CN117286177A - Obf1转录因子在植物染色体加倍中的应用及转基因植物培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术和遗传学领域，尤其是一种OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用及转基因植物培育方法，所述OBF1转录因子的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述植物包括矮牵牛、番茄和烟草。本发明将OBF1基因导入植物细胞或组织中，在卡那霉素处理下，得到染色体加倍的转基因细胞系或转基因植株；所述转基因植株长势旺盛，具有对生物胁迫的抗性。根据本发明处理后，植物仍易于自花授粉，从而可以高效分离加倍的子代植物，且加倍性状可被稳定遗传。该技术克服了在植物中使用现有技术使染色体加倍所面临的植物致畸现象和环境安全问题，对于培育染色体加倍的植物品种具有重要意义，可用于染色体加倍品种的培育和鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术和遗传学领域，具体领域为OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用及转基因植物培育方法。
背景技术
植物的倍性改变是植物生物学研究、植物生物技术和植物育种的重要研究内容。与二倍体相比，同源多倍体具有某些器官增大或代谢产物含量提高的特点，对于以收获营养器官为目的的作物及无性繁殖作物有极好的育种利用价值。因此染色体加倍具有重大的理论研究和商业化价值。
现有方法多用化学药剂和物理处理方法诱导植物细胞染色体加倍。例如，秋水仙碱、一氧化二氮气体、热处理、甲基氨丙基磷、氟乐灵、谷维素和丙酰胺已被用于获得多种植物染色体加倍株系。另外，8-羟基喹啉、一溴萘、一溴萘与秋水仙碱的混合溶液、以及秋水仙碱与8-羟基喹啉混合液也可用于植物染色体加倍。
以上诸多方法中，目前常用的是利用秋水仙碱作为加倍剂，但秋水仙碱对植物的加倍效果难以满足上述研究的需要，主要问题是秋水仙碱对处理的植物材料损伤大，常导致植物生长异常、畸形甚至处理材料的死亡，且易致植物不能自花授粉。另外，秋水仙碱有剧毒，对包括人类在内的哺乳动物具有更大的毒性和潜在的致癌作用，对操作人员的健康和环境安全具有较大的危害。另一种常用的用于染色体加倍的物质为一氧化二氮气体，然而，一氧化二氮气体不如秋水仙碱有效，这限制了一氧化二氮气体在染色体加倍技术中的应用。因此，研究开发一种全新的植物染色体加倍方法成为了本领域研究人员面临的技术难题之一。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用。
具体的，本发明提供如下技术方案：
一种OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其中，所述OBF1转录因子的基因序列如SEQ ID NO:1所示。其蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
具体为，在卡那霉素处理下，将OBF1基因导入初始植物细胞或组织中，得到染色体加倍的转基因细胞系或转基因植株。
具体的，可以采用现有的植物表达载体构建含有OBF1 ORF片段的重组表达载体，所述的载体为携带有卡那霉素抗性的植物表达载体。
使用构建的OBF1重组植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，或化学诱导启动子，它们可以单独使用或与其它植物启动子结合使用。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所有植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(如GUS基因或荧光素酶基因)等。也可不加选择性标记基因，直接以染色体是否加倍筛选转化植株。
所述的重组表达载体具体可在植物表达载体多克隆位点插入自如SEQ ID NO:1所示序列的自5’末端第1-486位脱氧核糖核酸得到OBF1过表达载体。
携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法转化细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本发明的第二目的在于提供了一种植物育种的方法。
该方法可包括以下技术方案：
(1)使至少第一个和第二个亲本植物杂交以产生包含所选遗传背景的杂合植物；
(2)产生由所述杂交植物衍生的双倍体子代植物；
在本发明的实施方案中，初始植物可以进一步定义为双倍体植物，其中T1代植物是加倍的双倍体植物。起始植物可以是种间杂交植物或种内杂交植物。这种杂合植物可以是异源植物种群的成员，例如来自开放授粉的植物种群。杂合植物可以从任何杂合材料中获得，包括本地品种、不同遗传背景的复合物和其他植物集合。
