WO2015156340A1 - 植物による有用タンパク質の製造方法 - Google Patents

植物による有用タンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2015156340A1
WO2015156340A1 PCT/JP2015/061055 JP2015061055W WO2015156340A1 WO 2015156340 A1 WO2015156340 A1 WO 2015156340A1 JP 2015061055 W JP2015061055 W JP 2015061055W WO 2015156340 A1 WO2015156340 A1 WO 2015156340A1
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WO
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plant
protein
producing
root
agrobacterium
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PCT/JP2015/061055
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誠 村瀬
信博 池澤
大輔 北原
田中　裕之
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三菱化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a protein useful for medical use or the like by transient expression using a plant.
  • Patent Document 1 describes a method for producing influenza virus-like particles (VLP) such as H1 protein by cultivating Bensamiana tobacco (Nicotiana benthamiana) infected with transformed Agrobacterium in a greenhouse.
  • VLP virus-like particles
  • Patent Document 2 describes a plant obtained by preparing a chimeric gene containing a DNA sequence encoding an insecticidal protein under the control of a specific wound-inducible promoter and stably integrating it into the genome of a corn plant. Has been. The insecticidal protein is expressed locally in wound tissue that is directly affected by insect feeding and confers resistance to insect feeding on the plant.
  • Patent Document 3 describes a root cutting mechanism that cuts the roots of the cultivated plant in an apparatus for artificially cultivating a plant, particularly a hydroponic cultivation apparatus.
  • Patent Document 1 Although influenza virus hemagglutinin is transiently expressed in plants by infiltration of Agrobacterium and influenza virus-like particles (VLP) are detected, plants are cultivated in a solid medium, The handling of is not considered. Therefore, it is estimated that the expression efficiency is very low.
  • Patent Document 2 local high-dose toxin expression is performed in plants by environmental stimulation of insect feeding.
  • this method expresses an insecticidal protein by integrating a chimeric gene using a specific promoter sequence into the genome of a plant, and its expression level is extremely low in an unwounded tissue of a plant.
  • the present invention examines the handling of plant roots in the plant cultivation process and the process of infecting plants with Agrobacterium when producing the target protein using plants, and improves the production efficiency of the target protein. For the purpose.
  • the present inventors have improved the plant cultivation method of the host plant and the plant root treatment method in the infectious process by Agrobacterium.
  • the present inventors have found a method for significantly improving the transient expression efficiency of a protein using, and completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing a protein by a plant comprising the step of expressing the plant in the plant,
  • a method for producing a protein by a plant which imparts a damaging stimulus to the root of the plant.
  • the damaging stimulus is at least one selected from the group consisting of mechanical stimuli such as wounds, physical stimuli such as temperature and pressure changes, treatment with chemicals, electrical stimuli, and irradiation.
  • [4-1] The method for producing a protein according to any one of [1] to [3], wherein the damaging stimulus is applied before the infection step.
  • [4-2] The method for producing a protein according to any one of [1] to [3], wherein the damaging stimulus is applied during or after the infection step.
  • [5] The method for producing a protein according to any one of [1] to [4], comprising a step of purifying and / or recovering the target protein from the plant after the expression step.
  • [6] The method for producing a protein according to any one of [1] to [5], wherein the target protein is a medical protein.
  • [7] The method for producing a protein according to any one of [1] to [6], wherein the plant is benthamiana tobacco.
  • a plant protein comprising: a step of infecting a plant with an Agrobacterium having a polynucleotide encoding a target protein; and a step of further cultivating the plant after infection to express the target protein in the plant.
  • a manufacturing method comprising: A method for producing a protein by a plant, which imparts a damaging stimulus to the root of the plant. [9] The method for producing a protein according to [8], wherein the damaging stimulus is applied to roots of the plant prior to the infection. [10] The method for producing a protein according to [8], wherein the damaging stimulus is applied to roots of the plant simultaneously with or after the infection.
  • the expression efficiency of the target protein that is, the expression amount of the target protein per leaf weight is increased by devising the handling of the root. Therefore, a large amount of the target protein can be efficiently expressed with a relatively small leaf weight, and the load in the step of recovering and purifying the protein is reduced, which greatly contributes to the reduction of production cost.
  • the method for producing a target protein using the plant according to the present invention includes a step of cultivating the plant by hydroponics (cultivation step), and then a polynucleotide encoding the target protein in the plant.
  • the step of infecting the plant with Agrobacterium having a polynucleotide encoding the target protein (infection step), and further cultivating the plant after the infection It includes a step of expressing in a plant (expression step).
  • damaging stimuli may be applied to the roots of the plant prior to, simultaneously with or subsequent to the infection.
  • the plant that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a plant that can be infected with Agrobacterium and that expresses the target protein.
  • Examples include dicotyledonous plants and monocotyledonous plants.
  • dicotyledonous plants include solanaceous plants such as tobacco, potato, tomato, etc., cruciferous plants such as arugula, komatsuna, mizuna, mustard, white lizard, etc., asteraceae plants such as chicory, endive, artichoke
  • a leguminous plant alfalfa, mungbean, soybean and the like are exemplified
  • spinach, sugar beet and the like are used as a red crustaceae plant, perilla, basil and the like are exemplified as a family Lamiaceae, and bees and the like are exemplified as a celery family plant.
  • Examples of monocotyledonous plants include gramine
  • Cigarettes include tobacco (Nicotiana tabacum), N. ⁇ benthamiana, Hana tobacco (N. alata), N. glauca, Nagabana tobacco (N. longiflora), Nicotiana Persia (N. persica), Nicotiana Rustica (N. rustica), Nicotiana Silvestsis (N. sylvestris) and the like. Preferred is Bensamiana tobacco.
  • the target protein is not particularly limited as long as it is a protein used for medical or industrial purposes.
  • a protein for medical use is preferred.
  • Medical proteins are classified into therapeutic proteins and diagnostic proteins. Examples of therapeutic proteins include peptides, vaccines, antibodies, enzymes, hormones (preferably peptide hormones), and more specifically, as vaccines.
  • Viral proteins used granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin and other hematopoietic factors, interferon, interleukin (IL) -1
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • EPO erythropoietin
  • thrombopoietin and other hematopoietic factors interferon, interleukin (IL) -1
  • cytokines such as IL-6, monoclonal antibodies or fragments thereof, tissue plasminogen activator (TPA), urokinase, serum albumin, blood coagulation factor VIII, leptin, insulin, stem cell growth factor (SCF), etc.
  • diagnostic proteins include antibodies, enzymes, hormones and the like.
  • VLP virus-like particles
  • a VLP component protein may be a single protein or may include one or more proteins.
  • the virus include influenza virus, norovirus, human immunodeficiency virus (HIV), human hepatitis C virus (HCV), human hepatitis B virus (HBV), etc.
  • Influenza hemagglutinin is a constituent protein of VLP of influenza virus.
  • Examples of (HA) protein and norovirus VLP-constituting protein include Norwalk virus capsid protein (NVCP).
  • Industrial proteins are proteins used in food, feed, cosmetics, fibers, detergents, chemicals, etc., and examples include peptides, enzymes, and functional proteins. Specific examples include protease, lipase, cellulase, amylase, peptidase, luciferase, lactamase, collagen, gelatin, lactoferrin, jellyfish green fluorescent protein (GFP) and the like.
  • the present invention is characterized by having a step of cultivating the plant by a hydroponics method.
  • Hydroponics refers to hydroponics, and there are a flow method in which the nutrient solution (liquid fertilizer) flows through the root area and a stationary method in which the movement of the nutrient solution depends on the capillary phenomenon.
  • NFT Nutrient Film Technique
  • DFT Deep Flow Technique
  • DFT Drip-type hydroponics
  • Hydroponics is preferable because it facilitates multi-stage cultivation shelves, nutrient solution recycling, fertilizer components and pH management, and among these, the root-bare is exposed in the nutrient solution.
  • the method is preferred.
  • the bare-root method refers to a method of cultivating the whole or a part of the root as it is immersed in a nutrient solution.
  • the root may be supported by a support such as urethane. This is because roots can freely grow in the water and increase the contact area with the nutrient solution, so that a sufficient amount of moisture and nutrients can be absorbed.
  • the cultivation days in the cultivation process are usually 5 days or more, preferably 7 days or more, more preferably 10 days or more, and usually 35 days or less, preferably 28 days or less, more preferably 21 days or less. .
  • transplantation may be performed as necessary.
  • the transplanting period is preferably 6 to 15 days after cultivation.
  • the seedling raising process refers to a process until a plant seedling is germinated and grown in an artificial environment for a certain period of time and then transplanted to the cultivation process.
  • Conditions such as temperature and humidity in the seedling raising process can be the same as the conditions in the cultivation process.
  • light irradiation conditions may be normal conditions using sunlight, fluorescent lamps, LEDs, cold cathode fluorescent lamps (CCFL, HEFL), inorganic / organic EL, etc. It is preferable to grow plants under a cycle in which the irradiation time is 12 hours or more and 24 hours or less per day.
  • the “light irradiation time of 12 hours or more and 24 hours or less per day” is not necessarily continuous irradiation. For example, when the irradiation time is 20 hours per day, continuous irradiation of 10 hours or more is performed. You may do it twice a day.
  • any plant production system may be used as long as the plant can be cultivated under the above conditions, and is not particularly limited.
  • a semi-closed type or closed type plant factory is preferable, and a closed type plant factory is more preferable.
