JP2023056018A - 植物のゲノム編集方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない植物のゲノム編集方法を提供する。【解決手段】植物のゲノム編集方法であって、直径０．３μｍ以上１．５μｍ以下の微粒子を、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。【選択図】図４

Description

本発明は、パーティクルガン法を用いた植物のインプランタゲノム編集方法に関する。
現在普及している植物の一般的な形質転換法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片に外来遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介して又はパーティクルガン法などにより直接的に導入する方法である。しかしこれらの方法を用いた場合、ヌクレアーゼを細胞または組織に導入してゲノム編集がなされたとしても、植物品種によっては組織培養が困難で、植物体を再生してゲノム編集された植物個体を得ることが難しいという問題があった。また、遺伝子やタンパク質の導入効率が十分に高くなく、遺伝子導入個体を得るためには、選択マーカー遺伝子を導入してマーカー選抜を行わなければならないという問題があった。さらに、長期の組織培養を必要とすることに伴い、体細胞変異（ソマクローナル変異）が頻繁に生じる点も問題であった。ゲノム編集植物作製の労力軽減や遺伝子組換え植物の安全性の観点から、組織培養を伴わないインプランタゲノム編集技術およびゲノム編集個体の作製方法の開発が求められていた。
一方、コムギやイネなどにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない形質転換法（インプランタ形質転換法）も知られている。インプランタ形質転換方法としては、露出させた未熟胚又は完熟胚の茎頂に、パーティクルガン法を用いて直接遺伝子導入する方法が知られている（非特許文献１）。また、特許文献１及び非特許文献２には、発芽直後の完熟胚にアグロバクテリウムを感染させ、遺伝子導入する方法が記載されている。
しかし、これらの文献に記載の方法は、共通して、実験者の手技に大きく依存するため遺伝子導入効率が低調であり、再現性の点において改善の余地がある。また、非特許文献１は、導入遺伝子が次世代に伝達されることの実証に至っていない。このような要因から、上記の手法は、現在に至るまで汎用化されていない。
国際公開第２００５／０２４０３４号
Ｂｉｌａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｈｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ａｆｔｅｒ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｍｉｃｒｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９９３） ４， ７３５－７４４． Ｓｕｐａｒｔａｎａ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＮＤ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （２００５） ４， ３９１－３９７．
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない植物のゲノム編集方法を提供する。
本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）植物のゲノム編集方法であって、微粒子を、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
（２）前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、Ｌ２細胞に打ち込む工程を特徴とする、（１）の方法。
（３）前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に打ち込む工程を特徴とする、（１）の方法。
（４）前記微粒子が、直径０．３μｍ以上１．５μｍ以下であることを特徴とする、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）さらに、前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（７）前記完熟種子が、その根長が１ｍｍ以下の完熟種子であることを特徴とする、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（８）前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか１であることを特徴とする、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記核酸が、修飾酵素をコードする核酸を含むことを特徴とする、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記修飾酵素が、ヌクレアーゼまたはデアミナーゼであることを特徴とする、（９）に記載の方法。
（１１）前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現し得る核酸およびＣａｓヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記タンパク質がヌクレアーゼである、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記タンパク質がＣａｓヌクレアーゼである（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）（１）～（１３）のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
（１５）植物のゲノム編集方法であって、直径０．３μｍ以上１．５μｍ以下の微粒子を、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含む、方法。
（１６）さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、（１５）の方法。
（１７）前記完熟種子が、その根長が１ｍｍ以下の完熟種子であることを特徴とする、（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）前記植物が、コムギ、イネ、トウモロコシ、および大豆からなる群から選ばれるいずれか１であることを特徴とする、（１５）～（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）前記核酸が、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むことを特徴とする、（１５）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現し得る核酸およびＣａｓヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、（１５）～（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）前記タンパク質がヌクレアーゼである、（１５）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２２）前記タンパク質がＣａｓヌクレアーゼである（１５）～（１８）のいずれかに記載の方法。
（２３）（１５）～（２２）のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
（２４）インプランタ法により、茎頂分裂組織中の生殖細胞系列またはそれに移行し得る幹細胞のゲノム編集を行う方法。
（２５）（１）～（１３）のいずれかの方法を含むことを特徴とする、（２４）の方法。
（２６）（２４）または（２５）のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
（２７）（２６）の製造方法により製造された、ゲノム編集された植物体（出願時に公知のものを除く）。
本発明の方法によれば、パーティクルガン法の標的として茎頂を用いることで、カルス化及び選択マーカー遺伝子を必要とせずに、再現性良く植物のゲノム編集を行うことができる。本発明によれば、茎頂中の生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞のゲノム編集を行うことができる。
本発明の実施例１に係る茎頂のＧＦＰタンパク質の発現の様子を示した図である。 本発明の実施例２に係るＴ１世代形質転換体のゲノミックＰＣＲによる導入遺伝子確認の結果を示した図である。 図３は、遺伝子導入個体のサザン解析の結果を示す写真である（実施例３）。 図４Ａは本発明の実施例４に係るＧＦＰ蛍光観察したＴ１世代種子の全体写真の図である。図４Ｂは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の半切種子のＧＦＰ蛍光観察写真の図である。図４Ｃは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の幼葉のＧＦＰ蛍光写真の図である。図４Ｄは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の成葉のＧＦＰタンパク質を検出したウェスタンブロット写真の図である。 図５Ａは、主茎から得られたＴ１種子の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡのサザン解析の結果を示す写真である。 図５Ｂは、主茎および分げつから得られたＴ１種子の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡのサザン解析の結果を示す写真である（実施例５）。 図６は、トウモロコシのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例６）。 図７は、ダイズのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例７）。 図８は、オオムギのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例８）。 図９は、ジャガイモのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例９）。 図１０は、標的遺伝子導入個体を示す図である（実施例１２）。 図１１は、遺伝子導入後１週間後の茎頂における標的遺伝子の変異導入を示す図である（実施例１３）。 図１２は、Ｔ０世代成葉における標的遺伝子導入個体を示す図である（実施例１３）。 図１３は、Ｔ１世代葉における標的遺伝子変異導入を示す図である（実施例１３）。 図１４は、Ｃａｓ９タンパク質直接導入による標的遺伝子導入個体を示す図である（実施例１４）。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインプランタゲノム編集方法においては、植物の完熟種子を吸水させる工程、次に種子における胚の茎頂を露出させる工程、次に茎頂の細胞をゲノム編集する工程、を含む。
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ニューブリーディングテクニック（ＮＢＴ）といわれる技術の一部で、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを用いて、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して変異を導入することで遺伝子を破壊すること、もしくは、部位特異的にＤＮＡ断片を挿入または置換すること、または、ＣＲＩＳＰＲシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体を構築し、細胞中で発現させることで、狙った点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変することも含まれるがこれらに限られず、ゲノムを編集できる技術であればよい。ゲノム編集技術を用いることで、狙った遺伝子を高い効率で破壊できる。遺伝子破壊の場合、遺伝子組換えの痕跡を残さずに狙った遺伝子のみを破壊できることから組換え植物と取り扱わない国もある。また、ゲノム編集によれば、切断配列の両側の配列に相同な断片を、その部位に導入したいＤＮＡ断片の両側に連結しておくことで、効率よく部位特異的なＤＮＡ断片の挿入または置換が可能である。
上記意味で、ゲノム編集は、外来遺伝子がほぼランダムに組み込まれる従来型の植物の形質転換法、例えば、直接導入法やアグロバクテリウム法などとは異なる技術とも言える。ゲノム編集技術では、切断部位をターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを切断する工程を含むことが特徴で、かかるターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いない従来型の形質転換法とは区別できる。ここで、「ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いて」という意味は、ヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入してもよく、ヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを細胞に導入してヌクレアーゼタンパク質を発現させてもよいという意味である。また、ガイドＲＮＡについてもＲＮＡを細胞に導入してもよく、ガイドＲＮＡを発現し得るＤＮＡを導入してガイドＲＮＡを発現させてもよい趣旨である。
