WO2020111029A1 - ゲノム編集方法 - Google Patents

ゲノム編集方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020111029A1
WO2020111029A1 PCT/JP2019/046070 JP2019046070W WO2020111029A1 WO 2020111029 A1 WO2020111029 A1 WO 2020111029A1 JP 2019046070 W JP2019046070 W JP 2019046070W WO 2020111029 A1 WO2020111029 A1 WO 2020111029A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
gold particles
amphipathic molecule
solution containing
macrocarrier
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/046070
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
晴康 濱田
洋三 柳楽
隆二 三木
直明 田岡
亮三 今井
Original Assignee
株式会社カネカ
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ, 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 filed Critical 株式会社カネカ
Priority to JP2020557719A priority Critical patent/JP7416384B2/ja
Publication of WO2020111029A1 publication Critical patent/WO2020111029A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a technique for efficiently binding a protein to gold particles. More specifically, it relates to a technique for efficiently binding a protein to a gold particle used in a gene gun.
  • Patent Document 1 genome editing technology using the CRISPR system has been developed and is being applied to various organisms.
  • the means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> A method of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
  • proteins can be efficiently bound to gold particles.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of obtaining a genome-edited individual using a gene gun.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
  • FIG. 3 shows that 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule, and the binding of the protein to gold particles when various buffers (AI) were used. It is a graph which shows quantity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of obtaining a genome-edited individual using a gene gun.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
  • FIG. 3 shows that 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule, and the
  • Tris-HCl shows that the final concentration of Tris-HCl is 1.0 mM and the salt concentration affects the amount of protein bound to gold particles in the presence of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein. It is a graph which shows an influence.
  • the final object of the present invention is to create a genome-edited individual using a gene gun as shown in FIG.
  • a gene gun as shown in FIG.
  • steps of 1) preparation of gold particles, 2) coating on a hydrophilic film, and 3) bombardment (release from macrocarrier) are improved. ..
  • gene editing is a part of a technique called a new bleeding technique (NBT), in which a specific gene on the genome is cleaved to introduce a mutation by using meganuclease, CRISPR-CAS or the like.
  • NBT new bleeding technique
  • a specific gene on the genome is cleaved to introduce a mutation by using meganuclease, CRISPR-CAS or the like.
  • CRISPR-CAS a new bleeding technique
  • the targeted gene can be destroyed with high efficiency.
  • genome editing can be said to be a technique different from conventional plant transformation methods in which foreign genes are integrated almost randomly, such as the direct introduction method and the Agrobacterium method.
  • the genome editing technique is characterized by including a step of cleaving genomic DNA with a nuclease or a guide RNA and a nuclease capable of targeting a cleavage site, and a conventional transformation method that does not use such a targetable nuclease or guide RNA and a nuclease. Can be distinguished from.
  • RNA may be introduced into cells, or DNA capable of expressing guide RNA may be introduced to express guide RNA.
  • RNP means a nuclear protein containing RNA, that is, a complex of ribonucleic acid and protein.
  • RNP include, but are not limited to, for example, CRISPR-CAS, ribosome, splicesome, telomerase, vault, ribonuclease P, hnRNP, snRNP and the like.
  • the inventors have developed a method for coating gold particles with a protein and a method for reducing the residual amount of gold particles spotted on a macrocarrier after being shot, which can be used in a genome editing technique using a gene gun. Completed the invention.
  • the method of coating gold particles of the present invention is a method of coating gold particles using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
  • the amphipathic molecule has a hydrophilic (water-soluble) portion and a hydrophobic (insoluble) portion.
  • Hydrophilic groups have the property that their chemical residues favor water. Hydrophilic groups include, but are not limited to, carbohydrates, polyoxyethylenes, peptides, oligonucleotides and groups containing amines, amides, alkoxyamides, carboxylic acids, sulfur, or hydroxyl groups.
  • Amphiphilic molecules (compounds) include, but are not limited to, lipid molecules, liposomes, lipopolyplexes, and the like.
  • the lipopolyplex may include, for example, 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine.
  • the chemical residue of the hydrophobic group has the property of excluding water. Such chemical groups are not water soluble and do not form hydrogen bonds. Hydrocarbons are hydrophobic groups.
  • the amount of protein bound to gold particles can be increased by using an amphipathic compound, and the release rate from macrocarriers is also improved. (Remaining amount of gold particles on the macro carrier can be reduced).
  • the amphipathic compound has a cationic property.
  • the cationic amphiphilic compound may be a non-naturally occurring polyamine, the one or more amines being bound to at least one hydrophobic residue, which hydrophobic residue is C6. It may have a -C24 alkane, a C6-C24 alkene, a sterol, a steroid, a lipid, a fatty acid or a hydrophobic hormone.
  • the number X in CX represents the number of carbon atoms.
  • the amphipathic compound may or may not form liposomes.
  • the amphipathic compound may have the following structure.
  • R1 and R2 are substituents selected from the group consisting of C6-C24 alkanes, C6-C24 alkenes, sterols, steroids, lipids, fatty acids or hydrophobic hormones and other similar hydrophobic groups.
  • R1 and R2 may be the same or different.