  • the semi-closed type include horticultural facilities and solar type plant factories.
  • the closed plant factory means a plant factory not exposed to sunlight, and is a system for cultivating plants in a space where temperature, humidity, carbon dioxide concentration, wavelength of artificial light, irradiation time, and the like are controlled.
  • the environment can be controlled, so that the quality of the plant and the substance produced by the plant can be stabilized, and the infection of pathogenic bacteria contained in the outside air can be prevented.
  • the closed plant factory includes an environment-controlled room, a plant-cultivating container shelf installed in the environment-controlled room for placing a plant-cultivating container, and a plant disposed in the vicinity of the plant-cultivating container shelf. Illustrated is a system that includes illumination that provides close proximity illumination. Plant cultivation container shelves can be arranged in multiple stages.
  • the plant cultivated in the cultivation process preferably has a plant height (cm) of 2 cm or more, more preferably 3 cm or more, and preferably 25 cm or less, more preferably 15 cm or less. . If the plant height is within the above-mentioned range, it is advantageous for improving STY (space time yield) of the closed plant factory by making the cultivation shelf multi-stage. Furthermore, precise control of the cultivation environment conditions such as temperature, humidity, and airflow is easily possible, and the plant growth rate in the cultivation process and the expression of the target protein in the expression process are improved, which is preferable.
  • the "plant height” here means the length from the lower end of the above-ground part to the growth point, and is obtained by measuring the length of the plant height after excising the underground part of the plant immediately after harvesting. it can.
  • the plant cultivated in the cultivation process preferably has an above-ground fresh weight (g) of 3 g or more, more preferably 10 g or more, and preferably 100 g or less, and 70 g or less. Is more preferable.
  • a plant having an above-ground fresh weight within the above-mentioned range has a high growth rate, and it is preferable to use a plant in such a high growth rate because the production efficiency of the target protein is improved.
  • the plant cultivated in the cultivation process preferably has a leaf weight (g) of 2.5 g or more, more preferably 7.5 g or more, and preferably 80 g or less, and 60 g or less. More preferably.
  • a plant having a leaf weight in the above-mentioned range has a high growth rate, and it is preferable to use a plant in such a high growth rate because the production efficiency of the target protein is improved.
  • the cultivation conditions in the cultivation process are not particularly limited as long as the conditions are suitable for the growth of the plant and the production of the target protein.
  • the cultivation can be performed under the following conditions.
  • the temperature in the plant factory is usually 10 ° C or higher, preferably 15 ° C or higher, and is usually 40 ° C or lower, preferably 37 ° C or lower.
  • the humidity in the plant factory is usually 40% or more, preferably 50% or more, and usually 100% or less, preferably 95% or less.
  • the carbon dioxide concentration in the plant factory is usually 300 ppm or more, preferably 500 ppm or more, and usually 5000 ppm or less, preferably 3000 ppm or less.
  • a fluorescent lamp, LED, a cold cathode fluorescent lamp (CCFL, HEFL), inorganic, organic EL, etc. can be illustrated.
  • a fluorescent lamp, LED, and a cold cathode fluorescent lamp are mentioned, More preferably, LED is mentioned.
  • the LED is preferable because it has high light conversion efficiency and power saving as compared with an incandescent bulb and an HID lamp. It is also preferable in that the amount of heat rays that cause leaf burning damage to plants is small.
  • the light intensity in the cultivation process can be evaluated by measuring photosynthetic effective photon flux density (PPFD) and the like.
  • PPFD is represented by the unit time of light in the visible region 400 to 700 nm effective for photosynthesis and the number of photons per unit area, and the unit is ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 .
  • PPFD is usually 30 ⁇ mol ⁇ m -2 ⁇ s -1 or from 600 ⁇ mol ⁇ m -2 ⁇ s -1 or less, preferably, 500 ⁇ mol ⁇ m -2 ⁇ s -1 or less from 50 ⁇ mol ⁇ m -2 ⁇ s -1 or More preferably, it is cultivated at 70 ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 or more and 400 ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 or less.
  • PPFD can be measured using an optical quantum meter or the like.
  • the conditions of light intensity it is not necessary for the conditions of light intensity to be the above-mentioned conditions over the entire period of the cultivation process.
  • the cultivation process is divided into the first half and the second half, and the conditions of the intensity of the second half are the above conditions. You may grow a plant on the said conditions only for the fixed period of them.
  • the period of 1% or more of the whole cultivation period is preferable, and the period of 20% or more is more preferable.
  • the light intensity condition in the period when the light intensity condition is not the above-mentioned condition during the entire cultivation process and this period may be cultivated under sunlight in an open plant factory. .
  • the plant is preferably cultivated under a cycle in which the time of light irradiation is 10 hours or more and less than 24 hours per day, or cultivated under continuous light. Among these, it is more preferable to grow under continuous light. The above range is preferable because the plant growth rate is accelerated and the cultivation period until harvesting is shortened.
  • the irradiation time of light is 10 hours or more and less than 24 hours per day” is not necessarily continuous irradiation. For example, when the irradiation time is 20 hours per day, continuous irradiation of 10 hours or more is performed. You may do it twice a day.
  • the light irradiated here may be pulsed light. Pulsed light is obtained by blinking an LED or the like at short intervals of 1 microsecond to 1 second. By using such pulsed light, light is emitted at a time when a plant does not need light physiologically. Since the light can be applied only for the time required for light, the photosynthesis speed can be increased and the power cost can be reduced.
  • the irradiation time includes the time when the LED is not turned on, and is the total of the irradiation time of the pulsed light per day.
  • the plant obtained in the cultivation process is infected with Agrobacterium having a polynucleotide encoding the target protein.
  • Agrobacterium infection is an excellent method for introducing recombinant DNA into plant cells and is preferably used in the present invention.
  • the polynucleotide encoding the target protein is a polynucleotide encoding the target medical or industrial protein described above.
  • a natural sequence that has been appropriately mutated or modified within a range in which the target protein of interest can be obtained may be used.
  • the polynucleotide is operably linked downstream of an appropriate promoter, and the resulting polynucleotide construct is introduced into a plant cell by the Agrobacterium method. That's fine.
  • the promoter include, but are not limited to, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin promoter, the elongation factor 1 ⁇ promoter, and the corn ubiquitin promoter.
  • the promoter is called a constitutive promoter or constitutive regulatory element, and expresses the target protein continuously throughout various parts of the plant and throughout the entire growth of the plant.
  • tissue specific promoters or inducible promoters may be used, including mesophyll specific promoters, inducible promoters due to light, heat shock, low temperature, water stress, etc. .
  • a binary vector or an intermediate vector containing T-DNA (transfer DNA) derived from Agrobacterium Ti plasmid or Ri plasmid can be used (Nucl. Acids Res. 12 (22): 8711-8721 (1984), Plasmid, 7, 15-29 (1982)).
  • Specific examples of binary vectors include pBI vectors (for example, pRiceFOX), pPZP vectors (Plant Molecular Biology 25 (6): 989-94. (1994)), pCAMBIA vectors (vector backbone: pPZP vector), pSMA system A vector (Plant ⁇ ⁇ Cell Reports 19: 448-453. (2000)) can be mentioned, but is not limited thereto.
  • the pressure is adjusted while at least a part of the plant is immersed in an infection solution containing the Agrobacterium.
  • an infection solution containing the Agrobacterium a cell obtained by culturing Agrobacterium transformed with the above vector and suspended in a buffer suitable for infiltration into plant tissues should be used.
  • the infectious solution having a turbidity of OD600 of 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 2, and still more preferably 0.2 to 1 can be used.
  • the state in which the plant is immersed does not require the entire plant to be immersed in the infectious solution.
  • a part of the stem, root, etc. may be exposed from the infectious solution.
  • Adjusting the pressure in a state where a plant is immersed in an infectious solution means that a part of the plant is immersed in an infectious solution containing the Agrobacterium, and agglomeration is performed by pressure cycle treatment including at least one of pressure treatment and decompression treatment. Infecting plant cells with bacteria.
  • the pressure is preferably in the range of 1.7 atm (172 kPa) to 10 atm (1013 kPa), more preferably in the range of 4 atm (405 kPa) to 8 atm.
  • a range of 0.005 atm (0.5 kPa) to 0.3 atm (30 kPa) is preferable, and 0.01 atm (1.0 kPa) to 0.1 atm.
  • the range of atmospheric pressure (10.1 kPa) is more preferable, and the range of 0.02 atmosphere (2.0 kPa) to 0.06 atmosphere (6.1 kPa) is more preferable.
  • the pressure of decompression is too high, infiltration of the infectious solution becomes insufficient, which is not preferable.
  • the time for performing the pressure treatment or the pressure reduction treatment can be appropriately set according to the kind of plant and the tissue to be treated, but is 10 seconds to 10 minutes, preferably 20 seconds to 5 minutes. More preferably, it is about 30 seconds to 3 minutes.
  • the pressure reduction treatment is preferable to the pressure treatment because it is superior in terms of convenience such as a relatively simple apparatus.
  • One form of decompression treatment is vacuum infiltration, and it is preferable to infect plants with Agrobacterium by this vacuum infiltration method. Among them, Plant Science, 122, 1: 101-108 (1997) It is more preferred to use the vacuum-based transient expression method described by.
