WO2005024034A1 - 植物のインプランタ形質転換法 - Google Patents

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WO2005024034A1
WO2005024034A1 PCT/JP2004/013398 JP2004013398W WO2005024034A1 WO 2005024034 A1 WO2005024034 A1 WO 2005024034A1 JP 2004013398 W JP2004013398 W JP 2004013398W WO 2005024034 A1 WO2005024034 A1 WO 2005024034A1
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plant
agrobacterium
transformed
dna
binary vector
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PCT/JP2004/013398
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English (en)
French (fr)
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Mineo Kojima
Hidenari Shioiri
Masahiro Nogawa
Masayuki Nozue
Tsutomu Shimizu
Koichiro Kaku
Original Assignee
Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a plant implanter by Agrobacterium ummefaciens.
  • a method in which a target gene is introduced into a vector and the vector is used to introduce the target gene into a plant genome (Rhodes CA et al., Science, 240: 204-207) Datta, SK, Bio / Technology, 8: 736-740, 1990; Chritou P. et al., Bio / Technology, 9: 957-962, 1991) and (2) oligonucleotides having a desired nucleotide sequence.
  • a method of modifying a target gene by physically introducing it into cells and using the repair mechanism of a plant's native gene (Beetham PR et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 8774-8778, 1999).
  • techniques for introducing a vector containing a target gene into a plant cell include the elect-mouth-poration method (Rhodes CA et al., Science, 240: 204-207, 1989), polyethylene glycol (PEG), and the like. Methods (Datta, SK, Bio / Technology, 8: 736-740, 1990), particle gun method (Chritou P. et al., Bio / Technology 9: 957-962, 1991) A biological method called terium transformation method (JP-A-59-140885) can be mentioned.
  • the Agrobacterium transformation method is characterized by the fact that when a plant is infected by a kind of plant pathogenic bacterium, Agrobacterium, the T-DNA region present on its own Ti plasmid and Ri plasmid is integrated into the plant genome. (Zhu J. et al., J. Bacteriol., 182, 3885-3895, 2000) 0
  • the physical introduction method described above has been used.
  • the agrobacterium transformation method is suitable for monocotyledonous plants despite the fact that many transgenic plants have been produced. It was considered difficult to use. This was due to the low rate of infection of monocotyledonous plants by Agrobacterium, which originally infected dicotyledonous plants. However, subsequent studies have made it possible to transform monocots using the agrobacterium transformation method.
  • a method for transforming monocotyledonous plants into agrobacterium is the binary vector method.
  • this binary vector method can be used for (1) strong pathogenic Agrobacterium (EHA101, EHA105, etc.) having a disarmed Ti plasmid in which the hormone synthesis gene has been removed from T-DNA, and pBI121, etc.
  • Binary a method using a combination with a vector (Klee H., Trends in Plant Science, 5, 446-451, 2000) and (2) a moderately pathogenic Agrobacterium having a disarmed Ti plasmid (LBA4404, GV311 etc.) and superbinary such as pTOK233 — Method using combination of vector (WO 94/00977; Hie i Y.
  • the Agrobacterium which carries the binary vector is modified.
  • the virulent Agrobacterium ammeffaciens A281 strain has a broad host range and higher transformation efficiency than other Agrobacterium strains.
  • An EHA-series Agrobacterium bacterium (EHA10K EHA105) carrying a disarm-type T i plasmid produced from the T i plasmid of the Agrobacterium ammeffaciens A281 strain is used. Utilization of these Agrobacterium enables high-efficiency transformation of monocotyledonous plants such as rice.
  • the binary vector is devised.
  • Patent Document 1 is infected with Agrobacterium. Furthermore, the method was used for the Agrobacterium transformation of Japanese rice (Hiei Y. et al., Plant J., 6, 271-282, 1994). In addition, the embryo-derived callus is infected with Agrobacterium. On the other hand, for indica rice, it was possible to transform the indica rice with high efficiency by the same method as that used for the indica rice by culturing the culture suitable for the indica rice. It is disclosed (JP-A-10-117776)
  • JP-A-2000-342253 Another method for increasing the transformation efficiency of rice has been disclosed (JP-A-2000-342253). According to this method, it has been reported that the transformation efficiency of Agrobacterium mmefaciens LBA4404, which is a combination having low transformation efficiency, and the pIG121_Hm binary vector was increased about 2 to 7 times.
  • An object of the present invention is to provide a plant implanter transformation method that can be performed more simply and efficiently.
  • the present invention includes the following.
  • a method for in planta transformation of a plant which comprises inoculating a wound of a budding part of an embryo in a seed of a plant with Agrobacterium ammefaciens.
  • a method for transforming a plant by inbranta characterized in that the wound is wounded by a wound means having an adherence.
  • the Agrobacterium ummefaciens to be inoculated is an Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain, a PIG12-Hm binary vector containing an Agrobacterium ummefaciens LBA4404 bacterium and a binary vector for plasmid rescue (pBI (I) or (2), wherein the method is selected from the group consisting of LBA4404 bacteria having the Res.
  • the in-Plant transformation method includes a step of absorbing plant seeds, a step of damaging a budding part of an embryo in the seed, and a step of inoculating the wound with Agrobacterium-mmemefaciens. It is.
  • the in-plant evening transformation method according to the present invention is widely applied to plants that generally produce seeds. can do. Therefore, the target plant of the method for transforming an planta according to the present invention is a seed plant including an angiosperm plant and a gymnosperm.
  • Angiosperms include monocots and dicots.
  • the monocotyledonous plant may be of any type, and examples include rice, corn, wheat, oats, turf, sorghum, sugarcane, nonana and pineapple.
  • Examples of dicotyledonous plants include soybean, soybean, tobacco, sugar beet, azuki, buckwheat, kiuri, melon, oilseed rape, radish, lettuce, Alfalpha, endu, sweet potato, and potato.
  • the gymnosperms include pine, cedar, deciduous and cycad.
  • a plant seed is absorbed. Water absorption is achieved by soaking the seeds in water and incubating at a temperature of 15-20 ° C. At this time, the water may be changed once.
  • the water absorption period may be, for example, in the case of rice or corn sorghum, as long as it is a period until the seed embryo becomes white due to water absorption, and is preferably 2 to 3 days.
  • the water absorption period may be a period until the outline of the embryo becomes clear, and is preferably 2 to 3 days.
  • FIG. 1 schematically shows an embryo 2 in a rice seed as an example.
  • the wound may be any as long as it can infect the inoculated Agrobacterium ummefaciens, including a perforation made in the budding part or a cut made in the budding part.
  • FIG. 1 shows a perforated site 1 in a budding part of an embryo 2 in a rice seed.
  • An example of a device for piercing is a needle having a diameter of 0.71 face.
  • the number of perforations is preferably 1 to 2 per budding part.
  • the depth of the perforation is preferably 1 to 2.0 thighs.
  • examples of the cutting tool include cutting tools such as a scalpel and a cutter.
  • the wound of the budding part obtained above is inoculated with Agrobacterium ummefaciens.
  • Inoculation of wounds at the budding part of the embryo with Agrobacterium mmmefaciens Any method can be used as long as it can infect meristem tissue through the wound of the sprouting part, but it can be done using a needle tip, a pipette or a syringe.
  • the method of directly injecting the suspension in the sprout area into the wound of the sprouting area, the method of applying the suspension to the sprout area using a cotton swab soaked with the suspension of agglomerium, and a combination of these methods can be on the other hand, instead of inoculating the seeds of the embryos with the Agrobacterium umme facilien after injuring the budding part of the seeds, the germ germ of the seeds with the water absorbed above is added to the germ of the seeds.
  • the wound may be made by the attached wound means. Any means for wounding can be used as long as it can damage the budding part of the embryo in the seed. For example, a piercing instrument such as a ⁇ 0.71 needle, a pipette, etc.
  • the preparation method of Agrobacterium ummefaciens suspension is as follows. First, the agrobacterium ⁇ mefaciens is cultured with shaking at 28 ° C for 18 hours in an LB liquid medium containing kanamycin, rifampicin, streptomycin, and the like. Then, the culture solution is centrifuged to collect Agrobacterium ummefaciens and washed with water. Further, Agrobacterium ummefaciens is suspended in water so as to have a concentration of 1.0 ⁇ 10 8 cells / ml, and this is used as an Agrobacterium ummefaciens suspension.
  • Agrobacterium mmefaciens infects plants and forms a tumor called crown gall. This is due to the fact that upon infection, a region called the T-DNA region on the Ti plasmid in Agrobacterium-mmeffaciens is transferred into the plant and integrated into the plant genome. Therefore, in order to integrate a foreign gene into a plant genome using UG Pacterium ummefaciens, a foreign gene to be integrated into the plant genome is inserted into the T-DNA region on the Ti plasmid. Next, an Agrobacterium ummev having this T-DNA region When the plant is infected with the H. aciens, the foreign gene can be integrated into the plant genome.
  • the foreign gene may be a gene encoding any protein or peptide.
  • transformed plants can be selected using the expression of the selectable marker gene in the transformed plant as an index.
  • the selectable marker gene include antibiotic resistance genes such as kanamycin and hygromycin, a fluorescent protein (GFP) gene, and a mutant acetolactate synthase (hereinafter referred to as WO02 / 44385).
  • WO02 / 44385 a mutant acetolactate synthase
  • ALS mutant acetolactate synthase
  • the gene encoding the mutant ALS protein disclosed in WO02 / 44385 confers pyrimidinylcaroxy herbicide resistance.
  • the gene encoding the mutant ALS protein when used as a selection marker gene, it can be used in the presence of a pyrimidinylcaroxy herbicide such as bispyr ibac-sodium, pyritiobac-sodium ⁇ pyriminobac. Grow transformed plants. As a result, it can be confirmed that a gene encoding a mutant ALS protein was introduced into a plant that can grow in the presence of a pyrimigelcarpoxy herbicide and transformed. Whether the gene encoding the mutant ALS protein has been integrated into the plant genome is determined by changes in the phenotypic traits of the plant, genomic Southern hybridization or PCR. It can also be confirmed by examining the insertion.
  • a pyrimidinylcaroxy herbicide such as bispyr ibac-sodium, pyritiobac-sodium ⁇ pyriminobac.
  • the Agrobacterium mmefaciens to be inoculated may be any strain as long as it can infect a plant.
  • a non-pathogenic Agrobacterium mmuffaciens may be used. Examples include the M21 mutant strain, Agrobacterium mmefaciens LBA4404 having a PIG12 binary vector, and Agrobacterium mmemefaciens LBA4404 having a plasmid rescue binary vector (pBI-Res).
  • the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant is obtained by mutating the moderately pathogenic Agrobacterium mmefaciens A208 strain (C58 chromosome, nopaline-type T37pTi) with the transposon 5 (Tn5) mutation ( Maj umder P et al.
  • FIG. 2 shows Agrobacterium 2 shows the structure of the Tn5 insertion site in the T-DNA region of the Siensu M21 mutant.
  • the tributane monooxygenase gene involved in indoleacetic acid (IAA) biosynthesis in the T-DNA region of the Ti plasmid ( Tn5 is inserted into the “iaaM gene” below.
  • the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant retains its ability to integrate its own ⁇ -DNA region into the host chromosome, but does not form crown gall.
  • a binary vector can be introduced into the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain from outside and that the ⁇ -DNA on the introduced binary vector is inserted into the genomic DNA of the plant (Maj umder Pla, J. Bioscience and Bioengineering, 90, 328-330, 2000). Therefore, it is possible to introduce a binary vector into which an exogenous gene has been incorporated into an Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain and insert the exogenous gene into the plant genome using this fungus.
  • FIG. 3 shows the structure of the T-DNA region of the pIG12 HHiii binary vector.
  • CaMV 35S-Pro is a CaMV 35S promoter
  • GUS is / 3 - Darukuronidaze gene (hereinafter, "GUS gene” and hump)
  • Hm r is the hygromycin resistance gene .
  • the Agrobacterium mmme faciliens LBA4404 having the plasmid rescue binary vector is a modified PBI121 binary vector (pBI-Res binary) in addition to the aforementioned Agrobacterium mmme facilien LBA4404.
  • plasmid rescue binary vector pBI-Res
  • FIG. 4 shows the structure of the T-DNA region of the plasmid rescue binary vector (pBI-Res).
  • LB is the T-DNA left border sequence
  • RB is the right border sequence.
  • DNA between RB and LB is known to be inserted into the plant genome as T-DNA.
  • 35Sp is the CaMV 35S promoter
  • ori is the replication initiation region derived from the PBR322 plasmid.
  • Kmr is a kanamycin resistance gene
  • Ampr is an ampicillin resistance gene.
  • the CaMV 35S promoter-, the replication initiation region derived from the PBR322 plasmid, and the ampicillin resistance gene are functionally linked. I have. In addition, it contains a kanamycin resistance gene.
  • inoculated seeds are grown into plants under conditions suitable for various plants.
  • inoculated seeds are placed on filter paper laid in a beaker or petri dish. Then place these beakers and dishes in a thermostat and incubate at 22 ° C in the dark, for example, for 8 to 9 days for rice and 2 to 3 days for corn. During this process, Agrobacterium-mmefaciens infect meristems in the embryo. The inoculated seeds after the above treatment can be sown and grown into plants.
  • the inoculated seeds are placed on a beaker or petri dish containing vermiculite or the like.
  • the beakers and dishes are then incubated at 15 to 25 ° C for 2 days. Furthermore, transfer these beaker jars to a refrigerator at 3 ° C to 5 and keep them for 25 days.
  • the low-temperature treatment is referred to as banalization (vernalization treatment).
  • the leaves are 3cn! Grow to ⁇ 5cm.
  • the beakers and petri dishes are taken out of the refrigerator, acclimated to room temperature (15 ° C. to 20 ° C.), and grown into a plant.
  • T-DNA region derived from Agrobacterium ummefaciens is incorporated into the genome of the transformed plant produced by the above procedure.
  • DNA is prepared from a transformed plant, and a DNA-specific primer is designed to perform PCR.
  • the PCR product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis, stained with bromide TC, SYBR Green solution, etc., and the PCR product is detected as a single band.
  • the T-DNA region derived from Agrobacterium ummefaciens was integrated.
  • PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect a PCR product. Further, a method may be adopted in which the PCR product is bound to a solid phase such as a microplate, and the PCR product is confirmed by fluorescence or enzyme reaction.
  • the T-DNA of the PIG121-Hm pinary vector was Incorporated into the genome.
  • the PIG12 Hm binary vector has a hygromycin resistance gene in the T-DNA region. Therefore, it is possible to confirm that the plant has been transformed by selecting the hygromycin B resistance as an index.
  • Agrobacterium ummefaciens LBA4404 having a plasmid rescue binary vector (pBI-Res) is used in the method for transforming an implanter according to the present invention
  • T-DNA and a plant genomic DNA fragment adjacent thereto can be obtained.
  • pBI-Res plasmid rescue binary vector
  • Fig. 5 shows a method of plasmid rescue using the plasmid rescue binary vector-1 (pBI-Res).
  • plasmid rescue is a method of recovering a plant genomic DNA fragment adjacent to T-DNA inserted into the genome of a transgenic plant. This method will be described with reference to FIG.
  • a plasmid vector for plasmid rescue Transform rice with L. bacterium L. mefaciens LBA4404.
  • the T-DNA in the plasmid rescue binary vector (pBI_Res) is integrated into the rice genomic DNA.