本明細書において、「種子」とは、植物を天然またはそれに近い条件下で栽培（または培養）して得られる天然の種子のみでなく、人工種子も含むが、好ましくは天然の種子である。ただし、形質転換可能な茎頂が取得できる人工種子が開発されればそれを用いることも可能である。天然の種子には、野外の畑などで得られる種子のみでなく、温室栽培により得られる種子や、インビトロ苗などの組織培養物から得られる種子も含まれる。組織培養（ダイレクト・リプログラミングなど）により得られる種子も茎頂が取得できる限り本発明の種子として使用し得る。
なお、本発明においては、茎頂を取得する材料として完熟種子または地下茎を用いるのが好ましい。完熟種子とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。地下茎とは、地下にある茎の総称で、塊状で多くの芽をもつ塊茎，球状で大きな頂芽をもつ球茎，短縮した茎に肥大した鱗片葉がついて球状となった鱗茎などをいう。
本明細書において、茎頂とは、茎の先端の成長点（茎頂分裂組織）ならびに成長点および成長点から生じた数枚の葉原基からなる組織を含む意味である。本発明においては、葉原基を除去した半球状（ドーム状）の成長点のみを茎頂として用いても良く、成長点および葉原基を含む茎頂や該茎頂を含む植物組織を用いてもよい。葉原基を除去した成長点のみを用いることでウイルスフリーの組織が得られる。また、本明細書において、「生殖細胞系列」とは、生殖細胞の源である始原生殖細胞から最終産物である卵細胞や精細胞に至るまでの生殖細胞の総称であり、「Ｌ２層」とは、茎頂分裂組織の外側から２番目の細胞層をいう。
１．ゲノム編集の前処理工程
本発明に係るインプランタゲノム編集方法は、広く一般に種子を生じる植物、地下茎を生じる植物および茎頂培養可能な植物に適用することができる。従って、本発明に係るインプランタゲノム編集方法の対象植物は、被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。インプランタゲノム編集法とは、一般には組織培養の操作を含まないゲノム編集法であり，植物が成長する状態のまま成長点部位の細胞をゲノム編集させる方法である。ただし、本明細書においては、インプランタゲノム編集法は、茎頂培養を経て植物体を得る組織培養操作のみは含み、その他の組織培養の操作は含まれないという意味で使用する。インプランタ法も同様の意味である。
単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物などが挙げられる。
イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビなどが挙げられる。ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガスなどが挙げられる。バショウ科植物としては、バナナなどが挙げられる。パイナップル科植物としては、パイナップルなどが挙げられる。ラン科植物としては、ランなどが挙げられる。
双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、およびタデ科植物などが挙げられる。
アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ダイコンなどが挙げられる。マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファなどが挙げられる。ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシなどが挙げられる。ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカなどが挙げられる。ヒルガオ科植物としては、アサガオ、サツマイモ（カンショ）、ヒルガオなどが挙げられる。バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴなどが挙げられる。クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキなどが挙げられる。アオイ科植物としては、ワタ、ケナフなどが挙げられる。キク科植物としては、レタスなどが挙げられる。ヒユ科植物としては、テンサイ（サトウダイコン）などが挙げられる。タデ科植物としては、ソバなどが挙げられる。
一方、裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどが挙げられる。
本発明に係るインプランタゲノム編集方法の１実施態様としては、まず植物の完熟種子を吸水させる。必要により吸水前に春化処理をしてもよい。吸水は、種子を水に浸種し、インキュベートすることにより行われる。吸水温度は、例えば、コムギ、オオムギまたはイネの場合には、１５～２５℃が好ましく、トウモロコシまたはダイズでは２５～３５℃が好ましい。この際、一度以上、水を交換してもよい。吸水期間は、例えば、コムギの場合には、幼根が伸長を開始する前まで、又は新しい葉原基が形成される前までが好ましい。吸水時間で表すと、種子の休眠状態にもよるが、吸水後１６時間未満であり、好ましくは１２時間である。この吸水工程により、種子を柔らくすることで茎頂を露出させ易くすることができる。
２．種子における胚の茎頂を露出させる工程
次いで、上記で吸水させた種子における胚の茎頂を露出させる。コムギ、オオムギ、イネ又はトウモロコシの場合には、鞘葉及び葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。ダイズの場合には、種皮及び子葉を除去することで、茎頂を露出させる。ジャガイモの場合には、種芋から芽出しを行い、切り出した幼芽より葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。リンゴの場合には、種子胚または摘出した頂芽もしくは側芽から葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。露出手段としては、実体顕微鏡下において、鞘葉及び葉原基または種皮及び子葉を除去することができるものであればいずれのものであってよいが、例えば、直径０．２ｍｍ程度の針などの穿設するための器具、ピンセット、ピペット、注射器、並びにメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。次いで、メスなどの切断器具を用いて胚乳及び余分な胚盤部分を切除し、露出した茎頂を含む胚及び胚盤を寒天培地上に、茎頂を上向きに置床する。ウイルスフリーの茎頂を得るために、茎頂を切り出す最終段階でメスを新規な滅菌メスに取り替えてもよい。この場合はウイルスフリーの植物体を得ることができる。
３．茎頂の細胞に核酸および／またはタンパク質を導入する工程
部位特異的ヌクレアーゼなどの目的遺伝子の導入には、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されない。一般的には、目的遺伝子を含む組換えベクターを作製して、完熟胚の茎頂を標的に、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などにより、核酸（組換えベクターなど）やタンパク質などを導入することができるが、コムギ、イネ、トウモロコシ又はダイズでは、植物体への導入効率から、パーティクルガン法を用いて完熟種子胚に導入する方法が好ましい。また、パーティクルガン法はジャガイモの茎頂に遺伝子を導入するのにも有効である。パーティクルガン法は、金属微粒子に核酸および／またはタンパク質をコーティングして細胞組織に打ち込む方法であり、単子葉植物のようにアグロバクテリウムの感染効率が低い場合に有効である。
本発明に用いるベクターは特に限定されず、例えば、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６など）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９など）、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２など）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴなど）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などを用いることができる。
目的遺伝子を含むベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。ベクターに目的遺伝子を挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトなどに挿入してベクターに連結する方法を用いることができる。また、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）により中間ベクターに目的遺伝子を挿入してもよく、ＴＡクローニング、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングなどを用いてもよい。
ゲノム編集のターゲットとなる遺伝子は特に限定されず、その遺伝子の破壊または挿入・置換が望まれるものであればよい。また、導入するヌクレアーゼ遺伝子は、由来する生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子や、人工合成遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子としては、例えば、メガヌクレアーゼ遺伝子、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム、ＴＡＲＧＥＴ ＡＩＤなどがあげられる。
ゲノム編集のターゲットとなりうる遺伝子としては特に制限はないが、例えば、糖代謝関連遺伝子、脂質代謝関連遺伝子、有用物質（医薬、酵素、色素、芳香成分など）生産関連遺伝子、植物生長制御（促進／抑制）関連遺伝子、開花調節関連遺伝子、耐病虫害性（昆虫食害抵抗性、線虫、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など）関連遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、塩、光障害、紫外線）耐性関連遺伝子、トランスポーター関連遺伝子、製粉特性・製パン特性・製麺特性関連遺伝子、組換え酵素関連遺伝子などが挙げられる。
ゲノム編集の標的となる遺伝子については、切断した部位の間に組換えにより外来ＤＮＡ挿入または置換することにより目的の変異を導入してもよい。
部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質またはＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＬＥＮ）などが挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特定の塩基を認識するジンクフィンガーモチーフ数個とＦｏｋＩヌクレアーゼの融合タンパク質である。ＴＡＬＬＥＮはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｌｉｋｅ （ＴＡＬ） ｅｆｆｅｃｔｏｒとＦｏｋＩヌクレアーゼの融合タンパク質である。部位特異的ヌクレアーゼは、他の追加の標的化技術、例えば、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘発性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、またはロイシンジッパーなどで構成される。
部位特異的ヌクレアーゼを遺伝子銃を用いて茎頂に導入して、ゲノム編集することにより、１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができる。すなわち、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し、発現し得る細胞中に、Ｃａｓタンパク質およびＤＮＡ分子をターゲティングする１つ以上のガイドＲＮＡを含み得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを導入し、それにより１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質が、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができる。
遺伝子銃を用いてヌクレアーゼ遺伝子またはタンパク質を細胞に導入してゲノム編集を行う場合、必ずしもゲノムにインテグレートさせて安定な形質転換体を取る必要は無い。ヌクレアーゼ遺伝子を一過的に発現させ、それによりゲノム編集を行うことができる。また、タンパク質（およびガイドＲＮＡ）を細胞に導入することによってもゲノム編集を行うことができる。これらの方法によれば、得られたゲノム編集個体は遺伝子組換え体とはならない場合がある。
Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、天然に存在するもの（組み合わせ）であってもよく、天然には存在しない組み合わせであってもよい。本発明においては、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変してもよい。ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
ガイドＲＮＡの長さは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドである。好ましいヌクレオチド長の上限としては、３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２２以下、最も好ましくは２０以下である。
好ましい実施形態において、ゲノム編集の対象となる細胞は、植物細胞であり、さらに好ましくは、茎頂分裂組織の細胞であり、もっとも好ましくは、茎頂分裂組織中の生殖細胞系列に移行する細胞である。
本発明においては、Ｃａｓタンパク質が１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。
Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向し得る。本発明の他の側面において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。
ベクターには、目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、インシュレーター、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
ベクターに挿入する目的遺伝子は１ベクターあたり複数種であってもよく、微粒子に被覆する組換えベクターも１微粒子あたり複数種であってもよい。例えば、ヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクターと、薬剤耐性遺伝子を含む組換えベクターを別々に作製し、混合して微粒子を被覆して植物組織に撃ち込んでもよい。
ゲノム編集の目的遺伝子は２以上であってもよく、２以上の目的遺伝子を切断できるようにベクターを構築してもよい。その場合、２種類以上のベクターを作製してもよく、１つのプラスミド上に複数のガイドＲＮＡを発現するように挿入してもよい。また、ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
ゲノム編集により、部位特異的に二本鎖を切断し、相同組換えを促進して部位特異的ゲノム編集を行ってもよい。この場合は切断領域の両側に相同な配列を有するＤＮＡを導入して二重交叉組換えを起こせばよい。また、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体を用いても同様に相同組換えを行うことができる。
プロモーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、構成的に発現するか、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２－３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターなどが挙げられる。翻訳活性を高める配列、例えば、タバコモザイクウイルスのオメガ配列を用いて翻訳効率を上げることができる。また、翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’－下流側で、翻訳開始コドンの５’－上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーターなどが挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ））、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくてもゲノム編集された植物体の作製は可能である。
上記目的遺伝子を標的とするヌクレアーゼを含むベクターを、パーティクルガン法でコムギの完熟胚に撃ち込む。目的遺伝子を標的とするヌクレアーゼ遺伝子をコードする核酸および／またはタンパク質（ヌクレアーゼなど）は微粒子（マイクロキャリア）の表面に被覆して植物細胞に遺伝子銃で撃ち込むことができる。微粒子としては、細胞内への貫通力を高めるため、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいという理由から金属微粒子が好ましく用いられる。金属微粒子の中でも、金粒子、タングステン粒子などが特に好ましく用いられる。
パーティクルガン法では以下のようにして目的遺伝子を植物細胞に導入することができる。まず、金粒子またはタングステン粒子などの微粒子を洗浄滅菌し、該微粒子、核酸（組換えベクター、直鎖状ＤＮＡ、ＲＮＡなど）および／またはタンパク質、ＣａＣｌ２、スペルミジンをボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、ＤＮＡ・ＲＮＡおよび／またはタンパク質を金粒子またはタングステン粒子にコーティングし、エタノールまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳなど）で洗浄する。
前記微粒子の粒径（直径）は０．３μｍ以上１．５μｍ以下が好ましく、より好ましい粒径は０．４μｍ以上、さらに好ましくは０．５μｍ以上、特に好ましくは０．６μｍを用いる。粒径のより好ましい上限としては、１．４μｍ以下、さらに好ましくは１．３μｍ以下、よりさらに好ましくは１．２μｍ以下、特に好ましくは１．１μｍ以下、最も好ましくは１．０μｍ以下である。
金粒子またはタングステン粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリヤーフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させる。タンパク質をコートした微粒子の場合は、親水性のマクロキャリヤーフィルムを用いるのが好ましい。
親水性のマクロキャリアフィルムは、マクロキャリアフィルムに親水性フィルムを貼付しても良いし、親水性コーティングを施しても良い。フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法等が挙げられる。
上記手法に用いられる親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体が挙げられる。
そして、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの完熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する。マクロキャリヤーフィルムはストッピングプレートで止まるが、金粒子はストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入し、目的遺伝子が導入される。
ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離は、微粒子の粒径にもよるが、例えば、９ｃｍ以下が好ましく、より好ましくは８ｃｍ以下、さらに好ましくは７ｃｍ以下、特に好ましくは６ｃｍ以下であり、距離の下限としては、例えば、２ｃｍ以上が好ましく、より好ましくは３ｃｍ以上、さらに好ましくは４ｃｍ以上である。ストッピングプレートとターゲットの距離は、微粒子の種類、粒径、ガス圧などに応じて、一過的発現実験などにより、適宜最適な値を決定することができる。
ガス圧としては、微粒子の種類、ターゲットとの距離にもよるが、好ましくは、例えば、１，１００～１，６００ｐｓｉが好ましく，より好ましくは１，２００～１，５００ｐｓｉである。ガス圧については、微粒子の種類、ターゲットの種類、ターゲットとストッピングプレートとの距離などに応じて、一過的発現実験などにより、適宜最適な圧力を決定することができる。
本発明において、茎頂に微粒子を撃ち込む回数としては、２回以上が好ましく、さらに好ましくは３回以上、より好ましくは４回以上である。茎頂に微粒子を撃ち込む回数の上限としては、２０回以下が好ましく、より好ましくは１５回以下、さらに好ましくは１０回以下である。撃ち込む回数については、一過的発現実験などにより、適宜最適な回数を決定することができる。
微粒子を撃ち込まれた細胞中では、核酸および／またはタンパク質が微粒子から遊離し、核酸が核に移行してヌクレアーゼを発現することでゲノムＤＮＡを切断し、その修復の過程で変異が起こりゲノム編集された細胞が得られる。タンパク質の場合は、核移行シグナル（オルガネラ移行シグナルであってもよい）により核（オルガネラ）に移行し、ＤＮＡを切断することにより、ゲノム編集が起こる。ゲノム編集は核のゲノム遺伝子のみでなく、オルガネラ（葉緑体、ミトコンドリアなどの細胞内小器官）の遺伝子についても適用可能である。この場合は、各オルガネラへの移行シグナルをヌクレアーゼに連結させて導入してもよく、ヌクレアーゼなどに連結するプロモーターを各オルガネラでのみ発現するプロモーターを用いてもよい。
ヌクレアーゼを導入し、ゲノム編集した完熟胚の茎頂を寒天培地上で１ヶ月程度生育させた後、土へ移植する。茎頂への撃ち込みの場合、薬剤などによる選択圧をかけずに（抗生物質などを含まない）通常の培地で生育させることによってもゲノム編集された植物個体を得ることができるが、ヌクレアーゼと薬剤耐性遺伝子を同時に導入することでゲノム編集個体を選択することもできる。薬剤耐性遺伝子を導入した場合は、薬剤によりヌクレアーゼ遺伝子および／またはヌクレアーゼが導入された細胞を選択的に培養することができる。茎頂培養に適した選択薬剤としては、例えば、スルフォニル尿素系除草剤クロロスルフロン（変異型ＡＬＳ遺伝子（アセト酪酸合成酵素遺伝子）導入により耐性獲得可能）などが知られている。
薬剤耐性遺伝子を導入する場合、該薬剤耐性遺伝子はヌクレアーゼ遺伝子と同じベクター上にあってもよく別のベクター上にあってもよい。別々のベクター上に挿入した場合は、それらが別々の染色体に組み込まれた場合、自家受粉や戻し交配を行って後代を取ることによりゲノム編集された植物個体と薬剤耐性遺伝子を有する植物個体とに分離できるというメリットがある。
以上の手法により、目的遺伝子をゲノム編集された植物体を作出することができる。また、このようにして作出された植物は、安定的にゲノム編集された遺伝子の形質が発現し、または目的遺伝子の発現が抑制され、後代に正常に遺伝する（伝達される）。
コムギへの遺伝子導入効率およびゲノム編集効率は、以下のようにして調べることができる。
遺伝子の導入効率は、遺伝子導入処理後の生育個体からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法および／またはサザンブロット法を行うことにより、目的遺伝子がゲノム編集されたか否かを検出することができ、導入に用いた外植片数と外来遺伝子を有していた生育個体数から、ゲノム編集効率を算出する。
目的遺伝子のゲノム編集効率は、遺伝子の導入が確認された生育個体について、目的遺伝子から発現されたＲＮＡの有無を調べる。ＲＮＡの有無は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法などで確認することができる。ノザンブロッティングにより検出してもよい。
また、ゲノム編集された目的遺伝子から発現されたタンパク質の有無を調べることもできる。タンパク質の有無は、例えば植物片の染色、電気泳動、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ、ドットイミュノバイディングアッセイ、および／またはウエスタンブロット法などで確認することができる。そして導入に用いた外植片数と目的遺伝子がゲノム編集されたタンパク質の存在（または非存在）が確認された生育個体数から、目的遺伝子のゲノム編集効率を算出する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］遺伝子導入に最適な金粒子径の検討
適切な金粒子径を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無又はその当代（Ｔ０世代）における導入遺伝子の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ． Ｆｉｅｌｄｅｒ）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％、花王株式会社）に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、休眠打破のため４℃にて２日間インキュベートした。その後、２２℃で約１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実体顕微鏡下において、上記発芽種子の胚部分の鞘葉及び第１葉原基から第３葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去した。その後、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ，ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ，３０ｇ／Ｌ マルトース，０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ，３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ，ナカライテスク），７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標、シグマアルドリッチ），ｐＨ５．８）に置床した。
