segunda solicitud mencionada, se añade un exceso de sondas marcadas a la muestra En presencia de la secuencia blanco, la sonda se une y se diva catalíticamente Después del chvaje, la secuencia blanco se libera intacta para ser unido al exceso de sonda El clivaje de las sondas marcadas señala la presencia de la secuencia blanco Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en una transcripción (TAS), incluyendo una amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y 3SR (Kwoh ef al , 1989, Gmgeras ef al , publicación de la solicitud de patente internacional N° WO 88/10315, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia) En la NASBA, los ácidos nucleicos se pueden preparar por amplificación con extracción en fenol/cloroformo estándar, desnaturalización por calor de una muestra clínica, tratamiento con buffer de lisis y columnas Mmispm para el aislamiento de ADN y ARN o extracción de cloruro de guanidmio del ARN Estas técnicas de amplificación involucran la alineación de un cebador que posea secuencias blanco especificas Después de la polimerización, los híbridos de ADN/ARN se digieren con ARNasaH, en tanto se vuelven a desnaturalizar por calor las moléculas de ADN de cadena doble En cualquier caso el ADN de una sola cadena se vuelve completamente doble por adición de un segundo cebador blanco específico, seguido de polimerización Las moléculas de ADN de cadena doble se transcriben entonces de forma múltiple mediante una ARN polimerasa, como la T7 o SP6 En una reacción cíclica isotérmica, los ARN se transcriben de forma inversa en ADN de cadena simple, que luego es convertido en ADN de cadena doble, y después se transcriben una vez mas con una pohmerasa, como la T7 o SP6 Los productos resultantes, ya sean truncados o completos, indican secuencias específicas de proteínas cristalinas En la publicación EP 0 329 822 (cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia) se describe un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que involucra la síntesis cíclica de ARN de cadena simple ("ARNcs '), ADNcs y ADN de cadena doble (ADNcd), que se puede utilizar de acuerdo con la presente invención EL ARNcs es un templado para un primer cebador ohgonucleotidico, que se elongará mediante transcpptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN) Luego se elimina el ARN del dúplex ADN ARN con la acción de una ribonucleasa H (ARNasaH, una ARNasa especifica para ARN en un dúplex con ADN o ARN) EL ADNcs resultante es un templado para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de ARN pohmerasa (ejemplificado por la T7 ARN polimerasa) 5' con relación a la homología para con el templado Este cebador se extiende entonces mediante la ADN pohmerasa (ejemplificado por el fragmento grande de "Klenow" de la ADN pohmerasa I de E coli), dando como resultado una molécula de ADN de cadena doble ("ADNcd"), que posee una secuencia idéntica a la del ARN original comprendida entre los cebadores y que posee además, en un extremo, una secuencia promotora Esta secuencia promotora se puede utilizar con la ARN pohmerasa apropiada para elaborar muchas copias de ARN del ADN Estas copias pueden entonces volver a ingresar en el ciclo que conduce a una amplificación muy leve Si se efectúa una elección adecuada de enzimas, esta amplificación se puede llevar a cabo isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, se puede elegir la secuencia inicial ya sea en la forma de ADN o ARN En la publicación PCT/WO89/06700 (cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia) En la publicación de la solicitud de patente miternacional N° PCT WO 89/06700, cuyo contenido se incorpora por completo a la presente a modo de referencia, se describe un esquema de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos basado en la hibpdización de una secuencia de promotor/cebador con un ADN de cadena simple blanco ("ADNcs") seguido de la transcripción de muchas copias del ARN de la secuencia Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen templados nuevos a partir de los transcriptos de ARN resultantes Otros métodos de amplificación incluyen el "RACE" y la "PCR de un lado" (Frohman, 1990, Ohara, 1989, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia) Los métodos basados en la ligación de dos (o mas) ohgonucleótidos en presencia de ácidos nucleicos presentan la secuencia del 'di-o gonucleótido" resultante, amplificando de esa manera el di-oligonucleotido, también se pueden emplear en el paso de amplificación de la presente invención (Wu et al , 1989, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia) Después de la amplificación, habitualmente resulta conveniente, ya sea en una etapa o en otra, separar el producto de la amplificación del templado y del exceso de cebador con el fin de determinar si se ha producido una amplificación especifica En una realización, los productos de la amplificación son separados por electroforesis sobre gel de agarosa, agarosa-acplamida o poliacplamida usando métodos estándar (Sambrook ef al , 1989) Como alternativa, se pueden emplear técnicas cromatograficas para efectuar la separación Existen muchos tipos de crormatografias que se pueden emplear en la presente invención por adsorción, de partición, de intercambio iónico y con tamices moleculares, asi como muchas técnicas especializadas para utilizarlos incluyendo cromatografía en columna, sobre papel, en capa delgada y gaseosa (Freifelder, 1982) Se pueden visualizar productos con el fin de confirmar la amplificación de las secuencias marcadoras Un método típico de visuahzacion comprende la coloración de un gel con bromuro de etidio y visualizacion bajo luz UV Como alternativa, si los productos de la amplificación están marcados integralmente con nucleotidos marcados radioactiva o fluorometpcamente, dichos productos de amplificación pueden ser expuestos a una película para rayos X o se pueden visualizar bajo el espectro estimulante apropiado, después de separación En una realización, la visualizacion se logra de manera indirecta Después de la separación de los productos de la amplificación, la secuencia marcadora amplificada se pone en contacto con una sonda de ácidos nucleicos marcada La sonda esta conjugada, preferentemente, con un cromoforo pero puede estar marcada radioactivamente En otra realización, la sonda esta conjugada con un integrante de unión, tal como un anticuerpo o biotina, y el otro integrante del par lleva la porción detectable En otra realización, la detección se efectúa mediante una sonda marcada Las técnicas involucradas son bien conocidas por los especialistas en la técnica y se pueden consultar en muchos libros estándar sobre protocolos moleculares (Sambrook ef al , 1989) Por ejemplo, las sondas o los cebadores con cromoforo o marcados radiactivamente identifican el blanco durante o después de la amplificación Un ejemplo de lo recién mencionado se describe en la patente de E U A N° 5,279,721 , incorporada en este documente a modo de referencia, que trata de un aparato y un método para la electroforesis y transferencia automática de ácidos nucleicos El aparato permite efectuar la electroforesis y la transferencia sin una manipulación externa del gel y se adapta idealmente para llevar a cabo los métodos acordes con la presente invención Ademas, los productos de la amplificación descritos anteriormente pueden ser sometidos a análisis de secuencia con el fin de identificar tipos específicos de variaciones usando técnicas de análisis de secuencia estándar En algunos métodos, el análisis exhaustivo de los genes se efectúan por análisis de secuencia usando conjuntos de cebadores diseñados para una secuencia óptima (Pignon ef al , 1994) La presente invención provee métodos con los cuales se pueden emplear cualquiera o todos estos tipos de análisis. 2 Transferencia Southern/Northern Las técnicas de transferencia representan otros métodos que son bien conocidos por los especialistas en la técnica y se pueden emplear para la identificación de los ácidos nucleicos acordes con la presente invención La transferencia Southern, por ejemplo, se puede emplear para aislar un segmento de ADN que contiene un promotor Coix candidato de utilidad para la expresión de genes de maíz. En particular, por medio de hibpdización de una sonda de ADNc de maíz con clones de ADN genómico de una planta Coix se podrían aislar clones que incluyan la región promotora del gen correspondiente Como alternativa, la secuencia misma del promotor se podría emplear como sonda para identificar directamente promotores homólogos Coix La transferencia Southern comprende el uso de ADN como blanco, en tanto la transferencia Northern comprende el uso de ARN como blanco Cada uno provee diferentes tipos de información, si bien la transferencia de ADNc es análoga, en muchos aspectos, a la transferencia de especies de ARN Brevemente, se emplea una sonda para buscar especies de ADN o ARN que han sido inmovilizadas sobre una matriz adecuada, a menudo un filtro de nitrocelulosa Las diferentes especies deben estar separadas espacialmente para facilitar el análisis Esto se logra a menudo por electroforesis sobre gel de especies de ácidos nucleicos seguido de la "transferencia" al filtro A continuación, el blanco transferido es incubado con una sonda (habitualmente marcada) bajo condiciones que promueven la desnaturalización y rehibpdización Dado que la sonda está diseñada par aparearse por las bases con el, dicha sonda se unirá a una porción de la secuencia blanco bajo condiciones de renaturahzación Luego se elimina la sonda is no unida y la detección se lleva a cabo como se describió anteriormente 3 Tecnologías chip El autor de la invención contempla específicamente las tecnologías de ADN basadas en chips, tal como las descritas por Hacia ef al (1996) y Shoemaker et al (1996) En resumen, estas técnicas comprenden métodos cuantitativos para el análisis de grandes cantidades de genes de forma rápida y precisa La marcación de genes con o gonucleótidos o el uso de ordenamientos de sondas fijas, permite emplear la tecnología chip para segregar las moléculas blanco como conjuntos de gran intensidad y rastrear estas moléculas sobre la base de una hibpdizacion (Pease ef al , 1994, Fodor et al , 1991 ). (ni) Aislamiento De Novo de promotores Coix La presente invención contempla el uso de promotores Coix que fueron aislados sin el uso de sondas o cebadores derivados de promotores de otras especies Los medios para clonar promotores y su construcción en vectores adecuados para la transformación y expresión de genes exogenos en maíz son conocidos en la técnica y se describen en por ejemplo, Sambrook ef al , 1989, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia Los tipos de promotores Coix que se consideran especialmente útiles para la expresión transgenica en maíz son aquellos que se expresan con niveles altos de manera constitutiva o no constitutiva Los promotores no constitutivos adecuados incluyen aquellos que se expresan de una manera especifica temporal y/o de tejidos o son inducibles De manera especifica temporal significa un promotor que dirige la expresión en uno o mas periodos específicos del desarrollo Habitualmente, el primer paso en la clonación de un promotor comprende la identificación de un gen blanco que se exprese de la manera deseada es decir constitutivamente o especifica temporalmente / de tejidos Un medio eficiente para lograr esto comprende la preparación de una biblioteca de ADN a partir de uno o mas tejidos blanco identificados y la identificación de clones con muchas copias en la misma Serán particularmente convenientes los clones de ADNc que están muy bien representados si bien para los cuales la cantidad de copias de genes es baja El clon de ADNc se utiliza entonces para aislar ADN genomico que comprenda las regiones 5' flanqueadoras de la secuencia de codificación, incluyendo la región promotora, usando técnicas de búsqueda en bibliotecas estándar conocidas por los especialistas en la técnica (véase Sambrook ef a/ , 1989) Un método preferido para la clonación de promotores es el uso de la técnica de "PCR por supresión", descrita, por ejemplo, en la publicación de Siebert ef al , 1995 cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia Este método permite la amplificación por PCR de secuencias no clonadas y desconocidas siempre y cuando se conozca una secuencia de anclaje especifica del gen Usando esta técnica, se puede emplear una secuencia conocida, tal como una secuencia homologa o ADNc homologo, para clonar elementos reguladores flanqueadores, incluyendo promotores, potenciadores o termmadores 1 Cuantificacion de la expresión qenica con RT-PCR™ cuantitativa relativa La transcripción inversa (RT) de ARN en ADNc seguido de PCR™ (RT-PCR™) cuantitativa relativa se puede emplear para determinar las concentraciones relativas de especies de ARNm especifico aislado de plantas Al determinar si vana la concentración de una especie de ARNm especifica, se demuestra que el gen que codifica dicha especie de ARNm especifica se expresa de forma diferencial De esta manera, se pueden identificar y buscar rápidamente los promotores candidato de Coix para su uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación de maíz En la PCR™, la cantidad de moléculas de ADN blanco amplificado aumenta con un factor cercano a dos con cada ciclo de la reacción hasta que alguno de los reactivos se vuelva limitante A continuación, la velocidad de amplificación disminuye cada vez mas hasta que no se observa incremento alguno en el blanco amplificado entre ciclo y ciclo Si se traza un gráfico con la cantidad de ciclo sobre el eje X y el log de la concentración del ADN blanco amplificado sobre el eje Y, se obtiene una curva con una forma característica al unir los puntos graficados Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la curva es positiva y constante Esta se denomina la porción lineal de la curva Cuando el reactivo comienza a volverse limitante, la pendiente de la curva comienza a disminuir y eventualmente tiende a cero En este punto la concentración del ADN blanco amplificado se vuelve asmtotica en algún valor fijo Esta se denomina la porción estacionaria o plateau de la curva La concentración del ADN blanco en la porción lineal de la amplificación PCR™ es directamente proporcional a la concentración inicial del blanco antes de comenzar la reacción Al determinar la concentración de los productos amplificados de ADN blanco en las reacciones de PCR™ que han completado la misma cantidad de ciclos y que se encuentran en sus rangos lineales, es posible determinar las concentraciones relativas de la secuencia blanco especifica en la mezcla de ADN original Si las mezclas de ADN son ADNc sintetizados a partir de ARN aislado de diferentes tejidos o células se puede determinar la abundancia relativa del ARNm especifico a partir del cual deriva la secuencia blanco para los tejidos o células respectivos Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos de la PCR™ y la abundancia relativa del ARNm solamente se cumple en la porción lineal del rango de la reacción de PCR™ La concentración final del ADN blanco en la porción estacionaria de la curva se determina por la disponibilidad de reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original del ADN blanco Por ello la primera condición que se debe cumplir antes de que se pueda determinar la abundancia relativa de la especie de ARNm por RT-PCR™ para una colección de poblaciones de ARN es que las concentraciones de los productos amplificados por PCR™ deben ser registradas cuando las reacciones de PCT™ se encuentran en la porción lineal de sus respectivas curvas La segunda condición que se debe cumplir en un estudio con RT-PCR™ para determinar satisfactoriamente la abundancia relativa de una especie particular de ARNm es que las concentraciones relativas de los ADNc amplificables deben ser normalizadas con respecto a algún estándar independiente La finalidad de un estudio con RT PCR™ es la determinación de la abundancia de una especie particular de ARNm con relación a la abundancia promedio de todas las especies de ARNm presentes en la muestra La mayoría de los protocolos para una PCR™ competitiva emplean estándares internos para PCR™ que son aproximadamente tan abundantes como el blanco Estas estrategias son efectivas si las muestras de los productos de las amplificaciones por PCR™ se toman durante sus fases lineales Si las muestras de los productos se toman cuando las reacciones se están acercando a la fase estacionaria, entonces el producto menos abundante se vuelve relativamente sobrerepresentado Las comparaciones de la abundancia relativa para muchas muestras de ARN diferentes, como es el caso cuando se examinan muestras de ARN por su expresión diferencial, se distorsionan de manera tal que las diferencias observadas en las abundancias relativas de los ARN parecen menores de lo que realmente son Esto no constituye un problema significativo si el estándar interno es mucho más abundante que el blanco Si el estándar interno es mas abundante que el blanco, entonces se pueden efectuar comparaciones lineales directas entre muestras de ARN La discusión anterior describe las consideraciones teóricas de un ensayo de RT-PCR™ para tejidos vegetales Los problemas inherentes de las muestras de tejido vegetal son la cantidad variable de las mismas (con lo cual la normalización se vuelve problemática) y que son de calidad variable (por lo cual se necesita la co-amphficación de un control interno variable, con preferencia de mayor tamaño que el blanco) Estos dos problemas se pueden resolver si la RT-PCR™ se lleva a cabo como una RT-PCR™ cuantitativa relativa con un estándar interno, donde el estándar interno es un fragmento de ADNc amplificable mayor que el fragmento de ADN blanco y donde la abundancia del ARNm que codifica el estándar interno es apenas 5-100 veces más grande que el ARNm que codifica al blanco Este ensayo permite medir la abundancia relativa, no la abundancia absoluta de las especies de ARNm respectivas Se pueden efectuar otros estudios usando un ensayo RT-PCR™ cuantitativo relativo más convencional con un protocolo con estándar externo Estos ensayos muestran los productos de la PCR™ en la porción lineal de sus curvas de amplificación La cantidad de ciclos de PCR™ que son óptimos para el muestreo se debe determinar empíricamente para cada fragmento de ADN blanco Además, los productos de la transcpptasa inversa de cada población de ARN aislado de las diversas muestras de tejido deben ser cuidadosamente normalizados para concentraciones iguales de ADNc amphficable Esta consideración es muy importante dado que el ensayo mide la abundancia de ARNm absoluta La abundancia de ARNm absoluta solamente se puede utilizar como una medida de la expresión génica diferencial en muestras normalizadas Dado que la determinación empírica del rango lineal de la curva de amplificación y la normalización de las preparaciones de ADNc son procesos tediosos y que demoran mucho tiempo, los ensayos de RT-PCR™ resultantes pueden ser superiores a los que derivan de un ensayo RT- PCR™ cuantitativo relativo con un estándar interno Una de las razones de esta ventaja es que sin el estándar interno/competidor, todos los reactivos se pueden convertir en un solo producto de PCR™ en el rango lineal de la curva de amplificación, incrementando así la sensibilidad del ensayo Otra razón es que con un solo producto de PCR™, la visualización del producto sobre un gel electroforetico, u otro método de visua zación, se vuelve menos compleja, presenta menos ruido basal y es mas fácil de interpretar 2 Aislamiento de promotores no buscados como blancos Así como la clonación de promotores de manera específica y direccionada se efectúa identificando primero un gen con el perfil deseado de expresión, se podrían clonar promotores Coix utilizando una estrategia de búsqueda de escopeta Por ejemplo, se podría generar una gran cantidad de vectores que contengan un gen de selección o marcador ligado a segmentos aleatorios de ADN Coix Dichos vectores se podrían preparar mezclando y ligando porciones de ADN de genes marcadores digeridos por restricción y de ADN Coix genomico total y clonando el ADN en un vector adecuado Como alternativa, se podría emplear una construcción "jinete decapitado" en la cual el sitio de clonación preceda directamente a un gen marcador que de lo contrario carecería de un promotor En este caso, el gen marcador se expresara solamente cuando el promotor es clonado en el sitio de clonación Una vez construidos, los vectores se pueden utilizar para transformar una gran cantidad de células de maíz Al seleccionar transformantes que expresan el gen marcador, se pueden identificar nuevos promotores Coix capaces de dirigir la expresión en maíz (iv) Ensayos con promotores Una vez clonados, se puede confirmar la identidad y/o la utilidad del mediante ensayos de secuenciacion y/o expresión En plantas, el ensayo de expresión puede comprender un sistema que emplea células embrionarias o no embrionarias o, como alternativa, plantas completas Una de las ventajas de utilizar ensayos con células es que no se requiere la regeneración de grandes cantidades de plantas, no obstante, los sistemas son limitados por cuanto es posible que la actividad promotora en las células no regeneradas no se correlacione con la expresión en una planta Ademas, en general no son factibles los ensayos con promotores específicos de tejidos o del desarrollo La muestra biológica a evaluar puede comprender ácidos nucleicos aislados de las células de cualquier material vegetal según metodologías estándar (Sambrook ef al , 1989) El acido nucleico puede ser ADN genomico o ARN de células completas o fraccionadas Cuando se emplea ARN, puede ser conveniente convertir dicho ARN en un ADN complementario En una realización, el ARN es ARN de una célula completa, en otra, es ARN poli-A Habitualmente se amplifica el acido nucleico Según el formato, el acido nucleico especifico de ínteres se identifica directamente en la muestra usando amplificación o con un segundo acido nucleico conocido después de la amplificación A continuación, se detecta el producto identificado En ciertas aplicaciones, la detección se puede llevar a cabo con medios visuales (por ejemplo, coloración de un gel con bromuro de etidio) Como alternativa, la detección puede involucrar la identificación directa del producto por medio de quimioluminiscencia, centellografia radioactiva de una marca radioactiva o fluorescente o aun por medio de un sistema que emplea señales eléctricos o pulsos térmicos (Affymax Technology, Bellus, 1994) Después de la detección, se pueden comparar los resultados observados en una planta dada con un grupo de referencia estadísticamente significativo de plantas control no transformadas Típicamente, las plantas control no transformadas serán de antecedentes genéticos similares a los de las plantas transformadas De esta manera, es posible detectar diferencias en la cantidad o el tipo de protema detectada en diversas plantas transformadas Como alternativa, se pueden comparar cultivos de células clónales, por ejemplo, de callos o de embriones inmaduros, con otras muestras de células Tal como se indico, se contempla una gran variedad de ensayos diferentes en la búsqueda en células o plantas de la presente invención y promotores asociados Estas técnicas se pueden emplear en algunos casos para detectar tanto la presencia como la expresión de genes particulares, asi como los reordenamientos que se pudieran haber producido en la construcción del gen Las técnicas incluyen, pero sin limitaciones a las mismas, hibpdizacion fluorescente in situ (FISH), secuenciacion directa de ADN, análisis PFGE, trasferencia Southern o Northern, análisis de conformación de cadena simple (SSCA), ensayo con protección de ARNasa, oligonucleotidos específicos de alelos (ASO), análisis de transferencia puntual, electroforesis sobre gel con gradiente desnaturalizante, RFLP y PCR-SSCP Cuando se ha aislado un clon que comprende un promotor de acuerdo con la presente invención, se contempla que puede ser conveniente delimitar las regiones promotoras esenciales dentro del clon Un medio eficiente para lograr esto comprende el análisis por supresión En el análisis por supresión, se prepara una sene de construcciones, cada una de las cuales contiene una porción diferente del clon (un subclon) y estas construcciones son examinadas por su actividad promotora Un medio adecuado para rastrear la actividad es mediante la unión de las construcciones promotoras suprimidas a un marcador de selección o de búsqueda y el aislamiento de aquellas células que expresan el gen marcador De esta manera, se identifica una cantidad de construcciones promotoras diferentes, suprimidas, que aún retienen su actividad promotora El segmento más pequeño necesario para la actividad promotora es identificado de esta manera a través de una comparación de las construcciones seleccionadas Esta segmento se puede emplear entonces en la construcción de vectores para la expresión de genes exógenos II Métodos para preparar promotores mutados El inventor contempla específicamente que se podría mutar un promotor Coix con el fin de mejorar potencialmente la utilidad del promotor para la expresión de transgenes en maíz La mutagenesis de promotores Coix se puede efectuar aleatoriamente y los promotores mutados pueden ser examinados por su utilidad en un procedimiento de prueba y error Como alternativa, se pueden identificar secuencias particulares que provean un promotor Coix con características de expresión convenientes y estas secuencias, o secuencias similares, pueden ser introducidos en los promotores de maíz por medio de una mutación Además de maíz, se pueden mutar promotores de otras especies para proveerles de las características deseadas del promotor Coix Por ejemplo, se puede mutar un promotor de arroz, avena, sorgo, cebada o trigo con el fin de proveerle al promotor mutado una utilidad mejorada para la expresión transgenica en maíz Los medios para mutar un segmento de ADN que codifica un promotor de la presente invención son bien conocidos por los especialistas en la técnica Las modificaciones a dichas regiones promotoras se pueden efectuar por medio de procedimientos de mutagénesis aleatoria o específica del sitio La región promotora puede ser modificada por alteración de su estructura mediante la adición o supresión de uno o mas nucleotidos de la secuencia que codifica la correspondiente región promotora no modificada La mutagenesis se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica tal como, y sin limitaciones a las mismas, la síntesis de un oligonucleotido que posee una o más mutaciones en la secuencia de una región promotora en particular En particular, la mutagénesis específica del sitio es una técnica útil para la preparación de mutantes promotores, a través de la mutagenesis específica del ADN subyacente La técnica provee además la posibilidad de preparar y evaluar vanantes de secuencia, por ejemplo, con la incorporación de una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o mas cambios en la secuencia de nucleotidos en el ADN La mutagenesis específica del sitio permite producir mutantes mediante el uso de secuencias de o gonucleotidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como una cantidad suficiente de nucleotidos adyacente, para proveer una secuencia cebadora de tamaño y complejidad de secuencia suficientes como para formar un dúplex estable a ambos lados de la unión de la supresión que está siendo atravesada Habitualmente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 o mas nucleótidos de longitud, con aproximadamente 10 a 25 o más residuos a ambos lados de la unión de la secuencia que está siendo alterada En general, la técnica de mutagenesis especifica del sitio se conoce bien en la técnica, como queda demostrado por las numerosas publicaciones La técnica emplea habitualmente un vector fago que existe tanto en la forma de cadena simple como doble Los vectores típicos que son de utilidad en la mutagenesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13 Estos fagos se encuentran disponibles comercialmente y su uso es bien conocido en general para los especialistas en la técnica Los plásmidos de doble cadena también se emplean rutinariamente en la mutagénesis dirigida al sitio, que elimina el paso de transferir el gen de ínteres de un plasmido a un fago En general, la mutagenesis dirigida al sitio acorde con este contexto, se lleva a cabo obteniendo primero un vector de cadena simple, o fusionando dos cadenas de un vector de doble cadena que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la región promotora o el peptido deseado Se prepara un cebador de oligonucleotidos que lleva la secuencia mutada deseada, en general sintéticamente Este cebador se alinea después con el vector de cadena simple y se someta a enzimas pohmepzadoras de ADN, tales como el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E coll, con el fin de completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación Asi, se forma un heteroduplex donde una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda cadena lleva la mutación deseada Esta vector heteroduplex se utiliza entonces para transformar las células apropiadas, tales como células de maíz, y se seleccionan células que incluyan los vectores recombmantes que llevan el ordenamiento de la secuencia mutada Kunkel ef al (1987) desarrollo une esquema de selección genética para el enriquecimiento con clones que incorporan el o gonucleotido mutagenico Como alternativa, se puede emplear el uso de PCR™ con enzimas termoestables disponibles comercialmente, tal como Taq polimerasa, para incorporar un cebador de o gonucleotidos mutagenico en un fragmento de ADN amplificado que luego puede ser clonado en un vector de expresión o de clonación adecuado Los procedimientos de mutagenesis mediada por PCR™ de Tomic ef al (1990) y Upender ef al (1995) proveen dos ejemplos de dichos protocolos También se puede emplear PCR™ con una hgasa termoestable ademas de la polimerasa termoestable para incorporar un oligonucleotido mutagenico fosfoplado en un fragmento de ADN amplificado, que luego puede ser clonado en un vector de expresión o clonación adecuado El procedimiento de mutagenesis descrito por Michael (1994) provee un ejemplo de un protocolo tal Se provee la preparación de vanantes de la secuencia de los segmentos de ADN codificadores del promotor seleccionado utilizando mutagenesis dirigida al sitio como un medio para producir especies potencialmente útiles y no pretende ser limítrofe ya que existen otras maneras de obtener las vanantes de las secuencias de ADN Por ejemplo se pueden tratar los vectores recombinantes que codifican la secuencia promotora deseada con agentes mutagenicos, tal como hidroxilamina, para obtener dichas vanantes de las secuencias Tal como se utiliza en este documento, el termino "procedimiento de mutagénesis dirigida a o gonucleotidos" se refiere a procesos dependientes de templados y propagación mediada por vectores que dan como resultado un aumento en la concentración de una molécula de ácidos nucleicos especifico con relación a su concentración inicial o en un aumento en la concentración de una señal detectable como una amplificación Tal como se utiliza en este documento el termino "procedimiento de mutagenesis dirigida a oligonucleótidos" también pretende hacer referencia a un proceso que involucra la extensión dependiente de templado de una molécula cebadora El término proceso dependiente de un templado se refiere a la síntesis de ácidos nucleicos de una molécula de ARN o ADN, donde la secuencia de la cadena recién sintetizada de acido nucleico esta determinada por las reglas bien conocidas de complementariedad de bases apareadas (véase, por ejemplo, Watson y Ramstad, 1987) Habitualmente, las metodologías mediadas por vectores involucran la introducción del fragmento de ácidos nucleicos en un vector de ADN o ARN, la amplificación mediante clones del vector y la recuperación del fragmento de ácidos nucleicos amplificado Los ejemplos de dichas metodologías se pueden encontrar en la patente de E U A No 4,237,224, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia Existe una cantidad de procesos dependientes de templados para amplificar las secuencias blanco de ínteres presentes en una muestra, siendo dichos métodos bien conocidos en la técnica y se describen específicamente más adelante lll Transformación Existen muchos métodos para transformar segmentos de ADN en el interior de células, pero no todos son adecuados para distribuir ADN en células vegetales Se considera que los métodos adecuados para su uso con la presente invención incluyen virtualmente cualquier método por el cual sea posible introducir ADN en una célula, como por distribución directa de ADN tal como por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh ef al , (1993) por captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus ef al , 1985), por electroporacion (patente de E U A N° 5,384,253, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler ef al , 1990, patente de E U A N° 5,302,523, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia, y patente de E U A No 5,464,765, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), por transformación mediada por Agrobactenum (patente de E U A no 5,591 ,616 y patente de E U A No 5,563 055, ambos incorporados específicamente en este documento a modo de referencia) y por aceleración de partículas recubiertas con ADN (patente de E U A No 5,550,318, patente de E U A No 5,538,877, y patente de E U A No 5,538,880, cuyos contenidos se incorporan específicamente y por completo en este documento a modo de referenc?a),etc La aplicación de técnicas como las recién mencionadas, permite transformar de forma estable células de maíz, asi como las de virtualmente cualquier otra especie vegetal y estas células pueden desarrollarse en plantas transgenicas En algunas realizaciones, se prefieren los métodos de aceleración e incluyen, por ejemplo, bombardeo con microparticulas y semejantes (i) Electroporacion Cuando se desea introducir ADN por medio de electroporacion, se considera que el método de Krzyzek et al (patente de E U A No 5,384,253, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia) sera particularmente conveniente En este método, se emplean ciertas enzimas degradadoras de la pared celular, tales como enzimas degradadoras de pectma, para que las células receptoras se vuelvan mas susceptibles de la transformación por electroporacion que las células no tratadas Como alternativa, las células receptoras se pueden volver mas susceptibles a la transformación mediante lesiones mecánicas Para efectuar la transformación por electroporacion, se pueden emplear tejidos friables tal como un cultivo en suspensión de células o de callos embrionarios o, como alternativa, se pueden transformar directamente embriones inmaduros u otro tejido organizado En esta técnica, se degrada parcialmente las paredes celulares de las células elegidas por exposición de las mismas a enzimas degradadoras de pectma (pectoliasas) o por lesión mecánica controlada Los ejemplos de algunas especies que han sido transformados por electroporacion de células intactas incluyen maíz (patente de E U A No 5 384,253, D Halluin et al , 1992, Rhodes et al , 1995), trigo (Zhou et al , 1993), tomate (Hou y Lm, 1996), soja (Chpstou et al , 1987) y tabaco (Lee et al , 1989) También se pueden emplear protoplastos para la transformación por electroporacion de plantas (Bates, 1994, Lazzep, 1995) Por ejemplo, la generación de plantas de soja transgenicas por electroporacion de protoplastos derivados de cotiledones fue descrita por Dhir y Widholm en la publicación de la solicitud de patente internacional No WO 9217598 (incorporado específicamente en este documento a modo de referencia) Otros ejemplos de especies para las cuales se ha descrito la transformación de protoplastos incluyen cebada (Lazzep, 1995), sorgo (Battraw et al 1991 ), maíz (Bhattacharjee et al , 1997), trigo (He et al , 1994), tomate (Tsukada, 1989) y soja (Dhir et al , 1992) (n) Bombardeo con microparticulas Un método preferido para distribuir segmentos transformadores de ADN en células vegetales acorde con la invención es el bombardeo con microparticulas (patente de E U A No 5,550,318, patente de E U A No 5,538,880, patente de E U A No 5,610,042, y solicitud PCT WO 94/09699, cuyos contenidos se incorporan específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) En este método, se pueden recubrir partículas con ácidos nucleicos y distribuirlas en las células mediante una fuerza propulsora Los ejemplos de partículas incluyen aquellas compuestas por tungsteno, platino y, preferiblemente, oro Se considera que en algunos casos la precipitación del ADN sobre las partículas de metal no sena necesaria para la distribución del ADN en una célula receptora usando bombardeo con microparticulas Sin embargo, se contempla que las partículas pueden contener ADN en lugar de ser recubiertas con ADN Por ello, se propone que las partículas recubiertas con ADN pueden incrementar el nivel de distribución de ADN mediante bombardeo de partículas, pero no son necesarias, en y por sí mismas Una realización ilustrativa de un método para distribuir ADN en células de maíz por aceleración es el sistema biolístico de distribución de partículas, que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de una pantalla, tal como una pantalla de acero inoxidable o de Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de plantas monocotiledoneas cultivadas en suspensión La pantalla dispersa las partículas de manera que no alcanzan las células receptoras en grandes agregados Se cree que la pantalla que se interpone entre el equipo de proyectiles y las células a bombardear reduce el tamaño de los agregados de proyectiles y puede contribuir a una frecuencia más alta de transformación por reducción del daño infringido a las células receptoras por proyectiles demasiado grandes Las técnicas de bombardeo con micropartículas son de amplia aplicación y se pueden utilizar para transformar virtualmente cualquier especie vegetal. Los ejemplos de especie que han sido transformados por bombardeo con micropartículas incluyen especies monocotiledóneas, tal como maíz (solicitud PCT WO 95/06128), cebada (Rítala et al , 1994, Hensgens et al , 1993), trigo (patente de E.U A. No 5,563,055, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), arroz (Hensgens et al , 1993), avena (Torbet et al , 1998), centeno (Hensgens et al , 1993), caña de azúcar (Bower et al , 1992) y sorgo (Casa et al , 1993, Hagio et al , 1991 ), asi como una cantidad de dicotiledóneas, incluyendo tabaco (Tomes et al , 1990, Buising y Benbow, 1994), soja (patente de E U A No 5,322,783, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), girasol (Knittel et al , 1994), mam (Smgsit et al , 1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (VanEck et al , 1995) y legumbres en general (patente de E U A No 5,563,055, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) Para el bombardeo, se concentran células en suspensión sobre filtros o un medio de cultivo solido Como alternativa, se pueden disponer embriones inmaduros u otras células blanco sobre medio de cultivo solido Las células a bombardear se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención de macroproyectiles Si resultara conveniente, se pueden colocar una o mas pantallas entre el dispositivo de aceleración y las células a bombardear (ni) Transformación mediada por Aarobactenum La transferencia mediada por Agrobactenum es un sistema de amplia aplicación para introducir genes en células vegetales porque el ADN puede ser introducido en tejidos de plantas enteras, omitiendo asi la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto El uso de vectores mtegradores vegetales mediado por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica Véase, por ejemplo, los métodos descritos por Fraley et al , (1985), Rogers et al , (1987) y patente de E U A No 5,563,055, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia La transformación mediada por Agrobacterium es mas eficiente en plantas dicotiledóneas y es el método preferido para la transformación de dicotiledóneas, incluyendo Arabidopsis, tabaco, tomate y papa Es mas, en tanto la transformación mediada por Agrobactenum se ha empleado comunmente con plantas dicotiledóneas durante muchos años, solo recientemente se ha podido aplicar a plantas monocotiledoneas Los avances en