  • the digested DNA fragment contains the PBR322 plasmid-derived plasmid. It includes a DNA fragment containing a DNA fragment containing the replication initiation region (ori) and the ampicillin resistance gene (Ampr) and a rice genomic MA fragment adjacent to the T-DNA integrated into rice genomic DNA. Therefore, the obtained digest is subjected to self-ligation and cyclization, and then introduced into E. coli as a plasmid. Next, E. coli transformed with the plasmid having the above structure is selected using ampicillin resistance as an index.
  • a restriction enzyme having no cleavage site in the PBR322 region in the T-DNA region e.g., Sph I
  • the plasmid in the ampicillin-resistant E. coli is separated, and the sequence of the separated plasmid is determined.
  • the determined nucleotide sequence of the DNA adjacent to the T-DNA is subjected to homology analysis such as Blast search. As a result, if it is found that the T-DNA in the plasmid contains a structure in which rice genomic DNA is linked, it is confirmed that the T-DNA has been inserted into the rice genome.
  • the transformation can be confirmed using the change in the phenotypic trait (for example, morphology) of the transformed plant as compared with the non-transformed plant as an index.
  • changes in phenotypic traits of a rice-transformed plant transformed with the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant include the following.
  • examples of changes in the phenotypic traits of the maize-transformed plant transformed using the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain include the following. Compared to untransformed plants,
  • the change in the phenotypic trait of a wheat-transformed plant transformed using the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain may include, for example, yellowing earlier than a non-transformed plant.
  • the mechanism by which the transformed plant exhibits the above-described change in the phenotypic trait when the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain is used is estimated as follows.
  • the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain only the iaaM gene is mutated, and all other genes in the T-DNA region, including those involved in cytokinin biosynthesis, are healthy. Therefore, it is considered that a transformed plant produced by the Agrobacterium 'mmeffaciens M21 mutant synthesizes high levels of cytokinin. As a result, the hormone balance in the transformed plant is disturbed, and the transformed plant is considered to show a change in the phenotypic trait.
  • the phenotypes of rice and wheat transformed with Agrobacterium mmefaciens LBA4404 harboring the plasmid rescue binary vector (pBI-Res) and the pIG12 Hm binary vector have large variations among plant individuals.
  • pBI-Res plasmid rescue binary vector
  • pIG12 Hm binary vector plasmid rescue binary vector
  • the problem of the general transformation method described above can be solved by the above-described implanter transformation method of the present invention. Further, a transformed plant expressing the desired foreign gene can be obtained more easily and efficiently by the in-plane transformation method according to the present invention.
  • T D generation transformed plants of the plant represents the fertility, by crossed with or non-transformed plants to self-pollinate, it is possible to fruition. In this way, the next generation species that inherited the genotype of the transformed plant of the To generation of the plant Many children can be obtained easily.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a perforated site 1 and an embryo 2 in a rice seed.
  • FIG. 2 shows the structure of the Tn5 insertion site in the T-DNA region of the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant.
  • Figure 3 shows the structure of the T-DNA region of the PIG12 Hm binary vector, the DNA fragment spanning the CaMV 35S promoter and the GUS gene in the T-DNA region, and the primers for nested PCR that amplify the DNA fragment. Indicates the corresponding position.
  • Figure 4 shows the structure of the T-DNA region of the plasmid rescue binary vector (pBI_Res).
  • FIG. 5 shows a method of plasmid rescue using a binary vector for plasmid rescue (pBI-Res).
  • FIG. 6 shows photographs of a rice transformed plant (T Q ) and a non-transformed plant (generation 0) 6 months after in plant transformation using an Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain. .
  • FIG. 7 shows photographs of a young plant of a rice transformed plant and a non-transformed plant (first generation) produced with an Agrobacterium mmefaciens M21 mutant 7 days after seeding.
  • FIG. 8 shows photographs of a transformed rice plant and a non-transformed plant (1st generation) produced with the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant 48 days after seeding.
  • FIG. 9 shows photographs of a transformed rice plant (a first-generation plant) and a non-transformed plant (1st generation) produced with the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain 140 days after seeding.
  • Figure 10-1 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the T21 plasmid of Agrobacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR. ', Indicating.
  • FIG. 10-2 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant strain Ti plasmid and the corresponding position of the primer for nested PCR.
  • Fig. 10-3 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant strain Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • Fig. 10-4 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • FIGS. 10-5 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of primers for nested PCR.
  • FIGS. 10 to 6 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain Ti plasmid and the corresponding positions of primers for nested PCR.
  • FIGS. 10-7 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • FIGS. 10 to 8 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of primers for nested PCR.
  • FIGS. 10-9 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant strain Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • FIGS. 10-10 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the A. pacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • Fig. 10-11 shows the results of Agrobacterium ummefaciens M21 mutant Ti Plus The nucleotide sequence of the T-DNA region on the mid and the corresponding position of the primer for nested PCR are shown.
  • FIGS. 10 to 12 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on A. pacterium ummefaciens M21 mutant strain Ti plasmid and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • FIGS. 10 to 13 show the nucleotide sequence of the T-DNA region on the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant Ti plasmid and the corresponding positions of primers for nested PCR.
  • FIG. 11 shows the results of agarose electrophoresis of a PCR product obtained by using the genomic DNA of a rice transformed plant (a rice transformant plant produced by an Agrobacterium ammeffaciens M21 mutant strain) as a type II. ⁇
  • Fig. 12-1 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the pIG12 Hm binary vector and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • Figure 12-2 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the pIG12 Hm binary vector, and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • FIG. 12-3 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the PIG121-Hm binary vector and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • Fig. 12-4 shows the nucleotide sequence of the T-DNA region on the PIG121-Hm binary vector and the corresponding positions of the primers for nested PCR.
  • Fig. 13 shows agarose of a PCR product obtained by converting the genomic DNA of a rice transformed plant (T Q ) produced by Agrobacterium mme faciliens LBA4404 strain having the PIG121-Hm pinary vector into a type II. The result of electrophoresis is shown.
  • Figure 14 shows the results of genomic southern hybridization of a rice transformed plant (T-derived genomic DM fragment) transformed with Agrobacterium umme faciliens LBA4404 having the PIG121-Hm binary vector. Is shown.
  • Fig. 15 shows rice transformed plants ( ⁇ ,) and non-transformed rice plants transformed with Agrobacterium umme faciliens LBA4404 harboring the pIG12 Hm binary vector. Shows a photograph of 6 days after water absorption at the time of quality plant material (first generation) from respectively obtained seeds (T 2 and the second generation) divider Romaishin beta (20 ppm) were germinated in the coexistence.
  • Figure 1 6 is a plasmid rescue binary vector one (PBI-Res) ⁇ Gro Park Terri ⁇ -time Mmefashiensu LBA4404 rice transgenic plant transformed by agent (T [pi) of genomic DNA recovered plasmid than with Sequence (8th to 145th) of the DNA (SEQ ID NO: 15) adjacent to the T-DNA and the sequence hit on the database (partial sequence in accession number AC084764 (1st to No. 134) (SEQ ID NO: 16))
  • FIG. 17 shows seeds of rice transformed plants (T and non-transformed plants (first generation)) grown from seeds obtained from the rice transformed plant ( ⁇ 0 ) of FIG. The picture after 90 days.
  • FIG. 18 shows photographs of a maize-transformed plant (30 days after the implanter transformation using the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain) and a non-transformed plant (0 generation).
  • FIG. 19 shows a photograph of a maize-transformed plant () transformed with an Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain on day 80 after seeding.
  • FIG. 20 shows the results of agarose electrophoresis of a PCR product obtained by converting the genomic DNA of the maize transformed plant shown in FIG.
  • Fig. 21 shows that the cells were transformed with the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain or the Agrobacterium mmefaciens LBA4404 strain having the pIG121-Hm binary vector or the plasmid rescue binary vector (pBI-Res).
  • T Q wheat-transformed plant
  • pBI-Res plasmid rescue binary vector
  • Figure 22 shows the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant or PIG12 Hm binary vector or plasmid rescue binary vector (pBI-
  • FIG. 23 shows a PAG121-Hm binary vector containing a binary vector. Faciens LBA4404 transformed seeds and first-generation wheat (T fl ) and untransformed plants (0 generation), respectively, were germinated in the presence of hygromycin B (50 ppm). The photograph on the 9th day after water absorption is shown. Explanation of reference numerals
  • Rice (Oiyza sa tiva var. Koshihikari) seeds were soaked in tap water and incubated for 48 hours at a temperature of 15 ⁇ -20 ° ⁇ . During this time, the water was changed once. By this treatment, the embryo part became white as the seeds absorbed water. This seed was used in the following experiments.
  • the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant was cultured at 28 ° C. for 18 hours in an LB medium containing kanamycin (50/2 g / ml) and rifampicin (10 g / ml). Next, the cells were collected by centrifugation and washed with water. After washing, the cells were suspended in water to a concentration of 1.0 ⁇ 10 8 cells / ml, and this was used as an inoculum suspension.
  • a small amount of vermiculite was put in a beaker, a filter paper was spread on the beaker, and water was poured into the beaker, and the beaker was inverted to drain excess water.
  • Rice seeds inoculated with the above-mentioned Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain were placed on the filter paper and covered with aluminum foil. This was placed in a 22 ° C incubator and incubated in place for 9 days. After the 9-day incubation, the seeds were immersed in lOOOOppm aqueous solution of claforan (Hoeclist Marion, Roussel) for 1 hour. The seeds were then transferred to a pot containing vermiculite moistened with Hyponex 1000-fold dilution without washing, and grown at about 25 ° C for 1 week.
  • non-transformed plant (0 (zero) generation) water was allowed to adhere to the tip of the needle ( ⁇ . 71 ⁇ ), and this needle was used to make a 1 mm diameter of the rice seed embryo (about 2 mm long) centered on the budding center as described above.
  • depth lM! 1.1.5 min One place from the side in the circle, depth lM! 1.1.5 min, and grown in the same manner as the transformed plant ( ⁇ ) (hereinafter referred to as “non-transformed plant (0 (zero) generation)”).
  • each plant is referred to as a transformed plant and a non-transformed plant (first generation).
  • Example 2 Differences in phenotypic traits between a transformed rice plant and a non-transformed plant transformed by a mutant of Agrobacterium ummefaciens M21
  • FIG. 6 shows photographs of the transformed plant (T Q ) and the non-transformed plant (0 generation) 6 months after the transformation created in Example 1.
  • Table 1 shows the efficiency of rice plant transformation using the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain. The transformation was determined using the change in the phenotype (morphology of the plant) described above as an index. table 1
  • Transformation efficiency of rice in planta using a M21 mutant strain of Agrobacterium ummefaciens (T fl generation) Inoculated water absorption Germinated individuals Transformation Non-transformed number of seeds Number of plants Number of plants *
  • transformed plant (T D) is healthy germination, plant height with the progress of growth showed morphological changes to become larger than the non-transformed plants (0 generation). Also, as can be seen from Table 1, about 80% of the seeds subjected to the in-plan evening transformation germinated. Most of the grown transgenic plants (T Q ) showed the change in the phenotype (morphology) described above, and the transformation efficiency was about 70%.
  • FIG. 7 shows a photograph of the plant.
  • Fig. 8 shows photographs of the transformed plant 48 days later ((a) and (b) are derived from different transformed plants (T Q )) and the untransformed plant (first generation).
  • FIG. 9 shows photographs of the transformed plant and the untransformed plant (first generation) 140 days later. Note that the arrows in FIG. 9 indicate positions where ears are attached.
  • the foliage and root growth of the transformed plant ( ⁇ ,) is slower than that of the non-transformed plant (first generation), and there is little tillering. I got it. Poor root growth is thought to be due to an increase in the amount of cytokinin in the plant due to the cytokinin synthase gene contained in the introduced T-DNA.
  • the transformed plant () differs from the untransformed plant (1st generation) in that it has two ears and a seed yield (weight) of about 10%. Increased.
  • expression trait of transformed plants (T D) was inherited transformation plant object of the next generation (T.
  • Example 3 Agrobacterium ammeffaciens Agrobacterium ammfaciens from a rice-transformed plant transformed with an M21 mutant strain Of genes derived from T-DNA in rice
  • genomic DNA was extracted from the young leaves at the shoot apex of the young plant of the transformed plant produced in Example 1) according to the manufacturer's protocol. Next, the extracted genomic DNA was treated with RNase at 37 ° C for 45 minutes, and then with proteinase K at 55 ° (:, 16 hours.) The genomic DNA solution was then dissolved in phenol, phenol / clonal form (1: 1). Finally, the genomic DNA was subjected to ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in water IOO I. The genomic DNA sample thus prepared was subjected to agarose gel. Electrophoresis was performed to check the purity and amount of DNA.
  • Tn5 is inserted between bases 1,055 and 1,056 of the iaaM gene in the T-DNA region on the Ti plasmid (Fig. 2). ). Therefore, as shown in FIG. 10-1 to FIG. 10_13 and SEQ ID NO: 1 (base sequence of T-DNA region on Ti plasmid of M21 mutant strain A21), the iaaM gene and Tn5
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of T-DNA region on Ti plasmid of M21 mutant strain A21
  • the following nested PCR primers were designed to amplify a spanning DNA fragment (760 bp) (this fragment is unique to this bacterium and does not exist in other bacteria).
  • Formal primer 5'-cgcttacatctatgttggca-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Reverse primer 5'-catgttaggaggtcacatgg-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Formal primer 5'-tgccatcgaccttgcaccat-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Reverse primer 5'-aggttccgttcaggacgcta-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • genomic DNA prepared as described above (about lOOng), 50inM KCI, lOmM Tris- HC1 (pH8.3), 1.5mM MgCl 2, 200 / M dNTP, 1 st of 0.2 M, respectively
  • PCR first denatures at 94 ° C for 1 minute, then -Repeat the cycle consisting of 30 seconds at 94 ° C (denaturation), 1 minute at 55 ° C (annealing), and 1 minute at 72 ° C (extension) for 40 times, followed by extension at 72 ° C for 7 minutes. went.
  • PCR was performed in the same manner as in the first PCR, except that the first PCR reaction solution was used as a type II and primers for the second PCR were used.
  • the second PCR reaction solution (10 ⁇ l) was subjected to agarose gel (1%) electrophoresis, and stained with bromide thidium to confirm the PCR product.
  • the entire DNA of the Agrobacterium .mmefaciens M21 mutant was type III, and PCR was performed under the second PCR conditions described above. The obtained PCR product was used as a positive control.
  • Fig. 11 shows the results of agarose electrophoresis of a PCR product obtained by transforming the genomic DNA of the transformed plant) into type III.
  • Each lane in FIG. 11 is as follows. Lane 1: DNA size marker, Lane 2: Total DNA of A21 mutant M21 mutant (positive control), Lanes 3 to 24: Genomic DNA from different transformed plants ().
  • a 760 bp DNA fragment unique to the present bacterium spanning the Tn5 and iaaM genes in the T-DNA region on the Ti plasmid of the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain was transformed into a transformed plant. ( ⁇ ,) Detected in 11 of 22 individuals. On the other hand, this DNA fragment was not detected in non-transformed plants (first generation).
  • Example 2 Rice 0ryza sa ti va var.
  • Agrobacterium mmefaciens LBA4404 having a PIG121-Hm binary vector was used in place of the M21 mutant strain. Koshihikari) seeds were transformed and grown into plants.
  • the inoculated suspension of Agrobacterium ummefaciens LBA4404 having the pIG121-Hm binary vector was prepared using streptomycin (50 Mg / ml), streptomycin (50 g / ml), and rifampicin.
