WO2017195905A1 - 形質転換植物の作製方法 - Google Patents

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plant
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shoot
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晴康 濱田
洋三 柳楽
隆二 三木
直明 田岡
亮三 今井
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株式会社カネカ
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    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm

Definitions

  • the present invention relates to a plant implanter transformation method using a particle gun method.
  • Non-patent Document 1 a transformation method (inplanter transformation method) that does not use calli or tissue pieces in an in vitro culture system is also known.
  • an implanter transformation method a method is known in which a gene is directly introduced into the shoot apex of an exposed immature embryo or a fully mature embryo using a particle gun method (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 describe a method for introducing a gene by introducing Agrobacterium into a mature embryo immediately after germination.
  • Non-Patent Document 1 has not yet demonstrated that the transgene is transmitted to the next generation. Due to such factors, the above-described method has not been generalized until now.
  • the present invention provides a plant transformation method that does not use calli or tissue pieces in an in vitro culture system.
  • the present invention also provides a plant transformation method that does not introduce a selection marker gene.
  • the present invention further provides a method for producing a transformed plant having excellent reproducibility.
  • the present invention includes the following.
  • a plant transformation method comprising a step of coating fine particles having a diameter of 0.3 ⁇ m or more and 0.9 ⁇ m or less with at least one kind of nucleic acid, and a mature seed embryo using the coated fine particles using a gene gun
  • the method according to (1) which comprises a step of implanting into a shoot apical stem cell that transitions to a germ cell line among the shoot apex of an embryo of the mature seed or the bud of a tuber.
  • the shoot apex of the mature seed embryo is the shoot apex exposed by removing endosperm, sheath leaves, leaf primordia and excess scutella from the mature seed.
  • Any one of the methods is possible.
  • the shoot apex of the tuber bud is an shoot apex that is exposed by removing the tuber and leaf primordia from the tuber shoot.
  • the linear DNA is a linear plasmid in which a nucleic acid of 0.8 kb or more and 1.2 kb or less is added to both ends of a nucleic acid cassette to be introduced, any one of (1) to (6) The method described.
  • the plant according to any one of (1) to (8), wherein the plant is any one selected from the group consisting of wheat, barley, rice, corn, soybean, potato and apple. Method.
  • (10) A method for producing a plant transformant using the method according to any one of (1) to (9). (11) A transformant produced by the production method of (10) (excluding those known at the time of filing).
  • a target gene can be efficiently introduce
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Southern analysis of transgenic individuals (Example 3).
  • Figure 4A is a diagram of the overall photo T 1 generation seeds GFP fluorescence observation according to Example 4 of the present invention.
  • 4B is a diagram of GFP fluorescence observation photograph of T 1 generation of half seeds according to Example 4 of the present invention.
  • Figure 4C is a diagram of a GFP fluorescence photograph of the T 1 generation of young leaves according to a fourth embodiment of the present invention.
  • FIG. 4D is a diagram of a Western blot photograph of detecting the GFP protein T 1 generation of mature leaf according to a fourth embodiment of the present invention.
  • Figure 5A is a photograph showing the results of Southern analysis of the resulting genomic DNA from T 1 seeds young leaves obtained from the main stem.
  • FIG. 5B is a photograph showing the results of Southern analysis of genomic DNA obtained from young leaves of T 1 seed obtained from the main stem and tiller (Example 5).
  • FIG. 6 is a photograph showing transient expression of GFP in maize (Example 6).
  • FIG. 7 is a photograph showing transient expression of soybean GFP (Example 7).
  • FIG. 8 is a photograph showing transient expression of GFP in barley (Example 8).
  • FIG. 9 is a photograph showing transient expression of GFP in potato (Example 9).
  • the in-planter transformation method according to the present invention includes a step of absorbing a mature seed of a plant, a step of exposing an embryo shoot apex in the seed, and a step of transforming a cell of the shoot apex.
  • seed includes not only natural seeds obtained by cultivating (or cultivating) plants under natural or near conditions, but also artificial seeds, preferably natural seeds. However, if an artificial seed capable of obtaining a transformable shoot apex is developed, it can be used. Natural seeds include not only seeds obtained in outdoor fields, but also seeds obtained by greenhouse cultivation and seeds obtained from tissue culture such as in vitro seedlings. Seeds obtained by direct reprogramming can also be used as seeds of the present invention as long as the shoot tips can be obtained.
  • ripe seeds or underground stems as a material for obtaining the shoot apex.
  • a fully-ripened seed means a seed that has been matured as a seed after the ripening process after pollination has been completed.
  • the rhizome is a general term for the stems in the basement, and refers to a tuber having a lot of buds, a bulbous bulb having a large apical bud, a bulb having a shortened stalk, and a bulb having an enlarged scale leaf.
  • the shoot apex is meant to include a growth point (shoot apical meristem) at the tip of the stalk and a tissue composed of the growth point and several leaf primordia generated from the growth point.
  • a growth point shoot apical meristem
  • tissue composed of the growth point and several leaf primordia generated from the growth point.
  • only the hemispherical (dome-shaped) growth point from which the leaf primordium has been removed may be used as the shoot apex, or the shoot apex containing the growth point and the leaf primordium or a plant tissue containing the shoot apex may be used. Good.
  • a virus-free tissue can be obtained.
  • germ cell line is a general term for germ cells ranging from primordial germ cells that are the source of germ cells to egg cells and sperm cells that are end products, and “L2 layer” The second cell layer from the outside of the shoot apical meristem.
  • the target plant of the implanter transformation method according to the present invention is a seed plant including angiosperms and gymnosperms.
  • Angiosperms include monocotyledons and dicotyledons.
  • the in-planter transformation method is a transformation method that generally does not include a tissue culture operation, and is a method in which cells at a growth point site are transformed while the plant is growing.
  • the implanter transformation method is used in the sense that it includes only a tissue culture method using shoot apical culture and does not include other methods including tissue culture operations.
  • the monocotyledonous plant may be of any kind, and examples thereof include a grass family plant, a lily family plant, a bamboo family plant, a pineapple family plant, and an orchid family plant.
  • grasses include rice, wheat, barley, corn, oats, buckwheat, sorghum, rye, millet and sugar cane.
  • liliaceae include leeks and asparagus.
  • plantaceae include bananas.
  • pineapple plants include pineapples.
  • Orchids include orchids.
  • Dicotyledonous plants include, for example, cruciferous plants, legumes, eggplants, cucurbits, convolvulaceae, roses, mulberry plants, mallows, asteraceae plants, amaranthaceae, and seeds. Family plants.
  • Examples of cruciferous plants include Arabidopsis, Chinese cabbage, rapeseed, cabbage, cauliflower, and radish.
  • Leguminous plants include soybean, azuki bean, kidney bean, pea, cowpea, alfalfa and the like.
  • Examples of solanaceous plants include tomatoes, eggplants, potatoes, tobacco, and peppers.
  • Examples of cucurbitaceae plants include cucumber, cucumber, melon and watermelon.
  • Convolvulaceae plants include morning glory, sweet potato (sweet potato), and convolvulus.
  • Examples of the Rosaceae plant include roses, strawberries, and apples.
  • Mulberry plants include mulberry, fig, rubber tree and the like. Examples of mallows include cotton and kenaf.
  • An example of an Asteraceae plant is lettuce.
  • Examples of the Amaraceae plant include sugar beet (sugar beet).
  • Examples of the plantaceae include buckwheat.
  • gymnosperms examples include pine, cedar, ginkgo and cycad.
  • a mature seed of a plant is absorbed. If necessary, vernalization may be performed before water absorption.
  • Water absorption is performed by soaking seeds in water and incubating them.
  • the water absorption temperature is preferably 15 to 25 ° C. for wheat, barley or rice, for example, and preferably 25 to 35 ° C. for corn or soybean.
  • the water may be exchanged once or more.
  • the water absorption period is preferably before the radicle starts to grow or before a new leaf primordium is formed.
  • water absorption time although depending on the dormant state of the seed, it is less than 16 hours after water absorption, preferably 12 hours.
  • Step of Exposing Embryonic Apex in Seed the apex of the embryo in the seed soaked in water is exposed.
  • the shoot apex is exposed by removing the sheath leaves and leaf primordia.
  • the shoot apex is exposed by removing the seed coat and cotyledons.
  • sprouting is performed from the seed pod, and the shoot apex is exposed by removing the leaf primordia from the cut out young shoots.
  • the shoot apex is exposed by removing the leaf primordia from the seed embryo or the extracted apical bud or side bud.
  • the exposure means may be any means as long as it can remove the sheath leaves and leaf primordia or seed coat and cotyledons under a stereomicroscope. Instruments for installation, tweezers, pipettes, syringes, and cutting instruments such as scalpels and cutters. Next, the endosperm and the excess scutellum part are excised using a cutting tool such as a scalpel, and the embryo and scutellum including the exposed shoot apex are placed on the agar medium with the shoot apex facing upward. To obtain a virus-free shoot apex, the scalpel may be replaced with a new sterile scalpel at the final stage of cutting the shoot apex. In this case, a virus-free transformant can be obtained.
  • Step of transforming shoot apical cell A known gene engineering technique can be used to introduce the target gene, and is not particularly limited.
  • a recombinant vector containing the target gene is prepared, and the Agrobacterium method, electroporation method, particle gun method, PEG-calcium phosphate method, liposome method, microinjection are targeted at the shoot apex of the mature embryo
  • Nucleic acids (recombinant vectors, etc.) and proteins can be introduced by the method, whisker method, plasma method, laser injection method, etc., but in wheat, rice, corn or soybean, particles are introduced from the efficiency of introduction into plants.
  • a method of introducing a mature seed embryo using a cancer method is preferable.
  • the particle gun method is also effective for introducing genes into the potato shoot apex.
  • the particle gun method is a method in which a metal particle is coated with a gene and implanted into a cell tissue, and is effective when the infection efficiency of Agrobacterium is low like a monocotyledonous plant.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include pAL systems (pAL51, pAL156, etc.), pUC systems (pUC18, pUC19, pUC9, etc.), pBI systems (pBI121, pBI101, pBI221, pBI2113, pBI101.2, etc.), A pPZP system, pSMA system, intermediate vector system (pLGV23Neo, pNCAT, etc.), cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), tobacco mosaic virus (TMV), etc. can be used.
  • pAL systems pAL51, pAL156, etc.
  • pUC systems pUC18, pUC19, pUC9, etc.
  • pBI systems pBI121, pBI101, pBI221, pBI2113, pBI101.2, etc.
  • a pPZP system pSMA system
  • intermediate vector system pLGV23Neo,
  • the vector containing the target gene can be prepared, for example, as follows.
  • To insert the gene of interest into a vector for example, use a method in which purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or multiple cloning site, and linked to the vector. Can do.
  • the target gene may be inserted into the intermediate vector by double cross-over, and TA cloning, In-Fusion cloning, or the like may be used.