（３）遺伝子導入
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、蛍光レポーター遺伝子ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ系プラスミド）を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。
０．３μｍから１．６μｍの各金粒子３０ｍｇをはかり取り、７０％エタノール５００μＬを加え、ボルテックスにてよく懸濁した。その後、遠心により金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、５０％グリセロール５００μＬを加え滅菌金粒溶液とした。
１．５ｍＬチューブに、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製したプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）を、金粒子７５０μｇあたり５μｇになるように入れた。滅菌金粒子含有溶液は使用前に、超音波発生器（多賀電機製超音波洗浄機ＵＷ－２５）を使って念入りに懸濁し、上記チューブに適当量入れピペッティングにより攪拌した。次に上記チューブに、金粒子７５０μｇあたり２．５Ｍ ＣａＣｌ２（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）２５μＬと０．１Ｍ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）１０μＬを加えた。混合後すぐに、ボルテックスにより５分間激しく懸濁した。１０分間室温にて静置後、９，１００×ｇで２秒間遠心した。上清を除去し、７０％エタノール及び９９．５％エタノールで洗浄した。最後に、上清を除去して９９．５％エタノールを２４μＬ添加してよく懸濁した。クリーンベンチ内でマクロキャリアの中央に６μＬずつ注ぎ、風乾させた。
パーティクルガンは、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用し、撃ち込み時の圧力は約９４．９ｋｇｆ／ｃｍ２（１，３５０ｐｓｉ）とし、標的組織までの距離は５ｃｍ（金粒子径０．６μｍ以上）または３．５ｃｍ（金粒子径０．６μｍ未満）とした。１シャーレにつき４回ずつ撃ち込んだ。撃ち込み後、２２℃、暗所において一晩静置した。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実体蛍光顕微鏡 （Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０）を観察することで（図１）、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表１）。特に、０．６μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が７２．７％と最も高かった（表１）。また、後述するように、遺伝子導入効率についても、金粒子１．０μｍよりも０．６μｍの方が高かった。
Figure 2023056018000002
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
実施例１－１－（１）に記載の方法に準拠して行った。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）遺伝子導入
０．６μｍ、１．０μｍの２種の金粒子径を用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に準拠して行った。
（４）形質転換処理個体の生育
一晩静置した形質転換処理個体をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、長日（２２℃、１６時間日長）で育成した。３－４週間生育させた後、第２－３葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室（２４℃、１６時間日長、湿度５０－７０％）にて第４－６葉が出るまで育成した。
（５）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調査した。第４－６葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＧＦＰ遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列：ＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴ（配列番号１）
プライマーの配列：ＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号２）
ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ２０ｎｇ、ＥｘＴａｑＨＳ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、１０×添付バッファー１．５μＬ、２ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１５μＬにフィルアップした。
ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）を用いて、９５℃で３分処理後、９５℃を３０秒、６０℃を３０秒及び７２℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３３サイクル行った。ＰＣＲ反応後、１．０％のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色してＰＣＲ産物を検出し、予想される６０１ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片が検出されたものを、遺伝子導入個体と判断した。
遺伝子導入に用いた金粒子径１．０μｍ、０．６μｍの２通りにおいて、それぞれ得られた遺伝子導入個体数から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。
その結果、１．０μｍ径の金粒子を用いた場合において、導入遺伝子は検出されなかった（表２）。一方、０．６μｍ径の金粒子を用いた場合において、導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）は３個体（遺伝子導入効率１．４％）検出された（表２）。このことから、金粒子径１．０μｍと比較し、実施例１－１－（４）において一過的な発現効率が高かった金粒子径０．６μｍを用いることで、遺伝子導入効率が向上することがわかった。
Figure 2023056018000003
［実施例２］遺伝子導入に最適なガス圧の検討
適切なガス圧を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無とその当代（Ｔ０世代）における導入遺伝子の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
実施例１－１－（１）に記載の方法に準拠した。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠した。
（３）遺伝子導入
金粒子径を０．６μｍ、ガス圧を１，１００ｐｓｉまたは１，３５０ｐｓｉとし、実施例１－１－（３）に記載の方法に準拠した。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実施例１－１－（４）に記載の方法に準拠した。その結果、実施例１－１－（４）に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧１，３５０ｐｓｉの場合では７４．２％となり、ガス圧１，１００ｐｓｉの場合の１３．３％に比べ高かった（表３）。また、後述するように、Ｔ０世代の遺伝子導入効率についても、ガス圧１，１００ｐｓｉよりもガス圧１，３５０ｐｓｉの方が高かった。
Figure 2023056018000004
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に準拠した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
実施例１－２－（５）に記載の方法に準拠した。その結果、実施例１－２－（５）に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧１，３５０ｐｓｉの場合では４．２％となり、ガス圧１，１００ｐｓｉの場合の０．８％に比べ高かった（表３）。このことから、ガス圧１，１００ｐｓｉと比較し、実施例２－１－（４）においてＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率が高かったガス圧１，３５０ｐｓｉを用いることで、遺伝子導入効率が向上することがわかった。
［実施例３］遺伝子導入に最適な吸水時間の検討
適切な吸水時間を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無とその当代（Ｔ０世代）及び次世代（Ｔ１世代）における導入遺伝子の有無を調査した。
１．完熟胚の調製及び遺伝子導入操作
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ． Ｆｉｅｌｄｅｒ）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％）に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、４℃にて２日間インキュベートした。その後、２２℃で６～１２時間、１２～１８時間の各時間インキュベートし、以下の実験に用いた。種子根長は、根鞘を切り開いた後に幼根の長さを測定することで調査した。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）遺伝子導入
０．６μｍの金粒子径を用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に準拠して行った。
２．Ｔ０世代及びＴ１世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
実施例３－１－（３）において茎頂における一過的なＧＦＰ蛍光が観察された個体について、実施例１－（２）－４に記載の方法により育成した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
実施例１－２－（５）に記載の方法に準拠して行った。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、６～１２時間、１２～１８時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率は、それぞれ３．１％、１．３％となり（表３）、吸水６～１２時間後の完熟胚で特に高かった（表４）。
Figure 2023056018000005
（３）Ｔ１植物葉における導入遺伝子の有無
上記（２）で導入遺伝子が確認された個体を育成し、Ｔ１種子を取得した。各Ｔ１種子を１０～２０粒程度播種・育成し、第１葉（５０ｍｇ）をサンプリングした。ゲノミックＰＣＲ及び電気泳動は実施例１－（２）－５に準拠して行った。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体（Ｔ１世代）から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、６～１２時間、１２～１８時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率はそれぞれ３．１％（図２系統１及び２、表３）、０．７％（図２系統３～５、表３）となり、吸水６～１２時間後の完熟胚で特に高かった。これらの結果から、遺伝子導入には完熟種子の吸水初期（６時間後から１８時間程度であり、種子根長１．０ｍｍ以下）が適切であり、特に吸水６～１２時間後が好ましいと判断した。
なお、表４に示した導入遺伝子確認個体（Ｔ１世代）５系統については、ＧＦＰ遺伝子領域をプローブとしたサザンブロット解析によっても、ＧＦＰ遺伝子がゲノミックＤＮＡへ挿入されているのを確認した（図３）。
［実施例４］Ｔ１世代における遺伝子発現の確認
当該遺伝子導入法により作製された形質転換コムギにおける導入遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）発現の有無を調査した。
１．Ｔ１種子におけるＧＦＰ蛍光観察
実施例３－２－（３）で取得したＴ１種子を滅菌シャーレに置き、ＬＡＳ３０００（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）下で、Ｔ１種子のＧＦＰ蛍光（フィルター５１０ＤＦ１０）を観察した結果、種子においてＧＦＰ蛍光が観察された（図４Ａ）。次に、ＧＦＰ蛍光が観察された種子を半切し、実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬＩＩＩ）下で、胚乳のＧＦＰ蛍光観察（励起：４７０／４０、 吸収：５２５／５０）を行った。その結果、胚乳（Ｅ）においてＧＦＰ蛍光が観察された他、アリューロン層（Ａｌ）においてＧＦＰ蛍光が強く観察された（図４Ｂ）。