  • T Q Transgenic rice plant transformed with Agrobacterium umme faciliens LBA4404 having pIG12-Hm binary vector and pIG12-Hm binary from rice-transformed plant Detection of genes derived from one vector
  • Transgenic rice plants (T fl ) transformed by Agrobacterium ummefaschen LBA4404 harboring the PIG12 Hm binary vector are inhibited from growing compared to non-transformed plant (0 generation)
  • leaf primordium is already formed in the embryo part when the seeds of the plant have matured.
  • the primordium up to the third leaf is already formed in the seeds (Hoshikawa Kiyochika: Growth of Anatomical Illustrated Rice, Agricultural and Mountain Fish Village Agriculture Association. January 50, 1980) 1st print issuance). Therefore, in the planta transformation method according to the present invention, it is expected that the plant at the time of the transformation (T fl ) will be in a chimeric state.
  • T 0 from the result of genome analysis of generation of some tissue cells of the plant, the next generation is not possible to determine whether foreign genes into the gate of (generations) genome has been introduced (germline sequence of cells Only the foreign gene inserted into the chromosome is transmitted to the next generation.)
  • the exogenous gene has been introduced into the leaves after the fifth leaf, where the primordium has not yet been formed, the split cells in the apical buds It is considered that a foreign gene has been introduced, and it is expected that the foreign gene will be inherited in the next generation with a high probability.
  • T-DNA derived from the pIG121-Hm binary vector was confirmed by nested PCR using ⁇ A derived from the leaves of the fifth and subsequent leaves of the rice transformed plant (T Q ), and transformed. The efficiency was calculated.
  • the method for isolating genomic DNA and the conditions for nested PCR were the same as in Example 3.
  • the PIG121-Hm binary vector was used as type III, and PCR was performed under the above second PCR conditions.
  • the obtained PCR product was used as a positive control.
  • FIG. 3 FIG. 12-1 to FIG. 12-4, and SEQ ID NO: 6 (base sequence of the T-DNA region on the PIG12 Hm binary vector)
  • the PIG121-Hm T-DNA The following nested PCR primers were designed to amplify a DNA fragment (692 bp) spanning the CaMV 35S promoter and GUS gene.
  • Reverse primer 5'-atgctccatcact tcctgat-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer 5'-agtgaccgcatcgaaacgca-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Fig. 13 shows the results of agarose electrophoresis of a PCR product using the genomic DNA of the transformed plant (T.) as type III.
  • Each lane in Figure 13 was as follows: Lane 1: DNA size marker, Lanes 2 and 3: PIG12 Hm binary vector (positive control), Lanes 4-6: No type II, Lanes 7-14: genomic DNA from different transformed plants (T Q ).
  • a transformed plant in which a DNA fragment spanning the GUS gene was detected was the same as in Example 1. Self-pollinated in a similar manner and brought to fruition. Next, a transformed plant ( ⁇ ,) was grown from the obtained seeds.
  • Genomic DNA was isolated from the grown transformed plant ( ⁇ ) in the same manner as in Example 3, double-digested with PstI / HindIII, and then subjected to agarose gel electrophoresis. Next, the DNA was plotted from an agarose gel after electrophoresis on a HybondN + membrane (Amersham Bioscience) by a conventional method.
  • a DNA fragment corresponding to about 700 bp of the CaMV 35S promoter was amplified by PCR, and this DNA fragment was labeled with 32 P using a BcaBest labeling kit (Yukara) to prepare a probe.
  • FIG. 14 shows the results of the genomics hybridization.
  • each lane indicated by an alphabet is a genomic DNA fragment derived from a different transformed plant.
  • the position of the arrow is the band containing the detected DNA fragment of the CaMV 35S promoter.
  • the PIG121-Hm binary vector has a hygromycin resistance gene in the T-DNA region. Therefore, the transformation of the transformed rice plant (T 2 ) was confirmed using hygromycin resistance as an index.
  • the transformed plant in which a clear band was observed in the genomic southern hybridization in Example 5 (2)) was self-pollinated in the same manner as in Example 1 and allowed to bear fruit.
  • the obtained seeds were grown in an aqueous solution containing or not containing 20 ⁇ 1 of hygromycin B (hereinafter, referred to as “transformed plant (T 2 )”).
  • Non-transformed plants produced by repeating pollination and fruiting twice were grown in the same manner as the transformed plants (T 2 ) (hereinafter referred to as “non-transformed plants (second generation)”).
  • FIG. 15 shows photographs of the transformed plant ( ⁇ 2 ) and the non-transformed plant (second generation) on day 6 after water absorption.
  • Example 8 Plasmid rescue binary one vector (pBI-Res) ⁇ Gro Park Teri having ⁇ -time Mmefashiensu LBA4404 rice form transformant plants transformed with bacterial (T D) Plasmid rescue binary one vector from ( pBI-Res)
  • Genomic DNA was isolated from the flag leaves of the transformed plant (T Q ) produced in Example 7 in the same manner as in Example 3, and digested with SphI.
  • the digest obtained above was obtained.
  • the replication initiation region (ori) derived from the pBR322 plasmid in the plasmid rescue binary vector (pBI-Res) and the ampicillin resistance gene (a DNA fragment containing the A It should contain a DNA fragment linked to the rice genomic DM fragment, so the obtained digest was self-ligated and circularized according to Fig. 5, and then introduced into E. coli as a plasmid.
  • the transformed Escherichia coli was cultured and grown in a medium containing ampicillin. Next, a plasmid was isolated from E. coli in the obtained ampicillin-resistant colony. Using the obtained plasmid as a type III, the following nested PCR was performed to amplify the adjacent rice genomic DNA portion, and its nucleotide sequence was determined.
  • the first PCR used L41 and L27 primers.
  • Primer L41 (sense primer designed based on the sequence of CaMV 35S promoter): 5'-gcgtcatcccttacgtcagt-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Primer L27 Antisense primer designed based on the sequence of ampicillin resistance gene Ampr: 5'-ctgtgagatccagttcgatg-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • PCR was performed using the above primer set in the same manner as in Example 3. However, the PCR in this experiment was first denaturation at 94 ° C for 1 minute, then at 94 ° C for 30 seconds (denaturation), at 58 ° C for 1 minute (annealing), and at 72 ° C for 2 minutes (extension). This cycle was repeated 40 times, followed by extension at 72 ° C for 5 minutes.
  • PCR was performed in the same manner as in the first PCR, except that the first PCR product was used as type I and the following primer set (L-9 / L24) was used.
  • Primer L-9 (a sense primer designed based on the sequence of the CaMV 35S promoter): 5'-tcttgatgagacctgctgcg-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Primer L-24 Antisense primer designed based on the sequence between ampicillin resistance gene Amp 1 "and the right border sequence of T-DNA): 5'-tggccgtcgttttacaacgt-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • the second PCR product was converted into type III, and DNA sequencing analysis was performed using the above primer L-9 as a sequence primer.
  • Figure 16 shows the partial sequence (8th to 145th) of the PCR product (SEQ ID NO: 15) and the data The alignment with the sequence hit on the base (partial sequence (first to 134th in accession number AC084764) (SEQ ID NO: 16)) is shown.
  • n represents a, c, g, or t (location: 37, 83, 112, 136, 150, 152, 157, 180, 197, 200, 204, 212, 215 and 216).
  • the rice-derived sequence (accession number AC084764) (SEQ ID NO: 16) was compared with the partial distribution in the PCR product (SEQ ID NO: 15). I dropped it. From this result, it was found that a rice genomic DNA fragment was ligated adjacent to the T-DNA in the plasmid recovered from the genomic DNA of the transformed rice plant (To). Therefore, it was shown that the T-DNA region of the plasmid rescue binary vector (pBI_Res) was inserted into the rice genomic DNA.
  • pBI_Res T-DNA region of the plasmid rescue binary vector
  • Example 9 Transformed rice ( ⁇ ⁇ ) and non-transformed plants (No. 1) transformed by Agrobacterium ummefaciens LBA4404 having a binary vector for plasmid rescue (pBI-Res) Phenotype)
  • Fig. 17 shows photographs of transformed plants ( ⁇ and untransformed plants (1st generation)) 90 days after seeding.
  • the transformed plant () showed the phenotype of higher plant height compared to the non-transformed plant (first generation).
  • Example 11 1 Maize by Agrobacterium ummefaciens M21 mutant
  • the corn (Zea mays var. Calcorn) seeds were washed 2-3 times with tap water to remove the red fungicide on the seed coat.
  • the seeds were immersed in tap water and incubated at 25 ° C for 3 days. During this time the water was changed once. By this treatment, the seeds absorbed water and the embryo part became white. This seed was used for the following experiments.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, an inoculum suspension of Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain was prepared.
  • An inoculum suspension of the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant was attached to the tip of a needle ( ⁇ 0.71 thigh). Using this needle, the embryo (approximately 1 cm long) germ part of the corn seed (the seed is located above the central part of the embryo when the cap is placed down) from above 2 places, depth lmn! ⁇ 1.5mm drilled Thereafter, the bacterium was applied to the perforated site using a cotton swab soaked with the inoculated suspension of the Agrobacterium ummefasciens M21 mutant strain.
  • filter paper was spread in a petri dish, and the filter paper was moistened with water. Maize seeds inoculated with the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain were placed on top of this, and the dishes were covered. This was placed in a 25 ° C thermostat and incubated at the site for 2 days.
  • transgenic plant eg is crossed with a non-transformed plant (0 generation) inoculated with LBA4404 bacteria that does not have the binary vector.
  • the seeds obtained by the cultivation and fruiting were grown under the same growth conditions as the parent generation (hereinafter referred to as “transformed plant ()”).
  • transformed plant () seeds obtained by crossing a non-transformed plant (0 generation) with another non-transformed plant (0 generation) and setting the seed were grown under the same growth conditions as the parent generation.
  • untransformed plant (first generation) seeds obtained by crossing a non-transformed plant (0 generation) with another non-transformed plant (0 generation) and setting the seed were grown under the same growth conditions as the parent generation.
  • FIG. 18 shows photographs of a transformed plant (30 days after the transformation) and a non-transformed plant (0 generation).
  • Table 2 shows the efficiency of corn inbranta transformation using the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain.
  • the transformed plant (T fl ) in contrast to the case of rice, was untransformed at the early stage of growth.
  • the plant height was larger and the stem thicker than (0 generation).
  • the transformation efficiency was 100% using the change in phenotype (morphology) as an index. .
  • FIG. 19 shows photographs of the transformed plant and the untransformed plant of the generation 80 days after seeding.
  • the photograph of the plant in FIG. 19 shows the following plant.
  • Non-transformed plant Non-transformed plant (1st generation)
  • Transformed plant Cross between transformed plant (T D ) and non-transformed plant (0 generation) Transformed plants derived from seeds harvested from non-transformed plants (0 generations) after transformation
  • Transformed plants ⁇ ,
  • Transformed plants T Q
  • T beta Transformed plants body (0 generation) after the was allowed to cross, transformed plants derived from the seeds harvested from transformed plants (T beta) (T,).
  • Example 13 Detection of a gene derived from an Agrobacterium mme faciens T-DNA transformed from a maize transformed plant transformed with an Agrobacterium mmme fascients M21 mutant strain
  • FIG. 20 shows the results of agarose gel electrophoresis of a PCR product obtained by converting ⁇ to ⁇ .
  • a 760 bp DNA fragment unique to the present bacterium spanning the Tn5 and iaaM genes in the T-DNA region on the Ti plasmid of the Agrobacterium ⁇ mefaciens M21 mutant strain was transformed. Detected in 8 out of 12 individuals. This DNA fragment was not detected from the non-transformed plant.
  • the transformed plant (T expression phenotype shown in Example 12 was determined based on the expression of the T-DNA region on the Ti plasmid derived from the Agrobacterium ummefaciens M21 mutant strain on the maize chromosome. Attributed to insertion.
  • Example 15 Wheat planta with Agrobacterium mmefaciens LBA4404 bacteria having A21 mutant strain or PIG121-Hm binary vector or plasmid rescue binary vector (pBI-Res) Transformation
  • Seeds of wheat (Triticum aestivum L. var. Shi ranekomugi) were immersed in tap water and incubated at a temperature of 15 ° C to 20 ° C for 40 hours. This treatment allows the seeds to absorb water Then the outline of the embryo part becomes clear. This seed was used for the following experiments.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the Agrobacterium 'mmefaciens LBA4404 containing the Agrobacterium mmefaciens M21 mutant strain and the PIG12 Hm binary vector or the plasmid vector for plasmid rescue (pBI-Res) was used. An inoculated suspension of the bacteria was prepared.
  • the inoculum suspensions of the three species of Agrobacterium ⁇ mmefaciens prepared in (2) above were each attached to the tip of a needle ( ⁇ 0.71 marauder), and the water was absorbed in (1) using this needle.
  • the wheat seeds were pierced once from the top in the center of the embryo part (about 2 thighs) in a depth of 1 thigh to 1.5 mounds.
  • vermiculite was placed in a beaker, and water was poured and wetted. Wheat seeds inoculated with each of the above three types of Agrobacterium ummefaciens are placed on this, and the dried vermicellites are thinly covered on the seeds. Incubated at C-20 ° C for 2 days. After 2 days of incubation, the above beaker was transferred to a refrigerator at 3 ° C to 5 ° C and kept for 25 days (Banari Zeission: During this time, the leaves expanded to 3cn! ⁇ 5cm). After the panalize, remove the beaker from the refrigerator and acclimate it to room temperature (15 ° C to 20 ° C).
  • T. transformed plant
  • Example 16 Wheat transformed with Agrobacterium mmefaciens LBA4404 having A21 mutant M21 mutant strain or pIG121-Hm binary vector or plasmid rescue binary vector (pBI-Res). Differences in phenotypic traits between transformed and untransformed plants
  • FIG. 21 shows photographs of the transformed wheat plant (T fl ) and the non-transformed plant (0 generation) produced in Example 15 about 4 months after transplantation into the pot.
  • T fl transformed wheat plant
  • non-transformed plant (0 generation) produced in Example 15 about 4 months after transplantation into the pot.
  • ten transformed plants g or non-transformed plants (generation 0) are transplanted, respectively.
  • the transformed plant (T Q ) and the non-transformed plant (0 generation) were each self-pollinated and allowed to set.
  • 10 seeds obtained from the transformed plant (T Q ) and the non-transformed plant (0 generation) were randomly selected and cultivated under the same growth conditions as the parent generation (To generation). (Hereinafter, these are referred to as “transformed plants ()” and “untransformed plants (first generation),” respectively).
  • Fig. 22 shows photographs of the transformed plant (),) and the untransformed plant (1st generation) 11 months after sowing. In each pot shown in FIG. 22, ten transformed plants () or non-transformed plants (first generation) are cultivated.
  • each transformed plant exhibited a phenotypic trait of lower seed weight (yield) than the untransformed plant (first generation).
  • Example 17 Evaluation of hygromycin resistance of a wheat-transformed plant (T was hygromycin-resistant) transformed by Agrobacterium medmefaciens LBA4404 having pIG12-Hm binary vector
  • the wheat-transformed plant () and the non-transformed plant (0 generation) transformed by Agrobacterium ummefaciens LBA4404 having the pIG121_Hm binary vector were each self-pollinated and allowed to bear fruit.
  • seeds obtained from the transformed plant (T Q ) and the untransformed plant (generation 0), respectively, were grown in an aqueous solution containing or not containing 50 ⁇ of hygromycin B.
  • Fig. 23 shows photographs of a transformed plant (9th day after the start of water absorption) and a non-transformed plant (1st generation).