  • the target gene is not particularly limited as long as expression or suppression of expression of the gene is desired, and may be an endogenous gene of the target plant or a foreign gene.
  • the foreign gene may be of a different species, and for example, a gene such as an animal, a plant, a microorganism, or a virus can be used.
  • genes examples include sugar metabolism-related genes, lipid metabolism-related genes, useful substance (pharmaceuticals, enzymes, pigments, aromatic components, etc.) production genes, plant growth control (promotion / suppression) genes, flowering regulation-related genes, tolerance Pest resistance (insect feeding resistance, nematode, fungus and fungal resistance, virus (disease) resistance, etc.) gene, environmental stress (low temperature, high temperature, dryness, salt, light damage, UV) resistance gene, Examples include transporter genes, genes related to flour milling characteristics, bread characteristics, noodle characteristics, and site-specific nuclease genes.
  • the target gene may be introduced so as to express antisense, ribozyme, RNAi, etc. depending on the purpose of gene introduction.
  • “genome editing” is a part of the technology called New Breeding Technique (NBT), which introduces mutations by cleaving specific genes on the genome using meganuclease, CRISPR-CAS, etc.
  • NBT New Breeding Technique
  • targeted genes can be destroyed with high efficiency.
  • Genome editing can be said to be a technique different from conventional plant transformation methods in which foreign genes are incorporated almost randomly, such as the direct introduction method or the Agrobacterium method.
  • Genome editing technology includes a step of cleaving genomic DNA using a nuclease or guide RNA that can target a cleavage site and a nuclease, and a conventional transformation method that does not use such targetable nuclease or guide RNA and nuclease Can be distinguished.
  • nuclease protein may be introduced into a cell, and DNA and / or RNA encoding a nuclease gene is introduced into a cell to express the nuclease protein. It means that it may be.
  • RNA may be introduced into a cell, or guide RNA may be expressed by introducing DNA capable of expressing guide RNA.
  • Examples of the protein encoded by the site-specific nuclease gene include zinc finger nuclease, protein expressing zinc finger nuclease activity, or TAL effector nuclease (TALEN).
  • Zinc finger nuclease is a fusion protein of several zinc finger motifs that recognize specific bases and FokI nuclease.
  • TALLEN is a fusion protein of a transcribation activator like (TAL) effector and a FokI nuclease.
  • Site-specific nucleases are composed of other additional targeting techniques such as meganucleases, RNA-induced CRISPR-Cas9, or leucine zippers.
  • the expression of one or more gene products can be altered or altered by introducing site-specific nucleases into cells using the transformation method of the invention, integrating into the genome, expressing and editing the genome. . That is, introducing a CRISPR-Cas system into a cell containing and expressing a DNA molecule encoding one or more gene products, which may include a Cas protein and one or more guide RNAs targeting the DNA molecule, thereby One or more guide RNAs target genomic loci of DNA molecules encoding one or more gene products, and a Cas protein cleaves genomic loci of DNA molecules encoding one or more gene products; Thereby the expression of one or more gene products can be altered or modified.
  • the Cas protein and guide RNA may be naturally occurring (combination), or may be a combination that does not exist in nature. In the present invention, the expression of two or more gene products may be altered or modified.
  • the guide RNA may include a guide sequence fused to a tracr sequence.
  • the length of the guide RNA is at least 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucleotides, and the preferred upper limit is 30 or less, more preferably 25 or less, even more preferably 22 or less, most preferably 20. is there.
  • the cells to be transformed are plant cells, more preferably shoot apical meristem cells, more preferably L2 cells in the shoot apical meristem, and most preferably shoot apical meristems.
  • the Cas protein may contain one or more nuclear localization signals (NLS).
  • the Cas protein is a type II CRISPR-based enzyme.
  • the Cas protein is a Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is S. pneumoniae, S. pyogenes, or S. pneumoniae. S. thermophilus Cas9, which may include mutant Cas9 derived from those organisms.
  • the protein can be a Cas9 homolog or ortholog.
  • Cas protein may be codon optimized for expression in eukaryotic cells.
  • the Cas protein can direct the cleavage of one or two strands in the localization of the target sequence.
  • the expression of the gene product is decreased and the gene product is a protein.
  • a promoter, enhancer, insulator, intron, terminator, poly A addition signal, selection marker gene and the like can be linked to the vector.
  • the target gene to be inserted into the vector may be plural kinds per vector, and the recombinant vector coated on the fine particles may be plural kinds per fine particle.
  • a recombinant vector containing a target gene and a recombinant vector containing a drug resistance gene may be prepared separately, mixed, coated with fine particles, and shot into plant tissue.
  • a promoter is not derived from a plant as long as it is a DNA that functions in a plant body or a plant cell and is constitutively expressed, or can induce expression in a specific tissue of a plant or a specific developmental stage. Also good. Specific examples include, for example, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, El2-35S omega promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), corn-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, ADH , RuBisco promoter and the like. Translational efficiency can be increased using sequences that enhance translational activity, such as the omega sequence of tobacco mosaic virus.
  • a protein can be translated from a plurality of coding regions by inserting an IRES (internal ribosomal entry site) as a translation initiation region 3'-downstream of the promoter and 5'-upstream of the translation initiation codon.
  • IRES internal ribosomal entry site
  • the terminator may be any sequence that can terminate the transcription of the gene transcribed by the promoter and has a poly A addition signal.
  • the terminator of the nopaline synthase (NOS) gene the terminator of the octopine synthase (OCS) gene
  • CaMV 35S terminator the terminator of the nopaline synthase (NOS) gene
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • selection marker genes include herbicide resistance genes (bialaphos resistance gene, glyphosate resistance gene (EPSPS), sulfonylurea resistance gene (ALS)), drug resistance genes (tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene). , Hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc., fluorescence or luminescence reporter genes (luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase (GUS), green fluorescence protein (GFP) )), Neomycin phosphotransferase II (NPT II), dihydrofolate reductase, and other enzyme genes.
  • a transformant can be produced without introducing a selection marker gene.
  • the vector containing the target gene to be shot into the plant may be a circular plasmid, a linear DNA obtained by cleaving the plasmid with a restriction enzyme or the like, a nucleic acid cassette fragment obtained by excising only the DNA fragment to be introduced, or one or both of the cassette fragments. It may be a DNA fragment to which a nucleic acid of 0.8 kb or more and 1.2 kb or less is added at the end. These DNA fragments may be DNA fragments amplified by PCR.
  • the nucleic acid to be added is not particularly limited and may be a vector-derived sequence, but the sequence of the target site for introduction is more preferably used.
  • the lower limit of the length of the nucleic acid added to the end of the cassette fragment is 0.5 kb or more, more preferably 0.8 kb or more, more preferably 1.0 kb or more, and the upper limit is 3.0 kb or less. Preferably it is 2.0 kb or less, More preferably, it is 1.5 kb or less.
  • the target gene and / or protein can be coated on the surface of a microparticle (microcarrier) and shot into a plant cell with a gene gun.
  • a microparticle microcarrier
  • metal fine particles are preferably used because they have high specific gravity and are chemically inactive and hardly cause harm to the living body in order to enhance penetration into cells.
  • gold particles, tungsten particles and the like are particularly preferably used.
  • a target gene can be introduced into a plant cell as follows. First, fine particles such as gold particles or tungsten particles are washed and sterilized, and the fine particles, nucleic acid (recombinant vector, linear DNA, RNA, etc.), CaCl 2 , spermidine are added with stirring with a vortex mixer or the like to add DNA. Coat gold or tungsten particles and wash with ethanol.
  • the particle diameter of the fine particles is preferably 0.3 ⁇ m or more and 0.9 ⁇ m or less, more preferably 0.4 ⁇ m or more, further preferably 0.5 ⁇ m or more, and particularly preferably 0.6 ⁇ m.
  • a more preferable upper limit of the particle diameter is 0.8 ⁇ m or less, more preferably 0.7 ⁇ m or less, and particularly preferably 0.6 ⁇ m.
  • Gold particles or tungsten particles are applied as uniformly as possible to the macro carrier film using a pipetman or the like, and then dried in an aseptic environment such as a clean bench.
  • a macro carrier film and a plate on which the shoot apex of the mature embryo of the target is placed are installed in a particle gun apparatus, and high-pressure helium gas is emitted from the gas accelerator tube toward the macro carrier film.
  • the macro carrier film stops at the stopping plate, but the gold particles pass through the stopping plate, penetrate into the target placed under the stopping plate, and the target gene is introduced.
  • the distance between the stopping plate and the target shoot apex is preferably 9 cm or less, more preferably 8 cm or less, still more preferably 7 cm or less, and particularly preferably 6 cm or less, although it depends on the particle size of the fine particles.
  • the lower limit of the distance is, for example, preferably 2 cm or more, more preferably 3 cm or more, and further preferably 4 cm or more.
  • the distance between the stopping plate and the target can be appropriately determined by a transient expression experiment or the like according to the type of fine particles, particle size, gas pressure, and the like.
  • the gas pressure depends on the type of fine particles and the distance to the target, but is preferably 1,100 to 1,600 psi, and more preferably 1,200 to 1,500 psi, for example.
  • an optimal pressure can be appropriately determined by a transient expression experiment or the like according to the type of fine particles, the type of target, the distance between the target and the stopping plate, and the like.
  • the number of shots of fine particles on the shoot apex is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more.
  • the upper limit of the number of times the fine particles are shot on the shoot apex is preferably 20 times or less, more preferably 15 times or less, and still more preferably 10 times or less.
  • an optimal number can be determined as appropriate by a transient expression experiment or the like.
  • the nucleic acid is released from the microparticle, and the nucleic acid is integrated into the genomic DNA, whereby a transformed cell is obtained.
  • transformation may be performed without integration.
  • foreign genes can be introduced into organelles. In that case, it is preferable to use a gene operably linked to a promoter that is specifically expressed in an organelle.
  • the shoot apex of the fully-ripened embryo that has been transformed is grown on an agar medium for about one month, and then transplanted to soil.
  • transformants can be obtained by growing in a normal medium (without antibiotics) without applying selective pressure with drugs, It may be introduced.
  • a drug resistance gene is introduced, transformed cells can be selectively cultured with the drug.
  • a selective agent suitable for shoot tip culture for example, sulfonylurea herbicide chlorosulfuron (tolerance can be acquired by introduction of mutant ALS gene (acetobutyrate synthase gene) is known.
  • the drug resistance gene may be on the same vector as the target gene or on a different vector.
  • the drug resistance gene When inserted on separate vectors, if they are integrated into separate chromosomes, plant individuals with the target gene introduced by self-pollination or backcrossing and taking offspring and plant individuals with drug resistance genes There is an advantage that it can be separated.
  • a plant body into which a target gene has been introduced or a genome-edited plant body can be produced.
  • the plant produced in this way stably expresses the target gene, or suppresses the expression of the target gene and inherits (transmits) normally to the progeny.
  • the efficiency of gene introduction into wheat and the target gene expression efficiency can be examined as follows.
