WO2020111029A1 - ゲノム編集方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a technique for efficiently binding a protein to gold particles. More specifically, it relates to a technique for efficiently binding a protein to a gold particle used in a gene gun.
- Patent Document 1 genome editing technology using the CRISPR system has been developed and is being applied to various organisms.
- the means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> A method of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
- proteins can be efficiently bound to gold particles.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of obtaining a genome-edited individual using a gene gun.
- FIG. 2 is a graph showing the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
- FIG. 3 shows that 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule, and the binding of the protein to gold particles when various buffers (AI) were used. It is a graph which shows quantity.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of obtaining a genome-edited individual using a gene gun.
- FIG. 2 is a graph showing the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
- FIG. 3 shows that 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule, and the
- Tris-HCl shows that the final concentration of Tris-HCl is 1.0 mM and the salt concentration affects the amount of protein bound to gold particles in the presence of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein. It is a graph which shows an influence.
- the final object of the present invention is to create a genome-edited individual using a gene gun as shown in FIG.
- a gene gun as shown in FIG.
- steps of 1) preparation of gold particles, 2) coating on a hydrophilic film, and 3) bombardment (release from macrocarrier) are improved. ..
- gene editing is a part of a technique called a new bleeding technique (NBT), in which a specific gene on the genome is cleaved to introduce a mutation by using meganuclease, CRISPR-CAS or the like.
- NBT new bleeding technique
- a specific gene on the genome is cleaved to introduce a mutation by using meganuclease, CRISPR-CAS or the like.
- CRISPR-CAS a new bleeding technique
- the targeted gene can be destroyed with high efficiency.
- genome editing can be said to be a technique different from conventional plant transformation methods in which foreign genes are integrated almost randomly, such as the direct introduction method and the Agrobacterium method.
- the genome editing technique is characterized by including a step of cleaving genomic DNA with a nuclease or a guide RNA and a nuclease capable of targeting a cleavage site, and a conventional transformation method that does not use such a targetable nuclease or guide RNA and a nuclease. Can be distinguished from.
- RNA may be introduced into cells, or DNA capable of expressing guide RNA may be introduced to express guide RNA.
- RNP means a nuclear protein containing RNA, that is, a complex of ribonucleic acid and protein.
- RNP include, but are not limited to, for example, CRISPR-CAS, ribosome, splicesome, telomerase, vault, ribonuclease P, hnRNP, snRNP and the like.
- the inventors have developed a method for coating gold particles with a protein and a method for reducing the residual amount of gold particles spotted on a macrocarrier after being shot, which can be used in a genome editing technique using a gene gun. Completed the invention.
- the method of coating gold particles of the present invention is a method of coating gold particles using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
- the amphipathic molecule has a hydrophilic (water-soluble) portion and a hydrophobic (insoluble) portion.
- Hydrophilic groups have the property that their chemical residues favor water. Hydrophilic groups include, but are not limited to, carbohydrates, polyoxyethylenes, peptides, oligonucleotides and groups containing amines, amides, alkoxyamides, carboxylic acids, sulfur, or hydroxyl groups.
- Amphiphilic molecules (compounds) include, but are not limited to, lipid molecules, liposomes, lipopolyplexes, and the like.
- the lipopolyplex may include, for example, 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine.
- the chemical residue of the hydrophobic group has the property of excluding water. Such chemical groups are not water soluble and do not form hydrogen bonds. Hydrocarbons are hydrophobic groups.
- the amount of protein bound to gold particles can be increased by using an amphipathic compound, and the release rate from macrocarriers is also improved. (Remaining amount of gold particles on the macro carrier can be reduced).
- the amphipathic compound has a cationic property.
- the cationic amphiphilic compound may be a non-naturally occurring polyamine, the one or more amines being bound to at least one hydrophobic residue, which hydrophobic residue is C6. It may have a -C24 alkane, a C6-C24 alkene, a sterol, a steroid, a lipid, a fatty acid or a hydrophobic hormone.
- the number X in CX represents the number of carbon atoms.
- the amphipathic compound may or may not form liposomes.
- the amphipathic compound may have the following structure.
- R1 and R2 are substituents selected from the group consisting of C6-C24 alkanes, C6-C24 alkenes, sterols, steroids, lipids, fatty acids or hydrophobic hormones and other similar hydrophobic groups.
- R1 and R2 may be the same or different.
- the amphipathic compound may be 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine or Bis Imidazole ODAP (Bis imODAP, ODAP is Oxalyldiaminopropionic acid).
- the concentration of the amphipathic molecule (compound) in the solution containing the amphipathic molecule and the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the final concentration is 10 ⁇ g/mL or more. Preferably, 100 ⁇ g/mL or more is more preferable.
- a polycation can be added in addition to the amphipathic compound.
- Preferred polykaryons include, but are not limited to, polymers such as poly-L-lysine, polyethyleneimine (PEI), polysilazane, polydihydroimidazolenium, polyallylamine and similar compounds.
- a preferred polycation is ethoxylated polyethyleneimine (ePEI).
- the polycation may be a cationic protein.
- cationic proteins can facilitate the binding of proteins to gold particles.
- Suitable cationic proteins are DNA binding proteins, eg histones such as H1, H2A or H2B.
- the histone may be derived from a natural source such as beef thymus, or may be a recombinant protein synthesized in bacteria.
- DNA binding proteins such as histones have various advantages over polycationic compounds such as polylysine.
- the DNA binding protein may be a recombinant histone having both the SV40 large T antigen nuclear localization signal and the C-terminal domain of human histone H1 (NLS-H1), which is linked to the nuclear localization signal.
- the cationic protein is not particularly limited as long as it improves the binding efficiency of the protein to the gold particles when mixed with the amphipathic molecule, but the histone H1 protein is preferable.
- amphipathic compound and the polycation may be used in combination.
