KR20040075385A - 들깨 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성들깨 - Google Patents

Abstract

본 발명은 들깨에 아그로박테리움을 형질전환 매개체로 이용한 형질전환 방법과 그 방법에 의해 얻어진 제초제 저항성 형질전환 들깨 식물체에 관한 것이다.

본 발명은 아그로박테리움을 이용하여 유용유전자를 형질전환하는 방법으로 pCKBar와 pMOG6Bar 운반체를 포함한 아그로박테리움을 전처리없이 들깨 식물체의 배축과 공동배양하는 단계와, 상기 공동배양 된 들깨 식물체의 배축을 kanamycin 혹은 hygromycin이 포함된 선발배지에서 선발한 후 shoot 신장배지에서 shoot를 신장하는 단계와 신장된 shoot를 뿌리유도배지에 계대배양하는 단계와, 상기 선발배양되어 뿌리가 발달된 개체들을 멸균된 질석에 이식하여 순화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 제초제 저항성 형질전환 들깨의 제조방법 및 이 방법에 의해서 형질전환된 제초제 저항성 들깨 및 그 종자에 관한 것이다.

본 발명의 들깨 형질전환방법으로는 유용한 유전자를 들깨에 효율적으로 삽입해서 새로운 품종의 개발이 용이하며 육종연한 단축이 가능하다. 제초제 저항성 들깨는 노동력 절감, 비닐멀칭에 따른 환경의 피해를 최소화할 수 있고 다른 들깨 품종과 교배 등을 통한 육종 소재로의 이용 등이 가능하게 된다.

Description

들깨 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성 들깨{Method for Producing Transgenic Perilla Plants, and Herbicide-Resistent Perilla Plants by the Method}

본 발명은 제초제 외래 유전자를 들깨 식물체에 도입하여 들깨 식물체를 형질전환하는 방법 및 그 방법에 의해 얻어진 형질전환 들깨 식물체에 관한 것이다.

우리나라에서 들깨의 재배면적은 2.9만 ha이고 종실 생산량은 22.4MT으로 참깨 다음으로 많이 생산되는 특용작물이다. 최근에 들깨 종실은 연간 생산량이 605억원 정도이나 들깨잎의 경우는 가락동 시장에서만 연간 1000억원이상이 거래되는 채소류이기도 하다. 들깨의 유지조성은 필수지방산인 α-linolenic acid(18:3)가 60% 대로 유지작물 중에서 가장 함유량이 높아서 지방산 조성의 변화와 EPA, DHA 같은 특수 지방산의 생성 등에 좋은 재료로 사용될 수 있어 형질전환방법이 절실히 요구되고 있다. 또한 들깨는 전작물로서 재배시 생육초기에 잡초가 생육을 저해하기 때문에 제초제 저항성 식물을 육성시 제초 노력의 경감에 기여할 수 있을 것이다.

들깨에 아그로박테리움을 이용한 형질전환 보고는 국내외적으로 전무한 상태이고 제초제저항성 유전자를 형질전환하여 제초제저항성 작물을 만든 경우는 콩,담배, 유채 등에서 보고된 바는 있으나 들깨에서는 이 역시 보고된 바가 없다.

본 발명은, 아그로박테리움을 이용하여 유용한 외래 유전자를 도입하기 위한 들깨 식물체의 형질전환방법 즉, 새로운 육종방법 및 그 방법에 의해 얻어지는 새로운 품종의 들깨 식물체와 종자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 제초제 저항성 외래 유전자를 도입하기 위한 들깨 식물체의 형질전환방법 및 그 방법에 의해 얻어지는 제초제 저항성 들깨 식물체와 종자를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

도 1은 들깨를 형질전환하기 위하여 개발한 식물 형질전환용 운반체의 주요부를 보여주는 그림이다.

도 2는 본 발명에 의한 방법에 따라 아그로박테리움을 들깨 배축에 감염시켜 형질전환하고 형질전환된 들깨로 재분화시키는 과정을 보여주는 사진이다.

도 3은 본 발명에 의한 형질전환 들깨에 삽입된 제초제 저항성 유전자의 핵산증폭반응(PCR) 분석결과 사진이다.