  • Vacuum infiltration is a method that allows Agrobacterium to penetrate between plant cells or into the interstitial space. Physically, vacuum is the air between cells in plant tissue. Generates negative atmospheric pressure that reduces space. The longer the duration and the lower the vacuum pressure, the less air space in the plant tissue.
  • the increased pressure allows the infectious fluid (including Agrobacterium with the transformation vector) to move into the plant tissue.
  • a vacuum can be applied to the plant parts in the presence of Agrobacterium for a period of time. After reducing the pressure to obtain a vacuum state, the plant can be infected by returning to normal pressure (returning pressure). Due to the infection, Agrobacterium containing the polynucleotide construct becomes tissue, eg leaves, parts of the plant's ground structure (including stems, leaves and flowers), other parts of the plant (stems, roots, flowers), Or enter the space between the cells of the whole plant. After passage through the epidermis, Agrobacterium infects and transfers the polynucleotide into the cell. The polynucleotide is transcribed as an episome and the mRNA is translated, resulting in production of the protein of interest in the infected cell, but passage of the polynucleotide within the nucleus is transient.
  • the plant after the infection process is cultivated to express the target protein.
  • the cultivation conditions in the expression step are not particularly limited as long as the target protein can be efficiently expressed. Conditions such as temperature and humidity in the expression step can be the same as the conditions in the cultivation step. Moreover, the normal conditions using sunlight, a fluorescent lamp, LED, a cold cathode fluorescent lamp (CCFL, HEFL), inorganic / organic EL, etc. are employable as light irradiation conditions.
  • the cultivation days in the expression step are preferably 3 days or more, more preferably 4 days or more, and preferably 14 days or less, more preferably 10 days or less.
  • the method of the present invention is characterized in that a damaging stimulus is imparted to the root of a plant at any stage of the cultivation process, the infection process and the expression process.
  • the timing for applying the damaging stimulus is not particularly limited, but after the treatment for applying the stimulus, sufficient time is allowed for the polynucleotide encoding the target protein to be transcribed, translated and expressed in the plant cell. It is preferable to apply a damaging stimulus at such a time. Therefore, it is preferable that the plant grows properly in the cultivation process, particularly before the contact with the infectious solution containing Agrobacterium or immediately after the contact.
  • the stimulus when performing an operation of immersing the plant in an infectious solution containing Agrobacterium, the stimulus can be given to the roots.
  • such treatment may be performed during the infection process or in the initial stage of the expression process. Specifically, for example, the treatment is performed from 24 hours before the infection until immediately before the infection, the treatment is performed within 72 hours after the infection, and the like, 12 hours before the infection. It is preferable to carry out the treatment before the infection, and it is more preferred to carry out the treatment immediately before the infection, for example, 1 hour before, preferably 30 minutes before.
  • a plant cultivated by the bare-root method can be preferably used, but the plant cultivated by the bare-root method has a state in which the whole or a part of the root is exposed. Therefore, it is easy and preferable to give a damaging stimulus to the root as appropriate in each step. For example, even in the middle of the cultivation process and the expression process, it is possible to give a damaging stimulus and to continue cultivation without performing an operation of taking out roots from soil, solid medium or the like.
  • the infection process since various operations are usually performed on the leaf portion with the roots exposed, operations for imparting damaging stimuli to the root portion can be performed simultaneously with these operations, and the entire manufacturing method can be performed. The time required for the process can be shortened.
  • the “damaging stimulus” is at least selected from the group consisting of mechanical stimuli such as wounds, physical stimuli such as temperature and pressure changes, treatment with chemicals, electrical stimuli, and irradiation. It includes one environmental stimulus and typically includes, but is not limited to, cutting at least a portion of the root. For example, damaging a part of the tissue in such a form that the function of the roots of the plant is partially suppressed, for example, giving an open wound using a sharp protrusion, blunting, etc. It involves using it to create a closed wound with no cuts, such as a bruise, and does not require the roots to be completely separated from the plant. An example of a method for applying a damaging stimulus will be described with reference to the drawings. FIG.
  • FIG. 3A is a schematic diagram illustrating a plant before applying a damaging stimulus.
  • the whole root is exposed.
  • FIG. 3B a part of the tip of the root is cut, and the cut root is cut off from the plant.
  • FIG. 3C a location where an open or closed wound is provided near the root of the plant root is surrounded by a broken line, and the position of the wound applied in a linear shape is indicated by a dotted line.
  • the method of cutting the root and the method of applying the wound are not particularly limited, and the root may be cut with a sharp tool such as scissors and a knife, the wound may be applied, or bending fracture or You may cut
  • the roots can be cut and wounds can be applied.
  • the cutting site and wound application site may also be the tip of the root or the joint with the stem, but preferably at least 0.01 relative to the fresh weight of the whole root from the root tip. It suffices to cut about mass% or to give a wound.
  • the upper limit of the cutting amount or wound amount is considered to be no problem if it is about 50% by mass with respect to the fresh weight of the whole root.
  • the method of selecting a root to be cut or wound may cut or wound approximately the same amount for all the roots, or cut or cut a predetermined amount for any several of a plurality of roots. The wound may be adjusted to fall within the above range with respect to the fresh weight of the entire root.
  • the cut or wounded root part is 0.1% to 40% by weight, preferably 1% to 30% by weight, based on the fresh weight of the whole plant root, Preferably, it is about 2% by mass to 20% by mass.
  • damage to the root reduces nutrient uptake or the physiological activity of the plant. Priority is given to repairing the damage and the supply of nutrients to the leaf is reduced, or a specific control mechanism is activated or inactivated due to the propagation of some signal, etc. It is presumed that the resistance mechanism against overexpression of E. coli is weakened or that Agrobacterium is easily infected, and the method of the present invention is considered to improve the expression efficiency regardless of the type of target protein. It is done.
  • the target protein accumulated in the plant is preferably recovered from the plant. It is preferable to obtain a fraction containing the target protein from the plant and purify the target protein by an appropriate method.
  • the polynucleotide encoding the target protein may include a tag sequence for purification.
  • Sowing Liquid fertilizer for sowing (Otsuka House S1 (Otsuka Agritechno Co., Ltd.) 0.78 g / L, Otsuka House 2 (Otsuka Agritechno Co., Ltd.) 0.25 g / L, pH 5.0 )
  • a urethane mat for hydroponic cultivation (Ematsu Kasei W587.5mm x D282mm x H28mm: 12 x 2 trout hole diameter ⁇ 9mm) and placed in a seedling tray (W600mm x D300mm x H300mm) and benthamiana tobacco (Nicotiana) benthamiana) seeds were sown.
  • Liquid fertilizers are dechlorinated from fertilizer A liquid (Otsuka House S1 150g / L, Otsuka House 5 (Otsuka Agritechno Co., Ltd.) 2.5g / L) and Fertilizer B liquid (Otsuka House 2 100g / L). Dissolved in water and mixed in equal amounts. For pH adjustment, a pH adjuster down (Otsuka Agritechno Co., Ltd.) and a 4% KOH aqueous solution were used. The electrical conductivity (EC) and pH of the liquid fertilizer were adjusted to EC: 2.3 mS / cm and pH 6.0 using “Easy Fertilizer Manager 3” (Sem Corporation).
  • Expression plasmid The following two types of expression plasmids were used for the examination of GFP (jellyfish green fluorescent protein) expression.
  • a kanamycin resistance expression cassette (consisting of a nopaline synthase gene promoter, a kanamycin resistance gene, and a nopaline synthase gene terminator) of a plant binary vector pMM444 (Japanese Patent Laid-Open No. 9-313059)
  • the hygromycin resistance expression cassette (cauliflower mosaic virus 35S promoter, castor catalase gene first intron, hygromycin resistance gene, and nopaline synthase gene terminator) was substituted.
  • the plasmid thus obtained was further added to a GUS expression cassette derived from pIG221 (Plant Cell Physiol., 31, 805 (1990)) (cauliflower mosaic virus 35S promoter, castor catalase gene first intron, ⁇ -
  • An EGFP expression cassette was prepared by introducing an EGFP expression cassette in which the ⁇ -glucuronidase gene of the glucuronidase gene and the nopaline synthase gene terminator was replaced with the EGFP gene (pEGFP-N3: Clontech) (hereinafter referred to as EGFP gene expression plasmid).
  • This plasmid is called “pGFP / MM444. The structure is shown in FIG. 1).
  • p19 / MM444 a P19 gene expression plasmid
  • the structure is shown in FIG.
  • the P19 gene has a function of enhancing the expression of the EGFP gene, and this p19 / MM444 was subjected to co-expression with pGFP / MM444.
  • FIG. 1 and 2 the meaning of the symbol which shows a gene or its control region is as follows.
  • 35S P cauliflower mosaic virus 35S promoter int: castor bean catalase gene first intron Nos t: nopaline synthase terminator Spec R: spectinomycin resistance gene Tc R: tetracycline resistance gene Hm R: hygromycin resistance gene Ori pBR322: pBR322 ori Ori pRK2 : pRK2 ori B L : T-DNA left border B R: T-DNA right border
  • Agrobacterium tumefaciens AGL1 Rhizobium radiobacter ATCC BAA-101; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA20108, USA) (obtained transformed Agrobacterium, GFP-Agrobacterium, Called P19-Agrobacterium).
  • the transformed Agrobacterium (GFP-Agrobacterium, P19-Agrobacterium) is cultured in an LB medium (SIGMA-ALDRICH) containing carbenicillin 25 ⁇ g / ml and spectinomycin 50 ⁇ g / ml, and glycerol is added.
