CN108949819B - 柑橘显性功能突变体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括：步骤一、利用第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因连接入该载体骨架转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选得到阳性转化子；步骤三、将阳性转化子培养成植株之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。本发明创制出当代即可利用的柑橘遗传材料，解决了当前无法利用T‑DNA插入方法快速创制出直接可以利用的柑橘突变体的问题。

Description

柑橘显性功能突变体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术研发技术领域，涉及一种柑橘显性功能突变体的制备方法。
背景技术
T-DNA序列插入植物基因组后，能破坏插入位点基因的转录。将有T-DNA序列插入的植株通过自交回交等方法能在其子代中获得该基因T-DNA插入纯合的株系，即能获得到该基因功能缺失的突变体。利用获得的T-DNA插入纯合突变体与野生型等植物材料在不同生长条件下进行表型检测，已成为发掘鉴定拟南芥、水稻等植物功能基因的重要手段。但，柑橘的童期长，从种子生长成实生植株结出果实一般需要至少5年以上，因此柑橘不容易通过自交回交等方法快速获得相关基因插入纯合的植物材料，这也是至今无法利用大规模构建柑橘T-DNA插入突变群体的方法来发掘鉴定柑橘农艺性状功能基因的重要原因。
在T-DNA内的边界处安装组成型强启动子能对插入位点附近基因的表达产生影响。当边界处含强启动子的T-DNA插入植物基因组中时，既可能干扰插入位点处基因的正常表达(RNAi)，产生该基因沉默的功能缺失性突变体，也可能导致插入位点附近处基因过量表达，产生基因过量表达的功能获得性突变体。这些显性的功能突变体无需进行自交杂交等纯化过程，当代的株系即可与其他植物材料进行表型比较来发掘鉴定植物性状功能基因，这比利用纯合T-DNA插入基因敲除突变体来鉴定基因功能的方法至少可节约繁育该植物1代的时间。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种柑橘显性功能突变体的制备方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架(pCAMBIA1300质粒来自于湖南省园艺研究所实验室；PCR的反应体系(30μL)：10×PCR缓冲液3μL，dNTPs(each 2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，无菌去离子水23μL；扩增条件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25个循环；72℃10min)，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游；
步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；
步骤三、将所述阳性转化子培养形成完整植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因；
利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述第一强启动子为NOSp启动子；
利用如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述NOSp启动子基因的产物。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述第二强启动子为CaMV 35S启动子；
利用如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述CaMV 35S启动子基因的产物。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，构建含有转移DNA结构域的所述目的载体的具体步骤包括：
1.1)利用限制性内切酶SalⅠ对含有转移DNA结构域的所述载体骨架序列扩增产物进行酶切，然后使其发生自连接反应，获得pVC质粒；
1.2)首先利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp启动子基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒，之后分别取双酶切后的NOSp启动子基因扩增产物和双酶切后的pVC质粒产物进行连接，获得pVC-NOSp质粒；
1.3)首先利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUS基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒，之后分别取双酶切后的GUS基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSp质粒产物进行连接，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒；
1.4)首先利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件CaMV 35S基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒，之后分别取双酶切的CaMV 35S基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSpGUSter质粒产物进行连接，获得所述目的载体pVC-NOSpGUSter-35S载体质粒。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤二中，将所述目的载体通过农杆菌介导的转化法整合到柑橘幼苗基因组的具体方法包括：
2.1)首先将所述目的载体(pVC-NOSpGUSter-35S)转化入农杆菌感受态EHA105细胞中，获得含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，然后培养含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，并制备农杆菌转化液；
