JP7266226B2 - イチイ属の毛状根の製造方法 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
<1> イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
(a)前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
(b)前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
(c)前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
を含む、毛状根の製造方法。
<2> 前記植物材料がイチイ科イチイ属の枝である、<1>に記載の毛状根の製造方法。
<3> 前記枝が若枝である、<2>に記載の毛状根の製造方法。
<4> 前記植物材料の少なくとも一部の端部を切断して切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記切断面を前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、<1>~<3>のいずれか1つに記載の毛状根の製造方法。
<5> 前記植物材料の複数の端部を切断して複数の切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記複数の切断面の少なくとも1つを前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、<4>に記載の毛状根の製造方法。
<6> 前記複数の切断面は、前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬しない少なくとも一つの切断面を含む、<5>に記載の毛状根の製造方法。
<7> 前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、前記植物材料に導入する目的遺伝子を含む、<1>~<6>のいずれか1つに記載の製造方法。
<8> 前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、A13株(MAFF210266)、ATCC15834株、およびLBA1344株もしくはこれらの形質転換体からなる群より選ばれる少なくとも1種である、<1>~<7>のいずれか1つに記載の毛状根の製造方法。
<9> 前記植物材料がイチイ(Taxus cuspidata)である、<1>~<8>のいずれか1つに記載の毛状根の製造方法。
<10> イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
(a)前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
(b)前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
(c)前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
(e)前記育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に、浸漬する浸漬工程と、
(f)前記浸漬された不定根を挿し木する挿し木工程と、
(g)前記挿し木工程で挿し木された不定根を育成する育成工程と、
を含む、毛状根の製造方法。
本発明に係る毛状根の製造方法は、イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
(a)前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
(b)前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
(c)前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程、
を含む。
本発明における浸漬工程は、イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する工程である。
本発明における挿し木工程は、浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する工程である。
本発明における育成工程は、挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する工程である。
本発明における選別工程は、上述の育成工程で生じた不定根を選別する工程であり、任意に行うことができる。選別は、アグロバクテリウム・リゾゲネスに感染していない単なる不定根と毛状根とを選別する工程であってもよく、特定の遺伝子が導入された毛状根を選別する工程であってもよい。選別方法は、選別するという目的を達成できれば特に制限されないが、例えば、特定の遺伝子の導入状態により選別することができる。特定の遺伝子の導入状態は、レポーター遺伝子の発現や特定遺伝子に対するPCR法などの常法により確認することができる。
本発明における(e)浸漬工程は、(c)育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する工程である。植物材料の代わりに選別された不定根を用いる以外は(a)浸漬工程と同様に行うことができる。菌液の組成や、浸漬時の環境は、(a)浸漬工程と同じ条件であってもよく、異なる条件であってもよい。
本発明における(f)挿し木工程は、(e)浸漬工程で浸漬された不定根を挿し木する工程である。(f)挿し木工程は、(b)挿し木工程と同様に行うことができる。資材や固定方法は、(b)挿し木工程と同一であってもよく、異なっていてもよい。
本発明における(g)育成工程は、(f)挿し木工程で挿し木された不定根を育成する工程である。(g)育成工程は、(c)育成工程と同様に行うことができる。(g)育成工程における育成条件は、(c)育成工程の育成条件と同じあってもよく、異なっていてもよい。
1.アグロバクテリウム・リゾゲネスの接種
(1)アグロバクテリウム・リゾゲネスの培養
アグロバクテリウム・リゾゲネスLBA1344株、ATCC15834株及びA13株(MAFF 210266)をYEB培地に植菌し28℃、200rpmで2日間振とう培養した後6,500rpm、5分間、20℃で遠心分離し集菌した。
(2)イチイへのアグロバクテリウム・リゾゲネス接種
集菌した各菌体を、0.46gの接種培地(ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類(富士フィルム和光純薬社製))、20gのスクロース、0.1gのMES、100μLのB5ビタミンx1000倍液、2μLの6-ベンジルアデニン(1g/L DMSO)、1mLのアセトシリンゴン(10g/L DMSO)、40μLのSILWET L-77(商品名)を水に溶解し、1N水酸化カリウム溶液でpH5.7に調整し、200mLのアグロバクテリウム・リゾゲネス懸濁液(菌液)を得た。イチイ(Taxus cuspidata)から若枝約20cmを採取し、基部から約5cmの葉を除去した後、頂部及び基部を切断して切断面を2つ形成し、アグロバクテリウム・リゾゲネス懸濁液(菌液)に基部先端を含む切断面を浸漬した。このとき、もう一方の切断面(頂部)は菌液に浸漬しなかった。これを真空デシケーター(kartell社製)に移し真空ポンプ(アルバック機工社製:DA-30S)で3分間真空(0kPa)まで減圧した後、常圧に戻すことを3回繰り返した。イチイ若枝を取り出し、100倍希釈した植物活力剤(メネデール社製)を含む水で灌水した土(プロトリーフ社製:CASA GRAINE さし芽・種まきの土)に挿し木し、人工気象器(日本医科器械製作所社製:NC-350S)内で23℃、2.6klxで1ヶ月保管した。1ヶ月後、アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した若枝から約50本が発根した(図1)。
(1)不定根のゲノムDNA抽出
アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種し得られた不定根のうち、長さが長くDNAを抽出しかつ後述の実施例2を行うことができる49本について、それぞれの先端(根端)を数cm(7~10mg)切除し液体窒素で凍結、乳鉢で破砕した。破砕した不定根をチューブに移し、2×CTAB溶液(2%の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、100mMのTris-HCl(pH8.0)、1.4MのNaCl、20mMのEDTA)を1ml添加し、65℃で1時間インキュベートした。これに等量のクロロフォルム/イソアミルアルコール(24/1)を加え、20分間混和した後、12,000×gで10分間遠心分離した。遠心分離後上層を回収し、上記操作を繰り返した。得られた溶液に等量のイソプロパノールを添加し16,000×gで5分間遠心分離した後、上清を除去し70%エタノール水溶液を添加し再度遠心分離した。上清を除去し沈殿を乾燥させた後TE緩衝液100μLに溶解し、ゲノムDNA溶液を得た。
(2)PCRによる導入遺伝子の確認
不定根より抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRによる導入遺伝子の判定を行った。PCR試薬はKOD One(登録商標) PCR Master Mix(東洋紡社製)を、またイチイの内在遺伝子(EF1α)を検出するプライマー(配列番号1、2)、アグロバクテリウム・リゾゲネスの残留を判定するために用いるvirD2遺伝子を検出するプライマー(配列番号3、4)、毛状根の判定に用いるrolB遺伝子を検出するプライマー(配列番号5、6)を使用した。使用したプライマー配列を以下に示す。
CCCGGATCCTGAGACTGGAGTGATTAAGC
・配列番号2
TTGATGACTCCAACAGCAACAGT
・配列番号3
ATGCCCGATCGAGCTCAAGT
・配列番号4
CGAGCCTGCCGCTCAAGGCGCCGAA
・配列番号5
TTGGTGAACTGTGTGATGCCGCAA
・配列番号6
TCTATCTCGCGAGAAGATGCAGAA
3.アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した個体への再接種
(1)コンピテントセルの調製
アグロバクテリウム・リゾゲネスATCC15834株及びA13株(MAFF210266)を5mLのYEB培地に植菌し28℃、200rpmで一晩振とう培養した。この培養液を250mLのYEB培地に添加し28℃、200rpmで5時間振とう培養した後、5,000rpmで10分間、4℃で遠心分離し集菌した。1mMのHEPES(pH7.0)、10%グリセロールで順に洗浄し、前述遠心分離条件で集菌した後、2.5mLの10%グリセロールに懸濁した。滅菌チューブに40μLずつ分注し液体窒素で凍結した後-80℃で保存した。これをコンピテントセルとし、後述の実験に使用した。
(2)エレクトロポレーションによるアグロバクテリウムの形質転換
各コンピテントセルを溶解後プラスミドpHKN29(Mol Plant Microbe Interact.(2003)16:663-8)を1μg添加した。エレクトロポレーター(Bio-Rad社製:Gene-pluser)にて2.5kV、25μF、200Ωの条件で定法に従い高電圧パルスをかけた後、速やかに800μLのYEB培地を添加し28℃、1時間回復培養を行った。これを50μM/mLカナマイシンを含むYEB寒天培地に播種し、28℃で3日間静置培養した。
(3)アグロバクテリウム・リゾゲネスの培養及び接種
前述3.(2)で形質転換された各アグロバクテリウム・リゾゲネスのコロニーを50μM/mLのカナマイシンを含むYEB培地に植菌し28℃、200rpmで2日間振とう培養した後、6,500rpmで、5分間、20℃で遠心分離し集菌した。
集菌した各菌体を前述2.1で根端を採取した後のイチイ若枝の頂部を切断して改めて切断面を形成し、49本の不定根の根端を改めて切断して切断面を形成した。この若枝が有する49本の不定根に対し、1.(2)と同様の方法にて接種、保管した。1ヶ月後、アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した49本の不定根から新たに約40本発根した。なお、49本は、若枝から分離させずに、まとめて菌液に浸漬した。
前述の3.(3)で得られた不定根32本を2.(1)、2.(2)と同様にゲノムDNA抽出、PCRによる導入遺伝子の確認を行った。また、プラスミドpHKN29にコードされるGFP遺伝子を検出するプライマー(配列番号7、8)も合わせて使用した。アガロース電気泳動の結果を図3に示す。
CCACCCTCGTGACCACCTTCAC
・配列番号8
GAACTCCAGCAGGACCATGTGAT
Claims (9)
- イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
(a)前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬し、減圧環境下においた後、常圧に戻すことを3回以上繰り返す浸漬工程と、
(b)前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
(c)前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
を含み、
前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、A13株(MAFF210266)である、
毛状根の製造方法。 - 前記植物材料がイチイ科イチイ属の枝である、請求項1に記載の毛状根の製造方法。
- 前記枝が若枝である、請求項2に記載の毛状根の製造方法。
- 前記植物材料の少なくとも一部の端部を切断して切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記切断面を前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、請求項1~3のいずれか1項に記載の毛状根の製造方法。
- 前記植物材料の複数の端部を切断して複数の切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記複数の切断面の少なくとも1つを前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、請求項4に記載の毛状根の製造方法。
- 前記複数の切断面は、前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬しない少なくとも1つの切断面を含む、請求項5に記載の毛状根の製造方法。
- 前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、前記植物材料に導入する目的遺伝子を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記植物材料がイチイ(Taxus cuspidata)である、請求項1~7のいずれか1項に記載の毛状根の製造方法。
- イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
(a)前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬し、減圧環境下においた後、常圧に戻すことを3回以上繰り返す浸漬工程と、
(b)前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
(c)前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
(e)前記育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
(f)前記浸漬工程で浸漬された不定根を挿し木する挿し木工程と、
(g)前記挿し木工程で挿し木された不定根を育成する育成工程と、
を含み、
前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、A13株(MAFF210266)である、
毛状根の製造方法。
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