도 4는 본 발명에 의한 형질전환 식물체(T0)에서 Bar probe를 이용하여 유전자의 도입여부를 보여주는 genomic southern blot 분석결과 사진이다.

도 5는 본 발명에 의한 형질전환 식물체(T0)에서 Bar probe를 이용하여 유전자의 발현여부를 보여주는 northern blot 분석결과 사진이다.

도 6은 본 발명에 의한 형질전환 식물체를 항체를 이용하여 단백질의 생성을 GMO 진단키트(Strategic Diagnostics Inc, LL corn grain test kit)로 검정한 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 본 발명에 의한 형질전환체에서 0.6%의 바스타를 처리했을 때의 제초제 저항성 검정사진과 온실에서의 형질전환체의 재배사진이다.

본 발명은 아그로박테리움을 이용한 들깨의 형질전환방법과 제초제 저항성 들깨에 관한 것으로서, (A) 외래의 목적유전자 및 선발인자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 벡터제작단계와, (B) 상기 제조된 발현벡터를 상기 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 제조하는 아그로박테리움형질전환단계와, (C) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 들깨 식물체의 조직절편과 공동배양하는 공동배양단계와, (D) 상기 공동배양 된 들깨 식물체의 조직절편을 선발-슈트유도배지에서 슈트를 유도한 후 유도된 슈트를 뿌리유도배지에서 계대배양하는 재분화단계와, (F) 뿌리가 발달된 들깨 식물체를 자연환경에 이식하여 순화시키는 순화단계;를 포함하는 형질전환 들깨의 제조방법에 관한 것이다.

물론 필요한 경우 얻어진 형질전환 들깨 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여 분자생물학적인 방법 및/또는 바스타 제초제 살포에 의한 형질전환체의 확인단계를 포함하는 것이 가능하다.

본 발명에서 상기 (A) 단계에서의 식물 형질전환용 발현벡터의 선발인자로는 식물체에 저항성을 부여하는 여러 가지 유전자 중 어느 하나 또는 둘 이상을 적용할 수 있다. 그러나 카나마이신 저항성 유전자인 NPTⅡ 유전자 또는 하이그로마이신 저항성 유전자인 HPT 유전자를 적용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 (D) 단계에서, 상기 선발배지는 필수적으로 카나마이신 또는 하이그로마이신을 함유하게 된다.

본 발명에서 상기 발현벡터는 아그로박테리움과 함께 들깨 식물체에 도입될 것이므로, 아그로박테리움에서 복제·발현 및 선별이 가능하고, 식물체에서 발현 및 선별이 가능하도록 구성된 어떠한 벡터라도 이용될 수 있다.

한편, 널리 사용되고 있는 제초제인 Basta에 대한 저항성 유전자인 bar는Streptomyces hygroscopicus자신이 생산한 포스피노트리신(phosphinothricin)을 아세칠화하여 무독화시키는 효소인 포스피노트리신 아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase)의 유전자(EMBO 6, 2519-2523,1987)로서 형질전환 시 선발표식인자(selection marker) 또는 포스피노트리신을 함유한 제초제의 저항성 식물체 개발에 많이 이용되고 있다. 포스피노트리신은 글루타민 합성을 강력하게 저해함으로써 식물체내에 암모니아 농도를 증가시켜 식물체를 갈변시키고 고사하게 한다.S. hygroscopicus이 생산하는 바일라포스(bailaphos) 또는 포스피노트리신이 함유된 바스타(Basta)는 잔류성에 의한 환경오염이 다른 제초제에 비해 적고 효능이 우수한 비선택적 제초제로 알려져 있다.

따라서, 본 발명에서는, 제초제 저항성 들깨 식물체를 얻기 위하여, 상기 (A) 단계에서의 외래 유전자로 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자를 이용하는 것이 가능하다. 이 경우, 상기 (D) 단계에서, 식물체를 상기 선발배지에서 계대배양한 이후에, 포스포이노트리신이 함유된 2차 선발배지에서 추가로 배양하여 형질전환된 식물체를 선발할 수 있다.

이 경우, 목적 외래 유전자인 제초제 저항성 유전자는, 그 유전자 자체가 유용한 목적 유전자일 뿐 만 아니라 선별 유전자로도 이용될 수 있기 때문에 목적 유전자와 선별 유전자를 동시에 발현시킨다는 개념이 가능하게 된다.