  • the glycerol concentration was finally adjusted to 30% by mass and stored at ⁇ 80 ° C. to obtain each transformed Agrobacterium glycerol stock.
  • the beaker was placed in a vacuum desiccator (FV-3P) (manufactured by Tokyo Glass Instrument Co., Ltd.), allowed to stand at 19 to 40 Torr for 1 minute, and decompressed. After that, the valve was opened at once to restore the pressure.
  • V-3P vacuum desiccator
  • GFP expression level (1) Preparation of crude extract The GFP and P19-expressing Agrobacterium-infected leaves cryopreserved in were transferred to a mortar and ground in liquid nitrogen. Then, 6 times the sample fresh weight of GFP assay extraction buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton-X100 (pH 7.25)) was added, and the protein was suspended vigorously. Crude extraction was performed. 1 ml of the crude extract was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube, centrifuged at 4 ° C., 20,400 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was collected and used for GFP quantification described later.
  • GFP assay extraction buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton-X100 (pH 7.25)
  • Table 1 shows the expression level of GFP per fresh weight (mg / kg-FW), that is, the expression efficiency calculated and the plant whose roots were not cut as 100%. From Table 1, the amount of GFP expression per fresh weight of the leaves when the roots were cut was increased compared to the plants that did not cut the roots. This shows that the expression efficiency was improved by cutting the roots.
  • Example 3 The root of the benthamiana tobacco root (see Fig. 3C) obtained after 1 sowing obtained in 1 (4) above was repeatedly pierced 10 times with a dessert fork 18-8 (manufactured by Crimp Co., Ltd.). Gave. Immediately thereafter (within 30 minutes after wounding), the plant was inverted and submerged so that the above-ground part was immersed in the Agrobacterium solution (prepared in 2. (3) above) in a beaker. Thereafter, the beaker was placed in a vacuum desiccator (FV-3P) (manufactured by Tokyo Glass Instrument Co., Ltd.), allowed to stand at 19 to 40 Torr for 1 minute, and decompressed. After that, the valve was opened at once to restore the pressure. The cultivation after infection and the measurement of the expression level of GFP were carried out in the same manner as 4 and 5 above, respectively. The results are shown in Table 2.
  • FV-3P vacuum desiccator

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Abstract

　目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程、及び前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程を含む、植物によるタンパク質の製造方法であって、前記植物の根に損傷性刺激を付与することにより目的タンパク質の製造効率を向上させる。

Description

植物による有用タンパク質の製造方法
　本発明は、医療用途等に有用なタンパク質を、植物を用いた一過性発現により効率よく製造する方法に関する。
　近年、植物を用いたタンパク質の製造方法は、複雑なタンパク質の発現が可能で、低コストでの大量生産ができ、分離精製が容易であり、かつ安全性が保障されている等の理由により注目されている。植物を用いたタンパク質の製造方法や植物栽培装置としては、以下のような多くの報告がある。
　例えば、特許文献１には形質転換アグロバクテリウムを感染させたベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）を温室で栽培することによってＨ１タンパク質などのインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産する方法が記載されている。また、特許文献２には、特定の創傷誘導性プロモーターの制御下に殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子を作製し、トウモロコシ植物のゲノム内に安定に組み込むことにより得られる植物が記載されている。当該殺虫性タンパク質は、昆虫の摂食によって直接影響を受ける創傷組織において局所的に発現し、当該植物に昆虫による摂食に対する耐性を付与する。
　一方、特許文献３には、人工的に植物を栽培する装置、特に水耕栽培装置において、当該栽培されている植物の根を切る根切機構が記載されている。
日本国特表２０１０－５３３００１号公報 日本国特表２００５－５２４４００号公報 日本国特開２０１２－５０３８３号公報
　上記のように、植物を用いてタンパク質を生産する技術は知られているが、その生産効率を向上させるための条件検討は未だ十分になされてはいない。
　すなわち、特許文献１では、アグロバクテリウム浸透による植物におけるインフルエンザウイルスヘマグルチニンを一過性発現させて、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）が検出されているものの、固形培地で植物を栽培しており、根の取扱いについては検討がなされていない。そのため、その発現効率は極めて低いと推測される。
　特許文献２では、昆虫の摂食という環境刺激によって植物内での局所的な高用量毒素発現を行なっている。しかしながら、当該方法は、特定のプロモーター配列を用いたキメラ遺伝子を植物のゲノムに組み込むことによって殺虫性タンパク質を発現させるものであり、植物の無創傷の組織ではその発現量は極めて低いレベルである。
　特許文献３では、植物栽培装置で栽培されている植物の生育に及ぼす影響を抑制しつつ根を切断する方法及び装置が開示されているが、ニンニクのような根を収穫する植物について、植物の根の部分を繰り返し収穫することを目的とし、植物に導入した外来遺伝子の発現効率を改善することを目的とするものではない。
　本発明は、植物を用いて目的タンパク質を製造する際に、植物の栽培工程や、植物をアグロバクテリウムに感染させる工程において、植物の根の取り扱いについて検討し、目的タンパク質の製造効率を向上させることを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、宿主となる植物の栽培方法及びアグロバクテリウムによる感染工程における植物の根の処理方法を改善することにより、従来法による植物を用いたタンパク質の一過性発現効率を著しく向上させる方法を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
[１]アグロバクテリウムに感染し得る植物を水耕栽培法で栽培する工程、
　前記水耕栽培にて生育した植物を、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを含む感染液に接触させることにより感染させる工程、及び
　前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程を含む、植物によるタンパク質の製造方法であって、
　前記植物の根に損傷性刺激を付与することを特徴とする、植物によるタンパク質の製造方法。
[２]前記損傷性刺激が、前記植物の根の少なくとも一部を切断することを含む[１]に記載のタンパク質の製造方法。
[２－１]前記損傷性刺激が、創傷等の機械的刺激、温度や圧力変化等の物理的刺激、化学薬品等による処理、電気的刺激、及び放射線照射からなる群より選択される少なくとも１つの環境刺激である[１]に記載のタンパク質の製造方法。
[３]前記切断された根の部分が、前記植物の根全体の新鮮重量に対し、０．０１質量％～５０質量％である[２]に記載のタンパク質の製造方法。
[４]前記根の切断が、前記感染工程の前に行われる[２]又は［３］に記載のタンパク質の製造方法。
[４－１]前記損傷性刺激が、前記感染工程の前に付与される[１]から[３]の何れかに記載のタンパク質の製造方法。
[４－２]前記損傷性刺激が、前記感染工程中又はその後に付与される[１]から[３]の何れかに記載のタンパク質の製造方法。
[５]前記発現工程の後に、前記植物から目的タンパク質を精製し、及び／又は回収する工程を含む[１]から[４]の何れかに記載のタンパク質の製造方法。
