JP2017205104A - 植物のゲノム編集方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】植物のゲノム編集方法であって、直径0.3μm以上1.5μm以下の微粒子を、少なくとも1種の核酸および/または少なくとも1種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
【選択図】図4
Description
(1)植物のゲノム編集方法であって、微粒子を、少なくとも1種の核酸および/または少なくとも1種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
(2)前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、L2細胞に打ち込む工程を特徴とする、(1)の方法。
(3)前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に打ち込む工程を特徴とする、(1)の方法。
(4)前記微粒子が、直径0.3μm以上1.5μm以下であることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)さらに、前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(7)前記完熟種子が、その根長が1mm以下の完熟種子であることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8)前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか1であることを特徴とする、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)前記核酸が、修飾酵素をコードする核酸を含むことを特徴とする、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)前記修飾酵素が、ヌクレアーゼまたはデアミナーゼであることを特徴とする、(9)に記載の方法。
(11)前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも1つのガイドRNAを発現し得る核酸およびCasヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)前記タンパク質がヌクレアーゼである、(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)前記タンパク質がCasヌクレアーゼである(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)(1)〜(13)のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
(15)植物のゲノム編集方法であって、直径0.3μm以上1.5μm以下の微粒子を、少なくとも1種の核酸および/または少なくとも1種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
(16)さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、(15)の方法。
(17)前記完熟種子が、その根長が1mm以下の完熟種子であることを特徴とする、(15)または(16)に記載の方法。
(18)前記植物が、コムギ、イネ、トウモロコシ、および大豆からなる群から選ばれるいずれか1であることを特徴とする、(15)〜(17)のいずれかに記載の方法。
(19)前記核酸が、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むことを特徴とする、(15)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(20)前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも1つのガイドRNAを発現し得る核酸およびCasヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、(15)〜(19)のいずれかに記載の方法。
(21)前記タンパク質がヌクレアーゼである、(15)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(22)前記タンパク質がCasヌクレアーゼである(15)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(23)(15)〜(22)のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
(24)インプランタ法により、茎頂分裂組織中の生殖細胞系列またはそれに移行し得る幹細胞のゲノム編集を行う方法。
(25)(1)〜(13)のいずれかの方法を含むことを特徴とする、(24)の方法。
(26)(24)または(25)のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
(27)(26)の製造方法により製造された、ゲノム編集された植物体(出願時に公知のものを除く)。
本発明に係るインプランタゲノム編集方法においては、植物の完熟種子を吸水させる工程、次に種子における胚の茎頂を露出させる工程、次に茎頂の細胞をゲノム編集する工程、を含む。
本発明に係るインプランタゲノム編集方法は、広く一般に種子を生じる植物、地下茎を生じる植物および茎頂培養可能な植物に適用することができる。従って、本発明に係るインプランタゲノム編集方法の対象植物は、被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。インプランタゲノム編集法とは、一般には組織培養の操作を含まないゲノム編集法であり,植物が成長する状態のまま成長点部位の細胞をゲノム編集させる方法である。ただし、本明細書においては、インプランタゲノム編集法は、茎頂培養を経て植物体を得る組織培養操作のみは含み、その他の組織培養の操作は含まれないという意味で使用する。インプランタ法も同様の意味である。