2.2)首先在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述农杆菌转化液的三角瓶中，再然后将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.01～0.03MPa，保持10～20min，然后缓慢解除低气压状态，以三角瓶内的农杆菌转化液液面不出现晃动为宜，直至真空抽气装置内恢复到正常大气压；
2.3)在无菌条件下，将经过转化处理后的节间茎段置于生芽培养基上培养至生长出再生芽；
2.4)剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法鉴定得到所述阳性转化子。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，步骤2.4)中，还可采用PCR扩增方法进行阳性转化子的鉴定，PCR扩增方法采用的引物为如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对、如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对或如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤三中，将所述阳性转化子培养形成完整植株的具体方法包括如下步骤：
在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽，将再生芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处，该纵切处的深度约0.2cm；然后将制备的试管嫁接苗于光周期条件12h光照/12h黑暗、生长温度在26-28℃下培养15天以上，形成所述完整植株。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，步骤2.4)中，利用GUS染色方法鉴定得到阳性转化子的具体方法包括如下步骤：
将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含2％的甲醛(体积百分比浓度)和0.5％戊二醛(体积百分比浓度)的0.1mol/L磷酸缓冲液于室温下固定叶片45min，再分别用50％、70％和95％系列浓度乙醇(体积百分比浓度)依次漂洗5min，最后浸泡在75％(体积百分比浓度)乙醇中。
优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，步骤2.4)中，利用GUS染色液进行染色时，首先将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中，保持温度25-30℃，然后于20min内将环境气压调整至为0.5～0.8MPa并保持5-10min，再然后于30min内将环境气压调整为1.1～1.3MPa并保持3～5min，之后进入固定步骤。
本发明至少包括以下有益效果：
1.本发明以GUS染色法作为筛选标记，农杆菌侵染处理后的节间茎段再生芽培育过程能避免卡那青霉素抗生素等抗性筛选引起的生长抑制，因此在获得再生芽方面用时较短。本发明以GUS染色法作为筛选标记，农杆菌侵染处理后的节间茎段在12d-15d时即可生长出再生芽，而卡那青霉素抗生素筛选方法至少需要27d以上的时间才能观察到再生芽生长，即本发明利用GUS染色法作为筛选标记可比利用卡那青霉素抗生素筛选方法在获得再生芽方面能节约一半以上的时间。
2.本发明在农杆菌遗传转化柑橘节间茎段时利用真空抽气泵维持低气压0.02MPa时长15min，能排除节间茎段两端伤口处组织的细胞壁和外质体内存在的空气隔阂，并在缓慢解除低气压的过程有利于促进转化液扩散入节间茎段的伤口内，进而提高农杆菌的侵染效率。本发明以利用真空抽气泵维持低气压0.02MPa时长15min，能将遗传转化效率从2.5％(正常大气压下农杆菌遗传转化，正常大气压为1.01MPa)提高到为5.5％左右。
3.本发明创制出可直接利用(柑橘优良农艺性状株系筛选应用、柑橘农艺性状基因发掘鉴定)的柑橘遗传材料，解决了当前无法利用T-DNA插入方法来快速创造出可直接利用的柑橘突变体的问题，即本发明的方法在加速柑橘农艺性状基因解析和促进柑橘品种创制改良等方面有应用价值。本发明获得的冰糖橙和红肉脐橙显性功能突变体，当代即出现出了明显的表型。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中构建的目的载体结构图谱；
图2A为利用本发明获得的显性功能突变体植株变形叶冰糖橙图片，图2B为正常叶冰糖橙图片；
图3A、3B和3C分别为利用本发明的方法获得的花叶红肉脐橙的芽、嫩叶和幼果的图片，图3D、3E和3F分别为正常红肉脐橙的芽、嫩叶和幼果的图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300质粒为模板，PCR扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入到该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游。本发明的载体骨架含有转移DNA结构域，且右边界与第二强启动子的距离合适，十几个碱基对的距离，这样，既能够使得T-DNA结构域能够整合到柑橘幼苗基因组上，又能够使得第二强启动子发挥作用，能够对T-DNA插入位置附近的上下游基因产生过表达调控作用。pCAMBIA1300质粒来自于湖南省园艺研究所实验室；PCR的反应体系(30μL)：10×PCR缓冲液3μL，dNTPs(each 2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，无菌去离子水23μL；扩增条件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25个循环；72℃10min。
步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；