２．Ｔ１世代幼葉におけるＧＦＰ蛍光タンパク質の発現解析
実施例３－２－（３）で育成させたＴ１世代植物の幼葉をサンプリングし、実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬＩＩＩ）下で、葉におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０、 吸収：５２５／５０）を観察した。その結果、図４Ｃに示すように、ゲノミックＰＣＲ陽性個体（形質転換体）では葉の気孔細胞においてＧＦＰ蛍光が観察された。
次に、野生型株及び形質転換体（遺伝子導入個体）のそれぞれの成葉から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット法によるＧＦＰ蛍光タンパク質の検出を試みた。成葉１ｇを液体窒素で凍結・粉砕した後、タンパク抽出バッファー （０．２５Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ａｃｅｔａｔｅ， ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１％ＰＶＰ、１０μＭ ＰＭＳＦ）に懸濁した。この抽出液を遠心分離（１，１００×ｇ、１５分間、４℃）し、その上清をさらに遠心分離（１２，８００×ｇ、１５分間、４℃）した。この遠心分離の後得られた上清を全タンパク質画分とした。全タンパク質画分２０μｇを１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、セミドライ法によってニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキングバッファー（５％［ｗ／ｖ］ Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋ Ｐｏｗｄｅｒ ｉｎ ＴＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．５））で１時間振盪した。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、一次抗体を１時間反応させた。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、二次抗体を１時間反応させた。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌに記載の方法に従って検出を行った。なお、一次抗体として、マウスＩｇＧ１κ由来ＧＦＰ抗体（ＲＯＣＨＥ）（２０００倍希釈）を用い、二次抗体として上記キットに添付されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）を使用した。
ウェスタンブロット解析の結果、形質転換体ではＧＦＰタンパク質の推定分子量２７ｋＤａ付近にシグナルが見られたが、野生型株ではシグナルは検出されなかった（図４Ｄ）。これらの結果から、当該遺伝子導入法により作製された形質転換植物では、正常に導入遺伝子が発現していることが確認された。
オオムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
［実施例５］Ｔ０世代１系統から取得したＴ１世代各個体における遺伝型の確認
本法において作製された遺伝子導入個体（Ｔ０世代）は、同一個体内において異なった遺伝情報を持つ細胞が混在したキメラになる。そこで、ある１系統の遺伝子導入個体（Ｔ０世代）から得られた複数のＴ１種子が、それぞれ異なる遺伝情報を有するか否かを調査するため、サザンブロット解析を行った。
実施例３－２－（３）で得られたＴ０世代のＦＧ１系統の個体から、主茎および５つの分げつ由来の穂ごとにＴ１種子を収穫し、そこから複数個体を播種した。播種したＴ１世代個体を生育し、実施例３－２－（３）に記載の方法に従い、各Ｔ１世代個体における導入遺伝子の有無を調査した。その結果、分げつ２以外の主茎および分げつ由来の穂から収穫したＴ１世代において、導入遺伝子を確認した（表５）。
Figure 2023056018000006
次に、主茎から得られたＴ１種子１４個体（ＦＧ１－主茎－１～１４）の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡに対しＨｉｎｄＩＩＩ処理を行い、ＧＦＰ遺伝子領域をプローブとしてサザンブロット解析を行った。その結果、全ての個体について同様のシグナルパターンが得られた（図５Ａ）。さらに、主茎および分げつ１、３、４、５から得られたＴ１種子（ＦＧ１－主茎－１、ＦＧ１－分げつ１－１、ＦＧ１－分げつ３－１、ＦＧ１－分げつ４－１、ＦＧ１－分げつ５－１）の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡに対しＨｉｎｄＩＩＩ処理を行い、上記と同様にサザンブロット解析を行った。その結果、全ての個体について同様のシグナルパターンが得られた（図５Ｂ）。これらの結果から、ある１系統の遺伝子導入個体（Ｔ０世代）から得られた複数のＴ１種子は同じ遺伝情報を有することがわかった。これは、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞は極少数であることを示唆しており、当該方法によりこの極少数の茎頂幹細胞へ遺伝子導入が可能であることがわかった。
［実施例６］トウモロコシにおける形質転換体の取得
コムギと同様の手法によりトウモロコシの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）トウモロコシ完熟種子の調製
トウモロコシ（スノーデント王夏）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％）に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、３０℃で約３６時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを１０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ ，ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ，３０ｇ／Ｌ マルトース，０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ ，３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ，登録商標、ナカライテスク），７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ，ｐＨ５．８）に置床した。一処理区につき上記プレートを２枚用意した。
（３）遺伝子導入
実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０） 吸収：５２５／５０）を観察することで（図６）、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表６）。特に、０．６μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が８５％と最も高かった（表６）。
Figure 2023056018000007
［実施例７］ダイズにおける形質転換体の取得
コムギと同様の手法によりダイズの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無及びその後の形質転換体取得効率を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）ダイズ完熟種子の調製
ダイズ（ユキホマレ）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％）に浸漬し、室温で３分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、２３℃で約４０時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、子葉を全てカットし、胚軸のみにした。その後、上記胚軸の初生葉と基部を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを約１５個／プレートとなるようにＢＭ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ 、ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ、３％ スクロース、０．５０ｇ／Ｌ ＭＥＳ 、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク）、６．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．７）に置床した。
（３）遺伝子導入
プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０）を観察することで（図７）、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍおよび１．０μｍに比べ、金粒子径０．６μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が８５．０％と高かった（表７）。
Figure 2023056018000008
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
一晩静置した形質転換処理個体をＲＭ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ 、ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ、３％ スクロース、０．５０ｇ／Ｌ ＭＥＳ 、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク）、０．３％ ゲルライト、ｐＨ５．７）を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、インキュベーター（２３℃、１６時間日長）で育成した。根の生育及び茎頂からの葉の分化が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたセルトレイへ移植した。その後、同インキュベーターにて第２葉目まで育成した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調査した。第２葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＧＦＰ遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列：ＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴ（配列番号１）
プライマーの配列：ＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号２）
ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ２０ｎｇ、ＥｘＴａｑＨＳ（ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、１０×添付バッファー１．５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１５μＬにフィルアップした。
ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、９５℃で３分処理後、９５℃を３０秒、６０℃を３０秒及び７２℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３２サイクル行った。ＰＣＲ反応後、１．０％のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して紫外線照射によりＰＣＲ産物を検出し、予想される６０１ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片が検出されたものを、遺伝子導入個体と判断した。
遺伝子導入に用いた金粒子径１．０μｍ、０．６μｍの２通りにおいて、それぞれ得られた遺伝子導入個体数から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。
その結果、０．６μｍ径の金粒子を用いた場合において、処理完熟胚４７０個体のうち導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）は６３個体（遺伝子導入効率１３．４％）であった。このことから、実施例７－１－（４）において一過的な発現効率が高かった金粒子径０．６μｍを用いることで、高効率でダイズの遺伝子導入個体を取得することが可能であることがわかった。
［実施例８］オオムギにおける形質転換体の取得
コムギと同様の手法によりオオムギの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）オオムギ完熟種子の調製