次いで、上記で吸水させた種子における胚の茎頂を露出させる。コムギ、オオムギ、イネ又はトウモロコシの場合には、鞘葉及び葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。ダイズの場合には、種皮及び子葉を除去することで、茎頂を露出させる。ジャガイモの場合には、種芋から芽出しを行い、切り出した幼芽より葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。リンゴの場合には、種子胚または摘出した頂芽もしくは側芽から葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。露出手段としては、実体顕微鏡下において、鞘葉及び葉原基または種皮及び子葉を除去することができるものであればいずれのものであってよいが、例えば、直径0.2mm程度の針などの穿設するための器具、ピンセット、ピペット、注射器、並びにメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。次いで、メスなどの切断器具を用いて胚乳及び余分な胚盤部分を切除し、露出した茎頂を含む胚及び胚盤を寒天培地上に、茎頂を上向きに置床する。ウイルスフリーの茎頂を得るために、茎頂を切り出す最終段階でメスを新規な滅菌メスに取り替えてもよい。この場合はウイルスフリーの植物体を得ることができる。
部位特異的ヌクレアーゼなどの目的遺伝子の導入には、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されない。一般的には、目的遺伝子を含む組換えベクターを作製して、完熟胚の茎頂を標的に、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、PEG−リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などにより、核酸(組換えベクターなど)やタンパク質などを導入することができるが、コムギ、イネ、トウモロコシ又はダイズでは、植物体への導入効率から、パーティクルガン法を用いて完熟種子胚に導入する方法が好ましい。また、パーティクルガン法はジャガイモの茎頂に遺伝子を導入するのにも有効である。パーティクルガン法は、金属微粒子に核酸および/またはタンパク質をコーティングして細胞組織に打ち込む方法であり、単子葉植物のようにアグロバクテリウムの感染効率が低い場合に有効である。
適切な金粒子径を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無又はその当代(T0世代)における導入遺伝子の有無を調査した。
(1)コムギ完熟種子の調製
コムギ(Triticum aestivum cv. Fielder)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%、花王株式会社)に浸漬し、室温で20分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、休眠打破のため4℃にて2日間インキュベートした。その後、22℃で約12時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
実体顕微鏡下において、上記発芽種子の胚部分の鞘葉及び第1葉原基から第3葉原基を針(直径0.20mm)の先端を用いて除去した。その後、滅菌済みナイフ(または滅菌済みメス)を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを30個/プレートとなるようにMS−maltose培地(4.3g/L MS salt,MS vitamin,30g/L マルトース,0.98g/L MES,3%PPM(plant preservative mixture,ナカライテスク),7.0g/L phytagel(登録商標、シグマアルドリッチ),pH5.8)に置床した。
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、蛍光レポーター遺伝子GFP(S65T)を含むプラスミドDNA(pUC系プラスミド)を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素(NOS)遺伝子のターミネーターが付加されている。
0.3μmから1.6μmの各金粒子30mgをはかり取り、70%エタノール500μLを加え、ボルテックスにてよく懸濁した。その後、遠心により金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、50%グリセロール500μLを加え滅菌金粒溶液とした。
実体蛍光顕微鏡 (Leica社製MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50)を観察することで(図1)、茎頂におけるGFP遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において5スポット以上のGFP蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率(遺伝子導入個体/処理完熟胚数×100)を算出した。その結果、金粒子径1.6μm及び1.0μmに比べ、金粒子径0.8μm、0.6μm、及び0.3μmの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった(表1)。特に、0.6μmを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が72.7%と最も高かった(表1)。また、後述するように、遺伝子導入効率についても、金粒子1.0μmよりも0.6μmの方が高かった。
(1)コムギ完熟種子の調製
実施例1−1―(1)に記載の方法に準拠して行った。
(2)完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例1−1―(2)に記載の方法に準拠して行った。
(3)遺伝子導入
0.6μm、1.0μmの2種の金粒子径を用い、実施例1−1―(3)に記載の方法に準拠して行った。
一晩静置した形質転換処理個体をMS−maltose培地を入れたディスポ-ザブル植物細胞培養容器(Sigma)に移植し、長日(22℃、16時間日長)で育成した。3−4週間生育させた後、第2−3葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室(24℃、16時間日長、湿度50−70%)にて第4−6葉が出るまで育成した。
得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるGFP遺伝子の有無をPCR法により調査した。第4−6葉(50mg)から塩化ベンジル法を用いてゲノミックDNAを抽出し、これを鋳型として、GFP遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてPCR反応を行った。
プライマーの配列:ACGGCCACAAGTTCAGCGT(配列番号1)
プライマーの配列:ACCATGTGATCGCGCTTCT(配列番号2)