이때에도, 상기 발현벡터는 아그로박테리움에서 복제·발현 및 선별이 가능하도록 구성된 어떠한 벡터라도 가능할 것이다. 구체적으로 본 발명에서는 backbone으로 플라스미드 pCAMBIA 2300, 제초제 저항성(Bar)를 위한 promoter로 CaMV 35S, 식물체 선발인자로 kanamycin 저항성 유전자(NPTⅡ 유전자)를 가지는 식물 형질전환용 발현벡터 pCK-Bar 또는 식물체 선발인자로 hygromycin 저항성 유전자(HPT 유전자)를 가지는 식물 형질전환용 발현벡터 pMOG6-Bar를 제작하여 사용할수 있다. 상기 플라스미드 pCK-Bar와 pMOG6-Bar의 주요 부분의 유전자 배열을 도 1에 나타내었다.

본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 것이라도 적용이 가능할 것이다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 크다고 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105(Agrobacterium tumefaciensEHA 105)를 이용하였다. 즉 상기 식물 형질전환용 발현벡터 pCK-Bar 또는 pMOG6-Bar를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105(Agrobacterium tumefaciensEHA 105)에 통상의 방법으로 도입·선발하였고, 형질전환된 상기 아그로박테리움을 들깨 식물체 배축에 도입한 것이다.

각각 플라스미드 pCK-Bar 및 pMOG6-Bar이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105-CK(Agrobacterium tumefaciensEHA 105-CK) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105-MOG6(Agrobacterium tumefaciensEHA 105-MOG6)에 관하여 그 제작과정을 상세히 기재하였기에 균주의 기탁을 생략한다. 본 명세서에 기재된 방법론 및 종래 알려진 기술들을 참조하여 실험을 수행하는 경우, 당업자라면 본 발명에 의한 저항성 획득을 위한 들깨의 형질전환 방법을 숙지할 수 있고, 또한 그 방법에 의한 들깨를 반복적으로 획득할 수 있을 것이다.

본 발명의 (D) 및 (E) 단계에서는, 들깨의 배축과 아그로박테리움 공동배양 후 1차, 2차 선발배지에서의 선발, 뿌리 유도배지에서의 계대배양, 토양(예를들면 멸균처리된 인공토양)에 이식하여 순화하는 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 생산된 형질전환체를 대상으로 실제로 형질전환된 식물체들이 외래 유전자를 포함하고 있는 가를 확인하기 위하여, PCR증폭(도 3), 서던 블럿(도 4), 노던 블럿(도 5) 및 GMO진단키트 실험(도 6) 등을 수행하였고, 모든 결과에서 외래 유전자인 bar 유전자가 형질전환체에서 안정적으로 발현되는 것을 확인할 수 있다.

또한 실제 적용실험으로써, 제초제 생물 검정단계로 식물체에 직접 바스타 용액을 살포하고 추이를 검토한 바, 본 발명에 의한 방법으로 생산된 형질전환 들깨 식물체는 제초제 저항성을 보유하고 있음을 확인하였다(도 7).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예에서는 편의를 위하여 외래 목적 유전자로 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자를 활용하였으나, 동일한 방법으로 다른 여러 가지 외래 목적 유전자를 적용하는 것이 가능하리라는 것은 당업자에게 당연한 사실이다.

실시예 1 : 제초제 저항성 유전자 운반체 작성 및 아그로박테리움에의 도입

들깨 식물체 형질전환용 운반체를 제작하고, 이를 아그로박테리움에 도입·선별하였다.

들깨의 형질전환 조건을 탐색하기 위하여 식물체 선발 마커로 kanamycin과 hygromycin을 사용할 수 있고 reporter 유전자로 intron-GUS를 가진 pIG121 vector를 이용하여 형질전환 초기의 preculture 기간, coculture 기간, 균주별, inducer의 처리 등이Agrobacterium형질전환 효율에 미치는 영향에 대해서 조사하는데 사용하였다(도시 생략).