  • the pIG12 Hm binary vector has a hygromycin resistance gene in the T-DNA region. Therefore, it was considered that the T-DNA introduced by Agrobacterium umemefaciens LBA4404 having the PIG121-Hm binary vector was inserted into wheat genome and inherited in the next generation.
  • a method for transforming a plant which is simpler and more efficient in obtaining a plant transformant.
  • Plants that are difficult to transform due to difficulty in cultivation and regeneration can be transformed with low cost and high efficiency. Therefore, according to the present invention, it is possible to produce a plant crop having an economically and agriculturally value-added value.
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the T-DNA region on Agrobacterium mmefaciens M21 mutant Ti plasmid.
  • SEQ ID Nos: 2 to 5 and 7 to 14 are primers.
  • SEQ ID NO: 6 is the nucleotide sequence of the T-DNA region on the PIG121-Hm binary vector.
  • SEQ ID NO: 15 is a PCR product.
  • n represents a, c, g or t (location: 37, 83, 112, 136, 150, 152, 157, 180, 197, 200, 204, 212, 215 and 216) ).

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Abstract

植物の種子における胚の出芽部の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物のインプランタ形質転換法を提供する。

Description

明 細 書 植物のインプランタ形質転換法 技術分野
本発明は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスによる植物のインプランタ
(in planta)形質転換法に関する。 背景技術
一般的な植物の形質転換法としては、 （1)目的遺伝子をベクターに導入し、 そ のベクターを用い、 目的遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法 （Rhodes C.A.ら， Science, 240:204-207, 1989; Datta, S. K.， Bio/Technology, 8:736-740, 1990; Chritou P.ら， Bio/Technology, 9:957-962， 1991) 及び（2)所望の塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドを物理的に細胞内へ導入して、 植物が元来持つ遺伝子の 修復機構を利用して、 標的遺伝子を改変する方法 （Beetham P.R.ら， Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 8774-8778, 1999) の 2つの方法に大別される。 （1)の方法にお いて、 目的遺伝子を含むベクターを植物細胞へ導入する技術としては、 エレクト 口ポレーシヨン法 （Rhodes C.A.ら， Science, 240:204-207, 1989) 、 ポリエチレ ングリコール (PEG) 法 (Datta, S. K. , Bio/Technology, 8:736-740, 1990) 、 パーティクルガン法 (Chritou P.ら， Bio/Technology 9:957-962, 1991) 等の物 理的導入方法及びァグロパクテリゥム形質転換法 （特開昭 59- 140885号公報） と 呼ばれる生物学的な方法を挙げることができる。
ァグロパクテリゥム形質転換法は、 植物病原細菌の一種であるァグロパクテリ ム菌が植物に感染すると、 自らが持つ Tiプラスミドゃ Riプラスミド上に存在する T-DNA領域を植物のゲノム中へ組み込む性質を利用する （Zhu J. ら， J. Bacteriol. , 182, 3885-3895, 2000) 0
従来、 イネやトウモロコシ等の単子葉植物の形質転換法においては、 上記で説 明した物理的導入方法が使用されていた。 一方、 ァグロパクテリゥム形質転換法 は、 双子葉植物で多くの形質転換植物が作出されたにも拘らず、 単子葉植物に適 用することは難しいと考えられていた。 この原因は、 元来双子葉植物に感染する ァグロパクテリゥム菌の単子葉植物への感染率が低いことに起因した。 しかしな がら、 その後の研究により、 ァグロパクテリゥム形質転換法を用いて単子葉植物 を形質転換することが可能となってきた。
単子葉植物のァグロパクテリゥム形質転換法としては、 バイナリーベクター法
(特開昭 60- 70080号公報） が挙げられる。 さらに、 このバイナリーベクター法は、 (1) T- DNAからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型 Tiプラスミドを有 する強病原性ァグロバクテリゥム菌 （EHA101、 EHA105等） と pBI 121等のバイナリ —ベクタ一との組み合わせを利用する方法 （Klee H. , Trends in Plant Science, 5, 446-451, 2000) 及び（2)デイスアーム型 Tiプラスミドを有する中程度の病原 性ァグロパクテリゥム菌 （LBA4404、 GV311等） と pTOK233等のスーパーバイナリ —ベクターとの組み合わせを利用する方法 （国際公開第 94/00977号； Hie i Y.ら， Plant J. , 6, 271-282, 1994) の 2つの方法に大別される。 （1)の方法においては、 バイナリ一ベクタ一を担持することになるァグロバクテリウム菌に工夫を施す。 強病原性のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス A281株は、 宿主範囲が広く、 他のァグロパクテリム菌よりも形質転換効率が高い。 このァグロパクテリゥム · ッメファシエンス A 281株が有する T iプラスミドより作出されたデイスアーム型 T i プラスミドを担持する EHA系列のァグロパクテリゥム菌 (EHA10 K EHA105) を利 用する。 これらのァグロパクテリゥム菌を利用することでイネなどの単子葉植物 の高効率の形質転換が可能となる。 一方、 （2)の方法においては、 バイナリーべ クタ一に工夫を施す。 バイナリーベクターに vi rBや virG等の病原性に関与する遺 伝子を導入する。 これらのバイナリ一ベクターを利用することで、 ァグロバクテ リゥム菌が強病原性菌でなくとも単子葉植物の高効率での形質転換が可能となる。 一方、 例えばイネのァグロパクテリゥム形質転換法においては、 脱分化過程に あるか若しくは脱分化した培養細胞 （Hiei Y. ら， Plant J. , 6, 271-282, 1994) 、 種子から取り出された未熟胚 （Hie i Y. ら， Plant J. , 6， 271-282, 1994) 、 或いは籾殻除去後に人為的な操作を受けていない状態で培養された種子
(特許文献 1 ) にァグロバクテリウム菌を感染させる。 さらに、 日本型イネのァ グロバクテリゥム形質転換法 (Hiei Y.ら， Plant J. , 6, 271-282, 1994) にお いては、 胚由来カルスにァグロバクテリウム菌を感染させる。 一方、 インド型ィ ネに関しては、 培養方法をィンド型イネに適したものにすることにより日本型ィ ネと同様な方法でィンド型イネを高効率で形質転換することが可能となったこと が開示されている (特開平 10- 117776号公報)
また、 別のイネの形質転換効率を高める方法も開示されている （特開 2000 - 342253号公報） 。 この方法によれば、 形質転換効率の低い組み合わせであるァグ ロバクテリム ·ッメファシエンス LBA4404菌と pIG121_Hmバイナリーベクターとに よる形質転換効率が 2〜7倍程度高まったことが報告されている。
以上のようにイネに代表される単子葉植物のァグロパクテリゥム形質転換法は、 近年著しく進歩し、 形質転換効率も飛躍的に高まって来た。 しかしながら、 この ような形質転換法には以下の問題点がある。 まず第一に、 滅菌条件下での作業が 必要なことである。 第二は、 長期間かかる点である。 第三は、 組織培養中に、 体 細胞突然変異 （ソマクローナル変異） が頻繁に生じる点である。 特許文献 1 特開 2001- 29075号公報 発明の開示
そこで、 植物に広く適用でき、 簡便で効率が高く、 かつ体細胞突然変異等が生 じない形質転換法が構築できれば、 有用植物の育種に貢献でき、 分子農業の発展 に寄与することができる。
本発明は、 より簡便でかつ効率的に行うことのできる植物のインプランタ形質 転換法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 植物の種子における胚の出芽 部の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種することで、 植物が効率 良く形質転換されることを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 以下を包含する。
( 1 ) 植物の種子における胚の出芽部の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシ エンスを接種することを特徴とする、 植物のインプランタ形質転換法。
( 2 ) 植物の種子における胚の出芽部に、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシェ ンスを付着させた創傷手段により傷をつけることを特徴とする、 植物のインブラ ンタ形質転換法。
(3) 前記植物が単子葉植物であることを特徴とする、 （1) 又は （2) 記載 の植物のインプランタ形質転換法。
(4) 前記出芽部が、 胚の出芽部中央、 胚の幼芽部分及び胚の中央部から成る 群より選択されるものである、 （1) 又は （2) 記載の植物のインプランタ形質 転換法。
(5) 前記接種前に植物の種子を吸水させる工程を含む、 （1) 記載の植物の インプランタ形質転換法。
(6) 前記創傷前に植物の種子を吸水させる工程を含む、 （2) 記載の植物の インプランタ形質転換法。
(7) 吸水期間が、 2〜3日間であることを特徵とする、 （5) 又は （6) 記載 の植物のィンプランタ形質転換法。
(8) 前記胚の出芽部に傷をつける工程を含む、 （1) 記載の植物のインブラ ンタ形質転換法。
(9) 前記傷が穿孔であることを特徴とする、 （1) 又は （2) 記載の植物の インプランタ形質転換法。
(10) 接種するァグロバクテリゥム ·ッメファシエンスが、 ァグロパクテリ ゥム ·ッメファシエンス M21変異株、 PIG12卜 Hmバイナリーベクタ一を有するァグ ロバクテリウム ·ッメファシエンス LBA4404菌及びプラスミドレスキュ一用バイ ナリ一ベクタ一（pBI- Res)を有する LBA4404菌から成る群より選択されるものであ る、 （1) 又は （2) 記載の植物のインプランタ形質転換法。
(1 1) 前記接種がァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を塗布する ことである、 （1) 記載の植物のインプランタ形質転換法。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインプラン夕形質転換法においては、 植物の種子を吸水させるェ 程、 次に種子における胚の出芽部に傷をつける工程、 傷にァグロバクテリウム - ッメファシエンスを接種する工程が含まれる。
本発明に係るインプラン夕形質転換法は、 広く一般に種子を生じる植物に適用 することができる。 従って、 本発明に係るインプランタ形質転換法の対象植物は、 被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。 被子植物には、 単子葉植物及び双 子葉植物が含まれる。 単子葉植物としては、 いずれの種類であってもよいが、 例 えばイネ、 トウモロコシ、 コムギ、 ォォムギ、 シバ、 ソルガム、 サトウキビ、 ノ ナナ及びパイナップルなどが挙げられる。 また、 双子葉植物としては、 ダイズ、 ヮ夕、 タバコ、 サトウダイコン、 ァズキ、 ソバ、 キユウリ、 メロン、 ナタネ、 ダ イコン、 レタス、 アルフアルファ、 エンドゥ、 サツマィモ及びジャガイモなどが 挙げられる。
—方、 裸子植物としては、 マツ、 スギ、 イチヨウ及びソテツなどを挙げられる。 本発明に係るインプランタ形質転換法では、 まず植物の種子を吸水させる。 吸 水は、 種子を水に浸種し、 15〜20°Cの温度でインキュベートすることにより行わ れる。 この際、 一度、 水を交換してもよい。 吸水期間は、 例えば、 イネやトウモ 口コシの場合には、 吸水により種子の胚が白色を呈するまでの期間であればよく、 好ましくは 2〜3日間である。 一方、 例えばコムギの場合には、 吸水期間は、 胚部 分の輪郭が明瞭になるまでの期間であればよく、 好ましく 2〜3日間である。 この 吸水工程により、 種子を柔らくすることで胚の出芽部に傷をつけることができる。 次いで、 上記で吸水させた種子における胚の出芽部に傷をつける。 ここで、 「出芽部」 とは、 出芽の際に芽が出現する部位を意味する。 出芽部としては、 例 えば、 胚の出芽部中央、 胚の幼芽部分及び胚の中央部が挙げられる。 なお、 図 1 には、 例としてイネの種子における胚 2が模式的に示されている。 傷は、 接種す るァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスが感染できるものであればいずれのも のでよいが、 出芽部に穿設された穿孔または出芽部に切りつけられた切り口が挙 げられる。 図 1には、 イネの種子における胚 2の出芽部内の穿設部位 1が示され ている。 穿設するための器具としては、 例えば Φ 0. 71顏の針が挙げられる。 また、 穿孔の個数は出芽部あたり 1〜2個であることが好ましい。 さらに、 穿孔の深さは 1〜2. 0腿であることが好ましい。 一方、 切りつけるための器具としては、 例えば メスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。
次いで、 上記で得られた出芽部の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス を接種する。 胚の出芽部の傷へのァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスの接種 方法は、 出芽部の傷を通して分裂組織にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス が感染できるものであればいずれのものでよいが、 針の先端、 ピペット又は注射 器などを用いてァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を出芽部の傷に直 接注入する方法、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を浸した綿棒を 用いて出芽部の傷に塗布する方法、 並びにこれらの方法の組合せが挙げられる。 一方、 種子における胚の出芽部に傷をつけた後にァグロパクテリゥム ·ッメフ ァシエンスを接種するのではなく、 上記で吸水させた種子における胚の出芽部に、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを付着させた創傷手段により傷をつけて もよい。 創傷手段としては、 種子における胚の出芽部に傷をつけることができる ものであればいずれのものであってよいが、 例えば Φ 0. 71匪の針などの穿設する ための器具、. ピペット、 注射器、 並びにメスおよびカッターなどの切断器具が挙 げられる。 例えば、 創傷手段として針を用いる場合には、 針の先端部にァグロバ クテリウム ·ッメファシエンス懸濁液を付着させる。 本工程により、 胚の出芽部 に傷をつけると同時にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを胚の出芽部に接 種することができる。
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液の調製方法は、 以下の通りであ る。 まずァグロパクテリゥム 'ッメファシエンスをカナマイシン、 リファンピシ ン及びストレプトマイシンなどを含む LB液体培地中で 28°Cで 18時間振とう培養す る。 次いで培養液を遠心分離することでァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス を回収し、 水で洗浄する。 さらに 1. 0 X 108菌体/ mlの濃度となるようにァグロバ クテリウム ·ッメファシエンスを水に懸濁し、 これをァグロバクテリゥム ·ッメ ファシエンス懸濁液とする。
一般に、 ァグロバクテリウム ·ッメファシエンスは、 植物に感染してクラウン ゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。 これは、 感染の際に、 ァグロバクテリウム - ッメファシエンス中の Tiプラスミド上の T-DNA領域と呼ばれる領域が植物中に移 行し、 植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。 そこで、 ァグ 口パクテリゥム ·ッメファシエンスを用いて、 外来遺伝子を植物ゲノムに組み込 むためには、 Tiプラスミド上の T-DNA領域中に植物ゲノム中に組み込みたい外来 遺伝子を挿入する。 次いでこの T-DNA領域を有するァグロパクテリゥム ·ッメフ ァシエンスを植物に感染させると、 植物ゲノム中に該外来遺伝子を組込むことが できる。 外来遺伝子としては、 いかなるタンパク質またはペプチドをコードする 遺伝子であっても良い。 なお、 目的遺伝子と選抜マーカー遺伝子の双方を外来遺 伝子とした場合には、 形質転換された植物における該選抜マーカー遺伝子の発現 を指標として形質転換植物体を選抜することができる。 選抜マーカー遺伝子とし ては、 例えば、 カナマイシン又はハイグロマイシンなどに対する抗生物質耐性遺 伝子、 蛍光タンパク質 （GFP) 遺伝子及び国際公開第 02/44385号に開示された変 異型ァセト乳酸シン夕一ゼ（以下、 「ALS」 と呼ぶ）タンパク質をコードする遺伝 子などが挙げられる。 なお、 国際公開第 02/44385号に開示された変異型 ALSタン パク質をコードする遺伝子は、 ピリミジニルカルポキシ系除草剤耐性を付与する。 従って、 該変異型 ALSタンパク質をコードする遺伝子を選抜マーカ一遺伝子とし て使用した場合には、 bi spyr ibac-sod ium, pyri t iobac-sodium^ pyriminobacな どのピリミジニルカルポキシ系除草剤の存在下で形質転換された植物を生育させ る。 その結果、 ピリミジェルカルポキシ系除草剤の存在下で生育できる植物には、 変異型 ALSタンパク質をコードする遺伝子が導入され、 形質転換されたことが確 認できる。 また、 変異型 ALSタンパク質をコードする遺伝子が植物ゲノムに組み 込まれたか否かは、 植物体の表現形質の変化やゲノムサザ一ンハイブリダィゼー シヨン或いは PCRによって、 これらの遺伝子のゲノム中への挿入を調べることで も確認することができる。