本发明使用的起始植物可以是双子叶植物。其中，双子叶植物的例子包括番茄、烟草和矮牵牛。
(3)在形成花粉、子叶、下胚轴、幼叶的初始植物的发育阶段，卡那霉素处理过表达OBF1载体转化所述植物，所述植物包括初始植物的花粉、子叶、下胚轴、嫩叶以及转化后所述植物的发育；
在本发明的实施例中，用选定浓度(压力)的卡那霉素处理初始植物。初代卡那霉素的选定压力是100mg/g，也可以是约100mg/g至约150mg/g。在本发明的进一步实施方案中，用卡那霉素处理植物一段时间，选择的时间段可以是从愈伤到生根所需的时间，因物种不同，则具体处理时长不同。
在本发明的实施例中，用选定浓度(压力)的卡那霉素处理T0代种子。二代卡那霉素的选定压力是25mg/g，也可以是约15mg/g至约30mg/g。在本发明的进一步实施方案中，用卡那霉素处理种子一段时间，选择的时间段可以是从种子到发芽所需的时间，因物种不同，则具体处理时长不同。
(4)使T0代植物进行自花授粉，得到纯合株系，所述纯合株系具有器官变大、染色体加倍的特征。
(5)选择衍生自自花授粉的加倍双倍体子代植物，其中所述子代植物具有所需的遗传背景；植物染色体加倍性状可稳定遗传。
(6)起始植物和加倍植物的自花授粉可以通过任何方法进行，包括自然自花授粉和人工自花授粉。
利用任何一种携带有卡那霉素抗性的、可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的OBF1基因导入植物细胞或组织，在一定卡那霉素浓度处理下，可以高效获得染色体加倍的转基因细胞系及转基因植株。所述的植物染色体加倍具体可为植物体、植物器官、植物组织或培养的植物细胞，其尺寸变大，染色体加倍。
研究结果表明：将本发明的OBF1基因转入矮牵牛、番茄、烟草，在一定压力的卡那霉素选择下，在植物中过表达该基因时，转基因植物显示出尺寸增大的叶、花、种子和茎，细胞尺寸增加；转基因植株易于自花授粉，染色体加倍性状可稳定遗传。
进一步的，所述转基因植株具有对灰霉病病原菌的抗性。在病原菌侵染实验中，T2代转OBF1基因植株表现出抗病原菌侵染，说明本发明提供的OBF1基因与其编码的蛋白能够显著提高植物的抗病能力。
具体的，本发明提供了一种OBF1转基因植物的培育方法，包括以下步骤：
(1)对OBF1基因ORF区进行引物设计，得到引物OE_F1和OE_R1；其中，所述用于OBF1ORF片段扩增的序列如SEQ ID NO：3-4所示，
OE_F1：ATCTCGAGATGGCATCTTCTAGTGGAAA；
OE_R1：ATGAGCTCTCAATACTGATAGAACATAT。
(2)采用所述引物进行PCR扩增，克隆得到OBF1基因片段；将OBF1基因过表达的片段构建于携带有卡那霉素抗性的植物表达载体载体，获得重组质粒；
(3)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入2510电击杯中，使用电击装置2510V电击转化，转化后涂布到含有抗生素的LB固体培养基上，筛选获得带有重组质粒的农杆菌；
(4)对携带重组质粒的农杆菌进行扩大培养；将所述农杆菌侵染初始植物幼嫩组织；所述幼嫩组织包括子叶、下胚轴、嫩叶、花粉；
(5)上述幼嫩组织在带有卡纳霉素选择压的培养基上经分化培养获得愈伤组织，再生筛选培养获得新芽；剪取新芽，继续壮苗及生根培养获得幼苗，转移到土里继续培养；
(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对NPTII_F与NPTII_R，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了OBF1基因序列，获得T0代转基因株系。
其中，所述NPTII_F以及NPTII_R的序列如SEQ ID NO：5-6所示，
NPTII_F：AAGATGGATTGCACGCAGGT；
NPTII_R：AGCTTCAAAGCAGATCCAAG。
(7)待T0代转基因株系开花，自花授粉，获得T1代种子，经二代卡那霉素抗性培养基进一步筛选获得纯合的染色体加倍的子代，即为T2代转基因植株。
(8)T2代转基因植株继续培养，自花授粉，经鉴定，T3代植株稳定遗传了染色体加倍性状。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明研究结果表明，卡那霉素处理转化OBF1基因的矮牵牛幼嫩组织，转基因植物叶片、花瓣、花柱、柱头、花药、种子、茎、细胞等均增加，这些特征与染色体加倍有关。通过流式细胞仪和细胞学试验证实了在一定的卡那霉素筛选压力下，OBF1过表达引起植物染色体加倍，加倍的植物除器官变大外，生长正常，长势旺盛，易于自花授粉，使得该性状可稳定遗传。为了进一步验证该表型，卡那霉素处理转化OBF1基因的番茄和烟草幼嫩组织，在转基因番茄和烟草中也观察到染色体加倍现象。进一步的研究证实，经过自花授粉选择的纯系后代稳定遗传了染色体加倍性状。纯系染色体加倍植物的开发对种子作物、花卉、果树、蔬菜的商业品种开发具有重要意义，纯合染色体加倍植物可直接用作商业品种。