[６]前記目的タンパク質が、医療用タンパク質である[１]から[５]の何れかに記載のタンパク質の製造方法。
[７]前記植物が、ベンサミアナタバコである[１]から[６]の何れかに記載のタンパク質の製造方法。
[８]目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程、及び前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程を含む、植物によるタンパク質の製造方法であって、
　前記植物の根に損傷性刺激を付与することを特徴とする、植物によるタンパク質の製造方法。
[９]前記損傷性刺激が、前記感染に先立って前記植物の根に付与される[８]に記載のタンパク質の製造方法。
[１０]前記損傷性刺激が、前記感染と同時に又はその後に前記植物の根に付与される[８]に記載のタンパク質の製造方法。
　本発明の植物によるタンパク質の製造方法によれば、根の取り扱いを工夫することで、目的タンパク質の発現効率、すなわち、葉の重量あたりの目的タンパク質の発現量が増加する。そのため、比較的少ない葉重で多量の目的タンパク質を効率よく発現させることができ、当該タンパク質を回収、精製する工程での負荷を軽減して製造コストの削減に大きく寄与するものである。
プラスミドｐＧＦＰ／ＭＭ４４４の構造を示す図である。 プラスミドｐ１９／ＭＭ４４４の構造を示す図である。 根に損傷性刺激を付与していない植物を示す模式図である。 根の先端を切断した植物を示す模式図である。 切断以外の損傷性刺激を付与する場所を例示した植物を示す模式図である。
　本発明に係る植物を用いて目的タンパク質を製造する方法は、第一の態様において、植物を水耕栽培法で栽培する工程（栽培工程）、次いで、該植物に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる工程（感染工程）、及び、感染工程後の植物を栽培して前記目的タンパク質を発現させる工程（発現工程）を含む。また、本発明の第二の態様では、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程（感染工程）、及び前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程（発現工程）を含む。ここで、損傷性刺激は、前記感染に先立って、同時に又はその後に前記植物の根に付与されてよい。
　本発明で用いることのできる植物としては、アグロバクテリウムに感染し得る植物であり、目的タンパク質を発現する植物であればよく、特に限定されない。例えば、双子葉植物と単子葉植物が挙げられる。具体的には、双子葉植物ではナス科植物として、タバコ、ジャガイモ、トマト等が、アブラナ科植物として、ルッコラ、コマツナ、ミズナ、カラシナ、シロイズナズナ等が、キク科植物として、チコリ、エンダイブ、アーティチョーク等が、マメ科植物として、アルファルファ、リョクトウ、ダイズ等が、アカザ科植物としてホウレンソウ、テンサイ等が、シソ科植物としてシソ、バジル等が、セリ科植物としてミツバ等が例示される。単子葉植物としてはイネ科植物として、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等が、アオイ科植物としてはワタ等が例示される。中でも、ナス科植物が好ましく、タバコがより好ましい。
　タバコとしては、タバコ（Nicotiana tabacum）、ベンサミアナアタバコ（N. benthamiana）、ハナタバコ（N. alata）、キダチタバコ（N. glauca）、ナガバナタバコ（N. longiflora）、ニコチアナ・ペルシア（N. persica）、ニコチアナ・ルスチカ（N. rustica）、ニコチアナ・シルベストシス（N. sylvestris）などが挙げられる。好ましくはベンサミアナタバコである。
　本発明において、目的タンパク質とは、医療用や産業用に用いられるタンパク質であれば特に限定はされない。好ましくは医療用タンパク質である。
　医療用タンパク質としては、治療用タンパク質と診断タンパク質に分類され、治療用タンパク質としては、ペプチド、ワクチン、抗体、酵素、ホルモン（好ましくはペプチドホルモン）などが例示され、より具体的には、ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）－１やＩＬ－６等のサイトカイン、モノクローナル抗体またはその断片、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが例示される。また、診断タンパク質としては、抗体、酵素、ホルモン等が例示される。
　ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質として好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構成タンパク質が挙げられる。ＶＬＰの構成タンパク質は単一のタンパク質でもよいし、１つ以上のタンパク質を含んでもよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などが挙げられ、インフルエンザウイルスのＶＬＰの構成タンパク質としてはインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、ノロウイルスのＶＬＰ構成タンパク質としてはNorwalk virus capsid protein（ＮＶＣＰ）などが例示される。
　産業用タンパク質とは、食品、飼料、化粧品、繊維、洗剤、化学品などに用いられるタンパク質であり、ペプチド、酵素、機能性タンパク質が例示される。具体的には、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ルシフェラーゼ、ラクタマーゼ、コラーゲン、ゼラチン、ラクトフェリン、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などが例示される。
　以下、本発明の製造方法の各工程について説明する。
＜栽培工程＞
　１つの実施形態において、本発明は、前記植物を水耕栽培法で栽培する工程を有することを特徴とする。
　水耕栽培とは、養液栽培のことをいい、養液（液体肥料）が根域を流動する流動法と養液の動きが毛管現象に依存した静置法がある。流動法には緩傾斜の平面上に養液を薄く流下させる薄膜水耕法（ＮＦＴ：Nutrient Film Technique）と、溜めた養液中で栽培する湛液型水耕法（ＤＦＴ：Deep Flow Technique）等がある。湛液型水耕法（ＤＦＴ）は、液肥の流動により十分な酸素を根部に供給して養分吸収を促進し、さらに液肥の温度及び濃度を含む根圏環境も安定化し、栽培環境を一定に整えるという利点がある。
　水耕栽培法は、栽培棚の多段化や、養液のリサイクル、肥料成分およびｐＨの管理が容易であることから好ましく、これらの中でも、根が養液中でむき出しの状態となるbare-root法が好ましい。bare-root法とは、根の全体またはその一部がそのまま養液に浸された状態で栽培する方法をいう。尚、根元はウレタン等の支持体で支えられていてもよい。根は水の中を自由に伸び、養液との接触面積が増大することで、十分な量の水分と養分を吸収できるため、一般に土壌栽培に比べ生育が旺盛になるからである。
　また、栽培工程における栽培日数は、通常５日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは１０日以上であり、また、通常３５日以下、好ましくは２８日以下、より好ましくは２１日以下である。
　栽培工程においては、必要に応じて、移植を行なってもよい。移植の時期としては、栽培後６日～１５日の間に行なうことが好ましい。
　なお、本実施形態の製造方法においては、栽培工程の前に育苗工程を行うことが好ましい。育苗工程とは、植物の苗を一定期間人工的な環境下で発芽・育成させ、その後栽培工程に移植するまでの工程をいう。該育苗工程における温度、湿度等の条件は上記栽培工程における条件と同様の条件とすることができる。また、光照射の条件も太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を用いた通常の条件を採用することができるが、育苗工程においては、光照射の時間が一日当たり１２時間以上２４時間以下であるサイクル下で植物を育苗することが好ましい。なお、「光の照射時間が１日あたり１２時間以上２４時間以下」とは、必ずしも連続照射でなくてもよく、例えば、照射時間が１日あたり２０時間の場合、１０時間以上の連続照射を１日に２回行なってもよい。
　栽培工程では植物を、上記条件下で栽培することができれば、いずれの植物生産システムを用いてもよく、特に限定されない。栽培時の光の波長や強度の調整のしやすさから、半閉鎖型、または閉鎖型の植物工場が好ましく、閉鎖型植物工場がより好ましい。半閉鎖型としては、園芸施設、太陽光型植物工場などが例示される。
　ここで、閉鎖型植物工場は、太陽光が当たらない植物工場を意味し、温度、湿度、二酸化炭素濃度、人工光の波長および照射時間などが制御された空間で植物を栽培するシステムである。閉鎖型植物工場を用いることにより、環境の制御が可能なので、植物およびそれが生産する物質の品質が安定するという効果や、外気に含まれる病原菌の感染を防ぐことができるという効果がある。
　閉鎖型植物工場としては、環境制御された部屋と、該環境制御された部屋内に設置され植物栽培容器を載置する植物栽培容器棚と、該植物栽培容器棚の近接部に配され植物に光を近接照射する照明を含むシステムが例示される。植物栽培容器棚は複数段に配置可能である。
　栽培工程で栽培される植物は、その草丈（ｃｍ）が２ｃｍ以上であることが好ましく、３ｃｍ以上であることがより好ましく、また、２５ｃｍ以下であることが好ましく、１５ｃｍ以下であることがより好ましい。草丈が、上述の範囲内であると、栽培棚の多段化により閉鎖型植物工場のＳＴＹ（space time yield）向上に有利である。さらに、温度、湿度、気流などの栽培環境条件の精密制御が容易に可能となり、栽培工程における植物の生長速度、及び発現工程における目的タンパク質の発現が向上するという効果が得られるので好ましい。なお、ここでいう「草丈」とは、地上部の下端から生長点までの長さを意味し、収穫直後の植物の地下部を切除した後、草丈の長さを測定することにより求めることができる。
　栽培工程で栽培される植物は、その地上部新鮮重量（ｇ）が３ｇ以上であることが好ましく、１０ｇ以上であることがより好ましく、また、１００ｇ以下であることが好ましく、７０ｇ以下であることがより好ましい。地上部新鮮重量が、上述の範囲内である植物は生長速度が速く、このような生長速度の速い時期にある植物を用いると、目的タンパク質の生産効率が向上するので好ましい。
　栽培工程で栽培される植物は、その葉重量（ｇ）が２．５ｇ以上であることが好ましく、７．５ｇ以上であることがより好ましく、また、８０ｇ以下であることが好ましく、６０ｇ以下であることがより好ましい。葉重量が、上述の範囲内である植物は、生長速度が速く、このような生長速度の速い時期にある植物を用いると、目的タンパク質の生産効率が向上するので好ましい。