步骤三、将所述阳性转化子培养成完整植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。如图2A、3A、3B、3C所示，本发明获得的冰糖橙、红肉脐橙显性功能突变体，当代即出现出了明显的表型。获得显性功能突变体后，可通过TAIL PCR或基因组测序的方式来确定转移DNA(T-DNA)插入的位置，从而找到表达量受其影响的靶基因，以加速柑橘性状基因解析和促进柑橘品种创制改良。
在上述方案中，作为优选，所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因。
利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。
在步骤二中，采用GUS染色方法筛选阳性转化子，农杆菌侵染处理后的节间茎段在12d-15d时即可生长出再生芽，可比利用卡那青霉素抗生素筛选方法在获得再生芽方面能节约一半以上的时间。
在上述任一方案中，作为优选，所述步骤一中，所述第一强启动子为NOSp启动子；
利用如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述NOSp启动子基因的产物。
在上述方案中，作为优选，所述步骤一中，所述第二强启动子为CaMV 35S启动子；
利用如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述CaMV 35S启动子基因的产物。
在上述方案中，作为优选，所述步骤一中，构建含有转移DNA结构域的所述目的载体的具体步骤包括：
1.1)利用限制性内切酶SalⅠ对含有转移DNA结构域的所述载体骨架序列扩增产物进行酶切，然后使其发生自连接反应，获得pVC质粒；
1.2)首先利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp启动子基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒，之后分别取双酶切后的NOSp启动子基因扩增产物和双酶切后的pVC质粒产物进行连接，获得pVC-NOSp质粒；
1.3)首先利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUS基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒，之后分别取双酶切后的GUS基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSp质粒产物进行连接，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒；
1.4)首先利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件CaMV 35S基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒，之后分别取双酶切后的CaMV 35S基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSpGUSter质粒产物进行连接，获得所述目的载体pVC-NOSpGUSter-35S载体质粒。
本发明通过设置特异引物，使得通过扩增得到载体骨架和结构元件，并且通过多次酶切和连接方式最终得到目的载体，特异引物和酶切位置的设置精确、巧妙，能够快速构建得到目的载体，提高构建成功率，加快了显性功能突变体的制备效率。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，将所述目的载体通过农杆菌介导的转化法整合到柑橘幼苗基因组的具体方法包括：
2.1)首先将所述目的载体(pVC-NOSpGUSter-35S)转化入农杆菌感受态EHA105细胞中，获得含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，然后培养含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，并制备农杆菌转化液；
2.2)首先在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述农杆菌转化液的三角瓶中，再然后将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.01～0.03MPa，保持10～20min，然后缓慢解除低气压状态，以三角瓶内的农杆菌转化液液面不出现晃动为宜，直至真空抽气装置内恢复到正常大气压；优选地是，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.02MPa，保持15min。真空压力下能排除节间茎段两端伤口处组织的细胞壁和外质体内存在的空气隔阂，并在缓慢解除低气压的过程有利于促进转化液扩散入节间茎段的伤口内，进而提高农杆菌的侵染效率。本发明维持低气压0.02MPa时长15min，能将遗传转化效率能从2.5％(正常大气压下农杆菌遗传转化，正常大气压为1.01MPa)提高到为5.5％左右。
2.3)在无菌条件下，将经过转化处理后的节间茎段置于生芽培养基上培养至生长出再生芽；
2.4)剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法鉴定得到所述阳性转化子。
在上述方案中，作为优选，步骤2.4)中，还可采用PCR扩增方法进行阳性转化子的鉴定，PCR扩增方法采用的引物为如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对、如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对或如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对。
在上述方案中，作为优选，所述步骤三中，将所述阳性转化子培养形成完整植株的具体方法包括如下步骤：
在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽，将再生芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处，该纵切处的深度约0.2cm；然后将制备的试管嫁接苗于光周期条件12h光照/12h黑暗、生长温度在26-28℃下培养15天以上，形成所述完整植株。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤2.4)中，利用GUS染色方法鉴定得到阳性转化子的具体方法包括如下步骤：