las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium permiten ahora aplicar la técnica a casi todas las plantas monocotiledoneas Por ejemplo, las técnicas de transformación mediada por Agrobactenum se aplican ahora en arroz (Hiei et al , 1997, Zhang et al , 1997 patente de E U A No 5,591 ,616, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), trigo (McCormac et al , 1998), cebada (Tingay et al , 1997, McCormac et al , 1998) y maíz (Ishidia et al , 1996) Los modernos vectores de transformación con Agrobactenum tienen la capacidad de replicarse en E Coli, asi como en Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes como ya se describió (Klee et al , 1985) Mas aun, los avances tecnológicos recientes de los vectores para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, han mejorado el ordenamiento de genes y los sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diversos genes codificadores de po peptidos Los vectores descritos (Rogers et al , 1987) poseen regiones multihgadores convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de po adenilacion para la expresión directa de genes codificadores de polipeptido insertados y son adecuados para los fines de la invención Ademas, se pueden emplear genes Ti tanto armados como desarmados que contienen Agrobactenum para las transformaciones En aquellas cepas vegetales donde la transformación mediada por Agrobactenum es eficiente, constituye el método de elección debido a la naturaleza sencilla y definida de la transferencia de genes (iv) Otros métodos de transformación La transformación de protoplastos vegetales se puede lograr utilizando métodos basados en precipitación de fosfato de calcio, tratamiento con pohetileng col, electroporacion y combinaciones de estos tratamientos (véase, por ejemplo, Potrykus et al , 1985, Lorz et al , 1985, Omirulleh et al , 1993, Fromm et al , 1986, Uchimiya et al , 1986, Callis et al , 1987, Marcotte et al , 1988) La aplicación de estos sistemas a diferentes cepas vegetales depende de la capacidad de regeneración de dicha variedad de planta en particular a partir de protoplastos Los métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos están descritos en la literatura (Fujimara et al , 1985, Topyama et al , 1986, Yamada et al , 1986, Abdullah et al , 1986, Omirulleh et al , 1993 y patente de E U A No 5,508,184, cuyos contenidos se incorporan específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) Los ejemplos del uso de transformación por captación directa de protoplastos de cereales incluyen la transformación de arroz (Ghosh-Biswas et al , 1994), sorgo (Battraw y Hall, 1991 ), cebada (Lazzep, 1995), avena (Zheng y Edwards, 1990) y maíz (Omirulleh et al , 1993) Para la transformar cepas vegetales que no se pueden regenerar exitosamente a partir de protoplastos, se pueden utilizar otras formas para introducir el ADN en las células o los tejidos intactos Por ejemplo, la regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes se puede llevar a cabo como se describe en la literatura (Vasil, 1989) También se puede emplear una transformación mediada por fibras de carburo de silicio con o sin formación de protoplastos (Kaeppler, 1990, Kaeppler et al , 1992, patente de E U A No 5,563,055, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) La transformación con esta técnica se lleva a cabo agitando fibras de carburo de silicio junto con células en una solución de ADN El ADN ingresa pasivamente a medida que la célula es punzada Esta técnica se ha empleado exitosamente con, por ejemplo, el cereal monocotiledoneo maíz (solicitud PCT WO 95/06128, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia, Thompson, 1995) y arroz (Nagatam, 1997) IV Optimizacion del bombardeo con microparticulas Para la transformación por bombardeo con microparticulas acorde con la presente invención, se pueden optimizar los parámetros tanto físicos como biológicos Los factores físicos son aquellos que abarcan la manipulación del precipitado de ADN/microproyectiles o aquellos que afectan el vuelo y la velocidad ya sea de macro o de microproyectiles Los factores biológicos incluyen todos los pasos involucrados en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, tal como el ajuste osmótico de células blanco para ayudar a aliviar los traumas asociados con el bombardeo, la orientación de un embrión inmaduro u otro tejido blanco, relativos a la trayectoria de la partícula y también de la naturaleza del ADN transformante tal como ADN alineado o plasmidos superenrollados intactos Se cree que las manipulaciones previas al bombardeo son especialmente importantes para una transformación exitosa de embriones inmaduros Por consiguiente se contempla que puede ser conveniente ajustar los diversos parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar las condiciones por completo Puede ser particularmente conveniente ajustar los parámetros físicos, tal como la concentración de ADN, la distancia a la hendidura, la distancia de vuelo, la distancia del tejido y la presión de helio Se contempla ademas que el grado del helio puede afectar la eficacia de la transformación Por ejemplo, se pueden observar diferencias en las eficiencias de transformación entre bombardeos usando helio de grado industrial (99 99% de pureza) o helio ultrapuro (99 999% de pureza), si bien actualmente no esta claro todavía cual es mas ventajoso para el bombardeo También se puede optimizar los factores de reducción de trauma (TRF) modificando las condiciones que afectan el estado fisiológico de las células receptoras y que por ello pueden afectar la eficiencia de transformación y de integración Por ejemplo, se puede ajustar el estado osmótico, la hidratacion del tejido y la etapa del subcultivo o el ciclo celular de las células receptoras para una transformación óptima Se pueden afectar los parámetros tanto físicos como biológicos para una optimizacion adicional de la transformación balística Los factores físicos son aquellos que involucran la manipulación del precipitado de ADN/microproyectiles o aquellos que afectan el vuelo y la velocidad de los macro o microproyectiles Los factores biológicos incluyen todos los pasos involucrados en la manipulación de las células inmediatamente antes y después del bombardeo Las condiciones de cultivo previas al bombardeo tal como el entorno osmótico, los parámetros de bombardeo y la configuración del plasmido se ajustaron con el fin de obtener la cantidad máxima de transformantes estables (i) Parámetros físicos 1 - Distancia a la hendidura El montaje variable (macro soporte) puede ser ajustado con el fin de variar la distancia entre el disco de ruptura y el macroproyectil, es decir, la distancia a la hendidura Esta distancia puede variar de O a 2 cm Los efectos predichos de una hendidura mas corta son un incremento de la velocidad de tanto de macro como de microproyectiles, una mayor onda de shock (que conduce a dispersión de tejido y mayor trauma del mismo) y una penetración más profunda de los microproyectiles Mayores distancias a la hendidura presentan efectos opuestos, pero pueden incrementar la viabilidad y por ello la cantidad de transformantes estables recuperados 2 - Distancia de vuelo El montaje fijo (contenido dentro del montaje variable) puede ser variado entre 0 5 y 2 25 cm en incrementos predeterminados de 0 5 cm mediante la colocación de anillos espaciadores para ajustar la ruta de vuelo cursada por el macroproyectil Las rutas de vuelo corto permiten una mayor estabilidad del macroproyectil en vuelo pero reduce la velocidad general de los microproyectiles Un incremento en la estabilidad de vuelo aumenta, por ejemplo, la cantidad de focos GUS centrados Mayores distancias de vuelo (hasta algún punto) incrementan la velocidad pero también aumentan la inestabilidad de vuelo Sobre la base de observaciones, se recomienda efectuar los bombardeos habituales con una longitud de ruta de vuelo de 1 0 cm a 1 5 cm 3 - Distancia del teudo La colocación del tejido dentro de la cámara disparadora puede presentar efectos significativos sobre la penetración del macroproyectil Un aumento en la ruta de vuelo de los microproyectiles disminuirá la velocidad y los trauma asociados con la onda de shock Una disminución en la velocidad también dará como resultado una penetración menos profunda de los microproyectiles 4 - Presión de hielo La manipulación del tipo y la cantidad de discos de ruptura, permite variar la presión entre 400 y 2000 psi dentro del tubo de aceleración de gas La presión óptima para una transformación estable se ha determinado entre 1000 y 1200 psi 5 - Recubrimiento de los microprovectiles Para el bombardeo con partículas, se une (es decir, 'se recubre ') ADN a los microproyectiles de manera tal que es distribuido en las células receptoras en una forma adecuada para la transformación de las mismas En este respecto, por lo menos parte del ADN transformante debe hallarse disponible para la célula blanco para que produzca la transformación, al tiempo que durante la distribución el ADN debe estar unido al microproyectil Por ello, la disponibilidad de ADN transformante del microproyectil puede comprender la inversión física de los enlaces entre el ADN transformante y el microproyectil después de la distribución del microproyectil en la célula blanco Sin embargo, esto no necesariamente debe ser asi ya que la disponibilidad para la célula blanco puede tener lugar como resultado de la ruptura de segmentos no unidos de ADN o de otras moléculas que contengan la unión física al microproyectil La disponibilidad puede tener lugar ademas como resultado de la ruptura de enlaces entre ADN transformante y las otras moléculas, que se encuentran unidas directa o indirectamente, al microproyectil Se considera ademas que la transformación de una célula blanco puede tener lugar por medio de una recombmacion directa entre el ADN transformante y el ADN genomico de la célula receptora Por ello, tal como se utiliza en este documento, un microproyectil recubierto sera uno que se puede emplear para transformar una célula blanco por cuanto el ADN transformante sera distribuido en la célula blanco, y se encontrara accesible para la célula blanco para que tenga lugar la transformación Se puede usar cualquier técnica de recubrimiento de microproyectiles que permita la distribución de ADN transformante en células blanco Los métodos de recubpmiento de microproyectiles que se ha demostrado que funcionan bien con la presente invención se han descrito específicamente en este documento Sin embargo, el ADN se puede unir a las partículas de microproyectiles usando técnicas alternativas Por ejemplo, las partículas se puede recubrir con estreptavidma y el ADN se puede marcar termmalmente con cadenas de nucleotidos biotmilados, clivables por grupos tiol de cadena larga El ADN se adhiere a las partículas debido a la interacción estreptavidina-biotma, pero es liberado en la célula por reducción del enlace tiol mediante agentes reductores presentes en la célula Como alternativa, se pueden preparar partículas funcionalizando la superficie de una partícula de óxido aupco, proporcionando grupos amina libres El ADN, que posee una carga negativa fuerte, se une a las partículas funcionalizadas Aún más, se pueden depositar partículas cargadas en ordenamientos controlados sobre la superficie de los discos de vuelo Mylar usados en el dispositivo biolístico PDS-1000 Biolistics, facilitando de esa manera la distribución controlada de las partículas distribuidas en el tejido blanco Como se describió anteriormente, se propone además que la concentración de ADN usada para recubrir los microproyectiles puede afectar el recubrimiento de los transformantes que contienen una sola copia del transgen Por ejemplo, es probable que una concentración más baja de ADN no cambie necesariamente la eficiencia de la transformación, sino que en su lugar puede incrementar la proporción de sucesos de inserción de una sola copia En este sentido, se puede usar de 1 ng a 2000 ng aproximadamente de ADN transformante por cada 1 8 mg de microproyectiles iniciales En otras realizaciones de la invención, se pueden usar aproximadamente de 2 5 ng a 1000 ng, de 2 5 ng a 750 ng, de 2 5 ng a 500 ng, de 2 5 ng a 250 ng, de 2 5 ng a 100 ng o de 2 5 ng a 50 ng de ADN transformante por cada 1 8 mg de microproyectiles iniciales También se pueden emplear diversos métodos diferentes para incrementar la eficiencia de la transformación y/o para incrementar la proporción relativa de sucesos de transformación de pocas copias Por ejemplo, los inventores contemplan un ADN transformante modificador final con fosfatasa alcalina o un agente que pueda volver cohesivos los extremos del ADN antes de la transformación Ademas, se puede incluir un ADN transportador inerte con el ADN transformante, disminuyendo asi la concentración efectiva del ADN transformante sin disminuir la cantidad global de ADN empleado Estas técnicas se describen ademas en la solicitud de patente de E U A No de serie 08/995,451 , presentada el 22 de diciembre, 1997, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia (n) Parámetros biológicos Las condiciones de cultivo y otros factores pueden afectar el estado fisiológico de las células blanco y pueden tener efectos profundos sobre la eficiencia de transformación y de integración Primero, el acto de bombardear podría estimular la producción de etileno lo cual puede conducir a la senescencia del tejido La adición de compuestos antietileno podría incrementar la eficiencia de transformación Segundo, se propone que ciertos momentos del ciclo celular podrían ser mas apropiados para la integración del ADN introducido De aquí entonces que la sincronización de los cultivos celulares pueda mejorar la frecuencia de producción de transformantes Por ejemplo, la sincronización se puede lograr usando tratamiento con frío, arresto de aminoácidos u otros agentes de arresto del ciclo celular Tercero, el grado de hidratacion del tejido también puede contribuir a la cantidad de trauma asociado con el bombardeo, así como la capacidad de los microproyectiles para penetrar las paredes celulares La posición y orientación de un embrión u otro tejido blanco con relación a la trayectoria de las partículas también pueden ser importantes Por ejemplo, el dispositivo bio stico PDS-1000 no produce una dispersión uniforme de partículas sobre la superficie de la caja de Petn de interés La velocidad de las partículas en el centro de la placa es mayor que la velocidad de las partículas mas distantes del centro de la caja de Petp Por ello, resulta ventajoso situar el tejido blanco sobre la caja de Petp de manera tal que se evite el centro del disco, denominado por algunos como la 'zona de la muerte" Además, la orientación del tejido blanco con respecto a la trayectoria de los blancos también puede ser importante Se considera conveniente orientar el tejido con mayor probabilidad de regeneración en una planta hacia el flujo de partículas Por ejemplo, el escutelo de un embrión inmaduro comprende las células con mayor potencial embriogénico y por ello debería orientarse hacia el flujo de partículas También se ha informado que las células de levadura ligeramente plasmolizadas permiten obtener mayores eficiencias de transformación (Armaleo et al , 1990) Se propuso la hipótesis de que un estado osmótico alterado de las células contribuía en la reducción de los traumas asociados con la penetración del microproyectil Además, el crecimiento y la etapa del ciclo celular pueden ser importantes para la transformación 1 - Aiuste osmótico Se ha sugerido que un pretratamiento osmótico podría reducir, potencialmente, las lesiones asociadas con el bombardeo como resultado de una menor presión de turgor de la célula plasmolizada En un estudio anterior, la cantidad de células que expresan GUS de forma transiente aumento después de subcultivo tanto en medio fresco como en medio osmóticamente ajustado (solicitud PCT WO 95/06128, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) Los tiempos de pretratamiento de 90 minutos mostraron cantidades mayores de focos expresores de GUS que tiempos mas cortos Las células incubadas en 500 mOSM/kg de medio durante 90 minutos mostraron un incremento de aproximadamente 3 5 veces en focos GUS transientes con respecto al control Preferentemente, los embriones inmaduros son precultivados durante 4-5 horas antes del bombardeo sobre medio de cultivo que contiene sacarosa 12% Un segundo cultivo sobre sacarosa 12% se lleva a cabo durante 16-24 horas después del bombardeo Como alternativa, se tratan células tipo II sobre manitol 0 2 M durante 3-4 horas antes del bombardeo Se considera que también puede ser conveniente un pretratamiento de las células con otros solutos osmóticamente activos durante un periodo de 1-6 horas 2 - Configuración del plasmido En algunos casos sera conveniente distribuir ADN en células de maíz que no contenga las secuencias de ADN necesarias para el mantenimiento del plasmido vector en el huésped bacteriano, por ejemplo, E 5 Coh, tal como genes de resistencia a antibióticos, incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos resistencia a ampicilma, kanamicina y tetraciclma, y orígenes de replicacion de ADN procapontes En dicho caso, se puede purificar un fragmento de ADN que contiene el ADN transformante antes de la transformación Un ejemplo de un método de purificación es electroforesis 10 sobre un gel de agarosa de temperatura de fusión baja al 1 2%, seguido de recuperación del gel de agarosa fusionando cortes del gel en un exceso de 6- 10 de buffer Tps-EDTA (Tps-HCI 10 mM pH 8 0, EDTA 1 mM, 70°C-72°C), congelamiento y descongelamiento (37°C), y agrupación en pellets de la agarosa por centrifugación Después se puede utilizar una columna Qiagen Q- 15 100 para la purificación del ADN Para una recuperación eficiente del ADN, se puede ajustar la velocidad de flujo de la columna en 40 ml/hs Los fragmentos aislados de ADN se pueden recuperar de los geles de agarosa usando diversas técnicas de electroelucion, digestión enzimatica de la agarosa o unión del ADN a perlas de vidrio (por ejemplo, Gen 20 Clean) Ademas, se puede utilizar HPLC y/o partículas magnéticas para aislar los fragmentos de ADN Como una alternativa para el aislamiento de los fragmentos de ADN, se puede digerir un vector plasmido con una enzima de restricción y este ADN se puede distribuir en las células de maíz sin purificación previa del fragmento del cásete de expresión V Células receptoras de la transformación El cultivo de tejidos requiere medios y entornos controlados El término "medios" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se utilizan para cultivar células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto El medio es habitualmente una suspensión de diversas categorías de ingredientes (sales, aminoácidos, reguladores del crecimiento, azúcares, buffers) que son necesarias para el crecimiento de la mayoría de los tipos celulares Sin embargo, cada tipo de célula requiere un rango específico de proporciones de ingredientes para su crecimiento y un rango aun más específico de fórmulas para un crecimiento óptimo La velocidad de crecimiento de las células también vana entre cultivos iniciados con el orden de medios que permita el crecimiento de ese tipo de célula Los medios nutritivos se preparan como un líquido, pero éste puede ser solidificado por adición del liquido a materiales capaces de proporcionar un soporte solido El agar es el que se utiliza comúnmente con este fin El Bactoagar, agar Hazelton, Gelpte y Gelgro son tipos específicos de soportes solidos que son adecuados para el crecimiento de células vegetales en cultivos de tejido Algunos tipos de células crecerán y se dividirán ya sea en una suspensión líquida o sobre un medio sólido Tal como se describe en este documento, las células de maíz crecerán en suspensión o sobre medio sólido, pero la regeneración de plantas a partir de los cultivos en suspensión requieren la transferencia del medio líquido al medio sólido en algún momento del desarrollo El tipo y grado de diferenciación de las células en cultivo se verán afectados no sólo por el tipo de medio usado y por el entorno, por ejemplo, pH, sino también por el hecho de si el medio es sólido o liquido En la tabla 2 se ilustra la composición de diversos medios que son de utilidad para la creación de células receptoras y para la regeneración de plantas Las células receptoras blanco incluyen, pero sin limitaciones a las mismas, células mepstemáticas, incluyendo el ápice del brote (patente de E U A No 5,736,369), callos de tipo I, tipo II y tipo lll, embriones inmaduros y células gaméticas, tales como microsporas, polen, esperma y células huevo Se considera que cualquier célula a partir de la cual se puede regenerar una planta fértil es de utilidad como célula receptora Los callos de tipo I, tipo II y tipo lll se pueden iniciar a partir de fuentes de tejido incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, embriones inmaduros, mepstemas apicales de plántulas, microsporas y semejantes Aquellas células que son capaces de prohferar como callos también son células receptoras para una transformación genética La presente invención provee técnicas para transformar embriones inmaduros y regenerar a continuación de plantas transgénicas fértiles La transformación de embriones inmaduros evita la necesidad de un desarrollo por un término prolongado de los cultivos de las células receptoras El polen, así como las células precursoras, las microsporas, pueden funcionar como células receptoras durante la transformación genética o como vectores para llevar ADN extraño para su incorporación durante la fertilización La transformación directa de polen evita la necesidad del cultivo de células Las células mepstematicas ( es decir, las células vegetales capaces de una división celular continua y caracterizadas por un aspecto ortológico no diferenciado, habitualmente presentes en puntos o tejidos en crecimiento de las plantas tal como puntas de raíz, ápices de tallos, yemas laterales, etc ) representan otro tipo de célula vegetal receptora Debido a su crecimiento mdiferenciado y a su capacidad de diferenciación en órganos y totipotenciahdad, se puede recuperar una sola célula mepstemática transformada como una planta transformada completa De hecho, se propone que los cultivos embrionarios en suspensión pueden constituir un sistema de células mepstemáticas m vitro, que retiene la capacidad de una división celular continua en un estado mdiferenciado, controlado por el medio que lo rodea Las células vegetales en cultivo que pueden servir como células receptoras para una transformación con los segmentos deseados de ADN pueden ser cualquier célula vegetal, incluyendo células de maíz y más específicamente, células de Zea mays L Las células somáticas son de diversos tipos Las células embrionarias son un ejemplo de células somáticas que pueden ser inducidas a regenerar una planta por medio de la formación de un embrión Las células no embrionarias son aquellas que habitualmente no responden de dicha manera Un ejemplo de células no embrionarias son ciertas células de maíz Black Mexican Sweet (BMS) El desarrollo de los callos de maíz embpogenicos y los cultivos en suspensión que son de utilidad en el contexto de la presente invención, por ejemplo, como células receptoras para la transformación, se describieron en la patente de E U A No 5,134 074, y en la patente de E U A No 5,489,520, cuyos contenidos se incorporan por completo en este documento a modo de referencia Se pueden usar algunas técnicas que enriquecen a las células receptoras dentro de una población celular Por ejemplo, el desarrollo de callos de tipo II, seguido de selección manual y cultivo de tejido embpogenico friable, generalmente da como resultado un enriquecimiento de células receptoras para su uso en la transformación con microproyectiles El cultivo en suspensión, en particular usando los medios descritos en este documento, pueden mejorar la proporción de células receptoras a no receptoras en cualquier población dada Las técnicas de selección manual que se pueden emplear para seleccionar células receptoras pueden incluir, por ejemplo, evaluación de la morfología y diferenciación celular, o puede emplear diversos medios físicos o biológicos La cpoconservacion también es un método posible para seleccionar células receptoras La selección manual de las células receptoras, por ejemplo, por selección de células embrionarias de la superficie de un callo de tipo II, es un medio que se puede utilizar para tratar de enriquecer las células receptoras antes del cultivo (ya sea cultivo sobre medio sólido o en suspensión) Las células preferidas se pueden localizar en la superficie de un grupo de células y se pueden identificar además por su falta de diferenciación, su tamaño y citoplasma denso Las células preferidas serán en general las células que están menos diferenciadas o no comprometidas aún en la diferenciación Así, puede ser conveniente identificar y seleccionar las células de citoplasma denso, que poseen relativamente pocas vacuolas con una gran relación de núcleo a citoplasma (por ejemplo, determinado mediante observaciones ortológicas), de tamaño pequeño (por ejemplo, 10-20 µm) y capaces de divisiones seguidas y formación de proembpones somáticos Se considera que también se pueden emplear otros medios para identificar dichas células Por ejemplo, mediante el uso de colorantes, tales como azul de Evan, que es excluido de las células con membranas relativamente no permeables, tales como células embrionarias, y captadas por células relativamente diferenciadas, tal como células de raíz y células serpiente (denominados así por su aspecto tipo serpiente) Otros mediante posibles para identificar células receptoras incluyen el uso de marcadores de isozímas de células embrionarias, tal como el glutamato deshidrogenasa, que pueden ser detectados por coloración citoquímica (Fransz ef al , 1989) Sin embargo, se previene que el uso de marcadores de isozímas, incluyendo la glutamato deshidrogenasa, puede conducir a cierto grado de positivos falsos de células no embrionarias, tales como células de raíz, que no obstante poseen una actividad metabolica relativamente alta (i) Cultivo de células que serán receptores de transformación La capacidad para preparar y cnoconservar cultivos de células de maíz es importante para algunos aspectos de la presente invención, por cuanto provee un medio para preparar células para una transformación reproducible y satisfactoria Existen diversos tipos de medios diferentes que fueron desarrollados con anterioridad y que se pueden emplear para llevar a cabo vanos aspectos de la invención En el siguiente cuadro, cuadro 2, se describe la composición de los medios preferidos por el inventor para llevar a cabo estos aspectos de la invención CUADRO 2 Medios de cultivo para tejidos gue se utilizan para el desarrollo de callos de tipo II. para el desarrollo de cultivos en suspensión y para la regeneración de células vegetales (en particular células de maíz) * Medio MS básico descrito en Murashigee y Skoog (1962) Este medio se modifica habitualmente disminuyendo el NH4NO3 de 1 64 g/l a 1 55 g/l y omitiendo piridoxma HCl, acido nicotmico, mio-mositol y glicina ** NAA= Acido naftolacetico IAA= Acido indolacético 2-IP= 2, isopentiladenina 2,4-D= Acido 2,4-d?clorofenox?acét?co BAP= 6-benc?lam?nopur?na ABA= Acido abscísico *** Medio básico descrito en Clark (1982) ""Estos medios se pueden elaborar con o sin un agente solidificante Se ha desarrollado una cantidad de ejemplos de cultivos de maíz que se pueden utilizar para la transformación y se describen en la solicitud PCT WO 95/06128, cuyo contenido se incorpora específicamente en este documento a modo de referencia di) Medios En algunas realizaciones de la presente invención, las células receptoras se pueden seleccionar después del crecimiento en cultivo Cuando se emplean, las células cultivadas se pueden hacer crecer ya sea sobre soportes sólidos o en la forma de suspensiones líquidas En cualquier caso, se pueden proveer nutrientes a las células en la forma de medios y condiciones ambientales controladas Existen muchos tipos de medios para cultivo de tejidos compuestos de diversos aminoácidos, sales, azucares, reguladores del crecimiento y vitaminas La mayoría de los medios empleados en la práctica de la invención tendrán algunos componentes similares (véase el cuadro 2), pero pueden diferir en la composición y las proporciones de los ingredientes según la aplicación particular Por ejemplo, varios tipos celulares habitualmente crecen en más de un tipo de medio, pero exhibirán diferentes velocidades de crecimiento y morfologías distintas, dependiendo de los medios de crecimiento En algunos medios, las células sobreviven pero no se dividen Se han descrito diversos tipos de medios adecuados para el cultivo de células vegetales Los ejemplos de estos medios incluyen, pero sin limitaciones a los mismos, el medio N6 descrito por Chu ef al (1975) y medios MS (Murashige y Skoog, 1962) Se ha descubierto que los medios, tal como MS, que poseen una relación alta de amoniaco/nitrato son contraproducentes para la generación de células receptoras por cuanto promueven la pérdida de la capacidad morfogenica Los medios N6, por otro lado, poseen una relación algo menor de amoniaco/nitrato y se considera que promueven la generación de células receptoras manteniendo las células en un estado proembponapo capaz de divisiones sostenidas (ni) Mantenimiento El método de mantenimiento de cultivos de células puede contribuir a su utilidad como fuentes de células receptoras para la transformación La selección manual de células para la transferencia a medio de cultivo fresco, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo fresco, la composición del medio de cultivo y los factores ambientales incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos, la calidad y cantidad de luz y la temperatura son todos factores importantes para el mantenimiento de callos y/o cultivos en suspensión que son de utilidad como fuentes de células receptoras Se considera que la alternancia de callos entre diferentes condiciones de cultivo puede ser ventajoso para el enriquecimiento con células receptoras dentro de un cultivo Por ejemplo, se propone que las células se pueden cultivar en suspensión, pero que sean transferidas a medio solido a intervalos regulares Después de un periodo de crecimiento sobre medio sólido, las células pueden ser seleccionadas manualmente para su retorno de cultivo liquido Se considera que la repetición de esta secuencia de transferencias a medio de cultivo fresco permite un enriquecimiento con células receptoras También se considera que el paso de los cultivos de células a través de un tamiz de 1 9 mm es de utilidad para el mantenimiento la friabilidad de un cultivo de callos o en suspensión y puede ser ventajoso para el enriquecimiento en células transformables (iv) Métodos de cpoconservacion La cpoconservación es importante porque permite mantener y conservar un cultivo de células transformables conocido para su uso futuro, en tanto se eliminen los efectos nocivos acumulativos asociados con periodos de cultivos prolongados Las suspensiones de células y de callos se cnoconservaron usando modificaciones de métodos descritos previamente (Finfle, 1985, Withers & King, 1979) El protocolo de crioconservacion comprende la adición por pasos de una mezcla cpoprotectora, enfriada previamente (0 °C), sobre un período de una a dos horas, a las células enfriadas con anterioridad (0 °C) La mezcla se mantuvo a 0 °C durante todo este periodo El volumen de cnoprotector agregado era igual al volumen inicial de la suspensión de células (adición 1 1 ) y la concentración final de aditivos cpoprotectores era dimetilsulfóxido 10%, po etilenglicol 10% (6000 PM), prolina 0 23 M y glucosa 0 23 M Se dejó que la mezcla se equilibre a 0°C durante 30 minutos, después de lo cual la mezcla de suspensión de celulas/cpoprotector se dividió en alícuotas de 1 5 ml (0 5 ml de volumen en células empaquetadas) en 2 ml de viales de pohetileno Los tubos se enfriaron a 0 5 °C/m?nuto a -8 °C y se mantienen a esta temperatura para la formación de núcleos de hielo Una vez confirmada la formación de hielo extracelular visualmente, los tubos se enfriaron a 0 5 °C/m?nuto de -8 °C a -35 °C Se mantuvieron a esta temperatura durante 45 minutos (para asegurar una deshidratación inducida por frío uniforme en todos los grupos de células) En este momento, las células han perdido la mayor parte de su volumen osmótico (es decir, queda poca agua libre en las células) y se pueden introducir sin riesgo en nitrógeno líquido para su almacenamiento La poca cantidad de agua libre restante en las células junto con velocidades de enfriamiento rápidas de -35 °C a -196 °C impidieron la formación de grandes cristales de hielo organizados en las células Las células se guardan en nitrógeno líquido, que inmoviliza de forma efectiva a las células y disminuye la velocidad de los procesos metabo cos hasta el punto de evitar que el almacenamiento a largo plazo sea nocivo El descongelamiento de la solución extracelular se llevo a cabo retirando el tubo para conservación en frío del nitrógeno liquido y revolviéndolo en agua estéril a 42 °C durante 2 minutos aproximadamente El tubo se retiró del calor inmediatamente después que los últimos cristales se derritieron para evitar el calentamiento del tejido La suspensión de células (todavía en la mezcla cpoprotectora) se pipeteó sobre un filtro, que descansaba sobre una capa de células BMS (la capa alimentadora que proporcionaba un efecto de cuidado durante la recuperación) La solución cpoprotectora se retira con pipeta El medio de cultivo comprendía un medio para proliferación de callos con una fuerza osmótica incrementada La dilución del crioprotector tuvo lugar lentamente a medida que los solutos difundían alejándose a través del filtro y los nutrientes difundía hacia las células en recuperación Una vez que se observaba crecimiento de las células descongeladas, el tejido de crecimiento fue transferido a medio de cultivo fresco Si se desea iniciar el cultivo en suspensión, los grupos células fueron transferidos nuevamente al medio de suspensión líquido tan pronto como se había recuperado una masa suficiente de células (habitualmente dentro de 1 a 2 semanas) Como alternativa, las células se cultivaron sobre medio para proliferación de callos solido Después que se restableció el cultivo en el líquido (dentro de 1 a 2 semanas adicionales), se utilizó en los experimentos de transformación Cuando fuera conveniente, los cultivos cnoconservados previamente pueden ser congelados nuevamente para su almacenamiento VI Producción y caracterización de maíz transformado de forma estable Después de efectuar la distribución del ADN exógeno en las células receptoras, los pasos siguientes se refieren en general a la identificación de las células transformadas para su cultivo y la regeneración de la planta Tal como se menciono en este documento, con el fin de mejorar la capacidad de identificar transformantes, puede resultar conveniente emplear un gen marcador seleccionable o rastreable como, o ademas de, el gen de expresión de ínteres En este caso, se evaluara en general la población potencialmente transformada exponiendo las células a uno o mas agentes de selección, o se podra rastrear las células por la característica del gen marcador deseado (i) Selección Se cree que el ADN es introducido solamente en un pequeño porcentaje de células blanco en cualquier experimento Con el fin de proveer un sistema eficiente para la identificación de las células que reciben el ADN y lo integran en sus genomas, resulta conveniente emplear un medio para seleccionar aquellas células que están transformadas de forma estable Un ejemplo de realización de dicho método consiste en la introducción en la célula huésped de un gen marcador que confiera resistencia a algún habitualmente inhibitorio, tal como un antibiótico o un herbicida Los ejemplos de antibióticos que se puede utilizar incluyen los antibióticos aminoghcosido neomicina, kanamicina y paromomicina o el antibiótico higromicina La resistencia a los antibióticos aminoglicosido es conferida por las enzimas aminoghcosido fosfotransferasas, tal como la neomicina fosfotransferasa II (NTP II) o NPT I, en tanto la resistencia a higromicina es conferida por la higromicina fosfotransferasa A continuación, las células potencialmente transformadas son expuestas al agente de selección En la población, las células que sobrevivirán serán aquellas donde, en general, el gen que confiere resistencia ha sido integrado y se expresa a niveles suficientes como para permitir la sobrevida celular. Las células pueden ser evaluadas además para confirmar la integración estable del ADN exógeno Usando las técnicas descritas en este documento, más de un 40% de los embriones bombardeados pueden dar transformantes Un herbicida que se ha sugerido como un agente de selección adecuado es el herbicida de amplio espectro, bialafos. Bialaphos es un antibiótico tppéptido producido por Streptomyces hygroscopicus y está compuesto por fosfmotricina (PPT), un análogo del ácido L-glutamico y dos residuos L-alanina Después de eliminar los residuos de L-alanina con peptidadas intracelulares, la PPT es liberada y es un potente inhibidor de la glutamina smtetasa (GS), una enzima fundamental involucrada en la asimilación de amoníaco y el metabolismo del nitrógeno (Ogawa eí al , 1973) Las PPT sintéticas, el ingrediente activo de los herbicidas Liberty™, también es efectivo como agente de selección La inhibición de la GS en plantas por la PPT provoca una acumulación rápida de amoníaco y la muerte de las células vegetales El organismo productor de bialafos y otras especies del genero Streptomyces también sintetizan la enzima fosfinotncinacetil transferasa (PAT) que es codificada por el gen bar en Streptomyces hygroscopicus y el gen pat en Streptomyces vipdochromogenes El uso del gen de resistencia a herbicidas que codifica fosfinotpcinacetil transferasa (PAT) se describe en la publicación DE 3642 829 A, donde el gen de aislado de Streptomyces vipdochromogenes En el organismo de la fuente bacteriana, esta enzima acetila el grupo amina libre de la PPT impidiendo la autotoxicidad (Thompson er al , 1987) El gen bar ha sido clonado (Murakami er al , 1986, Thompson et al, 1987) y expresado en tabaco, tomate, papa (De Block, 1987) Brassica (De Block, 1989) y maíz (patente de E U A No 5,550,318) transgenico En informes anteriores, algunas plantas transgenicas que expresaban el gen de resistencia eran completamente resistentes a las formulaciones comerciales de PPT y bialafos en invernaderos Otro ejemplo de herbicida que es de utilidad en la selección de lineas celulares transformadas para la practica de la invención, es el herbicida de amplio espectro, glifosato El glifosato inhibe la acción de la enzima EPSPS que se activa en la vía biosintetica de aminoácidos aromáticos La inhibición de esta enzima conduce al arresto de los aminoácidos femlalanina, tirosina y tpptofano y los metabolitos secundarios derivados de los mismos En la patente de E U A No 4,535,060 se describe el aislamiento de mutaciones de EPSPS que confieren resistencia a glifosato presentes en el gen de Salmonella typhimupum para EPSPS, aroA El gen de EPSPS se clono de Zea mays y se introdujeron m vitro mutaciones similares a las halladas en un gen aroA resistente a glifosato Los genes mutantes que codifican enzimas EPSPS resistentes a ghfosato se describen en, por ejemplo, la patente internacional WO 97/4103 El gen mutante EPSPS mejor caracterizado que confiere resistencia a g fosato comprende cambios de aminoácidos en los residuos 102 y 106, si bien se considera que otras mutaciones también serán de utilidad (PCT/WO97/4103) Cuando se utiliza el sistema selectivo EPSPS-g fosato o bar-bialafos, el tejido bombardeado se cultiva durante 0-28 días sobre medio no selectivo y a continuación se transfiere a medio que contiene bialafos 1-3 mg/l o ghfosato 1-3 mM según corresponda En tanto se prefieren típicamente los rangos de 1-3 mg/l de bialafos o 1-3 M de g fosato, se considera que los rangos de 0 1-50 mg/l de bialafos o 0 1-50 mM de glifosato serán de utilidad en la practica de la invención El tejido se puede colocar sobre cualquier soporte solido o semisolido, poroso inerte, para el bombardeo incluyendo, pero sin limitaciones, filtros y medio de cultivo solido Los compuestos bialafos y glifosato se proveen como ejemplos de agentes adecuados para