　栽培工程での栽培条件は、植物の生育および目的タンパク質の生産に適した条件であれば特に制限されないが、例えば、以下の条件で栽培することができる。
　植物工場内の温度は、通常１０℃以上、好ましくは１５℃以上であり、また、通常４０℃以下、好ましくは３７℃以下である。
　植物工場内の湿度は、通常４０％以上、好ましくは５０％以上であり、また、通常１００％以下、好ましくは９５％以下である。
　植物工場内の二酸化炭素濃度は、通常３００ｐｐｍ以上、好ましくは５００ｐｐｍ以上であり、また、通常５０００ｐｐｍ以下、好ましくは３０００ｐｐｍ以下である。
　栽培工程において使用される光源としては、特に制限されないが、太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を例示することができる。好ましくは、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプが挙げられ、さらに好ましくはＬＥＤが挙げられる。ＬＥＤは、白熱電球、ＨＩＤランプと比較して、光変換効率が高く省電力であるので好ましい。また、植物に葉焼け障害を引き起こす熱線の放出量が小さい点でも好ましい。
　栽培工程における光強度としては、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）等を測定することで評価できる。ＰＰＦＤとは、光合成に有効な可視領域４００～７００ｎｍの光の単位時間、単面積当たりの光量子数で表され、単位は、μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１である。ＰＰＦＤは、通常３０μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以上から６００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下、好ましくは、５０μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以上から５００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下、さらに好ましくは、７０μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以上４００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下で栽培される。ここで、ＰＰＦＤは、光量子計などを用いて測定することができる。
　なお、栽培工程の全期間にわたって、光強度の条件を上記の条件とする必要はなく、例えば、栽培工程を前半と後半に分けて後半のみ強度の条件を上記の条件とするなど、栽培工程のうちの一定期間のみ上記の条件下で植物を栽培してもよい。この場合、上記の条件下とする期間としては、全栽培期間の１％以上の期間が好ましく、２０％以上の期間がより好ましい。
　栽培工程の全期間のうち、光強度の条件を上記の条件としない期間の光強度の条件については特に制限はなく、この期間は開放型植物工場で太陽光のもとで栽培してもよい。
　また、栽培工程において、植物は、光照射の時間が一日当たり１０時間以上２４時間未満であるサイクル下で栽培されるか、または、連続光下により栽培されることが好ましい。中でも、連続光下により栽培されることがより好ましい。上述の範囲にすると、植物生長速度が加速され、収穫までの栽培期間が短縮されるので好ましい。なお、「光の照射時間が１日あたり１０時間以上２４時間未満」とは、必ずしも連続照射でなくてもよく、例えば、照射時間が１日あたり２０時間の場合、１０時間以上の連続照射を１日に２回行なってもよい。
　なお、ここで照射する光は、パルス光であってもよい。パルス光は、１マイクロ秒～１秒間の短い間隔でＬＥＤ等を点滅させることにより得られるものであり、このようなパルス光を用いることにより、生理学上植物が光を必要としない時間には光を当てず、光を必要とする時間だけ光を当てることができるので光合成速度を上昇させ、電力コストを抑えることができる。この場合の照射時間は、ＬＥＤが点灯していない時間も照射時間に含むこととし、1日当たりのパルス光照射した時間の合計とする。
＜感染工程＞
　感染工程では、前記栽培工程で得られた植物に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを感染させる。アグロバクテリウムの感染は、植物細胞内に組換えＤＮＡを導入するための優れた方法であり本発明において好ましく用いられる。
　目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、前述した目的とする医療用又は産業用タンパク質をコードするポリヌクレオチドのことである。ポリヌクレオチドとしては、天然型の配列に、目的とする目的タンパク質が得られる範囲内で、適宜、変異や改変を加えたものを用いてもよい。
　目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物内で過剰発現させるには、該ポリヌクレオチドを適当なプロモーターの下流に機能的に連結し、得られたポリヌクレオチド構築物をアグロバクテリウム法によって植物細胞に導入すればよい。上記プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターやElongation factor 1βプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記プロモーターは、構成的プロモーター又は構成的調節エレメントと呼ばれ、植物の多様な部分全体で、かつ植物の全生育を通じて継続的に目的タンパク質を発現する。「構成的」という用語は、その制御下にある遺伝子が必ずしも全ての組織や細胞で同じレベルで発現されることを要するものではないが、広範囲の植物組織や細胞で発現されることを示しており、本発明の方法に好ましく用いられる。
　本発明の１つの実施形態では、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターを用いてもよく、これらの中には、葉肉特異的プロモーター、光、熱ショック、低温、水ストレスなどによる誘導性プロモーターがある。
　アグロバクテリウム法を行う際は、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドやＲｉプラスミド由来のＴ－ＤＮＡ（transfer DNA）を含むバイナリーベクターまたは中間ベクターを用いることができる（Nucl. Acids Res. 12(22):8711-8721 (1984), Plasmid, 7, 15-29 (1982)）。バイナリーベクターの具体例として、ｐＢＩ系ベクター（例えば、ｐＲｉｃｅＦＯＸ）、ｐＰＺＰ系ベクター（Plant Molecular Biology 25(6): 989-94. (1994)）、ｐＣＡＭＢＩＡ系ベクター（ベクター骨格：ｐＰＺＰベクター）、ｐＳＭＡ系ベクター（Plant Cell Reports 19: 448-453. (2000)）を挙げることができるが、これらに限定されない。
　具体的な感染工程としては、前記アグロバクテリウムを含む感染液に、前記植物の少なくとも一部を浸漬した状態で圧力を調節することによって行う。アグロバクテリウムを含む感染液は、上記ベクターにて形質転換されたアグロバクテリウムを培養して得られた菌体を、植物組織への浸潤に適した緩衝液に懸濁したものを用いることができ、好ましくは感染液の濁度がＯＤ６００で０．０５～５、より好ましくは０．１～２、さらに好ましくは０．２～１程度のものを用いることができる。
　植物を浸漬した状態とは、植物全体が感染液に浸漬している必要はなく、例えば、茎、根等の一部が感染液から露出していてもよい。
　感染液に植物を浸漬した状態で圧力を調節するとは、当該植物の一部を前記アグロバクテリウム含む感染液に浸漬した状態で、加圧処理及び減圧処理の少なくとも一方を含む圧力サイクル処理によってアグロバクテリウムを植物細胞に感染させることをいう。大気圧（通常は、１気圧＝１０１．３２５ｋＰａ＝約０．１ＭＰａ）よりも高い圧力で処理する加圧処理を行なう場合、少なくとも１．１気圧（１１２ｋＰａ）、１．５気圧（１５２ｋＰａ）、２気圧（２０３ｋＰａ）、２．５気圧（２５３ｋＰａ）、３気圧（３０４ｋＰａ）、４気圧（４０５ｋＰａ）若しくは５気圧（５０７ｋＰａ）又は任意の中間値又はこれを超える任意の値で処理する。好ましくは１．７気圧（１７２ｋＰａ）～１０気圧（１０１３ｋＰａ）の範囲であり、より好ましくは４気圧（４０５ｋＰａ）～８気圧の範囲である。大気圧よりも低い圧力で処理する減圧処理を行なう場合、０．００５気圧（０．５ｋＰａ）～０．３気圧（３０ｋＰａ）の範囲が好ましく、０．０１気圧（１．０ｋＰａ）～０．１気圧（１０．１ｋＰａ）の範囲がより好ましく、０．０２気圧（２．０ｋＰａ）～０．０６気圧（６．１ｋＰａ）の範囲がさらに好ましい。減圧の圧力が高すぎる場合は、感染液の浸潤が不十分になるため好ましくない。逆に圧力が低すぎる場合は、液体が沸点に達し著しく蒸発して液体が減少し浸潤が不十分になることや、製造プロセスや設備が大がかりになるためやはり好ましくない。したがって、これらの加圧処理又は減圧処理を行う時間は、植物の種類や処理する組織に応じて適宜設定することができるが、１０秒～１０分であり、好ましくは２０秒～５分であり、さらに好ましくは３０秒～３分程度である。
　感染液に植物を浸漬した状態で圧力を調節する際、装置が比較的簡素である等、利便性の点で優れていることから、加圧処理よりも減圧処理が好ましい。減圧処理の一形態として、真空浸潤法（vacuum infiltration）が挙げられ、この真空浸潤法によりアグロバクテリウムを植物に感染させることが好ましく、中でも、Plant Science, 122, 1: 101-108 (1997)によって記載された真空に基づく一過性発現方法を使用することがより好ましい。
真空浸潤法（vacuum infiltration）とは、植物の細胞間または間質腔の中へアグロバクテリウムの浸透を可能にする方法であり、物理的に、真空は、植物の組織における細胞の間の空気空間を減少させる陰性の大気圧を生成する。継続期間が長いほどおよび真空の圧力が低いほど、植物の組織内の空気空間は少ない。増加した圧力により、感染液（形質転換ベクターを有するアグロバクテリウムを含む）が植物の組織の中へ移動することが可能になる。植物の感染のために、アグロバクテリウムの存在下において植物部分に一定の期間で真空を適用することができる。真空状態とするために減圧にした後、通常の圧力に復帰（復圧）することで、植物の感染が可能となる。感染により、ポリヌクレオチド構築物を含むアグロバクテリウムは、組織、例えば、葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）、または全草の細胞間の空間に入り込む。表皮の通過後に、アグロバクテリウムは感染し、細胞へとポリヌクレオチドを移行させる。ポリヌクレオチドはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染した細胞中で対象となるタンパク質の産生をもたらすが、核の内部でのポリヌクレオチドの継代は一過性である。
＜発現工程＞