  • the efficiency of gene introduction can be determined by extracting DNA from growing individuals after transformation treatment and detecting the target gene by PCR and / or electrophoresis or Southern blotting. The number of explants used for introduction The gene transfer efficiency is calculated from the number of growing individuals who had foreign genes.
  • the expression efficiency of the target gene is determined by examining the presence or absence of RNA expressed from the target gene in growing individuals in which the gene has been introduced.
  • the presence or absence of RNA can be confirmed by, for example, the RT-PCR method. You may detect by Northern blotting.
  • the target gene expression efficiency is calculated from the number of explants used for introduction and the number of growing individuals in which the presence of the protein expressed from the target gene was confirmed.
  • Example 1 To find the study appropriate gold particle size of optimal gold particle size gene transfer, the presence of the transgene in the presence or absence or a contemporary GFP fluorescence in shoot apex after gene introduction treatment (T 0 generation) investigated.
  • MS-maltose medium (4.3 g / L MS salt, MS vitamin, 30 g / L maltose, 0.98 g / L MES, 3% PPM (plant preservative mixture, Nacalai Tesque) 7.0 g / L phytagel (registered trademark, Sigma-Aldrich), pH 5.8).
  • a plasmid DNA solution (1 ⁇ g / ⁇ L) purified by Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen) was placed at 5 ⁇ g per 750 ⁇ g of gold particles.
  • the sterilized gold particle-containing solution was carefully suspended using an ultrasonic generator (Ultrasonic Washer UW-25, manufactured by Taga Electric Co., Ltd.), and an appropriate amount was put into the tube and stirred by pipetting.
  • the particle gun uses Biolistic (registered trademark) PDS-1000 / He Particle Delivery System (BIO-RAD), the pressure at the time of shooting is about 94.9 kgf / cm 2 (1,350 psi), and the distance to the target tissue was 5 cm (particle diameter 0.6 ⁇ m or more) or 3.5 cm (particle diameter less than 0.6 ⁇ m). Shot four times per petri dish. After shooting, it was allowed to stand overnight in a dark place at 22 ° C.
  • T 0 in a plant body obtained whether transgenes in plant leaves, and the presence or absence of GFP gene is a fluorescent reporter gene was investigated by the PCR method.
  • Genomic DNA was extracted from the 4th to 6th leaves (50 mg) using the benzyl chloride method, and using this as a template, a PCR reaction was performed using a primer prepared from a sequence specific to the GFP gene.
  • Primer sequence: ACCATGTGATCCGCGCTCT SEQ ID NO: 2
  • PCR was performed using TaKara PCR Thermal Cycler Dice (registered trademark) for 3 minutes at 95 ° C., followed by 33 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 minute. Cycled. After the PCR reaction, 1.0% agarose gel electrophoresis was performed, and the PCR product was detected by staining with ethidium bromide. The one in which the expected 601 bp GFP gene fragment was detected was determined as a transgenic individual.
  • Gene transfer efficiency per number of fully matured embryos (number of transgenic individuals / treatment) in which the gene introduction treatment was performed from the number of transgenic individuals obtained in two types of gold particle diameters of 1.0 ⁇ m and 0.6 ⁇ m used for gene introduction The number of mature embryos ⁇ 100) was calculated.
  • Example 2 to find the study appropriate gas pressure optimum gas pressure in gene transfer was investigated whether the transgene and the presence or absence of GFP fluorescence in the shoot apex after gene introduction treatment in the contemporary (T 0 generation) .
  • Example 1-1- (4) Investigation of transient expression efficiency of GFP protein The method described in Example 1-1- (4) was followed. As a result, the gene transfer efficiency described in Example 1-1- (4) was 74.2% when the gas pressure was 1,350 psi, which was higher than 13.3% when the gas pressure was 1,100 psi. (Table 3). Further, as described later, the T 0 generation gene transfer efficiency was also higher at the gas pressure of 1,350 psi than at the gas pressure of 1,100 psi.
  • Example 1-2- (5) was followed.
  • the gene transfer efficiency described in Example 1-2- (5) was 4.2% when the gas pressure was 1,350 psi, which was higher than 0.8% when the gas pressure was 1,100 psi. (Table 3). Therefore, compared to the gas pressure of 1,100 psi, the gene transfer efficiency is improved by using the gas pressure of 1,350 psi, which was higher in the transient expression efficiency of the GFP protein in Example 2-1 (4).
  • Example 3 to find the study appropriate water absorption time of optimal water absorption time for gene transfer, whether its contemporary GFP fluorescence in shoot apex after gene introduction treatment (T 0 generation) and next generation (T 1 generation) The presence or absence of the transgene in was investigated.
  • T 1 foster individual transgenes is confirmed by the presence of the transgene (2) in the plant leaves were obtained T 1 seed. About 10 to 20 grains of each T 1 seed were sown and grown, and the first leaf (50 mg) was sampled. Genomic PCR and electrophoresis were in accordance with Example 1- (2) -5. In the case where the mature embryos after each water time transformed process, each resulting transgene confirmed individuals (T 1 generation) from per number mature embryos were transgenic process gene transfer efficiency (the transgenic population / processing The number of mature embryos ⁇ 100) was calculated. As a result, the gene transfer efficiencies when mature seeds that had been absorbed for 6 to 12 hours and 12 to 18 hours were used in the experiment were 3.1% (FIG.
  • transgene confirmation individuals T 1 generation 5 lines shown in Table 4, by Southern blot analysis in which the GFP gene region as a probe, it was confirmed that the GFP gene is inserted into the genomic DNA (Fig. 3).
  • T 1 introduced in transgenic wheat made by confirming the gene introduction method of gene expression in generation gene (GFP gene) expression.
  • T 1 and T 1 seeds obtained in GFP fluorescence observation Example 3-2- (3) in seeds placed in a sterile Petri dish, LAS 3000 (FujiFilm) below, result of observation of GFP fluorescence of T 1 seeds (filter 510DF10), GFP fluorescence was observed in the seed (FIG. 4A).
  • the seeds in which GFP fluorescence was observed were cut in half, and endosperm GFP fluorescence observation (excitation: 470/40, absorption: 525/50) was performed under a stereoscopic fluorescence microscope (Mica FLZ manufactured by Leica).
  • Mica FLZ manufactured by Leica
  • T 1 generation young leaf samples the young leaf of the T 1 generation plants were grown in expression analysis example of GFP fluorescent protein 3-2- (3) in, fluorescence stereomicroscope (Leica Inc. MZFLIII) below, in leaves GFP fluorescence (excitation: 470/40, absorption: 525/50) was observed. As a result, as shown in FIG. 4C, GFP fluorescence was observed in the stomatal cells of the leaves in the genomic PCR positive individuals (transformants).
  • transformants can be obtained essentially by the same method as wheat.
  • T 0 generation 1 fabricated transgenic individuals in genotype confirmed the method in the T 1 generation each individual acquired from the system (T 0 generation), cells with different genetic information in the same individual becomes a mixed chimera. Therefore, Southern blot analysis was performed in order to investigate whether or not a plurality of T 1 seeds obtained from a transgenic individual (T 0 generation) have different genetic information.
  • T 0 generation FG1 system of individuals obtained in Example 3-2- (3) From T 0 generation FG1 system of individuals obtained in Example 3-2- (3), and harvested T 1 seed per panicle from the main stem and five tillers were seeded multiple individuals from there .
  • Growing the inoculated T 1 generation individuals, according to the method described in Example 3-2- (3) were examined the presence or absence of the transgene in each T 1 generation individuals.
  • the transgene Table 5
  • T 1 seeds obtained from young leaves of 14 T 1 seeds (FG1-main stem-1 to 14) obtained from the main stem, and Southern blot analysis was performed using the GFP gene region as a probe. went. As a result, the same signal pattern was obtained for all individuals (FIG. 5A). Further, T 1 seeds obtained from the main stem and tillers 1, 3, 4, 5 (FG1-main stem-1, FG1- tiller 1-1, FG1- tiller 3-1, FG1- Genomic DNAs obtained from young leaves of tiller 4-1 and FG1-tiller 5-1) were subjected to HindIII treatment, and Southern blot analysis was performed as described above. As a result, the same signal pattern was obtained for all individuals (FIG. 5B).
  • T 1 seeds obtained from a single line of transgenic individuals have the same genetic information. This suggests that a very small number of shoot apical stem cells migrate to the germline, and it was found that gene transfer into this very small number of shoot apical stem cells was possible by this method.
  • Example 6 Acquisition of transformant in corn In order to confirm whether or not a corn transformant can be obtained by the same method as in wheat, the presence or absence of GFP fluorescence at the shoot apex after the gene introduction treatment was examined.
  • Example 7 Acquisition of transformant in soybean In order to confirm whether or not a transformant of soybean can be obtained by the same method as in wheat, the presence or absence of GFP fluorescence at the shoot apex after the gene introduction treatment and the subsequent acquisition of the transformant The efficiency was investigated.
  • T 0 survey and genomic PCR indicators in generation plants (1) stand overnight growth transformants treated individuals transformants treated individuals RM medium (4.3g / L MS salt, MS vitamin, 3% sucrose, 0 Transplanted into a disposable plant cell culture vessel (Sigma) containing .50 g / L MES, 3% PPM (plant preservative mixture, Nacalai Tesque), 0.3% gellite, pH 5.7) and incubator (23 ° C., 16 hours) Nurtured). When the growth of roots and the differentiation of leaves from the top of the stem were observed, the cells were transplanted to cell trays containing horticultural seedling culture soil. Then, it grew to the 2nd leaf in the same incubator.
  • PCR was performed using TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice for 3 cycles at 95 ° C for 3 minutes, followed by 32 cycles of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute. After the PCR reaction, 1.0% agarose gel electrophoresis was performed, stained with ethidium bromide, the PCR product was detected by ultraviolet irradiation, and the expected 601 bp GFP gene fragment was detected as a transgenic individual. It was judged.
  • Gene transfer efficiency per number of fully matured embryos that have undergone gene transfer processing is calculated from the number of transgenic individuals obtained at a gold particle diameter of 0.6 ⁇ m used for gene transfer (number of transgenic individuals / number of fully mature embryos x 100) did.
  • Example 8 Acquisition of transformant in barley In order to confirm whether or not a barley transformant was obtained by the same method as in wheat, the presence or absence of GFP fluorescence at the shoot apex after the gene introduction treatment was examined.
  • Example 1-1- (4) Investigation of transient expression efficiency of GFP protein The method described in Example 1-1- (4) was followed. As a result, compared with gold particle diameters of 1.6 ⁇ m and 1.0 ⁇ m, gene introduction efficiency at the shoot apex was higher in the case of gold particle diameters of 0.8 ⁇ m, 0.6 ⁇ m, and 0.3 ⁇ m (Table 8). In particular, when 0.3 ⁇ m was used, the gene transfer efficiency at the shoot apex was the highest at 80.0% compared to other gold particle sizes (FIG. 8, Table 8).