染色体加倍的转基因植物表现出对生物胁迫的抗性，如对灰霉病病原菌的抗性。对于培育耐生物胁迫的植物品种具有重要的理论及实际意义，可用于抗病植物品种的培育和鉴定。
附图说明
图1为过表达和基因沉默OBF1转录因子的矮牵牛植株表型；过表达植株命名为100-2、150-2、150-5；基因沉默植株命名为2-6、6-3、8-1；野生型为WT；
图2为过表达OBF1增加了矮牵牛茎干直径；其中，(A)主茎横切面；(B)主茎直径；
图3为过表达OBF1基因增加了矮牵牛叶片宽度(第6片叶)；
图4为过表达OBF1增加了矮牵牛胚轴长度的照片(A)及柱状图(B)；
图5为过表达OBF1增加了矮牵牛花瓣尺寸的照片(A)及柱状图(B)；
图6为过表达OBF1增加了矮牵牛花药尺寸的照片(A)及柱状图(B、C)；
图7为过表达OBF1增加了矮牵牛柱头大小的照片(A)及柱状图(B)；
图8为过表达OBF1增大了矮牵牛种子大小和重量的照片(A)及柱状图(B、C)；
图9为过表达OBF1增大了矮牵牛细胞尺寸；
图10为流式细胞仪证实过表达OBF1导致矮牵牛染色体加倍；
图11为过表达OBF1矮牵牛根尖染色体计数；
图12为流式细胞仪证实过表达OBF1导致番茄染色体加倍；过表达植株命名为OX21
图13为过表达OBF1番茄根尖染色体计数；
图14为流式细胞仪证实过表达OBF1导致烟草茄染色体加倍；过表达植株命名为T100-2；
图15为OBF1过表达增强矮牵牛抗灰霉病能力；
图16为OBF1过表达增强番茄抗灰霉病能力；
图17为OBF1过表达增强烟草抗灰霉病能力。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1诱导矮牵牛染色体加倍及抗性的培养方法
(1)对OBF1基因ORF区进行引物设计，过表达引物序列如下(SEQ ID NO：3-4)：
OE_F1：ATCTCGAGATGGCATCTTCTAGTGGAAA；
OE_R1：ATGAGCTCTCAATACTGATAGAACATAT。
基因沉默引物序列如下(SEQ ID NO：7-8)：
rnai-F1：ATACTAGTGGCGCGCCAGTGAAATCCTTCGTTCTGGT
rnai-R1：ATGGATCCATTTAAATCATTGAACCTGATGAATTTCC。
(2)采用如上引物，进行PCR扩增，克隆得到OBF1基因片段；将OBF1基因沉默的片段构建到pGSA1285载体；将OBF1基因过表达的片段构建于pGSA1403载体，获得重组质粒；
(3)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2510V电击转化，转化后涂布到含有抗生素氯霉素的LB固体培养基上，筛选获得带有重组质粒的农杆菌；
(4)将次氯酸钠表面消毒后的野生型矮牵牛种子在1/2MS培养基中萌发，在培养室培养4周；
(5)剪取幼嫩叶片，在操净工作台中用手术刀将叶片划为长宽5mm左右的正方形；
(6)对步骤(3)中携带重组质粒的农杆菌进行活化并扩大培养；
(7)将步骤(5)中切好的叶片放置在步骤(6)中的菌液中，室温200转/min摇15～20min；
(8)将侵染后的幼嫩叶片转移到共培养培养基，黑暗处理两天；
(9)两天后，将叶片转移至带有相应筛选抗性的再生培养基，每两到三周更换一次培养基，等待分化；
(10)分化出的新芽转接到新的筛选培养基，依次转入生根培养基。
组培室培养条件为：温度22～24℃，光照/黑暗：16h/8h，光强1500-2000lx。
卡那霉素浓度设置与培养基配置如下表1；
表1
(11)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对NPTII_F与NPTII_R(如SEQ ID NO:5-6所示)，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了OBF1基因序列；
NPTII_F：AAGATGGATTGCACGCAGGT；
NPTII_R：AGCTTCAAAGCAGATCCAAG。
将转OBF1基因矮牵牛命名为T0代转基因株系，将T0代转基因株系移至日光温室培养。
(12)过表达转基因和基因沉默的矮牵牛植株表型见图1，统计不同株系植株茎干、叶片、胚轴、花瓣、花药、柱头、种子的大小，如图2-8所示；
(13)取矮牵牛嫩叶，置于多聚甲醛固定液固定2h，去离子水冲洗3次，手撕获得叶片表皮；倒置于LSM880型激光共聚焦扫描显微镜(laserscanning confocal microscope，LSM880，ZEISS)载物台上，检测观察幼苗叶片细胞大小，如图9。