将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含2％的甲醛(体积百分比浓度)和0.5％戊二醛(体积百分比浓度)的0.1mol/L磷酸缓冲液于室温下固定叶片45min，再分别用50％、70％和95％系列浓度乙醇(体积百分比浓度)依次漂洗5min，最后浸泡在75％(体积百分比浓度)乙醇中。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，利用GUS染色液进行染色时，还可首先将再生芽的叶片浸入GUS染色液中，保持温度25-30℃，然后于20min内将环境气压调整至0.5～0.8MPa并保持5-10min，再然后于30min内将环境气压调整为1.1～1.3MPa并保持3～5min，之后进入固定步骤。在真空过程中，叶片表面气孔逐渐展开，GUS染色液能够通过气孔均匀进入叶片内进行染色，而在GUS染色液进入叶片组织内，缓慢将环境气压调整为高于大气压强，能够使得GUS染色液快速浸入叶片组织内，从而实现快速染色。并且，在抽真空和加压过程中，都采用缓慢进行过程，避免了对叶片进行伤害，提高了染色效率。
本方法组合了NOSp启动子、GUS基因、CaMV 35S启动子等结构元件，构建成了可适用于制备柑橘类植物显性功能突变体的载体，然后通过农杆菌(EHA105)介导的柑橘节间茎段遗传转化方法，获得了冰糖橙、红肉脐橙等柑橘类植物的阳性转化子，并观察到一些突变体当代即表现出了明显的表型。因此，利用本发明的方法能创制出可直接利用(柑橘优良农艺性状株系筛选应用、柑橘农艺性状基因发掘鉴定)的柑橘遗传材料、可解决当前无法利用T-DNA插入方法来快速创造出可直接利用的柑橘突变体的问题，因此本发明的方法在加速柑橘农艺性状基因解析和促进柑橘品种创制改良等方面有应用价值。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
实施例1
1.1载体元件的获得
a.利用引物Right298XS-F(SEQ ID NO：1：5’-GCGTCGACTCTAGAGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCG-3’)和Left6582HS-R(SEQ ID NO：2：5’-GCGTCGACAAGCTTTTGTTTACACCACAATATATCCTGC-3’)扩增质粒pCAMBIA1300获得载体元件pVC(6286bp)的PCR产物。(pCAMBIA1300质粒来自于湖南省园艺研究所实验室；PCR的反应体系(30μL)：10×PCR缓冲液3μL，dNTPs(each2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，Pyrobest DNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，无菌去离子水23μL；扩增条件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25个循环；72℃10min。)
b.以引物NOSp2462H-F(SEQ ID NO：5：5’-CCAAGCTTGCCAATATATCCTGTCAAACACTG-3’)和NOSp2837S-R(SEQ ID NO：6：5’-GCGTCGACGCGAAACGATCCAGATCC-3’)扩增质粒pBI121获得载体元件NOSp(377bp)PCR产物。
c.以引物GUSter5845HX-F(SEQ ID NO：3：5’-CCCTCGAGAAGCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACCC-3’)和GUSter8020SX-R(SEQ ID NO：4：5’-GCTCTAGAGTCGACTCCCAGTCACGACGTTGT-3’)，扩增载体pBI121质粒获得载体元件GUSter(3177bp)PCR产物。
d.以引物35S4941KS-F(SEQ ID NO：7：5’-GCGTCGACGGTACCGATTACGCCAAGCTTGCA-3’)和35S5860SX-R(SEQ ID NO：8：5’-GCTCTAGACCCGGGCTACAGGACGTAACATAAGGGAC-3’)，扩增载体pBI121质粒获得载体元件35S(921bp)PCR产物。
1.2载体元件的连接
a.利用内切酶SalⅠ酶切载体元件pVC的PCR产物，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收后进行自连接反应。连接反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含卡纳青霉素的培养基上进行生长筛选，然后对生长出的菌落进行测序鉴定，获得pVC质粒。
b.利用内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp的PCR产物；利用内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒；然后通过琼脂糖凝胶电泳回收后进行连接反应。连接反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含卡纳青霉素的培养基上进行生长筛选，然后对生长出的菌落利用特异引物(NOSp2462H-F、NOSp2837S-R)进行PCR鉴定及测序鉴定，获得pVC-NOSp质粒。
c.利用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUSter的PCR产物；利用内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒；然后通过琼脂糖凝胶电泳回收后进行连接反应。连接反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含卡纳青霉素的培养基上进行生长筛选，然后对生长出的菌落利用特异引物(GUSter5845HX-F和GUSter8020SX-R)进行PCR鉴定及测序鉴定，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒。