- the ratio of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine to histone H1 protein is preferably about 3:1.
- the solution containing the amphipathic molecule and the protein may further include a nucleic acid.
- the nucleic acid is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include DNA, RNA, and derivatives thereof.
- the protein is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include nucleic acid metabolizing enzymes such as nuclease and deaminase.
- the nuclease is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include CAS nuclease of CRISPR-CAS system.
- the CAS nuclease is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and examples thereof include Cas I which is a type I CRISPR system enzyme and Cas9 which is a type II CRISPR system enzyme.
- the concentration of the protein in the solution containing the amphipathic molecule and the protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the final concentration is preferably 50 ⁇ g/mL or more, and 300 ⁇ g/mL or more Is more preferable.
- the gold particles are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. At least the surface may be gold, may have a solid structure, or may have a core-shell structure, or may be hollow. It may be particles or nanoparticles such as gold nanorods. The gold purity of the gold particles is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 99% or more.
- the lower limit of the average particle size of the gold particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 0.3 ⁇ m or more, more preferably 0.4 ⁇ m or more, and 0.5 ⁇ m or more. More preferably, 0.6 ⁇ m or more is particularly preferable.
- the upper limit of the average particle size of the fine particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1.5 ⁇ m or less, more preferably 1.4 ⁇ m or less, and even more preferably 1.3 ⁇ m or less. It is preferably 1.2 ⁇ m or less, particularly preferably 1.1 ⁇ m or less, and most preferably 1.0 ⁇ m or less.
- the lower limit of the coating time is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 3 minutes or longer, more preferably 5 minutes or longer, still more preferably 10 minutes or longer.
- the upper limit of the coating time is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 30 minutes or less, more preferably 20 minutes or less, still more preferably 10 minutes or less.
- the coating method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
- a solution containing an amphipathic molecule and a protein and gold particles are mixed by pipetting or tapping, and then allowed to stand. And so on.
- the method for measuring the amount of protein bound to the gold particles is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
- a mixed solution of gold particles and protein is centrifuged, and the supernatant is added to ⁇ 2.
- SDS-PAGE sample buffer was added and heated at 95°C for 3 minutes.
- CBB staining was performed and compared with the control (no gold particle) band, the protein considered to be adsorbed on the gold particle The amount can be calculated.
- the final salt concentration of the buffer solution used for preparing the solution containing the amphipathic molecule and the protein in the present invention is preferably 20 mM or less, and more preferably 18 mM or less and 16 mM or less.
- the “salt” refers to a salt that inhibits binding of protein to gold particles.
- the “salt” includes, for example, sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), potassium acetate (KOAc), tris (Tris ⁇ Cl), Tris-OAc, HEPES, etc. Any substance that inhibits binding to gold particles is included without limitation. Note that magnesium chloride (MgCl 2 ) and dithiothreitol (DTT) are not included in the salt.
- the salt preferably contains an alkali metal.
- the “salt concentration” refers to the concentration of salt that inhibits protein binding to gold particles.
- the solution containing the amphipathic molecule and the protein may further contain other components.
- the other components are appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include MgCl 2 , DTT, bovine serum albumin (BSA), EDTA, DNase/RNase inhibitor, protease inhibitor, and glycerol. And so on.
- the salt concentration excluding MgCl 2 and DTT in the solution containing the amphipathic molecule and protein can be measured by an ion chromatography method.
- the relational expression between the concentration of salt excluding MgCl 2 and DTT and the response is obtained in advance, and the corresponding salt concentration is measured by applying the response obtained for the sample to the relational expression. can do.
- the method for producing coated gold particles of the present invention is a method for producing coated gold particles coated with a protein using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
- the method for producing coated gold particles coated with the protein using the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method for coating gold particles using the solution containing the amphipathic molecule and the protein. It is as follows.
- the method for producing a macrocarrier spotted with gold particles of the present invention is a step of coating a gold particle with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, and a step of spotting the coated gold particle on a macrocarrier, And can further include other steps.
- the step of coating the gold particles with the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method of coating the gold particles.
- the gold particles are applied to the macro carrier film as evenly as possible using a pipette man or the like, and then dried in a sterile environment such as a clean bench.
- the macro carrier film it is preferable to use a hydrophilic macro carrier film (“SH2CLHF” manufactured by 3M Co., Ltd.) or a macro carrier film coated with a hydrophilic coating agent.
- Hydrophilic polymers used for hydrophilic coating of hydrophilic films and macrocarriers include polyethylene glycol, hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl methacrylate, dihydroxyethyl methacrylate, diethylene glycol methacrylate, triethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, vinylpyrrolidone, Polymers of hydrophilic monomers such as acrylic acid, acrylamide, dimethylacrylamide, glucooxyoxyethyl methacrylate, 3-sulfopropylmethacryloxyethyldimethylammonium betaine, 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine, 1-carboxydimethylmethacryloyloxyethylmethanammonium Can be mentioned.
- the method for introducing a protein into cells of the present invention comprises a step of coating a gold particle with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, a step of spotting the coated gold particle on a macrocarrier, and the macrocarrier.
- the step of coating the gold particles with the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method of coating the gold particles.
- the step of spotting the coated gold particles on the macro carrier is the same as the method for manufacturing the macro carrier on which the gold particles are spotted.
- the method of bombarding the protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, for example, a macrocarrier film, a plate on which the shoot apex of the target ripe embryo is placed.
- a high-pressure helium gas is emitted from a gas accelerating tube toward a macro carrier film by installing it in a particle gun device.
- gold particles that are easily shot from the macro carrier can be obtained. That is, according to the method of the present invention, when the protein is coated with gold particles and spotted and shot on the macrocarrier, the effect that the gold particles remaining on the macrocarrier are reduced as compared with ordinary gold particles is obtained.