本発明に係るインプランタ形質転換法において、 接種するァグロバクテリゥ ム ·ッメファシエンスとしては、 植物に感染できる株であればいずれのものでよ いが、 例として、 非病原性のァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21変異株、 PIG12卜 Ηηιバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌及びプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（pB I- Re s)を有するァ グロバクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌を挙げることができる。
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株は、 中程度の病原性のァグ ロバクテリウム ·ッメファシエンス A208株（C58染色体, ノパリン型 T37pTi)をト ランスポゾン 5 (Tn5)変異によって突然変異させることで得られる（Maj umder Pら，
J B iosc i B ioeng 90： 328-331, 2000)。 図 2は、 ァグロバクテリウム ·ッメファ シエンス M21変異株の T-DNA領域における Tn5の挿入部位の構造を示す。 図 2に示 されるように、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株においては、 Tiプラスミドの T- DNA領域にあるィンドール酢酸（IAA)生合成に関与するトリブト ファンモノォキシゲナーゼ遺伝子（以下、 「iaaM遺伝子」 と呼ぶ）に Tn5が挿入さ れている。 ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株は、 それ自身の Τ - DNA領域を宿主染色体に組み込む能力を保持しているが、 クラウンゴールを形成 しない。 なお、 ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株に外部からバ イナリーベクターを導入できること及び導入されたバイナリーベクター上の Τ- DNAは植物のゲノム DNA内に挿入されることが証明されている （Maj umder Ρら， J. B iosc ience and Bioengineering, 90, 328-330, 2000) 。 従って、 外来遺伝子を 組み込んだバイナリーベクタ一をァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M21変 異株に導入し、 この菌を用いて植物ゲノムに外来遺伝子を挿入することが可能で ある。
一方、 pIG12卜 Hmバイナリ一ベクタ一を有するァグロパクテリゥム ·ッメファ シエンス LBA4404菌は、 デイスアーム型 Πプラスミドを含むァグロバクテリウ ム 'ッメファシエンス LBA4404菌に、 改変型 ρΒΠ 21バイナリーベクター （PIG121- Hmバイナリーベクタ一） を導入した菌である。 図 3は、 pIG12 HHiiiバイナリ一ベ クタ一の T-DNA領域の構造を示す。 なお、 図 3中、 CaMV 35S- Proは CaMV 35Sプロ モーターであり、 GUSは /3 -ダルクロニダーゼ遺伝子 （以下、 「GUS遺伝子」 と呼 ぶ） であり、 そして Hmrは、 ハイグロマイシン耐性遺伝子である。 図 3に示され るように、 pIG12卜 Hmバイナリ一ベクタ一においては、 T- DNA中の GUS遺伝子にィ ントロンが揷入され、 さらにハイグロマイシン耐性遺伝子が追加されている。 また、 プラスミドレスキュー用バイナリ一ベクター（pBI- Res)を有するァグロ バクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌は、 上記ァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌に、 改変型 PBI 121バイナリ一ベクター （pBI- Resバイナリ
—ベクター；以下、 「プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（pBI- Res)」 と呼ぶ） を導入した菌である。 プラスミドレスキュー用バイナリ一ベクター
(pBI-Res)は pBI 121バイナリ一ベクターの jS -ダルクロニダーゼ遺伝子 （GUS遺伝 子） の部位を、 PBR322プラスミド由来の複製開始領域 （ori) とアンピシリン耐 性遺伝子 （Ampf遺伝子） とを含む DNA断片で置換したバイナリーベクターである。 本菌で植物を形質転換すると、 作出された形質転換植物のゲノム中に挿入された T - DNAに隣接する植物のゲノム DNAを容易に回収 （レスキュー） することができる。 図 4は、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI- Res) の T- DNA領域 の構造を示す。 なお、 図 4中、 LBは、 T- DNA左境界配列で、 RBは右境界配列であ る。 RBと LBとの間の DNAが T- DNAとして、 植物ゲノムに挿入されることがわかって いる。.また、 35Spは CaMV 35Sプロモーターであり、 oriは PBR322プラスミド由来 の複製開始領域である。 そして、 Kmrはカナマイシン耐性遺伝子であり、 Amprは アンピシリン耐性遺伝子である。 図 4に示されるように、 プラスミドレスキュー 用バイナリーベクタ一 （pBI- Res) の T- DNA領域においては、 CaMV 35Sプロモータ ―、 PBR322プラスミド由来の複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子が機能的 に連結している。 さらに、 カナマイシン耐性遺伝子が含まれている。
次いで、 上記のようにァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種した植物 の種子（以下、 「接種種子」 と呼ぶ）を、 各種植物に応じた条件下で植物体へ生育 させる。 '
例えば、 イネやトウモロコシの場合には、 接種種子を、 ビーカ一やシャーレな どの中に敷いたろ紙上に置床する。 次いでこれらのビーカーやシャーレなどを恒 温器に入れ、 暗所、 22°Cで、 例えばイネの場合には 8〜9日間、 トウモロコシの場 合には 2〜3日間インキュベートする。 この処理の間に、 ァグロバクテリウム -ッ メファシエンスが胚中の分裂組織へ感染する。 上記の処理後の接種種子を播種し、 植物体へと生育させることができる。
一方、 例えば、 コムギの場合には、 接種種子を、 バーミキユライト等を含有す るビーカ一やシャーレなどに置床する。 次いで、 これらのビ一カーやシャーレな どを、 15で〜 25°Cで 2日間インキュベートする。 さらに、 これらのビーカーゃシ ヤーレなどを、 3°C〜5 の冷蔵庫へ移し、 25日間保持する。 当該低温処理は、 バ ーナリゼ一シヨン（春化処理）と呼ばれる。 当該パーナリゼ一シヨンの間に、 葉は 3cn！〜 5cmに生育する。 次いで、 パーナリゼーシヨン処理後、 これらのビーカ一や シャーレなどを冷蔵庫から取り出し、 室温（15°C〜20°C)に馴化した後、 植物体へ と生育させることができる。 上記の操作により作出した形質転換植物体のゲノムに、 ァグロバクテリゥム · ッメファシエンス由来の T-DNA領域が組み込まれたかどうかの確認は、 PCR法、 サ ザンハイブリダィゼーシヨン法等によって行うことができる。 例えば、 PCR法の 場合には、 形質転換植物体から DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行う。 次いで、 PCR産物についてァガ口一スゲル電気泳動、 ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動またはキヤピラリー電気泳動等を行い、 臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、 そして 1本のバンドとして PCR産物を検出することによ り、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス由来の T-DNA領域が組み込まれたこ とを確認する。 また、 予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて PCRを 行い、 PCR産物を検出することもできる。 さらに、 マイクロプレ一卜等の固相に PCR産物を結合させ、 蛍光または酵素反応等により PCR産物を確認する方法を採用 してもよい。
また、 PIG121- Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム，ッメファ シエンス LBA4404菌を、 本発明に係るインプラン夕形質転換法に使用した場合に は、 PIG121- Hmパイナリーベクターの T-DNAは植物ゲノムに取り込まれる。 上述し たように、 PIG12卜 Hmバイナリ一ベクタ一は、 T- DNA領域内にハイグロマイシン耐 性遺伝子を有する。 そこで、 ハイグロマイシン B耐性を指標として選抜すること により、 植物が形質転換されたことを確認することができる。
さらに、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI- Res) を有するァ グロバクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌を本発明に係るインプランタ形 質転換法に使用した場合には、 T- DNAとそれに隣接する植物ゲノム DNA断片が連結 した構造をもつプラスミドを回収 （レスキュー） することにより、 T- DNAが植物 ゲノムに挿入されたこと、 すなわち、 植物が形質転換されたことを確認すること ができる。
図 5は、 プラスミドレスキュー用バイナリ一ベクタ一 （pBI- Res) を用いたプ ラスミドレスキューの方法を示す。 ここで、 「プラスミドレスキュー」 とは、 形 質転換植物のゲノムに挿入された T-DNAに隣接する植物ゲノム DNA断片を回収する 方法である。 図 5に基づき、 本法を説明する。 本発明に係るインプランタ形質転 換法に従って、 プラスミドレスキュ一用バイナリーベクター （pBI- Res) を有す るァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌を用いてイネを形質転換す る。 生育した形質転換植物体においては、 プラスミドレスキュー用バイナリーべ クタ一 （pBI_Res) 中の T- DNAがイネゲノム DNAに組み込まれる。 形質転換植物体 由来のゲノム DNAを、 T-DNA領域内の PBR322領域に切断部位を有しない制限酵素 (例えば、 Sph I)で消化した場合、 消化した DNA断片中には、 PBR322プラスミド由 来の複製開始領域（ori)及びアンピシリン耐性遺伝子 （Ampr) を含む DNA断片と、 ィネゲノム DNAに組み込まれた T- DNAに隣接するイネゲノム MA断片とが連結した DNA断片が含まれる。 そこで、 得られた消化物をセルフライゲーシヨンして、 環 状化させた後、 プラスミドとして大腸菌へ導入する。 次に、 上記構造をもつブラ スミドで形質転換された大腸菌を、 アンピシリン耐性を指標として選抜する。 次 いで、 アンピシリン耐性大腸菌中のプラスミドを分離し、 分離したプラスミドの 配列を決定する。 決定された T- DNAに隣接する DNAの塩基配列を Blast searchなど の相同性分析に供する。 その結果、 当該プラスミド中の T-DNAにイネのゲノム DNA が連結した構造が含まれていることがわかれば、 T-DNAがィネゲノム中に挿入さ れたことが確認される。
また、 非形質転換植物体と比較した場合の形質転換植物体の表現形質 （例えば 形態） の変化を指標として形質転換を確認することができる。 例えばァグロパク テリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いて形質転換したイネ形質転換植物 体の表現形質の変化としては、 以下のものが挙げられる。
( 1)生育初期では、 生育 （分蘖及び草丈） が遅れ、 生育中期になり追い越し、 生育後期においては草丈がより高くなる。
(2)イネ形質転換植物体においては、 葉片が上にむかって直立する傾向があり、 一方、 非形質転換植物体においては、 葉片が開く傾向がある。
(3)穂の付き方においては、 イネ形質転換植物体は 2段につき、 一方、 非形質転 換植物体では 1段に付く。
また、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いて形質転換し たトウモロコシ形質転換植物体の表現形質の変化としては、 以下のものが挙げら れる。 非形質転換植物体と比べ、
( 1)生育初期では、 草丈が高く、 茎が太い。 (2)生育中期では、 下葉が枯れ、 生育も遅れる。
(3)生育後期では、 草丈が低くなる。
(4)雌穂の絹糸の数がより少なくなる。
さらに、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いて形質転換 したコムギ形質転換植物体の表現形質の変化としては、 例えば、 非形質転換植物 体と比べ、 早く黄化することが挙げられる。
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いた場合に、 形質転換 植物体が上記のような表現形質の変化を示す機構としては、 以下のように推定さ れる。 ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株においては、 唯一 iaaM 遺伝子だけが変異しており、 T- DNA領域に存在するサイトカイニン生合成に関わ る遺伝子を含む全ての他の遺伝子は健全である。 従って、 ァグロバクテリウム ' ッメファシエンス M21変異株によって作出された形質転換植物体は、 高レベルの サイ卜カイニンを合成すると考えられる。 これにより形質転換植物体中のホルモ ンバランスに支障をきたし、 形質転換された植物は表現形質の変化を示すと考え られる。
一方、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI- Res) や pIG12卜 Hmバ イナリ—ベクタ—を有するァグロバクテリウム ·ッメファシエンス LBA4404菌を 用いて形質転換したイネやコムギの表現形質は植物個体間に大きなばらつきが認 められた。 これは、 T-DNAがゲノム中の種々の遺伝子座に無作為に挿入されるこ との反映と考えられる。 これらの各植物個体 （To) の示すそれぞれの表現形質は 次世代 （Τ へ遺伝した。 このことはこれらの植物において形質転換が起きてい ることを強く示唆している。
以上、 説明した本発明に係るインプランタ形質転換法により、 上記で説明した 一般的な形質転換法の問題点を解決することできる。 また、 本発明に係るインプ ラン夕形質転換法により所望の外来遺伝子を発現する形質転換植物体をより簡便 でかつ効率的に得ることができる。
このように作出した植物の TD世代の形質転換植物体は稔性を示し、 自家受粉さ せるか又は非形質転換植物体と交雑させることで、 結実させることができる。 こ のようにして、 植物の To世代の形質転換植物体の遺伝子型を継いだ次の世代の種 子を多数、 容易に得ることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 315828号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 イネの種子における穿設部位 1及び胚 2を示す模式図である。
図 2は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の T-DNA領域におけ る Tn5の挿入部位の構造を示す。
図 3は、 PIG12卜 Hmバイナリーベクターの T-DNA領域の構造、 並びに該 T- DNA領 域における CaMV 35Sプロモーターと GUS遺伝子にまたがる DNA断片、 及び該 DNA断 片を増幅する nested PCR用のプライマーの対応する位置を示す。
図 4は、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI_Res) の T- DNA領域 の構造を示す。
図 5は、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクタ一 （pBI- Res) を用いたプ ラスミドレスキューの方法を示す。
図 6は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いたインブラ ンタ形質転換から 6ヶ月後のイネ形質転換植物体（TQ)及び非形質転換植物体 （0世 代） の写真を示す。
図 7は、 種子を播種して 7日後のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変 異株で作出したイネ形質転換植物体 及び非形質転換植物体 （第 1世代） の幼 植物の写真を示す。
図 8は、 種子を播種して 48日後のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21 変異株で作出したイネ形質転換植物体 及び非形質転換植物体 （第 1世代） の 写真を示す。
図 9は、 種子を播種して 140日後のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21 変異株で作出したイネ形質転換植物体 ）及び非形質転換植物体 （第 1世代） の 写真を示す。
図 1 0— 1は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nested PCR用のプライマーの対応する位置 '、 を示す。
図 1 0— 2は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマ一の対応する位置 を示す。
図 1 0— 3は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T-DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位置 を示す。
図 1 0— 4は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位置 を示す。
図 1 0— 5は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマ一の対応する位置 を示す。
図 1 0 _ 6は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T-DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマ一の対応する位置 を示す。
図 1 0— 7は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位置 を示す。
図 1 0 _ 8は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T-DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマ一の対応する位置 を示す。
図 1 0— 9は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位置 を示す。
図 1 0— 1 0は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラス ミド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位 置を示す。
図 1 0 - 1 1は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラス ミド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位 置を示す。
