JP2014003976A - 植物成長阻害ホルモンを用いた植物形質転換方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、植物成長阻害ホルモンの適用下で、外来遺伝子含有ベクターを有するアグロバクテリウム菌を植物に接種し感染させる工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法を提供する。本発明はまた、外来遺伝子を含むが選択マーカー遺伝子を含まないT-DNA領域を有するベクターを保持するアグロバクテリウム菌を用いて、植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法も提供する。
【選択図】なし
Description
[1] 植物成長阻害ホルモンの適用下で、外来遺伝子含有ベクターを有するアグロバクテリウム菌を植物に接種し感染させる工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法。
[2] 植物成長阻害ホルモンが、環境ストレス誘導性である、上記[1]の方法。
[3] 植物成長阻害ホルモンが、アブシジン酸又はジャスモン酸である、上記[1]又は[2]の方法。
[4] 外来遺伝子を含むが選択マーカー遺伝子を含まないT-DNA領域を有するベクターを保持するアグロバクテリウム菌を用いて、植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法。
[5] アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法が、メリステムの創傷部位にアグロバクテリウム菌を接種することを含むインプランタ形質転換法である、上記[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6] 種子の胚のメリステムの創傷部位にアグロバクテリウム菌を接種する、上記[5]の方法。
[7] 種子が1 mm以下の長さのシュートを有するものである、上記[6]の方法。
[8] アグロバクテリウム菌を接種した植物を減圧処理及び/又は共存培養することを含む、上記[1]〜[7]のいずれかの方法。
[9] 植物がイネ科植物又はマメ科植物である、上記[1]〜[8]のいずれかの方法。
[10] 植物成長阻害ホルモンを含む、植物形質転換用のアグロバクテリウム菌調製用培地。
(1)植物導入用の外来遺伝子含有ベクターの調製
植物導入用バイナリーベクターpIG121-Hm(Ohta, S. et al., Plant Cell Physiol., 31, 805-813 (1990))を制限酵素NheI及びHindIIIで切断することによりT-DNA領域内のカナマイシン耐性マーカー遺伝子NPTIIを除去し、さらに、制限酵素EcoRI及びStuIで切断することによりT-DNA領域内のハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子HPTを除去したベクターpIG121-1を調製した。ベクターマップを図1に示す。このpIG121-1においてはT-DNA領域内からGUS遺伝子以外の全ての選択マーカー遺伝子が除去されていた。植物に導入するpIG121-1中の外来遺伝子としては、pIG121-HmのT-DNA領域に既に含まれている、GUS(βガラクトシダーゼ)遺伝子をそのまま用いた。
上記(1)で得られたバイナリーベクターpIG121-1を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404菌に、凍結融解法(Hofgen et al.(1998) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acids Res., Oct 25;16(20):9877)を利用して導入し形質転換した。形質転換アグロバクテリウムを選抜するため、遺伝子導入したアグロバクテリウムをカナマイシン(50mg/L)及びストレプトマイシン(50mg/L)を含むYEP培地上で増殖させた。
上記で調製したpIG121-1を導入したアグロバクテリウムを、カナマイシン、ストレプトマイシン(各50mg/l)を含むLB培地中で28℃で18時間培養することにより、アグロバクテリウム菌液を調製した。この培養により、pIG121-1を保持する形質転換アグロバクテリウムを、pIG121-1のT-DNA領域外に含まれるカナマイシン耐性遺伝子及びストレプトマイシン耐性遺伝子の機能により選抜した。
GUS 5’ 5'-acctcgcattacccttacgc-3'(配列番号1)
GUS 3’ 5'-tatccacgccgtattcggtg-3'(配列番号2)
である。
実施例1で調製したpIG121-1を導入したアグロバクテリウムを、カナマイシン、ストレプトマイシン(各50mg/l)を含むLB培地中において28℃で18時間培養することにより、アグロバクテリウム菌液を調製した。
実施例1で調製したpIG121-1を導入したアグロバクテリウムを、カナマイシン、ストレプトマイシン(各50mg/l)を含むLB培地中で28℃で18時間培養することにより、アグロバクテリウム菌液を調製した。
実施例1で調製したpIG121-1を導入したアグロバクテリウムを、カナマイシン、ストレプトマイシン(各50mg/l)を含むLB培地中で28℃で18時間培養することにより、アグロバクテリウム菌液を調製した。