d.利用内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件35S的PCR产物；利用内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒；然后通过琼脂糖凝胶电泳回收后进行连接反应。连接反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含卡纳青霉素的培养基上进行生长筛选，然后对生长出的菌落利用特异引物(35S4941KS-F和35S5860SX-R)进行PCR鉴定及测序鉴定，获得应用于本发明的pVC-NOSpGUSter-35S载体质粒，载体结构如附图1所示。
2.培养基成分和配制方法
LB培养基(1L)：10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10g NaCl(固体培养基加15g/L琼脂粉)；pH 7.0；高压灭菌。
生芽培养基成分(1L)：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O0.37g，KH2PO4 0.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，琼脂粉8g，6-苄氨基腺嘌呤3g，Tris调pH至5.75-5.80；高温高压灭菌后加入0.5g Cefotaxime sodium salt。
转化液成分(1L)：0.01mol MgCl2，0.01mol MES，0.2mmol乙酰丁香酮，0.5％(v/v)Silwet L-77，过滤除菌。
GUS染色液成分(1mL)：X-Gluc 0.5mg，N，N-二甲基甲酰胺40μL，0.1mol/L磷酸盐缓冲液799μL，5mmol/L铁氰化钾100μL，5mmol/L亚铁氰化钾100μL，Triton X-100 1μL。
GUS染色方法：将剪取的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含2％的甲醛(体积百分比浓度)和0.5％戊二醛(体积百分比浓度)的0.1mol/L磷酸缓冲液于室温下固定叶片45min，再分别用50％、70％和95％系列浓度乙醇(体积百分比浓度)依次漂洗5min，最后浸泡在75％(体积百分比浓度)乙醇中。
或者，利用GUS染色液进行染色时，还可首先将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中，保持温度25-30℃，然后于20min内将环境气压调整至为0.5～0.8MPa并保持5-10min，再然后于30min内将环境气压调整为1.1-1.3MPa并保持3～5min，之后进入固定步骤。
3.载体质粒转化农杆菌的方法
3.1农杆菌感受态的制备
a.挑取农杆菌EHA105菌株单菌落接种于2mL LB液体培养基(含50μg/mL Rif)中，于摇床中28℃、180rpm培养过夜；
b.按1:50接种于50mL LB中(含50μg/mL Rif)，于摇床中28℃、180rpm培养至OD600为0.5，约需6h；
c.将菌液在冰上放置30min，5000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；
d.加入10mL预冷的无菌0.15mol/L NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm离心5min，弃上清；
e.加入1mL预冷的20mmol/L CaCl2悬浮细胞，混匀后分装成200μL/管，液氮中速冻1min后，-80℃保存备用。
3.2载体质粒转化农杆菌感受态及鉴定阳性克隆
a.取200μL农杆菌感受态细胞，加入1μg pVC-NOSpGUSter-35S质粒DNA，混匀后冰浴30min；
b.在液氮中速冻1min，然后37℃恢复5min；
c.加入1mL LB培养基(不含任何抗生素)，28℃培养4h；
d.10000rpm离心30s，弃大部分上清，留约100μL培养基重悬菌体；
e.涂布于含有50μg/mL Rif和50μg/mL卡那青霉素的LB固体平板上，28℃倒置培养48h；
f.挑取平板上的单菌落，用菌落PCR方法鉴定后，提取质粒DNA及测序鉴定。
4.柑橘显性功能突变体制备方法
a.挑取农杆菌单菌落(菌株中含有pVC-NOSpGUSter-35质粒)在LB液体培养基(含有50μg/mL Rif和50μg/mL卡那青霉素)中，于摇床中28℃、180rpm培养过夜；再按1:50转接，继续培养至OD600为1.2-1.8；然后5000rpm离心5min，弃上清，用转化液重悬，并调至菌液OD600为0.6-0.8。
b.在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述转化液的三角瓶中；将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.01～0.03MPa、时长10～20min，最优选的是气压为0.02MPa、时长15min，然后缓慢解除低气压状态(保证三角瓶内的转化液液面不出现晃动)直至真空抽气装置内恢复到正常大气压。
c.在无菌条件下，将经过转化处理后的节间茎段置于无菌的干燥滤纸上迅速吸干菌液，再置于生芽培养基上进行光照培养至生长出再生芽。光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃。
d.剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法或特异序列PCR扩增方法鉴定阳性转化子；
e.在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽(阳性转化子)，芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处(约0.2cm深)以制备试管嫁接苗(12h光照/12h黑暗，生长温度保持在26-28℃；约15d后观察成活情况)形成完整植株。
f.形成的完整植株经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等生长环境下的砧木上保存繁殖。
实施例2
1.冰糖橙和红肉脐橙的显性功能突变体的制备