la selección de los transformantes, pero la técnica de esta invención no se limita a los mismos Se considera ademas que los herbicidas DALAPON, acido 2,2-dicloropropionico, pueden ser de utilidad para la identificación de las células transformadas La enzima acido 2,2-d?cloroprop?on?co deshalogenasa (deh) inactiva la actividad herbicida del acido 2,2-d?cloro?rop?on?co y por ello confiere resistencia herbicida a células o plantas que expresen un gen codificador de la enzima deshalogenasa (Buchanan-Wollaston et al , 1992, solicitud PCT WO 95/06128, patente de E U A No 5,508,468, patente de E U A No 5,508,468) Como alternativa, se puede emplear un gen codificador de antranilato sintetesa que confiere resistencia a algunos análogos de aminoácidos, por ejemplo, 5-met?ltr?ptofano o 6-met?lantran?lato, como gen marcador de selección El uso de un gen de antranilato smtetasa como marcador de selección se describió en la patente de E U A No 5,508,468, y en la solicitud de patente de E U A No 08/604,789 Un ejemplo de una característica marcadora que se puede rastrear es el pigmento rojo producido bajo el control del locus R en maíz Este pigmento puede ser detectado cultivando células sobre un soporte solido que contenga medios nutritivos capaces de sustentar el crecimiento en esta etapa y seleccionando células de las colonias (agregados visibles de células) que están pigmentadas Luego, estas células pueden ser cultivadas, ya sea en suspensión o sobre medios sólidos El locus R es de utilidad para la selección de transformantes de embriones inmaduros bombardeados De manera similar, la introducción de los genes C1 y B dará como resultado células y/o tejidos pigmentados La enzima luciferasa se puede utilizar como un marcador rastreable en el contexto de la presente invención En presencia del substrato lucifenna, las células que expresan luciferasa emiten luz que puede ser detectada sobre película fotográfica o de rayos X, en un lummometro (o contador de centelleo liquido) mediante dispositivos que aumentan la visión nocturna o mediante una cámara de video muy sensible a la luz, como una cámara contadora de fotones Ninguno de estos ensayos son destructivos y las células transformadas pueden ser cultivados después de su identificación La cámara contadora de fotones es especialmente valiosa por cuanto permite identificar células o grupos de células específicos que expresan luciferasa y manipularlas en tiempo real Otro marcado rastreable que se puede usar es el gen que codifica la proteina fluorescente verde (Sheen et al , 1995) Se considera ademas que las combinaciones de marcadores rastreables y de selección serán de utilidad en la identificación de células transformadas En algunos tipos de células o tejidos, es posible que un agente de selección, tal como bialafos o glifosato, no proporcione suficiente actividad destructora como para poder reconocer claramente las células transformadas o que cause una inhibición no selectiva sustancial de los transformantes y no transformantes por igual, lo cual hace que la técnica de selección no sea efectiva Se considera que la selección con un compuesto inhibidor del crecimiento, tal como bialafos o glifosato, a concentraciones inferiores a las que causan un 100% de inhibición seguido de examen del tejido en crecimiento para la expresión de un gen marcador rastreable, tal como la luciferasa, permitirá recuperar transformantes de tipos de células o tejidos que solos no son susceptibles de selección Se considera que la combinación de selección y búsqueda o rastreo permite identificar transformantes en una variedad mayor de tipos de células y tejidos (n) Regeneración y producción de semillas Las células que sobreviven la exposición al agente de selección o las células que han sido calificadas como positivas en un ensayo de rastreo o búsqueda, pueden ser cultivadas en medios que sustenten la regeneración de plantas En un ejemplo de una realización, se pueden modificar los medios MS y N6 (véase la tabla 2) incluyendo ademas sustancias tales como reguladores del crecimiento Un regulador de crecimiento preferido para dichos fines es el compuesto dicamba o 2,4-D Sin embargo, se pueden emplear otros reguladores del crecimiento, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o quizas aun piclorama Se ha encontrado que las mejoras de los medios efectuadas de esta manera y otras similares facilitan el crecimiento de células en etapas especificas del desarrollo El tejido se puede mantener sobre medios básicos con reguladores del crecimiento has disponer de tejido suficiente como para empezar los trabajos de regeneración vegetal o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para la regeneración, por lo menos 2 semanas, y luego se transfiere a medios que conducen a la maduración de los embpoides Los cultivos son transferidos cada 2 semanas sobre este medio El desarrollo de brotes indicara el momento de la transferencia a un medio sin reguladores del crecimiento Después se deja que las células transformadas identificadas por selección o rastreo y cultivadas en un medio apropiado que sustenta la regeneración, maduren en plantas Las plántulas en desarrollo son transferidas a una mezcla de crecimiento para plantas sin tierra y endurecida, por ejemplo, en una cámara de ambiente controlado con un 85% aproximadamente de humedad relativa 600 ppm de CO2 y 25-250 microeinsteins m 2 s 1 de luz Las plantas son maduradas ya sea en una cámara de crecimiento o invernadero Las plantas están regeneradas de 6 semanas a 10 meses después de la identificación del transformante, dependiendo del tejido inicial Durante la regeneración, las células son cultivadas con medios solidos en vasos para cultivo de tejido Las realizaciones ilustrativas de dichos recipientes son cajas de Petn y conos concentradores para plantas Las plantas en regeneración se cultivan con preferencia a 19-28 °C aproximadamente Una vez que las plantas en regeneración alcanzaron la etapa de desarrollo de brotes y raíz, pueden ser transferidos a invernadero para crecimiento adicionales y evaluación Se deben tener en cuenta, sin embargo que ocasionalmente puede ser necesaria una recuperación de embriones de los granos sobre las plantas transformadas debido a una cesación en el desarrollo de los granos y a una senescencia prematura de las plantas Para recuperar los embriones en desarrollo, se recortan de la superficie desinfectada de los granos 10-20 días después de la polinización y se cultivan Una realización de medios utilizados para esta cultivo en esta etapa comprende sales MS sacarosa 2% y agarosa 5 5 g/l En la recuperación de embriones, se hacen germinar grandes embriones (definidos como mayores de 3 mm de longitud) directamente sobre un medio apropiado Los embriones mas pequeños se pueden cultivar durante 1 semana sobre medio que contiene los ingredientes mencionados junto con acido abscisico 105M y luego son transferidos a un medio libre de regulador de crecimiento para su germinación Se puede recuperar la progenie de las plantas transformadas y evaluarla por la expresión del gen de expresión exogena mediante la aplicación localizada de un sustrato apropiado a partes de la planta, tal como las hojas En el caso de plantas transformadas con bar, se encontró que las plantas progenitoras transformadas (R0) y la progenie de las mismas de cualquier generación evaluadas no presentaban necrosis relacionada con bialafos después de la aplicación localizada del herbicida Basta a las hojas, si había actividad PAT funcional en las plantas evaluada mediante un ensayo enzimatico m vitro Toda la progenie PAT positiva evaluada contenía el gen bar, confirmando asi la presencia de la enzima y la resistencia a bialafos se asocio con la transmisión a través de la linea germinal del gen marcador (MI) Caracterización Se pueden emplear diversos ensayos para confirmar la presencia del ADN exogeno o de "transgen(es)" en las plantas en regeneración Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de "biología molecular", tales como transferencias Southern y Northern y PCR™, ensayos "bioquímicos", tal como la detección de la presencia de un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunologicos (ELISA y transferencias Western) o de una función enzimatica, ensayos con partes de plantas, tales como ensayos con hojas o raices, y también, mediante el análisis del fenotipo de la planta regenerada completa 1 Integración del ADN, expresión del ARN y herencia El ADN genomico se puede aislar a partir de lineas celulares de callos o de cualquier parte de la planta para determinar la presencia del gen exogeno mediante el uso de técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica Se debe tener en cuenta que no siempre es posible encontrar secuencias intactas, posiblemente debido a un reordenamiento o una supresión de secuencias en la célula Se puede determina la presencia de elementos de ADN introducidos mediante los métodos de esta invención con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR™) El uso de esta técnica permite amplificar fragmentos discretos de ADN y detectarlos por medio de electroforesis sobre gel Este tipo de análisis permite determinar si un gen esta presente en un transformante estable, pero no constituye una prueba de la integración del gen introducido en el genoma de la célula huésped Según la experiencia del inventor, sin embargo, el ADN ha sido integrado en el genoma de todos los transformantes que demuestran la presencia del gen mediante análisis por PCR™ Ademas no es posible utilizar técnicas de PCR™ para determinar si los transformantes poseen genes exogenos introducidos en diferentes sitios en el genoma, es decir, si los transformantes son de origen independiente Se considera que el uso de técnicas de PCR™ permitirá clonar fragmentos del ADN genomico huésped adyacente a un gen introducido Una prueba positiva de la integración del ADN en el genoma huésped y las identidades independientes de los transformantes pueden ser determinadas usando la técnica de hibridizacion Southern Esta técnica permite identificar secuencias especificas de ADN que fueron introducidas en el genoma huésped y secuencias flanqueadoras del ADN huésped De aquí que el patrón de la hibpdizacion Southern de un transformante dado sirve como una característica identificadora del transformante Ademas es posible mediante hibridizacion Southern demostrar la presencia de genes introducidos en ADN de gran peso molecular, es decir confirmar que el gen introducido ha sido integrado en el genoma de la célula huésped La técnica de hibpdizacion Southern provee información que se obtiene usando PCR™, por ejemplo, la presencia de un gen, pero también demuestra la integración en el genoma y caracteriza cada transformante individual Se considera que el uso de las técnicas de hibpdizacion por transferencia puntual o por hendidura, que son modificaciones de las técnicas de hibpdizacion Southern, permitirá obtener la misma información que deriva de la PCR™, por ejemplo, la presencia de un gen Se pueden emplear las dos técnicas de PCR™ e hibridizacion Southern para demostrar la transmisión de un transgen a la progenie En la mayoria de los casos, el patrón de hibridización Southern característico para un transformante segregará en la progenie como uno o más genes Mendelianos (Spencer ef al., 1992) indicando así una herencia estable del transgen. En tanto las técnicas en análisis de ADN se pueden llevar a cabo usando ADN aislado de cualquier parte de una planta, el ARN solamente se expresará en tipos particulares de células o tejidos y por consiguiente será necesario preparar ARN para su análisis a partir de estos tejidos. También se pueden emplear técnicas de PCR™ para la detección y cuantificación del ARN producido a partir de los genes introducidos. En esta aplicación de la PCR™ primero es necesario efectuar una transcripción inversa del ARN en ADN, usando enzimas tales como la transciptasa inversa, y luego, mediante el uso de técnicas de PCR™ convencionales, amplificar el ADN. En la mayoría de los casos, las técnicas de PCR™, si bien son útiles, no demostrarán la integridad del producto ARN. Se puede obtener más información acerca de la naturaleza del producto ARN mediante transferencia Northern. Esta técnica demostrará la presencia de una especie de ARN y brindara información sobre la integridad de dicho ARN. La presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede determinar usando hibridizaciones Northern con transferencias puntuales o por hendidura. Estas técnicas son modificaciones de la transferencia Northern y solamente demostrarán la presencia o ausencia de una especia de ARN. 2 Expresión qénica En tanto la transferencia Southern y la PCR™ se pueden emplear para detectar el o los genes en cuestión, no proveen información acerca de si el gen se expresa o no. La expresión puede ser evaluada mediante la identificación específica de productos proteicos de los genes introducidos o la evaluación de cambios fenotípicos provocados por su expresión En los ensayos para la producción e identificación de proteínas específicas se tienen en cuenta las propiedades físico-químicas, estructurales, funcionales u otras propiedades de las proteínas Las propiedades físico-químicas o estructurales únicas permiten separar e identificar las proteínas mediante procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis sobre gel nativo o desnaturalizante o enfoque isoeléctrico, o mediante técnicas cromatográficas, tal como cromatografía de intercambio iónico o exclusión de gel Las estructuras únicas de las proteínas individuales ofrecen oportunidades para utilizar anticuerpos específicos con el fin de detectar su presencia en formatos tales como un ensayo ELISA Se puede emplear una combinación de enfoques con aún mayor especificidad, tal como transferencias Western en las cuales se emplean anticuerpos para localizar los productos génicos individuales que han sido separados por medio de técnicas electroforéticas Se pueden emplear técnicas adicionales para confirmar de manera absoluta la identidad del producto de interés, tal como evaluación mediante secuenciación de aminoácidos después de purificación Si bien estos se encuentran entre los procedimientos mas utilizados, también se pueden emplear otros procedimientos También se pueden utilizar procedimientos de ensayo para identificar la expresión de las proteínas por su funcionalidad, en especial la capacidad de enzimas para catalizar reacciones químicas especificas que involucren substratos y productos específicos Después de estas reacciones se puede proveer y cuantificar la perdida de substrato o la generación de productos de las reacciones mediante procedimientos físicos o químicos Los ejemplos son tan vanados como la enzima a analizar y pueden incluir ensayos para medir la actividad enzimatica PAT, mediante el seguimiento de la producción de fosfinotpcina acetilada marcada radioactivamente a partir de fosfinotricina y 14C-acet?l CoA, o la actividad de la antranilato sintetasa, mediante el seguimiento de la perdida de fluorescencia del antranilato, para nombrar dos ensayos Con mucha frecuencia, la expresión de un producto genico se determina por evaluación de los resultados fenotipicos de su expresión Estos ensayos también pueden tomar muchas formas incluyendo pero sin limitaciones, en análisis de los cambios en la composición química, en la morfología o en las propiedades fisiológicas de la planta La composición química puede ser alterada por la expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de almacenamiento que cambian la composición de aminoácidos y puede ser detectada mediante análisis de aminoácidos o mediante enzimas que cambian la cantidad de almidón que luego puede ser analizado por espectometría de reflectancia con infrarrojo cercano Los cambios morfológicos pueden incluir una mayor altura o tallos más anchos En general, los cambios en la respuesta de las plantas o partes de plantas o los tratamientos impuestos son evaluados bajo condiciones cuidadosamente controladas denominados bioensayos Vil Cria de las plantas de la Invención Además de la transformación directa de un genotipo particular con una construcción acorde con la presente invención, las plantas de la invención se pueden obtener cruzando una planta que posee la construcción de la invención con una segunda planta sin la construcción Por ello, la presente invención no solo abarca una planta regenerada directamente a partir de células que han sido transformadas de acuerdo con la presente invención, sino también la progenie de dicha planta Tal como se utiliza en este documento el término "progenie" indica la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención El "cruzamiento" de una planta para proveer una línea de plantas que posee uno o más transgenes agregados con relación a la línea de plantas inicial, descrito en este documento, se define como una técnica que permite obtener como resultado la introducción de un transgen de la invención en una linea de plantas por cruzamiento de una línea inicial con una línea de plantas donante que comprende un transgen de la invención Para lograr esto, se llevarán a cabo, en general, los siguientes pasos de (a) Plantar semillas de la primera planta (línea inicial) y la segunda (línea de plantas donantes que contiene un transgen de la invención) progenitora; (b) Cultivar las semillas de la primera y la segunda progenitora en plantas que llevan flores; (c) Polinizar la flor femenina de la primera planta progenítora con el polen de la segunda planta progenitora; y (d) Cosechar las semillas producidas en la planta progenitora que lleva las flores femeninas. La conversión por retrocruza se define aquí como el proceso que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene el gen, el elemento o la secuencia de ADN deseado con una planta de un segundo genotipo que no posee dicho gen, elemento o secuencia de ADN deseado; (b) seleccionar una o más plantas de la progenie que contenga el gen, el elemento o la secuencia de ADN deseado; ( c ) cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) con el fin de transferir dicho gen, secuencia o elemento de ADN de la planta del primer genotipo a una planta del segundo genotipo.
La introducción de un elemento de ADN en un genotipo vegetal se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza Un genotipo vegetal en el cual se ha introducido una secuencia de ADN se puede denominar un genotipo, una línea, un endogamico o un híbrido convertido por retrocruza De manera similar, un genotipo vegetal que no posee dicha secuencia de ADN deseada se puede denominar un genotipo, una línea, un endogámico o un híbrido no convertido VIII Composiciones transqénicas vegetales Un avance particularmente importante de la presente invención es que provee métodos para expresar transgenes incluyendo genes marcadores y otros Dichos transgenes a menudo serán genes que dirigen la expresión de un producto polipeptidico o proteico particular, pero también pueden ser segmentos de ADN que no se expresan, por ejemplo, transposones tal como Ds que no dirigen su propia transposición Tal como se utiliza en este documento, un "gen que se puede expresar" es cualquier gen capaz de transcribirse en ARN (por ejemplo, ARNm, ARN antisentido, etc ) o de ser traducido en una proteína, expresado como característica de ínteres o semejantes, etc , y no se limita a genes marcadores de selección, de rastreo o no seleccionables La invención también contempla que, cuando se emplea un gen que se puede expresar que no es necesariamente un gen marcador en combinación con un gen marcador, se pueden utilizar los genes separados ya sea en el mismo segmento o en segmentos diferentes de ADN para la transformación En este ultimo caso, los diferentes vectores son distribuidos de forma concurrente en las células receptoras para maximizar la co-transformación La elección de los segmentos de ADN particulares que serán distribuidos en las células receptoras a menudo dependerá del proposito de la transformación Uno de los propósitos más importantes de la transformación de plantas de cultivo es la adición de algunas características deseables comercialmente e importantes desde un punto de vista agronómico a la planta Dichas características incluyen, pero sin limitaciones, resistencia o tolerancia a herbicidas, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia a enfermedades (virales, bacterianas, fúngicas, por nematodes), tolerancia y/o resistencia al estrés, ejemplificada por resistencia o tolerancia a sequía, calor, frío, heladas, humedad excesiva, estrés salino, estrés oxidativo, rendimientos incrementados, contenido y estructura de la composición alimentaria, aspecto físico, esterilidad masculina, desecación, capacidad para permanecer en pie, capacidad de proliferación, propiedades del almidón, cantidad y calidad de aceites, y semejantes Puede ser conveniente incorporar uno o mas genes que confieran cualquiera de dicha o dichas características deseables, tal como, por ejemplo, un gen o genes codificadores de resistencia a herbicidas En algunas realizaciones, la presente invención comprende la transformación de una célula receptora con más de un transgen ventajoso Se pueden proveer dos o mas transgenes en un solo suceso de transformación usando distintos vectores codificadores del transgen o usando un solo vector que incorporó dos o más secuencias codificadoras de genes Por supuesto, se puede emplear, según convenga, dos o mas transgenes cualesquiera de cualquier descripción, tal como los que confieren resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades (virales, bacterianas, fúngicas, por nematodes) o a sequía, esterilidad masculina, desecación, capacidad para permanecer en pie, capacidad de proliferación, propiedades del almidón, cantidad y calidad de aceite o los que incrementan el rendimiento o la calidad nutritiva Es un hecho conocido en la técnica que se puede introducir virtualmente cualquier composición de ADN, por medio de cualquier técnica de transformación para producir finalmente plantas transgenicas fértiles La construcción de vectores que se puede emplear junto con la presente invención será conocida por los especialistas del arte a la luz de la presente invención (véase por ejemplo, Sambrook et al , 1989, Gelvm et al , 1990) Las técnicas de la presente invención no se limitan entonces a secuencias de ADN particulares Por ejemplo, se pueden emplear segmentos de ADN en la forma de vectores y plasmidos o fragmentos lineales de ADN, que en algunos casos solamente contienen el elemento de ADN que sera expresado en la planta y semejantes En algunas realizaciones, se considera conveniente emplear vectores virales capaces de replicación en la transformación de monocotiledóneas Dichos vectores incluyen, por ejemplo, vectores "procanontes o eucanontes" del virus enano de trigo (WDV), tal como pW1-11 y PW1-GUS (Ugaki et al , 1991) Estos vectores tienen la capacidad de replicarse de forma autónoma en células de maíz así como de E Coli, y como tales proveen una mayor sensibilidad para detectar el ADN distribuido en las células transgénicas Un vector de replicación también puede ser de utilidad para la distribución de genes flanqueados por secuencias de ADN de elementos que se pueden transponer, tales como Ac, Ds o Mu Se ha propuesto (Laufs eí al , 1990) que la transposición de estos elementos dentro del genoma de maíz necesita una replicación del ADN También se considera que los elementos que se pueden transponer serán de utilidad para introducir fragmentos de ADN que carecen de los elementos necesarios para la selección y el mantenimiento del vector plásmido en bacterias, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y orígenes de rep cación de ADN También se propone que el uso de un elemento que se puede trasponer, tal como Ac, Ds o Mu, pomoverá activamente la integración del ADN deseado y de esa manera incrementará la frecuencia de células transformadas de forma estable Se considera además que puede ser conveniente co-transformar plantas o células vegetales con 2 o más vectores La co-transformación se puede lograr usando un vector que contiene el marcador y otro gen o genes de interés Como alternativa, diferentes vectores, por ejemplo, plásmidos, pueden contener los distintos genes de interés y los plásmidos pueden ser distribuidos de forma concurrente en las células receptoras Usando este método, se presume que un cierto porcentaje de células en los cuales se introdujo el marcador, también recibió el o los otros genes de interés. Por lo tanto, no todas las células seleccionadas por medio del marcador, expresaran los otros genes de ínteres que habían sido introducidos de manera concurrente en las células Los vectores, plasmidos, cosmidos, YAC (cromosomas artificiales de levadura), BAC (cromosomas artificiales bacterianos) y otros segmentos de ADN útiles para la transformación de células vegetales generalmente comprenderán, por supuesto, el ADNc el o los genes que se desee introducir en las células Estas construcciones de ADN pueden incluir ademas estructuras tales como promotores, potenciadores, polihgadores o aun genes reguladores según se desea El segmento de ADN o el gen elegido para la introducción en células, a menudo codificara una proteina que se expresara en las células recombinantes resultantes y/o que impartirán un fenotipo mejorado a la planta regenerada Sin embargo, esto no siempre es el caso y la presente invención también abarca plantas transgenicas que incorporan transgenes que no están expresadas Los componentes preferidos que se pueden incluir con mayor probabilidad con los vectores usados en la presente invención son como sigue (i) Elementos reguladores Las construcciones preparadas de acuerdo con la presente invención incluirán en general un promotor que limite el silenciamiento de genes en maíz o en otra monocotiledonea Como tal, este promotor se aislara de una especie distinta de una monocotiledonea en la cual se desee una expresión transgénica Las construcciones preferidas incluirán, en general, un promotor del género Coix Los promotores pueden ser aislados de novo de Coix O, como alternativa, se pueden aislar sobre la base de datos de genes o promotores conocidos Los ejemplos de genes y promotores de monocotiledóneas conocidos considerados de particular utilidad para el aislamiento de promotores de Coix se describieron específicamente en este documento Además de promotores, existen otros tipos de elementos que pueden regular la expresión génica Uno de dichos elementos es la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el comienzo de la secuencia de codificación, denominada secuencia directriz no traducida La secuencia directriz puede afectar la expresión genica y se han efectuado compilaciones de secuencias directrices para predecir las secuencias óptimas o subóptimas y generar secuencias directrices de "consenso" y preferidas (Joshi, 1987) Se contempla que las secuencias directrices preferidas incluyen aquellas que poseen las secuencias predichas para dirigir la expresión óptima del gen unido, es decir, incluyen una secuencia directriz de consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARNm e impedir una iniciación mapropiada de la traducción La elección de dichas secuencias será conocida por los especialistas en la técnica a la luz de la presente invención Las secuencias que derivan de genes de gran expresión en plantas, y particularmente en maíz, serán las más prefepdas Los potenciadores o las duplicaciones de potenciadores de la transcripción se pueden emplear para incrementar la expresión Estos potenciadores a menudo se hallan 5 con respecto al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucapontes, pero a veces se pueden insertar con orientación 5 o 3 directa o inversa con respecto a la secuencia de codificación En algunos casos, estos elementos potenciadores 5 son intrones Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos del promotor CaMV 35S los genes de la octopina sintetasa (Elhs eí al , 1987) el gen actma 1 de arroz, el gen de alcohol deshidrogenasa de maíz, el gen shrunken 1 de maíz y promotores de eucanontes no vegetales (por ejemplo levadura, Ma eí al , 1988) Se considera específicamente el uso de vectores que incluyen el elemento potenciador oes con la presente invención Este elemento se identifico primero como un potenciador palindromico de 16 bp del gen de la octopina sintetasa (oes) de Agrobacterium (Ellis eí al , 1987) y esta presente en por lo menos otros 10 promotores (Bouchez efa al , 1989) Se propone que el uso de un elemento potenciador tal como el elemento oes y en particular múltiples copias del elemento para incrementar el nivel de transcripción de los promotores adyacentes cuando se aplican en el contexto de una transformación en monocotiledoneas Se considera que puede ser conveniente la introducción de grandes secuencias de ADN que comprendan mas de un gen La introducción de dichas secuencias puede estar facilitada por el uso de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BAC o YAC, respectivamente) o aun de cromosomas artificiales vegetales Por ejemplo, el uso de BAC para una transformación mediada por Agrobactenum fue descrito por Hamilton eí al , (1996) Por ultimo, los segmentos de ADN mas deseable para introducir en el genoma de monocotiledoneas pueden ser genes o familias de genes homólogos que codifiquen una característica deseada (por ejemplo, rendimiento incrementado por acre) y que es introducido bajo el control de nuevos promotores o potenciadores acordes con la presente invención Las regiones reguladoras especificas de tejidos pueden ser particularmente útiles en este sentido Es mas, se considera que un uso particular de la presente invención puede ser la producción de transformantes que contengan un transgen que es dirigido al blanco de una manera especifica de tejidos Por ejemplo, los genes resistentes a insectos se pueden expresar específicamente en tejidos de verticilo y collar/lamina que son los blancos de la primera y segunda progenie, respectivamente, del barrenador de maíz europeo (ECB) De la misma manera los genes que codifican proteínas con una actividad particular contra barrenadores pueden ser direccionados directamente a los tejidos de la raíz Ademas, la expresión de ciertos genes que afectan la composición nutritiva de los granos debe ser direccionada a las semillas, por ejemplo, al endosperma o embrión Los vectores que se pueden emplear en el direccionamiento de la expresión genica especifica de tejidos en plantas transgenicas incluyen típicamente promotores específicos de tejidos y también pueden incluir otros elementos de control específicos de tejidos, tales como secuencias potenciadoras Los promotores que dirigen una expresión especifica o potenciada en algunos tejidos vegetales acordes con la invención serán conocidos por los especialistas en la técnica a la luz de la presente invención También se considera que la expresión especifica de tejidos puede llevarse a cabo funcionalmente mediante la introducción de un gen expresado de forma constitutiva (todos los tejidos) en combinación con un gen antisentido que solamente se expresa en los tejidos donde no se desea dicho producto genico Por ejemplo, se puede introducir un gen que codifica la protema de la toxina cristalina de S Thunngiensis (Bt) de manera tal que se expresa en todos los tejidos usando un promotor constitutivo, por ejemplo con el promotor de actina de Coix Aun mas, se considera que los promotores que combinan elementos de mas de un promotor pueden ser de utilidad Por ejemplo, en la patente de E U A No 5,491 ,288 se describe la combinación de un promotor del virus en mosaico de la coliflor con un promotor de histona La expresión de un transcripto antisentido del gen Bt en un grano de maíz, usando por ejemplo un promotor de zeina, impedirá la acumulación de la proteina Bt en semillas Por consiguiente la protema codificada por el gen introducido estara presente en todos los tejidos excepto en los granos Como alternativa, puede ser conveniente obtener nuevas secuencias promotoras especificas de tejidos de Coix para su uso de acuerdo con la presente invención Con el fin de lograr esto, se pueden aislar primero clones de ADNc del tejido en cuestión e identificar aquellos clones que se expresan específicamente en dicho tejido, por ejemplo, usando transferencia Northern Idealmente, sería conveniente identificar un gen que no está presente con un gran numero de copias, pero cuyo producto genico es relativamente abundante en tejidos específicos El promotor y los elementos de control de los correspondientes clones genómicos se puede localizar entonces usando las técnicas de biología molecular conocidas por los especialistas en la técnica Otro método que es de utilidad para la identificación de promotores específicos de tejidos es la expresión diferencial (véase, por ejemplo, patente de E U A No 5,599,672, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) En la expresión diferencial, se comparan ARNm de diferentes tipos de tejido La identificación de especies de ARNm presentes solamente en un tipo particular de tejido, o conjunto de tipos de tejidos, permite identificar los genes correspondientes que se expresan de una manera específica de tejidos Los ARN se pueden transcribir mediante la transcpptasa inversa para producir ADNc y a su vez se puede usar el ADNc para aislar clones que contienen los genes de longitud completa Como se describe específicamente en este documento, el ADNc también se puede usar para aislar homólogos o promotores homólogos, potenciadores o terminadores del gen respectivo usando, por ejemplo, PCR por supresión Se considera que la expresión de algunos genes en plantas transgenicas solamente sera conveniente bajo condiciones especificas Por ejemplo, se considera que la expresión de ciertos genes que confieren resistencia a factores de estrés ambiental, tal como sequía, solamente sera conveniente bajo condiciones reales de estrés Se considera ademas que la expresión de dichos genes durante todo el desarrollo de la planta puede tener efectos nocivos Es un hecho conocido que existe una gran cantidad de genes que responden al medio ambiente Por ejemplo la expresión de algunos genes, tal como rbcS codificador de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa, esta regulada por la luz mediada por un fitocromo Otros genes son inducidos por estímulos secundarios Por ejemplo, la síntesis de acido abscisico (ABA) es inducida por determinados factores ambientales, incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, el estrés por agua Se ha demostrado que una cantidad de genes son inducidos por ABA (Skpver y Mundy, 1990) También se anticipa que la expresión de genes que confieren resistencia a depredación por insectos sena deseable solamente bajo condiciones de infestación actual por insectos Por lo tanto, para algunas cualidades deseadas, se deseara la expresión mducible de genes en plantas transgenicas Se propone que, en algunas realizaciones de la presente invención, la expresión de un gen en una planta transgenica se deseara solamente en un cierto periodo de tiempo durante el desarrollo de la planta La medición de tiempo de desarrollo se correlaciona con frecuencia con la expresión de gen específico de tejido Por ejemplo, la expresión de proteínas de almacenamiento de zeína se inicia en el endosperma aproximadamente 10 días después de la polinización. También se contempla que puede ser útil hacer objetivo a DNA en sí dentro de una célula Por ejemplo, puede ser útil hacer objetivo a ADN introducido al núcleo ya que esto puede incrementar la frecuencia de transformación Dentro del núcleo en sí sería útil hacer blanco un gen con el fin de lograr la integración específica de sitio Por ejemplo, sería útil tener que un gen introducido a través de transformación reemplace un gen existente en la célula (n) Terminadores Las construcciones incluyen típicamente el gen de interés junto con una secuencia de ADN 3' terminal que actúa como una señal para terminar la transcripción y permitir la poli-adenilación del ARNm resultante. Se considera que los elementos 3' preferidos son los del gen de la nopa na sintetasa de Agrobactenum tumefaciens (extremo 3'nos) (Bevan eí al , 1983), el terminador del transcripto T7 del gen de la octopina smtetasa de Agrobacterium tumefaciens y el extremo 3' de los genes inhibidores I o II de proteasa de papa o tomate Además si se desea, se pueden incluir elementos reguladores tales como el mtrón 1 Adh (Callis eta al , 1987), el intrón de la sacarosa sintetasa (Vasil ef al , 1989) o el elemento omega TMV (Gal e, ef al., 1989) Como alternativa, el terminador puede ser aislado de acuerdo con la invención de Coix, como se describió anteriormente para las secuencias promotoras Los terminadores particularmente preferidos son aquellos que fueron aislados de Coix Por ejemplo, el terminador de gamma-coixinas y los terminadores oleosina 3 de Coix La clonación de estos terminadores se describe mas adelante en el ejemplo 2 y en el ejemplo 3 Las secuencias de ácidos nucleicos de la gamma-coixina y los terminadores oleosina 3 se muestran en, por ejemplo, la SEQ ID No 11 y la SEQ ID No. 17, respectivamente (MI) Peptidos de señal o de tránsito Las secuencias que se unen a la secuencia de codificación del gen de resistencia, que se eliminan después de la traducción del producto inicial de la traducción y que facilitan el transporte de la proteína hacia el interior o a través de membranas intracelulares o extracelulares, se denominan secuencias de tránsito (habitualmente hacia vacuolas, vesículas, plástidos y otros organelas mtracelulares) y de señal (habitualmente al retículo endoplasmatico, aparato de Golgí y fuera de la membrana celular) Al facilitar el transporte de la proteina hacia compartimentos dentro y fuera de la célula, estas secuencias pueden aumentar la acumulación del producto génico protegiéndolos de una degradación proteolítica Estas secuencias también permiten que otras secuencias de ARNm adicionales de genes de gran expresión se unan a la secuencia de codificación de los genes Dado que el ARNm que está siendo traducido por los ribosomas es más estable que el ARNm desnudo, la presencia de un ARNm que se puede traducir en el frente del gen pueden incrementar la estabilidad global del transcripto de ARNm del gen y de esa manera incrementar la síntesis del producto génico. Dado que las secuencias de tránsito y de señal habitualmente se eliminan del producto inicial de la traducción después de dicha traducción, el uso de estas secuencias permite la adición de otras secuencias traducidas que posiblemente no aparezcan en el polipéptido final. Se considera además que el direccionamiento de algunas proteínas puede ser conveniente con el fin de aumentar la estabilidad de la proteína (patente de E.U.A. No. 5,545,818, cuyo contenido se incorpora por completo en este documento a modo de referencia). Además, se pueden construir y emplear vectores en el direccionamíento ¡ntracelular de un producto géníco específico dentro de las células de plantas transgénicas o en el direccionamíento de una proteína hacia un entorno extracelular. Esto se logra generalmente uniendo la secuencia de ADN que codifica una secuencia de un péptido de tránsito o señal a la secuencia de codificación de un gen en particular. El péptido de tránsito, o de señal, resultante transportará la proteína hacia el destino intracelular o extracelular particular, respectivamente, y luego será eliminado después de la traducción. Un ejemplo particular de dicho uso se refiere al direccionamiento de una proteína que confiere resistencia a herbicidas, tal como la proteína EPSPS mutante, a un organela en particular, tal como el cloroplasto, antes que al citoplasma Esto se puede observar con el uso del péptido de tránsito rbcS, el péptido de transito a cloroplastos descrito en la patente de E U A No 5,728,925, o el peptido de transito optimizado descrito en la patente de E U A No 5,510,471 , que confiere direccionamiento de proteínas específico a plástidos Además, puede ser conveniente dirigir ciertos genes responsables de la esterilidad masculina a las mitocondpas o dirigir ciertos genes para resistencia a organismos fitopatogenicos a los espacios extracelulares o dirigir proteínas a la vacuola Un uso adicional se refiere al direccionamiento de enzimas involucradas en la biosintesis de aminoácidos o en la síntesis de aceites hacia los plastidos Dichas enzimas incluyen la ácido dihidrodipicolínico smtetasa que contribuye en el aumento del contenido