オオムギ（ワセドリ二条）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％）に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、４℃にて２日間インキュベートした後、２２℃で６～１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ 、ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ マルトース、０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ 、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク），７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ，ｐＨ５．８）に置床した。
（３）遺伝子導入
実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実施例１－１－（４）に記載の方法に従った。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表９）。特に、０．３μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が８０％と最も高かった（図８、表８）。
Figure 2023056018000009
［実施例９］ジャガイモにおける形質転換体の取得
コムギと同様の手法によりジャガイモの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ジャガイモの調製
種芋（男爵）をハイター（次亜塩素酸濃度１％）で消毒し、水洗い、乾燥後、２２℃で１－２週間蛍光灯下でインキュベートし、芽出しを行った。
２．茎頂の露出
実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、萌芽より葉原基を針（直径０．２０ｍｍ）の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを４０個／プレートとなるようにＭＳ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ 、ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ ショ糖、０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ 、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク）、７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．８）に置床した。
３．遺伝子導入
導入ベクターをｐＵＣ１８－３５Ｓ－ＧＦＰとし、実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
実施例１－１－（４）に記載の方法に従った。その結果、金粒子径０．６μｍを用いることで、茎頂におけるＧＦＰ蛍光を観察することができた。（図９）。
［実施例１０］イネにおける形質転換体の取得
イネについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
１．イネ完熟種子の調製
脱穀したイネ（品種：日本晴）の完熟種子を実施例１－１－（１）に記載の方法で殺菌、洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、２５℃で２４時間～４８時間インキュベートしたものを以下の実験に用いる。
２．完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に従い、完熟種子胚中の茎頂を完全露出させる。茎頂を露出させた完熟胚を約３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地に置床する。
３．遺伝子導入
イネ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、実施例１－１－（３）に記載の方法に従って行う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．形質転換処理個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に従い、形質転換処理個体を生育する。
６．Ｔ０植物葉における導入遺伝子の確認
実施例１－２－（５）に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
［実施例１１］リンゴにおける形質転換体の取得
リンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
１．リンゴ茎頂の調製
リンゴ（品種：ジョナゴールド）の茎頂の調製は、植物組織培養， ９（２）， ６９－７３ （１９９２）に記載の茎頂培養の誘導条件に沿って実施する。
２．茎頂の露出
１．の手法にて調製した茎頂を、約３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ 、ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ マルトース、０．９８ｇ／Ｌ ＭＥＳ 、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク）、７．０ｇ／Ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．８）に置床する。
３．遺伝子導入
プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．形質転換処理個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に従い、形質転換処理個体を生育する。
６．Ｔ０植物葉における導入遺伝子の確認
実施例１－２－（５）に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
［実施例１２］当該遺伝子導入法を利用した標的変異導入
当該遺伝子導入法を利用してコムギのゲノム編集が可能か否かを検証するため、ＲＮＡ誘発性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による標的配列の変異導入を試みた。なお、実施例１－１－（４）より当該遺伝子導入法を用いて安定な形質転換体を作製する上では、金粒子径０．３μｍ以上０．９μｍ以下が良いが、ゲノム編集個体を作製する上では、植物細胞核内又はオルガネラ内で一過的にヌクレアーゼ等が発現すれば良いため、上記粒子径に限定されない。そこで、当該遺伝子導入法を用いてコムギのゲノム編集が可能な金粒子径の範囲を検討した。
１．ＧＦＰ蛍光を指標とした標的変異導入確認
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ． Ｆｉｅｌｄｅｒ）の完熟種子をハイター（次亜塩素酸濃度６％）に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、休眠打破のため４℃にて２日間インキュベートした。その後、２２℃で約１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）遺伝子導入
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、蛍光レポーター遺伝子（ＧＦＰ）の開始コドン直後に標的配列としてＴａＭＬＯ遺伝子内部の２０ｂｐ部分配列（ＣＣＧＴＣＡＣＧＣＡＧＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣ：配列番号３）が挿入された標的プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ系プラスミド）を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。当該ベクターと、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９一体型プラスミドを共導入することで、ＴａＭＬＯ遺伝子標的配列をＣａｓ９が切断し、修復過程で２塩基が欠失または１塩基が挿入される。その結果、翻訳フレームシフトが起こり、ＧＦＰ遺伝子のコドンの読み枠が回復し、活性型のＧＦＰタンパク質が発現する。
当該一体型プラスミド（ｐＵＣ系プラスミド）中のｇＲＮＡはコムギ由来Ｕ６プロモーターの制御下で発現するよう設計されたものである。当該Ｃａｓ９遺伝子はトウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。
金粒子の調製及び導入操作は、実施例２－１－（３）の方法に準拠して行った。但し、標的プラスミドＤＮＡ溶液及びｇＲＮＡ／Ｃａｓ９一体型プラスミドを、金粒子７５０μｇあたりそれぞれ２．５μｇ及び７．５μｇになるように入れた。金粒子量は１回の撃ち込みあたり、金粒子径０．３μｍでは３７５μｇ、それ以外の金粒子径では１８７．５μｇになるように入れた。
（４）ＴａＭＬＯ遺伝子配列切断によるＧＦＰ蛍光の確認
実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０）を観察することで、ＴａＭＬＯ遺伝子標的配列の切断の有無を調査した。遺伝子導入処理した完熟胚中、茎頂組織において１スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを標的配列切断個体として、標的配列切断導入効率（標的配列切断個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。実験は２度行い、標的配列切断導入効率の平均値を表１１に示した。その結果、標的プラスミドＤＮＡ及びｇＲＮＡ／Ｃａｓ９一体型プラスミドを共導入した場合、金粒子径０．３μｍから１．０μｍでは標的配列切断を示すＧＦＰ蛍光が観察されたが、金粒子径１．６μｍでは観察されなかった（表９）。また、その効率は金粒子径０．６μｍを用いた場合、２３．５％と最も高かった（表９，図１０）。これらの結果から、当該遺伝子導入法を用いてゲノム編集個体を作製するためには、金粒子径が１．６μｍ未満が良く、金粒子径０．６μｍが好ましいことがわかった。
Figure 2023056018000010
［実施例１３］当該遺伝子導入法を利用した標的変異導入（Ｔ０世代、Ｔ１世代）
当該遺伝子導入法を利用してコムギに内在する標的遺伝子のゲノム編集が可能か否かを検証するため、ＲＮＡ誘発性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＴａＱｓｄ１遺伝子（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子）、ＴａＬＯＸ２遺伝子（ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ遺伝子）、及びＴａＧＡＳＲ７遺伝子（Ｓｎａｋｉｎ／ＧＡＳＡ遺伝子）の変異導入を試みた。なお、ＴａＱｓｄ１遺伝子の変異導入には実用品種「春よ恋」を、その他には「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」を用いた。
１．遺伝子導入後一週間目における標的遺伝子変異導入確認
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ． Ｂｏｂｗｈｉｔｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ． Ｈａｒｕｙｏｋｏｉ）の完熟種子を用い、実施例１－１－（１）の方法に従った。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）遺伝子導入
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、ｇＲＮＡ発現用プラスミドとして、ｐＴＡＫＮ－２ベクターのマルチクローニングサイトへコムギＵ６プロモーター及びｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄをクローニングした。その後、内部のＢｂｓＩサイトへ各標的遺伝子の標的配列を導入し、各ｇＲＮＡ発現用プラスミドとした。
ＴａＱｓｄ１標的配列：ＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＧ （配列番号４）
ＴａＬＯＸ２標的配列：ＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＧ（配列番号５）
ＴａＧＡＳＲ７標的配列：ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ（配列番号６）
上記各ｇＲＮＡ発現用プラスミド、Ｃａｓ９遺伝子発現用プラスミド及びＧＦＰ発現用プラスミド（実施例１－１－（３）参照）を金粒子７５０μｇあたり各々５μｇ、２．５μｇ、２．５μｇ入れた。金粒子径は０．６μｍとし、金粒子量は１回の撃ち込みあたり、１８７．５μｇになるように入れた。
（４）各標的遺伝子配列切断による変異導入の確認
実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０）が見られた個体をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、長日（２２℃、１６時間日長）で育成した。約１週間後に各個体中の茎頂を切り出し、２μＬのＤＮＡｚｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標、コスモバイオ）が添加された８連ＰＣＲチューブへ入れ、ゲノミックＤＮＡを抽出した。