  • Example 9 Acquisition of transformants in potato In order to confirm whether or not potato transformants could be obtained by the same method as in wheat, the presence or absence of GFP fluorescence at the shoot apex after gene transfer treatment was examined.
  • Primer sequence CGACGGCCAGTGCCAAGCTT (SEQ ID NO: 4) Primer sequence: ATGACCATGATTACGAATTC (SEQ ID NO: 5) Primer sequence: AAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCA (SEQ ID NO: 6) Primer sequence: ATACTGTCCCTTCTAGTGTAGCCG (SEQ ID NO: 7)
  • PCR was carried out using TaKara PCR Thermal Cycler Dice for 40 cycles, with a reaction of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds and 68 ° C. for 2 minutes 30 seconds as one cycle.
  • the PCR product was purified by ethanol precipitation, dissolved in sterilized water to 1 ⁇ g / ⁇ L, and used for the following experiments.
  • a linear vector (a nucleic acid cassette targeted for introduction) is preferable for gene introduction, and more preferably a linear vector in which a nucleic acid of 0.8 kb or more is added to both ends of the nucleic acid cassette intended for introduction I found out that
  • transformants can be obtained essentially by the same method as in wheat. 1. Preparation of ripe rice seeds Ripe ripened rice (variety: Nipponbare) was sterilized and washed by the method described in Example 1-1- (1), and then placed on a Kim towel or filter paper moistened with sterilized water. Those incubated for 24 to 48 hours at 0 ° C. are used in the following experiments.
  • transformants in apples For apples, transformants can be obtained essentially in the same manner as in wheat. 1. Preparation of apple shoot apex The shoot apex of apple (variety: Jonagold) is prepared according to the shoot apical culture induction conditions described in Plant tissue culture, 9 (2), 69-73 (1992).
  • Exposed shoot apex MS-maltose medium (4.3 g / L MS salt, MS vitamin, 30 g / L maltose, 0.98 g / L MES, 3% PPM) (Plant preservative mix, registered trademark, Nacalai Tesque), 7.0 g / L phytagel, pH 5.8).
  • Example 1-1- (3) As a gene transfer promoter, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter was used, and the method described in Example 1-1- (3) was followed. 4). Selection using transient expression of GFP protein as an index 5 spots in the shoot apical tissue among individuals transformed with a gold particle diameter of 0.6 ⁇ m according to the method described in Example 1-1- (4) Those in which the above GFP fluorescence is observed are selected. 5). Growth of transformed individuals According to the method described in Example 1-2- (4), transformed individuals are grown. 6). According to the method described in confirmation Example of transgenes 1-2- (5) in T 0 plants leaves, acquires the transgenic confirmation individual. A stable transformant can be obtained by growing the obtained individual and obtaining next-generation seeds.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • the present invention can be used in agriculture, pharmaceutical industry, enzyme industry and the like.

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Abstract

本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない植物の形質転換方法を提供する。本発明はまた、選択マーカー遺伝子を導入しない植物形質転換方法を提供する。本発明はさらに、再現性に優れる形質転換植物の作製方法を提供する。　植物の形質転換方法であって、直径０．３μｍ以上０．９μｍ以下の微粒子を、少なくとも１種の核酸により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育し、植物体を得る工程と、該植物体から形質転換植物体を選択する工程とを含む、方法。

Description

形質転換植物の作製方法
　本発明は、パーティクルガン法を用いた植物のインプランタ形質転換方法に関する。
　現在普及している植物の一般的な形質転換法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系のプロトプラスト、カルス又は組織片などに外来遺伝子を、電気穿孔法、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介して又はパーティクルガン法などにより導入する方法である。しかしこれらの方法では、遺伝子が細胞または組織に導入されたとしても、植物品種によっては組織培養が困難で、植物体を再生して形質転換体を作製することが難しいという問題があった。また、形質転換効率が十分に高くなく、そのため選択マーカー遺伝子を導入してマーカー選抜を行わなければならないという問題もあった。さらに、長期の組織培養を必要とすることに伴い、体細胞変異(ソマクローナル変異)が頻繁に生じる点も問題であった。そのため、形質転換植物作製の労力軽減や形質転換植物の安全性の観点から、組織培養を伴わないインプランタ形質転換方法およびインプランタ形質転換植物体の作製方法の開発が求められていた。
　一方、コムギやイネなどにおいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない形質転換法(インプランタ形質転換法)も知られている。インプランタ形質転換方法としては、露出させた未熟胚又は完熟胚の茎頂に、パーティクルガン法を用いて直接遺伝子導入する方法が知られている（非特許文献１）。また、特許文献1及び非特許文献２には、発芽直後の完熟胚にアグロバクテリウムを感染させ、遺伝子導入する方法が記載されている。
　しかし、これらの文献に記載の方法は、共通して、実験者の手技に大きく依存するため遺伝子導入効率が低調であり、再現性の点において改善の余地がある。また、非特許文献１は、導入遺伝子が次世代に伝達されることの実証に至っていない。このような要因から、上記の手法は、現在に至るまで汎用化されていない。
国際公開ＷＯ２００５／０２４０３４号
Bilang et al. (1993) Transient gene expression in vegetative shot apical meristems of wheat after ballistic microtargeting. Plant Journal (1993) 4, 735-744 Supartana et al. (2005) Development of simple and efficient in planta transformation for rice (Oryza sativa L.) using Agrobacterium tumefaciencs. Journal of Bioscience AND Bioengineering (2005) 4, 391-397
　本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系のカルス又は組織片を用いない植物の形質転換方法を提供する。本発明はまた、選択マーカー遺伝子を導入しない植物形質転換方法を提供する。本発明はさらに、再現性に優れる形質転換植物の作製方法を提供する。
　本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）植物の形質転換方法であって、直径０．３μｍ以上０．９μｍ以下の微粒子を、少なくとも１種の核酸により被覆する工程と、該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育し、植物体を得る工程と、該植物体から形質転換植物体を選択する工程とを含む、方法。
（２）前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、Ｌ２細胞に打ち込む工程を特徴とする、（１）の方法。
（３）前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に打ち込む工程を特徴とする、（１）の方法。
（４）さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）さらに、前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記少なくとも１種の核酸が、導入目的とする核酸カセットを含む線状ＤＮＡである、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記線状ＤＮＡが、導入目的とする核酸カセットの両末端に０．８ｋｂ以上１．２ｋｂ以下の核酸が付加された線状プラスミドである、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記完熟種子が、その根長が１ｍｍ以下の完熟種子であることを特徴とする、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか１であることを特徴とする、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）（１）～（９）のいずれかに記載の方法を用いて植物の形質転換体を製造する方法。
（１１）（１０）の製造方法により製造された形質転換体（出願時に公知のものを除く）。
　本発明の方法によれば、パーティクルガン法の標的として完熟種子胚中の茎頂を用いることで、カルス化及び選択マーカー遺伝子を必要とせずに、再現性良く植物の形質転換体を取得することができる。本発明によれば、茎頂中の生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に目的遺伝子を効率よく導入することができる。
本発明の実施例１に係る茎頂のＧＦＰタンパク質の発現の様子を示した図である。 本発明の実施例２に係るＴ１世代形質転換体のゲノミックＰＣＲによる導入遺伝子確認の結果を示した図である。 図３は、遺伝子導入個体のサザン解析の結果を示す写真である（実施例３）。 図４Ａは本発明の実施例４に係るＧＦＰ蛍光観察したＴ１世代種子の全体写真の図である。図４Ｂは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の半切種子のＧＦＰ蛍光観察写真の図である。図４Ｃは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の幼葉のＧＦＰ蛍光写真の図である。図４Ｄは、本発明の実施例４に係るＴ１世代の成葉のＧＦＰタンパク質を検出したウェスタンブロット写真の図である。 図５Ａは、主茎から得られたＴ１種子の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡのサザン解析の結果を示す写真である。図５Ｂは、主茎および分げつから得られたＴ１種子の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡのサザン解析の結果を示す写真である（実施例５）。 図６は、トウモロコシのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例６）。 図７は、ダイズのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例７）。 図８は、オオムギのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例８）。 図９は、ジャガイモのＧＦＰの一過性発現を示す写真である（実施例９）。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係るインプランタ形質転換法においては、植物の完熟種子を吸水させる工程、次に種子における胚の茎頂を露出させる工程、次に茎頂の細胞を形質転換する工程、を含む。
　本明細書において、「種子」とは、植物を天然またはそれに近い条件下で栽培（または培養）して得られる天然の種子のみでなく、人工種子も含むが、好ましくは天然の種子である。ただし、形質転換可能な茎頂が取得できる人工種子が開発されればそれを用いることも可能である。天然の種子には、野外の畑などで得られる種子のみでなく、温室栽培により得られる種子や、インビトロ苗などの組織培養物から得られる種子も含まれる。ダイレクト・リプログラミングなどにより得られる種子も茎頂が取得できる限り本発明の種子として使用し得る。
　なお、本発明においては、茎頂を取得する材料として完熟種子または地下茎を用いるのが好ましい。完熟種子とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。地下茎とは、地下にある茎の総称で、塊状で多くの芽をもつ塊茎，球状で大きな頂芽をもつ球茎，短縮した茎に肥大した鱗片葉がついて球状となった鱗茎などをいう。
　本明細書において、茎頂とは、茎の先端の成長点（茎頂分裂組織）ならびに成長点および成長点から生じた数枚の葉原基からなる組織を含む意味である。本発明においては、葉原基を除去した半球状（ドーム状）の成長点のみを茎頂として用いても良く、成長点および葉原基を含む茎頂や該茎頂を含む植物組織を用いてもよい。葉原基を除去した成長点のみを用いることでウイルスフリーの組織が得られる。また、本明細書において、「生殖細胞系列」とは、生殖細胞の源である始原生殖細胞から最終産物である卵細胞や精細胞に至るまでの生殖細胞の総称であり、「Ｌ２層」とは、茎頂分裂組織の外側から２番目の細胞層をいう。