de lisina en un alimento (iv) Genes marcadores Con el fin de mejorar la capacidad para identificar transformantes, se puede emplear un gen marcador o de selección rastreable como gen de ínteres expresable, o ademas del mismo Los "genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distintivo a las células que expresan dicho gen marcador y por lo tanto permiten distinguir dichas células transformadas de las células que no poseen el marcador Dichos genes pueden codificar un marcador seleccionable o rastreable, dependiendo de si el marcador confiere una característica que se pueda "seleccionar" con un medio químico, es decir, mediante el uso de un agente de selección (por ejemplo, un herbicida, antibióticos o semejantes) o si simplemente se trata de una característica que se pueda identificar mediante observación o evaluación, es decir, por "rastreo" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde) Por supuesto, existen muchos ejemplos de genes marcadores adecuados en el arte y que se pueden utilizar en la practica de la invención Los términos gen marcador seleccionable o rastreable también incluyen genes que codifican un "marcador de secreción", cuya secreción puede ser detectada como un medio para identificar o seleccionar las células transformadas Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que puede ser identificado mediante interacción con anticuerpos o aún enzimas secretables que pueden ser detectados por su actividad catalítica Las proteínas secretables se pueden dividir en distintas clases, incluyendo pequeñas proteínas de difusión detectables, por ejemplo, mediante ELISA, pequeñas enzimas activas detectables en solución extracelular (por ejemplo, a-amilasa, ß-lactamasa, fosfinotpcín acetiltransferasa), y proteínas que están insertadas o atrapadas en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia directriz, tal como la de la unidad de expresión de extensina o PR-S de tabaco) Con respecto a los marcadores secretables de selección, es particularmente conveniente el uso de un gen que codifique una proteína que queda secuestrada en la pared celular y cuya proteína incluye un epitope único Dicho marcador antigénico secretado empleará idealmente una secuencia epitope que proporcionara un nivel basal bajo en los tejidos vegetales, un promotor-secuencia directriz que impartirá una expresión eficiente y efectuara el direccionamiento a través de la membrana plasmática, y se podra obtener una protema que esta unida en la pared celular y que aun es accesible para los anticuerpos Una proteina de la pared secretada normalmente modificada para incluir un epitope único permitirá satisfacer todos dichos requisitos Un ejemplo de una protema adecuada para una modificación de esta manera es ia extensina, o ghcoprotema rica en hidroxiprolma (HPRG) Se prefiere el uso de HPRG de maíz (Steifel ef al 1990), ya que esta molécula esta bien caracterizada en términos de biología molecular, expresión y estructura proteica Sin embargo, se podría modificar cualquiera de las diversas extensinas y/o proteínas de pared ricas en glicina (Keller ef al , 1989) mediante la adición de un sitio antigenico con el fin de crear un marcador rastreable Un ejemplo de realización de un marcador rastreable secretable se refiere al uso de una secuencia de maíz codificadora de la proteina de la pared HPRG, modificada para incluir un epitope de 15 residuos de la pro-region de ?nterleuqu?na-1-ß (IL-1-ß) de munnos Sin embargo, se puede emplear casi cualquier epitope detectable en dichas realizaciones, seleccionados entre diversas combinaciones de antigeno anticuerpo conocidas por los especialistas en la técnica El epitope extracelular único, ya sea si deriva de IL-1 ß o de cualquier otra proteina o sustancia epitopica, puede ser detectado entonces de forma directa usando una marcación con anticuerpo junto con adjuntos cromogénicos o fluorescentes 1 Marcadores de selección 5 Se pueden usar diversos genes marcadores de selección en relación con la presente invención incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, el gen neo (Potrykus et al , 1985) que codifica resistencia a kanamicina y puede ser seleccionado usando kanamicma, G418, paromomicina, etc , el gen bar que confiere resistencia a bialafos, la proteína 10 EPSP smtetasa mutante (Hinchee eta al , 1988) que confiere resistencia a g fosato, el gen de nitnlasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoximlo (Stalker ef al , 1988), un gen mutante de acetolactato sintetasa (ALS) que confiere resistencia a imidazohnona, sulfonilurea u otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (solicitud de patente europea 15 154,204, 1985), el gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet eí al , 1988), el gen de la dalapon deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon, o un gen mutado de la antranilato sintetasa que confiere resistencia a 5-met?ltr?ptofano Cuando se emplea el gen mutante de la EPSP smtetasa, se pueden lograr ventajas adicionales mediante la incorporación de un péptido 20 de tránsito a cloroplasto adecuado, CTP (patente de E U A No 5,188,642) u OTP (patente de E U A No 5,633,448) y el uso de un gen modificado de EPSPS de maíz (solicitud PCT WO 97/04103) Una realización ilustrativa de genes marcadores de selección que se pueden utilizar en los sistemas para seleccionar transformantes son los genes que codifica la enzima fosfinotpcín acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces higroscopicus o el gen paf de Streptomyces vindochromogenes La enzima fosfinotpcinacetil transferasa (PAT) inactiva el ingrediente activo en el herbicida bialafos fosfinotpcina (PPT) La PPT inhibe la glutamina sintetasa, (Murakami ef a/ , 1986, Twell et al , 1989) provocando una acumulación rápida de amoníaco y muerte celular Cuando se desee emplear un gen de resistencia a bialafos en la práctica de la invención, el inventor ha descubierto que los genes particularmente útiles para este fin son los genes bar o paf que se pueden obtener de especies de Streptomyces (por ejemplo, No ATCC 21 ,705) La clonación del gen bar está descrita en la literatura (Murakami et al , 1986), Thompson et al , 1987) al igual que el uso del gen bar en el contexto de plantas (De Block et al , 1987, De Block et al , 1989, patente de E U A No 5,550,318) 2 Marcadores rastreables Los marcadores rastreables que se pueden emplear incluyen el gen de ß-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la cual se conocen vanos substratos cromogénicos, el gel del locus R, que codifica un producto que regula la producción de los pigmentos antocianina (de color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al , 1988), el gen de ß-lactamasa (Sutcliffe, 1978), que codifica una enzima para la cual se conocen vanos substratos cromogenicos (por ejemplo, PADAC, una cefalospopna cromogénica), el gen de xy/E (Zukowsky et al , 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogenicos, el gen a-amilasa (Ikuta et al , 1990), el gen de tirosinasa (Katz et al , 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina en DOPA y dopaqumona que a su vez se condensa para formar el compuesto fácilmente detectable, melamna, el gen de ß-galactosidasa, que codifica una enzima para la cual hay substratos cromogénicos, el gen de luciferasa (lux) (Ow et al , 1986), que permite una detección con bioluminiscencia, el gen de aecuopna (Prasher et al , 1985) que se puede utilizar en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio, o un gen que codifica una proteína fluorescente verde (Sheen et al , 1995, Haseloff et al , 1997, Reichel et al , 1996, Tian et al , 1997, WO 97/41228) Los genes del complejo R de maíz se consideran de particular utilidad como marcadores rastreables El complejo del gen R en maíz codifica una proteina que regula la producción de pigmentos de antocianma en la mayoría de las semillas y tejidos vegetales Las líneas de maíz pueden presentar uno, o hasta cuatro, alelos R que se combinan para regular la pigmentación de una manera especifica del desarrollo y de tejidos Por lo tanto, la introducción del gen R en dichas células causará la expresión de un pigmento rojo y, si se incorpora de manera estable, puede ser determinado visualmente como un sector rojo Si una línea de maíz lleva alelos dominantes para los genes que codifican intermediarios enzimáticos en la vía biosmtética de la antocíanina (C2, A1 , A2, Bz1 y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el locus R, la transformación de cualquier célula de dicha línea con R dará como resultado la formación de un pigmento rojo. Los ejemplos de líneas incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo rg-Stadler y TR112, un derivado de K55 que es r-g, b, Pl. Como alternativa, se puede utilizar cualquier genotipo de maíz si los alelos C1 y R se introducen juntos. Se considera además que se pueden emplear las regiones reguladoras del gen R en las construcciones quiméricas con el fin de proveer mecanismos para el control de la expresión de los genes quiméricos. Se conoce más diversidad de expresión fenotípica en el locus R que en cualquier otro locus (Coe et al., 1988). Se considera que las regiones reguladoras obtenidas de las regiones 5' con respecto al gen estructural R serán valiosas para dirigir la expresión de genes para, por ejemplo, resistencia a insectos, tolerancia a herbicidas u otras regiones de codificación de proteína. Para los fines de la presente invención, se cree que se puede emplear cualquiera de los diversos miembros de la familia del gen R (por ejemplo, P, S, Le, etc.). Sin embargo, el más preferido serán en general el Sn (en particular Sn;bol3). Sn es un miembro dominante del complejo del gen R y es funcionalmente similar a los loci R y B por cuanto Sn controla la deposición específica de tejidos de pigmentos antocianina en determinadas células de plántulas y plantas, por lo cual, su fenotipo es similar a R. Otro marcador rastreable que se puede utilizar en la presente invención es la lucíferasa de la luciérnaga, codificada por el gen lux. La presencia del gen lux en células transformadas puede ser detectada usando, por ejemplo, película de rayos X un contador de centelleo, espectrofotometpa fluorescente, cámaras de video de poca luz, cámaras de recuento de fotones o luminometpa con cavidades múltiples También se considera que este sistema puede ser desarrollado para un rastreo de bioluminiscencia a nivel poblacional, tal como sobre placas de cultivo de tejido o aun para el examen de plantas enteras El gen que codifica la proteina fluorescente verde es considerado particularmente util como informante (Sheen et al , 1995 Haseloff et al , 1997, Reichel et al , 1996 Tian et al , 1997, WO 97/41228) La expresión de la proteina fluorescente verde se visualiza en una célula o planta como fluorescencia después de iluminación con luz de determinadas longitudes de onda (v) Transqenes para la modificación de monocotiledoneas Uno de los avances particularmente importantes de la presente invención es que provee métodos y composiciones para una expresión eficiente en células vegetales de genes ademas de, o distintos de, los genes marcadores Dichos transgenes a menudo serán genes que dirigen la expresión de un producto proteico o pohpeptidico particular, pero también pueden ser segmentos de ADN que no se expresan, por ejemplo, transposones tal como Ds, que no dirigen su propia transposición Tal como se utiliza en este documento, un "gen expresable" es cualquier gen que pueda ser transcrito en ARN (por ejemplo, ARNm, ARN antisentido etc ) o traducido en una proteína, expresado como una característica de interés o semejantes, etc , y no se limita a genes marcadores seleccionables, rastreables o no seleccionares La invención también contempla que, cuando se emplea un gen expresable que no necesariamente es un gen marcador en combinación con un gen marcador, es posible usar los genes separados sobre un mismo segmento de ADN o sobre segmentos diferentes, en la transformación En este último caso, los distintos vectores se distribuyen de forma concurrente en las células receptoras con el fin de maximizar la co-transformacion La elección de los segmentos de ADN particulares a distribuir en las células receptoras a menudo depende del propósito de la transformación Uno de los propósitos fundamentales de la transformación de plantas de cultivo es la adición a las plantas de algunas características agronómicamente importantes y deseables comercialmente Dichas características incluyen, pero sin limitaciones, resistencia o tolerancia a herbicidas, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o tolerancia a enfermedades (virales, bacterianas, fúngicas, por nematodes), tolerancia y/o resistencia al estrés, por ejemplo resistencia o tolerancia a sequía, calor, enfriamiento, congelamiento, humedad excesiva, estrés salina, estrés oxidativo, mayores rendimientos, contenido y estructura de los alimentos, aspecto físico, esterilidad masculina, desecación, capacidad para permanecer en pie, capacidad de proliferación, cantidad y calidad del almidón, cantidad y calidad de aceite, cantidad y calidad de proteínas, composición de aminoácidos, y semejantes Puede ser conveniente incorporar uno o más genes que confieran cualquiera de dichas características deseables, tal como por ejemplo, gen o genes que codifiquen resistencia a herbicidas En algunas realizaciones, la presente invención contempla la transformación de una célula receptora con mas de un gen exogeno Tal como se utiliza en este documento, un "gen exogeno" es un gen que habitualmente no esta presente en el genoma huésped en un contexto idéntico Esto significa que el gen puede ser aislado de una especie diferente de la del genoma huésped o como alternativa, puede ser aislado del genoma huésped pero ligado operativamente a una o mas regiones reguladoras que difieren de aquellas presentes en el gen nativo no alterado También se pueden proveer dos o mas genes exogenos en un solo suceso de transformación ya sea usando distintos vectores codificadores de transgenes o usando un solo vector que contiene dos o mas secuencias codificadoras de genes Por ejemplo, los plasmidos que llevan las unidades de expresión bar y aroA con orientación convergente, divergente o cohneal, son considerados de particular utilidad Otras combinaciones preferidas son las de un gen de resistencia a insectos, tal como un gen Bt, junto con un gen de un inhibidor de proteasa, tal como pmll, o el uso de bar en combinación con cualquiera de los genes mencionados Por supuesto, se puede emplear dos o mas transgenes cualesquiera de cualquier descripción según necesidad, tal como los que confieren resistencia a herbicidas, a insectos, a enfermedades (virales bacterianas, fungicas, por nematodes) o sequía, esterilidad masculina, desecación, capacidad para permanecer en pie, capacidad de proliferación, propiedades del almidón, cantidad y calidad de aceite o aquellos que aumentan el rendimiento o la calidad nutpcional 1 Resistencia a herbicidas Los genes que codifican fosfinotpcinacetil transferasa (bar y pat), los genes de la EPSP sintetasa tolerante a g fosato el gen de la enzima degradadora de ghfosato, gox, que codifica al glifosato oxidoreductasa, los genes deh (que codifica una enzima deshalogenasa que inactiva el dalapon), acetolactato sintetasa resistente a herbicidas (por ejemplo, sulfonilurea e imidazolmona) y bxn (que codifica una enzima nitnlasa que degrada el bromoxinilo) son buenos ejemplos de genes de resistencia a herbicidas que se pueden emplear en la transformación Los genes bar y paf codifican la enzima fosfinotpcinacetil trapsferasa (PAT), que inactiva el herbicida fosfinotpcina e impide que este compuesto inhiba las enzimas glutamina sintetasa La enzima 5-enolp?ruv?lsh?qu?mato 3-fosfato smtetasa (EPSP sintetasa), habitualmente es inhibida por el herbicida N-(fosfonomet?l)gl?c?na (glisfosato) Sin embargo, se conocen genes que codifican enzimas EPSP sintetasa resistentes a glifosato Estos genes se consideran particularmente útiles para la transformación de monocotiledoneas El gen deh codifica la enzima dalapon deshalogenasa y confiere resistencia al herbicida delapon El gen bxn codifica una enzima nitplasa especifica que convierte bromoxinilo en un producto de degradación no herbicida 2 Resistencia a insectos Los genes de resistencia a insectos potenciales que se pueden introducir incluyen los genes de la toxina cristalina de Baclllus thunngiensis o genes Bt (Watrud et al , 1985) Los genes Bt proveen resistencia a plagas provocadas por lepidópteros o coleópteros, como el barrenador de maíz europeo (ECB) Los genes de toxina Bt preferidos que se pueden emplear en dichas realizaciones incluyen los genes CrylA(b) y CryM(c) En este aspecto también se pueden utilizar genes de endotoxinas de otras especies de B thunngiensis que afectan el crecimiento o desarrollo de insectos Se considera que los genes Bt preferidos para los protocolos de transformación descritos en este documento son aquellos en los cuales la secuencia de codificación ha sido modificada para provocar una expresión aumentada en plantas, y particularmente, en maíz Los medios para preparar genes sintéticos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de E U A No 5,550,365 y en la patente de E U A No 5,689,052, cuyos contenidos se incorporan específicamente y por completo en este documento a modo de referencia Los ejemplos de dichos genes modificados de toxina Bt incluyen el gen sintético Bt CrylA(b) (Perlak et al , 1991) y los genes sintéticos CrylA(c) denominados 1800b (solicitud PCT WO 95/06128) Algunos ejemplos de otros genes de toxina Bt conocidos por los especialistas en la técnica se muestran en el siguiente cuadro 3 CUADRO 3 Genes3 de la d-endotoxina de Bacillus thurinpiensis Nomenclatura nueva Nomenclatura anterior GenBank, No. de acceso CrylAa Cry1A(a) M11250 CrylAb Cry1A(b) M13898 CrylAc Cry1A(c) M11068 CrylAd Cry1A(d) M73250 CrylAe Cry1A(e) M65252 CrylBa CrylB X06711 CrylBb ET5 L32020 CrylBc PEG5 Z46442 Cryl Bd CryE1 U70726 CrylCa CrylC X07518 CrylCb CrylC(b) M97880 CrylDa CrylD X54160 CrylDb PrtB Z22511 CrylEa CrylE X53985 Cryl Eb CrylE(b) M73253 Cryl Fa CrylF M63897 Cryl Fb PrtD Z22512 CrylGa PrtA Z22510 CrylGb CryH2 U70725 CrylHa PrtC Z22513 CrylHb U35780 Cryl la CryV X62821 Cryllb CryV U07642 CryUa ET4 L32019 CryUb ET1 U31527 CrylK U28801 Nomenclatura nueva Nomenclatura anterior GenBank, No. de acceso Cry2Aa Cryl I A M31738 Cry2Ab CryllB M23724 Cry2Ac CryllC X57252 Cry3A Cryll IA M22472 Cry3Ba Cryl I IB X17123 Cry3Bb CrylllB2 M89794 Cry3C CrylllD X59797 Cry4A CrylVA Y00423 Cry4B CrylVB X07423 Cry5Aa CryVA(a) L07025 Cry5Ab CryVA(b) L07026 Cry6A CryVIA L07022 Cry6B CryVIB L07024 Cry7Aa CrylllC M64478 Cry7Ab CrylllCb U04367 CrydA Cryll IE U04364 Cry8B CrylllG U04365 CrydC CrylllF U04366 Cry9A CrylG X58120 Cry9B CrylX X75019 Cry9C CrylH Z37527 CrylOA CrylVC M 12662 Cry11A CrylVD M31737 Cry11 B Jeg80 X86902 Cry12A CryVB L07027 Cry13A CryVC L07023 Cry14A CryVD U 13955 Cry15A 34kDa M76442 Cry16A cbm71 X94146 Cry17A cbm71 X99478 Cry18A CryBPI X99049 Nomenclatura nueva Nomenclatura anterior GenBank, No. de acceso Cr 19A Jeg65 Y08920 CytlAa CytA X03182 CytlAb CytM X98793 Cyt2A CytB Z14147 Cyt2B CytB U52043 Los inhibidores de proteasas también pueden proporcionar resistencia a insectos (Johnson et al , 1989) y por consiguiente serán de utilidad en la transformación de plantas El uso del gen del inhibidor II de proteasas, pmll, de tomate o papa se considera de particular utilidad Aún mas ventajoso es el uso del gen pmll en combinación con un gen de toxina Bt, ya que se descubrió que el efecto combinado produce una actividad insecticida sinérgica También pueden ser de utilidad otros genes que codifican inhibidores del sistema digestivo de insectos o que codifican enzimas o cofactores que facilitan la producción de inhibidores Este grupo esta representado por los inhibidores de opzacistatina y amilasa, como los de trigo y cebada Además, los genes que codifican lectinas pueden conferir propiedades insecticidas adicionales o alternativas Las lectinas (originalmente llamados fitohemaglutininas) son proteínas que ligan carbohidratos multiv alentes que poseen la capacidad de aglutinar glóbulos rojos de un rango de especies Las lectinas se identificaron recientemente como agentes insecticidas con actividad contra gorgojos, ECB y escarabajos pulga (Murdock et al , 1990, Czapla & Lang, 1990) Los genes de lectma considerados de utilidad incluyen, por ejemplo, las lectmas de aglutinina de germen de trigo y cebada (WGA) y de arroz (Gatehouse et al , 1984), siendo preferidas las WGA Los genes que controlan la producción de polipeptidos grandes o pequeños activos contra insectos cuando son introducidos en dichos insectos plaga, tales como, por ejemplo, peptidos ticos, venenos y toxinas y hormonas peptidicas, constituyen otro aspecto de la invención Por ejemplo, se considera que la expresión de la hormona juvenil esterasa, dirigida a insectos plaga específicos, también puede presentar actividad insecticida o quizás causar el cese de la metamorfosis (Hammock et al , 1990) Los genes de maíz de expresión transgénica que codifican enzimas que afectan la integridad de la cutícula de los insectos constituyen otro aspecto mas de la invención Dichos genes incluyen aquellos que codifican, por ejemplo, quitinasa, proteasas, pasas y también genes para la producción de nikomicma, un compuesto que inhibe la síntesis de quitina, y la introducción de cualquiera de ellos produce plantas de maíz resistentes a insectos Los genes que codifican actividades que afectan la muda de los insectos, como aquellos que afectan la producción de la ecdisteroide-UDP-glucosil transferasa, también se encuentran dentro del alcance de transgenes de la presente invención Los genes que codifican enzimas que facilitan la producción de compuestos que reducen la calidad nutritiva de la planta huésped para los insectos plaga también están comprendidos por la presente invención Puede ser posible, por ejemplo, conferirle actividad insecticida a una planta alterando su composición de esterales Los insectos obtienen esteróles de su dieta y se emplean en la síntesis de hormonas y la estabilidad de membranas Por ello es que las alteraciones en la composición de esterales vegetales mediante la expresión de genes nuevos, por ejemplo, aquellas que promueven directamente la producción de esteróles no deseados o aquellas que convierten esteróles deseables en formas no deseadas, pueden tener un efecto negativo sobre el crecimiento y/o el desarrollo de insectos y por consiguiente dota a la planta de actividad insecticida Las lipoxigenasas son enzimas vegetales naturales que han demostrado presentar efectos antinutncionales sobre insectos y reducir la calidad nutpcional de sus dietas Por ello otras realizaciones de la invención se refieren a plantas transgencias con una mayor actividad lipoxigenasa que puede ser resistente a alimentación por insectos Tppsacum dactyloides es una especie de pasto que es resistente a algunos insectos incluyendo la barrenadora de maíz Se prevé que se pueden aislar los genes que codifican proteínas toxicas para insectos o que están involucrados en la biosintesis de compuestos tóxicos para insectos Tnpsacum y que estos genes nuevos serán de utilidad para conferir resistencia a insectos Se sabe que el fundamento de la resistencia a insectos en Tnpsacum es genético, porque dicha resistencia ha sido transferida a Zea mays por medio de cruzamientos sexuales (Branson y Guss, 1972) Se prevé ademas que otras especies de cereales, monocotiledoneas o dicotiledóneas pueden contener genes codificadores de proteínas que son toxicas para insectos que serian útiles para producir plantas de maíz resistentes a insectos Otros genes que codifican proteínas caracterizadas por presentar una actividad insecticida potencial también se pueden usar como transgenes en concordancia con esto Dichos genes incluyen, por ejemplo, el inhibidor de tripsina de caupi (CpTI, Hilder et al , 1987) que se puede emplear como un freno para los barrenadores, los genes codificadores de avermectina (Avermectin and Abamectm , Campbell, W C , Ed , 1989, Ikeda et al , 1987) que han probado ser de particular utilidad como frenos de los barrenadores de maíz, los genes de proteínas inactivadores de ribosomas, y aun los genes que regulan las estructuras vegetales También se contempla el maíz transgenico que incluye genes de anticuerpos anti-insectos y genes que codifican enzimas que pueden convertir un insecticida no toxico (pro-insecticida) cuando es aplicado a la parte externa de las plantas en un insecticida dentro de la planta 3 Resistencia al estrés o al medio ambiente La mejora en la capacidad del maíz para tolerar diversos tipos de estrés provocados por el medio ambiente, tales como, pero sin limitaciones a los mismos, estrés por sequía, humedad excesiva, enfriamiento, congelamiento, temperaturas altas, sales y oxidativo, también se puede lograr mediante la expresión de genes nuevos Se propone que las ventajas se pueden lograr en términos de una mayor resistencia a temperaturas de congelamiento mediante la introducción de una proteína "anticongelante", tal como la del lenguado (Cutler et al , 1989) o genes sintéticos derivados de las mismas También se puede conferir una mayor tolerancia al enfriamiento por medio de un incremento en la expresión de la gl?cerol-3-fosfatoacet?l transferasa en cloroplastos (Wolter et al , 1992) Se puede conferir resistencia al estrés oxidativo (a menudo exacerbado por condiciones tales como temperaturas de enfriamiento en combinación con grandes intensidades de luz) mediante la expresión de la superóxido dismutasa (Gupta et al , 1993) y puede ser mejorada con la glutation reductasa (Bowler et al , 1992) Dichas estrategias permiten una tolerancia al congelamiento en campos de emergencia reciente, asi como una extensión de variedades de rendimiento alto de maduración mas tardía a zonas de maduración relativa más temprana Se considera que la expresión de genes nuevos que afectan de manera favorable el contenido de agua de las plantas, el potencial total de agua, el potencial osmótico y el turgor mejorara la capacidad de las plantas para tolerar la sequía Tal como se utilizan en este documento, los términos "resistencia a sequía" y "tolerancia a sequía" hacen referencia a una mayor resistencia o tolerancia en las plantas al estrés inducido por una reducción en la disponibilidad de agua, en comparación con circunstancias normales, y la capacidad de la planta para funcionar y sobrevivir en ambientes con menos agua En este aspecto de la invención, se propone, por ejemplo, que la expresión de genes que codifican la biosíntesis de solutos osmóticamente activos, como compuestos poliol, pueden otorgar protección contra la sequía En esta clase se encuentran los genes que codifican la manitol-L-fosfato deshidrogenasa (Lee y Saier, 1982) y la trehalosa-6-fosfato sintetasa (Kaasen et al , 1992) La acción subsiguiente de las fosfatasas nativas en la célula o la introducción y coexpresion de una fosfatasa especifica, permitirá que los genes introducidos den como resultado la acumulación de manitol o trehalosa, respectivamente, ambos compuesto bien documentados en cuanto a su capacidad como compuestos protectores capaces de mitigar los efectos del estrés Se ha verificado la acumulación de manitol en tabaco transgenico y los resultados preliminares indican que las plantas que expresan mayores niveles de este metabohto tienen la capacidad de tolerar un estrés osmótico aplicado (Tarczynski et al , 1992, 1993) De manera similar, se ha documentado la eficacia de otros metabolitos en la protección ya sea la función de enzimas (por ejemplo, alanopina o acido propionico) o la integridad de membranas (por ejemplo, alanopina) (Loomis et al , 1989) y por ello la expresión de genes que codifican la biosmtesis de estos compuestos puede conferir resistencia a sequía de una manera similar o complementaria al manitol Otros ejemplos de metabolitos naturales que son osmóticamente activos y/o que proveen algún efecto protector directo durante la sequía y/o desecación, incluyen fructosa, eptptol (Coxson et al , 1992), sorbitol, dulcitol (Karsten et al , 1992), glucosilglicerol (Reed et al , 1984, ErdMann et al , 1992), sacarosa, estaquiosa (Koster y Leopold, 1988, Blackman et al , 1992) rafmosa (Bemal-Lugo y Leopold, 1992), pro na (Rensburg et al , 1993), glicinbetaína, ononitol y pinitol (Vernon y Bohnert, 1992) El crecimiento continuo de la bóveda del follaje y un mayor ajuste reproductor durante el tiempo de estrés aumentaran mediante la introducción y expresión de genes tales como aquellos que controlan los compuestos osmóticamente activos descritos anteriormente y otros compuestos parecidos Los genes actualmente preferidos que promueven la síntesis de un compuesto pohol osmóticamente activo son genes que codifican las enzimas man?tol-1 -fosfato deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintetasa y mioinositol O-metiltransferasa Se considera que la expresión de proteínas específicas también incrementa la tolerancia a la sequía Se han designado tres clases de proteínas embpogénicas tardías sobre la base de similitudes estructurales (véase Dure et al , 1989) Se ha demostrado que las tres clases de LEA participan en la maduración (es decir desecación) de semillas Dentro de estos 3 tipos de proteínas LEA, el Tipo II (tipo dehidpna) se ha implicado, en general, en la tolerancia a la sequía y/o la desecación en las partes vegetativas de plantas (es decir, Mundy y Chua, 1988, Piatkowski et al , 1990, Yamaguchi-Shinozaki et al , 1992) Recientemente, se encontró que la expresión de una LEA de Tipo lll (HVA-1) en tabaco tiene influencia sobre la altura de la planta, la madurez y la tolerancia a la sequía (Fitzpatpck, 1993) En arroz, la expresión del gen HVA-1 afectó la tolerancia al déficit de agua y a la salinidad (Xu et al , 1996) La expresión de genes estructurales de los tres grupos de LEA pueden por ello conferir tolerancia a sequía Otros tipos de proteínas inducidas durante el estrés por agua incluyen tiol proteasas, aldolasas y transportadores transmembrana (Guerrero ef al , 1990), que pueden conferir diversas funciones de tipo protectoras y/o reparadoras durante el estrés por sequía También se cosidera que los genes que afectan la biosintesis de hpidos, y por ende la composición de la membrana, también podrían ser de utilidad para conferirle a las plantas resistencia a sequía Muchos de estos genes para mejorar la resistencia a la sequía poseen modalidades de acción complementarias Por consiguiente, se prevé que las combinaciones de estos genes podrían presentar efectos aditivos y/o sinergicos para mejorar la resistencia a sequía en maíz Muchos de estos genes también mejoran la tolerancia (o la resistencia) al congelamiento, los tipos de estrés físicos que tienen lugar durante el congelamiento y la sequía son similares en cuanto a naturaleza y pueden ser mitigados de manera similar Se pueden conferir ventajas por medio de la expresión constitutiva de estos genes, pero el medio preferido para expresar estos genes nuevos puede ser mediante el uso de un promotor inducido por el turgor (tal como los promotores para los genes inducidos por el turgor descrito en Guerrero ef al , 1990 y Shagan ef al , 1993 cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia) Los patrones de expresión espacial y temporal de estos genes permitirán que el maíz resista mejor al estrés Se propone que la expresión de genes involucrados con características morfológicas especificas que permitan una mayor extracción de agua del suelo seco constituirá una gran ventaja Por ejemplo, la introducción y expresión de genes que alteren las características de las raices pueden mejorar la captación de agua También se considera que la expresión de genes que mejoran la disposición reproductora durante momentos de estrés sería de valor significativo Por ejemplo, la expresión de genes que mejoren la sincronización de la liberación de polen y la receptividad de las partes florales femeninas, es decir, de los estilos, será una gran ventaja Además se propone que la expresión de genes que minimicen el aborto de granos durante los momentos de estrés incrementara la cantidad de granos a cosechar y por ende sera también de valor Dado el rol general del agua en la determinación del rendimiento, se considera que al permitir que una utilización más eficiente del agua en el maíz, por medio de la introducción y expresión de genes nuevos, se logrará un mejor rendimiento aun cuando la disponibilidad de agua en la tierra no sea limitante Al introducir genes que mejoran la capacidad del maíz para maximizar la utilización del agua, se puede afectar un rango completo de tipos de estrés relacionados con la disponibilidad del agua, la estabilidad del rendimiento o la coherencia del rendimiento 4 Resistencia a enfermedades Se propone que se puede lograr una mayor resistencia a enfermedades mediante la introducción de genes en plantas monocotiledóneas, tal como el maíz Es posible producir resistencia a enfermedades causadas por virus, bacterias, hongos y nematodes También se considera que se puede lograr el control de organismos productores de micotoxina por medio de la expresión de genes introducidos La resistencia a virus se puede producir mediante la expresión de genes nuevos Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de una proteina de recubrimiento viral en plantas transgenicas puede impartir resistencia a infecciones en la planta por parte de dicho virus y tal vez de otros virus muy relacionados (Cuozzo et al , 1988, Hemenway ef al , 1988, Abel ef al , 1986) Se considera que la expresión de genes antisentido direccionados hacia funciones virales esenciales puede impartir resistencia a dicho virus Por ejemplo, un gen antisentido direccionado hacia el gen responsable de la replicación del ácido nucleico viral puede inhibir la replicación y conducir a resistecia al virus Se cree que la interferencia con otras funciones virales mediante el uso de genes antisentido también puede incrementar la resistencia a los virus Además, se propone que sería posible lograr resistencia a virus por medio de otros enfoques, incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, el uso de virus satélite Los ejemplos de enfermedades virales y tipo virales, para las cuales se podría introducir resistencia en plantas transgénicas acordes con la presente invención se enumeran a continuación en el cuadro 4 CUADRO 4 Enfermedades virales y tipo virales en plantas ENFERMEDAD AGENTE CAUSAL Estnacion de trigo americano Virus en mosaico estriado de trigo (mosaico estriado de trigo) Americano (AWSMV) Mosaico rayado de cebada Virus en mosaico rayado de cebada (BSMV) Enanismo amarillo de cebada Virus del enanismo amarillo de cebada (BYDV) Mosaico de bromaliáceas Virus en mosaico de bromaliaceas (BMV) Moteado clorótico de cereales* Virus moteado clorotico de cereales (CCMV) Bandas de venas cloroticas de maíz Virus de bandas de venas cloroticas (mosaico de maíz Brazil)1 de maíz (CCVBV) Necrosis letal de maíz Complejo viral (virus moteado clorótico de maíz [MCMV] y virus en mosaico enano de maíz [MDMV] A o B o virus en mosaico estriado de trigo [WSMV] Mosaico de pepino Virus en mosaico de pepino (CMV) Estriado clor ótico de Cynodon*'1 Virus estriado clorótico de Cynodon (CCSV) Mosaico del pasto Johnson Virus en mosaico del pasto Johnson (JGMV) Achaparramiento de maíz Asociación de organismos tipo micoplasma (MLO) Enanismo clorótico de maíz Virus del enanismo clorótico de maíz (MCDV) Moteado clorstico de maíz Virus moteado clorotico de maíz (MCMV) Mosaico enano de maíz Virus en mosaico enano de maíz (MDMV), cepas A, D, E Y F ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Manchas foliares de maíz* Virus de manchas foliares de maíz (MLFV) Línea de maíz* Virus de linea de maíz (MLV) Mosaico de maíz (follaje rayado, Virus en mosaico del maíz (MMV) enanismo rayado de maíz) Achaparramiento clorótico y moteado Virus del achaparramiento clorótico de maíz 1 y moteado de maíz* Manchas anulares pelúcidas de maíz* Virus de manchas anulares pelúcidas de maíz (MPRV) Raya gruesa de maíz* 1 Virus de raya gruesa de maíz (MRGV) Rayado fino de maíz* (enfermedad de Virus de rayado fino de maíz rayado fino) (MRFV) Rayas y hojas rojas de maíz* Mollicute'? Rayado rojo de maíz* Virus de moteado anular de maíz (MRMV Rio IV de maíz* Virus de Rio Cuarto de maíz (MRCV) Enanismo rugoso de maíz* (nanismo Virus de enanismo rugoso de maíz ruvido) (MRDV) (=V?rus de la enfermedad de labranza de cereales*) Achaparramiento estéril de maíz* Virus del achaparramiento estéril de maíz (cepas del virus estriado amarillo de cebada) Maíz rayado* Virus de maíz rayado (MSV) Maíz rayado (rayado clorótico de maíz, Virus de maíz rayado hoja blanca de maíz) Achaparramiento de maíz* 1* Virus de achaparramiento de maíz Aborto de espiguillas de maíz* Virus del aborto de espiguillas de maíz (MTAV) ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Parentesco por madre de vena de Virus del parentesco por madre de maíz* vena de maíz (MVEV) Mazorca wallabí de maíz* Virus de mazorca wallabí de maíz (MWEV) Hoja blanca de maíz* Virus de hoja blanca de maíz Mosaico de líneas blancas de maíz Virus en mosaico de lineas blancas de maíz (MWLMV) Hoja roja de mijo* Virus de hojas rojas de mijo (MRLV) Mosaico cerealero del norte* Virus en mosaico cerealero del norte (NCMV) Pseudoroseta de avena* Virus de la pseudoroseta de avena (zakukhvanie) Enanismo estéril de avena* Virus del enanismo estéril de avena (OSDV) Enanismo de rayas negras de arroz* Virus del enanismo de rayas negras de arroz (RBSDV) Arroz rayado* Virus del arroz rayado (RSV) Mosaico de sorgo Virus del mosaico de sorgo (SrMV), antes virus en mosaico de la caña de azúcar (SCMV), cepas H, I y M Enfermedad de la caña de azúcar de Virus de la enfermedad de la caña de FIJI* azúcar de FIJI (FDV) Mosaico de la caña de azúcar Virus en mosaico de la caña de azúcar (SCMV), cepas A, B, D, E, SC, BC, Sabí y MB (antes MDMV-B) Parentesco por madre de vena* 1 Virus' Mosaico manchado de trigo Virus en mosaico manchado de trigo (WSMV) Se desconoce si aparece de forma natural en maíz en los EE UU. Enfermedad viral menor Se propone que se puede lograr una mayor resistencia a enfermedades causadas por bacterias y hongos mediante la introducción de genes nuevos Se considera que serán de utilidad los genes que codifican los asi denominados "antibióticos peptídicos", proteínas relacionadas con una patogénesis (PR), resistencia a toxinas y proteínas que afectan las interacciones huesped-patogeno, como características morfológicas Los antibióticos peptídicos son secuencias de po péptidos que son inhibidores del crecimiento de bacterias y otros microorganismos Por ejemplo, las clases de peptidos denominados cecropinas y magaininas inhiben el crecimiento de muchas especies de bacterias y hongos Se propone que la expresión de proteínas PR en plantas monocotiledóneas, tal como maíz, puede ser de utilidad en conferir resistencia a enfermedades bacterianas Estos genes son inducidos después del ataque del patógeno a una planta huésped y se han dividido en por lo menos cinco clases de proteínas (Bol, Linthorst, y Comelissen, 1990) Entre las proteínas PR se encuentran las ß-1 ,3-glucanasas, quitinasas y osmotina y otras proteínas que se cree que cumplen alguna función en la resistencia de las plantas a los organismos que provocan enfermedades Se han identificado otros genes que presentan propiedades antifúngicas, por ejemplo, UDA (lectina de ortiga urticante) y hevema (Broakaert ef al , 1989, Barkai-Golan ef al , 1978) Se sabe que algunas enfermedades de las plantas son causadas por la producción de fitotoxinas Se propone que la resistencia a estas enfermedades se podría lograr mediante la expresión de un gen nuevo que codifique una enzima capaz de degradar o ¡nactivar de otra manera a la fitotoxina. También se considera que la expresión de genes nuevos que alteran las interacciones entre la planta huésped y el patógeno puede ser de utilidad para reducir la capacidad del organismo que provoca la enfermedad para invadir los tejidos de la planta huésped, por ejemplo, un incremento en la cerosidad de la cutícula de la hoja u otras características morfológicas. Los ejemplos de enfermedades bacterianas y fúngicas, incluyendo los mildiú pulverulentos, para los cuales se puede introducir resistencia en plantas transgénicas acordes con la presente invención, se enumeran a continuación en los cuadros 5, 6 y 7.