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的冰糖橙或红肉脐橙种子播种于MS盐培养基(pH值5.7)上暗培养约20d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)10d。生长温度保持在26-28℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm-3mm，株高大于5cm。
②挑取农杆菌单菌落(菌株中含有pVC-NOSpGUSter-35质粒或含有pBI121质粒)在LB液体培养基(含有50μg/mL Rif和50μg/mL卡那青霉素)中，于摇床中28℃、180rpm培养过夜；再按1:50转接，继续培养至OD600为1.2-1.8；然后5000rpm离心5min，弃上清，用转化液重悬，并调至菌液OD600为0.6-0.8。
③在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述转化液的三角瓶中。
处理一：将三角瓶置于室温条件下(大气压为1.01MPa)处理15min后，取出完成转化处理后的节间茎段。
处理二：将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.02MPa、时长15min，然后缓慢解除低气压状态(保证三角瓶内的转化液液面不出现晃动)直至真空抽气装置内恢复到正常大气压，取出完成转化处理后的节间茎段。
④在无菌条件下，分别将经过转化处理后的节间茎段置于无菌的干燥滤纸上迅速吸干菌液，再置于生芽培养基(菌株含有pBI121质粒转化后的节间茎段生芽培养基含有50μg/mL卡那青霉素)上进行光照培养至生长出再生芽。光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃。
⑤剪取处理二的节间茎段再生芽部分叶片，利用GUS染色方法或特异序列PCR扩增方法鉴定阳性转化子；
GUS染色方法：将剪取的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含2％的甲醛(体积百分比浓度)和0.5％戊二醛(体积百分比浓度)的0.1mol/L磷酸缓冲液于室温下固定叶片45min，再分别用50％、70％和95％系列浓度乙醇(体积百分比浓度)依次漂洗5min，最后浸泡在75％乙醇中。或者，利用GUS染色液进行染色时，还可首先将再生芽的部分叶片进入GUS染色液中，保持温度25-30℃，然后于20min内将环境气压调整至为0.5～0.8MPa并保持5-10min，再然后于30min内将环境气压调整为1.1-1.3MPa并保持3～5min，即完成染色，之后进入固定步骤。
⑥在无菌条件下切取0.5cm长的处理二节间茎段阳性再生芽(转化子)，芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处(约0.2cm深)以制备试管嫁接苗(12h光照/12h黑暗，生长温度保持在26-28℃；约15d后观察成活情况)形成完整植株。
⑦形成的完整植株经过炼苗培养(约20d)后，直接定植在土壤等生长环境。
效果数据
表1处理柑橘幼年态节间茎段后再生芽的最早出现时间
Figure BDA0001741734290000141
表2载体(pVC-NOSpGUSter-35S)遗传转化柑橘幼年态节间茎段的效率
Figure BDA0001741734290000142
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的柑橘显性功能突变体的制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，创制出可直接利用(柑橘优良农艺性状株系筛选应用、柑橘农艺性状基因发掘鉴定)的柑橘遗传材料，解决了当前无法利用T-DNA插入方法来快速创造出可直接利用的柑橘突变体等问题，即本发明的方法在加速柑橘农艺性状基因解析和促进柑橘品种创制改良等方面有应用价值。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南省园艺研究所
<120> 柑橘显性功能突变体的制备方法
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgtcgactc tagaggtaaa cctaagagaa aagagcg 37
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgtcgacaa gcttttgttt acaccacaat atatcctgc 39
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctcgagaa gcttatgtta cgtcctgtag aaaccc 36
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctctagagt cgactcccag tcacgacgtt gt 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccaagcttgc caatatatcc tgtcaaacac tg 32
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcgtcgacgc gaaacgatcc agatcc 26
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgtcgacgg taccgattac gccaagcttg ca 32
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctctagacc cgggctacag gacgtaacat aagggac 37

Claims (9)

1.一种柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游，所述转移DNA结构域的右边界与第二强启动子的距离为十几个碱基对；
步骤二、通过农杆菌介导的转化法将含有目标序列的转移DNA结构域整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；
步骤三、将所述阳性转化子培养成植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体；