(14)采用流式细胞仪对植株的倍性进行鉴定，统计卡那霉素不同处理浓度下的植株的加倍比率，结果见表2和图10。从图10来看，染色体加倍植株检测为单峰，表明加倍植株为纯系，且没有检测到嵌合体的发生，纯系植株的概率为100％。
表2不同浓度卡那霉素处理下，过表达OBF1获得染色体加倍的矮牵牛的比例
| 卡那霉素浓度 | 转基因植株(株) | 染色体加倍植株(株) | 染色体加倍比例(％) |
| 50mg/ml | 27 | 0 | 0 |
| 100mg/ml | 22 | 14 | 63.6 |
| 150mg/ml | 6 | 4 | 80 |
(15)取矮牵牛根尖，用常规方法进行预处理、固定、水浴和染色等操作，切取根尖部位少量分生组织常规压片，观察并进行染色体计数，如图11。
(16)在T0代株系花药成熟且花瓣开放前，进行自花授粉，获得T1代种子，继续培养、自花授粉获得T2代种子。将T2代种子，次氯酸钠消毒、播种，用添加有终浓度为25.0mg·mL-1卡那霉素的MS培养基继续筛选，以观察T2代植株分离情况。T2代种子在含有卡那霉素的MS培养基上发芽率为100％，染色体加倍率为100％。该T2代种子即为纯合染色体加倍的种子。
(17)选取T2代纯合转基因株系种子播种后培养，继续观察植株表型等农艺性状，用上述步骤(14)的方法进行流式细胞仪检测；
(18)将获得的过表达OBF1基因的纯合转基因株系叶片进行灰霉病病原菌接种。转基因植物(100-2)相对于野生型有较强的抗病表型，如图15所示。
实施例2诱导番茄染色体加倍的培养方法
(1)将15％次氯酸钠消毒15min，75％酒精消毒45s的番茄种子播种于培养基：MS/2+Vitamines R3+Agar 8g/L，pH 5.7；
(2)约一周后，种子长出实生苗，将子叶、下胚轴均切成小段，在预培养基上暗培养1天；
(3)将实施例1中步骤(3)的携带重组质粒的农杆菌进行扩大培养；
(4)将经预培养的外植体与带重组质粒的农杆菌混合，室温200转/min摇30min；外植体用灭菌滤纸吸干菌液，置于预培养基上暗培养2天；
(5)将外植体转置到筛选培养基中，光周期为18/6h，温度为22～25℃，湿度为60％，卡那霉素浓度设置与培养基配置如下表3；
表3
(4)每两周换一次新培养基；大约2-3周后，视外植体再生芽的生长情况而定，转入生根培养基中。
(5)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对NPTII_F与NPTII_R(SEQ ID NO：5-6所示)，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定植物为转基因阳性株系；
(6)采用流式细胞仪对植株的倍性进行鉴定，统计卡那霉素不同筛选浓度下的植株的加倍比率，结果见表4和图12。从图12来看，染色体加倍植株检测为单峰，表明加倍植株为纯系，且没有检测到嵌合体的发生，纯合体植株的概率为100％。
表4不同浓度卡那霉素处理下，过表达OBF1获得染色体加倍的番茄的比例
| 卡那霉素浓度 | 转基因植株(株) | 染色体加倍植株(株) | 染色体加倍比例(％) |
| 50mg/ml | 30 | 0 | 0 |
| 100mg/ml | 10 | 6 | 60 |
(7)取番茄根尖，常规方法进行预处理、固定、水浴和染色等操作，切取根尖部位少量分生组织常规压片，观察并进行染色体计数，如图13。
(8)将获得的过表达OBF1基因的纯合转基因株系叶片进行灰霉病病原菌接种。转基因植物(OX21)相对于野生型有较强的抗病表型，如图16所示。
实施例3诱导烟草染色体加倍的培养方法
(1)将15％次氯酸钠15min，75％酒精45s的表面消毒后的野生型烟草种子在1/2MS培养基中萌发，待长出子叶后移栽到土中，在培养室培养4～6周；
(2)剪取10-12个幼嫩叶片，10％次氯酸钠表面消毒；在操作台中用剪刀将叶片剪成长宽各为5mm左右的正方形；
(3)对实施例1中步骤(3)的携带重组质粒的农杆菌进行扩大培养；将步骤(2)中切好的叶片放置在菌液中充分浸泡10min；
(4)将叶片转移到共培养培养基，黑暗处理两天；
(5)将叶片再次转移至带有相应筛选抗性的筛选培养基，每两到三周更换一次培养基，等待分化；
卡那霉素浓度设置与培养基配置如下表5：
表5
(6)培养条件：光周期为18/6h，温度为25℃，湿度为60％；每两周换一次新培养基；大约2-3周后，视外植体再生芽的生长情况而定，转入生根培养基中；
(7)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对NPTII_F与NPTII_R(SEQ ID NO：5-6所示)，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定植物为阳性转基因株系；