- Genome editing method By the method of coating the gold particles, the method of producing the coated gold particles, the method of producing a macrocarrier spotted with the gold particles, or the method of introducing a protein into the cells, genome editing can be performed, and as a result, Genome-edited cells, tissues, organs, organisms and/or progeny and/or seeds can be obtained.
- the organism for which the genome is edited in the present invention is not particularly limited as long as it is an organism into which gold particles are introduced by a gene gun, and may be an animal, a plant, or a microorganism.
- the plant may be a seed plant including angiosperms and gymnosperms, and the angiosperms include monocotyledons and dicotyledons.
- the present invention can also be applied to the following plants.
- the monocotyledon may be of any type, and examples thereof include Gramineae plants, Liliaceae plants, Musaceae plants, Pineapple plants and Orchidaceae plants.
- the above Gramineae plants include rice, wheat, barley, corn, oats, turf, sorghum, rye, millet, sugar cane and the like.
- Examples of the Liliaceae plant include leeks and asparagus.
- Examples of the Musaceae plant include banana.
- Examples of the pineapple plant include pineapple and the like.
- Examples of the orchidaceous plant include orchids.
- Examples of the dicotyledon for example, Brassicaceae, legumes, Solanaceae, Cucurbitaceae, Convolvulaceae, Rosaceae, Moraceae, Mallow, Asteraceae, Amaranthaceae, and Examples include Polygonaceae plants.
- Examples of the cruciferous plant include Arabidopsis, Chinese cabbage, rapeseed, cabbage, cauliflower, and Japanese radish.
- Examples of the legumes include soybean, adzuki bean, kidney bean, pea, cowpea, alfalfa and the like.
- Examples of the Solanaceae plant include tomato, eggplant, potato, tobacco, and red pepper.
- Examples of the Cucurbitaceae plant include makuwari, cucumber, melon and watermelon.
- Examples of the bindweed plant include morning glory, sweet potato (sweet potato), bindweed, and the like.
- Examples of the Rosaceae plant include roses, strawberries, apples and the like.
- Examples of the mulberry plant include mulberry, fig, and rubber tree.
- Examples of the mallow family plants include cotton and kenaf.
- Examples of the Asteraceae plant include lettuce and the like.
- Examples of the Amaranthaceae plant include sugar beet (sugar radish).
- Examples of the Polygonaceae plant include buckwheat.
- gymnosperms examples include pine, cedar, ginkgo and cycad.
- the method for promoting the binding of the protein of the present invention to the gold particles is a method of promoting the binding of the protein to the gold particles by adding a cationic protein.
- the cationic protein is as described above.
- Example 1 Used buffer An experiment was conducted using the following buffer.
- Example 2 Method for influencing Liposome (Lipopolyamine) (1) Add 3 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 1 ⁇ g sgRNA, 2.0 ⁇ L of Nuclease-free water, and 1 ⁇ L of 10 ⁇ various buffers to a 1.5 mL tube, and mix well by pipetting.
- FIG. 2 shows the results of examining the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
- the amount of protein bound to the gold particles was as low as 40%-55% regardless of various buffer compositions (see Table 1).
- FIG. 3 shows the amount of protein bound to gold particles when 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule and various buffers (AI) were used. Is the result of examining. In the presence of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein, the binding amount of the salt concentration protein to the gold particles was high regardless of various buffer compositions (see Table 1) (Fig. 3).
- FIG. 4 shows that the final concentration of Tris-HCl is 1.0 mM, the final concentration of NaCl is 0-35 mM (see Table 2), and 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone is used as an amphipathic molecule. It is the result of investigating the binding amount of the protein to the gold particles when the H1 protein was used. As shown in FIG. 4, when 10% of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was added, the binding amount of the protein to the gold particles was almost 100% regardless of the salt concentration. Indicated.
- the preferable final concentration of NaCl in the case of adding 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein is 15 mM or less.
- Example 3 Method for Improving Efficiency of RNP Introduction into Shoot Tip by Addition of Amphipathic Molecule (1) 12 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 5 ⁇ g sgRNA, Ribolock (Rnase inhibitor, Thermo Fisher Scientific utb) 1 ⁇ L, ⁇ 10 ⁇ L in a 1.5 mL tube. Add 4 ⁇ L, New England Biolabs, and 5 ⁇ L Nuclease-free water, and mix well by pipetting.
- Example 4 Method for obtaining a genome-edited individual using an amphipathic molecule (1) Add 12 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 5 ⁇ g sgRNA, Ribolock (Rnase inhibitor) 1 ⁇ L, ⁇ 10 Cut Smart buffer 4 ⁇ L, and Nuclease-free to a 1.5 mL tube. , Mix well by pipetting. (2) After standing at room temperature for 10 minutes, 5 ⁇ L of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein mixture (3:1, 1330 ⁇ g/mL) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. To do.
- the wheat TaGASR7 gene was used as a target gene for genome editing.
- sgRNA target sequence CCG CCGGGCACCCTAGGGCAAC (SEQ ID NO: 1, underlined is PAM sequence) was used.
- crRNA is GUUGCCGUAGGUGGCCCGGGuuuuagagcuaugcuguuuuug (SEQ ID NO: 2) was used.
- Cas9 SpCas9 protein purchased from TaKaRa was used.
- the target sequence was cleaved with CRISPR-Cas9 (DSB), and the base insertion/deletion occurring in the DSB repair process was detected by CAPS analysis (PCR+restriction enzyme treatment) (see Example 13 of JP-A-2017-205104).
- Examples of aspects of the present invention include the following.
- ⁇ 1> A method of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
- ⁇ 2> A method for producing coated gold particles coated with a protein using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
- ⁇ 3> Production of a gold particle-spotted macrocarrier having a step of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein and a step of spotting the coated gold particles on a macrocarrier Is the way.
- ⁇ 4> A step of coating the gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, a step of spotting the coated gold particles on a macro carrier, and a protein for a cell using the macro carrier for a gene gun.