또한 종래 형질전환 과정에서 가장 논란이 많은 부분인 형질전환 여부의 판별과정을 간편하고 명확하게 하기 위하여 선발 마커로 hygromycin 저항성 유전자인hpt와bar유전자를 가진 pMOG6-Bar plasmid를 이용하였다(도 1). pMOG6-Bar plasmid를HindIII로 절단하여bar 유전자를 pCambia 2300에 클로닝하여 kanamycin 저항성npt II와 제초제 저항성bar(Bialaphos resistance) 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 만들었다.

운반체의 backbone으로 binary 벡터인 pCAMBIA 2300이 사용되었으며, 제초제 저항성 유전자(Bar)의 식물체 전신발현을 유도하기 위하여 CaMV 35S promoter를 사용하였다. 형질전환된 식물체 선발인자로는 kanamycin 저항성(NPTⅡ 유전자) 및 제초제 저항성 BAR(Bialaphos resistance) 유전자를 포함하는 플라스미드 pCK-Bar 및 hygromycin 저항성(HPT 유전자) 및 Bar 유전자를 포함하는 플라스미드 pMOG6-Bar 플라스미드를 제작하였다. 상기 플라스미드 pCK-Bar와 플라스미드 pMOG6-Bar의 주요 부분의 유전자 배열을 도 1에 나타내었다. 도에서 각 부호의 약어는 다음과 같다: BL(left border), RL(fight border), P35S(CaMV 35S promoter,HPT(hygromycin phosphotransferase), Tnos(3' signal of nopaline synthase), Bar(phosphinothricin acetyltransferase), Ti7(T7 terminator), NPTII(Neomycin phosphotransferase II).

Agrobacterium 선발 항생제는 rifampicin과 kanamycin을 사용하였으며 제작된 형질전환용 binary vector DNA인 pCK-Bar 및 pMOG6-Bar를 통상의 방법으로Agrobacterium tumefaciensEHA 105에 도입하여, 각각 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105-CK 및 EHA 105-MOG6를 얻었다.

실시예 2 : 들깨 형질전환 방법

(1) 재분화 조건의 탐색

들깨를 기내에서 파종하여 발아한 후 자엽과 배축 부위를 이용하여 식물체 재분화 조건을 조사하였다. 그 결과, 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 자엽은 BA 3과 NAA 2에서 가장 재분화율이 좋았으며, 배축은 NAA가 포함되지 않은 BA 3에서 0.691로 가장 재분화가 잘 되었다. 자엽의 경우는 BA가 3mg 포함된 실험구에서 NAA의 존재유무에 따라 약간의 차이가 있었으나 전체적으로 재분화가 잘 되었으며, BA 양이 적고 NAA가 많은 시험구에서는 shoot가 형성되기보다는 뿌리의 형성이 왕성하게 일어났다. 배축의 경우도 역시 자엽과 비슷하였으나 NAA가 포함되지 않은 시험구에서 shoot 형성이 잘 되었으며 BA농도가 2 mg이나 1 mg으로 낮은 경우도 상당히 재분화율이 높았다.

위의 재분화 조건을 기초로 하여 식물체에 사용하는 항생제의 농도를 적정농도를 구명한 결과 kanamycin은 125 mg/L, hygromycin은 15 mg/L의 농도에서 식물체가 고사하였기 때문에 형질전환에 필요한 선발 농도로 이용하였다.

(2) 자엽을 이용한 형질전환 - 실패예

기존에 연구소에서 사용하고 있는 들깨 형질전환 방법으로 알려진 "자엽" 이용법을 수행하였다.

종자를 기내에서 파종하여 2∼3일된 자엽으로 3시간 MS 배지에 전처리한 다음A. tumefacience와 2일간 공동 배양하였다. shoot 유도를 위해 BA 3mg/L를 함유한 MS배지에 배양하였다. 이때 선발 및 슈트유도를 위해 배지에 kanamycin 100mg/L을 첨가하였고A. tumefacience의 제거를 위하여 carbenicillin 500mg/L 첨가하였다(선발-슈트유도배지). 선발-슈트유도배지에서 2달정도 배양후에 형성된 shoot를 뿌리형성을 위해, NAA를 농도별로 단독첨가한 MS 배지에 kanamycin 100mg/L 및A. tumefacience제거를 위해 carbenicillin 500mg/L가 첨가된 배지(뿌리유도배지)로 옮겼다.