CUADRO 5 Enfermedades bacterianas en plantas ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Podredumbre de tallo y tizón de hoja Pseudomonas avenae subsp avenae bacteriano Manchas foliares bacterianas Xanthomonas campestns pv holcicola Podredumbre de tallo bacteriana Entßrobacter d?ssolvens=Erw?n?a dissolvens Podredumbre de ápice y tallo bacteriana Erwmia carotovora subsp Carotovora, Erwmia chrysanthemí pv Zeae Rayas bacterianas Pseudomonas andropogonis Manchas de chocolate Psedomonas syringae pv coronafaciens Tizón y marchitamiento bacteriano de Clavibacter michiganensis subsp Goss (marchitamiento y moteado foliar) nebraskens?s=Corynßbactepum michiganense pv Nebraskense Manchas de Holcus Pseudomonas syringae pv Syringae Lamina foliar purpura Bacteria Hemiparasitica +(vease bajo hongos) Tizón de plántula-podredumbre de Bacillus subtilis semillas Enfermedad de Stewart (marchitamiento Pantoea stewart??=Erw?n?a stewartn bacteriano) Achaparramiento de maíz Spiroplasma kunkelu (achapparramiento, achapparramiento de maíz, achaparramiento de maíz de Mesa Central o de Rio Grande) CUADRO 6 Enfermedades fúnqicas en plantas ENFERMEDAD PATÓGENO Tizón foliar con antracposis y Colletotpchum grammicola (teleomorph podredumbre de tallo con antracnosis Glomerella grammicola Politis) Glomerella tucumanensis (anamorph Glomerella falcatum Went) Podredumbre de granos y mazorcas por Aspergillus flavus Link Fr Aspergillus Manchas de laminas y hojas con Rhizoctonia solaní kuhn=Rh?zocton?a bandas* microsclerotia J Matz (teleomorfo Thanatephorus cucumeps) Enfermedad del manojo negro Acremonium stnctum W Gams= Cephalosponum acremonium Auct No Corda Podredumbre negra de granos* Lasiodiplodia theobromae= Botryodiplodia theobromae Borde blanco* Marasmiellus sp Manchado marran (manchado negro, Phiysoderma maydis podredumbre de tallo) Podredumbre de granos por Acremonium str?ctum=Cephalospor?um Cephalospopum acremonium Podredumbre de carbón Macrophomma phasßolina Podredumbre de mazorca Corticium* Thanatephorus cucumens=Cort?c?um sasakn Manchado foliar por Curvulapa Curvulapa claveta, C eragrostidis ,=C maculans (teleomorph cochliobolus eragrostidis), Curvulana inaequalis, C intermedia (teleomorph Cochiobolus ENFERMEDAD PATÓGENO intermedius), Curvulana lunata (teleomorph cochliobolus lunatus), Curvulana pallescens (telomorph Cochliobolus pallescens), curvulana senegalensis, C tuberculata (teleomorph Cochilobolus tuberculatus) Manchado fo car por Didymella* Didymella exitahs Podredumbre de tallo y podredumbre de Diplodia frumeti (teleomorph mazorcas por Diplodia Botryosphaena festucae) Podredumbre de mazorca, Diplodia mayd?s=Stenocarpella maydis podredumbre de talo, podredumbre de semillas y tizón de plántulas por Diplodia Rayado foliar o manchado foliar por Stenocarpella macrospora=D?plod?a Diplodia macrospora *Se desconoce si aparece de forma natural en maíz en los EE UU CUADRO 7 Mildiú pulverulento en plantas ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Mildiú pubescente rayado marrón* Sclerophthora reyssiae var zeae Mildiú pubescente de cima loca Sclerophthora macrospora=Sclerospora macrospora Mildiú pubescente de mazorca verde Scleoropora gaminicol (mildiú pubescente graminícola) Mildiú pubescente de Java** Peronosclerospora maydis=Sclerospora maydis Mildiú pubescente de Filipinas* Peronosclerospora ph?l?pp?nens?s=Sclerospora phi ppinensis Mildiú pubescente de sorgo* Peronosclerospora sorgh?=Sclerospora sorghi Mildiú pubescente espontáneo Peronosclerospora spontanea=Sclerospora spontanea Mildiú pubescente de caña de azúcar* Peronosclerospora sacchap=Sclerospora sacchan Podredumbre de mazorca seca Nigrospora oryzae (teleomorph Khuskia (podredumbre de tallo, grano y marlo) oryzae) Podredumbres de mazorca, menor Alternaría alternata= A Tenuis, aspergillus glaucus, A niger, Aspergillus spp , Botrytis cinérea (teleomorph: Botryotima fuckeliana), Cunninghamella sp , Curvulapa pallescens, Doratomyces stemon?t?s=Cephalotpchum stemonitis, Fusapum culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus Tiegh , R stolon?fer= R. nigpcans Scpíña opsis brumptu ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Cornezuelo* (diente de caballo) Calviceps gigantea (anamorfo Sphacelia sp ) Mancha ocelar Aureobasidium zeae=Kabat?ella zeae Podredumbre de tallo y mazorca por Fusanum subglut?nans=F Momliforme Fusarium var subglutmans Podredumbre de tallo, raíz y grano Fusanum monilifoima (teleomorph podredumbre de semilla y tizón de Gibberella fujiduroi) semillas por Fusarium Podredumbre de tallo, podredumbre de Fusarium avenaceum (teleomorph raíz de plántula por fusarium Gibberella avenacea) Podredumbre de tallo y mazorca por Gibberella zeae (anamorph fusarium Gibberella graminearum) Podredumbre gris de mazorca Botryosphaena zeae=Physalospora zeae (anamorph Macrophomazeae) Manchado foliar gris (manchado foliar Cercospora Sorght=C sorghi var Maydis, por Cercospora) C zeae-maydis Podredumbre radicular por Exserohilum Helminthosponum ped?cellatum=Helm?nthospopum pedicellatum (teleomorfo Setosphaena pedicellata) Podredumbre de mazorca por Cladosporium Hormodendrum (podredumbre por cladospono?des=Hormodendrum Cladosporium) cladosponoides, C herbaru fteleomorfo Mycosphaerella tassiana) Manchado foliar por Hyalothyridtum* Hyalothyndium maydis Marchitamiento tardío* Cephalosponum maydis Manchas foliares, menor Alternaría atternata, Ascochyta maydis, A tntict, A zeicola, Bipolaps v?ctonae= ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Helmmthosponum victopae (teleomorph Cochliobolus victopae), C sativus (anamorph Bipolaps sorok?n?nan=H sorok?n?anum=H sativum) Epicoccum nigrum, Exserohilum prolatum=Drechs?era prolata (teleomorph Setosphaepa prolata) Graphium penicillioides, leptosphaena maydis, Leptothypum zeae, Ophiosphaerella herpotpcha, (anamorph Scolecosponella sp ), Paraphaesophaepa michotil, Phoma sp ,Septona zeae, S zeicola, S zeina Tizón foliar de maíz del norte Setosphaepa tucica (anamorph (marchitamiento blanco, podredumbre Exserohilum turcum=helm?nthosponum de tallo superior, rayas) turcicum) Manchado foliar de maíz del norte, Cochliobolus carbonum (anamorph podredumbre de mazorca por Bfolaps ze?cola=Helm?nthospor?um Helminthospopum (raza 1) carbonum) Podedumbre de mazorca por Penicillium spp P chrysogenum, P Penicillium (moho azul) expansum, P oxalicum Podredumbre de tallo y de raíz por Phaeocytostroma ambiguum, = Phaeocytostroma Phaeocytosporella zeae Manchado foliar por Phaeosphaena* Phaeosphaena mayd?s=Sphaerul?na maydis Podredumbre de mazorca por Botryosphaena festucae=Physalospora Physalospora (podredumbre de zeicola (anamorph Diplodia frumenti) mazorca por Botryosphaena) Lamina foliar purpura Bacteria Hemiparasitica y hongos Podredumbre de tallo y de raíz por Phoma terrestps=Pyrenochaeta terrestps Pyrenochaeta ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Podredumbre radicular por Pythium Pythium spp , P arrhenomanes, P grammicola Podredumbre de tallo por Pythium Pythium aphan?dermatum=P butlep L Enfermedad de granos rojos (moho de Epicoccum nigrum mazorca, podredumbre de tallo y de semillas Podredumbre de mazorca por Rhizoctonia zeae (teleomorph Waitea Rhizoctonia (podredumbre esclerótico) circmata) Podredumbre de tallo y de raíz por Rhizoctonia solam, Rhizoctonia zeae Rhizoctonia Podredumbres radiculares, menor Aternapa alt rnate, cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acumtnatu (teleomorph Gibberella acummata), F Equiseti (teleomorph G Intpcans), F Oxysporum, F pallidoroseum, F Poae, F Roseum, G Cyanogena, (anamorph F Sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp , Pepconia ciranata, Phytophthora cactorum, P drechslen, P nicotianae var Parasítica, Rhizopus arrhizus Manchado foliar por rostratum Setosphaepa rostrata=Helm?nthospor?um (enfermedad foliar por rostratum) Helminthospopum, podredumbre de tallo y de mazorca) Roya, maíz común Puccmia sorghi Roya, maíz del sur Puccinia polysora Roya, maíz tropical Physopella pallescens, P zeae=Ang?opsora zeae ENFERMEDAD AGENTE CASUAL Podredumbre de mazorca por Selerotium rolfsn Sacc (teleomorph Sclerot?um*(t?zon del sur) Athelia rolfsn Podredumbre de semillas-tizon de Bipolaps sorokiniana, B plántulas ze?cola=Helm?nthospor?um carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turc?cum=Helm?nthospopum tucicum, fusarium avenaceum, F Culmorum, F moniliforme, Gibberella zeae (anamofh F Graminearum), Macrophomma phaseolina, Penicillium spp , Phomopsis sp , Pythium spp , Rhizoctonia solaní, R zeae, Selerotium rolfsn, spicana sp Manchado foliar por Selenophoma* Selenophoma sp Podredumbre de lamina foliar Gaeumannomyces grammis Podredumbre de vainas Myrothecium grammeum Moho de ensilaje Monascus purpureus, M Ruber Roya negra, común Ustilago zeae=U maydis) Roya negra, falsa Ustilaginoidea virens Roya negra, cabeza Sphacelotheca re?l?ana=Sponsor?um holci-sorghi Podredumbre de tallos y tizón foliar de Cochiliobolus heterostrophus (anamorph maíz del sur Bfolaps mayd?s= Helmmthosporium mydis ENFERMEDAD AGENTE CAUSAL Manchado foliar del sur Stenocarpella macrospora = Dflodia macrospora Podredumbre de tallo, menor Cercospora sorghi, Fusarium episphaena, F mensmoides, F oxysporum Schlechtend, F poae, F roseum F solaní (telemorfo Nectna haematococca), F Tncinctum, Mapannaea elegans, Mucor s , Rophographus zeae, Spicapa sp Podredumbre de almacenamiento Aspergillus sp , Penicilhum spp y otros hongos Manchado de alquitrán * Phyllachora aydis Podredumbre radicular y de mazorca Tnchoderma vinde = T lignorum por Tpchoderma telemorph Hypocrea sp Podredumbre blanca de tallos, Stenocarpella maydis = dflodia radicular y de mazorca zeae Tizón amarillo de hojas Asochyta ischaemí, Phyllosticta mayd?s(telemorph mycosphaerella zeae-maydis) Manchado foliar en zonas Gloeocercospora sorghi * Se desconoce si aparece de forma natural en maíz en los EE UU Los nematodes parásitos de plantas constituyen la causa de enfermedades en muchas plantas, incluyendo el maíz Se propone que sena posible volver resistentes alas plantas de maíz a estos organismos por medio de la expresión de genes nuevos Se prevé que el control de infestaciones por compuestos nematocidas, incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, proteínas Los ejemplos de enfermedades de plantas asociadas a nematodes, para las cuales se podra introducir resistencia en plantas transgenicas acordes con la invención se enumeran a continuación, en la tabla 8 CUADRO 8: N EMATQDES PARÁSITOS ENFERMEDAD PATÓGENO Punzón Do chodorus spp , d heterocephalus Tallo y bulbo (Europa) Ditylenchus dipsaa Horadado radopholus similis Quiste heterodera avenae, H zeae, Punctodera chalcoensis Daga xfhmema sp , amepcanum, Mediterraneum Nudo radicular falso Nacobbus dorsalis lanceta, Colombia Hoplolaimus colombus Lanceta Hoplolaimus spp , H galeatus Lesión Pratylenchus spp , P brachyurus, P crenatus, P hexincisus, P nelgetus, P penetrans, P scnbnen, P thornei, P zeae Aguja Longidorus spp , L breviannulatus Anillo cpconemella spp C ornata Nudo radicular Meloidogyne sp , M chitwoodi, M incógnita, Mjavanica Espiral Helicotylenchus spp Puntada Belonolaimus spp , B longicaudatus Raíz gruesa Paratnchodorus spp , P chnstiei, P mmor, quinisul us acutus, Tpchodorus spp Achaparramiento Tylenchorhynchus dubius 5 Reducción/eliminación de micotoxinas La producción de micotoxmas, incluyendo aflatoxina y fumomsina, por hongos asociados con plantas monocotiledonas, tal como el maíz, constituye un factor significativo en la inutilización del grano Estos organismos fungióos no provocan síntomas de enfermedad y/o interferencias con el crecimiento de la planta, pero producen sustancias químicas (micotoxinas) que son toxicas para los animales Se considera que la inhibición del crecimiento de estos hongos puede reducir la síntesis de estas sustancias tóxicas y por ende puede reducir la pérdida de granos debido a contaminación con micotoxmas También se propone que sena posible introducir genes nuevos en plantas monocotiledóneas, tal como el maíz, que inhiban la síntesis de las micotoxinas sin interferir con el crecimiento de los hongos Además, se considera que la expresión de un gen nuevo que codifique una enzima capaz de volver no toxicas a las micotoxmas sera de utilidad para lograr una reducción en la contaminación con micotoxinas de los granos El resultado de cualquiera de los mecanismos mencionados será una reducción de la presencia de micotoxinas en los granos 6 Composición o calidad de los granos Se puede introducir genes en plantas monocotiledóneas, en particular en cereales de importancia comercial tal como maíz, para mejorar los granos por los cuales se cultiva el cereal en primer lugar Se puede prever un amplio rango de plantas transgenicas nuevas producidas de esta manera dependiendo del uso final pretendido de los granos El uso más importante de los granos de maíz es para forraje o alimentos La introducción de genes que alteren la composición de los granos puede aumentar en mucho el valor alimentario o de forraje Los componentes primarios de los granos de maíz son almidón, proteínas y aceites Cada uno de estos componentes primarios de los granos de maíz puede ser mejorado alterando el nivel o la composición de los mismos Se pueden mencionar vanos ejemplos con fines ilustrativos, pero no proveen en modo alguno una lista exhaustiva de posibilidades Las proteínas de los granos de cereales, incluyendo el maíz, son subóptimas para los fines de forraje y alimento, en especial cuando son para alimentar cerdos, aves de corral y seres humanos Las proteínas son deficientes en diversos aminoácidos que son esenciales en la dieta de estas especies, por lo cual se requiere la adición de suplementos a los granos Los aminoácidos esenciales limitantes incluyen lisina, metiomna, tpptofano, treonma, valina, arginina e histidina Algunos aminoácidos solamente se vuelven limtantes después que el maíz es suplementado con otros agregados para las formulaciones alimentarias Por ejemplo, cuando maíz es suplementado con harina de soja para cumplir con los requerimientos de lisina, la metiomna se vuelve limitante Es posible elevar los niveles de estos aminoácidos esenciales en semillas y granos por medio de mecanismos que incluyen, pero sin limitaciones a los mismos, la introducción de genes para incrementar la biosintesis de aminoácidos, disminuir la degradación de los aminoácidos, incrementar el almacenamiento de los aminoácidos en las proteínas o incrementar el transporte de los aminoácidos a las semillas o granos Un mecanismo para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos consiste en introducir genes que regulan las vías biosintéticas de los aminoácidos de manera tal que la planta ya no pueda controlar de forma adecuada los niveles que se producen Esto se puede llevar a cabo desregulando o desviando pasos en la vía de biosíntesis de aminoácidos que habitualmente es regulada por los niveles del producto final de aminoácidos de dicha vía Los ejemplos incluyen la introducción de genes que codifican versiones desreguladas de las enzimas aspartoquinasa o acido dihidrodipicolínico (DHDP) sintetasa para incrementar la producción de lisina y treonina y de la antranilato sintetasa para incrementar la producción de tpptofano La reducción del catabolismo de los aminoácidos se puede llevar a cabo mediante la introducción de secuencias de ADN que reduzcan o eliminen la expresión de genes codificadores de enzimas que catalizan los pasos de las vías catabolicas, tal como la enzima lisina-cetoglutarato reductasa Se prevé que puede resultar conveniente dirigir la expresión de los genes relacionados con la biosíntesis de aminoácidos hacia el endosperma o embrión de las semillas Se prefiere aún más dirigir el gen hacia el embrión También será de preferencia, en el caso de genes codificadores de proteínas involucradas en la biosintesis de aminoácidos, dirigir las proteínas hacia un plastido usando una secuencia de un péptido de tránsito a plastidos La composición proteica de los granos puede ser alterada, con el fin de mejorar el equilibrio de los aminoácidos, de diversas maneras, incluyendo una elevación en al expresión de proteínas nativas, una disminución en la expresión de aquellas que presentan una pobre composición, un cambio en la composición de proteínas nativa o una introducción de genes codificadores de proteínas completamente nuevas con una composición superior Los ejemplos incluyen la introducción de ADN que permita disminuir la expresión de los miembros de la familia de proteínas de almacenamiento de la zeina Este ADN puede codificar pbozímas o secuencias antisentido para afectar ia expresión de proteínas zeina o la expresión de reguladores de la expresión de zema tal como el producto genico opaque-2 También se propone que la composición proteica de los granos puede ser modificada mediante el fenómeno de cosupresion, es decir, inhibición de la expresión de un gen endógeno mediante la expresión de un gen o un fragmento de gen estructural idéntico introducido mediante transformación (Gopng ef al , 1991 ) Ademas el ADN introducido puede codificar enzimas que degradan las zemas La disminución en la expresión zeina lograda puede estar acompañada de un incremento de proteínas con una composición de aminoácidos mas conveniente o un incremento en otros de los constituyentes importantes de las semillas, tal como el almidón Como alternativa, se pude introducir un gen quimérico que contenga la secuencia de codificación de una proteina nativa con una composición adecuada de aminoácidos, tal como la de las proteínas globulinas o delta zeina de 20 kF o gamma-zeina de 27 kD de maíz y un promotor u otra secuencia reguladora diseñada par elevar la expresión de dicha protema La secuencia de codificación de dicho gen puede incluir codones adicionales o de sustitución para los aminoácidos esenciales Ademas, se puede emplear una secuencia de codificación obtenida de otras especies o una secuencia parcial o completamente sintética que codifique una secuencia peptida completamente única diseñada para mejorar la composición de aminoácidos de las semillas Se prevé que puede ser preferible dirigir la expresión de estos transgenes codificadores de proteínas con una composición superior al endoesperma de las semillas La introducción de genes que alteren el contenido de aceites de los granos puede ser de gran valor Un incremento en el contenido de aceite puede dar como resultado incrementos en el contenido de energía metabolizable y en la densidad de las semillas para el uso de las mismas en forrajes y alimentos Los genes introducidos pueden codificar enzimas que eliminen o que reduzcan las limitaciones por velocidad o los pasos regulados en la biosintesis de ácidos grasos o pidos Dichos genes incluyen, pero sin limitaciones a los mismos, aquellos que codifican acetil-CoA carboxilasa, ACP-aciltransferasa, ß-cetoacil-ACP sintetasa, además de otras actividades de la biosíntesis de ácidos grasos que son bien conocidas Otras posibilidades son genes que codifican proteínas que no posean actividad enzimatica, tal como una proteína transportadora de acilo Se puede introducir genes que alteren el equilibrio de los ácidos grasos presentes en el aceite proporcionando así un alimento más nutritivo o saludable El ADN introducido también puede codificar secuencias que bloquean la expresión de enzimas involucradas en al biosíntesis de ácidos grasos, que alteran las proporciones de ácidos grasos presentes en los granos tal como se describirá a continuación Algunos otros ejemplos de genes específicamente considerados de utilidad por los inventores en la creación de plantas transgenicas con la característica de una composición de aceite alterada incluyen 2- acetiltransferasa, oleosina, el complejo de la piruvato deshidrogenasa, acetil-CoA sintetasa ATP-citrato liasa, ADP-glucosa pirofosfoplasa y genes de los enlaces carnitina-CoA-acetil-CoA Se prevé que la expresión de genes relacionados con la biosintesis de aceite sera direccionada hacia los plastidos, usando una secuencia de un peptido de transito a plastido y se exprese preferentemente en el embrión de las semillas Se pueden introducir genes que aumenten el valor nutritivo del componente almidón de los granos, por ejemplo aumentado el grado de ramificación, dando como resultado una mejor utilización de almidón en vacas debido a una demora en el metabolismo de las mismas Se prevé que la expresión de genes relacionados con la biosmtesis de almidón sera direccionada preferentemente hacia el endosperma de las semillas Ademas de afectar los constituyentes principales de los granos, se pueden introducir genes que tengan efecto sobre diversos aspectos nutritivos, de procesamiento u otros aspectos de la calidad de los granos utilizados como forraje o alimento Por ejemplo, se puede aumentar o disminuir la pigmentación de los granos La mejora y estabilidad de la pigmentación amarilla es conveniente en algunos forrajes para animales y se puede lograr mediante la introducción de genes que dan como resultado una mayor producción de xantofilos y carotenos por eliminación de pasos limitantes de la velocidad en su producción Dichos genes pueden codificar formas alteradas de las enzimas fitoeno sintetasa, fitoeno desaturasa o licopeno smtetasa Como alternativa, es deseable el maíz blanco no pigmentado para la producción de muchos productos alimentarios y pude ser producido por la introducción de ADN que bloquee o elimine pasos en las vías de producción de pigmentos La mayor parte del contenido de fósforo de los granos se encuentra en la forma de fitato, una forma de almacenamiento de fosfato que no es metabohzada por animales monogástncos Por ello, con el fin de incrementar la disponibilidad de fosfato en semillas, se prevé que sera conveniente disminuir la cantidad de fitato en semillas e incrementar la cantidad de fósforo libre Como alternativa, es posible expresar un gen en semillas de maíz que será activado, por ejemplo, por el pH, en el sistema gástrico de un animal monogástpco y liberara fosfato del filato, por ejemplo, la fitasa Los alimentos o forrajes que comprenden primariamente maíz u otros granos de cereales poseen cantidades insuficientes de vitaminas y deben ser suplementados con el fin de proveer el valor nutritivo adecuado La introducción de genes que mejoren la biosintesis de vitaminas en semillas puede ser previsto incluyendo, por ejemplo, las vitaminas A, E, B12, colina y semejantes Los granos de maíz tampoco poseen un contenido suficiente de minerales para un valor nutritivo óptimo Los genes que afectan la acumulación o disponibilidad de compuestos que contienen, entre otros, fósforo, azufre, calcio, manganeso, zinc y hierro, serán de gran valor Un ejemplo puede ser la introducción de un gen que reduce la producción de acido fitico o que codifica la enzima fitasa que aumenta la degradación del acido fitico Estos genes incrementaran los niveles de fosfato disponible en la dieta, reduciendo la necesidad de suplementos con fosfato mineral Existen numerosos ejemplos de mejoras de maíz u otros cereales con fines alimentarios o de forraje Las mejoras no deben involucrar necesariamente a los granos, sino que pueden, por ejemplo, mejorar el valor del maíz para el ensilaje La introducción de ADN para lograr esto puede incluir secuencias que alteren la producción de lignina, tal como aquellas que dan como resultado el fenotipo de "vena central marrón" asociado con un valor alimentario superior para ganado Ademas de tratar las mejoras en el valor alimentario o forrajero, también se pueden introducir genes que permitan mejorar el procesamiento del maíz y mejorar el valor de los productos que se obtienen de dicho procesamiento El método primario del procesamiento maíz es mediante la molienda en húmedo El maíz puede ser mejorado por medio de la expresión de genes nuevos que incrementan la eficacia y reduzcan el costo del procesamiento, como por ejemplo disminuyendo el tiempo de inmersión Una mejora en el valor de los productos de la molienda en húmedo puede incluir la alteración de la cantidad o calidad de almidón aceite, harina gluten de maíz o de los componentes del alimento gluten de maíz El aumento en almidón se puede lograr mediante la identificación y eliminación de pasos limitantes de la velocidad de la biosintesis del almidón o la disminución de los niveles de los otros componentes de los granos, dando como resultado un incremento proporcional del almidón Un ejemplo de esto ultimo puede ser la introducción de genes que codifican enzimas ADP-glucosa pirofosfoplasa con actividad reguladora alterada o que se expresan con niveles más altos Los ejemplos de esto último pueden incluir inhibidores selectivos de, por ejemplo, la biosíntesis de proteínas o aceites expresada durante etapas más avanzadas del desarrollo de los granos Las propiedades del almidón pueden ser alteradas ventajosamente mediante cambios en la velocidad de conversión de amilosa en amilopectina, en el tamaño de moléculas de almidón o en su patrón de ramificación Estos cambios permitirán modificar un amplio rango de propiedades que incluyen, pero sin limitaciones a los mismos, cambios en la temperatura de gelatinización, en el calor de gelatinización, en la claridad de películas y pastas, en las propiedades reologicas y semejantes Para efectuar estos cambios en las propiedades, se pueden introducir genes que codifican actividad enzimática de almidón sintetasa ligando a granulos o solubles o actividad enzimatica ramificadora, ya sean solos o en combinación También se puede emplear ADN tal como en construcciones antisentido para disminuir los niveles de actividad endógena de estas enzimas Los genes o las construcciones introducidas pueden contener secuencias reguladoras que permitan sincronizar su expresión a intervalos específicos en la biosíntesis del almidón y en el desarrollo de los granulos de almidón Además, vale la pena introducir y expresar genes que permitan una depvatización in vivo u otra modificación, de los grupos glucosa de la molécula de almidón Se puede considerar la unión covalente de cualquier molécula, limitada solamente por la existencia de enzimas que catalizan las depvatizaciones y la posibilidad de acceso de los sustratos apropiados en los granulos de almidón Los ejemplos de derivaciones importantes incluyen la adición de grupos funcionales, tales como grupos amina, carboxilo o fosfato, que proporcionan sitios para subsiguientes depvatizaciones in vitro o afectan las propiedades del almidón debido a la introducción de cargas iónicas Los ejemplos de otras modificaciones incluyen cambios directos en las unidades de glucosa, tal como perdida de grupos hidroxilo o su oxidación en grupos o carboxilo El aceite es otro de los productos de la molienda en húmedo del maíz, cuyo valor puede ser mejorado mediante la introducción y expresión de genes La cantidad de aceite que se puede extraer por molienda en húmedo puede ser incrementada con los enfoques que se describieron anteriormente para los alimentos y forrajes Las propiedades del aceite también pueden ser alteradas para mejorar su rendimiento en la producción y el uso de aceite de cocina, grasas vegetales, lubricantes u otros productos derivados del aceite o para mejorar sus atributos para la salud cuando se emplea en aplicaciones relacionadas con los alimentos También se pueden sintetizar nuevos ácidos grasos que luego de la extracción pueden servir como materiales iniciales para las síntesis químicas Los cambios en las propiedades del aceite se pueden obtener alterando el tipo, nivel u ordenamiento pidico de los ácidos grasos presentes en el aceite Esto se puede lograr a su vez mediante la adición de genes que codifican enzimas catalizadoras de la síntesis de nuevos ácidos grasos y los lipidos que los contienen o mediante un aumento en los niveles de ácidos grasos nativos que posiblemente puedan reducir los niveles de los precursores Como alternativa, se pueden introducir secuencias de ADN que disminuyan la velocidad o bloqueen los pasos de la biosmtesis de ácidos grasos, dando como resultado un incremento de los intermediarios de ácidos grasos precursores Los genes que se pueden agregar incluyen los de enzimas desaturasas, epoxidasas, hidratasas, deshidratasas y otras enzimas que catalizan reacciones que involucran intermediarios de ácidos grasos Los ejemplos representativos de los pasos catalíticos que pueden ser bloqueados incluyen las desaturaciones de acido esteárico en acido oleico y de acido oleico en acido linolenico, dando como resultado las respectivas acumulaciones de los ácidos esteárico y oleico Otro ejemplo es el bloqueo de los pasos de elongación que dan como resultado la acumulación de ácidos grasos saturados de Cß a C12 Las mejoras en los otros productos principales de la molienda en húmedo de maíz, harina gluten de maíz y alimento gluten de maíz, también se pueden lograr mediante la introducción de genes con el fin de obtener nuevas plantas de maíz Las posibilidades representativas incluyen, pero sin limitaciones a las mismas, aquellas que se describieron anteriormente para la mejora del valor alimentario y forrajero Ademas se debe considerar que la planta de maíz puede ser empleada en la producción o manufactura de compuestos biológicos útiles que no se habían producido antes o que no se producían al mismo nivel en la planta de maíz Las nuevas plantas de maíz productoras de estos compuestos son posibles gracias a la introducción y expresión de genes mediante métodos de transformación de maíz La amplia gama de posibilidades incluyen, pero sin limitaciones a las mismas, cualquier compuesto biológico producido actualmente con cualquier organismo, tal como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos primarios e intermediarios, polímeros de carbohidratos, etc Los compuestos pueden ser producidos por la planta, extraídos luego de la cosecha y/o del procesamiento y usados para cualquier propósito considerado actualmente de utilidad, tal como enzimas industriales, fragancias y productos farmacéuticos, para solo nombrar unos pocos Otras posibilidades para ejemplificar el rango de características o propiedades de los granos codificado potencialmente por los genes introducidos en plantas transgenicas incluyen granos con una menor susceptibilidad de degradación con fines de exportación o con un mayor tamaño de granulo cuando son procesados por molienda seca, mediante la introducción de genes que mejoren la síntesis de ?-zeína, rosetas de maíz con mayor calidad de inflado y volumen de expansión debido a genes que incrementan el espesor del pericarpio, maíz con granos más blancos para su uso en alimentos debido ala introducción de genes que bloquean de forma efectiva la expresión de enzimas involucradas en la vías de producción de pigmentos y bebidas alcohólicas de mejor calidad o maíz dulce, mediante la introducción de genes que afectan el sabor tal como el gen shrunken 1 (que codifica sacarosa sintetasa) o el gen shrunken 2 (que codifica ADPG-pirofosfoplasa) para el maíz dulce 7 Características agronómicas de las plantas Dos de los factores que determinan el lugar donde puede ser cultivado el maíz son la temperatura diana promedio durante la estación de cultivo y los intervalos de tiempo entre heladas Dentro de las áreas donde es posible cultivar maíz, existen limitaciones variables con respecto al tiempo máximo necesario par alcanzar la madurez y ser cosechadas El maíz que se va a cultivar en un área en particular se selecciona por su capacidad para madurar y desecar hasta el contenido de humedad apropiado para la cosecha dentro del periodo de tiempo requerido con el máximo rendimiento posible Por ello, se desarrolla maíz de maduración variable para las diferentes ubicaciones de cultivo Aparte de la necesidad de un desecado suficiente como para permitir la cosecha, resulta conveniente que el máximo secado tenga lugar en el campo para minimizar la cantidad de energía requerida para un secado adicional después de la cosecha Además, cuanto mayor es la facilidad de desecado del grano, mayor es el tiempo que queda disponible para el crecimiento y relleno de los granos Se considera que es posible identificar e introducir genes que afecten la madurez y/o el desecado en líneas de maíz usando técnicas de transformación para crear nuevas variedades de maíz adaptadas a las diferentes ubicaciones de cultivo o a la misma ubicación de cultivo, pero con una proporción mejorada de humedad en el momento de la cosecha La expresión de genes involucrados en la regulación del desarrollo de las plantas puede ser de especial utilidad, por ejemplo, los genes sin lígula y de lámina rugosa ya identificados en maíz Se considera que se pueden introducir genes en monocotiledóneas que pueden mejorar la capacidad para permanecer en pie y otras características del crecimiento de plantas La expresión de genes nuevos que confieran tallos mas fuertes, sistemas radiculares mejorados o bien, que impidan o reduzcan la caída de mazorcas sera de gran valor para el granjero Se propone que será conveniente introducir y expresar genes que incrementen la cantidad fotoasimilada total, por ejemplo, mediante un incremento en la distribución y/o intercepción de la luz Además, la expresión de genes que aumenten la eficacia de la fotosíntesis y/o de la bóveda de hojas proporcionara aumentos adicionales de ganancia de productividad Se considera ventajosa la expresión de un gen de fitocromo en maíz La expresión de dicho gen puede reducir la dominancia apical, conferir semienanismo a la planta e incrementar la tolerancia a la sombra (patente de E U A No 5,268,526) Estos enfoques permitirán aumentar las poblaciones de plantas en el campo Una demora en la senescencia vegetativa de la estación tardía incrementa el flujo asimilado hacia los granos y por consiguiente aumenta el rendimiento Se propone que sera ventajosa la sobre-expresion de genes en maíz que están asociados con el "siempre verde" o la expresión de cualquier gen que demore la senescencia Por ejemplo, se ha identificado un mutante no amapllante en festuca pratensis (Davies et al , 1990) La expresión de este gen, así como de otros puede impedir la degradación prematura de la clorofila y de esas manera mantener la función de la bóveda verde 8 Utilización de los nutrientes La capacidad para utilizar los nutrientes disponibles puede constituir un factor limitante en el crecimiento de plantas monocotiledoneas, tal como el maíz Se propone que sena posible alterar la captación de los nutrientes, la tolerancia a valores extremos de pH, la movilización a través de la planta, los sumideros de almacenamiento y la disponibilidad de actividades metabolicas mediante la introducción de genes nuevos Estas modificaciones permitirán que una planta, tal como el maíz, utilice de manera mas eficiente los nutrientes disponibles Se considera que un incremento en la actividad de, por ejemplo, una enzima que habitualmente esta presente en la planta y que esta involucrada en la utilización de nutrientes aumentara la disponibilidad de un nutriente Un ejemplo de dicha enzima sena la fitasa, Se considera ademas que una mejor utilización del nitrógeno por parte de la pllanta de maíz seria muy conveniente La expresión de un gen de la glutamato deshidrogenasa en maíz, por ejemplo, genes gdhA de £ coli, puede conducir a una mayor fijación de nitrógeno en los compuestos orgánicos Aun mas la expresión de gdhA en maíz puede llevar a una mayor resistencia al herbicida glufosinato debido a la incorporación de un exceso de amoniaco en el glutamato, desintoxicando asi el efecto del amoniaco También se considera que la expresión de un gen nuevo puede permitir la disponibilidad de una fuente de nutrientes a la cual no era posible acceder previamente, por ejemplo, una enzima que libere un componente con valor nutritivo de una molécula mas compleja, tal vez una macromolecula 9 Esterilidad masculina La esterilidad masculina es de utilidad en la producción de semillas híbridas Se propone que es posible producir esterilidad masculina mediante la expresión de genes nuevos Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de genes que codifican proteínas que interfieren con el desarrollo de la inflorescencia masculina inflorescencia y/o el gametofito da como resultado esterilidad masculina Los genes de pbonucleasas quiméricas que se expresan en las anteras de tabaco transgenico y colza conducen a esterilidad masculina (Mapaní et al, 1990) Se descubrió una cantidad de mutaciones en maíz que confieren esterilidad masculina citoplasmática Una mutación en particular, denominada citoplasma T, también se correlaciona con la sensibilidad al tizón de hoja de maíz del sur Se identifico una secuencia de ADN, denominada TURF-13 (Levings, 1990), que se correlacionaba con el citoplasma T Se propone que sería posible, mediante la introducción de TURF-13 por transformación, separar la esterilidad masculina de la sensibilidad a la enfermedad Dado que es necesario poder restablecer la fertilidad masculina con fines de cría y para la producción de granos, se propone que también se introduzcan genes codificadores del restablecimiento de la fertilidad masculina 10 Marcadores de selección negativos La introducción de genes codificadores de características que pueden ser seleccionados puede ser de utilidad para eliminar genes ligados no deseados Se considera que cuando dos o mas genes son introducidos juntos por co-transformacion, dichos genes estaran ligados entre si en el cromosoma huésped Por ejemplo, un gen que codifica un gen Bt, que le confiere resistencia a insectos a la planta, puede ser introducido en la planta junto con el gen bar que es util como marcador de selección y confiere resistencia al herbicida Liberty® en la planta Sin embargo, es posible que no sea conveniente tener una planta resistente a insectos que también sea resistente al herbicida Liberty® Se propone que también se puede introducir un gen bar antisentido que se exprese en aquellos tejidos donde no se desea la expresión del gen bar, por ejemplo, en partes completas de la planta Entonces si bien el gen Dar se expresa y es de utilidad como un marcador de selección no es util al conferir resistencia al herbicida en la planta completa El gen bar antisentido es un marcador de selección negativo También se considera que la selección negativa es necesaria con el fin de rastrear en una población de transformantes los recombinantes homólogos raros generados mediante direccionamiento de genes Por ejemplo se puede identificar un recombmante homologo por medio de la inactivación de un gen que se expresaba antes en dicha célula El gen antisentido de la neomicina fosfotransferasa II (NPT II) ha sido investigado como un marcador de selección negativo en tabaco (Nicotiana tabacum) y Arabidopsis thaliana (Xiang y Guerra, 1993) En este ejemplo, se introducen genes NPT II tanto en el sentido del marco de lectura como antisentido en la planta por transformación y las plantas resultantes son sensibles al antibiótico kanamicina Un gen introducido que se integra en el cromosoma de una célula huésped en el sitio del gen antisentido NPT II, e inactiva dicho gen antisentido, hará que la planta sea resistente a kanamicina y a otros antibióticos aminoglicosidos Por ello, se pueden identificar recombinantes raros, específicos del sitio, mediante una búsqueda de resistencia a antibióticos De manera similar, cualquier gen, nativo para la planta o introducido por medio de transformación, que al ser inactivado confiere resistencia a un compuesto, puede ser de utilidad como un marcador de selección negativo Se considera que los marcadores de selección negativos también pueden ser de utilidad de otras maneras Una aplicación es la construcción de una linea transgenica en la cual se puede seleccionar la transposición a sitios no ligados En el proceso de marcación, es muy común mover el elemento a transponer hacia un sitio ligado genéticamente sobre el mismo cromosoma Sena de utilidad contar con un marcador seleccionable para la recuperación de plantas raras en las cuales se ha producido una transposición hacia un locus no ligado Por ejemplo, la enzima citosina desaminasa puede ser de utilidad para este proposito (Stouggard, 1993) En presencia de esta enzima, el compuesto 5-fluoroc?tos?na es convertido en 5-fluorouracilo que es toxico para las células animales y vegetales Si se liga un elemento que se puede transponer al gen de la enzima citosina desammasa, es posible seleccionar la transposición a sitios no ligados mediante la selección de suceso de transposición en los cuales la planta resultante es ahora resistente a 5-fluoroc?tos?na Las plantas progenitoras y las plantas que contienen transposiciones a sitios ligados permanecerán sensibles a la 5-fluorocitosma La resistencia a la 5-fluoroc?tos?na se debe a la pérdida del gen de la citosina desammasa a través de segregación genética del elemento que se pude transponer y el gen de la citosina desaminasa En este contexto también serán de utilidad otros genes que codifican proteínas que vuelven la planta sensible a un compuesto determinado Por ejemplo, el gen T-ADN 2 de Agrobacterium tumefaciens codifica una proteína que cataliza la conversión de la a-naftalenacetamida (NAM) en acido a-naftalenacetico (NAA) vuelve sensibles a las células vegetales a concentraciones altas de NAM (Depicker et al, 1988) También se considera que los marcadores de selección negativos pueden ser de utilidad en la construcción de líneas con marcas de transposones Por ejemplo, si se marca un elemento que se puede transponer, autónomo, tal como Ac, Master Mu o En/Spn, con un marcador de selección negativo, se pueden seleccionar transformantes en los cuales el elemento autónomo no está integrado de forma estable en el genoma Se propone que esto sena conveniente, por ejemplo, cuando se desea una expresión transiente del elemento autónomo para activar en trans la transposición de un elemento que se puede transponer defectuoso, tal como Ds, pero no se desea la integración estable del elemento autónomo Es posible que no sea conveniente la presencia del elemento autónomo para estabilizar el elemento defectuoso, es decir, impedir su transposición adicional Sin embargo, se propone que si se desea la integración estable de un elemento que se puede transponer autónomo en una planta, la presencia de un marcador de selección negativo permite eliminar el elemento autónomo durante el proceso de cría (vi) Secuencias que no expresan proteínas 1 Secuencias que expresan ARN Se puede introducir ADN en maíz y otras monocotiledóneas con el fin de expresar transcriptos de ARN que afectan el fenotipo de la planta si bien no son traducidos en proteínas Dos ejemplos son el ARN antisentido y ARN con actividad ribozíma Ambos pueden cumplir posibles funciones en la reducción o eliminación de la expresión de genes vegetales nativos o introducidos Se pueden construir o aislar genes, que al ser transcriptos, producen ARN antisentido que es completamente de todo o de una o mas partes del ARN mensajero buscado como blanco El ARN antisentido reduce la producción del producto polipeptídico del ARN mensajero El producto polipeptídico puede ser cualquier protema codificada por el genoma vegetal Los genes antes mencionados se denominan genes antisentido Se puede introducir entonces un gen antisentido en una planta mediante métodos de transformación con el fin de producir nuevas plantas transgenicas con una expresión reducida de la protelna seleccionada de interés Por ejemplo, la proteína puede ser una enzima que cataliza una reacción en la planta La reducción de la actividad enzimática puede reducir o eliminar los productos de la reacción que incluyen cualquier compuesto sintetizado enzimáticamente en la planta, tales como ácidos grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y semejantes Como alternativa, la protema puede ser una proteína de almacenamiento, tal como la zeína, o una proteina estructural, cuya expresión disminuida conduce a cambios en la composición de aminoácidos en las semillas o a cambios morfológicos en la planta, respectivamente Las posibilidades mencionadas anteriormente solamente se ofrecen a modo de ejemplo y no representan el rango completo de aplicaciones También se pueden construir o aislar genes, que al ser transcriptos producen enzimas de ARN, o pbozímas, que pueden actuar como endopbonucleasas y catalizar el c vaje de moléculas de ARN con secuencias seleccionadas El clivaje de ARN mensajero seleccionados puede dar como resultado una producción reducida de los productos polipeptídicos codificados Estos genes se pueden usar para preparar nuevas plantas transgénicas que los contengan Las plantas transgénicas pueden tener niveles reducidos de pohpeptidos incluyendo, pero sin limitaciones a las mismas, los pohpéptidos citados anteriormente que pueden ser afectados por ARN antisentido También es posible introducir genes para producir nuevas plantas transgénicas que poseen una expresión reducida de un producto génico nativo mediante un mecanismo de co-supresion Se ha demostrado en tabaco, tomate y petunia (Gopng et al, 1991 , Smith et al, 1990, Napoli et al, 1990, van der Krol et al, 1990) que la expresión del transcripto en el sentido del marco de lectura de un gen nativo reducirá o eliminará la expresión del gen nativo de una manera similar a la observada para los genes antisentido El gen introducido puede codificar toda o una parte de la proteina pero quizás no sea necesario reducir los niveles de dicha proteína nativa 2 Secuencias que no expresan ARN Se pueden insertar elementos de ADN, incluyendo elementos que se pueden transponer tales como Ds, Ac o Mu, en un gen con el fin de causar mutaciones Estos elementos de ADN pueden ser insertados con el fin de mactivar (o activar) un gen y de esa manera "marcar" una característica en particular En este caso, el elemento que se puede transponer no provoca la inestabilidad de mutación marcada, porque la utilidad del elemento no depende de su capacidad para moverse en el genoma Una vez marcada una característica deseada, se puede usar la secuencia de ADN introducida para clonar el gen correspondiente, por ejemplo, usando la secuencia de ADN introducida como una cebador para PCR mediante técnicas de clonación genica por PCR (Shapiro, 1983, Dellaporta et al, 1988) Una vez identificados el o los genes para la característica en particular, incluyendo regiones control o reguladoras según convenga, es posible aislarlos, clonarlos y manipularlos según necesidad La utilidad de los elementos de ADN introducidos en un organismo con el fin de marcar los genes es independiente de la secuencia de ADN y no depende de cualquier actividad biológica de la secuencia de ADN, es decir, su transcripción en ARN o traducción en una proteína. La única función del elemento de ADN es interrumpir la secuencia de ADN de un gen.