図 1 0— 1 2は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラス ミド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマーの対応する位 置を示す。
図 1 0— 1 3は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラス ミド上の T- DNA領域の塩基配列、 および nes ted PCR用のプライマ一の対応する位 置を示す。
図 1 1は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株により作出され たイネ形質転換植物体 ）のゲノム DNAを铸型とした PCR産物のァガロース電気泳 動の結果を示す。 ·
図 1 2— 1は、 pIG12卜 Hmバイナリーベクター上の T- DNA領域の塩基配列、 およ び ne s t ed PCR用のプライマーの対応する位置を示す。
図 1 2— 2は、 pIG12卜 Hmバイナリーベクタ一上の T- DNA領域の塩基配列、 およ び ne s ted PCR用のプライマーの対応する位置を示す。
図 1 2— 3は、 PIG121- Hmバイナリーベクタ一上の T- DNA領域の塩基配列、 およ び ne s t ed PCR用のプライマーの対応する位置を示す。
図 1 2— 4は、 PIG121- Hmバイナリーベクター上の T- DNA領域の塩基配列、 およ び nested PCR用のプライマーの対応する位置を示す。
図 1 3は、 PIG121- Hmパイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404株菌により作出されたイネ形質転換植物体 (TQ)のゲノム DNA を铸型とした PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す。
図 1 4は、 PIG121- Hmバイナリ一ベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （T 由来の ゲノム DM断片に対するゲノミックサザーンハイブリダイゼ一ションの結果を示 す。
図 1 5は、 pIG12卜 Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 (Τ,)及び非形 質転換植物体 （第 1世代） からそれぞれ得られた種子 (T2及び第 2世代）をバイダ ロマイシン Β (20 ppm) 共存下で発芽させた際の吸水後 6日目の写真を示す。 図 1 6は、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクタ一 （pBI- Res) を有する ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転換されたイネ 形質転換植物体 （Τπ) のゲノム DNAより回収されたプラスミド中の T-DNAに隣接 する DNA (配列番号 1 5 ) の部分配列（第 8番目〜第 145番目）とデーターベース 上でヒッ卜した配列 （ァクセッション番号 AC084764中の部分配列（第 1番目〜第 134番目） （配列番号 1 6 ) ) とのァライメン卜を示す。
図 1 7は、 図 1 6のイネ形質転換植物体 (Τ0)から得られた種子より生育させた イネ形質転換植物体 （T 及び非形質転換植物体（第 1世代）の、 種子を播種して 90日後の写真を示す。
図 1 8は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いたインプ ランタ形質転換から 30日後のトウモロコシ形質転換植物体 )及び非形質転換植 物体 （0世代） の写真を示す。
図 1 9は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株で形質転換した トウモロコシ形質転換植物体 （ ） の播種後 80日目の写真を示す。
図 2 0は、 図 1 9に示すトウモロコシ形質転換植物体 のゲノム DNAを铸型 とした PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す。
図 2 1は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株又は pIG121-Hmバ イナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクタ一 （pBI - Res) を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転 換したコムギ形質転換植物体 (TQ)及び非形質転換植物体 （0世代） の、 ポット移 植後約 4ヶ月の写真を示す。
図 2 2は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株又は PIG12卜 Hmバ イナリーべクタ一もしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクタ一 （pBI -
Res) を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転 換したコムギ形質転換植物体 ）及び非形質転換植物体 （第 1世代） の、 播種後
11ヶ月後の写真を示す。
図 2 3は、 PIG121- Hmバイナリーベクタ一を有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体 （Tfl) 及び 非形質転換植物体（0世代）からそれぞれ得られた種子 及び第 1世代）をハイグロ マイシン B (50 ppm) 共存下発芽させた際の吸水後 9日目の写真を示す。 符号の説明
1 穿設部位
2 胚 発明を実施するための最良の形態
〔実施例〕
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によるイネのィ ンプランタ形質転換
(1) イネ （コシヒカリ） 種子の準備
イネ ( Oiyza sa tiva var. Koshihikari ) の種子 （新籾） を水道水に浸種し、 15^〜20°〇の温度で 48時間インキュベートした。 この間に水を一度交換した。 こ の処理により、 種子が吸水することで、 胚部分が白色を呈するようになった。 こ の種子を以下の実験に使用した。
(2) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の接種懸濁液の調製
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を、 カナマイシン（50 /2 g/ml)とリファンピシン（10 g/ml)を含む LB培地中で 28°Cで 18時間培養した。 次 いで菌体を遠心分離により回収し、 水で洗浄した。 洗浄後、 1. 0 X 108 菌体/ ml の濃度に菌体を水に懸濁し、 これを接種懸濁液とした。
(3) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によるイネのィンプラン 夕形質転換
ァグロパクテリゥム · ッメファシエンス M21変異株の接種懸濁液を針（φ
0. 71mm)の先に付着させ、 この針を用いて、 上記のイネの種子における胚（長径約
2匪）の出芽部中央を中心とする直径 1腿の円内に側面から 1ケ所、 深さ 1蓮〜 1. 5mm になるように穿設した （図 1 ) 。
次いでビーカーの中にバーミキユライトを少量入れ、 その上にろ紙を敷き、 水 を注ぎ濡らした後、 ビーカーを逆さまにして余分な水を切った。 このろ紙の上に 上記ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を接種したイネの種子を 置床して、 アルミはくで蓋をした。 これを 22°Cの恒温器に入れて、 喑所で 9日間 インキュベートした。 9日間のインキュベート後、 種子をクラフォラン （Hoeclis t Mar ion. Rous se l社製） の lOOOppm水溶液に 1時間浸漬した。 次いでこの種子を洗浄 しないでそのままハイポネックス 1000倍希釈液で湿らせたバーミキユライトを入 れたポットへ移植し、 約 25°Cで 1週間生育させた。
次に、 イネ育苗用培土 （ （株） 大塚産業） を入れた 7号植木鉢を準備した。 こ の鉢に上記のバーミキユラィトポット中で生育したイネ幼苗を移植し、 さらに生 育させた（以下、 「形質転換植物体 (TQ)」 と呼ぶ)。
一方、 対照として、 水を針（Φ Ο. 71ΐΜΐ)の先に付着させ、 この針を用いて上記の ようにイネの種子の胚（長径約 2mm)の出芽部中央を中心とする直径 1mmの円内に側 面から 1ケ所、 深さ lM！〜 1. 5minになるように穿設し、 形質転換植物体（^)と同様 に生育させた（以下、 「非形質転換植物体（0 (ゼロ）世代)」 と呼ぶ)。
さらに、 形質転換植物体 eg及び非形質転換植物体（0世代）をそれぞれ自家受 粉させ、 結実させた。 次いでそれぞれ形質転換植物体 (TQ)及び非形質転換植物体 (0世代）から得られた種子を親世代 （To世代） と同様の生育条件下で栽培した。 以下、 それぞれの植物体を形質転換植物体 ）及び非形質転換植物体（第 1世代） と呼ぶ。
〔実施例 2〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によって形質転 換したイネ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現形質の差異
実施例 1で作出した形質転換から 6ヶ月後の形質転換植物体（TQ)及び非形質転 換植物体 （0世代）の写真を図 6に示す。 また、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシ エンス M21変異株を用いたイネのインプラン夕形質転換効率を以下の表 1に示す。 なお、 形質転換は、 上記で説明した表現形質 （植物体の形態） の変化を指標と して判定した。 表 1
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いたイネ （コシヒカリ） のインプランタ形質転換効率 （Tfl世代） 接種吸水 発芽個体 形質転換 非形質転換 種子数 数 植物体数 植物体数 *
32 . 25 22 0
(83 %) (69%) (0%)
* ： 3個体が枯死した。 図 6に示すように、 形質転換植物体 (TD)は健全に発芽し、 成育の進行とともに 草丈が非形質転換植物体（0世代）よりも大きくなるという形態変化を示した。 ま た、 表 1から判るように、 インプラン夕形質転換に供した種子の約 80%が発芽し た。 また成長した形質転換植物体 （TQ) のほとんどが、 上記で説明した表現形質 (形態） の変化を示し、 形質転換効率は約 70%であった。
また、 種子を播種して 7日後の形質転換植物体 ( (a)及び (b)は、 異なる形質 転換植物体 (TQ)に由来する）及び非形質転換植物体 （第 1世代） の幼植物の写真を 図 7に示す。 さらに、 48日後の形質転換植物体 ） （（a)及び (b)は、 異なる形質 転換植物体 (TQ)に由来する）及び非形質転換植物体 （第 1世代） の写真を図 8に示 す。 また、 140日後の形質転換植物体 及び非形質転換植物体 （第 1世代）の写 真を図 9に示す。 なお、 図 9中の矢印は、 穂が付く位置を示す。
図 7及び 8に示すように、 生育の初期においては、 形質転換植物体（Τ,)の茎葉 部及び根部の成長が非形質転換植物体 （第 1世代） よりも遅く、 分げつも少なか つた。 根の発育が悪いのは導入された T-DNA中に含まれているサイトカイニン合 成酵素遺伝子により植物体内のサイトカイニン量が増えたためだと考えられる。 一方、 図 9に示すように、 生育後期において、 形質転換植物体 ( ）は非形質転換 植物体（第 1世代）とは異なり穂が 2段に付き、 種子の収量 （重量） が約 10%増加し た。 このように、 形質転換植物体 (TD)の表現形質は、 次世代 （Τ の形質転換植 物体に遺伝した。
〔実施例 3〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によって形質転 換したイネ形質転換植物体 からのァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス の T- DNA由来の遺伝子の検出
(1) イネ形質転換植物体 （T からのゲノム DNAの単離
Nucleon Phytopure for Plant DNA extraction Kit (Amersham Biosciences社 製）を用いて、 製造元のプロトコールに従い、 実施例 1で作出した形質転換植物 体 ）の幼植物の茎頂にある若い葉からゲノム DNAを抽出した。 次いで抽出され たゲノム DNAを、 RNaseで 37°C、 45分間、 その後プロティナーゼ Kで 55° (：、 16時間 処理した。 次にゲノム DNA溶液をフエノール、 フエノール/クロ口ホルム（1:1)溶 液及びク口口ホルムで抽出した。 最後にゲノム DNAに対してエタノ一ル沈澱を行 い、 得られた沈澱を水 IOO Iに溶解した。 このように調製されたゲノム DNAサン プルをァガロースゲルで電気泳動し、 DNAの純度と量をチェックした。
(2) Nested PCRによるァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス T- DNA由来の遺伝 子の検出
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株においては、 Tiプラスミド 上の T-DNA領域に存在する iaaM遺伝子の 1， 055番目と 1, 056番目の塩基の間に Tn5が 挿入されている （図 2) 。 従って、 図 1 0— 1〜図 1 0 _ 1 3及び配列番号 1 (ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミド上の T- DNA領域 の塩基配列）に示すように iaaM遺伝子と Tn5にまたがる DNA断片（760bp) (この断片 は本菌に固有の断片で、 他の菌中には存在しない） を増幅するために、 以下の nested PCRプライマーを設計した。
1回目の PCR用プライマー：
フォヮ一ドプライマ一： 5'- cgcttacatctatgttggca- 3' (配列番号 2)
リバースプライマー： 5'-catgttaggaggtcacatgg-3' (配列番号 3)
2回目の PCR用プライマ一：
フォヮ一ドプライマ一： 5' -tgccatcgaccttgcaccat-3' (配列番号 4)
リバ一スプライマー： 5'-aggttccgttcaggacgcta-3' (配列番号 5)
1回目の PCRでは、 上記のように調製したゲノム DNA (約 lOOng)を、 50inM KCI、 lOmM Tris- HC1 (pH8.3)、 1.5mM MgCl2、 200 / M dNTP、 それぞれ 0.2 Mの 1回目の
PCR用プライマー及び 0.63ュニットの Tad DNAポリメラーゼ (宝酒造）からなる最終 容量 25/xlの反応混合液に加えた。 PCRは、 最初 94°Cで 1分間の変性を行い、 次い -、 で 94°Cで 30秒間 (変性）、 55°Cで 1分間（アニーリング）、 及び 72°Cで 1分間（伸長）か らなるサイクルを 40回繰り返し、 その後 72 で 7分間の伸長を行った。
2回目の PCRでは、 1回目の PCR反応液 を铸型とし、 2回目の PCR用プライマー を用いたこと以外は、 1回目の条件と同様にして PCRを行った。 2回目の PCR反応液 10 x lをァガロースゲル（1 %)電気泳動に供し、 臭化工チジゥムで染色し、 PCR産 物を確認した。 また、 ァグロパクテリゥム .ッメファシエンス M21変異株の全 DNA を铸型とし、 上記の 2回目の PCR条件で PCRを行った。 得られた PCR産物を陽性対照 とした。
形質転換植物体 ）のゲノム DNAを鍩型とした PCR産物のァガロース電気泳動の 結果を図 1 1に示した。 図 1 1の各レーンは、 以下の通りである。 レーン 1 : DNA サイズマーカー、 レーン 2：ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の 全 DNA (陽性対照）、 レーン 3〜24：それぞれ異なる形質転換植物体 ( ）に由来する ゲノム DNA。
図 1 1に示されるように、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 の Tiプラスミド上の T- DNA領域における Tn5と i aaM遺伝子にまたがる本菌固有の 760bpの DNA断片が、 形質転換植物体（Τ,) 22個体中 11個体に検出された。 一方、 非 形質転換植物体（第 1世代）からはこの DNA断片は検出されなかった。
これらの結果により、 実施例 2で示した形質転換植物体（Τ,)の表現形質の変化 は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株に由来する Tiプラスミド 上の T-DNA領域のィネゲノムへの挿入に起因すると考えられた。
〔実施例 4〕 pIG121-Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシェンス LBM404菌によるイネのインプラン夕形質転換
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の代わりに PIG121- Hmバイナ リーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌を使用 した以外は実施例 1と同様の方法でイネ 0ryza sa ti va var. Koshihikari ) の 種子を形質転換し、 植物体へ生育させた。 なお、 pIG121-Hmバイナリーベクター を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌の接種懸濁液は、 ス トレプトマイシン（50 M g/ml)及び力ナマイシン（50 g/ml)並びにリファンピシン
(10 z g/ml)を含む LB培地中で本菌を 28°C、 18時間培養して調製した。 〔実施例 5〕 pIG12卜 Hmバイナリーベクタ一を有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （TQ) 及びィ ネ形質転換植物体 からの pIG12卜 Hmバイナリ一ベクター由来の遺伝子の検 出
(1) PIG121- Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメファシェ ンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （Τπ) からの pIG121 - Hm バイナリーベクター由来の遺伝子の検出
PIG12卜 Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッメファシェン ス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （Tfl) は、 非形質転換植 物体 （0世代） と比較して生育が抑制される個体や逆に草丈が大きくなる個体が 出現し、 表現形質が個体間で大きくばらついた。 表現形質の変化とばらつきは、 PIG12卜 Hmバイナリーベクター由来の T- DNAがイネゲノム中の種々の遺伝子座へ無 作為に挿入され、 遺伝子破壌や T-DNA中に含まれる 35Sプロモーターによる下流遺 伝子の発現の促進が起こったためであると考えられた。 従って、 この現象は高頻 度で T - DNAがイネゲノムに挿入されていることを示唆していると考えられる。 植物の種子が成熟した時点ですでに胚部分には葉の原基が形成されている場合 が多い。 例えばイネの場合には、 種子中に既に第 3葉までの原基が形成されてい る （星川清親：解剖図説イネの生育、 （社） 農山魚村文化協会. 昭和 5 0年 1月 1 0日 第 1刷発行） 。 それ故、 本発明に係わるインプランタ形質転換法では、 形質転換当代 （Tfl) の植物体はキメラ状態になることが予想される。 従って、 T0 世代の植物体の一部の組織細胞のゲノム分析の結果から、 次世代 （ 世代） のゲ ノムに外来遺伝子が導入されているかどうかを判定することはできない （生殖系 列の細胞の染色体に挿入した外来遺伝子のみが次世代に伝達される） 。 しかしな がら、 ァグロバクテリウム菌を接種した時点で、 原基が未だ形成されていなかつ た第 5葉以降の葉に外来遺伝子が導入されていることが確認できれば、 頂芽の分 裂細胞に外来遺伝子が導入されていると考えられ、 高い確率で外来遺伝子が次世 代に遺伝することが予想できる。