이 결과, 그러나 뿌리는 전혀 형성되지 않고 캘러스만 유도되었다. 이에 따라, 뿌리 형성을 위하여 여러 가지 실험을 하였으며 그 결과 뿌리 형성에는 kanamycin이 뿌리형성을 억제하며 뿌리형성에는 shoot 유도시 BA함량과 관계가 있음을 알 수 있었다. 그 결과 들깨의 형질전환 체계를 확립할 수 있었다.

선발인자로 phosphinothricin을 사용할 경우는 선발 농도는 1.2mg/L였다. 그러나 이 농도에서도 형질전환체의 선발의 기준이 되는 shoot의 고사는 명확하게 결정되지 않고 애매한 점이 많았다. 아울러 kanamycin 보다 shoot의 발생율은 1/2-1/3정도로 떨어졌으며 뿌리의 생성도 상당히 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(데이터 생략). 그러나 제초제 저항성은 완전한 식물체를 형성할 경우에 선발이 간편하기 때문에 이 방법을 이용하여 형질전환을 실시하였다.

제초제 저항성 유전자를 선발인자로 사용할 경우의 재분화 식물체의 선발이 용이하기 때문에 PPT를 선발인자로 이용하여 형질전환을 실시하였다.

이렇게 하여 획득한 재분화체는 210개체로 이들을 0.3%의 제초제를 살포하였으나 생존개체를 확인할 수 없었다. PCR을 이용한 선발시 positive signal을 나타내는 몇 개체를 이용하여 genomic southern blot을 실시하였으나 내재의 유전자 signal은 확인할 수 있었으나 유전자의 삽입은 확인하지 못하였다(데이터 생략).

따라서, 저항성 들깨 식물체를 얻기 위해 기존에 연구소에서 사용하던 "자엽이용법"이 불가능함을 확인하고 배축을 이용하여 조건의 재정립을 시도하였다.

(3) 배축을 이용한 형질전환 - 성공예

들깨(엽실) 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지하고 멸균수로 3∼4회 세척하고 filter paper로 건조시켜 1/2 MS 배지에 파종하였다. 파종 후 6∼8일 경과된 배축을 0.5∼1㎝ 정도의 크기로 절단한 후 explant로 사용하였다.

pMog6-Bar 또는 pCK-Bar으로 형질전환된Agrobacterium tumefaciensEHA 105를 30시간 배양 후(OD600〓1) 5000rpm에서 5분 정도 원심분리하여 배양액을 제거한 후 MSO 액체배지로 약 20배 희석하여 상기 explant와 20분 방치하였다. explant를 멸균된 filter paper로 건조시킨 후 공동배양배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA, 0.2% gelrite. 0.2% phytagel)에서 25℃, 2∼3일간 공동배양(co-culture)하였다.

표면에 잔류하는 Agrobacterium을 제거하기 위하여, 공동배양한 explant를 cefatoxime 250㎎/L가 첨가된 MS 배지로 세척한 후 멸균된 종이에 올려 외부의 수분을 제거한 뒤 shoot를 유도하는 선발-슈트유도배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA, 0.1㎎/L NAA, 0.2% gelrite. 0.2% phytagar, 130㎎/L kanamycin 또는 10㎎/L hygromycin, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.6)에 옮겨서 형질전환된 배축에서만 shoot를 유도되도록 하였다.

3주마다 새로운 선발배지로 계대배양하면서 유도된 shoot 부분만을 절단하여 2차 선발배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 3㎎/L BA. 0.2% gelrite. 0.2% phytagar, 2㎎/L phosphinothricin, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.6)에서 배양·선발한 후에 뿌리유도배지(1/2 MS 기본배지, 500㎎/L carbenicillin, pH 5.8)에 계대배양하였다.

각 단계에서 사용된 배지의 조건을 정리하면 아래의 <표 2>와 같다.

뿌리가 발달된 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 플라스틱의 순화통에서 멸균된 질석(vermiculite)에 이식하여 순화시켰다.