適切なガス圧を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無とその当代(T0世代)における導入遺伝子の有無を調査した。
1.GFP蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
(1)コムギ完熟種子の調製
実施例1−1―(1)に記載の方法に準拠した。
(2)完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例1−1―(2)に記載の方法に準拠した。
(3)遺伝子導入
金粒子径を0.6μm、ガス圧を1,100psiまたは1,350psiとし、実施例1−1―(3)に記載の方法に準拠した。
実施例1−1―(4)に記載の方法に準拠した。その結果、実施例1−1―(4)に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧1,350psiの場合では74.2%となり、ガス圧1,100psiの場合の13.3%に比べ高かった(表3)。また、後述するように、T0世代の遺伝子導入効率についても、ガス圧1,100psiよりもガス圧1,350psiの方が高かった。
(1)形質転換処理個体の生育
実施例1−2―(4)に記載の方法に準拠した。
(2)T0植物葉における導入遺伝子の有無
実施例1−2―(5)に記載の方法に準拠した。その結果、実施例1−2―(5)に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧1,350psiの場合では4.2%となり、ガス圧1,100psiの場合の0.8%に比べ高かった(表3)。このことから、ガス圧1,100psiと比較し、実施例2−1−(4)においてGFPタンパク質の一過的な発現効率が高かったガス圧1,350psiを用いることで、遺伝子導入効率が向上することがわかった。
[実施例3]遺伝子導入に最適な吸水時間の検討
適切な吸水時間を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無とその当代(T0世代)及び次世代(T1世代)における導入遺伝子の有無を調査した。
(1)コムギ完熟種子の調製
コムギ(Triticum aestivum cv. Fielder)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%)に浸漬し、室温で20分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、4℃にて2日間インキュベートした。その後、22℃で6〜12時間、12〜18時間の各時間インキュベートし、以下の実験に用いた。種子根長は、根鞘を切り開いた後に幼根の長さを測定することで調査した。
(2)完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例1−1―(2)に記載の方法に準拠して行った。
(3)遺伝子導入
0.6μmの金粒子径を用い、実施例1−1―(3)に記載の方法に準拠して行った。
(1)形質転換処理個体の生育
実施例3−1−(3)において茎頂における一過的なGFP蛍光が観察された個体について、実施例1−(2)―4に記載の方法により育成した。
実施例1−2−(5)に記載の方法に準拠して行った。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体(T0世代)から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率(遺伝子導入個体数/処理完熟胚数×100)を算出した。その結果、6〜12時間、12〜18時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率は、それぞれ3.1%、1.3%となり(表3)、吸水6〜12時間後の完熟胚で特に高かった(表4)。
上記(2)で導入遺伝子が確認された個体を育成し、T1種子を取得した。各T1種子を10〜20粒程度播種・育成し、第1葉(50mg)をサンプリングした。ゲノミックPCR及び電気泳動は実施例1−(2)―5に準拠して行った。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体(T1世代)から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率(遺伝子導入個体数/処理完熟胚数×100)を算出した。その結果、6〜12時間、12〜18時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率はそれぞれ3.1%(図2系統1及び2、表3)、0.7%(図2系統3〜5、表3)となり、吸水6〜12時間後の完熟胚で特に高かった。これらの結果から、遺伝子導入には完熟種子の吸水初期(6時間後から18時間程度であり、種子根長1.0mm以下)が適切であり、特に吸水6〜12時間後が好ましいと判断した。
なお、表4に示した導入遺伝子確認個体(T1世代)5系統については、GFP遺伝子領域をプローブとしたサザンブロット解析によっても、GFP遺伝子がゲノミックDNAへ挿入されているのを確認した(図3)。
当該遺伝子導入法により作製された形質転換コムギにおける導入遺伝子(GFP遺伝子)発現の有無を調査した。
実施例3−2−(3)で取得したT1種子を滅菌シャーレに置き、LAS3000(FujiFilm)下で、T1種子のGFP蛍光(フィルター510DF10)を観察した結果、種子においてGFP蛍光が観察された(図4A)。次に、GFP蛍光が観察された種子を半切し、実体蛍光顕微鏡(Leica社製MZFLIII)下で、胚乳のGFP蛍光観察(励起:470/40、 吸収:525/50)を行った。その結果、胚乳(E)においてGFP蛍光が観察された他、アリューロン層(Al)においてGFP蛍光が強く観察された(図4B)。
実施例3−2−(3)で育成させたT1世代植物の幼葉をサンプリングし、実体蛍光顕微鏡(Leica社製MZFLIII)下で、葉におけるGFP蛍光(励起:470/40、 吸収:525/50)を観察した。その結果、図4Cに示すように、ゲノミックPCR陽性個体(形質転換体)では葉の気孔細胞においてGFP蛍光が観察された。
オオムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
本法において作製された遺伝子導入個体(T0世代)は、同一個体内において異なった遺伝情報を持つ細胞が混在したキメラになる。そこで、ある1系統の遺伝子導入個体(T0世代)から得られた複数のT1種子が、それぞれ異なる遺伝情報を有するか否かを調査するため、サザンブロット解析を行った。
コムギと同様の手法によりトウモロコシの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無を調査した。