　発現工程では感染工程後の植物を栽培して該目的タンパク質を発現させる。発現工程での栽培条件は目的タンパク質が効率よく発現できる条件であれば特に制限されないが、該発現工程における温度、湿度等の条件は上記栽培工程における条件と同様の条件とすることができる。
　また、光照射の条件も太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を用いた通常の条件を採用することができる。発現工程における栽培日数は、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上であり、また、好ましくは１４日以下、より好ましくは１０日以下である。
＜タンパク質発現増強のための根の取り扱い＞
　本発明の方法では、上記栽培工程、感染工程及び発現工程の何れかの段階で、植物の根に損傷性刺激を付与することを特徴とする。損傷性刺激を付与する時期は特に限定されないが、当該刺激を付与する処理を行った後に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが転写、翻訳されて植物細胞内で発現するために十分な時間がとれるような時期に損傷性刺激を付与することが好ましい。そのため、植物が栽培工程で適度に成育した段階、特に、アグロバクテリウムを含む感染液に接触する前段階または接触した直後の間が好ましい。さらに好ましくは、アグロバクテリウムを含む感染液に植物を浸漬する操作を行なう際に、併せて根に当該刺激を付与することができる。あるいは、前記感染工程中又は発現工程の初期段階においてそのような処理を行ってもよい。具体的には、例えば、感染を実施する２４時間前から感染直前までの間に処理を行うこと、感染後７２時間以内の間に処理を行うことなどが挙げられ、感染を実施する１２時間前までに処理を行うことが好ましく、感染直前、例えば１時間前、好ましくは３０分前までに処理を行うことがより好ましい。
　また、上記栽培、感染工程及び発現工程のそれぞれを別々の植物工場等で行ってもよい。さらに、市販の栽培植物を購入し、これを用いて感染工程及び発現工程を行ってもよい。その際、購入した植物に直ちに損傷性刺激を付与するとともにアグロバクテリウムを感染させてもよいし、あるいはそれらの処理を所定の時間をおいて順次実施してもよい。
　前述のとおり、本発明の方法おいてはbare-root法で栽培された植物を好適に用いることができるが、bare-root法で栽培された植物は根の全体または一部がむき出しの状態となっているため、各工程において適宜根へ損傷性刺激を与えることが容易であり好ましい。例えば、栽培工程及び発現工程の途中であっても、土壌、固形培地等から根を取り出す操作を行うことなく損傷性刺激を付与し、さらに栽培を継続することが可能である。また、感染工程において、通常、根がむき出しの状態で葉部分へ種々の操作を実施するため、これらの操作と同時に根部分に損傷性刺激を付与する操作を行うことができ、製造方法全体の工程に要する時間を短縮することができる。
　一方で、水耕栽培、特にbare-root法で栽培された植物を用いる場合には、根の周辺に土壌由来の汚染物質や雑菌を伴う可能性が少ないことから、根へ損傷性刺激を付与する操作において取り扱いが容易となるメリットがある。特に、感染液に浸漬して圧力調整を行う場合、圧力装置内に根を含む植物全体を配置したとしてもコンタミネーションなどの問題が発生しにくく好ましい。
　本発明において、「損傷性刺激」とは、創傷等の機械的刺激、温度や圧力変化等の物理的刺激、化学薬品等による処理、電気的刺激、及び放射線照射からなる群より選択される少なくとも１つの環境刺激を含むものであり、典型的には、根の少なくとも一部を切断することを含むがこれに限定されるものではない。例えば、植物の根の機能が部分的に抑制されるような形態でその組織の一部に損傷を加えること、例えば、鋭利な突起物を用いて開放性の傷を与えることや、鈍器等を用いて打撲のような切り口のない閉鎖性の傷を与えることを含み、根が植物から完全に切り離されることを必要とするものではない。
　損傷性刺激を付与する方法の一例を、図面を用いて説明する。図３Ａは、損傷性刺激を付与する前の植物を示す模式図である。図３Ａでは根の全体がむき出しの状態となっている。図３Ｂでは根の先端部の一部が切断され、切断された根が植物から切り離されている。図３Ｃでは、植物の根の根元付近に開放性または閉鎖性の傷を付与する箇所が破線で囲まれ、線状に付与される傷の位置が点線で示されている。
　根を切断する方法、創傷を付与する方法は特に限定されるものではなく、はさみや小刀のような鋭利な道具で根を切断したり、創傷を付与したりしてもよく、あるいは曲げ破壊やせん断破壊などの物理的な応力によって切断したり、創傷を付与したりしてもよい。
　どの程度の範囲で根を切断したり、創傷を付与したりするかについても特に限定するものではないが、根による水分や養分の吸収が著しく阻害されて目的タンパク質の発現効率が低下しない範囲内で根を切断したり、創傷を付与したりすることができる。切断箇所および創傷付与箇所についても根の先端部分であってもよいし、茎との接合部分であってもよいが、好ましくは根の先端部分から根全体の新鮮重量に対し、少なくとも０．０１質量％程度切断する、または創傷を与えればよい。切断量または創傷量の上限についても上述したような理由から、根全体の新鮮重量に対し５０質量％程度であれば問題ないと考えられる。ここで、切断または創傷される根の選択方法は、全ての根について概ね同程度の量を切断または創傷してもよいし、複数の根のうちの任意の数本について所定の量を切断または創傷し、根全体の新鮮重量に対して上記範囲内に入るように調整してもよい。
　本発明の好ましい実施形態では、切断または創傷された根の部分が、前記植物の根全体の新鮮重量に対し、０．１質量％～４０質量％、好ましくは１質量％～３０質量％、さらに好ましくは２質量％～２０質量％程度である。
　このように植物の根を切断または創傷することにより、目的タンパク質の発現効率が向上する理由は必ずしも明らかではないが、根が損傷を受けることで、養分の吸収が減少するか、植物の生理活動が損傷の修復に優先され葉への養分の供給が減少するか、あるいは、何らかの信号が伝播すること等により、特定の制御機構が活性化、もしくは、不活性化されること等で、外来遺伝子の過剰発現に対する抵抗性機構等が弱まるか、あるいは、アグロバクテリウムが感染しやすくなることが理由として推測され、本発明の方法では目的タンパク質の種類によらずその発現効率が向上するものと考えられる。
＜目的タンパク質回収工程＞
　発現工程において、植物内に蓄積した目的タンパク質は植物から回収されることが好ましい。植物から目的タンパク質を含む画分を取得し、目的タンパク質を適当な方法により精製することが好ましい。なお、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは精製のためのタグ配列を含んでもよい。
　本発明の方法では、植物全体の重量が増加することなく、目的タンパク質のみの発現量が増加するため、含量の高い出発原料を用いて目的タンパク質を回収、精製することができ、製造コストの大きな割合を占める精製工程の負担を軽減できると考えられる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
１．植物バイオマスの調製
（１）播種
　播種用液体肥料（大塚ハウスＳ１号（大塚アグリテクノ株式会社）０．７８ｇ／Ｌ、大塚ハウス２号（大塚アグリテクノ株式会社）０．２５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．０）を水耕栽培用ウレタンマット（江松化成Ｗ５８７．５ｍｍ×Ｄ２８２ｍｍ×Ｈ２８ｍｍ：１２×２マス穴径φ９ｍｍ）にしみこませ、育苗トレー（Ｗ６００ｍｍ×Ｄ３００ｍｍ×Ｈ３００ｍｍ）に収め、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）種子を播種した。
（２）育苗
　播種後の植物を人工気象器（ＮＣ－４１０ＨＣ）（日本医化器械製作所）にて室温２８℃、１６時間昼／８時間夜の光サイクルにて１２日間生育させた。
（３）栽培（前期）
　（２）で育苗に用いたウレタンマットを１マスずつ分離し、栽培（前期）用パネル（Ｗ６００ｍｍ×Ｄ３００ｍｍ、３０穴）に移植した。移植後の栽培（前期）用パネルを栽培装置にセットし、湛液方式（deep flow technique, ＤＦＴ方式）にて９日間栽培した。環境条件および液体肥料条件は以下のとおりに制御した。
《環境条件》
－温度：２８℃
－相対湿度：６０～８０％
－ＣＯ２濃度：４００ｐｐｍ
－照明：平均光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）：１４０μｍｏｌ／ｍ２・秒、２４ｈ連続照射、三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）
《液体肥料条件》
　液体肥料は、肥料Ａ液（大塚ハウスＳ１号１５０ｇ／Ｌ、大塚ハウス５号（大塚アグリテクノ株式会社）２．５ｇ／Ｌ）、肥料Ｂ液（大塚ハウス２号１００ｇ／Ｌ）をそれぞれ脱塩素水に溶解し、等量に混合して使用した。ｐＨ調整にはｐＨ調整剤ダウン（大塚アグリテクノ株式会社）および４％ＫＯＨ水溶液を用いた。液体肥料の電気伝導度（electrical conductivity, ＥＣ）およびｐＨは「らくらく肥料管理機３」（株式会社セムコーポレーション）を用いてＥＣ：２．３ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ６．０になるように調整した。
（４）栽培（後期）
　栽培（前期）用パネルより植物体を取り出し、栽培（後期）用パネル（Ｗ６００ｍｍ×Ｄ３００ｍｍ　６穴）に定植した。移植後の栽培（後期）用パネルを栽培装置にセットし、ＤＦＴ方式にて７日間（播種後２８日間）栽培した。液体肥料条件は、液体肥料条件のうち電気伝導度（ＥＣ）を４．０ｍＳ／ｃｍに変更したこと以外は、栽培（前期）と同様の条件に制御した。
《環境条件》
－温度：２８℃
－相対湿度：６０～８０％
－ＣＯ２濃度：４００ｐｐｍ
－照明：平均光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）：１４０μｍｏｌ／ｍ２・秒、２４ｈ連続照射、三波長蛍光灯「ルピカライン」（三菱電機株式会社）
２．形質転換アグロバクテリウムの調製
（１）発現プラスミド
　ＧＦＰ（クラゲ緑色蛍光タンパク質）発現の検討には、以下の２種類の発現プラスミドを用いた。
　植物バイナリーベクターｐＭＭ４４４（特開平９－３１３０５９号公報）のカナマイシン耐性発現カセット（ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）を、ｐＩＺＩ（特開平７－２７４７５２）由来のハイグロマイシン耐性発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター）に置換した。このようにして得られたプラスミドに、さらに、ｐＩＧ２２１（Plant Cell Physiol., 31, 805(1990)）由来のＧＵＳ発現カセット（カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、ヒマのカタラーゼ遺伝子の第一イントロン、β－グルクロニダーゼ遺伝子、及びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターからなる）のβ－グルクロニダーゼ遺伝子をＥＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ－Ｎ３：クローンテック社製）に置換したＥＧＦＰ発現カセットを導入し、ＥＧＦＰ遺伝子発現プラスミドを作製した（以下、このプラスミドを「ｐＧＦＰ／ＭＭ４４４」と称する。その構造を図１に示す）。