所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因；
利用如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。
2.如权利要求1所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一强启动子为NOSp启动子；
利用如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述NOSp启动子基因的产物。
3.如权利要求2所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第二强启动子为CaMV 35S启动子；
利用如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述CaMV 35S启动子基因的产物。
4.如权利要求3所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，构建含有转移DNA结构域的所述目的载体的具体步骤包括：
1.1)利用限制性内切酶SalⅠ对含有转移DNA结构域的所述载体骨架序列扩增产物进行酶切，然后使其发生自连接反应，获得pVC质粒；
1.2)首先利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp启动子基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒，之后分别取双酶切后的NOSp启动子基因扩增产物和双酶切后的pVC质粒产物进行连接，获得pVC-NOSp质粒；
1.3)首先利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUS基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒，之后分别取双酶切后的GUS基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSp质粒产物进行连接，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒；
1.4)首先利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件CaMV 35S基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒，之后分别取双酶切后的CaMV35S基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSpGUSter质粒产物进行连接，获得所述目的载体pVC-NOSpGUSter-35S载体质粒。
5.如权利要求1、3或4任一项所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上的具体方法包括：
2.1)首先将所述目的载体转化入农杆菌感受态EHA105细胞中，获得含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，然后培养含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，并制备农杆菌转化液；
2.2)首先在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述农杆菌转化液的三角瓶中，再然后将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.01～0.03MPa，保持10～20min，然后缓慢解除低气压状态，以三角瓶内的农杆菌转化液液面不出现晃动为宜，直至真空抽气装置内恢复到正常大气压；
2.3)在无菌条件下，将经过转化处理后的节间茎段置于生芽培养基上培养至生长出再生芽；
2.4)剪取再生芽部分叶片，利用GUS染色方法鉴定得到所述阳性转化子。
6.如权利要求5所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，步骤2.4)中，还可采用PCR扩增方法进行阳性转化子的鉴定，PCR扩增方法采用的引物为如SEQ ID NO：3和4所示的第二对引物对、如SEQ ID NO：5和6所示的第三对引物对或如SEQ ID NO：7和8所示的第四对引物对。
7.如权利要求5所述的柑橘显性功能突变体制备方法，其特征在于，所述步骤三中，将所述阳性转化子培养成完整植株的具体方法包括如下步骤：
在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽，将再生芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处，该纵切处的深度约0.2cm；然后将制备的试管嫁接苗于光周期条件12h光照/12h黑暗、生长温度在26-28℃下培养15天以上，形成所述完整植株。
8.如权利要求1所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，步骤2.4)中，利用GUS染色方法鉴定得到阳性转化子的具体方法包括如下步骤：
将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含体积百分比浓度2％的甲醛和0.5％戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液于室温下固定叶片45min，再分别用体积百分比浓度50％、70％和95％系列浓度乙醇依次漂洗5min，最后浸泡在体积百分比浓度75％乙醇中。
9.如权利要求1所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，步骤2.4)中，利用GUS染色液进行染色时，首先将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中，保持温度25-30℃，然后于20min内将压力调整至为0.5～0.8MPa并保持5-10min，再然后于30min内将环境压力调整为1.1～1.3MPa并保持3～5min，之后进入固定步骤。
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