각각 40 개체의 pCK-Bar에 의한 재분화 식물체와, pMOG6-Bar에 의한 재분화 식물체를 얻었다. 각 과정에서 재분화체의 효율은 1% 내외로 비슷하였다. 얻어진 재분화 개체에 0.3% 제초제를 처리하여 Bar 저항성 식물체를 선별하였다. 그 결과, pCK-Bar에 의한 재분화 식물체는 36 개체가, pMOG6-Bar에 의한 재분화 식물체는 40 개체 모두가 생존하였다. 이하 확인실험에서는 pCK-Bar에 의한 재분화 식물체 5개체(C1∼C5) 및 pMOG6-Bar에 의한 재분화 식물체 8개체(1∼8)를 이용하였다.

상기의 아그로박테리움을 들깨 배축에 감염시켜 형질전환하고 형질전환된 들깨로 재분화시키는 과정의 사진을 도 2에 나타내었다. 도에서 사진 A는 분리한 배축과 아그로박테리움을 공동배양하는 모습, B는 shoot 유도배지에서 shoot가 유도되는 모습, C는 유도된 shoot가 발달한 모습, D는 뿌리유도배지에서 뿌리가 유도되는 모습, E는 뿌리까지 생성된 재분화 식물체를 질석에서 순화하는 모습, F는 온실에 옮겨져서 생장한 재분화 식물체의 모습을 나타낸다.

실시예 3 : 제초제 저항성 들깨의 분자생물학적 분석

1) PCR을 이용한 유전자의 확인

본 발명에서 사용한 운반체 및 유전자가 형질전환 개체에 성공적으로 삽입되어 있는 지를 직접 확인하였다.

이를 위해, 확보된 들깨 재분화개체에서 genomic DNA를 분리하고 PCR을 실시하였다. 이때 들깨 재분화개체에서 분리한 genomic DNA를 주형으로 우선 제초제 저항성 유전자의 삽입여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 4종의 PCR 프라이머 세트를 디자인하여 사용하였다.

① Bar 확인용 프라이머 세트

5' - CCGTACCGAGCCGCAGGAACC - 3'(21 mer) (서열 1)

5' - GGCAGCCCGATGACAGCGACCAC - 3'(23 mer) (서열 2)

② 35S : Bar 확인용 프라이머 세트

5' - GACCCCCACCCACGAGGAGCATC - 3'(23 mer) (서열 3)

5' - AGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAG - 3'(24 mer) (서열 4)

PCR에 사용한 조건은 primer를 각각 1μM, 들깨 genomic DNA는 100ng을 사용하였고, PCR반응은 95℃에서 5분간 변성 반응시킨 후. 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 30초간 신장반응을 35회 반복하여 수행하였다. 사용한 효소는 Ex-Taq polymerase(Takara)이며 Perkin Elmer사의 GeneAmp PCR system 9700에서 행하였다.

Bar 확인용 프라이머와, 35S : Bar 확인용(35S 프로모터와 Bar 유전자 부위에 걸쳐 디자인된) 프라이머를 이용하여 PCR 한 결과 사진을 도 3에 나타내었다. 도에서 P는 positive control, M은 1kb marker, N은 비형질전환체, C1∼C5는 pCK-Bar에 의한 재분화 개체, 1∼8은 pMOG6-Bar에 의한 재분화 개체를 나타내며(이하 도면에서 동일), Bar는 증폭된 Bar 유전자(200bp)를, 35S-Bar는 증폭된 CaMV35S-Bar 유전자(500bp)를 나타낸다.

실험결과, 도에서 볼 수 있듯이, 모든 재분화 개체에서 500bp 크기와 200bp크기의 밴드가 확인되었다. 이는 모든 재분화 개체가 발현이 가능한 Bar 유전자를 가지는 형질전환체임을 증명하는 것이다.

2) southern hybridization 분석을 통한 유전자의 삽입 확인

외래 유전자인 Bar 유전자가 상기 형질전환체들의 genome 상에 삽입되었는지 여부를 서던 혼성화 방법으로 확인하였다.

재분화 개체들로부터 들깨 genomic DNA를 추출하여 정량한 다음 제한효소 HindⅢ을 이용하여 절단하였다. 처리된 DNA를 0.8% Agarose gel에서 전기영동하고 nylom membrane에 전이시켜서 bar유전자 단편을 방사성 동위원소 P32로 표지한 탐침으로 hybridization을 실시하였다. 실험결과 사진을 도 4에 도시하였다.