　また、ｐＧＦＰ／ＭＭ４４４におけるハイグロマイシン耐性発現カセットを削除し、ついで、ＥＧＦＰ発現カセットのＥＧＦＰ遺伝子をＰ１９遺伝子に置換することでＰ１９遺伝子発現プラスミドを作製した（以下、このプラスミドを「ｐ１９／ＭＭ４４４」と称する。その構造を図２に示す）。なお、Ｐ１９遺伝子はＥＧＦＰ遺伝子の発現を強化する働きがあり、このｐ１９／ＭＭ４４４は、ｐＧＦＰ／ＭＭ４４４との共発現に供した。
　なお、図１及び２において、遺伝子やその制御領域を示す記号の意味は、以下の通りである。
３５ＳＰ：　カリフラワーモザイクウィルス　３５Ｓ　プロモーター
ｉｎｔ：　ヒマ　カタラーゼ遺伝子　第一イントロン
Ｎｏｓｔ：　ノパリンシンターゼ　ターミネーター
ＳｐｅｃＲ：　スペクチノマイシン耐性遺伝子
ＴｃＲ：　テトラサイクリン耐性遺伝子
ＨｍＲ：　ハイグロマイシン耐性遺伝子
ＯｒｉｐＢＲ３２２：　ｐＢＲ３２２　ｏｒｉ
ＯｒｉｐＲＫ２：　ｐＲＫ２　ｏｒｉ
ＢＬ：　Ｔ－ＤＮＡ　ｌｅｆｔ　ｂｏｒｄｅｒ　
ＢＲ：　Ｔ－ＤＮＡ　ｒｉｇｈｔ　ｂｏｒｄｅｒ　
（２）アグロバクテリウムの形質転換と形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックの調製
　上述のプラスミド（ｐＧＦＰ／ＭＭ４４４、ｐ１９／ＭＭ４４４）をそれぞれ、エレクトロポレーション法（Mattanovich et al.1989）によってアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens AGL1: Rhizobium radiobacter ATCC BAA-101;  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA20108, USA）株に導入した（得られた形質転換アグロバクテリウムを、以下、それぞれ、ＧＦＰ－アグロバクテリウム、Ｐ１９－アグロバクテリウムと称する）。
　形質転換アグロバクテリム（ＧＦＰ－アグロバクテリウム、Ｐ１９－アグロバクテリウム）を、カルベニシリン２５μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養後、グリセロールを加えて最終的にグリセロール濃度を３０質量％となるよう調整し、－８０℃で保存することで各形質転換アグロバクテリウムグリセロールストックとした。
（３）感染工程用形質転換アグロバクテリウムの調製
　上記（２）で作製した形質転換アグロバクテリウム（ＧＦＰ－アグロバクテリウム、Ｐ１９－アグロバクテリウム）のグリセロールストックをＬＢ培地に植菌して、培養を行った。
　培養後、遠心することで集菌し、得られた菌体をインフィルトレーションｂｕｆｆｅｒ［５ｍＭ　ＭＥＳ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．６］に懸濁して濃縮菌液を得た。得られた濃縮菌体をＧＦＰ－アグロバクテリウムとＰ１９－アグロバクテリウムの１：１混合菌液のＯＤ６００が０．８となるように４Ｌのインフィルトレーションｂｕｆｆｅｒに加えて、ｐＨ５．６に調整し、感染工程用アグロバクテリウム菌液とした。
［実施例１及び２、比較例１］
３．Vacuum Infiltration（真空浸潤法）による感染（感染工程）
　上記１（４）で得られた播種後２８日目のベンサミアナタバコの根を、該根の総重量に対して、切断なし（０質量％;比較例１；図３Ａ参照）、２質量％（実施例１；図３Ｂ参照）又は１８質量％（実施例２；図３Ｂ参照）の割合で、それぞれその先端から切断した。その後すぐ（切断後３０分以内）に、各々を逆さにしてビーカー中のアグロバクテリウム菌液（上述の２．（３）で調製したもの）中に地上部が浸るように沈めた。その後、該ビーカーを真空デシケーター（ＦＶ－３Ｐ）（東京硝子器械株式会社製）に入れ、１９～４０Ｔｏｒｒに１分間静置し、減圧した。その後、バルブを一気に開放して復圧をおこなった。
４．感染葉の栽培（発現工程）
　感染後の栽培は人工気象器（日本医化器械製作所製）を用いて行った。光源として、三波長蛍光灯「ルピカライン（登録商標）」（三菱電機株式会社製）を用い、１６時間昼／８時間夜の光サイクルで、平均ＰＰＦＤ１５０μｍｏｌ／ｍ２・秒にて栽培した。液体肥料は、ＥＣ：２．１～２．２ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ５．５とした。温度は、昼２５℃／夜２０℃のサイクルとした。また、相対湿度は６０～８５％とした。６日間かけて上述の発現工程を行ったアグロバクテリウム感染ベンサミアナタバコは、葉柄を含めずに全ての葉を収穫した。その後、－８０℃にて保管した。
５．ＧＦＰ発現量の測定
（１）粗抽出液の調製
　４．で凍結保存したＧＦＰおよびＰ１９発現用アグロバクテリウム感染葉を乳鉢に移し、液体窒素中で磨砕した。その後、サンプル新鮮重量の６倍量のＧＦＰアッセイ用抽出バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ｐＨ７．２５））を加え、激しく懸濁することでタンパク質粗抽出を行った。粗抽出液１ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、４℃、２０，４００×ｇ、１０分間遠心後、上清を回収し、後述のＧＦＰ定量に用いた。
（２）ＧＦＰ定量
　ＧＦＰ蛍光の検出にはWallac ARVO SX 1420 Multilabel counter (Perkin-Elmer Life Sciences)を用いて４８５ｎｍの励起光によって生じる５０７ｎｍの発光を検出した。定量には段階希釈したＧＦＰスタンダード（rAcGFP1 Protein：タカラバイオ社製）を用いた。測定サンプルはＧＦＰ用抽出バッファーで５倍希釈し、１００μＬずつ、９６－ｗｅｌｌマイクロプレート（Ｎｕｎｃフルオロヌンクプレート：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に分注し、３株の測定結果を平均し、葉の新鮮重量当たりのＧＦＰ発現量（mg／kg－ＦＷ）、すなわち発現効率を算出し根を切断しなかった植物の場合を１００％として表１に示した。
　表１から、根を切断しなかった植物に比べ、根を切断した場合の葉の新鮮重量当たりのＧＦＰ発現量が増大した。これより、根の切断により発現効率が向上したことがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［比較例２］
　上記１（４）で得られた播種後２８日目のベンサミアナタバコを逆さにしてビーカー中のアグロバクテリウム菌液（上述の２．（３）で調製したもの）中に地上部が浸るように沈めた。その後、該ビーカーを真空デシケーター（ＦＶ－３Ｐ）（東京硝子器械株式会社製）に入れ、１９～４０Ｔｏｒｒに１分間静置し、減圧した。その後、バルブを一気に開放して復圧をおこなった。真空浸潤処理後の植物の根に対して、切断などの処理を特に行わなかった。（比較例２；図３Ａ参照）。
　感染後の栽培、およびＧＦＰ発現量の測定は、それぞれ上記４、および上記５と同様の方法にて行った。結果を表２に示した。
［実施例３］
　上記１（４）で得られた播種後２８日目のベンサミアナタバコの根の根元（図３Ｃ参照）を、デザートフォーク１８－８（株式会社クリンプ製）で１０回繰り返して突いて刺傷を与えた。その後すぐ（創傷後３０分以内）に、該植物を逆さにしてビーカー中のアグロバクテリウム菌液（上述の２．（３）で調製したもの）中に地上部が浸るように沈めた。その後、該ビーカーを真空デシケーター（ＦＶ－３Ｐ）（東京硝子器械株式会社製）に入れ、１９～４０Ｔｏｒｒに１分間静置し、減圧した。その後、バルブを一気に開放して復圧をおこなった。
　感染後の栽培、およびＧＦＰ発現量の測定は、それぞれ上記４、および上記５と同様の方法にて行った。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　日本国特許出願２０１４－０８１１１０号（出願日：２０１４年４月１０日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (10)

  1. 　アグロバクテリウムに感染し得る植物を水耕栽培法で栽培する工程、
    　前記水耕栽培にて生育した植物を、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを含む感染液に接触させることにより感染させる工程、及び
    　前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程を含む、植物によるタンパク質の製造方法であって、
    　前記植物の根に損傷性刺激を付与することを特徴とする、植物によるタンパク質の製造方法。
  2. 　前記損傷性刺激が、前記植物の根の一部を切断することを含む請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
  3. 　前記切断された根の部分が、前記植物の根全体の新鮮重量に対し、０．０１質量％～５０質量％である請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
  4. 　前記根の切断が、前記感染工程の前に行われる請求項２又は３に記載のタンパク質の製造方法。
  5. 　前記発現工程の後に、前記植物から目的タンパク質を精製し、及び／又は回収する工程を含む請求項１～４の何れか一項に記載のタンパク質の製造方法。
  6. 　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質である請求項１～５の何れか一項に記載のタンパク質の製造方法。
  7. 　前記植物が、ベンサミアナタバコである請求項１～６の何れか一項に記載のタンパク質の製造方法。
  8. 　目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程、及び
    　前記感染後の植物をさらに栽培して、目的タンパク質を前記植物で発現させる工程を含む、植物によるタンパク質の製造方法であって、
    　前記植物の根に損傷性刺激を付与することを特徴とする、植物によるタンパク質の製造方法。
  9. 　前記損傷性刺激が、前記感染に先立って前記植物の根に付与される請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
  10. 　前記損傷性刺激が、前記感染と同時に又はその後に前記植物の根に付与される請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
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