(1)トウモロコシ完熟種子の調製
トウモロコシ(スノーデント王夏)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%)に浸漬し、室温で20分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、30℃で約36時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ(または滅菌済みメス)を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針(直径0.20mm)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを10個/プレートとなるようにMS−maltose培地(4.3g/L MS salt ,MS vitamin,30g/L マルトース,0.98g/L MES ,3%PPM(plant preservative mixture,登録商標、ナカライテスク),7.0g/L phytagel,pH5.8)に置床した。一処理区につき上記プレートを2枚用意した。
実施例1−1−(3)に記載の方法に従った。
実体蛍光顕微鏡(Leica社製MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50) 吸収:525/50)を観察することで(図6)、茎頂におけるGFP遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において5スポット以上のGFP蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率(遺伝子導入個体/処理完熟胚数×100)を算出した。その結果、金粒子径1.6μm及び1.0μmに比べ、金粒子径0.8μm、0.6μm、及び0.3μmの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった(表6)。特に、0.6μmを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が85%と最も高かった(表6)。
コムギと同様の手法によりダイズの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無及びその後の形質転換体取得効率を調査した。
(1)ダイズ完熟種子の調製
ダイズ(ユキホマレ)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%)に浸漬し、室温で3分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、23℃で約40時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ(または滅菌済みメス)を用いて、子葉を全てカットし、胚軸のみにした。その後、上記胚軸の初生葉と基部を針(直径0.20mm)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを約15個/プレートとなるようにBM培地(4.3g/L MS salt 、MS vitamin、3% スクロース、0.50g/L MES 、3%PPM(plant preservative mixture、ナカライテスク)、6.0g/L phytagel、pH5.7)に置床した。
プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターを用い、実施例1−1−(3)に記載の方法に従った。
実体蛍光顕微鏡(Leica社製MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50)を観察することで(図7)、茎頂におけるGFP遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において5スポット以上のGFP蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率(遺伝子導入個体/処理完熟胚数×100)を算出した。その結果、金粒子径1.6μmおよび1.0μmに比べ、金粒子径0.6μmの場合では茎頂における遺伝子導入効率が85.0%と高かった(表7)。
(1)形質転換処理個体の生育
一晩静置した形質転換処理個体をRM培地(4.3g/L MS salt 、MS vitamin、3% スクロース、0.50g/L MES 、3%PPM(plant preservative mixture、ナカライテスク)、0.3% ゲルライト、pH5.7)を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器(Sigma)に移植し、インキュベーター(23℃、16時間日長)で育成した。根の生育及び茎頂からの葉の分化が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたセルトレイへ移植した。その後、同インキュベーターにて第2葉目まで育成した。
得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるGFP遺伝子の有無をPCR法により調査した。第2葉(50mg)から塩化ベンジル法を用いてゲノミックDNAを抽出し、これを鋳型として、GFP遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてPCR反応を行った。
プライマーの配列:ACGGCCACAAGTTCAGCGT(配列番号1)
プライマーの配列:ACCATGTGATCGCGCTTCT(配列番号2)
コムギと同様の手法によりオオムギの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無を調査した。
(1)オオムギ完熟種子の調製
オオムギ(ワセドリ二条)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%)に浸漬し、室温で20分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、4℃にて2日間インキュベートした後、22℃で6〜12時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針(直径0.20mm)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを30個/プレートとなるようにMS−maltose培地(4.3g/L MS salt 、MS vitamin、30g/L マルトース、0.98g/L MES 、3%PPM(plant preservative mixture、登録商標、ナカライテスク),7.0g/L phytagel,pH5.8)に置床した。