Se considera que se pueden introducir secuencias de ADN no expresadas, incluyendo nuevas secuencias sintéticas, en las células como "etiquetas" propias de dichas células y plantas y semillas de las mismas. No será necesario que el elemento de ADN marcador interrumpa la función de un gen endógeno para el organismo huésped, dado que la única función de este ADN sería identificar el origen del organismo. Por ejemplo, se podría introducir una secuencia de ADN única en una planta y elemento de ADN permitirá identificar todas las células, plantas y la progenie de estas células como provenientes de dicha fuente marcada. Se propone que la inclusión de marcas de ADN permitirá distinguir el propio germoplasma, o un germoplasma derivado del mismo, de un germoplasma no marcado. Otro elemento posible que puede ser introducido es una región de unión a la matriz (MAR), tal como el elemento del lisosoma A de pollo (Stíef, 1989), que puede ser ubicado alrededor de un gen de interés expresable para lograr un incremento en la expresión general del gen y disminuir los efectos dependientes de la posición después de su incorporación en el genoma vegetal (Stief et al, 1989; Phi-Van et al, 1990) IX. Integración o excisión específica del sitio de transgenes El inventor considera específicamente que se pueden emplear técnicas para una integración o excisión específica del sitio de transgenes preparados de acuerdo con la presente invención Una ventaja de la integración o excisión especifica del sitio es que se puede usar para solucionar los problemas asociados con las técnicas de transformación convencionales, en las cuales los transgenes típicamente se integran de forma aleatoria en el genoma huésped y en múltiples copias Esta inserción aleatoria del ADN introducido en el genoma de las células huésped puede ser letal si el ADN extraño se inserta en un gen esencial Ademas, la expresión del transgen puede ser influenciada por "efectos de posición" causadas por el ADN genómico que lo rodea Entonces, debido a las dificultades asociadas con la transformación de múltiples copias del transgen, incluyendo el silenciamiento de genes, recombinacion y herencia no predecible, típicamente resulta conveniente controlar la cantidad de copias del ADN insertado, siendo conveniente a menudo la inserción de una sola copia de la secuencia de ADN La integración o excisión específica del sitio de transgepes o de partes de transgenes se puede lograr en plantas por medio de recombinacion de homólogos (véase, por ejemplo, patente de los EE UU N° 5,527,695, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) La recombinacion de homólogos es una reacción entre cualquier par de secuencias de ADN que poseen una secuencia de nucleótidos similar, donde las dos secuencias interactuan (se recombinan) para formar una nueva especie de ADN recombinante La frecuencia de la recombinación de homólogos aumenta a medida que aumenta la longitud de las secuencias de ADN de nucleótidos compartidos y es mayor con moléculas de plásmido alineadas que con moléculas de plásmido circulares La recombinación de homólogos puede tener lugar entre dos secuencias de ADN que son menos que idénticas, pero la frecuencia de recombmación disminuye a medida que aumenta la divergencia entre las dos secuencias. Las secuencias de ADN introducidas pueden ser direccionadas mediante recombinación de homólogos ligando la molécula de ADN de interés a secuencias que comparten homología con secuencias endógenas de la célula huésped Una vez que el ADN ingresa en la célula, las dos secuencias homologas pueden interactuar para insertar el ADN introducido en el sitio donde se ubican las secuencias homologas de ADN genómico Por ello, la elección de las secuencias homologas contenidas en el ADN introducido, determinará el sitio donde el ADN introducido es integrado mediante recombinación de homólogos Por ejemplo, si la secuencia de ADN de interés está ligada a secuencias de ADN que comparten homología con un gen de una sola copia de una célula vegetal huésped, la secuencia de ADN de interés se insertará mediante recombinación de homólogos solamente en dicho sitio específico único Sin embargo, si la secuencia de ADN de interés está ligada a secuencias de ADN que comparten homología con un gen de copias múltiples de la célula huésped eucaponte, entonces la secuencia de ADN de interés puede ser insertada mediante recombinación de homólogos en cada uno de los sitios específicos donde está ubicada una copia del gen El ADN puede ser insertado en el genoma huésped mediante una reacción de recombinación de homólogos que comprende una sola recombmacion reciproca (que da como resultado la inserción de la longitud completa del ADN introducido) o una recombmacion reciproca doble (que da como resultado la inserción del ADN ubicado entre los dos sucesos de recombinacion solamente) Por ejemplo, si se desea insertar un gen extraño en el sitio genomico donde esta ubicado el gen seleccionado, el ADN introducido debe contener secuencias homologas para el gen seleccionado Un solo suceso de recombinacion de homólogos dará como resultado entonces la inserción de toda la secuencia de ADN introducida en el gen seleccionado Como alternativa, se puede obtener un suceso doble de recombmacion flanqueando cada extremo de la secuencia de ADN de ínteres (la secuencia que se pretende insertar en el genoma) con secuencias de ADN homologas del gen seleccionado El suceso de recombinacion de homólogos que comprende cada una de las regiones flanqueadoras homologas dará como resultado la inserción del ADN extraño Entonces, solamente aquellas secuencias de ADN que están ubicadas entre las dos regiones que comparten homología genomica serán integradas en el genoma Si bien las secuencias introducidas pueden ser direccionadas para una inserción en un sitio genomico especifico mediante recombinacion de homólogos, en los eucapontes superiores la recombmacion de homólogos es un suceso relativamente raro en comparación con los sucesos de inserción aleatorios En células vegetales, las moléculas de ADN extraño encuentran secuencias homologas en el genoma de la célula y se recombinan con una frecuencia de aproximadamente 0 5-4 2 X 10"4 Por consiguiente, cualquier célula transformada que contiene una secuencia de ADN introducida integrada mediante recombínacíón de homólogos también presenta una gran probabilidad de contener numerosas copias de secuencias introducidas de ADN integradas aleatoriamente. Por ello, para mantener el control de la cantidad de copias y la ubicación del ADN insertado, se pueden eliminar estas secuencias de ADN insertadas aleatoriamente. Una manera de eliminar estas inserciones aleatorias es el uso de un sistema recombinasa específico del sitio. En general, el sistema recombinasa específico del sitio consiste de tres elementos: dos pares de secuencias de ADN (las secuencias de recombinación específica del sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica del sitio). La recombinasa específica del sitio solamente catalizará una reacción de recombinación entre dos secuencias de recomblnación específica del sitio. Se pueden emplear diferentes sistemas de recombinasas específicas del sitio de acuerdo con la presente invención, incluyendo, pero sin limitaciones a los mismos, el sistema Cre/lox del bacteriófago P1 (patente de EE.UU. N°: 5,658,772, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia), el sistema FLP/FRT de levadura (Golic y Lindquist, 1989), la recombinasa Gin del fago Mu (Maeser et al, 1991 ), la recombínasa Pin de £. coli (Enomoto et al, 1983) y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Arakí et al, 1992). Los sistemas Cre/lox del bacteriófago P1 y FLP/FRT de levadura constituyen dos sistemas particularmente útiles para la integración o excisión específica del sitio de transgenes En estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interactua específicamente con la respectiva secuencia de recombinacion especifica del sitio (lox o FRT, respectivamente) para invertir o recortar las secuencias intervinientes La secuencia en cada una de estos dos sistemas es relativamente corta (34 bp para lox y 47 bp para FRT) y por ello, conveniente para su uso con vectores de transformación Se ha demostrado que el sistema de recombinasa FLP/FRT funciona de manera eficiente en células vegetales Los experimentos sobre el rendimiento del sistema FLP/FRT tanto en protoplastos de maíz y de arroz indican que la estructura del sitio FRT y la cantidad de protema FLP presente afectan la actividad de excisión En general, los sitios FRT cortos e incompletos conducen a una mayor acumulación de productos de excisión que los sitios FRT completos de toda su longitud Los sistemas pueden catalizar reacciones intra e intermoleculares en protoplastos de maíz, lo cual es indicativo de su utilidad para las reacciones de excisión asi como de integración del ADN La reacción de recombinacion es reversible y esta reversibilidad puede comprometer la eficiencia de la reacción en cada dirección La alteración de la estructura de las secuencias de recombmacion especifica del sitio constituye un enfoque para remediar esta situación La secuencia de recombinacion especifica del sitio puede ser mutada de manera tal que el producto de la reacción de recombinacion ya no sea reconocido como substrato para la reacción inversa, estabilizando de esa manera el suceso de integración o excisión En el sistema Cre-lox, descubierto en el bacteriófago P1 , la recombmacion entre sitios loxP tiene lugar en presencia de la recombmasa Cre (véase, por ejemplo, patente de los EE UU N° 5,658,772, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia) Este sistema se ha utilizado para recortar un gen ubicado entre dos sitios lox que fueron introducidos en el genoma de levadura (Sauer, 1987) El gen Cre se expresaba con el promotor GALI inducible de levadura y el gen Cre estaba ubicado sobre un vector de levadura de rep cación autónoma Dado que el sitio lox es una secuencia de nucleótidos asimétrica, los sitios lox sobre la misma molécula de ADN pueden tener la misma orientación, o la orientación opuesta, entre sí La recombmación entre sitios lox con la misma orientación da como resultado la supresión del segmento de ADN ubicado entre los dos sitios lox y una conexión entre los extremos resultantes de la molécula de ADN original El segmento suprimido de ADN forma una molécula de ADN circular La molécula de ADN original y la molécula circular resultante contienen, cada una, un solo sitio lox La recombinacion entre sitios lox con orientaciones opuestas sobre la misma molécula de ADN da como resultado una inversión de la secuencia de nucleótidos del segmento de ADN ubicado entre los dos sitios lox Además, puede producirse un intercambio reciproco de segmentos de ADN próximos a los sitios lox ubicados sobre dos moléculas de ADN diferentes Todos estos sucesos de recombinación son catalizados por el producto de la región de codificación Cre.
X Purificación de proteínas En algunas realizaciones particulares de la presente invención puede resultar conveniente purificar las proteínas codificadas por los transgenes de la invención. Como alternativa, se pueden aislar proteínas nativas de una planta como parte del esfuerzo por clonar un gen codificador de la proteína aislada o el promotor que dirige la expresión del gen Una vez que se tiene la proteína, dicha proteína puede ser secuenciada y es posible deducir la secuencia de codificación del gen Se pueden elaborar sondas o cebadores sobre la base de la secuencia de ADN deducida, permitiendo de esa manera una clonación eficiente del gen correspondiente Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los especialistas en la técnica Estas técnicas comprenden, en un nivel, el fraccionamiento en crudo del medio celular en fracciones con polipéptidos y sin pohpéptidos Una vez separados los polipéptidos de otras proteínas, es posible purificar aún más el polipéptido de interés utilizando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son-cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis sobre gel de poliacnlamida y enfoque isoeléctrico Un método particularmente eficiente de purificar peptidos es mediante cromatografía líquida rápida de proteínas o aún HPLC Existen vanas técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas conocidas para los especialistas en la técnica Estas técnicas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y análogos o por desnaturalización por calor, seguido de centrifugación, pasos de cromatografía tales como de intercambio iónico, filtración por gel, de fase reversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad, enfoque isoeléctrico, electroforesis sobre gel, y combinaciones de las mismas así como otras técnicas Como es sabido en el arte, se cree que se puede cambiar el orden de los distintos pasos de purificación o que se pueden omitir ciertos pasos y aun contar con un método adecuado para la preparación de una proteína o un peptido substancialmente purificado No hay un requisito general que indique que la protema o el peptido siempre se deban obtener en su estado mas purificado En realidad se contempla que los productos que no están sustancialmente purificados serán de utilidad en ciertas realizaciones La purificación parcial se puede llevar a cabo utilizando menos pasos de purificación en combinación o utilizando diferentes formas dei mismo esquema de purificación general Por ejemplo, se considera que la cromatografía con columna de intercambio catiónico en un equipo para HPLC dará como resultado, en general, una purificación más "veces" mayor que la misma técnica pero en un sistema de cromatografía de baja presión Los métodos que exhiben un grado mas bajo de purificación relativa pueden presentar ventajas en la recuperación total del producto proteico o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada Es un hecho conocido que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al, 1977) Por ello se considera que bajo diferentes condiciones de electroforesis, pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con una resolución de picos extraordinaria. Esto se logra utilizando partículas muy finas y presión alta para mantener una velocidad de flujo adecuada La separación se puede llevar a cabo en cuestión de minutos o a lo sumo una hora Más aún, solamente se necesita un volumen muy pequeño de muestra porque las partículas son tan pequeñas y están tan empaquetadas por lo que el volumen muerto constituye una fracción muy pequeña del volumen del lecho Además, no es necesario que la concentración de la muestra sea muy grande porque las bandas son tan estrechas que se produce muy poca dilución de la muestra La cromatografía sobre gel, o cromatografía con tamizado molecular, es un tipo especial de cromatografía de partición que se basa en el tamaño de las moléculas La teoría de la cromatografía sobre gel es que la columna, que se prepara con partículas muy pequeñas de una sustancia inerte que contiene pequeños poros, separa las moléculas grandes de las más pequeñas a medida que van pasando por los poros o alrededor de los mismos, dependiendo de su tamaño En tanto el material que constituye las partículas no absorba las moléculas, el único factor que determina la velocidad de flujo es el tamaño Entonces, las moléculas se eluyen de la columna por tamaño decreciente, siempre y cuando la forma sea relativamente constante La cromatografía sobre gel es la técnica más adecuada para separar moléculas de diferentes tamaños porque la separación es independiente de otros factores tales como pH, fuerza iónica, temperatura, etc Tampoco existe prácticamente adsorción, hay menos dispersión de zonas y el volumen de elución se relaciona de forma simple con el peso molecular La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que se basa en la afinidad específica entre la sustancia a aislar y una molécula con la cual se pueda unir especialmente Esta es una interacción del tipo receptor-ligando El material de la columna se sintetiza por acoplamiento covalente de una de las partes de la unión con una matriz insoluble El material de la columna puede entonces absorber específicamente la sustancia de la solución La elución se produce cambiando las condiciones bajo las cuales la unión no tendrá lugar (alterando el pH, la fuerza iónica, la temperatura, etc) Un tipo particular de cromatografía de afinidad que es de utilidad en la purificación de compuestos que contienen carbohidratos es la cromatografía de afinidad con lectina Las lectinas son una clase de sustancias que se unen con diversos polisacapdos y glicoproteínas Las lectinas se acoplan habitualmente con agarosa mediante bromuro de cianogeno La conconavalma A acoplada a Sepharosa fue el primer material de ese tipo que se utilizo y se ha empleado ampliamente en el aislamiento de polisacandos y glicoprotemas Otras lectinas que se han utilizado es la lectma de lentejas, aglutmina de germen de trigo que ha sido de utilidad en la purificación de residuos N-acetiIglucosamimlo y lectina de Hehx pomatia Las lectinas mismas se purifican utilizando cromatografía de afinidad con gandos de carbohidratos Se ha empleado lactosa para purificar lectinas de habas y mames, la maltosa ha sido de utilidad en la extracción de lectinas de lenteja y haba, la N-acetil-D-galactosamina se usa para la purificación de lectinas de soja, el N-acetil glucosamimlo se une a las lectinas del germen de trigo, la D-galactosamina se ha empleado en la obtención de lectmas de almeja y la L-fucosa se unirá a lectinas de loto La matriz debe ser una sustancia que por si misma no adsorbe moléculas en un grado significativo y que presenta un rango amplio de estabilidad química, física y térmica El ligando se debe acoplar de manera tal que no afecte sus propiedades de unión El ligando también debe proveer una unión relativamente estrecha Debería ser posible, ademas, eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando Una de las formas mas comunes de cromatografía de afinidad es la inmunocromatografia de afinidad La generación de anticuerpos adecuados de acuerdo con la presente invención se discutirá mas adelante XI Definiciones Gen exogeno un gen que no esta presente habitualmente en un genoma huésped dado en la forma actual del gen exogeno En este sentido el mismo gen puede ser nativo para el genoma huésped y sin embargo, el gen exogeno comprendera al gen nativo alterado por la adición o supresión de uno o mas elementos reguladores diferentes Un tipo de gen exogeno considerado por el inventor como de particular utilidad en la presente invención comprende un gen de maíz ligado operativamente al promotor del genero Coix Expresión La combinación de procesos intracelulares, incluyendo transcripción y traducción, experimentada por una molécula ADN de codificación tal como un gen estructural para producir un po peptido Progenie Cualquier generación subsiguiente, incluyendo las semillas y las plantas de la misma que deriva una planta progenitora en particular o de un conjunto de plantas progenitoras Promotor El sitio de reconocimiento en una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que provee un elemento de control de la expresión para un gen estructural y al cual se une específicamente la ARN A polimerasa e inicia la síntesis de ARN (transcripción) de dicho gen Regeneración El proceso de cultivar una planta a partir de una célula vegetal (por ejemplo un protoplasto o explante vegetal) ADN seleccionado Un segmento de ADN que ha sido introducido en un genoma huésped Los ADN seleccionados preferidos incluyen uno o mas genes exogenos y los elementos para expresar el gen exógeno en una célula huésped, por ejemplo, un promotor y un terminador La ventaja será mayor si se incluye uno o más elementos potenciadores con el ADN seleccionado Transformación Un proceso para introducir una secuencia o una construcción de ADN exógeno (por ejemplo, un vector o un cásete de expresión) en una célula o protoplasto, donde el ADN exógeno es incorporado en el cromosoma o tiene la capacidad de una replicación autónoma Célula transformada Una célula cuyo ADN ha sido alterado por la introducción de una molécula de ADN exógeno en dicha célula Trangen Un segmento de ADN que es introducido en un genoma huésped Los ejemplos de transgenes proveen a la huésped célula, o a las plantas regeneradas a partir de las mismas, con un nuevo fenotipo en comparación con la correspondiente célula o planta no transformada Los transgenes pueden codificar proteínas, solamente ARN o pueden no ser transcriptas ni traducidas Se puede proveer un transgen a una planta individual directamente por transformación o bien, por herencia de uno o ambos progenitores de la planta Célula transgénica Cualquier célula derivada o regenerada de una célula transformada Los ejemplos de células transgénico incluyen callos vegetales derivados de una célula vegetal transformada y células particulares, tales como de hoja, raíz, tallo, es decir, células somáticas, o células reproductoras (germinales) obtenidas de una planta transgénica Planta transgénica Una planta o la progenie de cualquier generación subsiguiente derivada de la misma, de una célula o protoplasto vegetal transformado, donde el ADN vegetal contiene una molécula de ADN exógeno introducido que no estaba presente originalmente en las plantas nativas, no transgénicas de la misma línea Las plantas transgenicas pueden contener además secuencias que son nativas de la planta que está siendo transformada, pero donde el gen "exógeno" ha sido alterado por medios de tecnología genética con el fin de alterar el nivel o patrón de expresión del gen Péptido de tránsito Una secuencia de polipéptidos que tiene la capacidad de direccionar un polipeptido hacia una organela particular o hacia otra ubicación dentro de una célula Vector Una molécula de ADN capaz de rephcación en una célula huésped y/o con la cual se puede ligar operativamente otro segmento de ADN con el fin de lograr la replicación del segmento unido Un plásmido es un ejemplo de vector o una molécula de ADN usada para llevar genes nuevos hacia el interior de las células Un plasmido es un ejemplo de vector que es una pieza de ADN independiente, estable, autorep cante XII Eiemplos Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención Los expertos en el arte deben tener en cuanta que técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan las técnicas que el inventor descubrió que funcionan bien en la práctica de la invención, y por consiguiente pueden considerarse los modos preferidos para su práctica Sin embargo, los expertos en el arte deben tener en cuenta, a la luz de la presente descripción, que se pueden efectuar muchos cambios en las realizaciones especificas que se describen y aun obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención Más específicamente, se apreciara que ciertos agentes que están relacionadas química y fisiológicamente pueden sustituir los agentes descritos en el presente documento obteniendo los mismos resultados o similares Todos dichos sustitutos y modificaciones evidentes para los expertos en el arte son considerados dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas EJEMPLO 1 Clonación de secuencias homologas de Coix Se obtuvieron semillas de Coix lacryma-jobi (Pl 320865) de USDA/ARS Plant Introduction Station, Ames, IA Las semillas se hicieron germinar y se dejaron crecer en invernadero durante vanas semanas El ADN genómico se preparó a partir de material foliar de 2-3 semanas de acuerdo con el siguiente protocolo Se molió tejido foliar congelado (2 gramos de peso fresco) hasta un polvo fino con una varilla de vidrio bajo nitrógeno líquido El tejido en polvo se mezclo exhaustivamente con 8 ml de buffer de extracción (Tris 100 mM, pH 8 0, EDTA 50 mM, SDS 1% v/v, NaCI 500 mM), precalentado a 60°C, seguido de 45 minutos de incubación a 60°C. La muestra se mezcló entonces con 2.5 ml de acetato de potasio 5 M helado y luego se incubó sobre hielo durante 20 minutos. Los agregados de proteínas fueron eliminados por centrifugación a 3750 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se vertió a través de una capa de Miracloth, seguido de precipitación del ADN por mezcla con 5 ml de alcohol isopropílico. El ADN precipitado se recogió por centrifugación a 3750 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante eliminó del ADN agrupado en pellets y el tubo se invirtió durante 5 minutos para permitir el drenaje del sobrenadante residual del pellet. El ADN se volvió a suspender en 300 µl de agua que contenía Tris 50 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM y 3 µl de ARNasa (solución madre 10 mg/ml). Nuevamente se precipitó el ADN por el agregado de 50 µL de acetato de amonio 4.4 M, pH 5.2 y 350 µL de alcohol isopropílico, seguido de centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 10 minutos. El pellet de ADN se lavó con 750 µL de etanol 80% v/v y luego se dejó secar por inversión durante 10 minutos. El ADN se volvió a suspender en 200 µL de agua que contenía Tris 10 mM, pH 8.0 y EDTA 1 mM. Se elaboraron bibliotecas de ADN, para su uso como templados para PCR, con el juego [kit] Genoma Walker PCR (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se amplificó por PCR un segmento de ADN ubicado 5' con respecto a la secuencia de codificación de la proteína gemma-coixina de la siguiente manera. Se preparó un conjunto de cebadores oligonucleotídicos anidados denominados, gCo/x5' nest2 (SEQ ID N°: 1 ) y gCo/x5' nest3 (SEQ ID N° 2), que corresponde a las posiciones 267-288 y 26-53, respectivamente, de la secuencia publicada de gamma-coixina (Genbank, N° Acceso X59850) También se usaron cebadores, denominados AP1 (SEQ ID N° 3) y AP2 (SEQ ID N° 4), provistos en el kit ' Genoma Walker de (Clontech) La secuencia de los cebadores es como sigue gCo.xd' nest2 = CTGGAACTGGAACGGGCTTGGA gCo/x5' nest3 = GCGAGGGCAACGAGCAGCACCTTCATGG AP1 = GTAATACGACTCACTATAGGGC AP2 = ACTATAGGGCACGCGTGGT La PCR se llevo a cabo de la siguiente manera Primero se empleó el Sistema para PCR de Templado Largo (Boehpnger Mannheim (Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante, con las siguientes excepciones, cada reacción contenía dNTP 350 µM, 500 nM de cada cebador, Tps-HCL 50 mM, pH 92, (NH4)2S04 14 mM, MgCI2 3 0 mM y 2 µl (>25 ng) de templado de ADN de la biblioteca de Genoma Walker Los primeros cebadores que se usaron fueron gCo/x5 nest2 y el cebador adaptador AP1 Se llevaron a cabo las siguientes condiciones de ciclado usando un termociclador MJ Research PTC-100 con tapa calefactora 95o- 1 mm 1 ciclo 94° - 30 seg 72° - 3 min 7 ciclos 94° - 30 seg 67° - 3 min 32 ciclos 67° - 4 mm 1 ciclo 4° - detención Los productos de esta reacción se diluyeron luego 1 25 con agua y se usaron 2 µl como templado para un segunda ronda de amplificación Se cambiaron los cebadores por el conjunto anidado gCo/x5' nest3 y el cebador AP2 Los únicos cambios que se efectuaron estaban relacionados con el mismo ciclado, que fue como sigue 95° - 1 min 1 ciclo 94° - 30 min 72° - 3 min 5 ciclos 94° - 30 seg 67° - 3 min 20 ciclos 67° - 4 mm 1 ciclo 4° - detención Se aislaron bandas del tamaño apropiado (500 bp o mayores) por electroforesis sobre gel, se recortaron las bandas y se clonaron en el vector plásmido pCR2 1 , de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) Se secuenció el ADN usando cebadores oligonucleotídicos o localizados en vectores y el kit de secuenciación con coloración deoxi ABl (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Norwaik, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante Las reacciones de secuenciación fueron analizadas usando un secuenciador de ADN ABl Ppsm 373 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems) Después de obtener la secuencia de los extremos 3' y 5' del producto de la PCR, se diseñaron cebadores con colas con sitios de enzimas de restricción convenientes para permitir una amplificación y subsiguiente clonación del promotor de la gamma-coixina directamente del ADN genomico Se sintetizaron los cebadores gcx-1000seq5'xho (SEQ ID N° 5), gcx-1 pcr3'xba (SEQ ID N° 6) y gcx-1 pcr3'nco (SEQ ID N° 7) Las secuencias de los cebadores eran como sigue gcx-1000seq5'xho= = GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG gcx-1 pcr3'xba = GGTCTAGAGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT gcx-1 pcr3'nco = GGCCATGGGGTGTCGATCTTCTGTGCTCT Después se efectuó la amplificación del promotor de gamma-coixina con los cebadores gcx-1 pcr3'nco y gcx-1 OOOseqd'xho usando el kit para PCR High Fidelity (Boehpnger Mannheim) La mezcla de reacción contenía 200 ng de templado de ADN genomico de Coix, dNTP 200 µM, 500 nM para cada uno de los cebadores y 5 µl de buffer N° 2 10X Las condiciones de ciclacion, efectuada con un termociclador MJ Research PTC-100 con tapa calefactora, eran como sigue 95° - 2 min 1 ciclo 94° - 1 min 56° - 1 min 72° - 1 min 32 ciclos 72° - 4 mm 4°- detención Después de la amplificación el amphcón fue digerido con Ncol y Xhol para una clonación dirigida hacia el vector de expresión GUS pDPG827 (mcs/GUS/nos en la estructura primaria del pSP72, Promega Corp , Madison, Wl) Se secuencio el inserto completo de promotor, asi como las uniones de inserción y el vector se denomino pDPG844 (FIG 1 ) Luego se secuenció el ADN usando los cebadores ohgonucleotídicos o localizados en el vector propios y el kit de secuenciacion con coloración deoxi ABl (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Norwaik, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante Las reacciones de secuenciacion se analizaron usando un secuenciador de ADN ABl Ppsm 373 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems) La secuencia del inserto promotor se muestra en la SEQ ID N° 8 Se efectuó una amplificación paralela del promotor del fragmento de gamma-coixina usando los cebadores gcx-1 pcr3'xba y gcx-1000seq5'xho El producto de la amplificación se digirió con Xbal y Xhol y se ligó en el vector de expresión GUS pDPG828 (mcs/?ntron1 de actina de arroz /GUS/nos en la estructura primaria del pSP72) Se secuenciaron las uniones de inserción, así como el inserto completo y el vector se denominó pDPG845 (FIG 2) Para la construcción de los plásmidos pDPG846 (FIG 3) y pDPG847 (FIG 4), se amplifico el promotor de gamma-coixina usando el kit para PCR High Fidelity (Boehpnger Mannheim) y los cebadores gcx-lpcr3'xba (SEQ ID N° 6) y gcx-(400)pcr5'xho (SEQ ID N° 24) El producto de la amplificación se dirigió con Xbal y Xhol y se ligó en los vectores de expresión GUS pDPG827 (mcs(GUS/nos en la estructura primaria del pSP72) y pDPG828 (mes/ intronl de actinal de arroz /GUS/nos en la estructura primaria del pSP72) para crear los vectores pDPG847 y pDPG846, respectivamente Se secuenciaron las uniones de inserción y el inserto completo promotor para confirmar la construcción apropiada de los vectores La secuencia del inserto promotor se muestra en la SEQ ID N° 19 Se construyeron los plasmidos pDPG848 (FIG 5) y pDPG849 (FIG 6) en paralelo con la construcción de pDPG846 y pDPG847 El promotor del fragmento de gamma-coixina fue amplificado por PCR usando el kit para PCR High Fidelity (Boehpnger Mannheim) y los cebadores gcx-lpcr3'xba (SEQ ID N° 6) y gcx-(220)pcr5'xho (SEQ ID N° 25) El producto de la amplificación se dirigió con Xbal y Xhol y se ligo en los vectores de expresión GUS pDPG827 (mcs/GUS/nos en la estructura primaria del pSP72) y pDPG828 (mcs/?ntron1 de actinal de arroz /GUS/nos en la estructura primaria del pSP72) para crear los vectores pDPG849 y pDPG848, respectivamente Se secuenciaron las uniones de inserción y todo el inserto promotor para confirmar la construcción adecuada de los vectores La secuencia del inserto promotor se muestra en la SEQ ID N° 18 A continuación se muestran las secuencias de gcx-(400)pcr5'xho y gcx-(220)pcr5 xho y también en las SEC ID N° 24 y SEQ ID N° 25 gcx-(400)pcr5 xho GGCTCGAGTAAGTATGCAGGA gcx-(220)pcr5'xho GGCTCGAGCACTCGGCTTGCT EJEMPLO 2 Aislamiento del terminador y de la secuencia de codificación de gamma- coixina y construcción del pDPG869 El kit Genoma Walker y las bibliotecas de ADN genomico utilizados para aislar el promotor de gamma-coixma se emplearon ademas para el aislamiento de las secuencias del terminador de gamma-coixma Todas las concentraciones y condiciones de ciclacion de la PCR fueron idénticas a las usadas para el aislamiento del promotor (Ejemplo 1 ) en todas las rondas Los únicos cambios eran de los cebadores específicos coixina La primera ronda de PCR se efectuó usando los cebadores gcxd pcr2 (SEQ ID N° 9) y AP1 y la segunda ronda con los cebadores gCo;x3 nest2 (SEQ ID N° 10) y AP2 La secuencia de los cebadores era como sigue gcxd pcr2 = (CTCAGCCCCAGCAGCCACATCCA) gCo/x3 nest2 = (GTGCGGCAGCCAATGACAAGTC) El producto de la amplificación fue separado por electroforesis sobre gel, seguido de excisión de una banda de tamaño apropiado, elución de la banda y clonación del ADN en el vector pCR2 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y finalmente secuenciaciop Este clon, que contenía el teminador de gamma-co xina, se denomino DV108 (FIG 11 ) La secuencia del terminado se muestra en la SEQ ID N° 11 Con el fin de obtener la secuencia de codificación de la proteina gamma-coixina, se utilizo amplificación por PCR para el aislamiento de un producto de la amplificación que contenía la secuencia de codificación y el promotor del gen de la gamma-coixina. La amplificación se llevó a cabo usando los cebadores gcx-1000seq5'xho (SEQ ID N°. 12) y gCo x3'pcr (SEQ ID N°: 13), que se muestran a continuación. gcx-1000seq5'xho= = GGCTCGAGGGACCGGTTACAGCACACCACTG gCo/x3'pcr = TCAGTACTGGGCACCGCCGGC Se usó el kit "Master Amp" (Epicentre Technologies, Madisop, Wl) para optimizar la amplificación. La secuencias del promotor/producto de codificación de la amplificación se obtuvo usando buffer D y el siguiente programa en un equipo Robocycler (Stratagene): 94° - 2 min. 1 ciclo 94° - 1 min. 73° - 1 min. 72° - 1 min. 32 ciclos 72° - 4 min. 1 ciclo 6° - detención Este amplicón se clonó entones en el pCR2.1. Usando esta construcción plasmídíca como templado, se diseñó la siguiente estrategia para PCR para obtener la secuencia de codificación y el promotor como productos de reacción separados. Se diseñaron los siguientes cebadores, gCo/x 5'pcr+4 (SEC ID N°: 14) y gCo/x 3'pcr+sac (SEC ID N°. 15), solamente para la amplificación de la secuencia de codificación: gCo/x 5'pcr+4 = AAGGTGCTGCTCGTTGCCCTC gCoix 3'pcr+sac =GGGAGCTCTCAGTACTGGGCACCGCCGGC Estos cebadores corresponden a las bases 31-51 y 607-627, respectivamente, de la secuencia Genbank indicada anteriormente. El uso del cebador gCo/x 5'pcr+4 da como resultado un producto de amplificación que no posee el codón de inicio para la proteína gamma-coixina. Se empleó el kit para PCR High Fidelity de Boehringer Mannheim con una mezcla de reacción de 100 pg de templado plasmídico, 500 nM de cada cebador, Buffer 1 1x y dNTP 200 µM en una concentración final de 3 mM de MgCI2. Las condiciones de la ciclación, usando un termociclador MJ Research PTC-100 con tapa calefactora, fueron como sigue: 95° - 2 min. 1 ciclo 94° - 1 min. 62° - 1 min. 72° - 1 min. 32 ciclos 72° - 4 min. 1 ciclo 4° - detención Este producto de reacción se purificó después por electroforesis sobre gel, se recortaron las bandas y se dirigió con Sacl para la clonación en el pDPG845. El plásmido pDPG845 se preparó por digestión con Ncol y relleno subsiguiente de la superposición en 5' con Klenow mediante la adición de 2 unidades de enzima Klenow y dNTP hasta una concentración final de 0.2 mM de cada uno de ellos. Esto permitió una ligación directa del codón de inicio ATG con el extremo 5' de la secuencia de codificación de la proteína gamma-coixina, restableciendo así el marco de lectura abierto completo de la gamma-coixma A continuación se digirió el vector con Sacl y se eliminó la secuencia de codificación GUS para dejar un sitio compatible con el extremo 3' de la secuencia de codificación de gamma-coixma El vector preparado pDPG845 y la secuencia de codificación de gamma-coixina se ligaron juntos para formar el vector nuevo denominado pDPG851 (FIG 9) Para facilitar la sustitución del terminador nos en el pDPG851 con el terminado de gamma-coixma, se movió el cásete de expresión a un vector más adecuado, por ejemplo, pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA) Esto se efectuó por digestión del pBK-CMV con Seal (cohesivo) y pDPG851 con Xhol y Clal con un relleno subsiguiente de Klenow de las superposiciones 5' (2 unidades de Klenow y 0 2 mM de cada dNTP) El cásete pDPG851 y la estructura primaria del pBK-CMV fueron purificados sobre gel Después se ligaron los dos plasmidos para generar el pDPG862 (FIG 10) El terminador de gamma-coixina se clonó en el extremo 3' de la secuencia de codificación del gamma-coixina en el pDPG862 Esto se llevo a cabo eliminando primero el terminador nos y clonando después el termmador de coixina purificado en el lugar mediante los pasos que se indican a continuación La secuencia de codificación de la gamma-coixina posee un sitio Seal en la posición 620-625 de la secuencia informada en Genbank Este sitio de restricción, que está presente en el pDPG862 y DV108 como resultantes de la porción de la secuencia de codificación obtenida por medio del procedimiento Genoma Walker, se cortó con Seal, así como con Notl. La secuencia del terminador de gamma-coixina se purificó después sobre gel y lo mismo se hizo con la estructura primaria del pDPG862. Estos dos fragmentos se ligaron para generar el pDPG969 (FIG. 7). La secuencia de codificación de la gamma-coixina se muestra en la SEQ ID N°: 16. Cada una de estas construcciones genéticas fueron introducidas por bombardeo de partículas en células de maíz regenerables como se describirán más adelante en los ejemplos 5 y 6.