도 4에서 M은 marker로서 1kb 간격의 DNA 조각이고 나머지 기호는 도 3에서와 같다. 도에서 보는 바와 같이, 모든 재분화 개체에서 비형질전환체인 대조구에서는 확인하지 못한 2kb크기의 밴드(화살표)를 확인할 수 있었다. 이는 모든 재분화 개체의 genome 상에 외래 유전자인 Bar 유전자가 발현가능하도록 성공적으로 삽입되었음을 증명하는 것이다.

3) 유전자의 발현 분석

상기 형질전환 개체에서 외래 유전자(Bar 유전자)가 현실적으로 발현되는 지 여부를 재확인하였다.

Bar 유전자의 RNA 생성 유무를 확인하기 위하여 식물체의 total RNA를 분리하고 이를 nylon membrane에 전이한 다음 Bar 유전자의 단편을 이용하여 hybridization을 실시하였다(도 5). 도에서 각 기호의 의미는 도 4의 것과 동일하다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 13개의 재분화 개체 모두에서 (비록 발현양은 차이가 있지만) Bar 유전자의 RNA 단편이 확인되었다. 따라서 모든 재분화 개체에서 Bar 유전자의 발현(RNA 생성)이 가능함을 알 수 있다.

실시예 4 : 제초제 저항성 생물검정

상기 얻어진 재분화 개체에서 Bar 유전자의 최종산물인 단백질 즉, 포스피노트리신 아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase)가 생성되는 지를 GMO 진단키트 실험 및 실제 제초제 살포실험을 통해 확인하였다.

(1) 분자생물학적인 방법에 의해 형질전환체를 확인한 후에bar유전자 단백질에 특이적으로 결합하는 GMO(Genetically Modified Organism) 진단키트(Strategic Diagnostics Inc 사의 LL corn Grain test kit)를 이용하여 형질전환 여부를 다시 검정하였다. 그 결과 비형질전환체와 아그로박테리움이 감염된 식물체에서는 하나의 band만 확인 가능하여 음성반응으로 판별하였으며 형질전환체에서는 두 개의 band가 두 종류의 운반체 (pCKBar, pMog6Bar)에서 확인되어 13 개체 모두에서 제초제 저항성 단백질 즉, 포스피노트리신 아세틸전이효소에 대한 양성반응을 나타내었다(도 6).

(2) 상기 실시예 1에서 획득된 80 개체의 형질전환체에 상용 제초제 사용 농도인 0.3% 바스타 액제를 처리하면, 비형질전환체는 1주일 정도 지난 후에 고사하나 형질전환체는 생육에 지장이 없었다. 총 재분화개체 80개체에서 0.3% 제초제에서 생존한 76개체를 다시 0.6% 농도의 바스타 살포하였을 때 이중에서 8개체가 고사하였다. 0.6% 제초제를 살포하여 최종적으로 생존한 개체수는 pMOG6-Bar는 40개체이고, pCK-Bar는 28개체였다(데이터 도시 생략). 본 발명에 의한 형질전환체에서 0.6%의 바스타를 처리했을 때의 제초제 저항성 검정사진과 온실에서의 형질전환체의 재배사진을 도 7에 도시하였다.

본 발명에 의한 형질전환 식물체들이 0.6% 바스타를 살포하여서도 모두가 생존하는 것을 확인한 바, 이는 상기 획득된 재분화 개체들에서 제초제 저항성 단백질이 생성되고 있음을 증명하는 것이다.

실시예 5 : 제초제 저항성 형질의 유전 확인

제초제 저항성 들깨의 종자를 수확하여 후대 분리비를 검정한 결과 멘델의 분리비를 따랐으며 13개통중에서 제초제를 0.6% 살포시 생존개체와 고사개체가 3;1로 분리되는 개체는 8계통이었다. 제초제저항성 유전자는 들깨 식물체 게놈에 삽입되어 후대 유전함을 다시한번 확인하였다.