１．形質転換の前処理工程
　本発明に係るインプランタ形質転換法は、広く一般に種子を生じる植物、地下茎を生じる植物および茎頂培養可能な植物に適用することができる。従って、本発明に係るインプランタ形質転換法の対象植物は、被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。インプランタ形質転換法とは、一般には組織培養の操作を含まない形質転換法であり，植物が成長する状態のまま成長点部位の細胞を形質転換させる方法である。ただし、本明細書においては、インプランタ形質転換法は、茎頂培養を用いる組織培養方法のみは含み、その他の組織培養の操作を含む方法は含まれないという意味で使用する。
　単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物などが挙げられる。
　イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビなどが挙げられる。ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガスなどが挙げられる。バショウ科植物としては、バナナなどが挙げられる。パイナップル科植物としては、パイナップルなどが挙げられる。ラン科植物としては、ランなどが挙げられる。
　双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、およびタデ科植物などが挙げられる。
　アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ダイコンなどが挙げられる。マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファなどが挙げられる。ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシなどが挙げられる。ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカなどが挙げられる。ヒルガオ科植物としては、アサガオ、サツマイモ（カンショ）、ヒルガオなどが挙げられる。バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴなどが挙げられる。クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキなどが挙げられる。アオイ科植物としては、ワタ、ケナフなどが挙げられる。キク科植物としては、レタスなどが挙げられる。ヒユ科植物としては、テンサイ（サトウダイコン）などが挙げられる。タデ科植物としては、ソバなどが挙げられる。
　一方、裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどが挙げられる。
　本発明に係るインプランタ形質転換法の１実施態様としては、まず植物の完熟種子を吸水させる。必要により吸水前に春化処理をしてもよい。吸水は、種子を水に浸種し、インキュベートすることにより行われる。吸水温度は、例えば、コムギ、オオムギまたはイネの場合には、１５～２５℃が好ましく、トウモロコシまたはダイズでは２５～３５℃が好ましい。この際、一度以上、水を交換してもよい。吸水期間は、例えば、コムギの場合には、幼根が伸長を開始する前まで、又は新しい葉原基が形成される前までが好ましい。吸水時間で表すと、種子の休眠状態にもよるが、吸水後１６時間未満であり、好ましくは１２時間である。この吸水工程により、種子を柔らくすることで茎頂を露出させ易くすることができる。
２．種子における胚の茎頂を露出させる工程
　次いで、上記で吸水させた種子における胚の茎頂を露出させる。コムギ、オオムギ、イネ又はトウモロコシの場合には、鞘葉及び葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。ダイズの場合には、種皮及び子葉を除去することで、茎頂を露出させる。ジャガイモの場合には、種芋から芽出しを行い、切り出した幼芽より葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。リンゴの場合には、種子胚または摘出した頂芽もしくは側芽から葉原基を除去することで、茎頂を露出させる。露出手段としては、実体顕微鏡下において、鞘葉及び葉原基または種皮及び子葉を除去することができるものであればいずれのものであってよいが、例えば、直径０．２ｍｍ程度の針などの穿設するための器具、ピンセット、ピペット、注射器、並びにメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。次いで、メスなどの切断器具を用いて胚乳及び余分な胚盤部分を切除し、露出した茎頂を含む胚及び胚盤を寒天培地上に、茎頂を上向きに置床する。ウイルスフリーの茎頂を得るために、茎頂を切り出す最終段階でメスを新規な滅菌メスに取り替えてもよい。この場合はウイルスフリーの形質転換体を得ることができる。
３．茎頂の細胞を形質転換する工程
　目的遺伝子の導入には、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されない。一般的には、目的遺伝子を含む組換えベクターを作製して、完熟胚の茎頂を標的に、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などにより、核酸（組換えベクターなど）やタンパク質などを導入することができるが、コムギ、イネ、トウモロコシまたはダイズでは、植物体への導入効率から、パーティクルガン法を用いて完熟種子胚に導入する方法が好ましい。また、パーティクルガン法はジャガイモの茎頂に遺伝子を導入するのにも有効である。パーティクルガン法は、金属微粒子に遺伝子をコーティングして細胞組織に打ち込む方法であり、単子葉植物のようにアグロバクテリウムの感染効率が低い場合に有効である。
　本発明に用いるベクターは特に限定されず、例えば、ｐＡＬ系（ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６など）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９など）、ｐＢＩ系（ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２など）、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、中間ベクター系（ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴなど）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などを用いることができる。
　目的遺伝子を含むベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。ベクターに目的遺伝子を挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトなどに挿入してベクターに連結する方法を用いることができる。また、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）により中間ベクターに目的遺伝子を挿入してもよく、ＴＡクローニング、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングなどを用いてもよい。
　目的遺伝子は特に限定されず、その遺伝子の発現または発現の抑制が望まれるものであればよく、対象となる植物の内因性遺伝子または外来遺伝子でもよい。外来遺伝子としては、生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子として、例えば、糖代謝関連遺伝子、脂質代謝関連遺伝子、有用物質（医薬、酵素、色素、芳香成分など）生産遺伝子、植物生長制御（促進/抑制）遺伝子、開花調節関連遺伝子、耐病虫害性（昆虫食害抵抗性、線虫、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など）遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、塩、光障害、紫外線）耐性遺伝子、トランスポーター遺伝子、製粉特性・製パン特性・製麺特性関連遺伝子、部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子などが挙げられる。また、目的遺伝子は、センス鎖以外に、遺伝子導入の目的に応じてアンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉなどを発現するように導入してもよい。
　本明細書において、「ゲノム編集」とは、ニューブリーディングテクニック（ＮＢＴ）といわれる技術の一部で、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを用いて、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して変異を導入することで遺伝子を破壊すること、部位特異的にＤＮＡ断片を挿入または置換すること、または、ＣＲＩＳＰＲシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体を構築し、細胞中で発現させることで、狙った点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変することも含まれるがこれらに限られず、ゲノムを編集できる技術であればよい。ゲノム編集技術を用いることで、狙った遺伝子を高い効率で破壊できる。遺伝子破壊の場合、遺伝子組換えの痕跡を残さずに狙った遺伝子のみを破壊できることから組換え植物と取り扱わない国もある。また、ゲノム編集によれば、切断配列の両側の配列に相同な断片を、その部位に導入したいＤＮＡ断片の両側に連結しておくことで、効率よく部位特異的なＤＮＡ断片の挿入または置換が可能である。
　上記意味で、ゲノム編集は、外来遺伝子がほぼランダムに組み込まれる従来型の植物の形質転換法、例えば、直接導入法やアグロバクテリウム法などとは異なる技術とも言え、形質転換法の定義からゲノム編集技術を除く考え方もあり得る。ゲノム編集技術では、切断部位をターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを切断する工程を含むことが特徴で、かかるターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いない従来型の形質転換法とは区別できる。ここで、「ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いて」という意味は、ヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入してもよく、ヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを細胞に導入してヌクレアーゼタンパク質を発現させてもよいという意味である。また、ガイドＲＮＡについてもＲＮＡを細胞に導入してもよく、ガイドＲＮＡを発現し得るＤＮＡを導入してガイドＲＮＡを発現させてもよい趣旨である。
　部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質またはＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）などが挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、特定の塩基を認識するジンクフィンガーモチーフ数個とＦｏｋＩヌクレアーゼの融合タンパク質である。ＴＡＬＬＥＮはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　Ｌｉｋｅ　（ＴＡＬ）　ｅｆｆｅｃｔｏｒとＦｏｋＩヌクレアーゼの融合タンパク質である。部位特異的ヌクレアーゼは、他の追加の標的化技術、例えば、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘発性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、またはロイシンジッパーなどで構成される。
　部位特異的ヌクレアーゼを本発明の形質転換法を用いて細胞に導入して、ゲノム中に組み込み、発現させてゲノム編集することにより、１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができる。すなわち、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し、発現する細胞中に、Ｃａｓタンパク質およびＤＮＡ分子をターゲティングする１つ以上のガイドＲＮＡを含み得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを導入し、それにより１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質が、１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム遺伝子座を開裂し、それにより１つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変することができる。
　Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、天然に存在するもの（組み合わせ）であってもよく、天然には存在しない組み合わせであってもよい。本発明においては、２つ以上の遺伝子産物の発現を変更または改変してもよい。ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
　ガイドＲＮＡの長さは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドであり、好ましい上限のヌクレオチド数は、３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２２以下、最も好ましくは２０である。
　好ましい実施形態において、形質転換される細胞は、植物細胞であり、より好ましくは、茎頂分裂組織の細胞であり、さらに好ましくは茎頂分裂組織中のＬ２細胞であり、もっとも好ましくは茎頂分裂組織中の生殖細胞系列に移行する細胞である。
　本発明においては、Ｃａｓタンパク質が１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。タンパク質は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。
　Ｃａｓタンパク質は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。Ｃａｓタンパク質は、標的配列の局在における１または２つの鎖の開裂を指向し得る。本発明の他の側面において、遺伝子産物の発現を減少させ、遺伝子産物はタンパク質である。
　ベクターには、目的遺伝子のほかに、例えばプロモーター、エンハンサー、インシュレーター、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
　ベクターに挿入する目的遺伝子は１ベクターあたり複数種であってもよく、微粒子に被覆する組換えベクターも１微粒子あたり複数種であってもよい。例えば、目的遺伝子を含む組換えベクターと、薬剤耐性遺伝子を含む組換えベクターを別々に作製し、混合して微粒子を被覆して植物組織に撃ち込んでもよい。
　プロモーターとしては、植物体内または植物細胞において機能し、構成的に発現するか、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２―３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨ、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターなどが挙げられる。翻訳活性を高める配列、例えば、タバコモザイクウイルスのオメガ配列を用いて翻訳効率を上げることができる。また、翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’―下流側で、翻訳開始コドンの５’―上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
　ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ　３５Ｓ　ターミネーターなどが挙げられる。
　選抜マーカー遺伝子としては、例えば、除草剤耐性遺伝子（ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ））、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ　ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくても形質転換体の作製は可能である。