実施例1−1−(3)に記載の方法に従った。
実施例1−1−(4)に記載の方法に従った。その結果、金粒子径1.6μm及び1.0μmに比べ、金粒子径0.8μm、0.6μm、及び0.3μmの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった(表9)。特に、0.3μmを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が80%と最も高かった(図8、表8)。
コムギと同様の手法によりジャガイモの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるGFP蛍光の有無を調査した。
種芋(男爵)をハイター(次亜塩素酸濃度1%)で消毒し、水洗い、乾燥後、22℃で1−2週間蛍光灯下でインキュベートし、芽出しを行った。
実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、萌芽より葉原基を針(直径0.20mm)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを40個/プレートとなるようにMS培地(4.3g/L MS salt 、MS vitamin、30g/L ショ糖、0.98g/L MES 、3%PPM(plant preservative mixture、登録商標、ナカライテスク)、7.0g/L phytagel、pH5.8)に置床した。
導入ベクターをpUC18−35S−GFPとし、実施例1−1−(3)に記載の方法に従った。
実施例1−1−(4)に記載の方法に従った。その結果、金粒子径0.6μmを用いることで、茎頂におけるGFP蛍光を観察することができた。(図9)。
イネについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
1.イネ完熟種子の調製
脱穀したイネ(品種:日本晴)の完熟種子を実施例1−1−(1)に記載の方法で殺菌、洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、25℃で24時間〜48時間インキュベートしたものを以下の実験に用いる。
2.完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例1−1−(2)に記載の方法に従い、完熟種子胚中の茎頂を完全露出させる。茎頂を露出させた完熟胚を約30個/プレートとなるようにMS−maltose培地に置床する。
イネ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、実施例1−1−(3)に記載の方法に従って行う。
4.GFPタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例1−1−(4)に記載の方法に従い、金粒子径0.6μmを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてGFP蛍光が観察されたものを選抜する。
5.形質転換処理個体の生育
実施例1−2−(4)に記載の方法に従い、形質転換処理個体を生育する。
6.T0植物葉における導入遺伝子の確認
実施例1−2−(5)に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
リンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
1.リンゴ茎頂の調製
リンゴ(品種:ジョナゴールド)の茎頂の調製は、植物組織培養, 9(2), 69-73 (1992)に記載の茎頂培養の誘導条件に沿って実施する。
1.の手法にて調製した茎頂を、約30個/プレートとなるようにMS−maltose培地(4.3g/L MS salt 、MS vitamin、30g/L マルトース、0.98g/L MES 、3%PPM(plant preservative mixture、登録商標、ナカライテスク)、7.0g/L phytagel、pH5.8)に置床する。
プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターを用い、実施例1−1−(3)に記載の方法に従う。
4.GFPタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例1−1−(4)に記載の方法に従い、金粒子径0.6μmを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてGFP蛍光が観察されたものを選抜する。
5.形質転換処理個体の生育
6.T0植物葉における導入遺伝子の確認
実施例1−2−(5)に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
当該遺伝子導入法を利用してコムギのゲノム編集が可能か否かを検証するため、RNA誘発性CRISPR/Cas9による標的配列の変異導入を試みた。なお、実施例1−1−(4)より当該遺伝子導入法を用いて安定な形質転換体を作製する上では、金粒子径0.3μm以上0.9μm以下が良いが、ゲノム編集個体を作製する上では、植物細胞核内又はオルガネラ内で一過的にヌクレアーゼ等が発現すれば良いため、上記粒子径に限定されない。そこで、当該遺伝子導入法を用いてコムギのゲノム編集が可能な金粒子径の範囲を検討した。
(1)コムギ完熟種子の調製
コムギ(Triticum aestivum cv. Fielder)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度6%)に浸漬し、室温で20分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、休眠打破のため4℃にて2日間インキュベートした。その後、22℃で約12時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
実施例1−1−(2)に記載の方法に準拠して行った。
(3)遺伝子導入