- the method of introducing a protein into a cell which comprises the step of: ⁇ 5>
- ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 5>, wherein the macrocarrier is a hydrophilic film.
- ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> above, wherein the amphipathic molecule is liposome, 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine, or Bis Imidazole ODAP. is there.
- ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the solution containing the amphipathic molecule and the protein further contains histone H1 protein.
- ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 8>, which is a genome editing method.
- ⁇ 10> A cell, tissue, organ, individual, and/or progeny and/or seed introduced with the protein and/or nucleic acid by the method according to any one of ⁇ 4> to ⁇ 8>.
- ⁇ 11> A cell, a tissue, an individual organism and/or a progeny and/or a seed thereof, whose genome has been edited by the method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 9>.
- ⁇ 12> A method of promoting the binding of protein to gold particles by adding a cationic protein.
- ⁇ 13> The method according to ⁇ 12>, wherein the cationic protein is histone H1 protein.
- ⁇ 14> The method according to ⁇ 12> or ⁇ 13>, further comprising adding an amphipathic molecule.
- ⁇ 15> The method according to ⁇ 14>, wherein the amphipathic molecule is 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine.
- the present invention can be used in the biotechnology industry, agriculture, breed breeding industry, etc.
Landscapes
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Abstract
両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
Description
本発明は、タンパク質を金粒子に効率よく結合させる技術に関する。より詳しくは、遺伝子銃に使用する金粒子にタンパク質を効率よく結合させる技術に関する。
近年、CRISPRシステムによるゲノム編集技術が開発され、種々の生物に応用されるようになりつつある(特許文献1)
しかしながら、形質転換系の開発されていない生物、または、形質転換効率の低い生物については、ゲノム編集技術の適用が困難であった。
そこで、形質転換の困難な生物に対するゲノム編集技術の開発が求められていた。
タンパク質を金粒子に効率よく被覆する方法を提供する。
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
<1> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
<1> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
本発明によれば、タンパク質を効率よく金粒子に結合できる。
本発明の最終目的は、図1に記載のように、遺伝子銃を用いてゲノム編集個体を作成することである。そのためには、図1のように4つのステップ、1)金粒子の調製、2)マイクロキャリアへの塗布、3)茎頂への撃ち込み、4)ゲノム編集個体の取得が必要となる。本発明においては、これらの工程のうち、特に、1)金粒子の調製、2)親水性フィルムへの塗布の工程、および3)撃ち込み(マクロキャリアからの放出)の工程を改善するものである。
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ニューブリーディングテクニック(NBT)といわれる技術の一部で、メガヌクレアーゼ、CRISPR-CASなどを用いて、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して変異を導入することで遺伝子を破壊すること、もしくは、部位特異的にDNA断片を挿入または置換すること、または、CRISPRシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体を構築し、細胞中で発現させることで、狙った点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変することも含まれるがこれらに限られず、ゲノムを編集できる技術であればよい。ゲノム編集技術を用いることで、狙った遺伝子を高い効率で破壊できる。遺伝子破壊の場合、遺伝子組換えの痕跡を残さずに狙った遺伝子のみを破壊できることから組換え植物と取り扱わない国もある。また、ゲノム編集によれば、切断配列の両側の配列に相同な断片を、その部位に導入したいDNA断片の両側に連結しておくことで、効率よく部位特異的なDNA断片の挿入または置換が可能である。また、CRISPR-CASなどを通常用いる濃度から下げることで、DNA切断後に起きる置換変異の割合を増加させることも可能である。
上記意味で、ゲノム編集は、外来遺伝子がほぼランダムに組み込まれる従来型の植物の形質転換法、例えば、直接導入法やアグロバクテリウム法などとは異なる技術とも言える。ゲノム編集技術では、切断部位をターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドRNAとヌクレアーゼを用いてゲノムDNAを切断する工程を含むことが特徴で、かかるターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドRNAとヌクレアーゼを用いない従来型の形質転換法とは区別できる。ここで、「ヌクレアーゼまたはガイドRNAとヌクレアーゼを用いて」という意味は、ヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入してもよく、ヌクレアーゼ遺伝子をコードするDNAおよび/またはRNAを細胞に導入してヌクレアーゼタンパク質を発現させてもよいという意味である。また、ガイドRNAについてもRNAを細胞に導入してもよく、ガイドRNAを発現し得るDNAを導入してガイドRNAを発現させてもよい趣旨である。
本明細書において、RNPとは、RNAを含む核タンパク質、即ち、リボ核酸とタンパク質の複合体を意味する。RNPの例としては、例えば、CRISPR-CAS、リボソーム、スプライスソーム、テロメラーゼ、ヴォールト、リボヌクレアーゼP、hnRNP、およびsnRNP等が挙げられるがこれらに限られない。好ましくは、CRISPR-CASを含む、ゲノム編集能力のあるRNPである。
上述のように、ゲノム編集においては、ヌクレアーゼなどのタンパク質をターゲットとなる生物の細胞中、特に生殖系列の細胞中に導入することが必要であるが、タンパク質を効率よく遺伝子銃で細胞中に導入することは生物、特に植物の特定の種においては困難な場合があった。そこで、発明者らは、遺伝子銃を用いたゲノム編集技術に用いることができる、タンパク質による金粒子の被覆方法、マクロキャリアにスポットした金粒子の撃ち込み後の残存量を減らす方法を開発し、本発明を完成した。
(金粒子を被覆する方法)
本発明の金粒子を被覆する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
本発明の金粒子を被覆する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
前記両親媒性分子(化合物)は、親水性(水溶性)部分と、疎水性(不溶性)部分とを有している。親水性基は、その化学残基が水を好む性質を有している。親水性基としては、例えば、炭水化物、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基を含む基が含まれるが、これらに限られない。両親媒性分子(化合物)としては、脂質分子、リポソーム、リポポリプレックス(lipo polyplex)などを含むがこれらに限られない。リポポリプレックスは、例えば、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンを含んでいてもよい。
前記疎水性基は、その化学残基は水を排除する性質を有している。かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない。炭化水素は、疎水性基である。