そこで、 イネ形質転換植物体 （TQ) の第 5葉以降の葉由来の丽 Aを鍀型とした nes ted PCRにより pIG121-Hmバイナリーベクター由来の T- DNAを確認し、 形質転換 効率を算出した。
ゲノム DNAの単離方法及び nes ted PCRの条件は実施例 3と同様であった。 また、 PIG121- Hmバイナリーベクターを铸型とし、 上記の 2回目の PCR条件で PCRを行った。 得られた PCR産物を陽性対照とした。 なお、 図 3並びに図 1 2— 1〜図 1 2— 4 及び配列番号 6 (PIG12卜 Hmバイナリーベクター上の T- DNA領域の塩基配列）に示す ように、 PIG121- Hmの T- DNA内の CaMV 35Sプロモーターと GUS遺伝子にまたがる DNA 断片（692bp)を増幅するために、 以下の nes ted PCRプライマーを設計した。
1回目の PCR用プライマー：
フォワードプライマ一： 5' -cgataaaggaaaggccatcg-3' (配列番号 7 )
リバースプライマー： 5' -atgctccatcact tcctgat-3' (配列番号 8 )
2回目の PCR用プライマー：
フォワードプライマー： 5' -agtggtcccaaagatggacc-3' (配列番号 9 )
リバースプライマー： 5' -agtgaccgcatcgaaacgca-3' (配列番号 1 0 )
形質転換植物体（T。）のゲノム DNAを錡型とした PCR産物のァガ口一ス電気泳動の 結果を図 1 3に示す。 図 1 3の各レーンは、 以下の通りであった： レーン 1： DNA サイズマ一カー、 レーン 2及び 3： PIG12卜 Hmバイナリ一ベクター（陽性対照）、 レ ーン 4〜6：鍀型なし、 レーン 7〜14：それぞれ異なる形質転換植物体（TQ)に由来 するゲノム DNA。
図 1 3に示すように、 形質転換植物体（TQ)の 8個体のうち 6個体において、 pIG121-Hmバイナリーベクターの T-DNA内の CaMV 35Sプロモーターと GUS遺伝子に またがる DNA断片（692bp)が検出された。 従って、 第 5葉の形質転換効率は 75% (8 個体中 6個体） であったので、 ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス LBA4404菌 と PIG12卜 Hmバイナリーベクターの組み合わせでもァグロパクテリゥム ·ッメフ ァシエンス M21変異株と同程度の確率で形質転換が起きていると判断された。
(2) PIG12卜 Hmバイナリ一ベクタ一を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシェ ンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （Τ,) からの pIG121 - Hm バイナリーベクター由来の遺伝子の検出
上記（1)で PIG12卜 Hmバイナリーベクタ一の T-DNA内の CaMV 35Sプロモータ一と
GUS遺伝子にまたがる DNA断片が検出された形質転換植物体 を、 実施例 1と同 様の方法で自家受粉させ、 結実させた。 次いで、 得られた種子から形質転換植物 体 （Τ,) を生育させた。
生育した形質転換植物体（η)から実施例 3と同様にしてゲノム DNAを単離し、 Ps t I/Hind I I Iで二重消化した後、 ァガロースゲル電気泳動に供した。 次いで、 常法により DNAを電気泳動後のァガロースゲルから HybondN+メンブラン （アマシ ャムバイオサイエンス社製） 上にプロッティングした。
一方、 CaMV 35Sプロモーターの約 700bpに相当する DNA断片を PCRで増幅した後、 この DNA断片を BcaBes tラベリングキット （夕カラ社製） を用いて32 Pで標識し、 プローブを作製した。
次いで、 上記で作製したプローブを使用して、 HybondN+メンブラン上に転写さ れたゲノム DNA断片を、 ゲノミツクサザーンハイブリダィゼーシヨンに供した。 ゲノミツクサザ一ンハイプリダイゼーシヨンの結果を図 1 4に示す。 なお、 図 1 4において、 アルファベットで示した各レーンは、 各々別の形質転換植物体 に由来するゲノム DNA断片である。 さらに、 図 1 4において、 矢印の位置は、 検 出された CaMV 35Sプロモーターの DNA断片を含むバンドである。
図 1 4に示されるように、 明瞭なバンドを示す形質転換植物体（ ）が観察され た。 従って、 形質転換植物体（ ）において、 pIG121-Hmバイナリ一ベクター由来 の T-DNA領域がィネのゲノム DNA内に確かに揷入されていると判断された。
〔実施例 6〕 pIG12卜 Hmバイナリーベクタ一を有するァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形質転換植物体 （T2) のハイ グロマイシン耐性の評価
PIG121- Hmバイナリーベクタ一は、 図 3に示すように、 T-DNA領域内にハイグロ マイシン耐性遺伝子を有する。 そこで、 イネ形質転換植物体 （T2) の形質転換の 確認を、 ハイグロマイシン耐性を指標として行った。
実施例 5 (2)においてゲノミックサザ一ンハイプリダイゼーシヨンで明瞭なバ ンドが観察された形質転換植物体 ）を実施例 1と同様の方法で自家受粉させ、 結実させた。 得られた種子を、 20ΡΡΠ1のハイグロマイシン Bを含む又は含まない水 溶液中で生育させた （以下、 「形質転換植物体 (T2)」 と呼ぶ） 。
一方、 対照として、 実施例 1と同様にして、 非形質転換植物体（0世代）から自 家受粉と結実を 2回繰り返して作出した非形質転換植物体を形質転換植物体（T2) 同様に生育させた（以下、 「非形質転換植物体 (第 2世代)」 と呼ぶ）。
吸水後 6日目の形質転換植物体 (Τ2)及び非形質転換植物体 （第 2世代） の写真を 図 1 5に示す。
図 1 5に示すように、 ハイグロマイシン Β (20 ppm) 存在下において、 非形質 転換植物体（第 2世代）と比べ、 茎葉部の生育が健全な形質転換植物体 (T2)が認め られ、 形質転換植物体（Τ2)は、 ハイグロマシン Βに対して耐性を示すことがわか つた。 従って、 イネゲノム内に挿入された PIG121- Hmバイナリーベクター由来の T - DNA領域は後代に遺伝することが示された。
〔実施例 7〕 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI- Res) を有する ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によるイネのィンプラン夕形 質転換
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の代わりにプラスミドレス キュー用バイナリーベクター （pBI- Res) (図 4に示す T- DNA領域の構造を有す る） を有する LBA4404菌を使用した以外は実施例 1と同様の方法でイネ (Qryza sa tiva var. Koshihikar i) の種子を形質転換し、 植物体へ生育させた（以下、 「形質転換植物体（TQ)」 と呼ぶ）。 なお、 プラスミドレスキュー用バイナリーべ クタ一 （pBI- Res) を有するァグロバクテリウム ·ッメファシエンス LBA4404菌の 接種懸濁液は、 実施例 4に記載の PIG121- Hmバイナリーベクターを有するァグロ バクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌の接種懸濁液と同様の方法で調製し た。
〔実施例 8〕 プラスミドレスキュー用バイナリ一ベクター （pBI-Res) を有する ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形 質転換植物体 （TD) からのプラスミドレスキュー用バイナリ一ベクター （pBI - Res) 由来の遺伝子の検出
実施例 7で作出した形質転換植物体 (TQ)の止葉から実施例 3と同様にしてゲノ ム DNAを単離し、 Sph Iで消化した。
図 5に示すように、 形質転換によりプラスミドレスキュー用バイナリーベクタ 一の T- DNA領域がイネゲノム DNAに組み込まれた場合には、 上記で得られた消化物 の中には、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI- Res) 中の pBR322 プラスミド由来の複製開始領域（ori)及びアンピシリン耐性遺伝子 （A即 を含 む DNA断片と、 組み込まれた T-DNAに隣接するイネゲノム DM断片とが連結した DNA 断片が含まれるはずである。 そこで、 図 5に従って、 得られた消化物をセルフラ ィゲーシヨンして、 環状化させた後、 プラスミドとして大腸菌へ導入した。
形質転換した大腸菌を、 アンピシリン含有培地で培養し、 増殖させた。 次いで、 得られたアンピシリン耐性のコロニー中の大腸菌からプラスミドを単離した。 得られたプラスミドを铸型にして、 下記の nested PCRを行い、 隣接イネゲノム DNA部分を増幅し、 その塩基配列を決定した。
1回目の PCRでは L41と L27プライマーを使用した。
プライマー L41 (CaMV 35Sプロモ タ一の配列に基づいて設計したセンスプライ マー） :5' -gcgtcatcccttacgtcagt-3' (配列番号 1 1)
プライマー L27 (アンピシリン耐性遺伝子 Amprの配列に基づいて設計したアンチ センスプライマー) ： 5' -ctgtgagatccagttcgatg-3' (配列番号 1 2 )
1回目の PCRでは、 実施例 3と同様な方法で、 上記プライマーセットを用い PCR を行った。 但し、 本実験の PCRは最初 94°Cで 1分間の変性を行い、 次いで、 94°Cで 30秒間 （変性） 、 58°Cで 1分間 （アニーリング） 、 および 72°Cで 2分間 （伸長） か らなるサイクルを 40回繰り返し、 その後 72°Cで 5分間伸長した。
次の 2回目の PCRでは、 1回目の PCR産物を铸型とし、 下記のプライマ一セット (L-9/L24) を用いたこと以外は、 1回目の条件と同様にして PCRを行った。
プライマー L- 9 (CaMV 35Sプロモーターの配列に基づいて設計したセンスプライ マ一） :5' -tcttgatgagacctgctgcg-3' (配列番号 1 3)
プライマー L- 24 (アンピシリン耐性遺伝子 Amp1"と T- DNA右境界配列との間の配列 に基づいて設計したアンチセンスプライマー） ：5' -tggccgtcgttttacaacgt- 3' (配列番号 1 4)
2回目の PCR産物を錡型にし、 上記プライマー L- 9をシークェンスプライマーと して用いて、 DNA配列決定分析を行った。
次いで、 決定した PCR産物の DNA配列を相同性検索 （BLAST search) に供した。 図 1 6に、 PCR産物（配列番号 1 5)の部分配列（第 8番目〜第 145番目）と、 データ ベース上でヒッ卜した配列 （ァクセッション番号 AC084764中の部分配列（第 1番目 〜第 134番目） （配列番号 1 6 ) )とのァライメントを示す。 なお、 PCR産物（配列 番号 1 5 )において、 nは、 a、 c、 g又は tを表す（存在位置： 37、 83、 112、 136、 150、 152、 157、 180、 197、 200、 204、 212、 215及び 216)。
図 1 6に示すように、 相同性分析の結果、 PCR産物（配列番号 1 5 )中の部分配 列に対してイネ由来の配列 （ァクセッション番号 AC084764) (配列番号 1 6 )がヒ ッ卜した。 この結果から、 イネ形質転換植物体 （To) のゲノム DNAより回収され たプラスミド中の T-DNAに隣接してイネゲノム DNA断片が連結していたことが判明 した。 従って、 プラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI_Res) の T-DNA 領域がイネゲノム DNA中に挿入されていることが示された。
〔実施例 9〕 プラスミドレスキュ 用バイナリーベクタ一 （pBI- Res) を有する ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転換したイネ形 質転換植物体 （Ί^) と非形質転換植物体 (第 1世代）との表現形質の差異
実施例 8においてプラスミドレスキュー用バイナリーベクタ一 （pBI- Res) の T-DNA領域の挿入が確認された一つの形質転換体 （T。） を実施例 1と同様の方法 で自家受粉させ、 結実させた。 次いで、 得られた種子から植物体を生育させた (以下、 「形質転換植物体 (I 」 と呼ぶ)。 一方、 対照として、 実施例 1と同様の 方法で、 非形質転換植物体 (0世代）から自家受粉と結実を 1回繰り返して作出した 非形質転換植物体を形質転換植物体は 同様に生育させた（以下、 「非形質転換 植物体 (第 1世代)」 と呼ぶ)。
種子を播種して、 90日後の形質転換植物体 （Τ 及び非形質転換植物体（第 1世 代）の写真を図 1 7に示す。
図 1 7に示すように、 世代と同じように、 非形質転換植物体（第 1世代）と比 較して、 形質転換植物体 （ ） は、 草丈が高いという表現形質を示した。
〔実施例 1 0〕 イネ形質転換植物体におけるァグロパクテリゥム ·ッメファシェ ンス残存の可能性の検証
イネ形質転換植物体 (TD)及び形質転換植物体 ）において、 形質転換に用いた ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株或いはァグロパクテリゥム · ッメファシエンス LBA4404菌が残存するか否かを検証した。 実施例 3においてゲノム腿 Aを抽出した時と同様にして、 実施例 1及び 4で作 出したイネ形質転換植物体 (TQ及び ）の茎頂の若い葉をそれぞれ滅菌水中で無菌 的に磨砕し、 その磨砕液をカナマイシン（50 g/ml)とリファンピシン（lO g/ml) を含む LB培地上で 28 で 3日間培養した。 その結果、 TDと のいずれの形質転換 植物体の磨砕液を塗布した培地上にもコロニーが全く見られなかった。 この結果 から、 形質転換植物体 (T。及び Τ,)には、 形質転換に用いたァグロバクテリウム - ッメファシエンスは残存していないことが判明した。 ァグロバクテリウム菌は宿 主植物の抵抗性反応により除去されたと推定される。
以上から、 実施例 3及び実施例 5で検出されたァグロパクテリゥム ·ッメファ シエンス M21変異株及び PIG121- Hmバイナリ一ベクターを有するァグロパクテリゥ ム ·ッメファシエンス LBA4404菌の T- DNA由来の遺伝子は、 形質転換植物体 及 び ）の植物ゲノムに組み込まれた T-DNAに由来するものであることが判明した。 〔実施例 1 1〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によるトウモ
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(1) トウモロコシ （キャルコーン 90) 種子の準備
トウモロコシ （Zea mays var. Calcorn) の種子を水道水で 2〜3回洗い、 種皮 に付いている赤色の殺菌剤を洗い落とした。 この種子を水道水中に浸漬して、 25°Cの温度で 3日間インキュベートした。 この間に水を 1回交換した。 この処理に より、 種子が吸水して胚部分が白色を呈するようになった。 この種子を以下の実 験に使用した。
(2) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の調製
実施例 1と同様の方法でァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の 接種懸濁液を調製した。
(3) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によるトウモロコシのィ ンプランタ形質転換
ァグロパクテリゥム · ッメファシエンス M21変異株の接種懸濁液を針（Φ 0. 71腿）の先に付着させた。 この針を用いて上記トウモロコシの種子における胚 (長径約 lcm) の幼芽部分 (種子を、 尖帽が下にくるように置いた場合、 胚の中央 部よりも上部に存在する）に上から 2ケ所、 深さ lmn！〜 1. 5mmになるように穿設した 後、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の接種懸濁液を浸した綿 棒を用いて穿孔箇所にァグロパクテリゥム菌を塗布した。
次いで、 シャーレ中にろ紙を敷き、 ろ紙を水で湿らせた。 その上にァグロパク テリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を接種したトウモロコシの種子を置床し て、 シャーレの蓋をした。 これを 25°Cの恒温器に入れて、 喑所で 2日間インキュ ベー卜した。
2日間のインキュベーション後、 少し発根した種子をそのままバーミキユラィ トと赤玉土 1 : 1混合培土 （肥料として Magアンプ K (ハイポネックス ジャパン社 製） を 5g添加） へ播種して、 生育させた（以下 「形質転換植物体 (Tfl)」 と呼ぶ)。 一方、 対照として、 いずれの処理も施さない種子、 或いはァグロバクテリウ ム ·ッメファシエンス M21変異株の代わりにバイナリーベクターを有しないァグ ロバクテリウム ·ッメファシエンス LBA4404菌を接種した種子を、 形質転換植物 体 (TD)と同様に生育させた（以下、 「非形質転換植物体（0世代)」 と呼ぶ）。
さらに、 トウモロコシは他殖性作物であるため、 形質転換植物体 egとバイナ リ一ベクターを有しないァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌を接 種した非形質転換植物体 (0世代）とを交雑させ、 結実させることで得られた種子 を親世代と同様の生育条件下で生育した（以下、 「形質転換植物体 ( )」 と呼ぶ）。 一方、 対照として、 非形質転換植物体 (0世代）と他の非形質転換植物体 (0世代）と を交雑させ、 結実させることで得られた種子を親世代と同様の生育条件下で生育 した（以下、 「非形質転換植物体 (第 1世代)」 と呼ぶ)。
〔実施例 1 2〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株により形質転 換したトウモロコシ形質転換植物体 (Tfl)と非形質転換植物体 （0世代） との表現 形質の差異
形質転換から 30日後の形質転換植物体 )及び非形質転換植物体 （0世代）の写 真を図 1 8に示す。 また、 ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株を 用いたトウモロコシのインブランタ形質転換効率を以下の表 2に示す。
なお、 形質転換は、 上記で説明した表現形質 （形態） の変化を指標として判定 した。 表 2
ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いたトウモロコシ
(Cal corn 90) のインプランタ形質転換効率 （ 世代） 接種吸水 発芽個体 形質転換 非形質転換
種子数 数 植物体数 植物体数
1 1 . 1 1 1 1 0
(100 % ) (100 %) (0 %) 図 1 8に示すように、 形質転換植物体 （Tfl) は、 イネの場合とは対照的に、 生 育初期の段階では非形質転換植物体 （0世代） よりも草丈が大きく茎が太くなつ た。 また、 表 2から判るように表現形質 （形態） の変化を指標とした形質転換効 率は 100%であった。 .