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実体蛍光顕微鏡(Leica、MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50)を観察することで、TaMLO遺伝子標的配列の切断の有無を調査した。遺伝子導入処理した完熟胚中、茎頂組織において1スポット以上のGFP蛍光が観察されたものを標的配列切断個体として、標的配列切断導入効率(標的配列切断個体/処理完熟胚数×100)を算出した。実験は2度行い、標的配列切断導入効率の平均値を表11に示した。その結果、標的プラスミドDNA及びgRNA/Cas9一体型プラスミドを共導入した場合、金粒子径0.3μmから1.0μmでは標的配列切断を示すGFP蛍光が観察されたが、金粒子径1.6μmでは観察されなかった(表9)。また、その効率は金粒子径0.6μmを用いた場合、23.5%と最も高かった(表9,図10)。これらの結果から、当該遺伝子導入法を用いてゲノム編集個体を作製するためには、金粒子径が1.6μm未満が良く、金粒子径0.6μmが好ましいことがわかった。
当該遺伝子導入法を利用してコムギに内在する標的遺伝子のゲノム編集が可能か否かを検証するため、RNA誘発性CRISPR/Cas9によるTaQsd1遺伝子(alanine aminotransferase遺伝子)、TaLOX2遺伝子(lipoxygenase遺伝子)、及びTaGASR7遺伝子(Snakin/GASA遺伝子)の変異導入を試みた。なお、TaQsd1遺伝子の変異導入には実用品種「春よ恋」を、その他には「Bobwhite」を用いた。
(1)コムギ完熟種子の調製
コムギ(Triticum aestivum cv. Bobwhite、Triticum aestivum cv. Haruyokoi)の完熟種子を用い、実施例1−1−(1)の方法に従った。
実施例1−1−(2)に記載の方法に準拠して行った。
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、gRNA発現用プラスミドとして、pTAKN−2ベクターのマルチクローニングサイトへコムギU6プロモーター及びgRNA scaffoldをクローニングした。その後、内部のBbsIサイトへ各標的遺伝子の標的配列を導入し、各gRNA発現用プラスミドとした。
TaQsd1標的配列:ACGGATCCACCTCCCTGCAGCGG (配列番号4)
TaLOX2標的配列:GTGCCGCGCGACGAGCTCTTCGG(配列番号5)
TaGASR7標的配列:CCGCCGGGCACCTACGGCAAC(配列番号6)
実体蛍光顕微鏡(Leica、MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50)が見られた個体をMS−maltose培地を入れたディスポ-ザブル植物細胞培養容器(Sigma)に移植し、長日(22℃、16時間日長)で育成した。約1週間後に各個体中の茎頂を切り出し、2μLのDNAzol Direct(登録商標、コスモバイオ)が添加された8連PCRチューブへ入れ、ゲノミックDNAを抽出した。
TaQsd1−F:CAGCCTGGAGGGAATGACC (配列番号7)
TaQsd1−R:ACCTGGTGGAATCCAGAGC (配列番号8)
TaLOX2−F:CGTCTACCGCTACGACGTCTACAACG(配列番号9)
TaLOX2−R:GGTCGCCGTACTTGCTCGGATCAAGT(配列番号10)
TaGASR7−F:CCTTCATCCTTCAGCCATGCAT(配列番号11)
TaGASR7−R:CCACTAAATGCCTATCACATACG(配列番号12)
(1)コムギ完熟種子の調製
実施例13−1−(1)に記載の方法に従った。
(2)完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例13−1−(2)に記載の方法に準拠して行った。
(3)遺伝子導入
実施例13−1−(3)に記載の方法に従った。
一晩静置した遺伝子導入個体をMS−maltose培地を入れたディスポ-ザブル植物細胞培養容器(Sigma)に移植し、長日(22℃、16時間日長)で育成した。2週間生育させた後、第2−3葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室(24℃、16時間日長、湿度50−70%)にて育成した。
得られた植物体において、標的遺伝子に変異が導入されているかを調査した。第5葉又は止葉(50mg)から塩化ベンジル法を用いてゲノミックDNAを抽出し、これを鋳型として、各遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてPCR反応を行った。
上記(5)で変異が確認されたTaQsd1変異導入個体からT1種子を回収し、T1世代植物の幼葉(50mg)から塩化ベンジル法を用いてゲノミックDNAを抽出した。その後の標的遺伝子変異導入の確認は、上記(5)に記載の方法に従った。その結果、T1世代2系統について、T1世代幼葉における標的遺伝子変異導入を確認した。図13に、T1世代1系統における解析結果を示した。16個体中9個体について標的遺伝子に変異が導入されていることを確認した。当該遺伝子導入法を用いることで、茎頂中の生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞をゲノム編集することが可能だとわかった。
当該遺伝子導入法を利用したgRNA/Cas9タンパク質導入によって、コムギに内在する標的遺伝子のゲノム編集が可能か否かを検証した。検証するにあたり、TaLOX2遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をコムギ茎頂へ導入した。
(1)コムギ完熟種子の調製
コムギ(Triticum aestivum cv.Bobwhite)の完熟種子を用い、実施例1−1−(1)の方法に従った。
実施例1−1−(2)に記載の方法に準拠して行った。
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いた。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いた。
GUGCCGCGCGACGAGCUCUUguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号13)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
解析は実施例13−1−(4)に記載の方法に従った。
親水性フィルムを未使用時には、茎頂におけるGFP蛍光が観察されなかったのに対し、使用時にはGFP蛍光が観察された(表11)。さらに、1撃ち込み当たりの金粒子量を187.5μgから375μg増やすことで、GFP蛍光の発現効率が23.3%から66.7%に向上した(表11)。親水性フィルムを使用することで、水系溶媒に分散させた金粒子が効率的に茎頂に導入されることがわかった。GFP蛍光が観察された個体について実施例13−1−(4)に従ってPCR/制限酵素解析を行った結果、野生型株ではPCR産物が制限酵素により完全に切断されるのに対し、変異が導入された個体ではPCR産物に切れ残りが生じた。切れ残ったバンドからDNAを抽出・精製し、シークエンス解析にかけた結果、標的遺伝子配列に変異が導入されていることが確認された(図14)。その結果、TaLOX2標的遺伝子について、gRNA/Cas9タンパク質導入後1週間目の茎頂中の細胞群における変異導入が確認された。
ダイズについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。
ダイズ(フクユタカ、エンレイ)の完熟種子を用い、実施例7−1−(1)に記載の方法に従い調製する。
実施例7−1−(2)に記載の方法に従う。
完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNA発現用プラスミドとして、pTAKN−2ベクターのマルチクローニングサイトへダイズU6プロモーター及びgRNA scaffoldをクローニングする。その後、内部のBbsIサイトへ標的遺伝子の標的配列を導入し、各gRNA発現用プラスミドとする。
Glyma.10G244400.1標的配列:CCTCCGCCCAAGGCTCCGCCACC (配列番号15)
Glyma.20G150000.1標的配列:CCTCCGCCCAAGGCTCCGCCACC(配列番号15)
実体蛍光顕微鏡(Leica、MZFLIII)下で茎頂におけるGFP蛍光(励起:470/40 吸収:525/50)が見られた個体をRM培地(4.3g/L MS salt ,MS vitamin,3% スクロース,0.50g/L MES ,3%PPM(plant preservative mixture,ナカライテスク),0.3% ゲルライト,pH5.7)を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器(Sigma)に移植し、インキュベーター(23℃、16時間日長)で育成する。
実施例7−2−(1)に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
得られた植物体において、標的遺伝子に変異が導入されているかを調査する。新たに生育した葉(50mg)から塩化ベンジル法を用いてゲノミックDNAを抽出し、これを鋳型として、各遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてPCR反応を行う。PCR/制限酵素解析は実施例13−1−(4)に記載の方法に従って行う。変異が導入された個体をそのまま育成し、次世代の種子を取得することで、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
ダイズについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばGlyma.10G244400.1遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体を茎頂へ導入する。
1.ダイズ完熟種子の調製
実施例15−1に記載の方法に従って行う。
2.完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例15−2に記載の方法に従って行う。
ダイズ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
GGUGGCGGAGCCUUGGGCGGguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号16)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。
実施例15−4の記載の方法に従う。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例15−5に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
イネについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばOsPDS(イネphytoene desaturase)遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をイネ茎頂へ導入する。
実施例10−1に記載の方法に従って行う。
2.完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例10−2に記載の方法に従って行う。
イネ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
GUUGGUCUUUGCUCCUGCAGguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号17)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。
実施例10−4の記載の方法に従う。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例10−5に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
リンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばリンゴPDS(phytoene desaturase)遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をリンゴ茎頂へ導入する。
実施例11−1に記載の方法に従う。
2.茎頂の露出
実施例11−2に記載の方法に従う。
3.gRNA/Cas9タンパク質導入
リンゴの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
ACCUGAUCGAGUAACUACAGguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号18)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。但し、実施例7−1−(3)に記載のGFPベクターを用いる。
実施例11−4の記載の方法に従う。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例11−5に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
ジャガイモについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばStIAA2(an Auxin/Indole−3−Acetic Acid family member)遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をジャガイモ茎頂へ導入する。