これを鋳型として、各遺伝子に特異的な配列から作製されたプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
ＴａＱｓｄ１－Ｆ：ＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＡＣＣ （配列番号７）
ＴａＱｓｄ１－Ｒ：ＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＣ （配列番号８）
ＴａＬＯＸ２－Ｆ：ＣＧＴＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧ（配列番号９）
ＴａＬＯＸ２－Ｒ：ＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＡＴＣＡＡＧＴ（配列番号１０）
ＴａＧＡＳＲ７－Ｆ：ＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ（配列番号１１）
ＴａＧＡＳＲ７－Ｒ：ＣＣＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＴＡＣＧ（配列番号１２）
ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ０．５μＬ、ＫＯＤＦＸＮｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）０．４Ｕ、２×添付バッファー１０μＬ、０．４ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマー対各０．２μＭを加え、滅菌蒸留水で合計２０μＬにフィルアップした。
ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、９８℃を１０秒、６８℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。ＰＣＲ反応後、各ＰＣＲ産物を１μＬ、１０×添付バッファー１μＬ，適当な制限酵素５Ｕを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。３７℃、オーバーナイトで反応させた後、２．０％のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。
野生型株ではＰＣＲ産物が制限酵素により完全に切断されるのに対し、変異が導入された個体ではＰＣＲ産物に切れ残りが生じた。切れ残ったバンドからＤＮＡを抽出・精製し、シークエンス解析にかけ、標的遺伝子配列に変異が導入されているものについて、標的遺伝子変異導入個体と判断した（図１１）。その結果、全ての標的遺伝子について、ゲノム編集用ベクター導入後１週間目の茎頂中の細胞群における変異導入が確認された。
２．Ｔ０世代成葉及びＴ１世代幼葉における標的遺伝子変異導入確認
（１）コムギ完熟種子の調製
実施例１３－１－（１）に記載の方法に従った。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１３－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）遺伝子導入
実施例１３－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）遺伝子導入個体の生育
一晩静置した遺伝子導入個体をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、長日（２２℃、１６時間日長）で育成した。２週間生育させた後、第２－３葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室（２４℃、１６時間日長、湿度５０－７０％）にて育成した。
（５）Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
得られた植物体において、標的遺伝子に変異が導入されているかを調査した。第５葉又は止葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、各遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ０．７μＬ、ＫＯＤＦＸＮｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）０．４Ｕ、２×添付バッファー５μＬ、０．４ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマー対各０．２μＭを加え、滅菌蒸留水で合計１０μＬにフィルアップした。
ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、９８℃を１０秒、６８℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３２サイクル行った。ＰＣＲ／制限酵素解析は実施例１３－１－（４）に記載の方法に従った。
野生型株ではＰＣＲ産物が制限酵素により完全に切断されるのに対し、変異が導入された個体ではＰＣＲ産物に切れ残りが生じた。切れ残ったバンドからＤＮＡを抽出・精製し、シークエンス解析にかけ、標的遺伝子配列に変異が導入されているものについて、標的遺伝子変異導入個体と判断した。その結果、全ての標的遺伝子について、Ｔ０世代成葉における標的遺伝子変異導入を確認した（図１２、表１０）。
Figure 2023056018000011
（６）Ｔ１植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
上記（５）で変異が確認されたＴａＱｓｄ１変異導入個体からＴ１種子を回収し、Ｔ１世代植物の幼葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出した。その後の標的遺伝子変異導入の確認は、上記（５）に記載の方法に従った。その結果、Ｔ１世代２系統について、Ｔ１世代幼葉における標的遺伝子変異導入を確認した。図１３に、Ｔ１世代１系統における解析結果を示した。１６個体中９個体について標的遺伝子に変異が導入されていることを確認した。当該遺伝子導入法を用いることで、茎頂中の生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞をゲノム編集することが可能だとわかった。
［実施例１４］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入による標的変異導入
当該遺伝子導入法を利用したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入によって、コムギに内在する標的遺伝子のゲノム編集が可能か否かを検証した。検証するにあたり、ＴａＬＯＸ２遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をコムギ茎頂へ導入した。
１．遺伝子導入後一週間目における標的遺伝子変異導入確認
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ｃｖ．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）の完熟種子を用い、実施例１－１－（１）の方法に従った。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１－（２）に記載の方法に準拠して行った。
（３）ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いた。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いた。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＵＧＣＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＵＣＵＵｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号１３）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
上記各ｇＲＮＡ ４μｇ、Ｃａｓ９タンパク質 ７μｇ、１０×Ｃａｓ９バッファー２μＬ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬを加え、滅菌蒸留水で合計２０μＬにフィルアップした。室温で１５分間静置した後、金粒子７５０μｇまたは１５００μｇを入れ、氷上で１０分間静置した。上清を捨てた後、ＧＦＰ発現用プラスミド（実施例１－１－（３）参照）２．５μｇおよび滅菌蒸留水を３２μＬ加え、これを金粒子／Ｃａｓ９複合体と使用した。なお、金粒子径は０．６μｍとし、金粒子量は１回の撃ち込みあたり、１８７．５または３７５μｇになるように入れ、１プレートあたり４回の撃ち込みを行った。クリーンベンチ内でマクロキャリアの中央に、１．０～１．５ｃｍ角に切った親水性フィルム（３Ｍ、ＳＨ２ＣＬＨＦ）を貼りつけた。これに上記金粒子／Ｃａｓ９複合体を８μＬずつ注ぎ、風乾させた。撃ち込み条件は実施例１－１－（３）に従った。
（４）ＴａＬＯＸ２標的遺伝子配列切断による変異導入の確認
解析は実施例１３－１－（４）に記載の方法に従った。
親水性フィルムを未使用時には、茎頂におけるＧＦＰ蛍光が観察されなかったのに対し、使用時にはＧＦＰ蛍光が観察された（表１１）。さらに、１撃ち込み当たりの金粒子量を１８７．５μｇから３７５μｇ増やすことで、ＧＦＰ蛍光の発現効率が２３．３％から６６．７％に向上した（表１１）。親水性フィルムを使用することで、水系溶媒に分散させた金粒子が効率的に茎頂に導入されることがわかった。ＧＦＰ蛍光が観察された個体について実施例１３－１－（４）に従ってＰＣＲ／制限酵素解析を行った結果、野生型株ではＰＣＲ産物が制限酵素により完全に切断されるのに対し、変異が導入された個体ではＰＣＲ産物に切れ残りが生じた。切れ残ったバンドからＤＮＡを抽出・精製し、シークエンス解析にかけた結果、標的遺伝子配列に変異が導入されていることが確認された（図１４）。その結果、ＴａＬＯＸ２標的遺伝子について、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入後１週間目の茎頂中の細胞群における変異導入が確認された。
Figure 2023056018000012
［実施例１５］当該遺伝子導入法を利用したダイズにおける標的変異導入
ダイズについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。
１．ダイズ完熟種子の調製
ダイズ（フクユタカ、エンレイ）の完熟種子を用い、実施例７－１－（１）に記載の方法に従い調製する。
２．完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例７－１－（２）に記載の方法に従う。
３．遺伝子導入
完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡ発現用プラスミドとして、ｐＴＡＫＮ－２ベクターのマルチクローニングサイトへダイズＵ６プロモーター及びｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄをクローニングする。その後、内部のＢｂｓＩサイトへ標的遺伝子の標的配列を導入し、各ｇＲＮＡ発現用プラスミドとする。
Ｇｌｙｍａ．１０Ｇ２４４４００．１標的配列：ＣＣＴＣＣＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣ （配列番号１５）
Ｇｌｙｍａ．２０Ｇ１５００００．１標的配列：ＣＣＴＣＣＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５）
上記各ｇＲＮＡ発現用プラスミド、Ｃａｓ９遺伝子発現用プラスミド及びＧＦＰ発現用プラスミド（実施例７－１－（３）参照）を金粒子７５０μｇあたり各々５μｇ、２．５μｇ、２．５μｇ入れる。金粒子径は０．６μｍとし、金粒子量は１回の撃ち込みあたり、１８７．５μｇになるように入れる。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実体蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＭＺＦＬＩＩＩ）下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光（励起：４７０／４０ 吸収：５２５／５０）が見られた個体をＲＭ培地（４．３ｇ／Ｌ ＭＳ ｓａｌｔ ，ＭＳ ｖｉｔａｍｉｎ，３％ スクロース，０．５０ｇ／Ｌ ＭＥＳ ，３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｉｘｔｕｒｅ，ナカライテスク），０．３％ ゲルライト，ｐＨ５．７）を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、インキュベーター（２３℃、１６時間日長）で育成する。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例７－２－（１）に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