EJEMPLO 3 Aislamiento del terminador de oleosina 3 de Coix El kit Genoma Walker y las bibliotecas de ADN genómico usados para aislar las secuencias del promotor y del terminador en los ejemplos 1 y 2 también se emplearon para el aislamiento del terminador de la oleosina 3 de Coix. Todas las concentraciones y condiciones de ciclación de la PCR fueron idénticas a las empleadas en dichos ejemplos, para todas las rondas de PCR. Los únicos cambios efectuados eran los cebadores específicos de Coix utilizados. La primera ronda de PCR se efectuó usando los cebadores cx-L3 3'nestl (SEQ ID N°: 26) y AP1 (SEQ ID N°: 3) y la segunda ronda con los cebadores cx-L3 3'nest2 (SEQ ID N°: 27), cx-L3 3'nest3 (SEQ ID N°. 28) y AP2 (SEQ ID N°: 4). Las secuencias de los cebadores fueron como sigue: cx-L3 3'nestl CGGGCTGATCCTGGCCGGCACCGT cx-L3 3'nest2 GTGTTCTCCTGGATGTACAAGTAC cx-L3 3'nest3 TCCAAGGCCCGCGACGTCAAGGA Los productos de la amplificación fueron separados por medio de electroforesis sobre gel, seguido de excisión de una banda de tamaño apropiado (>500 bp), elución de la banda; la clonación del ADN en el vector pCR2.1 (Invítrogen) se llevó a cabo de acuerdo con las Instrucciones del fabricante y el ADN clonado se secuenció como se describió anteriormente. Este clon, que contenía el terminador de oleosina de Coix, se denominó DV112. La secuencia del terminador de la oleosina se muestra en la SEQ ID N°: 17.
EJEMPLO 4 Comparación de las secuencias del promotor de la qamma-coixina y promotores homólogos de maíz y sorgo Las gamma-prolaminas son una clase de proteínas de almacenamiento de semillas presentes en el endosperma de Coix, sorgo y maíz. Se efectuó un análisis para determinar la similitud de secuencias entre el promotor de gamma-prolamina de Coix (gamma-coixina, SEQ ID N°: 8), clonado por los inventores como se describió en el ejemplo 1 , y las regiones promotoras de gamma-prolamína de las secuencias correspondientes de sorgo (gamma-kafirina, SEQ ID N°: 22, GenBank, N° de Acceso: X62480) y maíz (gamma-zaina, SEQ ID N°: 23, GenBank, N° de Acceso: X56117). Las alineaciones se efectuaron a 894 nucleótidos hacia el extremo 5' con respecto al codón de inicio de la traducción usando el software para análisis de ADN GeneWorks (Intelligenetics, Inc., Mountainview, CA). Se introdujeron faltas de coincidencia [gaps] para facilitar la alineación. El extremo más cercano a 3' de cada secuencia corresponde al codón de inicio ATG. Los resultados de la comparación se muestran en la FIG. 8 y en el cuadro 9. El análisis indica que existe un 65% de identidad de secuencia entre la gamma-coixina y la gamma-kafirina y un 63% de identidad de secuencia entre la gamma-coixina y la gamma-zeína. Estos resultados indicaron la existencia de diferencias significativas entre las regiones promotoras de cada una de las tres especies.
CUADRO 9 Identidad de secuencias de nucleótidos entre las regiones 5' de gamma- prolamina en Coix. maíz y sorgo. gamma kafipna gamma- zeina -1 a -894 1 a -894 gamma coixma 65% 63% -1 a -894 gamma zeina 56% -1 a -894 EJEMPLO 5 Preparación de microprovectiles Los microproyectiles se prepararon de la siguiente manera las partículas de oro se prepararon por adición de 60 mg de partículas de oro 06 µm (BioRad, N° cat 165-2262) a 1000 µl de etanol absoluto e incubación durante por lo menos 3 hora a temperatura ambiente seguido de almacenamiento a -20°C se centrifugaron veinte a treinta y cinco µl de partículas de oro estériles, y con mayor preferencia 30 a 35 µl de partículas de oro (30 µl contienen 1 8 mg de partículas), en una microcentrífuga durante 1 min como máximo El sobrenadante se eliminó y se agregó un ml de agua estéril al tubo, seguido de centrifugación a 1800-2000 rpm durante 2-5 minutos Las partículas de microproyectiles se volvieron a suspender en 25-30 µl de solución de ADN que contenía 250 ng aproximadamente de ADN vector Se agregaron doscientos veinte microhtros de agua estéril, 250 µl de CaCI2 2 5 M y 50 µl de solución que contenía las partículas La solución se mezclo exhaustivamente se coloco sobre hielo, seguido de vortexeo a 4°C durante 10 minutos y centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos El sobrenadante se elimino y el pellet se volvió a suspender en 600 µl de etanol absoluto Después de centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos, el pellet se volvió a suspender en 36-38 µl de etanol absoluto, se vortexeo durante 20 segundos aproximadamente y se sónico durante 20-30 segundos En esta etapa, las partículas se dejaron en reposo durante 2-5 minutos, después de los cuales se retiraron 5-10 µl de sobrenadante y se colocaron sobre la superficie de un disco volador y el etanol se dejó secar por completo. Como alternativa, se pueden retirar partículas directamente después e la resuspensión y vortexeo durante 20 a 30 segundos en 36 µl - 38 µl de etanol, se pueden colocar sobre el disco volador y dejar secar como en el tratamiento con reposo. La cámara de bombardeo fue evacuada entonces hasta aproximadamente 28 pulgadas de Hg antes del bombardeo. Las partículas se emplearon luego para el bombardeo con una descarga de helio de aproximadamente 1100 psi usando el dispositivo para bombardeo de partículas DuPont Bio stics PDS1000He.
EJEMPLO 6 Bombardeo de embriones inmaduros Hi-ll Se recortaron embriones ¡nmadduros (1.2 - 3 0 mm de longitud) el genotipo Hi-ll de maíz de mazorcas Hi-ll cultivadas en invernadero y e superficie esterilizada 10-12 días después de la polinización. El genotipo Hi-ll se desarrolló a partir de un cruzamiento de A188 x B73 (Armstrong af al., 1991 ). Se plaquearon aproximadamente 30 embriones por caja de Petp con el lado del eje hacia abajo sobre medio N6 modificado que contenía 2.4-D 1 mg/l, caseína hidro zada 100 mg/l L-prolina 6 mM, ácido 2-(N-morfol?n)etansulfónico (MES) 0 5 g/l, MgCI20 75 g/l y sacarosa 2% solidificada con Gelgro 2 g/l, pH 5.8 (medio N° 735). Los embriones fueron cultivados en oscuridad durante dos a cuatro días a 24°C. Aproximadamente 3-4 horas antes del bombardeo, transfirieron los embriones al medio cultivo recién descripto con un incremento en la 5 concentración de sacarosa del 3% al 12%. Al transferir los embriones al medio osmótico alto se dispusieron en círculos concéntricos sobre la placa, inicíalmente a 1 cm del centro de la placa, ubicados de manera tal que el extremo de la coleorriza estaba orientado hacia el centro de la placa generalmente se formaron dos círculos concéntricos con 25-35 embriones por 10 placa. Las placas que contenían los embriones se colocaron sobre el tercer estante desde abajo, 5 cm debajo de la pantalla de detención. Se usaron discos de ruptura de 100 psi para el bombardeo. Cada placa con embriones fue bombardeada una vez con la pistola de partículas DuPont 15 Biolistics PDSI OOOHe. Después del bombardeo, se dejó que los embriones se recuperan sobre medio osmótico alto (735, sacarosa 12%) durante toda la noche (16-24 horas) y luego fueron transferidos a medio de selección que contenía bialafos 1 mg/l (N° 739, 735 más bialafos 1 mg/l o N° 750, 735 más manitol 0.2M y bialafos 1 mg/l). Los embriones se conservaron en oscuridad a 20 24°C. Después de tres o cuatro semanas sobre las placas de selección iniciales, alrededor de un 90% de los embriones había formado callos de Tipo II y se transfirieron a medio selectivo que contenía bialafos 3 mg/l (N° 758). Después se puede emplear análisis Southern para analizar a los transformantes y llevar a cabo los ensayos de expresión génica. Las construcciones usadas para la transformación y la cantidad de transformantes se indican en el siguiente cuadro 10 CUADRO 10 Transformantes obtenidos del bombardeo de embriones de maíz con EJEMPLO 7 Determinación de elementos reguladores promotores putativos La identificación de los elementos reguladores putativos dentro de cada secuencia promotora comienza por una comparación con secuencias promotoras conocidas por su similitud en cuanto a expresión específica de tejidos o relacionada con el desarrollo única Las secuencias que son compartidas ente promotores con patrones de expresión similares son candidatos probables para la unión de factores de transcripción y por consiguiente son elementos que confieren patrones de expresión parecidos La confirmación de estos elementos reguladores putativos se logra mediante análisis de supresión de cada promotor, seguido de un análisis funcional de cada construcción de supresión mediante evaluación de un gen informante que está unido funcionalmente a cada construcción Dicho análisis se llevo a cabo con el promotor clonado de gamma-coixma La alineación de la secuencia de ADN del promotor de gamma-coixina de Coix con los promotores de los genes de gamma-zeína de maíz y gamma-kafipna de sorgo se efectuó como se describió en el ejemplo 4 y reveló diversas regiones cortas de homología que representan sitios de unión a potenciales factores de transcripción Algunos de estos sitios también han sido identificados anteriormente como regiones reguladoras putativas de promotores de proteínas de almacenamiento de sorgo (Ottoboni et al , 1993, de Freitas et al , 1994) Se identificaron cuatro regiones reguladoras putativas Se anticipa que dos regiones confieren actividad promotora general, potencialmente como respuesta al estado del nitrógeno, y estas regiones se denominan regiones de tipo GCN4-1 Se predice que otras dos regiones adicionales confieren expresión especifica de tejidos y se denomina regiones de unión al box de prolamina Los elementos se disponen entre 180 y 700 pares de base desde el sitio de inicio de la traducción, con un box de GCN4 mas próximo al codon de metionina inicial (-190 bp), seguido de una box de prolamina (-395 bp), un segundo box de GCN4 (-525 bp) y, finalmente, un segundo box de prolamina (-650 bp) Se diseñaron secuencias promotoras truncadas para eliminar 5 específicamente los elementos reguladores putativos específicos de tejidos mediante la generación de fragmentos promotores de 412 bp (SEQ ID N° 19) y 222 bp (SEQ ID N° 18) (distancias del sitio de inicio de la traducción) El fragmento promotor de 412 bp solamente incluye los motivos de GCN4 proximal y del box de prolamina, en tanto el fragmento de 22 bp solamente 10 incluye el motivo GCN4 proximal, habiéndose eliminado ambas regiones box de prolamina Estos fragmentos promotores, ademas del promotor de longitud completa de la gamma-coixina, se clonaron en vectores que contenía el gen informante GUS, con sin el intronl de actinal de arroz para potenciar la expresión Estos vectores se denominaron pDPG844 845, 846, 847, 848 y 15 849, y su construcción se ha descppto anteriormente Cada construcción fue bombardeada en embriones inmaduros de maíz (como se describió en el ejemplo 6) y se generaron plantas que contenían cada una de las construcciones promotor GUS como transgenes Las plantas que contienen estos transgenes serán analizadas 20 por la expresión del gen informante GUS en todos los tejidos vegetales en muchas etapas de desarrollo distintas Se prevé que la mas corta de las construcciones promotoras (221 bp, pDPG848 y pDPG849) no presentara patrones de expresión específicos de tejidos dado que este promotor carece de las regiones reguladoras prolamina-box. Se prevé además que las construcciones promotoras de 412 bp (pDPG846 y pDPG847) van a retener la especificidad de tejidos, pero dirigirán niveles de expresión más bajas en comparación con las construcciones promotoras de longitud completa (pDPG844 y pDPG845).
EJEMPLO 8 Supresión en el sentido del marco de lectura de un gen de a-zeina en maíz transgénico y eliminación de la supresión mediante el uso de promotores de Coix Se ha demostrado que la expresión de un cásete de expresión de zeína en el sentido del marco de lectura en maíz induce la supresión de la expresión endógena de zeína si el gen de zeína está controlado por un promotor de maíz. Para demostrar que no obtendrá supresión si se usa un promotor Coix, se puede llevar a cabo estudios de transformación y efectuar comparaciones estudios se llevan a cabo de la siguiente manera. Se transformaron células de maíz con el vector plasmídico pDPG531 , que contiene el promotor Z27 en el sentido del marco de lectura de maíz y la región 3' de la nopalina sintetasa, como se describe en la Patente de los E.U.A. No. de serie: 08/763.704, presentada el 9 de diciembre, 1996, cuya descripción se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia. El pDPG531 se elaboró recortando un fragmento de aproximadamente 960 pares de bases del vector SPZ4Ent y rellenando los extremos (Patente de los E U A No de sene 08/763 704, presentada el 9 de diciembre, 1996) En esencia, toda la unidad de transcripción Z4 está contenida en SPZ4Ent, con un tamaño de inserto total de 960 nucleotidos El gen Z4 se reconstruyó a partir de dos subclones Z4, pSPZ4R3' y pSPZ45' El vector progenitor era pSPZ4R3', que contenía 713 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de repetición en la región media 3', desde el nucleotido 630 al nucleótido 1341 de la secuencia Z4 El extremo 5' de la secuencia Z4 fue liberado por digestión con Sacl (que iva la secuencia del poliligador fuera del gen insertado) y BamHl, y el inserto que contenía la secuencia 5' del pSPZ45', obtenido por digestión con Sacl (que también diva la secuencia poli gadora) y BamHl, se ligo con el vector alineado pSPZ4R3', dando como resultado la reconstitución de la unidad de transcripción intacta Z4 El vector resultante contenía la construcción promotor Z27 región 3' Nos en el pBSK(-) que contenía un sitio Ncol único entre el promotor y el terminador Se aplicaron extremos pegajosos al vector y al inserto y se ligaron Los clones fueron identificados con la orientación en el sentido del marco de lectura de la secuencia de ADN Z4 (pDPG531 ) El pDPG531 puede ser transcripto y traducido en la protema zeína de 22 kD (a-zeína) Los plásmidos pDPG531 y pDPG165 fueron introducidos en células de maíz por cobombardeo de la siguiente manera Se regeneraron transformantes como se describe en la publicación PCT WO 95/06128 y en la Patente de los Estados Unidos No de sene 08/763 704, presentada el 9 de diciembre, 1996, ambas descripciones se incorporan específicamente y por completo en este documento a modo de referencia El procedimiento fue como sigue se cruzaron plantas de maíz de los genotipos A188 x B73 con plantas de maíz Hi-ll (Armstrong et al , 1991 ) Se recortaron embriones inmaduros (1 2-2 0 mm de mm longitud) de mazorcas Hi-ll cultivadas en invernadero, de superficie esterilizada, 11-12 días después de la polinización El genotipo Hi-ll fue desarrollado a partir de un cruzamiento A188 x B73 para una frecuencia alta de desarrollo de callos tipo II a partir de embriones inmaduros (Armstrong et al , 1991 ) Se plaquearon aproximadamente 30 embriones por caja de Petp con el lado del eje hacia abajo sobre medio N6 modificado que contenía 2 4-D 1 mg/l, caseína hidro zada 100 mg/l, L-prohna 6 mM, ácido 2-(N-morfol?n)etansulfón?co (MES) 0 5 g/l, MgCI2 0 75 g/l y sacarosa 2% solidificado con Gelgro 2 gl, pH 5 8 medio No 735) Los embriones fueron cultivados en oscuridad durante dos a cuatro días a 24°C Aproximadamente cuatro horas antes del bombardeo, se transfirieron los embriones al medio de cultivo anterior con un incremento en la concentración de la sacarosa de 3% a 12% Al transferir los embriones al medio osmótico alto se dispusieron en circuios concéntricos sobre la placa, inicialmente a 2 cm del centro de la placa, ubicados de manera tal que el extremo de la coleorriza estaba orientado hacia el centro de la placa Generalmente se formaron dos círculos concéntricos con 25-35 embriones por placa Las placas que contenían los embriones se colocan sobre el tercer estante desde abajo, 5 cm debajo de la pantalla de detención. Se usaron discos de ruptura de 1100 psi. Cada placa con embriones fue bombardeada una vez. Se dejó que los embriones se recuperaran sobre medio osmótico fuerte durante toda la noche antes de iniciar la selección. Después de recuperación sobre medio osmótico alto (735, sacarosa 12%) durante toda la noche (16-24 horas), los embriones fueron transferidos a medio de selección que contenía bialafos 1 mg/l (No. 739, 735 más bialafos 1 mg/l o No. 750, 735 más manitol 0.2 M y bialafos 1 mg/l). Los embriones se mantuvieron en oscuridad a 24°C. Después de tres a cuatro semanas sobre las placas de selección iniciales, alrededor del 90% de los embriones había formado callos de Tipo II y fueron transferidos a medio selectivo que contenía bialafos 3 mg/l (No. 758). Se subcultivó el tejido resistente a bialafos aproximadamente cada dos semanas sobre medios de selección fresco (No. 758). Los callos embrionarios transformados fueron transferidos a medio de cultivo de regeneración (medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), que contenía L-asparagina 0.91 mg/L, L-prolina 1.4 g/L, D-sorbitol 20 g/L, ácido naftalenacétíco 0.04 mg/L (NAA) y 6-bencilaminopurina 3 mg/L). Las células se cultivaron durante cuatro semanas aproximadamente sobre este medio de cultivo con una transferencia a medio fresco a las 2 semanas aproximadamente. Los transformantes fueron transferidos subsiguientemente a medio de cultivo MSO (medio MS sin adición de fítohormonas). Las plantas regeneradas fueron transferidas a tierra. Las plantas se cruzaron con líneas entogámicas de maíz denominadas AW, CV yY DJ. Las semillas que contenían el cásete de expresión en el sentido del marco de lectura Z27 eran opacas con un fenotipo similar al de los granos mutantes opaque-2. Se regeneraron plantas a partir de tres casetes de expresión en el sentido del marco de lectura Z27-Z4 y se cruzaron con endogámicos denominados AW, CV y CN. Se comparó la cantidad de proteína a-zeína presente en plantas de maíz no transformadas y transformantes en el sentido del marco de lectura Z27-Z4 sobre geles de poliacrilamida coloreados con Coomassie blue como se describe a continuación. Se suspendieron 50 miligramos de granos molidos en 0.5 ml de etanol 70%, ß-mercaptoetanol 1 % y se extrajeron a temperatura ambiente durante 30 minutos a toda la noche. La muestra se vortexeó y se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 minutos. Se retiraron cincuenta microlitros del sobrenadante que contenía proteína-zeína y se secó. Las proteínas zeína se volvieron a suspender en 50 µl de buffer de carga para gel de poliacrilamida SDS que contenía ß-mercaptoetanol 1 %. La proteína se separó sobre geles de poliacrilamida SDS y se coloreó con Coomassie blue. Los resultados demostraron una reducción inesperada en los niveles de proteína a-zeína presentes en transformantes en el sentido del marco de lecuta Z27-Z4. La reducción fue comparable con la observada en los transformantes antisentido. Además de la reducción inesperada en la concentración de proteína zeína en transformantes con el sentido del marco de lectura, las semillas con un contenido reducido de zeína también exhibía, en general, el fenotipo opaco y una reducción en los niveles de zeína Z27.
Las concentraciones de lisina y leucma también fueron analizadas en semillas derivadas de granos individuales Se extrajeron aminoácidos de granos maduros derivados de tres líneas transformadas independientes de la siguiente manera Se hidrolizaron cincuenta miligramos de harina de maíz molido en 1 ml de HCl 6N bajo argón durante 24 horas a 110°C Las muestras se diluyeron a 50 ml y se filtraron a través de un filtro de 045 micrones Se agregó normaliza a cada muestra como estándar interno antes del análisis por HPLC Los aminoácidos se separaron sobre una columna para HPLC Supelcosil LC-8 (Jarrett et al , 1986, Jones et al , 1983, AACC, 1995) Los resultados de los análisis de granos separados revelaron diferencias entre granos transformados y no transformados que eran significativas, con un nivel de significancia de p<0 05 En un transformante, denominado KQ018, los niveles de lisina y leucina eran estadísticamente iguales en semillas isogenicas transformadas y no transformadas Sin embargo, en un transformante, denominado KQ012, los niveles de sma habían aumentado con significancia estadística en el transformante y los niveles de leucma habían disminuido con significancia estadística en el transformante Por ello se indica que los transformantes promotor Z27-Z4 en sentido del marco de lectura producen un fenotipo de morfología, proteínas y composición de aminoácidos en las semillas similar al observado en los transformantes antisentido. Se cree que esto tienen lugar como resultado del silenciamiento de genes dependiente de homología.
Con el fin de demostrar que el silenciamiento de genes basado en homología no se produce cuando se sustituye el promotor Z27 de maíz por un promotor Coix del gen Coix homólogo, se construye un vector plasmídico que contiene un promotor aislado del gen Coix homólogo del gen Z27 y este promotor es ligado operativamente a la secuencia de codificación Z4 de Zea mays. La secuencia promotora es aislada usando la estrategia descripta en el ejemplo 1. El vector con el promotor-Co/x-secuencia de codificación-Z4 es transformada entonces en maíz como se describió anteriormente. Se regeneran plantas transgénicas que contienen el vector como se describió anteriormente se cruzan con endogámicos no transformados. Luego se mide la cantidad de a-zeína para demostrar la falta de reducción en la expresión transgénica en los transformantes que contienen el cásete de expresión con el promotor derivado de Co/x-gen estructural Z4. Aún más, una expresión incrementada del cásete de expresión con el promotor derivado de Co/x-gen estructural Z4 con relación a la de transformantes que contienen el promotor nativo queda demostrada por la falta del fenotipo opaco en las plantas que poseen el cásete de expresión con el promotor derivado de Co/x-gen estructural Z4. También se efectúa un análisis de las concentraciones de Usina y leucina en transformantes con el cásete de expresión promotor Co/x-gen estructural Z4 para demostrar que los niveles de lisina no aumentaron y que los niveles de leucina no disminuyeron, indicando así que no se observa una co-supresión en el sentido del marco de lectura en los transformantes de maíz que contienen un promotor derivado de Coix, como se observó al usar el promotor Z27 de maíz.
EJEMPLO 9 Tranformación de embriones inmaduros o callos H99 y selección con paromomicina Se aislaron embriones inmaduros de maíz (1.2-3.0 mm, 10-14 días después de la polinización) de plantas H99 cultivadas en invernadero que habían sido autopolinizadas o polinizadas entre hermanos. Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio 735 en oscuridad a 27°C aproximadamente. Los embriones inmaduros son bombardeados a 27°C aproximadamente. Los embriones inmaduros son bombardeados 1-6 días después del aislamiento o bien, cultivadas para producir callos embrionarios que luego se emplean para el bombardeo. Los callos embrionarios se expanden y se mantienen por subcultivo a intervalos de 2-3 semanas sobre medio 735 fresco. Antes del bombardeo, los embriones o callos embrionarios cultivados (subdivididos en grupos de 2-4 mm aproximadamente) son transferidos a medio 735 que contiene sacarosa 12% durante 3-6 horas. Después del bombardeo, efectuado como se describió en el ejemplo 6, los cultivos de tejido son incubados durante toda la noche y transferidos a medio 735 que contiene paromomicina 500 mg/L. Después de 2-3 semanas, los callos se subdividen en pequeños trozos (2-4 mm de diámetro aproximadamente) y se transfieren a medio de selección. Este paso de subcultivo se repite a intervalos de 2-3 semanas durante aproximadamente 15 semanas como máximo después del bombardeo, con subdivisión y selección visual de callos saludables, en crecimiento. Los callos tolerantes a paromomicina se transfieren a medio 735 sin 2,4-D pero que contiene BAP 3.52 mg/L durante 3-9 días en oscuridad a 27°C aproximadamente y luego se transfieren a medio 110 (sales MS V2 X, tiamina 0.5 mg/L, ácido nicotínico 0.5 mg/L, sacarosa 3%, Gelgro 3.6 g/L, pH 5.8) que contiene paromomicina 100 mg/L en Phytatrays (Sigma) y se cultivan a 27°C aproximadamente con luz. Las plántulas que se desarrollan en Phytatrays y después de 3-6 semanas se transfieren a tierra. Las plántulas son aclimatadas en una cámara de crecimiento y se cultivan hasta alcanzar la madurez en invernadero.
EJEMPL0 10 Expresión del gen informante GUS bajo el control del promotor de gamma-coixina Coloración histoquímica estádar para actividad GUS 1 ) Combinar soluciones madre para el buffer de ensayo GUS, para ello preparar: Ferricianuro de potasio solución madre 50 mM 1 mL Ferrocíanuro de potasio solución madre 50 mM 1 mL Buffer fosfato de sodio solución madre 200 mM, pH 7.0 5 mL EDTA sódica solución madre 10 mM, pH 8.0 1 mL Tritón X-100 solución 10% v/v 1 mL 2) Esteerilizar con filtro la mezcla del buffer de ensayo a través de un filtro de 0.2 micrones. 3) El substrato cromogénico es X-gluc(5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónido) que se disuelve en N,N-dimetilformamida a una concentración de 25 mg/mL. 4) Preparar la solución de trabajo del ensayo GUS combinando los siguientes reactivos: Buffer fosfato de sodio 200 mM, pH 7.0 26 mL Buffer de ensayo GUS (paso 1 anterior) 9 mL Substrato X-gluc Solución madre 25 mg/mL 1.2 mL 5) Incubar el tejido en la mezcla para ensayo GUS a 37°C. Los tejidos que contienen la enzima GUS activa aparecen de color azul. El tejido puede ser incubado durante toda la noche o por más tiempo a temperatura ambiente si fuera necesario. Los granos de las plantas transgénicas descriptas en el ejemplo 7 fueron evaluadas por la expresión del gen GUS. Los granos se obtuvieron de plantas transgénicas R0 individuales desde 9 días después de la polinización (DAP) hasta 27 DAP. Los granos se cortaron longitudinalmente con una hoja de afeitar. Los trozos de grano se colocaron en las cavidades de una placa para microtitulación de 24 cavidades y se incubaron en solución para ensayo GUS a temperatura ambiente usando el método descripto por Jefferson (Jefferson, R.A., 1987). Se registró el color azul indicativo de actividad GUS usando una escala de 0-4 (0, sin coloración azul; y 4, coloración azul intenso). Entre las plantas evaluadas en la etapa RO por la expresión de GUS en los granos, se observó coloración azul en cinco de nueve plantas que contenían la construcción GcxPro(900)/GUS/NOS, cuatro de nueve plantas que contenían la construcción GcxPro(900)/rActina1/GUS/NOS, tres de 12 plantas que contenían la construcción GcxPro(400)/rActina1/GUS/NOS y dos de seis plantas que contenían la construcción GcsPro(220(/rActina1/GUS/NOS (CUADRO 11 ). Ninguna de las plantas examinadas que contenían la construcción GcxPro(400)/GUS/NOS o la construcción GcxPro/220)/GUS/NOS presentaban ninguna coloración azul en los granos. También se observó el patrón de coloración espacial, con respecto a la coloración azul en diferentes partes del grano. Los granos de las plantas GcxPro(900)/GUS/NOS presentaban un patrón de expresión exclusivamente en el endosperma, con mayor coloración en el endosperma almidonoso y una coloración limitada en la aleurona de algunos granos; los granos de las plantas GcxPro(900/rActina1/GUS/NOS presentaban un patrón de coloración primariamente en el almidón del endosperma y una coloración ligera, limitada en el germen de algunos granos; y los granos de las plantas GcxPro(400)/rActina1/GUS/NOS o de las plantas GcsPro(220)/rActina1/GUS/NOS presentaban coloración tanto en el endosperma como en el germen, indicativo de la pérdida del patrón de expresión específico del endosperma. No eran detectables ninguna coloración azul en los granos de las plantas GcxPro(400)/GUS/NOS o de las plantas GcxPro(220)/GUS/NOS. Las plantas que expresan cualquiera de los transfenes GcxPro(900)/GUS/NOS o GcsPro(900)/rActin1/GUS/NOS también presentaba un patrón de coloración regulado temporalmente, donde las semillas más viejas presentan un mayor grado de coloración azul que las semillas más jóvenes (cuadro 12).
CUADRO 11 Frecuencia de plantas transgénicas qamma-coxina/GUS gue presentan actividad GUS en tejidos de los granos Nro de Nro. . de transformantes transformantes que expresan actividad evaluados GUS GcxPro/(900)/GUS/NOS 9 5 GcxPro/(900)rActin 1 /GUS/NOS 9 4 GcxPro/(400)/GUS/NOS 8 0 GcxPro/(400)rActin/GUS/NOS 12 3 GcxPro/(220)/GUS/NOS 9 0 GcxPro/(220)rActin1/GUS/NOS 6 2 CUADRO 12 Expresión de actividad GUS en granos en desarrollo de plantas transgénicas RO gue contienen construcciones gamma-coixina/GUS Descripción de plásmido Tranformante No. de DAP Calificación plantas GUS GcxPro(900)/GUS/NOS 92RR204 4 10 1 12 0 20 3 24 4 92RR201 3 10 0 20 3 92RR101 2 10 0 20 1 24 1 92RR205 1 11 2 25 3 92RR207 2 10 0 20 3 24 4 GcxPro(900)/rAct¡n 1 /GUS/NOS 93RS302 4 10 1 20 3 24 3 93RS306 1 24 2 2 24 2 GcxPro(400)/rAct¡n 1/GUS/NOS 94RT503 3 22 3 2 29 3 94RT507 1 16 3 2 27 3 3 21 3 GcxPro(220)/rActin 1/GUS/NOS 99RX303 1 9 1 23 1 99RX305 3 11 2 27 2 EJEMPLO 11 Método general para el bombardeo con micropartículas Existen muchas variaciones en las técnicas de bombardeo con micropartículas que son bien conocidas en la técnica y por ello consideradas de utilidad con la presente invención Los ejemplos de procedimientos para el bombardeo se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 95/06128, cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia Los ejemplos de tejidos blanco que se pueden utilizar con la presente invención incluyen embriones inmaduros, callos de tipo I, callos de tipo II, callos de tipo lll, cultivos en suspensión y tejido mepstematico (solicitud PCT WO 96/04392) Algunos genotipos que son de especial utilidad para la transformación de maíz se describieron específicamente en este documento, asi como en, por ejemplo, la solicitud PCT WO 95/06128 Los genotipos preferidos son aquellos que se pueden transformar con facilidad y que también pueden ser regenerados para obtener una pl<_nta transgénica fértil Se puede usar potencialmente cualquier método para acelerar microproyectiles en la transformación de una célula vegetal con la presente invención El método preferido es una pistola de partículas a gas, tal como el dispositivo para bombardeo de partículas DuPont Bio stics PDSIOOOHe Los ejemplos de partículas para el bombardeo incluyen los que se componen de tungsteno, oro, platino y semejantes. Las partículas de oro se consideran de particular utilidad en la presente invención, siendo prefepdas las partículas de oro de 0.6 µm ó 0.7 µm y más preferidas aún las partículas de 0.6 µm. Las partículas más preferidas se recubren con ADN y poseen un tamaño promedio entre 0.6 µm y 1.0 µm. Tal como se describe en este documento, se puede emplear cualquier secuencia de ADN para la transformación. Los segmentos de ADN usados para la transformación incluyen preferentemente uno o más marcadores seleccionables, secretables o rastreables. Muchos ejemplos de los mismos son bien conocidos en la técnica y se describen específicamente en este documento. En el caso de los marcadores seleccionables, la selección puede ser en medios sólidos o líquidos. Los segmentos de ADN usados también incluyen con preferencia, uno o más genes que confieren, ya sea individualmente o en combinación con otras secuencias, el fenotipo deseado en la planta transformadora. Los ejemplos de genes de la transformación y los correspondientes fenotipos que pueden conferir estas secuencias a la planta transformada se describen en este documento.
EJEMPLO 12 Integración de transgenes en híbridos y endogámicos de élite Se puede emplear la retrocruza para mejorar una planta endogámica. La retrocuza transfiere características deseables específicas de una fuente a un endogámico u otra planta que no posee dicha característica. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un primer cruzamiento de un endogámico superior (A) (progenitor recurrente) con un endogámico donante (progenitor no recurrente), que lleva el o los genes apropiados gen(s) para la característica en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de acuerdo con la presente invención. De la progenie resultante de este cruzamiento se selecciona primero la progenie con la característica que se desea transferir de la plana no recurrente, luego se vuelve a cruzar la progenie con el progenitor recurrente superior (A). Después de cinco o más generaciones de retrocruza con selección para la característica deseada, la progenie es hemicigota para los loci que controlan la característica que está siendo transferida, pero es como el progenitor superior para la mayoría o casi todos los demás genes. La última generación de retrocruza se va a autocruzar por lo menos una vez para dar una progenie de línea pura para el o los genes que están siendo transferidos, es decir uno o más sucesos de transformación.
Por ello, a través de una serie de manipulaciones de mejoramiento se puede mover el gen seleccionado de una línea de maíz a una línea de maíz completamente diferentes si la necesidad de ninguna manipulación recombinante adicional. Los transgenes introducidos son valiosos por cuanto se comportan genéticamente como cualquiera otro gen de maíz y se puede manipular mediante técnicas de mejoramiento de manera idéntica a cualquier otro gen de maíz. Entonces, se pueden producir planta endogámicas que son puras para un o más transgenes. El cruzamiento de diferentes plantas endogámicas permite producir una gran cantidad de híbridos con diferentes combinaciones de transgenes. De esta manera, se pueden producir plantas que posean las propiedades agronómicas deseables, frecuentemente asociadas con híbridos ("vigor híbrido"), así como las características deseables Impartidas por uno o más transgenes.
EJEMPL0 13 Selección asistida por marcadores Se pueden emplear marcadores genéticos para asistir en la introducción de uno o más transgenes de la invención desde un antecedente genético en otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas con respecto a la cría o mejoramiento convencional por cuanto se puede utilizar para evitar los errores causados por las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proveer datos con respecto al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruzamiento en particular. Por ejemplo, cuando se cruza una planta con la característica deseada que de otra manera no tendría un antecedente genético agronómico deseable con un progenitor de élite, se pueden emplear marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no solamente posea la característica de interés, sino que también presenta una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, se minimiza la cantidad de generaciones necesarias para introducir una o más características en un antecedente genético particular.