본 발명에 의한 형질전환의 방법이 확립되지 않은 들깨의 형질전환 체계확립으로 인하여 유용한 유전자를 들깨에 형질전환하여 원하는 형질을 가진 들깨의 육성이 가능하다. 또한, 제초제 저항성이 도입된 들깨는 재배와 관리시에 제초제 살포에 의한 잡초 제거가 용이하며 비닐멀칭설치가 불필요하여 노동력 절감, 환경오염방지, 생산량 증대의 효과가 있다. 또한 육종소재로 사용할 경우 교대후대에서의 유전자의 도입 및 발현에 대한 검정이 편리하여 신품종의 육종소요 기간단축과 선발의 효율성을 높일 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Method for Producing Transgenic Perilla Plants, and Herbicide-Resistent Perilla Plants by the Method <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying BAR sequence <400> 1 ccgtaccgag ccgcaggaac c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying BAR sequence <400> 2 ggcagcccga tgacagcgac cac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying 35S : BAR sequence <400> 3 gacccccacc cacgaggagc atc 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for identifying 35S : BAR sequence <400> 4 agcaggtggg tgtagagcgt ggag 24

Claims (9)

1. 외래 유전자를 도입을 통한 형질전환 들깨의 제조방법에 있어서,

   (A) 외래의 목적유전자 및 선발인자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 벡터제작단계;

   (B) 상기 제조된 발현벡터를 상기 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하여 형질전환된 아그로박테리움을 제조하는 아그로박테리움형질전환단계;

   (C) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 들깨 식물체의 조직절편과 공동배양하는 공동배양단계;

   (D) 상기 공동배양 된 들깨 식물체의 조직절편을 선발-슈트유도배지에서 슈트를 유도한 후 유도된 슈트를 뿌리유도배지에서 계대배양하는 재분화단계;

   (F) 뿌리가 발달된 들깨 식물체를 자연환경에 이식하여 순화시키는 순화단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는

   형질전환 들깨의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 공동배양단계 (C)에서, 아그로박테리움을 전배양하지 않고 바로 배양액을 원심분리하여 아그로박테리움 pellet을 MS 배지와 희석하여 들깨 배축에 1∼3시간 접종하며,

   상기 재분화단계 (D)에서, 공동배양된 들깨 배축의 표면에 있는 아그로박테리움을 제거하기 위하여 건조단계를 거친 후 선발배지에 치상하는 것을 특징으로 하는 형질전환 들깨의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 재분화단계 (D)에서, 상기 들깨 조직절편은 5∼8일된 배축이며, 상기 선별-슈트유도배지는 3% sucrose, 0.2% gellite, 0.2% phytagar, carbenicillin 500mg/L와 kanamycin 125mg/L (pCKBar) 혹은 hygromycin 15mg/L (pMOG6-Bar)를 함유한 MS 배지에 BA 3mg/L NAA 0.1mg/L가 첨가된 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 들깨의 제조방법.
4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,

   상기 재분화단계 (D)에서, 3% sucrose, 0.2% gellite, 0.2% phytagar, carbenicillin 500mg/L, phosphinothricin 2mg/L를 포함하는 MS 배지에 3mg/L BA가 첨가된 슈트신장배지에 유도된 슈트를 계대배양하는 소단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 들깨의 제조방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 재분화단계 (D)에서, 상기 뿌리유도배지는 3% sucrose, 0.2% gellite, 0.2% phytagar, carbenicillin 500mg/L를 함유하는 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 들깨의 제조방법.
6. 제 1 항에 의한 방법에 의해 외래유전자가 도입된 형질전환 들깨 식물체 및 그의 종자.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 벡터제작단계 (A)에서, 상기 외래 유전자는 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자이며,

   상기 재분화단계 (D)에서, 상기 선발-슈트유도배지에서 계대배양한 이후에, 포스포이노스리신이 함유된 2차 선발배지에서 추가로 배양하여 형질전환된 식물체를 선발하는 것을 특징으로 하는 들깨 식물체의 형질전환방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 벡터제작단계 (A)에서, 상기 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터는 pCK-Bar 또는 pMOG6-Bar인 것을 특징으로 하는 들깨 식물체의 형질전환방법.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 의한 방법에 의해 제조된 제초제 저항성 들깨 식물체 및 그의 종자.