実施例9−1に記載の方法に従う。
2.茎頂の露出
実施例9−2に記載の方法に従う。
ジャガイモの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
GAUGUUUAGCUCCUUUACUAguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号19)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。但し、実施例7−1−(3)に記載のGFPベクターを用いる。
実施例9―(4)の記載の方法に従う。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例1−2−(4)に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
トウモロコシについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばZmALS2(トウモロコシacetolactate synthase)遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をトウモロコシ茎頂へ導入する。
実施例6−1−(1)に記載の方法に従う。
2.茎頂の露出
実施例6−1−(2)に記載の方法に従う。
トウモロコシの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
GCUGCUCGAUUCCGUCCCCAguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号20)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。
実施例1−1−(4)に記載の方法に従い、金粒子径0.6μmを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてGFP蛍光が観察されたものを選抜する。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例1−2−(4)に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
オオムギについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばHvPM19(オオムギABA−inducible plasma membrane protein)遺伝子を標的としたgRNA及びCas9タンパク質の複合体をオオムギ茎頂へ導入する。
実施例8−1−(1)に記載の方法に従う。
2.茎頂の露出
実施例8−1−(2)に記載の方法に従う。
オオムギの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、gRNAとしてcrRNA及びtracrRNA(ファスマック)の混合物(0.5μg/μL)を用いる。Cas9タンパク質として、Streptococcus pyogenes 由来EnGen Cas9 NLS(NEB)を用いる。
crRNA:
GCUCUCCACUCUGGGCUCUUguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号21)
tracrRNA:
AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU(配列番号14)
撃ち込み条件は、実施例14−1−(3)に記載の方法に従う。
実施例1−1−(4)に記載の方法に従い、金粒子径0.6μmを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてGFP蛍光が観察されたものを選抜する。
5.遺伝子導入個体の生育
実施例1−2−(4)に記載の方法に従う。
6.T0植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例15−6に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
E 胚乳
Claims (17)
- 植物のゲノム編集方法であって、微粒子を、少なくとも1種の核酸および/または少なくとも1種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
- 前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、L2細胞に打ち込む工程を特徴とする、請求項1の方法。
- 前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に打ち込む工程を特徴とする、請求項1の方法。
- 前記微粒子が、直径0.3μm以上1.5μm以下であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- さらに、前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記完熟種子が、その根長が1mm以下の完熟種子であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか1であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸が、修飾酵素をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾酵素が、ヌクレアーゼまたはデアミナーゼであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも1つのガイドRNAを発現し得る核酸およびCasヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記タンパク質がヌクレアーゼである、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記タンパク質がCasヌクレアーゼである請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
- インプランタ法により、茎頂分裂組織中の生殖細胞系列またはそれに移行し得る幹細胞のゲノム編集を行う方法。
- 請求項1〜13のいずれかの方法を含むことを特徴とする、請求項15の方法。
- 請求項15または16のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
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