　植物に撃ち込む目的遺伝子を含むベクターとしては、環状のプラスミドでも良く、プラスミドを制限酵素等で切断した線状ＤＮＡ、導入するＤＮＡ断片のみを切り出した核酸カセット断片、または、カセット断片の一方もしくは両方の端に０．８ｋｂ以上、１．２ｋｂ以下の核酸が付加されたＤＮＡ断片であってもよい。これらのＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片であってもよい。この場合付加される核酸としては、特に制限されず、ベクター由来の配列であってもよいが、導入の標的部位の配列がより好ましく用いられる。カセット断片の端に付加される核酸の長さの下限としては、０．５ｋｂ以上、より好ましくは０．８ｋｂ以上、さらに好ましくは１．０ｋｂ以上であり、上限としては、３．０ｋｂ以下、より好ましくは２．０ｋｂ以下、さらに好ましくは１．５ｋｂ以下である。
　上記目的遺伝子を含むベクターを、パーティクルガン法でコムギの完熟胚に撃ち込む。目的遺伝子および／またはタンパク質は微粒子（マイクロキャリア）の表面に被覆して植物細胞に遺伝子銃で撃ち込むことができる。微粒子としては、細胞内への貫通力を高めるため、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいという理由から金属微粒子が好ましく用いられる。金属微粒子の中でも、金粒子、タングステン粒子などが特に好ましく用いられる。
　パーティクルガン法では以下のようにして目的遺伝子を植物細胞に導入することができる。まず、金粒子またはタングステン粒子などの微粒子を洗浄滅菌し、該微粒子、核酸（組換えベクター、直鎖状ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、ＣａＣｌ２、スペルミジンをボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、ＤＮＡを金粒子またはタングステン粒子にコーティングし、エタノールで洗浄する。
　前記微粒子の粒径は０．３μｍ以上０．９μｍ以下が好ましく、より好ましい粒径は０．４μｍ以上、さらに好ましくは０．５μｍ以上、特に好ましくは０．６μｍを用いる。粒径のより好ましい上限としては、０．８μｍ以下、さらに好ましくは０．７μｍ以下、特に好ましくは０．６μｍである。
　金粒子またはタングステン粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリヤーフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させる。そして、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの完熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する。マクロキャリヤーフィルムはストッピングプレートで止まるが、金粒子はストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入し、目的遺伝子が導入される。
　ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離は、微粒子の粒径にもよるが、例えば、９ｃｍ以下が好ましく、より好ましくは８ｃｍ以下、さらに好ましくは７ｃｍ以下、特に好ましくは６ｃｍ以下であり、距離の下限としては、例えば、２ｃｍ以上が好ましく、より好ましくは３ｃｍ以上、さらに好ましくは４ｃｍ以上である。ストッピングプレートとターゲットの距離は、微粒子の種類、粒径、ガス圧などに応じて、一過的発現実験などにより、適宜最適な値を決定することができる。
　ガス圧としては、微粒子の種類、ターゲットとの距離にもよるが、好ましくは、例えば、１，１００～１，６００ｐｓｉが好ましく，より好ましくは１，２００～１，５００ｐｓｉである。ガス圧については、微粒子の種類、ターゲットの種類、ターゲットとストッピングプレートとの距離などに応じて、一過的発現実験などにより、適宜最適な圧力を決定することができる。
　本発明の形質転換方法においては、茎頂に微粒子を撃ち込む回数としては、２回以上が好ましく、さらに好ましくは３回以上、より好ましくは４回以上である。茎頂に微粒子を撃ち込む回数の上限としては、２０回以下が好ましく、より好ましくは１５回以下、さらに好ましくは１０回以下である。撃ち込む回数については、一過的発現実験などにより、適宜最適な回数を決定することができる。
　微粒子を撃ち込まれた細胞中では、核酸が微粒子から遊離し、核酸がゲノムＤＮＡにインテグレートすることで形質転換細胞が得られる。ただし、ジェミニウイルスのようなプラスミド状で増殖する核酸や人工染色体を導入した場合はインテグレートせずに形質転換する場合もあり得る。また、本発明の形質転換法によれば、オルガネラへの外来遺伝子の導入も可能である。その場合にはオルガネラで特異的に発現するプロモーターを機能的に連結された遺伝子を用いるのが好ましい。
　形質転換処理した完熟胚の茎頂を寒天培地上で１ヶ月程度生育させた後、土へ移植する。茎頂へのボンバードメントの場合、薬剤などによる選択圧をかけずに（抗生物質などを含まない）通常の培地で生育させることによっても形質転換体を得ることができるが、薬剤耐性遺伝子をさらに導入してもよい。薬剤耐性遺伝子を導入した場合は、薬剤により形質転換細胞を選択的に培養することができる。茎頂培養に適した選択薬剤としては、例えば、スルフォニル尿素系除草剤クロロスルフロン（変異型ＡＬＳ遺伝子（アセト酪酸合成酵素遺伝子）導入により耐性獲得可能）などが知られている。
　薬剤耐性遺伝子を導入する場合、該薬剤耐性遺伝子は目的遺伝子と同じベクター上にあってもよく別のベクター上にあってもよい。別々のベクター上に挿入した場合は、それらが別々の染色体に組み込まれた場合、自家受粉や戻し交配を行って後代を取ることにより目的遺伝子が導入された植物個体と薬剤耐性遺伝子を有する植物個体とに分離できるというメリットがある。
　以上の手法により、目的遺伝子を導入した植物体やゲノム編集した植物体を作出することができる。また、このようにして作出された植物は、安定的に目的遺伝子が発現し、または、目的遺伝子の発現が抑制され、後代に正常に遺伝する（伝達される）。
　コムギへの遺伝子導入効率および目的遺伝子発現効率（形質転換効率）は、以下のようにして調べることができる。
　遺伝子の導入効率は、形質転換処理後の生育個体からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法および／または電気泳動又はサザンブロット法により、目的遺伝子を検出することができ、導入に用いた外植片数と外来遺伝子を有していた生育個体数から、遺伝子導入効率を算出する。
　目的遺伝子の発現効率は、遺伝子の導入が確認された生育個体について、目的遺伝子から発現されたＲＮＡの有無を調べる。ＲＮＡの有無は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法などで確認することができる。ノザンブロッティングにより検出してもよい。
　また、目的遺伝子から発現されたタンパク質の有無を調べることもできる。タンパク質の有無は、例えば植物片の染色、電気泳動、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ、ドットイミュノバイディングアッセイ、および／またはウエスタンブロット法などで確認することができる。そして導入に用いた外植片数と目的遺伝子から発現されたタンパク質の存在が確認された生育個体数から、目的遺伝子発現効率（形質転換効率）を算出する。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
[実施例１]遺伝子導入に最適な金粒子径の検討
　適切な金粒子径を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無又はその当代（Ｔ０世代）における導入遺伝子の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
コムギ(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ｃｖ．　Ｆｉｅｌｄｅｒ)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度６％、花王株式会社)に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、休眠打破のため４℃にて２日間インキュベートした。その後、２２℃で約１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実体顕微鏡下において、上記発芽種子の胚部分の鞘葉及び第１葉原基から第３葉原基を針(直径０．２０ｍｍ)の先端を用いて除去した。その後、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ，ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ，３０ｇ／Ｌ　マルトース，０．９８ｇ／Ｌ　ＭＥＳ，３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ，ナカライテスク)，７．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標、シグマアルドリッチ），ｐＨ５．８）に置床した。
（３）遺伝子導入
　コムギ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、パーティクルガン法を用いて以下のようにして行った。
　実施例においては、導入遺伝子は蛍光レポーター遺伝子ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ系プラスミド）を用いた。当該遺伝子は、トウモロコシのユビキチンプロモーターと第一イントロンの制御下で発現するよう設計されたものである。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターが付加されている。
　０．３μｍから１．６μｍの各金粒子３０ｍｇをはかり取り、７０％エタノール５００μＬを加え、ボルテックスにてよく懸濁した。その後、遠心により金粒子を沈殿させ、エタノールを除去した。その後、５０％グリセロール５００μＬを加え滅菌金粒溶液とした。
　１．５ｍＬチューブに、Ｑｉａｇｅｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製したプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ/μＬ）を、金粒子７５０μｇあたり５μｇになるように入れた。滅菌金粒子含有溶液は使用前に、超音波発生器（多賀電機製超音波洗浄機ＵＷ－２５）を使って念入りに懸濁し、上記チューブに適当量入れピペッティングにより攪拌した。次に上記チューブに、金粒子７５０μｇあたり２．５Ｍ　ＣａＣｌ２(ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ)２５μＬと０．１Ｍ　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）１０μＬを加えた。混合後すぐに、ボルテックスにより５分間激しく懸濁した。１０分間室温にて静置後、９，１００×ｇで２秒間遠心した。上清を除去し、７０％エタノール及び９９．５％エタノールで洗浄した。最後に、上清を除去して９９．５％エタノールを２４μＬ添加してよく懸濁した。クリーンベンチ内でマクロキャリアの中央に６μＬずつ注ぎ、風乾させた。
　パーティクルガンは、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用し、撃ち込み時の圧力は約９４．９ｋｇｆ／ｃｍ２（１，３５０ｐｓｉ）とし、標的組織までの距離は５ｃｍ（粒子の直径０．６μｍ以上）または３．５ｃｍ（粒子の直径０．６μｍ未満）とした。１シャーレにつき４回ずつ撃ち込んだ。撃ち込み後、２２℃、暗所において一晩静置した。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実体蛍光顕微鏡(Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬIII)下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光(励起：４７０/４０　吸収：５２５/５０)を観察することで(図１)、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表１）。特に、０．６μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が７２．７％と最も高かった（表１）。また、後述するように、遺伝子導入効率についても、金粒子１．０μｍよりも０．６μｍの方が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
　実施例１－１―（１）に記載の方法に準拠した。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実施例１－１―（２）に記載の方法に準拠した。
（３）遺伝子導入
　０．６μｍ、１．０μｍの２種の金粒子径を用い、実施例１－１―（３）に記載の方法に準拠した。
（４）形質転換処理個体の生育
　一晩静置した形質転換処理個体をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、長日（２２℃、１６時間日長）で育成した。３－４週間生育させた後、第２－３葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室（２４℃、１６時間日長、湿度５０－７０％）にて第４－６葉が出るまで育成した。
（５）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
　得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調査した。第４－６葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＧＦＰ遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
プライマーの配列：ＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴ（配列番号１）
プライマーの配列：ＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号２）
　ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ２０ｎｇ、ＥｘＴａｑＨＳ（登録商標、ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、１０×添付バッファー１．５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１５μＬにフィルアップした。
　ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）を用いて、９５℃で３分処理後、９５℃を３０秒、６０℃を３０秒及び７２℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３３サイクル行った。ＰＣＲ反応後、１．０％のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色してＰＣＲ産物を検出し、予想される６０１ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片が検出されたものを、遺伝子導入個体と判断した。
　遺伝子導入に用いた金粒子径１．０μｍ、０．６μｍの２通りにおいて、それぞれ得られた遺伝子導入個体数から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。
　その結果、１．０μｍ径の金粒子を用いた場合において、導入遺伝子は検出されなかった（表２）。一方、０．６μｍ径の金粒子を用いた場合において、導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）は３個体（遺伝子導入効率１．４％）検出された（表２）。このことから、金粒子径１．０μｍと比較し、実施例１－１－（４）において一過的な発現効率が高かった金粒子径０．６μｍを用いることで、遺伝子導入効率が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
[実施例２]遺伝子導入に最適なガス圧の検討
適切なガス圧を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無とその当代（Ｔ０世代）における導入遺伝子の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