En el proceso de mejoramiento asistido por marcadores se utilizan secuencias de ADN para efectuar un seguimiento de las características agronómicas deseables (Tanksley et al, 1989) en el proceso de cria o fitomejoramiento El mejoramiento asistido por marcadores se puede llevar a cabo de la siguiente manera Se siembran semillas de planta con la característica deseada en tierra en invernadero o en el campo El tejido de las hojas se cosecha de la planta para la preparación de ADN en cualquier momento del crecimiento en que se puede retirar aproximadamente un gramo de tejido de hojas de la planta sin comprometer la viabilidad de la misma Se aisla el ADN genomico utilizando un procedimiento modificado de Shure et al, (1983) Se liofiliza aproximadamente un gramo de tejido de hoja de una plántula durante toda la noche en tubos de polipropileno de 15 ml El tejido secado por congelamiento se muele hasta obtener un polvo en el tubo utilizando una varilla de vidrio El tejido pulverizado se mezcla cuidadosamente con 3 ml de buffer de extracción (urea 7 0 NaCI 0 35 M, Tris-HCl 0 05 M pH 8 0 EDTA 0 01 M, sarcosina 1 %) El homogenato de tejido/buffer se extrae con 3 ml de fenol/cloroformo La fase acuosa se separa por centrifugación y se precipita dos veces utilizando 1/10 volumen de acetato de amonio 4 4 M pH 5 2 y un volumen igual de isopropanol El precipitado se lava con etanol 75% y se vuelve a suspender en 100-500 µl TE (Tps-HCI 0 01 M, EDTA 0 001 M, pH 8 0) El ADN genomico se digiere con un exceso de 3-veces de enzimas de restricción, se somete a electroforesis a través de agarosa 0 8% (FMC) y se transfiere (Southern, 1975) sobre Nytran (Scheicher y Schuell) utilizando SCP 10X (20 SCP: NaCI 2M, fosfato disódico 0.6 M, EDTA disódica 0.02 M). Los filtros se prehibridizan en SCP 6X, sulfato de dextrano 10%, sarcosina 2% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 500 µg/ml y sonda marcada con 32P generada por un proceso de cebado aleatorio (Feínberg & Vogelstein, 1983). Los filtros hibridizados se lavan con SCP 2X, SDS 1 % a 65°C durante 30 minutos y se visualizan por autoradiografía utilizando una película Kodak XAF.5. De esta manera se utilizan polimorfismos que están ligados a las características de interés para predecir la presencia o ausencia de dichas características de interés. Los expertos en el arte comprenderán que existen muchas maneras diferentes de aislar ADN de los tejidos vegetales y que existen muchos protocolos diferentes para una hibridización Southern que permitirán obtener resultados idénticos. Los expertos en el arte comprenderán también que se puede eliminar la sonda radioactiva en una transferencia Southern después de la autoradiografía y volver a efectuar un análisis con sonda usando una sonda diferente. De esta manera es posible identificar cada uno de los diversos transgenes presentes en la planta. Además, el especialista en la técnica comprenderá que se puede utilizar cualquier tipo de marcador genético que sea polimórfico en la o las regiones de interés con el propósito de identificar la presencia o ausencia relativa de una característica y que dicha información puede ser empleada en cría asistida por marcadores.
Cada línea en la transferencia Southern representa un ADN asilado de una planta El uso de una multiplicidad de sucesos de integración del gen como sondas con el mismo transferido de ADN genomico, permite determinar la composición de sucesos de integración de cada planta Se han establecido correlaciones entre las contribuciones de un suceso de integración particular con el fenotipo de la planta Solamente aquellas plantas que contienen la combinación deseada de sucesos de integración llegarán a la madurez y serán empleadas para polinización Las sondas de ADN correspondientes a sucesos de integración particulares son marcadores útiles durante el transcurso del mejoramiento de una planta para identificar y combinar sucesos de integración particulares sin necesidad de cultivar las plantas y evaluarlas por su rendimiento agronómico Se prevé que se puede emplear una o más enzimas de restricción para digerir el ADN genómico, ya sea solo o en combinaciones El especialista en la técnica comprenderá que muchas enzimas de restricción diferentes serán de utilidad y la elección de la enzima de restricción dependerá de la secuencia de ADN del suceso de integración transgénico que se utiliza como sonda y de las secuencias de ADN del genoma que rodea al transgen Para el caso de una sonda, se empleará secuencias de ADN o ARN que se hibpdizan con el ADN usado en la transformación Se seleccionará una enzima de restricción que produzca un fragmento de ADN después de la hibpdización que sea identificable como el suceso de integración transgénico Así, las enzimas de restricción que son de especial utilidad serán aquéllas que presentan polimorfismos ligados en general con transgenes específicos o con las características de interés.
EJEMPLO 14 Métodos generales para los ensayos El análisis de ADN de las plantas transformadas se llevó a cabo como sigue. Se aisló ADN genómico utilizando un procedimiento modificado de Shure, et al., 1983. Se molió aproximadamente 1 g de tejido de callo u hoja hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando un mortero. El tejido pulverizado se mezcló cuidadosamente con 4 ml de buffer de extracción (urea 7.0, NaCI 0.35 M, Tris-HCl 0.05 M, pH 8.0, EDTA 0.01 , sarcosina 1%). El homogenato tejido/buffer se extrajo con 4 ml de fenol/cloroformo. La fase acuosa se separó por centrifugación, se pasó a través de Miracloth y se precipitó des veces utilizando 1/10 volumen de acetato de amonio 4.4 M, pH 5.2 y un volumen igual de isopropanol. El precipitado se lavó con etanol 70% y se volvió a suspender en 200-500 µl de TE (Tris-HCl 0.01 M, EDTA 0.001 M, pH 8.0). La presencia de un gen en una célula transformada puede ser detectada mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Utilizando esta técnica se pueden amplificar fragmentos específicos de ADN y detectarlos después de electroforesís sobre gel. Por ejemplo, se agregan doscientos a 1000 ng de ADN genómico a la mezcla de reacción que contiene Tris-HCl 10 mM pH 8.3, MgCI2 1.5 mM, KCl 50 mM, gelatina 0.1 mg/ml, 200 µM de cada uno de dATP, dCP, dGTP, dTTP, cebadores de ADN directos e inversos 0.5 µM cada uno, glicerol 20% y 2.5 unidades de ADN polimerasas Taq. La reacción se corre en un equipo de ciclación térmica de la siguiente manera: 3 minutos a 94°C, 39 repeticiones del ciclo, 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C, 30 segundos a 72°C, seguido por 5 minutos a 72°C. Se corren 20 µl de cada mezcla de reacción sobre un gel NuSieve 3.5% en buffer TBE (Tris-borato 90 mM, EDTA 2 mM) a 50 V durante dos a cuatro horas. Utilizando estos cebadores se amplifica un fragmento de 324 pares de bases del transgen EPSPS mutante. Este procedimiento permite detectar, por ejemplo, la presencia del gen bar, usando el cebador directo CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC (SEQ ID N°: 20) y el cebador inverso AAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGA (SEQ ID N°: 21 ). El método para detectar la presencia de fosfinotricinacetíl transferasa (PAT) comprende el uso de una reacción enzimática in vitro, seguido do cromatografía en capa delgada, como se describe en la solicitud PCT WO 95/06128 (cuyo contenido se incorpora específicamente y por completo en este documento a modo de referencia). El procedimiento consiste en preparar varios extractos de proteínas a partir de homogenatos de células potencialmente transformadas y a partir de células control, que no han sido transformadas ni expuestas a selección con bialafos, y evaluar después mediante incubación con PPT y C-acetil-Coenzima-A seguido de cromatografía en capa delgada. Los resultados de este ensayo permiten confirmar la expresión del gen bar que codifica PAT. Para el análisis de transferencia Southern, se digirió ADN genómico con un exceso de tres veces de enzimas de restricción, se sometió 5 a electroforesis a través de agarosa 0.8% (FMC) y se transfirió (Southern, 1975) a Nytran (Schleicher y Schuell) utilizando SCP 10X (SCP 20X: NaCI 2 M, fosfato disódico 0.6 M, EDTA disódica 0.02 M). Las sondas se marcaron con 32P usando el método de cebado aleatorio (Boehringer Mannheim) y se purificaron usando columnas Spin Quik-Sep® (Isolab Inc., Akron, OH). Los 10 filtros se prehibridizaron a 65°C en SCP 6X, sulfato de dextrano 10%, sarcosina 2% y heparina 500 µg/ml (Chomet et al., 1987) durante 15 min. Los filtros se hibridizaron después durante toda la noche a 65°C en SCP 6X que contenía ADN de esperma de salmón desnaturalizado 100 µg/ml y sonda marcada con 32P. Los filtros se lavaron en SCP 2X, SDS 1% a 65°C durante 15 30 mín. y se visualizaron por autoradiografía utilizando una película Kodak XAR5. Para la rehibridización, los filtros se llevaron a ebullición durante 10 min. en H2O destilada para eliminar la primera sonda y luego se prehibridizaron como se describió anteriormente.
EJEMPLO 15 Utilización de los cultivos transgénicos La meta final de la transformación de plantas es precisamente producir plantas que sean de utilidad para el hombre. En este sentido, se pueden emplear las plantas transgénicas creadas de acuerdo con la presente invención para casi cualquier propósito considerado de valor para el cultivador o para el consumidor. Por ejemplo, puede ser conveniente cosechar semillas de las plantas transgénicas. Estas semillas se pueden emplear, a su vez, para diversos fines. Las semillas pueden ser vendidas a los grupos para la siembra de las mismas en el campo o se pueden utilizar directamente como alimento, ya sea para animales o seres humanos. Como alternativa, se pueden elaborar productos a partir de las mismas semillas. Los ejemplos de productos que se pueden elaborar a partir de las semillas incluyen, aceite, almidón, alimento para animales o seres humanos, farmacéuticos y diversos productos industriales. Los usos del maíz en alimentos, además del consumo para seres humanos de granos de maíz, incluyen productos de las industrias de molienda seca y húmeda. Los principales productos de la molienda seca de maíz son sémola, harina de grano fino y grueso. La industria de la molienda húmeda de maíz puede proveer almidón de maíz, jarabes y dextrosa de maíz para uso en alimentos. El aceite de maíz se recupera del germen de maíz, que es un subproducto de ambas industrias de molienda, seca y húmeda.
El maíz, incluyendo tanto las porciones de granos y como las que no son granos de la planta, también se emplean extensivamente como forrajes para ganado, primariamente para ganado de faena, ganado lechero, porcinos y aves de corral Los usos industriales del maíz la producción de etanol, almidón de maíz en la industria de la molienda y húmeda y harina de maíz en la industria de molienda seca. Las aplicaciones industriales del almidón y la harina de maíz se basan en propiedades funcionales, tales como viscosidad, formación de películas, propiedades adhesivas y capacidad para suspender partículas El almidón y la harina de maíz poseen aplicaciones en las industrias del papel y textil Otros usos industriales incluyen aplicaciones en adhesivos, materiales para la construcción, aglutinantes de función, almidones para lavandería, explosivos, barros para pozos de petróleo y otras aplicaciones de minería. Las partes de la planta de maíz distintas de los granos también se usan en la industria, por ejemplo, los tallos y chalas para elaborar papel y laminados y las mazorcas se usan para combustible y para elaborar carbón Otras formas para utilizar las plantas, tal como las que se pueden elaborar con la presente invención, se han conocido desde los albores de la agricultura y son bien conocidas por los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción Los métodos específicos para la utilización de los cultivos se pueden consultar, por ejemplo, en las publicaciones de Sprague y Dudley (1988) y Watson y Ramstad (1987) Todas las composiciones y los métodos descritos y reivindicados en este documento se pueden elaborar y llevar a cabo sin experimentación especial a la luz de la presente invención. En tanto las composiciones y los métodos de esta invención se describieron en términos de las realizaciones preferidas, será evidente para los especialistas en la técnica que se pueden aplicar variaciones a dichas composiciones y métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método aquí descritos sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que se pueden sustituir los agentes descritos en este documento por algunos agentes química y fisiológicamente relacionados con los mismos resultados o resultados similares.
REFERENCIAS Las referencias enumeradas a continuación se incorporan en este documento a modo de referencia al grado que suplementan, explican, proveen antecedentes o describen metodologías, técnicas y/o composiciones empleadas en este documento. Abel et al., Science, 232:738-743, 1986. Araki ef al., "Site-specific recombinase, R, encoded by yeast plasmid pSR1", J. Mol. Biol. 225(1 ):25-37, 1992. Amstrong ef al., Maize Genetics Coop Newsletter, 65:92-93, 1991. Assad, Tucker, Signer, "Epígenetic repeat-induced gene silencing (RIGS) in Arabidopsis," Plant Mol. Biol., 22:1067-85, 1993. Bansal, Viret, Haley, Khan, Schantz, Bogorad, "Transient expression from cab-m1 and rbcS-m3 promoter sequence is different in mesophyll and bundle sheath cells ¡n maize leaves," Proc. Nati Acad. Sci. USA, 89:3654-3658, 1992. Barkai-Golan et al., Arch. Microbio!., 116:119-124, 1978. Barton et al., Plant Physiol., 85:1103-1109, 1987. Bates, "Genetic transformation of plants by protoplast electroporation," Mol Biotechnol., 2(2): 135-145, 1994.
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<210>17 <211>377 <212>ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400>17 agaagaagca cgtacgcggg cggaacgcgt gtcctgcctg gataccgcgc gcgagatgac 60 gtgcggcggc ggcgcgcgac taccgccggc gcggcatggc cctactacgg cggctgctgc 120 tgctgctacg tacgctgccg taaagtctcg gtcgccgtgc tagctctagc tagtcgttat 180 gtgtgttgtg ctttgtatgt gcgcgtgtct tgttgggaca tgcagtgtag tgctgctgta 240 tgcgtgtgtc ctttcttgat cggagtcgga gtggctgatg cacagcatgc tggatgtcaa 300 gtttatgatg aggaataaaa tgcaatgttc agggcgagat actacggttt tccttgacta 360 ccatgggatt tgtagaa 377 <400>18 gcactcggct tgctacataa agtgaatgat gagtcataaa tatttggcaa gaaaccgtga 60 aagctacaca gccgtcgtca gtagcacagg aacacaagaa actgtgctaa tcgaagctat 120 aaataaccct agtatgccta tgcacttctc catcaccact acccatatct tcagtctatt 180 taccttctct atctactcca gagagcacag aagatcgaca cc 222 <210> 19 <211> 412 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400>19 gtaagtatgc aggaggggac aataatcctt gcttgacgcg taaagtgaat ttacaaagcc 60 atatatcaac ctatatctaa ttaataagtt cgttatatat acgcacgatg atcatcaaca 120 accgtacctg tgaaaggcaa caaaatgagc cacgcaaaaa tgcagaatga atccatatga 180 tgacgaacgt acactcggct tgctacataa agtgaatgat gagtcataaa tatttggcaa 240 gaaaccgtga aagctacaca gccgtcgtca gtagcacagg aacacaagaa actgtgctaa 300 tcgaagctat aaataaccct agtatgccta tgcacttctc catcaccact acccatatct 360 tcagtctatt taccttctct atctactcca gagagcacag aagatcgaca cc 412 <210> 20 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 20 catcgagaca agcacggtca acttc 25 <210> 21 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 21 aagtccctgg aggcacaggg cttcaaga 28 <210> 22 <211> 2647 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 22 tatgaattat tatgtattta ttaattttca gtcgatttaa aaaataaaag aaaagtaaat 60 tggagatttt acattgggaa cctagaaaat tttttatttt ttttctctct tccatcgtaa 120 cgattctggg ctgattgggc ctacagagag gagagcgaaa gcgaagtaat atgagatttt 180 acattaggaa ccctagaata ttttttattt tgtttttccc cttctagaaa agttggatgg 240 aggaggccat cggtaaaccg aacacggaca agatcagggg caaaagaaaa tatttggcaa 300 actaaaattt tggctcttta tagataggta tagatttggg ttaagaacag tagtcggaca 360 ttccacgctt tgttaagttc tttttttaca taacaagaat agaatcacgc tctgtaggct 420 cgtcagaccg tacctttcta aggaagtcgc tttgggtagt tcagttggcg agaaaagcct 480 tcctaccttt gcaggtccat cgggccgact acaacccgtg gctcaatccc ggttcttgcg 540 gtgtcttggc aacattcttg ttggaagata ccagaaggtt gctccacggg taatcttgac 600 acgtatgtaa agtgatgagg aacattgaac gaacattggc atgtaagctc tataattggt 660 gttatccata acaacgtcgc agaacatcac aaattgcacg tcaagggatt gggtcagaaa 720 caaatcgtct ccgtgtacaa cgaagtggtg agtcatgagc catgttgatc tgatatatac 780 atagcacaca cgaca caca aacaagtcat actacattac agagttag tcacctt ca 840 agtaaaaaca aagtaggccg gagagaggac aataatcctt gacgtgtaaa gtgaatttac 900 aaagccatat atcaatttat atctaattcg tttcatgtag atatcaacaa cctgtaaaag 960 gcaacaaatt gagccacgca aaattacaag tgagtccaaa taaaccctca catgctacat 1020 aaaagtgaat gatgagtcat gtatatctgg caagaaactg tagaagctac agtcatcggt 1080 agcaaagaaa cacaagaaaa tgtgctaata aaagctataa ataaccctcg tacgcctatg 1140 cacatctcca tcaccaccac tggtcttcat tcagcctatt aacttatatc tatctactcc 1200 agagcagaca agaactcgac accatgaagg tg tgctcgt tgccc cgct ctcctggctc 1260 tcgcgagcgc cgcctccacg cttacaaccg gcggctgcgg ctgccagaca cctcatctac 1320 caccaccgcc ggttcatctg ccgccgccgg tgcatctgcc accgccggtg cacctgccgc 1380 cgccggttca cgtgccaccg ccgccaccac aatgccaccc acaccctact ctaccgcccc 1440 acccacatcc atgcgctaca tacccaccgc atccaagccc gtgccaccca gggcatcccg 1500 gatcctgcgg tgttggcggc ggccccgtca ccccgccgat cctgggccag tgcatcgagt 1560 tcctgaggca tcagtgcagc ccggcggcga cgccctactg ctcgccacag tgccaggcgt 1620 tgcggcagca gtgctgtcag cagctcaggc aggtggagcc gctgcaccgg taccaggcga 1680 tcttcggcgt ggtcctgcag tccatccagc agcagcagcc gcaaggccag tcgtcaccgc 1740 tcccggcgct gatggcggcg caaatagcac agcaactgac ggcgatgtgc ggtctaggag 1800 tggggcagcc aagtccctgc gcttcttgca gcccttttgc cggtggtgtc cactattaaa 1860 gaaactatct atactgtaat aatgttgtat agccgccgga tagctagcta gttagtcatt 1920 cagcggcgat gggtaataat aaagtgtcat ccatccatca ccatgggtgg caacgtgagc 1980 aatgacctga ttgaacaaat tgaaatgaaa agaagaaata tgttatatgt caacgagatt 2040 tcctcataat gccactgaca acgtgtgtcc aagaaatgta tcagtgatac gtatattcac 2100 aattttttta tgacttatac tcacaatttg tttttttact acttatactc gaacaatttg 2160 ttgtgggtac cataacaatt tcgatcgaat atatatcaga aagttgacga aagtaagctc 2220 actcaaaaag ttaaatgggc tgcggaagct gcgtcaggcc caagttttgg ctattctatc 2280 cggtatccac gattttgatg gctgagggac atatgttcgg cttaagctgc agctttgtag 2340 ttagttttgt ttttgattat atttaatact ctatgcatgt gcaccaagat ttttctggtg 2400 aattaaacaa ggcctaataa cgtgagtagc gtatctaact gtgacctata aagtagagca 2460 cctttttaga gtaggggctc ctttttttag aactctattt attgcaccca acttcaataa 2520 gggtcttttc atccaaaatt aagagtcctt acattacatc taatcgtcta ttcattgtct 2580 atattttaat ataaatctta ctgtatatct tgtagcacac tagtatgcct caaagccgac 2640 aataaat 2647 <210> 23 <211> 3704 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sintético <400> 23 gtggcgcctg taccgcgtgt ggggacgatg agcgctccct gaacgctgtc ttgggagagc 60 tgcaagatga gacactccat cccgcgcagc ctgtcgtggc gtcctcctgg atggacacct 120 gcatcgctgt cgccctccac caactcacct gaacgaagaa tagaataaaa aatggaggga 180 gctgaggggg cagtggttgc gctgtaggga ggagagagac cgcgtcatta taagactatc 240 tgcaaccgtt acctctaaat ttttccctct atatcatttt ttccccatat tttcccccct 300 attttttcat ctcccgcaac ggtttctcct aaatactccc cctatatctc actaccacta 360 taaaatatta ttttttatac caactatcaa ttttttatct actaacaatt actcgtggac 420 ccacagcaca gtgtttagga gatgaacagt gacacgctat atctgggggg agagagaaag 480 aggcgcgcgt agggggcgcg cggtaggggc actgctgcgg ctgtagagta ccccctacac 540 gccggcatgc aagggaaggg ggcaa gt g cgcatagcct aaagagcgga tgaagcggct 600 tgcaatttgc acgctggatt cataaatagt gcatattact aaaaaaaggg tggggacgta 660 ggtatagaga gtctattaga gttgatctaa gacccggttt atttcagatt ataatctgtc 720 cggattatat aatccagcgc aaataataca gtaggtaaac aaacaactag attatgggtt 780 cagattatat aatctaaacc ccagattatg ataatctcat aatctcctca agagtagctt 840 attggagatt attttggcaa aagacccact acccatggtt atgtaaatag aaattataat 900 atatatcatc ttttttctca ccttaaataa acaaataagg gtattgttgt ctttatgaat 960 aatctacatt tgtataatct aaactaccaa acaactacat ctagattata atctggatta 1020 tataatttaa attataatct agattatata atttataagc tgaaacaacc cggccctaaa 1080 gcactatcgt atcacctatc tgatagtcac gggtttcgaa cgtccacttg cgtcgcacgg 1140 aattgcatgt ttcttgttgg aagcatattc acgcaatctc cacacataaa ggtttatgta 1200 taaacttaca tttagctcag tttaattaca gtcttatttg gatgcatatg tatggttctc 1260 aatccatata agttagagta aaaaataagt ttaaatttta tcttaattca ctccaacata 1320 tacggattga gtacaatact catgtgcatc caaacaaact acttatattg aggtgaattt 1380 ggatagaaat taaactaact tacacactaa gccaatcttt actatattaa agcaccagtt 1440 tcaacgatcg tcccgcgtca atattattaa aaaactccta catttcttta taatcaaccc 1500 gcactcttat aatctcttct ctactactat aataagagag 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artificial: Cebador sintético <400> 26 cgggctgatc ctggccggca ccgt 24 <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 27 gtgttctcct ggatgtacaa gtac 24 <210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador sintético <400> 28 tccaaggccc gcgacgtcaa gga 23

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para preparar una planta monocotiledónea distinta de Coix que exprese un gen seleccionado que comprende los pasos de: (a) proveer un gen seleccionado; (b) preparar una construcción que contenga dicho gen ligado operativamente a un promotor Coix; (c) transformar una célula receptora de una planta monocotiledónea distinta de Coix con dicha construcción; y (d) regenerar una planta monocotiledónea que exprese dicho gen de dicha célula receptora. 2.- El método de la cláusula 1 , donde planta monocotiledónea es una planta seleccionada del grupo formado por arroz, trigo, avena, cebada, centeno, sorgo y maíz. 3.- El método de la cláusula 2, donde la planta monocotiledónea es maíz. 4.- El método de la cláusula 1 , donde dicho paso de transformación comprende bombardeo con micropartículas, transformación de proplastos mediada por PEG, electroporación, transformación mediada por fibras de carburo de silicio o transformación mediada por Agrobacterium. 5.- El método de la cláusula 4, donde dicho bombardeo con micropartículas comprende el recubrimiento de microproyectiles con ADN que contenga dicha construcción y el contacto de dichas células receptoras con dichos mícroproyectiles. 6.- El método de la cláusula 1 , donde dicho gen seleccionado comprende un gen seleccionado del grupo formado por un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades fúngicas, un gen de resistencia a enfermedades virales, un gen de resistencia a enfermedades bacterianas, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un gen marcador de selección negativa, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al medio ambiente. 7.- El método de la cláusula 1 , donde dicho promotor Coix es un promotor de un gen Coix homólogo de un gen seleccionada del grupo formado por gamma-zeína, oleosina ole16, glotulinal , actinal , actina d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globulina2, b-32, ADPG-pirofosforilasa, Ltp1 , Ltp2, oleosina ole17, oleosina ole18, actina2, proteína específica del polen, pectato Nasa específica de polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen específico de polen, gen especifico del tapete, gen RAB24 específico del tapete, subunidad alfa de la antranilato sintetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato sintetasa, dihidrodipicolinato sintetasa, Thi1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión a cab, H3C4, RUBISCO SS enzima ramificadora del almidón, ACCasa, actina3, actina7, proteína reguladora GF' 14-12, proteína ribosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, superóxído dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm de RCc3 específico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 -fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoacil-ACP sintetasa, fosfosistema II de 33KDa, proteína que libera oxígeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 KDa, proteína tipo metalotioneína gllceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ABA y proteína tipo inductor de la maduración, fenilalanina amoniaco Nasa, adenosintrifosfatasa S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, -tubulina, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteína de shock de calor, chalcona sintetasa, zeína, globulina-1 , ABA, proteína ligadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide glicosil-transferasa, MPI, actina, opaque 2, b70 y olesina. 8.- El método de la cláusula 1 , donde dicho promotor Coix es el promotor de gamma-coixina. 9.- Un método para producir progenie que comprende los pasos de (a) preparar una planta monocotiledónea de acuerdo con el método de la cláusula 1 ; y (b) cruzar dicha planta con una segunda planta o consigo misma. 10.- Un método para criar plantas que comprende los pasos de: (a) obtener una planta progenie de acuerdo con el método de las cláusula 9, y (b) cruzar dicha planta consigo misma o con una segunda planta. 11.- Un método para impedir el silenciamiento de genes de una planta monocotiledónea distinta de Coix que comprende los pasos de: (a) proporcionar un promotor de Coix; (b) preparar una construcción que contenga dicho promotor Coix ligado operativamente a un gen seleccionado; (d) transformar una célula receptora de una planta monocotiledónea distinta de Coix con dicha construcción; y (e) regenerar una planta que exprese dicho gen de dicha célula receptora, con lo cual dicha planta no exhibe silenciamiento de genes. 12.- El método de la cláusula 11 , donde la planta monocotiledónea se selecciona del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y maíz. 13.- El método de la cláusula 12, donde la monocotiledónea es maíz. 14,. El método de la cláusula 11 , donde dicho paso de transformación comprende bombardeo con micropartículas, transformación de protoplastos mediada por PEG, eledroporacíón, transformación mediada por fibras de carburo de silicio o transformación mediada por Agrobacterium. 15.- El método de la cláusula 14, donde dicho bombardeo con micropartículas comprende el recubrimiento de microproyectiles con ADN que contenga dicha construcción y el contacto de dichas células receptoras con dichos microproyectiles. 16.- El método de la cláusula 11 , donde dicho gen seleccionado es un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades fúngicas, un gen de resistencia a enfermedades virales, un gen de resistencia a enfermedades bacterianas, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un gen marcador de selección negativo, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al medio ambiente. 17.- El método de la cláusula 11 , donde dicho promotor Coix es un promotor de un gen Coix homólogo de un gen de una monocotiledónea distinta de Coix seleccionada del grupo formado por gamma-zeína, oleosina ole16, globuNnal , actinal , actina d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globulina2, b-32, ADPG-pirofosforilasa, Ltp1 , Ltp2, oleosína ole17, oleosina ole18, actina2, proteína específica del polen, pectato Nasa específica de polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen específico de polen, gen especifico del tapete, gen RAB24 específico del tapete, subunidad alfa de la antranilato sintetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato sintetasa, dihidrodípicolinato sintetasa, Thi1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión a cab, H3C4, RUBISCO SS enzima ramificadora del almidón, ACCasa, actina3, actina7, proteína reguladora GF' 14-12, proteína ribosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L-homocisteín hídrolasa, superóxido dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm de RCc3 específico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 -fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoacil-ACP sintetasa, fosfosistema II de 33KDa, proteína que libera oxígeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 KDa, proteína tipo metalotioneína gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ABA y proteína tipo inductor de la maduración, fenilalanina amoniaco Nasa, adenosintrifosfatasa S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, a-tubulina, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteína de shock de calor, chalcona sintetasa, zeína, globulina-1 , ABA, proteína ligadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide glicosil-transferasa, MPI, actina, opaque 2, b70 y oleosina. 18.- El método de la cláusula 17, donde el paso de provisión comprende la hibridización de ADN de un gen de una especie de monocotiledónea distinta de Coix o secuencias flanqueadoras del mismo con ADN de Coix. 19.- El método de la cláusula 18, donde dicha especie de monocotiledónea distinta de Coix y dicha planta monocotiledónea distinta de Coix pretenecen a la misma especie. 20.- El método de la cláusula 18, donde dicho ADN de Coix comprende una biblioteca de clones de ADN genómico. 21.- El método de la cláusula 11 , donde el paso de proveer un promotor Coix comprende PCR™. 22.- Un método para producir progenie que comprende los pasos de: (a) preparar una planta de acuerdo con el método de la cláusula 11 ; y (b) cruzar dicha planta con una segunda planta o consigo misma. 23.- Un método para criar plantas que comprende los pasos de: (a) obtener una planta progenie de acuerdo con el método de la cláusula 22, donde dicha planta progenie contiene dicha construcción, y (b) cruzar dicha planta consigo misma o con una segunda planta. 24.- Un método para preparar un vector de expresión en monocotiledóneas que comprende: (a) identificar un primer promotor de una monocotiledónea distinta de Coix que posee el perfil de expresión deseado; (b) aislar un promotor de Coix homólogo de dicho primer promotor; y (c) construir un vector de expresión que contenga dicho promotor Coix ligado operativamente a un gen seleccionado. 25.- El método de la cláusula 24, donde la monocotíledónea se selecciona del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo, avena y maíz. 26.- El método de la cláusula 25, donde la monocotiledónea es maíz. 27.- El método de la cláusula 24, donde dicho gen seleccionado codifica una característica seleccionada del grupo formado por un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades fúngicas, un gen de resistencia a enfermedades virales, un gen de resistencia a enfermedades bacterianas, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un gen marcador de selección negativa, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al medio ambiente 28 - El método de la clausula 24, donde dicho promotor de monocotiledónea proviene de un gen seleccionada del grupo formado por gamma-zeína, oleosina ole16, globulmal , actinal , actina d , sacarosa smtetasa, INOPS, EMB5, globul?na2, b-32, ADPG-pirofosfoplasa, Ltp1 , Ltp2, oleosma ole17, oleosina ole18, act?na2, proteína específica del polen, pectato asa específica de polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen específico de polen, gen especifico del tapete, gen RAB24 específico del tapete, subunidad alfa de la antranilato smtetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato sintetasa, dihidrodipicolinato sintetasa, Th?1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión a cab, H3C4, RUBISCO SS enzima ramificadora del almidón, ACCasa, act?na3, act?na7, proteína reguladora GF' 14-12, proteína pbosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, superóxido dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm de RCc3 específico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 -fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoacil-ACP smtetasa, fosfosistema II de 33KDa, proteina que libera oxigeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 KDa, proteína tipo metalotioneína gl?ceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ABA y proteína tipo inductor de la maduración, fenilalanma amoniaco Nasa, adenosintpfosfatasa S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, a-tubulma, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteína de shock de calor, chalcona smtetasa, zeína, globulina-1 , ABA, proteína ligadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide glicosil-transferasa, MPI, actina, opaque 2, b70 y olesína. 29.- El método de la cláusula 28, donde el paso de identificación comprende la hibridazión de ADN de dicho gen de monocotiledónea, o secuencias flanqueadoras del mismo, con ADN de Coix . 30.- El método de la cláusula 29, donde dicho ADN de Coix comprende una biblioteca de clones de ADN genómico. 31.- El método de la cláusula 28, donde el paso de identificación de un promotor Coix comprende PCR™. 32.- Un promotor aislado de gamma-coixina que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°: 8. 33.- Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 80 a 894 nucleótidos de la SEQ ID N°: 8. 34.- La secuencia asilada de ácidos nucleicos de la cláusula 33, que comprende aproximadamente de 222 a 894 nucleótidos de la SEQ ID N°:8. 35.- La secuencia asilada de ácidos nucleicos de la cláusula 34, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°:18. 36.- La secuencia asilada de ácidos nucleicos de la cláusula 35, que comprende aproximadamente de 412 a 894 nucleótidos contiguos de la secuencias de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°:8. 37.- La secuencias asilada de ácidos nucleicos de la cláusula 36, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°:19. 38.- Un terminador aislado de gamma-coixina que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°11. 39.- Una secuencia de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 80 a 412 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°11. 40.- La secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 39, que comprende aproximadamente de 200 a 412 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°11. 41.- La secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 40, que comprende aproximadamente de 325 a 412 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°11. 42.- La secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 41 , que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°11. 43.- Un terminador de olesina 3 de Coix que se puede aislar de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°:17. 44.- Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende aproximadamente de 50 a 377 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°17. 45.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de la cláusula 44, que comprende aproximadamente de 120 a 377 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°17. 46.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de la cláusula 45, que comprende aproximadamente de 220 a 377 nucleótídos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°17. 47.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de la cláusula 46, que comprende aproximadamente de 300 a 377 nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°17. 48.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de la cláusula 47, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°17. 49.- Una planta transgénica fértil que comprende ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionada contiene un promotor de gamma-coíxina. 50.- La planta de la cláusula 49, donde dicho promotor comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo formado por la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 32, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 33, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 34, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 35, y la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 36. 51.- La planta de la cláusula 50, donde dicho promotor está ligado operativamente a un gen exógeno seleccionado del grupo formado por un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxína, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador de selección, un gen marcador que se pueda rastrear, un marcador de selección negativo, un gen que afecta las características agronómicas de una planta y un gen de resistencia al estrés o al medio ambiente. 52.- Una planta transgénica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado contiene un gen codificador de gamma-coixina ligado operativamente a un promotor que no es nativo para dicho gen de gamma-coíxina. 53.- La planta transgénica fértil de la cláusula 52, donde dicho gen codificador de gamma-coixína codifica el polipéptído codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID N°:16. 54.- Una planta transgénica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado comprende un terminador de gamma-coixina. 55.- La planta transgénica fértil de la cláusula 54, donde dicho terminador de gamma-coixina contiene una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del yi?po formado por la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 39, ia secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 40, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 41 y la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 42. 56.- Una planta transgénica fértil que comprende un ADN seleccionado, donde dicho ADN seleccionado contiene un terminador de oleslna 3 de Coix. 57.- La planta transgénica fértil de la cláusula 56, donde dicho terminador de oleosina 3 de Coix comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo formado por la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 44, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 45, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 46, la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 47 y la secuencia de ácidos nucleicos de la cláusula 48. 58.- Una planta progenie de cualquier generación de la planta de la cláusula 49, 52, 54 ó 56, donde dicha planta progenie comprende dicho ADN seleccionado. 59.- La planta transgénica fértil de la cláusula 49, 52, 54 ó 56, donde dicha planta es una planta monocotiledónea seleccionada del grupo formado por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz. 60.- La planta transgénica fértil de la cláusula 59, donde la monocotiledónea es maíz. 61.- La planta tiansgénica fértil de la cláusula 49, 52, 54 ó 56, donde dicha planta es una planta dicotiledónea seleccionada del grupo formado por tabaco, tomate, papa, soja y algodón. 62.- Un método para criar plantas que comprende cruzar la planta transgénica fértil de la cláusula 49, 52, 54 ó 56, o la progenie transgénica de la misma, consigo misma o con una segunda planta. 63.- Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que codifica un gen de Coix seleccionado del grupo formado por oleosina ole16, globulinal , actinal , actina d , sacarosa sintetasa, INOPS, EMB5, globulina2, b-32, ADPG-pirofosforilasa, Ltp1 , Ltp2, oleosina ole17, oleosina ole18, actina2, proteína específica del polen, pedato Nasa específica de polen, proteína específica de anteras, gen RTS2 específico de anteras, gen específico de polen, gen especifico del tapete, gen RAB24 específico del tapete, subunídad alfa de la antranilato sintetasa, alfa-zeína, subunidad beta de la antranilato sintetasa, dihidrodipicolinato sintetasa, Thi1 , alcohol deshidrogenasa, proteína de unión a cab, H3C4, RUBISCO SS enzima ramificadora del almidón, ACCasa, actina3, adina7, proteína reguladora GF' 14-12, proteína ribosómica L9, enzima biosintética de celulosa, S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, superóxido dismutasa, receptor de la C-quinasa, fosfoglicerato mutasa, ARNm de RCc3 específico de raíz, glucosa-6 fosfato isomerasa, pirofosfato-fructosa 6-fosfato-1 -fosfotransferasa, ubiquitina, beta-cetoacil-ACP sintetasa, fosfosistema II de 33KDa, proteína que libera oxígeno, subunidad ATPasa vacuolar de 69 KDa, proteína tipo metalotioneína gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, ABA y proteína tipo ¡¡.ductor de la maduración, fenilalanina amoniaco Nasa, adenosintrifosfatasa S-adenosil-L-homocisteín hidrolasa, a-tubulina, cab, PEPCasa, R, lectina, complejo cosechador de luz, proteína de shock de calor, chalcona sintetasa, zeína, globulina-1 , ABA, proteína ligadora de auxina, gen de la UDP-glucosa flavonoide glicosil-transferasa, MPI, olesina, actina, opaque 2 y b70.
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