本発明の金粒子のタンパク質被覆方法においては、両親媒性化合物を用いることにより、金粒子へのタンパク質の結合量(結合率)を増加させることができ、さらに、マクロキャリアからの放出率も向上させる(マクロキャリアへの金粒子の残存量を減少させる)ことができる。
前記両親媒性化合物は陽イオン性を有していることが好ましい。この陽イオン性両親媒性化合物は、天然由来ではないポリアミンであってもよく、これら1つ以上のアミンは、少なくとも1つの疎水性残基に結合されており、この疎水性残基は、C6-C24アルカン、C6-C24アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモンを有していてもよい。ここでCXのXの数字は炭素数を表す。両親媒性化合物は、リポソームを形成していても形成していなくてもよい。また、両親媒性化合物は、以下の構造を有していてもよい。
R1及びR2は、C6-C24アルカン、C6-C24アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。R1及びR2は、同一であっても異なっていてもよい。
前記両親媒性化合物は、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンまたはBis Imidazole ODAP (Bis imODAP, ODAPはOxalyldiaminopropionic acid)であってもよい。
前記両親媒性化合物は、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンまたはBis Imidazole ODAP (Bis imODAP, ODAPはOxalyldiaminopropionic acid)であってもよい。
前記両親媒性分子(化合物)の、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が10μg/mL以上が好ましく、100μg/mL以上がより好ましい。
本発明においては、前記両親媒性化合物に加えて、ポリカチオンを添加することができる。好ましいポリカリオンとしては、ポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びこれらに類する化合物などのポリマーなどが挙げられるがこれらに限られない。好適なポリカチオンは、エトキシル化ポリエチレンイミン(ePEI)である。
また、前記ポリカチオンは陽イオン性タンパク質であってもよい。陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進することができる。好適な陽イオン性タンパク質は、DNA結合タンパク質であり、例えばH1、H2A又はH2Bなどのヒストンである。前記ヒストンは、牛胸腺などの天然ソースに由来していてもよいし、バクテリア内で合成された組換えタンパク質であってもよい。ヒストンなどのDNA結合タンパク質は、ポリリジンなどのポリカチオン化合物に比べて種々の点で利点を有している。DNA結合タンパク質は、SV40ラージT抗原核局在化シグナルやヒトヒストンH1のC末端ドメイン(NLS-H1)の両方を有する組換えヒストンであってもよく、これは核局在化シグナルにリンクされている。陽イオン性タンパク質としては両親媒性分子と混合することでタンパク質の金粒子への結合効率が上がるものであれば特に限定されないが、ヒストンH1タンパク質が好ましい。
また、前記両親媒性化合物と、前記ポリカチオンを組み合わせて用いてもよい。例えば、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンとヒストンH1タンパク質の比率は、3:1程度が好ましい。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、核酸を含むことができる。
前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、DNA、RNA、及びこれらの誘導体などが挙げられる。
前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、DNA、RNA、及びこれらの誘導体などが挙げられる。
前記タンパクとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどの核酸代謝酵素が挙げられる。
前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CRISPR-CASシステムのCASヌクレアーゼなどが挙げられる。
前記CASヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、I型CRISPR系酵素であるCas3、II型CRISPR系酵素であるCas9などが挙げられる。
前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CRISPR-CASシステムのCASヌクレアーゼなどが挙げられる。
前記CASヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、I型CRISPR系酵素であるCas3、II型CRISPR系酵素であるCas9などが挙げられる。
前記タンパクの、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が50μg/mL以上が好ましく、300μg/mL以上がより好ましい。
前記金粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、少なくとも表面が金であればよく、中実構造のものでもよいし、コアシェル構造のものであっても、中空粒子であってもよく、金ナノロッドなどのナノ粒子であってもよい。
前記金粒子の金の純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、99%以上が好ましい。
前記金粒子の金の純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、99%以上が好ましい。
前記金粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、0.3μm以上が好ましく、0.4μm以上がより好ましく、0.5μm以上がさらに好ましく、0.6μm以上が特に好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1.5μm以下が好ましく、1.4μm以下がより好ましく、1.3μm以下がさらに好ましく、1.2μm以下が特に好ましく、1.1μm以下がさらに特に好ましく、1.0μm以下が最も好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1.5μm以下が好ましく、1.4μm以下がより好ましく、1.3μm以下がさらに好ましく、1.2μm以下が特に好ましく、1.1μm以下がさらに特に好ましく、1.0μm以下が最も好ましい。
前記被覆の時間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、3分間以上が好ましく、5分間以上がより好ましく、10分間以上がさらに好ましい。
前記被覆の時間の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、30分間以下が好ましく、20分間以下がより好ましく、10分間以下がさらに好ましい。
前記被覆の時間の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、30分間以下が好ましく、20分間以下がより好ましく、10分間以下がさらに好ましい。
前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液と金粒子をピペッティングまたはタッピングにより混合し、静置する方法などが挙げられる。
前記金粒子へのタンパク質の結合量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金粒子とタンパクの混合液を遠心し、上清に、×2 SDS-PAGE用sample bufferを加え、95℃3分間加熱し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離後、CBB染色し、コントロール(金粒子なし)のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるタンパク質量を算出することができる。
本発明で両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を作成する際に使用する緩衝液の好ましい塩濃度の終濃度としては、20mM以下が好ましく、より好ましくは18mM以下、16mM以下であっても良い。ここで「塩」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩をいう。「塩」とは、例えば、食塩(NaCl)、塩化カリウム(KCl)、酢酸カリウム(KOAc)、トリス(Tris・Cl)、Tris-OAc、HEPES等が含まれるが、これらに限られず、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する物質であれば制限なく含まれる。なお、塩化マグネシウム(MgCl2)、及びジチオトレイトール(DTT)は塩に含まれない。塩としては、好ましくはアルカリ金属を含む。また「塩濃度」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩の濃度をいう。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、その他の成分を含むことができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、MgCl2、DTT、ウシ血清アルブミン(BSA)、EDTA、DNase/RNase阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどが挙げられる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、MgCl2、DTT、ウシ血清アルブミン(BSA)、EDTA、DNase/RNase阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどが挙げられる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における、MgCl2、及びDTTを除く塩濃度は、イオンクロマトグラフ法により測定することができる。前記イオンクロマトグラフ法では、あらかじめMgCl2、及びDTTを除く塩の濃度と応答との関係式を求めておき、サンプルについて得られた応答をその関係式に当てはめることで、該当する塩濃度を測定することができる。