実施例１－１―（１）に記載の方法に準拠した。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
実施例１－１―（２）に記載の方法に準拠した。
（３）遺伝子導入
　金粒子径を０．６μｍ、ガス圧を１，１００ｐｓｉまたは１，３５０ｐｓｉとし、実施例１－１―（３）に記載の方法に準拠した。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実施例１－１―（４）に記載の方法に準拠した。その結果、実施例１－１―（４）に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧１，３５０ｐｓｉの場合では７４．２％となり、ガス圧１，１００ｐｓｉの場合の１３．３％に比べ高かった（表３）。また、後述するように、Ｔ０世代の遺伝子導入効率についても、ガス圧１，１００ｐｓｉよりもガス圧１，３５０ｐｓｉの方が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
　実施例１－２―（４）に記載の方法に準拠した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
　実施例１－２―（５）に記載の方法に準拠した。その結果、実施例１－２―（５）に記載の遺伝子導入効率は、ガス圧１，３５０ｐｓｉの場合では４．２％となり、ガス圧１，１００ｐｓｉの場合の０．８％に比べ高かった（表３）。このことから、ガス圧１，１００ｐｓｉと比較し、実施例２－１－（４）においてＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率が高かったガス圧１，３５０ｐｓｉを用いることで、遺伝子導入効率が向上することがわかった。
[実施例３]遺伝子導入に最適な吸水時間の検討
　適切な吸水時間を見出すため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無とその当代（Ｔ０世代）及び次世代 (Ｔ１世代) における導入遺伝子の有無を調査した。
１．完熟胚の調製及び遺伝子導入操作
（１）コムギ完熟種子の調製
　コムギ(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ｃｖ．　Ｆｉｅｌｄｅｒ)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度６％)に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、４℃にて２日間インキュベートした。その後、２２℃で６～１２時間、１２～１８時間の各時間インキュベートし、以下の実験に用いた。種子根長は、根鞘を切り開いた後に幼根の長さを測定することで調査した。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実施例１－１―（２）に記載の方法に準拠した。
（３）遺伝子導入
　０．６μｍの金粒子径を用い、実施例１－１―（３）に記載の方法に準拠した。
２．Ｔ０世代及びＴ１世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
　実施例３－１－（３）において茎頂における一過的なＧＦＰ蛍光が観察された個体について、実施例１－（２）―４に記載の方法により育成した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
　実施例１－２－（５）に記載の方法に準拠した。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、６～１２時間、１２～１８時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率は、それぞれ３．１％、１．３％となり(表４)、吸水６～１２時間後の完熟胚で特に高かった（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（３）Ｔ１植物葉における導入遺伝子の有無
　上記（２）で導入遺伝子が確認された個体を育成し、Ｔ１種子を取得した。各Ｔ１種子を１０～２０粒程度播種・育成し、第１葉（５０ｍｇ）をサンプリングした。ゲノミックＰＣＲ及び電気泳動は実施例１－（２）―５に準拠した。各吸水時間後の完熟胚を形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体（Ｔ１世代）から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、６～１２時間、１２～１８時間吸水させた完熟種子を実験に用いた場合の遺伝子導入効率はそれぞれ３．１％（図２系統１及び２、表４）、０．７％（図２系統３～５、表４）となり、吸水６～１２時間後の完熟胚で特に高かった。これらの結果から、遺伝子導入には完熟種子の吸水初期（６時間後から１８時間程度であり、種子根長１．０ｍｍ以下）が適切であり、特に吸水６～１２時間後が好ましいと判断した。
　なお、表４に示した導入遺伝子確認個体（Ｔ１世代）５系統については、ＧＦＰ遺伝子領域をプローブとしたサザンブロット解析によっても、ＧＦＰ遺伝子がゲノミックＤＮＡへ挿入されているのを確認した（図３）。
[実施例４]Ｔ１世代における遺伝子発現の確認
　当該遺伝子導入法により作製された形質転換コムギにおける導入遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）発現の有無を調査した。
１．Ｔ１種子におけるＧＦＰ蛍光観察
　実施例３－２－（３）で取得したＴ１種子を滅菌シャーレに置き、ＬＡＳ３０００（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）下で、Ｔ１種子のＧＦＰ蛍光(フィルター５１０ＤＦ１０)を観察した結果、種子においてＧＦＰ蛍光が観察された（図４Ａ）。次に、ＧＦＰ蛍光が観察された種子を半切し、実体蛍光顕微鏡(Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬIII)下で、胚乳のＧＦＰ蛍光観察（励起：４７０／４０、　吸収：５２５／５０）を行った。その結果、胚乳（Ｅ）においてＧＦＰ蛍光が観察された他、アリューロン層（Ａｌ）においてＧＦＰ蛍光が強く観察された（図４Ｂ）。
２．Ｔ１世代幼葉におけるＧＦＰ蛍光タンパク質の発現解析
　実施例３－２－（３）で育成させたＴ１世代植物の幼葉をサンプリングし、実体蛍光顕微鏡 (Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬIII)下で、葉におけるＧＦＰ蛍光(励起：４７０/４０、　吸収：５２５/５０)を観察した。その結果、図４Ｃに示すように、ゲノミックＰＣＲ陽性個体(形質転換体)では葉の気孔細胞においてＧＦＰ蛍光が観察された。
　次に、野生型株及び形質転換体（遺伝子導入個体）のそれぞれの成葉から全タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット法によるＧＦＰ蛍光タンパク質の検出を試みた。成葉１ｇを液体窒素で凍結・粉砕した後、タンパク抽出バッファー (０．２５Ｍ　ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ/ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＤＴＴ、１％ＰＶＰ、１０μＭ　ＰＭＳＦ)に懸濁した。この抽出液を遠心分離（１，１００×ｇ、１５分間、４℃）し、その上清をさらに遠心分離（１２，８００×ｇ、１５分間、４℃）した。この遠心分離の後得られた上清を全タンパク質画分とした。全タンパク質画分２０μｇを１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、セミドライ法によってニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキングバッファー(５％[ｗ/ｖ]　Ｓｋｉｍ　Ｍｉｌｋ　Ｐｏｗｄｅｒ　ｉｎ　ＴＴＢＳ(１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．５))で１時間振盪した。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、一次抗体を１時間反応させた。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、二次抗体を１時間反応させた。メンブレンをＴＴＢＳで５分間×３回洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｍａｎｕａｌに記載の方法に従って検出を行った。なお、一次抗体として、マウスＩｇＧ１κ由来ＧＦＰ抗体（ＲＯＣＨＥ）（２０００倍希釈）を用い、二次抗体として上記キットに添付されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体(５０００倍希釈)を使用した。
　ウェスタンブロット解析の結果、形質転換体ではＧＦＰタンパク質の推定分子量２７ｋＤａ付近にシグナルが見られたが、野生型株ではシグナルは検出されなかった（図４Ｄ）。これらの結果から、当該遺伝子導入法により作製された形質転換植物では、正常に導入遺伝子が発現していることが確認された。
　オオムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
[実施例５]Ｔ０世代１系統から取得したＴ１世代各個体における遺伝型の確認
　本法において作製された遺伝子導入個体（Ｔ０世代）は、同一個体内において異なった遺伝情報を持つ細胞が混在したキメラになる。そこで、ある遺伝子導入個体（Ｔ０世代）から得られた複数のＴ１種子がそれぞれ異なる遺伝情報を有するか否かを調査するため、サザンブロット解析を行った。
　実施例３－２－（３）で得られたＴ０世代のＦＧ１系統の個体から、主茎および５つの分げつ由来の穂ごとにＴ１種子を収穫し、そこから複数個体を播種した。播種したＴ１世代個体を生育し、実施例３－２－（３）に記載の方法に従い、各Ｔ１世代個体における導入遺伝子の有無を調査した。その結果、分げつ２以外の主茎および分げつ由来の穂から収穫したＴ１世代において、導入遺伝子を確認した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次に、主茎から得られたＴ１種子１４個体（ＦＧ１－主茎－１～１４）の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡに対しＨｉｎｄIII処理を行い、ＧＦＰ遺伝子領域をプローブとしてサザンブロット解析を行った。その結果、全ての個体について同様のシグナルパターンが得られた（図５Ａ）。さらに、主茎および分げつ１、３、４、５から得られたＴ１種子（ＦＧ１－主茎－１、ＦＧ１－分げつ１－１、ＦＧ１－分げつ３－１、ＦＧ１－分げつ４－１、ＦＧ１－分げつ５－１）の幼葉から得られたゲノミックＤＮＡに対しＨｉｎｄIII処理を行い、上記と同様にサザンブロット解析を行った。その結果、全ての個体について同様のシグナルパターンが得られた（図５Ｂ）。これらの結果から、ある１系統の遺伝子導入個体（Ｔ０世代）から得られた複数のＴ１種子は同じ遺伝情報を有することがわかった。これは、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞は極少数であることを示唆しており、当該方法によりこの極少数の茎頂幹細胞へ遺伝子導入が可能であることがわかった。
[実施例６]トウモロコシにおける形質転換体の取得
　コムギと同様の手法によりトウモロコシの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）トウモロコシ完熟種子の調製
　トウモロコシ(スノーデント王夏)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度６％)に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、３０℃で約３６時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針(直径０．２０ｍｍ)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを１０個/プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　，ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ，３０ｇ／Ｌ　マルトース，０．９８ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　，３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ，登録商標、ナカライテスク)，７．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ，ｐＨ５．８）に置床した。一処理区につき上記プレートを２枚用意した。
（３）遺伝子導入
　実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実体蛍光顕微鏡(Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬIII)下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光(励起：４７０/４０　吸収：５２５/５０)　吸収：５２５/５０)を観察することで(図６)、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表６）。特に、０．６μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が８５％と最も高かった（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
[実施例７]ダイズにおける形質転換体の取得
　コムギと同様の手法によりダイズの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無及びその後の形質転換体取得効率を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）ダイズ完熟種子の調製
　ダイズ(ユキホマレ)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度６％)に浸漬し、室温で３分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、２３℃で約４０時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実体顕微鏡下において、滅菌済みナイフ（または滅菌済みメス）を用いて、子葉を全てカットし、胚軸のみにした。その後、上記胚軸の初生葉と基部を針(直径０．２０ｍｍ)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを約１５個／プレートとなるようにＢＭ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　、ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ、３％　スクロース、０．５０ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク)、６．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．７）に置床した。
（３）遺伝子導入
　プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実体蛍光顕微鏡(Ｌｅｉｃａ社製ＭＺＦＬIII)下で茎頂におけるＧＦＰ蛍光(励起：４７０/４０　吸収：５２５/５０)を観察することで(図７)、茎頂におけるＧＦＰ遺伝子の導入効率を算出した。形質転換処理した完熟胚中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを遺伝子導入個体として、遺伝子導入効率（遺伝子導入個体／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、金粒子径１．６μｍおよび１．０μｍに比べ、金粒子径０．６μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が８５．０％と高かった（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
２．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）形質転換処理個体の生育