コムギとして品種春よ恋(品種登録番号第8834号。春小麦の1種)を用いた点以外は、実施例4記載と同一の方法で、コムギ種子に遺伝子を導入し、T1種子を取得後、実施例1と同様にしてT1世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。
300μMアブシジン酸を添加する点以外は、実施例4と同一の方法で、コムギ種子に遺伝子を導入し、T1種子を取得後、実施例1と同様にしてT1世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。
10μMアブシジン酸を添加する点以外は、実施例4と同一の方法で、コムギ種子に遺伝子を導入し、T1種子を取得後、実施例1と同様にしてT1世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。
ダイズとして品種トヨムスメを用い、発芽後14日経過時の植物体の腋芽にアグロバクテリウム菌液を接種する点以外は、実施例1と同様の方法にて形質転換を実施し、T0世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。
アグロバクテリウム菌株として、アグロバクテリウム・ツメファシエンスM21変異株を用いること以外は、実施例8と同様の方法にて、形質転換を実施し、T0世代での遺伝子導入を確認した。
トウモロコシ(Zea mays)の種子を滅菌水で2〜3回洗い、種皮に付いている赤色の殺菌剤を洗い落とした。この種子を滅菌水中に浸漬して、25℃の温度で2日間インキュベートした。この間に水を1回交換した。この処理により、種子が吸水して胚部分が白色を呈するようになった。この種子を以下の実験に使用した。また、実施例1と同様の方法で、pIG121-1を導入したアグロバクテリウムとアブシジン酸(終濃度100μM)を含む菌液を接種用アグロバクテリウム菌液として調製した。
実施例1で調製したpIG121-1を導入したアグロバクテリウムを、カナマイシン、ストレプトマイシン(各50mg/l)を含むLB培地中で28℃で18時間培養することにより、アグロバクテリウム菌液を調製した。
共存培養において、アグロバクテリウム菌液より取り出した種子を、湿ったキムタオルの上に乗せ、シャーレのフタをした状態で、28℃で2日間培養(共存培養)したこと以外は、比較例1と同じ手順で実験を行った。
アグロバクテリウム感染工程において、メリステムに創傷をつくった種子を、比較例1と同じアグロバクテリウム菌液に浸し、アスピレーターにて減圧操作を20分間実施すること(減圧浸潤操作)により、アグロバクテリウムを接種したこと以外は、比較例1と同じ手順で実験を行った。
アグロバクテリウム感染工程において、直径0.71mmの針で、種子のシュート(シュート長:1mm以下。およそ0.5〜1.0mm)周辺を、約1mmの深さで突いて孔を開けたこと以外は、比較例1と同じ手順で実験を行った。
ダイズとして品種トヨムスメを用い、発芽後14日経過時の植物体の腋芽にアグロバクテリウム菌液を接種する点以外は、比較例1と同様の方法にて形質転換を実施し、T0世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。
アグロバクテリウム菌液にアブシジン酸を添加しない点以外は、実施例9と同様の方法にて形質転換を実施し、T0世代での遺伝子導入を確認した。このようにして算出された、本方法による形質転換効率(T0世代)は、30%であった。
アグロバクテリウム菌液にアブシジン酸を添加しない点以外は、実施例10と同様の方法にて形質転換を実施し、T0世代での遺伝子導入、遺伝子発現を確認した。このようにして算出された、本方法による形質転換効率(T0世代)は、0%であった。
Claims (10)
- 植物成長阻害ホルモンの適用下で、外来遺伝子含有ベクターを有するアグロバクテリウム菌を植物に接種し感染させる工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法。
- 植物成長阻害ホルモンが、環境ストレス誘導性である、請求項1に記載の方法。
- 植物成長阻害ホルモンが、アブシジン酸又はジャスモン酸である、請求項1又は2に記載の方法。
- 外来遺伝子を含むが選択マーカー遺伝子を含まないT-DNA領域を有するベクターを保持するアグロバクテリウム菌を用いて、植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする、アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法。
- アグロバクテリウム菌を介する植物形質転換方法が、メリステムの創傷部位にアグロバクテリウム菌を接種することを含むインプランタ形質転換法である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 種子の胚のメリステムの創傷部位にアグロバクテリウム菌を接種する、請求項5に記載の方法。
- 種子が1 mm以下の長さのシュートを有するものである、請求項6に記載の方法。
- アグロバクテリウム菌を接種した植物を減圧処理及び/又は共存培養することを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 植物がイネ科植物又はマメ科植物である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 植物成長阻害ホルモンを含む、植物形質転換用のアグロバクテリウム菌調製用培地。
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