また、 種子を播種して 80日後の 世代の形質転換植物体及び非形質転換植物体 の写真を図 1 9に示す。 なお、 図 1 9中の植物体の写真は、 以下の植物体を示す。 (a)非形質転換植物体：非形質転換植物体（第 1世代）、 （b)形質転換植物体 ） ： 形質転換植物体 (TD)と非形質転換植物体（0世代）とを交雑させた後、 非形質転換 植物体（0世代）から収穫した種子に由来する形質転換植物体 、 （c)形質転換 植物体 (Τ,) ：形質転換植物体 (TQ)と非形質転換植物体（0世代）とを交雑させた後、 形質転換植物体 (Τβ)から収穫した種子に由来する形質転換植物体 （Τ,) 。
図 1 9に示すように、 生育後期にはイネとは対照的に形質転換植物体 （ ） は、 非形質転換植物体よりも草丈が低くなつた。 また、 非形質転換植物体の場合には 雄穂が出た後で雌穂が発達するが、 形質転換植物体 （ ） では発達の順序が逆で あった。 さらに、 非形質転換植物体と比較して、 形質転換植物体 （ ） では下葉 が早く枯れ、 種子に付く絹糸が短くなつていた。 このように、 形質転換植物体 (To)の表現形質は、 次世代 （ 世代） の形質転換植物体に遺伝した。
〔実施例 1 3〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によって形質 転換されたトウモロコシ形質転換植物体 （T からのァグロバクテリウム ·ッメ ファシエンス T- DNA由来の遺伝子の検出
ゲノム DNAの単離及び nes t ed PCRの方法は実施例 3と同様であった。 ゲノム DNA は、 実施例 1 1における形質転換植物体 （Τ から調製した。 形質転換植物体（ ）のゲノム]) ΝΑを铸型とした PCR産物のァガロース電気泳動の 結果を図 2 0に示した。 図 2 0に示されるように、 ァグロバクテリウム ·ッメフ ァシエンス M21変異株の Tiプラスミド上の T- DNA領域における Tn5と iaaM遺伝子に またがる本菌固有の 760bpの DNA断片が、 形質転換植物体 ） 12個体中 8個体に検 出された。 なお、 非形質転換植物体からはこの DNA断片は検出されなかった。 これらの結果により、 実施例 1 2で示した形質転換植物体（T の表現形質は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株に由来する T iプラスミド上の T - DNA領域のトウモロコシ染色体への挿入に起因すると考えられた。
〔実施例 1 4〕 トウモロコシ形質転換植物体におけるァグロパクテリゥム ·ッメ ファシエンス残存の可能性の検証
トウモロコシ形質転換植物体 （Tfl及び 1 ) において、 形質転換に用いたァグロ パクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株が残存するか否かを検証した。
実施例 3においてゲノム DNAを抽出した時と同様にして、 実施例 1 1で作出し た形質転換植物体 (T。及び T の茎頂の若い葉を滅菌水中で無菌的にホモジナイズ し、 そのホモジネ一卜をカナマイシン（50 g/ml)とリファンピシン（10 g/ml)を 含む LB培地上で、 28°Cで 3日間培養した。 その結果、 Τβと のいずれの形質転換 植物体のホモジネートを塗布した培地上にもコロニーは全く見られなかった。 こ の結果から、 形質転換植物体 （Τ。及び ） において、 形質転換に用いたァグロバ クテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株は残存していないことが判明した。 以上から、 実施例 1 3で検出されたァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の T-DNA由来の遺伝子は、 形質転換植物体 （Τ。及び ） のゲノムに組み 込まれた Τ- DNAに由来するものであることが判明した。
〔実施例 1 5〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株又は PIG121 - Hm バイナリ一ベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI - Res) を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によるコムギの インプランタ形質転換
(1) コムギ （シラネコムギ） 種子の準備
コムギ （Tr i t icum aes t ivum L. var. Shi ranekomugi) の種子を水道水に浸漬 し、 15°C〜20°Cの温度で 40時間インキュベートした。 この処理により種子が吸水 して胚部分の輪郭が明瞭になる。 この種子を以下の実験に使用した。
(2) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株及び T3IG121- Hmバイナリ一 ベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター （PBI- Res) を有する ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌の接種懸濁液の調製
実施例 1と同様の方法で、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 及び PIG12卜 Hmバイナリーベクター又はプラスミドレスキュ一用バイナリーべク 夕一 （pBI- Res) を有するァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス LBA4404菌の接 種懸濁液を調製した。
(3) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株又は PIG121- Hmバイナリー ベクタ一もしくはプラスミドレスキュー用バイナリ一ベクター （pBI- Res) を有 するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によるコムギのィンプラ ンタ形質転換
上記（2)で調製した 3種のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌の接種懸濁 液を各々針 （Φ 0. 71匪） の先に付着させ、 この針を用いて上記（1)で吸水させた コムギの種子の胚部分 （長径約 2腿） の中央部に深さ 1腿〜 1. 5匪になるように上 から 1回穿設した。
次いでビーカーの中にバーミキユライトを少量入れて、 水を注ぎ、 濡らした。 この上に上記 3種のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌を各々接種したコ ムギの種子を置床して、 その上に乾燥しているバーミキユラィトを薄く被せた後、 ラップで蓋をして 15°C〜20°Cで 2日間ィンキュペートした。 2日間のィンキュベー シヨン後、 3°C〜5°Cの冷蔵庫へ上記ビーカーを移し、 25日間保持した （バーナリ ゼーシヨン：この間に葉が 3cn！〜 5cmに伸びる） 。 パーナリゼ一シヨンの後、 冷蔵 庫から上記ビーカ一を出して室温 （15°C〜20°C) に馴化した後、 バーミキユラィ 卜と赤玉土を 1： 1に混ぜた培養土を入れたポッ卜に、 植物体を移植して、 Mgアン プ K (ハイポネックスジャパン社製） を肥料として使用し、 栽培した（以下、 「形 質転換植物体 (T。)」 と呼ぶ）。
一方、 対照として、 水を針 （Φ 0. 71腿） の先に付着させ、 この針を上記（1)で 吸水させたコムギの種子の胚部分 （長径約 2腿） の中央部に深さ 1讓〜 1. 5醒にな るように上から 1回穿設し、 形質転換植物体 (Tfl)と同様に生育させた（以下、 「非 形質転換植物体 (0世代)」 と呼ぶ）。
〔実施例 1 6〕 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株又は pIG121 - Hm バイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター （pBI - Res) を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転 換したコムギ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現形質の差異
ポットに移植してから約 4ヶ月後の実施例 1 5で作出したコムギ形質転換植物 体 （Tfl) 及び非形質転換植物体 （0世代） の写真を図 2 1に示す。 図 2 1に示す 各ポットには、 それぞれ 10個の形質転換植物体 g又は非形質転換植物体（0世 代）が移植されている。
図 2 1に示すように、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株で形 質転換された形質転換植物体 (TQ)は、 ほぼ全てが非形質転換植物体 (0世代）より も早く黄化した。 この表現形質の変化は、 導入された T- DNA中に含まれているサ ィトカイニン合成酵素遺伝子により植物体内のサイトカイニン量が増えたためと 推定された。 従って、 この結果は、 高い効率で形質転換が起こっていることを示 唆している。 一方、 pIG121-Hmバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用 バイナリ一ベクター （pBI- Res) を有するァグロパクテリゥム 'ッメファシェン ス LBA4404菌で形質転換された形質転換植物体 (TQ)は、 TQ世代では明瞭な表現形 質の変化が観察されなかった。
そこで、 形質転換植物体 (TQ)及び非形質転換植物体（0世代）をそれぞれ自家受 粉させ、 結実させた。 次いで、 それぞれ形質転換植物体 (TQ)及び非形質転換植物 体（0世代）から得られた種子を無作為に 10個ずつ選び、 親世代（To世代）と同様の 生育条件下で栽培した（以下、 それぞれ 「形質転換植物体 ( ）」 及び 「非形質転 換植物体 (第 1世代)」 と呼ぶ)。
播種後 11ヶ月後の形質転換植物体 （Τ,) 及び非形質転換植物体 （第 1世代） の 写真を図 2 2に示す。 図 2 2に示す各ポットには、 それぞれ 10個の形質転換植物 体 ( ）又は非形質転換植物体 (第 1世代)が栽培されている。
図 2 2に示すように、 各形質転換植物体 ）は、 非形質転換植物体（第 1世代） よりも種子重量 （収量） が少ないという表現形質を示した。
このように、 PIG121- Hmバイナリ一ベクター又はプラスミドレスキュー用バイ ナリーべクタ一 （pBI- Res) を有するァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス LBA4404菌で形質転換された形質転換植物体は、 ^世代で表現形質の変化が観察 された。 従って、 PIG12卜 Hmバイナリ一ベクター又はプラスミドレスキュー用バ イナリーべクタ一 （pBI- Res) を有するァグロバクテリウム ·ッメファシエンス LBA4404菌で形質転換された形質転換植物体についても形質転換が成功している ことが示唆された。
〔実施例 1 7〕 pIG12卜 Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリゥム ·ッ メファシエンス LBA4404菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体 （T の ハイグロマイシン耐性の評価
実施例 1 6と同様に、 pIG121_Hmバイナリーベクターを有するァグロパクテリ ゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体 ( )及び非形質転換植物体 (0世代）をそれぞれ自家受粉させ、 結実させた。 次い で、 それぞれ形質転換植物体 (TQ)及び非形質転換植物体（0世代）から得られた種 子を 50ρρπιのハイグロマイシン Bを含む又は含まない水溶液中で生育させた。
吸水開始後 9日目の植物体の形質転換植物 ）及び非形質転換植物 （第 1世代） の写真を図 2 3に示す。
図 2 3に示すように、 ハイグロマイシン B (50 ppm) 存在下で、 非形質転換植 物体 (第 1世代）と比べ、 茎葉部の生育が健全な形質転換植物体 が認められ、 形質転換植物体 ( ）は、 ハイグロマシン Bに対して耐性を示すことがわかった。 上述したように、 pIG12卜 Hmバイナリ一ベクターは T- DNA領域内にハイグロマイシ ン耐性遺伝子を有する。 従って、 PIG121- Hmバイナリーベクターを有するァグロ パクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌により導入された T-DNAはコムギゲノ ム中に挿入されて、 次世代に遺伝すると考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 植物の形質転換体をより簡便でかつ効率的に得られる植物のィ ンプランタ形質転換法が提供される。 本発明によれば、 品種や種にとらわれずに、 培養や再分化が困難なために形質転換が難しい植物を、 低コス卜で高効率に形質 転換することができる。 従って、 本発明により、 経済上及び農業上付加価値を有 する植物の作物を作出することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1は、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミ ド上の T-DNA領域の塩基配列である。
配列番号 2〜 5及び 7〜1 4は、 プライマーである。
配列番号 6ば、 PIG121- Hmバイナリーベクタ一上の T- DNA領域の塩基配列である。 配列番号 1 5は、 PCR産物である。
配列番号 1 5において、 nは、 a、 c、 g又は tを表す（存在位置： 37、 83、 1 12、 136、 150、 152、 157、 180、 197、 200、 204、 212、 215及び 216)。

Claims

請求の範囲
1 . 植物の種子における胚の出芽部の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシ エンスを接種することを特徴とする、 植物のインプランタ形質転換法。
2 . 植物の種子における胚の出芽部に、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシェ ンスを付着させた創傷手段により傷をつけることを特徴とする、 植物のインブラ ンタ形質転換法。
3 . 前記植物が単子葉植物であることを特徴とする、 請求の範囲 1又は 2記 載の植物のィンプランタ形質転換法。
4 . 前記出芽部が、 胚の出芽部中央、 胚の幼芽部分及び胚の中央部から成る 群より選択されるものである、 請求の範囲 1又は 2記載の植物のインプランタ形 質転換法。
5 . 前記接種前に植物の種子を吸水させる工程を含む、 請求の範囲 1記載の 植物のインプランタ形質転換法。
6 . 前記創傷前に植物の種子を吸水させる工程を含む、 請求の範囲 2記載の 植物のインプランタ形質転換法。
7 . 吸水期間が、 2〜3日間であることを特徴とする、 請求の範囲 5又は 6記 載の植物のィンプランタ形質転換法。
8 . 前記胚の出芽部に傷をつける工程を含む、 請求の範囲 1記載の植物のィ ンプラン夕形質転換法。
9 . 前記傷が穿孔であることを特徴とする、 請求の範囲 1又は 2記載の植物 のインプランタ形質転換法。
1 0 . 接種するァグロバクテリゥム ·ッメファシエンスが、 ァグロパクテリ ゥム ·ッメファシエンス M21変異株、 PIG12卜 Hmバイナリーベクターを有するァグ 口パクテリゥム ·ッメファシエンス LBA4404菌及びプラスミドレスキュ一用バイ ナリーべクタ一 （pBI_Res) を有する LBA4404菌から成る群より選択されるもので ある、 請求の範囲 1又は 2記載の植物のインプランタ形質転換法。
1 1 . 前記接種がァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を塗布する ことである、 請求の範囲 1記載の植物のインプランタ形質転換法。
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