(被覆金粒子を製造する方法)
本発明の被覆金粒子を製造する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法は、前述の両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法のとおりである。
本発明の被覆金粒子を製造する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法は、前述の両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法のとおりである。
(金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法)
本発明の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
本発明の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
前記スポット工程において、金粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリヤーフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させる。前記マクロキャリヤーフィルムとしては、親水性のマクロキャリヤーフィルム(3M社「SH2CLHF」など)、又は、親水性のコーティング剤によりコーティングしたマクロキャリヤーフィルムを用いるのが好ましい。
親水性フィルムやマクロキャリアの親水性のコーティングに用いられる親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、3-スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、1-カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体が挙げられる。
(細胞へのタンパク質導入方法)
本発明の細胞へのタンパク質導入方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
前記該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程は、前述の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法のとおりである。
本発明の細胞へのタンパク質導入方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
前記該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程は、前述の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法のとおりである。
前記細胞にタンパク質を撃ち込む工程において、タンパク質を撃ち込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの完熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する方法などが挙げられる。
また、本発明の金粒子の被覆方法によれば、マクロキャリアから撃ち出されやすい金粒子が得られる。すなわち、本発明の方法により、タンパク質を金粒子に被覆し、マクロキャリアにスポットして撃ち込んだ場合、通常の金粒子よりもマクロキャリアに残存する金粒子が減少するという効果が得られる。
前記細胞へのタンパク質導入方法により、タンパク質および/または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子を得ることができる。
(ゲノム編集方法)
前記金粒子を被覆する方法、前記被覆金粒子を製造する方法、前記金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法、又は前記細胞へのタンパク質導入方法により、ゲノム編集を行うことができ、その結果、ゲノム編集された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子を得ることができる。
前記金粒子を被覆する方法、前記被覆金粒子を製造する方法、前記金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法、又は前記細胞へのタンパク質導入方法により、ゲノム編集を行うことができ、その結果、ゲノム編集された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子を得ることができる。
本発明におけるゲノム編集の対象となる生物は、遺伝子銃により金粒子が導入される生物であれば、特に制限されず、動物、植物、微生物であってもよい。前記植物としては、被子植物及び裸子植物を含む種子植物であってもよく、前記被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。また、以下の植物についても本発明を適用し得る。
前記単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物などが挙げられる。
前記イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビなどが挙げられる。前記ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガスなどが挙げられる。前記バショウ科植物としては、バナナなどが挙げられる。前記パイナップル科植物としては、パイナップルなどが挙げられる。前記ラン科植物としては、ランなどが挙げられる。
前記双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、およびタデ科植物などが挙げられる。
前記アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ダイコンなどが挙げられる。前記マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファなどが挙げられる。前記ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシなどが挙げられる。前記ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカなどが挙げられる。前記ヒルガオ科植物としては、アサガオ、サツマイモ(カンショ)、ヒルガオなどが挙げられる。前記バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴなどが挙げられる。前記クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキなどが挙げられる。前記アオイ科植物としては、ワタ、ケナフなどが挙げられる。前記キク科植物としては、レタスなどが挙げられる。前記ヒユ科植物としては、テンサイ(サトウダイコン)などが挙げられる。前記タデ科植物としては、ソバなどが挙げられる。
前記裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどが挙げられる。
(タンパク質の金粒子への結合を促進する方法)
本発明のタンパク質の金粒子への結合を促進する方法は、陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
前記陽イオン性タンパク質は、前述のとおりである。
本発明のタンパク質の金粒子への結合を促進する方法は、陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
前記陽イオン性タンパク質は、前述のとおりである。
(実施例1)
用いたbuffer
以下のbufferを用いて実験を行った。
用いたbuffer
以下のbufferを用いて実験を行った。
(実施例2)
Liposome(Lipopolyamine)の影響
方法
(1)1.5mLチューブに3μg SpCas9(TaKaRa)、1μg sgRNA、Nuclease-free water 2.0μL、×10 各種buffer 1μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)両親媒性分子である、Bis Imidazole ODAP(両親媒性分子1)または1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混粒子(3:1)(両親媒性分子2)(1330μg/mLを1.25μL)、360μg 金粒子(直径0.6μm)を添加し、ピペッティングにより混ぜ、10分間静置(最終volume 10μL)する。
(3)遠心後、上清を新しいエッペンチューブへ移し、×2 SDS-PAGE用sample buffer 10μLを加え、95℃3分間加熱する。