(8)采用流式细胞仪对植株的倍性进行鉴定，统计卡那霉素不同筛选浓度下的植株的加倍比率，结果见表6和图14。从图14来看，染色体加倍植株检测为单峰，表明加倍植株为纯系，且没有检测到嵌合体的发生，纯合体植株的概率为100％。
表6不同浓度卡那霉素处理下，过表达OBF1获得染色体加倍的烟草的比例
| 卡那霉素浓度 | 转基因植株(株) | 染色体加倍植株(株) | 染色体加倍比例(％) |
| 50mg/ml | 10 | 0 | 0 |
| 100mg/ml | 20 | 6 | 33.3 |
(9)将获得的过表达OBF1基因的纯合转基因株系叶片进行灰霉病病原菌接种。转基因植物(T100-2)相对于野生型有较强的抗病表型，如图17所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其中，所述OBF1转录因子的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其特征在于：初始植物为双子叶杂合体。
3.根据权利要求2所述的OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其特征在于：初始植物包括矮牵牛、番茄和烟草。
4.根据权利要求3所述的OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其特征在于：将OBF1基因导入植物细胞或组织中，在卡那霉素处理下，得到染色体加倍的转基因细胞系或转基因植株。
5.根据权利要求4所述的OBF1转录因子在植物染色体加倍中的应用，其特征在于：通过卡那霉素处理过表达OBF1载体转化所述植物，所述植物包括初始植物的花粉、子叶、下胚轴、嫩叶以及转化后生根前所述初始植物的发育。
6.一种OBF1转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对OBF1基因ORF区进行引物设计，得到OE_F1和OE_R1引物对；
(2)采用所述引物对进行PCR扩增，克隆得到OBF1 ORF片段；将OBF1 ORF片段构建于带有卡那霉素抗性的植物表达载体，获得重组质粒；
(3)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2510V电击转化，转化后将菌液涂布到含有抗生素的LB固体培养基上，筛选获得带有重组质粒的农杆菌；
(4)对携带重组质粒的农杆菌在LB液体培养基上进行扩大培养；
(5)将所述扩大培养后的农杆菌侵染初始植株幼嫩组织，所述幼嫩组织包括子叶、下胚轴、嫩叶、花粉；
(6)将所述侵染后的外植体采用共培养培养基进行培养；
(7)将所述共培养后的外植体用初代卡那霉素筛选培养基进行诱导分化培养，获得新芽；
(8)将所述新芽切取，转接入初代卡那霉素筛选培养基继续培养，再依次转入生根培养基进行生根培养，转移到土里继续培养；
(9)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对NPTII_F与NPTII_R，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，确定植物为阳性转基因株系，即为T0代转基因株系；
(10)在T0代转基因株系花药成熟且花瓣开放前，进行人工自花授粉，继续培养获得种子；
(11)将所述种子消毒，经二代卡那霉素抗性培养基进一步筛选，获得生长正常的小苗；
(12)将所述生长正常的小苗转入营养土中继续培养，获得的植株即为T1代纯合的阳性转基因植株，也即纯合的染色体加倍的植株。
7.根据权利要求6所述的初代卡那霉素筛选压力，其特征在于：所述的卡那霉素处理浓度为100mg/g～150mg/g。
8.根据权利要求6所述的二代卡那霉素抗性培养基，其特征在于：所述的卡那霉素处理浓度为15mg/g～30mg/g。
9.根据权利要求6所述的OBF1转基因植物的培育方法，其特征在于：所述用于OBF1ORF片段扩增的引物序列如SEQ ID NO：3-4所示，
OE_F1：ATCTCGAGATGGCATCTTCTAGTGGAAA；
OE_R1：ATGAGCTCTCAATACTGATAGAACATAT。
10.根据权利要求6所述的OBF1转基因植物的培育方法，其特征在于：所述NPTII_F和NPTII_R序列如SEQ ID NO：5-6所示，
NPTII_F：AAGATGGATTGCACGCAGGT；
NPTII_R：AGCTTCAAAGCAGATCCAAG。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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