得られた植物体において、標的遺伝子に変異が導入されているかを調査する。新たに生育した葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、各遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ／制限酵素解析は実施例１３－１－（４）に記載の方法に従って行う。変異が導入された個体をそのまま育成し、次世代の種子を取得することで、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例１６］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるダイズへの標的変異導入
ダイズについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばＧｌｙｍａ．１０Ｇ２４４４００．１遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体を茎頂へ導入する。
１．ダイズ完熟種子の調製
実施例１５－１に記載の方法に従って行う。
２．完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１５－２に記載の方法に従って行う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
ダイズ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＧＵＧＧＣＧＧＡＧＣＣＵＵＧＧＧＣＧＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号１６）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１５－４の記載の方法に従う。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１５－５に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例１７］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるイネへの標的変異導入
イネについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばＯｓＰＤＳ（イネｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をイネ茎頂へ導入する。
１．イネ完熟種子の調製
実施例１０－１に記載の方法に従って行う。
２．完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１０－２に記載の方法に従って行う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
イネ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＵＵＧＧＵＣＵＵＵＧＣＵＣＣＵＧＣＡＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号１７）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１０－４の記載の方法に従う。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１０－５に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例１８］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるリンゴへの標的変異導入
リンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばリンゴＰＤＳ（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をリンゴ茎頂へ導入する。
１．リンゴ茎頂の調製
実施例１１－１に記載の方法に従う。
２．茎頂の露出
実施例１１－２に記載の方法に従う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
リンゴの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＡＣＣＵＧＡＵＣＧＡＧＵＡＡＣＵＡＣＡＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号１８）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。但し、実施例７－１－（３）に記載のＧＦＰベクターを用いる。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１１－４の記載の方法に従う。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１１－５に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例１９］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるジャガイモへの標的変異導入
ジャガイモについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばＳｔＩＡＡ２（ａｎ Ａｕｘｉｎ／Ｉｎｄｏｌｅ－３－Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ）遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をジャガイモ茎頂へ導入する。
１．ジャガイモ茎頂の調製
実施例９－１に記載の方法に従う。
２．茎頂の露出
実施例９－２に記載の方法に従う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
ジャガイモの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＡＵＧＵＵＵＡＧＣＵＣＣＵＵＵＡＣＵＡｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号１９）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。但し、実施例７－１－（３）に記載のＧＦＰベクターを用いる。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例９－（４）の記載の方法に従う。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例２０］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるトウモロコシへの標的変異導入
トウモロコシについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばＺｍＡＬＳ２（トウモロコシａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をトウモロコシ茎頂へ導入する。
１．トウモロコシ茎頂の調製
実施例６－１－（１）に記載の方法に従う。
２．茎頂の露出
実施例６－１－（２）に記載の方法に従う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
トウモロコシの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＣＵＧＣＵＣＧＡＵＵＣＣＧＵＣＣＣＣＡｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号２０）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
［実施例２１］当該遺伝子導入法を利用したＣａｓ９タンパク質導入によるオオムギへの標的変異導入
オオムギについても、本質的にはコムギと同様の手法により標的遺伝子変異導入個体を得ることができる。例えばＨｖＰＭ１９（オオムギＡＢＡ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を標的としたｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の複合体をオオムギ茎頂へ導入する。
１．オオムギ茎頂の調製
実施例８－１－（１）に記載の方法に従う。
２．茎頂の露出
実施例８－１－（２）に記載の方法に従う。
３．ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質導入
オオムギの茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行う。
実施例においては、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ファスマック）の混合物（０．５μｇ／μＬ）を用いる。Ｃａｓ９タンパク質として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 由来ＥｎＧｅｎ Ｃａｓ９ ＮＬＳ（ＮＥＢ）を用いる。
ｃｒＲＮＡ：
ＧＣＵＣＵＣＣＡＣＵＣＵＧＧＧＣＵＣＵＵｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号２１）
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（配列番号１４）
撃ち込み条件は、実施例１４－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織においてＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．遺伝子導入個体の生育
実施例１－２－（４）に記載の方法に従う。
６．Ｔ０植物葉における標的遺伝子変異導入の確認
実施例１５－６に記載の方法に従って、安定的に標的遺伝子に変異が導入された個体を取得することができる。
本発明は、農業、医薬産業、酵素産業などに利用できる。
Ａｌ アリューロン層
Ｅ 胚乳

Claims (15)

  1. 植物のゲノム編集方法であって、微粒子を、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含み、
    前記核酸が、ヌクレアーゼをコードする核酸を含み、
    前記タンパク質が、ヌクレアーゼを含み、
    前記微粒子が、直径０．３μｍ以上０．８μｍ以下である、方法。
  2. 植物のゲノム編集方法であって、微粒子を、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育させ、植物体を得る工程と、該植物体からゲノム編集された植物体を選択する工程とを含み、
    前記核酸が、修飾酵素をコードする核酸を含み、
    前記タンパク質が、ヌクレアーゼを含み、
    前記微粒子が、直径０．３μｍ以上０．８μｍ以下である、方法。
  3. 前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記完熟種子が、その根長が１ｍｍ以下の完熟種子であることを特徴とする、請求項１または３に記載の方法。
  6. 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか１であることを特徴とする、請求項１、３および５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記植物が、ジャガイモであることを特徴とする、請求項２または４に記載の方法。
  8. 前記修飾酵素が、ヌクレアーゼまたはデアミナーゼであることを特徴とする、請求項２、４および７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記核酸が、それぞれが発現するようにプロモーターおよびターミネーターに結合された、少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現し得る核酸およびＣａｓヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記タンパク質がＣａｓヌクレアーゼである、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. インプランタゲノム編集方法である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記茎頂に撃ち込む工程において、前記遺伝子銃に、ストッピングプレート、および前記茎頂を、前記ストッピングプレートと前記茎頂の距離が６ｃｍ以下となるように設置する、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記植物体を得る工程において、選択圧をかけずに生育させる、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記茎頂に前記微粒子を撃ち込む回数は、２回以上である、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 請求項１～１４のいずれかに記載の方法を用いて、ゲノム編集された植物体を製造する方法。
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