(4)SDS-PAGEによりタンパク質(Cas9)を分離後、CBB染色する。
(5)各処理区において、Cas9タンパク質由来のバンドを定量化する。コントロール(金粒子なし)のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるCas9タンパク質量を算出する。
Liposome(Lipopolyamine)の影響
方法
(1)1.5mLチューブに3μg SpCas9(TaKaRa)、1μg sgRNA、Nuclease-free water 2.0μL、×10 各種buffer 1μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)両親媒性分子である、Bis Imidazole ODAP(両親媒性分子1)または1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混粒子(3:1)(両親媒性分子2)(1330μg/mLを1.25μL)、360μg 金粒子(直径0.6μm)を添加し、ピペッティングにより混ぜ、10分間静置(最終volume 10μL)する。
(3)遠心後、上清を新しいエッペンチューブへ移し、×2 SDS-PAGE用sample buffer 10μLを加え、95℃3分間加熱する。
(4)SDS-PAGEによりタンパク質(Cas9)を分離後、CBB染色する。
(5)各処理区において、Cas9タンパク質由来のバンドを定量化する。コントロール(金粒子なし)のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるCas9タンパク質量を算出する。
結果を図2~4に示す。図2は両親媒性分子非存在下において、各種buffer(A-H)を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。タンパク質の金粒子への結合量は、各種buffer組成(表1参照)に関わらず、40%-55%と低かった。
図3は両親媒性分子として1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質を使用し、各種buffer(A-I)を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。
1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質存在下における、塩濃度のタンパク質の金粒子への結合量は、各種buffer組成(表1参照)に関わらず高かった(図3)。
1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質存在下における、塩濃度のタンパク質の金粒子への結合量は、各種buffer組成(表1参照)に関わらず高かった(図3)。
図4はTris-HClの終濃度を1.0mM、NaClの終濃度を0-35mMとし(表2参照)、両親媒性分子として1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質を使用した際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。図4に示すように、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質を10%添加した場合、塩濃度にかかわらずほぼ100%のタンパク質の金粒子への結合量を示した。ただし、NaClが0mMの場合は、タンパク質の金粒子への結合量は85%程度に低下し、また、NaClの終濃度が15mMを超えると、タンパク質の金粒子への結合量は減少した。すなわち、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質を添加した場合の好ましいNaClの終濃度は15mM以下と考えられる。
(実施例3)
両親媒性分子添加による茎頂へのRNP導入効率の向上
方法
(1)1.5 mLチューブに12μg SpCas9(TaKaRa)、5μg sgRNA、Ribolock(Rnase inhibitor,Thermo Fisher Scientific) 1μL、×10 Cut Smart buffer 4μL,New England Biolabs、Nuclease-free water 5μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)室温10分間静置した後、Bis Imidazole ODAPまたは1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混合物(3:1、1330μg/mL)を0.5-5μL加え、さらに室温で5分間静置する。
(3)1800μg金粒子を加え、氷上で10分間静置する。
(4)遠心後上清を捨て、21μL Nuclease-free water+5μL GFP plasmid(1μg/μL)を加え、超音波処理により攪拌する。
(5)疎水性フィルム(マクロキャリア)または親水性フィルムに6μLずつ塗布し、4回/30茎頂/プレートの撃ち込みを行う。
(6)翌日、GFP蛍光を有する茎頂を数え、GFP plasmid(Cas9タンパク質)が撃ち込まれた茎頂の割合を算出する。
両親媒性分子添加による茎頂へのRNP導入効率の向上
方法
(1)1.5 mLチューブに12μg SpCas9(TaKaRa)、5μg sgRNA、Ribolock(Rnase inhibitor,Thermo Fisher Scientific) 1μL、×10 Cut Smart buffer 4μL,New England Biolabs、Nuclease-free water 5μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)室温10分間静置した後、Bis Imidazole ODAPまたは1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混合物(3:1、1330μg/mL)を0.5-5μL加え、さらに室温で5分間静置する。
(3)1800μg金粒子を加え、氷上で10分間静置する。
(4)遠心後上清を捨て、21μL Nuclease-free water+5μL GFP plasmid(1μg/μL)を加え、超音波処理により攪拌する。
(5)疎水性フィルム(マクロキャリア)または親水性フィルムに6μLずつ塗布し、4回/30茎頂/プレートの撃ち込みを行う。
(6)翌日、GFP蛍光を有する茎頂を数え、GFP plasmid(Cas9タンパク質)が撃ち込まれた茎頂の割合を算出する。
結果を表3に示す。疎水性フィルムを用いた場合では、本実験条件下においては、両親媒性分子の有無に関わらず、茎頂でのGFP発現は見られなかった。一方、親水性フィルムを用いた場合、両親媒性分子の非存在下では、茎頂でのGFP発現効率は23.3%程度であった。一方、両親媒性分子を添加することで、その効率は80%以上となることがわかった。よって、本発明の被覆方法によれば、金粒子へのタンパク質の結合が促進されるだけでなく、マクロキャリアからの撃ち出しの効率も高くなることがわかった。
(実施例4)
両親媒性分子によるゲノム編集個体の取得
方法
(1)1.5 mLチューブに12μg SpCas9(TaKaRa)、5μg sgRNA、Ribolock(Rnase inhibitor) 1μL、×10 Cut Smart buffer 4μL、Nuclease-free water 5μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)室温10分間静置した後、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混合物(3:1、1330μg/mL)を5μL加え、さらに室温で5分間静置する。
(3)1800μg 金粒子を加え、氷上で10分間静置する。
(4)遠心後上清を捨て、26μL Nuclease-free waterを加え、超音波処理により攪拌する。
(5)親水性フィルムに6μLずつ塗布し、4回/30茎頂/プレートの撃ち込みを行う。
(6)翌日、茎頂においてGFP蛍光の見られる個体を選抜し、そのまま生育させる。GFPプラスミドを導入していない場合は、全個体をそのまま生育させる。
(7)T0世代第5葉、止葉およびT1世代幼葉をサンプリングし、CAPS解析により、変異の有無を確認する。
両親媒性分子によるゲノム編集個体の取得
方法
(1)1.5 mLチューブに12μg SpCas9(TaKaRa)、5μg sgRNA、Ribolock(Rnase inhibitor) 1μL、×10 Cut Smart buffer 4μL、Nuclease-free water 5μLを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
(2)室温10分間静置した後、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質混合物(3:1、1330μg/mL)を5μL加え、さらに室温で5分間静置する。
(3)1800μg 金粒子を加え、氷上で10分間静置する。
(4)遠心後上清を捨て、26μL Nuclease-free waterを加え、超音波処理により攪拌する。
(5)親水性フィルムに6μLずつ塗布し、4回/30茎頂/プレートの撃ち込みを行う。
(6)翌日、茎頂においてGFP蛍光の見られる個体を選抜し、そのまま生育させる。GFPプラスミドを導入していない場合は、全個体をそのまま生育させる。
(7)T0世代第5葉、止葉およびT1世代幼葉をサンプリングし、CAPS解析により、変異の有無を確認する。
ゲノム編集の標的遺伝子としてはコムギTaGASR7遺伝子を用いた。sgRNA標的配列として、CCGCCGGGCACCTACGGCAAC(配列番号1、下線部はPAM配列)
を用いた。sgRNA(crRNA+tracrRNA)のうち、crRNAには、
GUUGCCGUAGGUGCCCGGguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号2)
を用いた。Cas9はTaKaRa社から購入したSpCas9タンパク質を用いた。上記標的配列をCRISPR-Cas9で切断(DSB)し、DSB修復過程で起こる塩基挿入/欠失をCAPS解析(PCR+制限酵素処理)により検出した(特開2017-205104の実施例13参照)。
を用いた。sgRNA(crRNA+tracrRNA)のうち、crRNAには、
GUUGCCGUAGGUGCCCGGguuuuagagcuaugcuguuuug(配列番号2)
を用いた。Cas9はTaKaRa社から購入したSpCas9タンパク質を用いた。上記標的配列をCRISPR-Cas9で切断(DSB)し、DSB修復過程で起こる塩基挿入/欠失をCAPS解析(PCR+制限酵素処理)により検出した(特開2017-205104の実施例13参照)。
結果を表4に示す。両親媒性分子の未添加時には、ゲノム編集された個体は見られなかった。
1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン/ヒストンH1タンパク質を用いて被覆金粒子を調製したところ、GFPプラスミドの有無に関わらず、制限酵素BcnIで切断されないバンドが見られた。すなわち、表4に示すように、ゲノム編集が起きていることが1%以上の効率で確認された。
以上より、本発明の金粒子へのタンパク質結合法は植物のゲノム編集に有効であることが示された。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
<1> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
<2> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
<3> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法である。
<4> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有する、細胞へのタンパク質導入方法である。
<5> 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、前記<1>~<4>のいずれかに記載の方法である。
<6> 前記マクロキャリアが親水性フィルムである、前記<3>~<5>のいずれかに記載の方法である。
<7> 前記両親媒性分子が、リポソーム、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン、またはBis Imidazole ODAPである、前記<1>~<6>のいずれかに記載の方法である。
<8> 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンH1タンパク質を含む、前記<1>~<7>のいずれかに記載の方法である。
<9> ゲノム編集方法である、前記<5>~<8>のいずれかに記載の方法である。
<10> 前記<4>~<8>のいずれかに記載の方法によりタンパク質および/または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子である。
<11> 前記<5>~<9>のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子である。
<12> 陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
<13> 前記陽イオン性タンパク質がヒストンH1タンパク質である、前記<12>に記載の方法である。
<14> さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、前記<12>または<13>に記載の方法である。
<15> 前記両親媒性分子が、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンである、前記<14>に記載の方法である。
<1> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
<2> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
<3> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法である。
<4> 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有する、細胞へのタンパク質導入方法である。
<5> 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、前記<1>~<4>のいずれかに記載の方法である。
<6> 前記マクロキャリアが親水性フィルムである、前記<3>~<5>のいずれかに記載の方法である。
<7> 前記両親媒性分子が、リポソーム、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン、またはBis Imidazole ODAPである、前記<1>~<6>のいずれかに記載の方法である。
<8> 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンH1タンパク質を含む、前記<1>~<7>のいずれかに記載の方法である。
<9> ゲノム編集方法である、前記<5>~<8>のいずれかに記載の方法である。
<10> 前記<4>~<8>のいずれかに記載の方法によりタンパク質および/または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子である。
<11> 前記<5>~<9>のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子である。
<12> 陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
<13> 前記陽イオン性タンパク質がヒストンH1タンパク質である、前記<12>に記載の方法である。
<14> さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、前記<12>または<13>に記載の方法である。
<15> 前記両親媒性分子が、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンである、前記<14>に記載の方法である。
本発明は、バイオテクノロジー産業、農業、新品種育種産業等において利用できる。
Claims (15)
- 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法。
- 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法。
- 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法。 - 両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、
を有する、細胞へのタンパク質導入方法。 - 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 前記マクロキャリアが親水性フィルムである、請求項3~5のいずれかに記載の方法。
- 前記両親媒性分子が、リポソーム、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジン、またはBis Imidazole ODAPである、請求項1~6のいずれかに記載の方法。
- 前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンH1タンパク質を含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- ゲノム編集方法である、請求項5~8のいずれかに記載の方法。
- 請求項4~8のいずれかに記載の方法によりタンパク質および/または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子。
- 請求項5~9のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官、生物個体ならびに/またはその後代および/もしくは種子。
- 陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法。
- 前記陽イオン性タンパク質がヒストンH1タンパク質である、請求項12に記載の方法。
- さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。
- 前記両親媒性分子が、1,4-ビス(3-オレオイルアミドプロピル)ピペラジンである、請求項14に記載の方法。
Priority Applications (1)
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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MIZUTA, YOKO ET AL.: "Genome editing of pollen", RESEARCH PRESENTATION RECORD OF THE 82ND ANNUAL MEETING OF THE BOTANICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 82, September 2018 (2018-09-01), pages 256 * |
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