　一晩静置した形質転換処理個体をＲＭ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　、ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ、３％　スクロース、０．５０ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ、ナカライテスク)、０．３％　ゲルライト、ｐＨ５．７）を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、インキュベーター（２３℃、１６時間日長）で育成した。根の生育及び茎頂からの葉の分化が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたセルトレイへ移植した。その後、同インキュベーターにて第２葉目まで育成した。
（２）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
　得られた植物体において、蛍光レポーター遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の有無をＰＣＲ法により調査した。第２葉（５０ｍｇ）から塩化ベンジル法を用いてゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＧＦＰ遺伝子に特異的な配列から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
　プライマーの配列：ＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴ（配列番号１）
　プライマーの配列：ＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＴＣＴ（配列番号２）
　ＰＣＲ反応液には、ゲノミックＤＮＡ２０ｎｇ、ＥｘＴａｑＨＳ（ＴａＫａＲａ）０．２５Ｕ、１０×添付バッファー１.５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計１５μＬにフィルアップした。
　ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅを用いて、９５℃で３分処理後、９５℃を３０秒、６０℃を３０秒及び７２℃を１分の反応を１サイクルとしてこれを３２サイクル行った。ＰＣＲ反応後、１．０％のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して紫外線照射によりＰＣＲ産物を検出し、予想される６０１ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片が検出されたものを、遺伝子導入個体と判断した。
　遺伝子導入に用いた金粒子径０．６μｍにおいて、得られた遺伝子導入個体数から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。
　その結果、０．６μｍ径の金粒子を用いた場合において、処理完熟胚４７０個体のうち導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）は６３個体（遺伝子導入効率１３．４％）であった。このことから、実施例７－１－（４）において一過的な発現効率が高かった金粒子径０．６μｍを用いることで、高効率でダイズの遺伝子導入個体を取得することが可能であることがわかった。
[実施例８]オオムギにおける形質転換体の取得
　コムギと同様の手法によりオオムギの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）オオムギ完熟種子の調製
　オオムギ(ワセドリ二条)の完熟種子をハイター(次亜塩素酸濃度６％)に浸漬し、室温で２０分間振とう後、クリーンベンチ内で滅菌水で洗浄した。洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、４℃にて２日間インキュベートした後、２２℃で６～１２時間インキュベートし、以下の実験に用いた。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、胚乳及び余分な胚盤部分を除去した。その後、上記発芽種子の胚部分の子葉鞘及び葉原基を針(直径０．２０ｍｍ)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを３０個/プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　、ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ　マルトース、０．９８ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク)，７．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ，ｐＨ５．８）に置床した。
（３）遺伝子導入
　実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実施例１－１－（４）に記載の方法に従った。その結果、金粒子径１．６μｍ及び１．０μｍに比べ、金粒子径０．８μｍ、０．６μｍ、及び０．３μｍの場合では茎頂における遺伝子導入効率が高かった（表８）。特に、０．３μｍを用いたときは、他の金粒子径と比較して、茎頂における遺伝子導入効率が８０．０％と最も高かった（図８、表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
[実施例９]ジャガイモにおける形質転換体の取得
　コムギと同様の手法によりジャガイモの形質転換体が得られるか確認するため、遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無を調査した。
１．ＧＦＰ蛍光タンパク質の一過的発現系を指標とした調査
（１）ジャガイモの調製
　種芋(男爵)をハイター(次亜塩素酸濃度１％)で消毒し、水洗い、乾燥後、２２℃で１－２週間蛍光灯下でインキュベートし、芽出しを行った。
（２）茎頂の露出
　実体顕微鏡下において、滅菌済みメスを用いて、萌芽より葉原基を針(直径０．２０ｍｍ)の先端を用いて除去し、茎頂部分を完全に露出させた。これを４０個/プレートとなるようにＭＳ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　、ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ　ショ糖、０．９８ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク)、７．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．８）に置床した。
（３）遺伝子導入
　導入ベクターをｐＵＣ１８－３５Ｓ－ＧＦＰとし、実施例１－１－（３）に記載の方法に従った。
（４）ＧＦＰタンパク質の一過的な発現効率の調査
　実施例１－１－（４）に記載の方法に従った。その結果、金粒子径０．６μｍを用いることで、茎頂におけるＧＦＰ蛍光を観察することができた。（図９）。
[実施例１０]線状プラスミドを用いた形質転換
　形質転換効率改善のため、線状プラスミドを用いた遺伝子導入処理後の茎頂におけるＧＦＰ蛍光の有無及びその後の形質転換体取得効率を調査した。
１．Ｔ０世代植物におけるゲノミックＰＣＲを指標とした調査
（１）コムギ完熟種子の調製
　実施例１－１－（１）に記載の方法に従った。
（２）完熟種子胚中の茎頂の露出
　実施例１－１－（２）に記載の方法に従った。
（３）線状ベクターの調整
　実施例１－１－（３）で用いたＧＦＰベクター（配列番号３）を鋳型として、ユビキチンプロモーター及びＮｏｓターミネーターに特異的な配列（配列番号４及び５）又はベクターに特異的な配列（配列番号６及び７）から作製したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。その後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製することで、線状ベクター１（Ｐｕｂｉ－ＧＦＰ－Ｔｎｏｓ断片）及び線状ベクター２（Ｐｕｂｉ－ＧＦＰ－Ｔｎｏｓ断片－１ｋｂ付加）を作製した。なお線状ベクター２においては、線状ベクター１の５’末端に約１．２ｋｂｐ、３’末端に０．８ｋｂｐのＧＦＰベクター由来配列が付加されている。
　プライマーの配列：ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴ（配列番号４）
　プライマーの配列：ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣ（配列番号５）
　プライマーの配列：ＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡ（配列番号６）
　プライマーの配列：ＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧ（配列番号７）
　ＰＣＲ反応液には、ベクターＤＮＡ１０ｎｇ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）１．０Ｕ、５×添付バッファー４．０μＬ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、プライマー対各２．５ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水で合計２０μＬにフィルアップした。
　ＰＣＲは、ＴａＫａｒａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅを用いて、９８℃を１０秒、６０℃を１５秒及び６８℃を２分３０秒の反応を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製し、１μｇ／μＬになるように滅菌水に溶解し、これを以下の実験に用いた。
（４）遺伝子導入
　０．６μｍの金粒子径を用い、ＧＦＰベクター又は線状ベクター溶液（１μｇ/μＬ）を、金粒子７５０μｇあたり１０μｇになるように入れ、実施例１－１―（３）に記載の方法に準拠した。
（５）形質転換処理個体の生育
　一晩静置した形質転換処理個体をＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地を入れたディスポーザブル植物細胞培養容器（Ｓｉｇｍａ）に移植し、長日（２２℃、１６時間日長）で育成した。３－４週間生育させた後、第２－３葉が観察された時点で、園芸用育苗培土を入れたポットへ移植した。その後、長日の人工気象室（２４℃、１６時間日長、湿度５０－７０％）にて第４－６葉が出るまで育成した。
（６）Ｔ０植物葉における導入遺伝子の有無
　実施例１－２－（５）に記載の方法に準拠した。各種ベクターを形質転換処理した場合において、それぞれ得られた導入遺伝子確認個体（Ｔ０世代）から遺伝子導入処理を行った完熟胚数当たりの遺伝子導入効率（遺伝子導入個体数／処理完熟胚数×１００）を算出した。その結果、従来のＧＦＰベクターを導入した場合（４．２％）に比べ、線状ベクター１及び線状ベクター２を実験に用いた場合の遺伝子導入効率は、それぞれ７．１％、１４．２％となり(表９)、線状ベクター２で特に高かった。これらの結果から、遺伝子導入には線状ベクター（導入目的とする核酸カセット）が好ましく、より好ましくは導入目的とする核酸カセットの両末端に０．８ kb以上の核酸が付加された線状ベクターを用いることだとわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
[実施例１１]イネにおける形質転換体の取得
　イネについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
１．イネ完熟種子の調製
　脱穀したイネ(品種：日本晴)の完熟種子を実施例１－１－（１）に記載の方法で殺菌、洗浄後、滅菌水で湿らせたキムタオル又はろ紙上に載せ、２５℃で２４時間～４８時間インキュベートしたものを以下の実験に用いる。
２．完熟種子胚中の茎頂の露出
　実施例１－１－（２）に記載の方法に従い、完熟種子胚中の茎頂を完全露出させる。茎頂を露出させた完熟胚を約３０個／プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地に置床する。
３．遺伝子導入
　イネ完熟胚の茎頂への遺伝子導入は、実施例１－１－（３）に記載の方法に従って行う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
　実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．形質転換処理個体の生育
　実施例１－２－（４）に記載の方法に従い、形質転換処理個体を生育する。
６．Ｔ０植物葉における導入遺伝子の確認
　実施例１－２－（５）に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
[実施例１２] リンゴにおける形質転換体の取得
　リンゴについても、本質的にはコムギと同様の手法により形質転換体を得ることができる。
１．リンゴ茎頂の調製
　リンゴ(品種：ジョナゴールド)の茎頂の調製は、植物組織培養, 9(2), 69-73 (1992)に記載の茎頂培養の誘導条件に沿って実施する。
２．茎頂の露出
　１．の手法にて調製した茎頂を、約３０個/プレートとなるようにＭＳ－ｍａｌｔｏｓｅ培地(４．３ｇ／Ｌ　ＭＳ　ｓａｌｔ　、ＭＳ　ｖｉｔａｍｉｎ、３０ｇ／Ｌ　マルトース、０．９８ｇ／Ｌ　ＭＥＳ　、３％ＰＰＭ（ｐｌａｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ、登録商標、ナカライテスク)、７．０ｇ／Ｌ　ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．８）に置床する。
３．遺伝子導入
　プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを用い、実施例１－１－（３）に記載の方法に従う。
４．ＧＦＰタンパク質の一過的な発現を指標とした選抜
　実施例１－１－（４）に記載の方法に従い、金粒子径０．６μｍを用いて形質転換処理した個体中、茎頂組織において５スポット以上のＧＦＰ蛍光が観察されたものを選抜する。
５．形質転換処理個体の生育
　実施例１－２－（４）に記載の方法に従い、形質転換処理個体を生育する。
６．Ｔ０植物葉における導入遺伝子の確認
　実施例１－２－（５）に記載の方法に従い、遺伝子導入確認個体を取得する。得られた個体を育成し、次世代種子を取得することで、安定的な形質転換体を取得することができる。
　本発明は、農業、医薬産業、酵素産業などに利用できる。
　Ａｌ　　アリューロン層
　Ｅ　　　胚乳

Claims (10)

  1. 　植物の形質転換方法であって、
    　直径０．３μｍ以上０．９μｍ以下の微粒子を、少なくとも１種の核酸により被覆する工程と、
    　該被覆した微粒子を遺伝子銃を用いて完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂に撃ち込む工程と、
    　該被覆した微粒子を撃ち込んだ茎頂を生育し、植物体を得る工程と、
    　該植物体から形質転換植物体を選択する工程と
    　を含む、方法。
  2. 前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、Ｌ２細胞に打ち込む工程を特徴とする、請求項１の方法。
  3. 前記完熟種子の胚の茎頂または塊茎の幼芽の茎頂のうち、生殖細胞系列へ移行する茎頂幹細胞に打ち込む工程を特徴とする、請求項１の方法。
  4. 　さらに、前記完熟種子の胚の茎頂が、該完熟種子から胚乳、鞘葉、葉原基、および余分な胚盤を除去し、露出させた茎頂である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　さらに、前記塊茎の幼芽の茎頂が、該塊茎の幼芽から塊茎、葉原基を除去し、露出させた茎頂である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記少なくとも１種の核酸が、導入目的とする核酸カセットを含む線状ＤＮＡである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記線状ＤＮＡが、導入目的とする核酸カセットの両末端に０．８ｋｂ以上１．２ｋｂ以下の核酸が付加された線状プラスミドである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記完熟種子が、その根長が１ｍｍ以下の完熟種子であることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモおよびリンゴからなる群から選ばれるいずれか１であることを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法を用いて植物の形質転換体を製造する方法。
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