  • the amphipathic compound may be 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine or Bis Imidazole ODAP (Bis imODAP, ODAP is Oxalyldiaminopropionic acid).
  • the concentration of the amphipathic molecule (compound) in the solution containing the amphipathic molecule and the protein is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the final concentration is 10 ⁇ g/mL or more. Preferably, 100 ⁇ g/mL or more is more preferable.
  • a polycation can be added in addition to the amphipathic compound.
  • Preferred polykaryons include, but are not limited to, polymers such as poly-L-lysine, polyethyleneimine (PEI), polysilazane, polydihydroimidazolenium, polyallylamine and similar compounds.
  • a preferred polycation is ethoxylated polyethyleneimine (ePEI).
  • the polycation may be a cationic protein.
  • cationic proteins can facilitate the binding of proteins to gold particles.
  • Suitable cationic proteins are DNA binding proteins, eg histones such as H1, H2A or H2B.
  • the histone may be derived from a natural source such as beef thymus, or may be a recombinant protein synthesized in bacteria.
  • DNA binding proteins such as histones have various advantages over polycationic compounds such as polylysine.
  • the DNA binding protein may be a recombinant histone having both the SV40 large T antigen nuclear localization signal and the C-terminal domain of human histone H1 (NLS-H1), which is linked to the nuclear localization signal.
  • the cationic protein is not particularly limited as long as it improves the binding efficiency of the protein to the gold particles when mixed with the amphipathic molecule, but the histone H1 protein is preferable.
  • amphipathic compound and the polycation may be used in combination.
  • the ratio of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine to histone H1 protein is preferably about 3:1.
  • the solution containing the amphipathic molecule and the protein may further include a nucleic acid.
  • the nucleic acid is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include DNA, RNA, and derivatives thereof.
  • the protein is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include nucleic acid metabolizing enzymes such as nuclease and deaminase.
  • the nuclease is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include CAS nuclease of CRISPR-CAS system.
  • the CAS nuclease is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and examples thereof include Cas I which is a type I CRISPR system enzyme and Cas9 which is a type II CRISPR system enzyme.
  • the concentration of the protein in the solution containing the amphipathic molecule and the protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the final concentration is preferably 50 ⁇ g/mL or more, and 300 ⁇ g/mL or more Is more preferable.
  • the gold particles are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. At least the surface may be gold, may have a solid structure, or may have a core-shell structure, or may be hollow. It may be particles or nanoparticles such as gold nanorods. The gold purity of the gold particles is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 99% or more.
  • the lower limit of the average particle size of the gold particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 0.3 ⁇ m or more, more preferably 0.4 ⁇ m or more, and 0.5 ⁇ m or more. More preferably, 0.6 ⁇ m or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the average particle size of the fine particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1.5 ⁇ m or less, more preferably 1.4 ⁇ m or less, and even more preferably 1.3 ⁇ m or less. It is preferably 1.2 ⁇ m or less, particularly preferably 1.1 ⁇ m or less, and most preferably 1.0 ⁇ m or less.
  • the lower limit of the coating time is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 3 minutes or longer, more preferably 5 minutes or longer, still more preferably 10 minutes or longer.
  • the upper limit of the coating time is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, but it is preferably 30 minutes or less, more preferably 20 minutes or less, still more preferably 10 minutes or less.
  • the coating method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a solution containing an amphipathic molecule and a protein and gold particles are mixed by pipetting or tapping, and then allowed to stand. And so on.
  • the method for measuring the amount of protein bound to the gold particles is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a mixed solution of gold particles and protein is centrifuged, and the supernatant is added to ⁇ 2.
  • SDS-PAGE sample buffer was added and heated at 95°C for 3 minutes.
  • CBB staining was performed and compared with the control (no gold particle) band, the protein considered to be adsorbed on the gold particle The amount can be calculated.
  • the final salt concentration of the buffer solution used for preparing the solution containing the amphipathic molecule and the protein in the present invention is preferably 20 mM or less, and more preferably 18 mM or less and 16 mM or less.
  • the “salt” refers to a salt that inhibits binding of protein to gold particles.
  • the “salt” includes, for example, sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), potassium acetate (KOAc), tris (Tris ⁇ Cl), Tris-OAc, HEPES, etc. Any substance that inhibits binding to gold particles is included without limitation. Note that magnesium chloride (MgCl 2 ) and dithiothreitol (DTT) are not included in the salt.
  • the salt preferably contains an alkali metal.
  • the “salt concentration” refers to the concentration of salt that inhibits protein binding to gold particles.
  • the solution containing the amphipathic molecule and the protein may further contain other components.
  • the other components are appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, and examples thereof include MgCl 2 , DTT, bovine serum albumin (BSA), EDTA, DNase/RNase inhibitor, protease inhibitor, and glycerol. And so on.
  • the salt concentration excluding MgCl 2 and DTT in the solution containing the amphipathic molecule and protein can be measured by an ion chromatography method.
  • the relational expression between the concentration of salt excluding MgCl 2 and DTT and the response is obtained in advance, and the corresponding salt concentration is measured by applying the response obtained for the sample to the relational expression. can do.
  • the method for producing coated gold particles of the present invention is a method for producing coated gold particles coated with a protein using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
  • the method for producing coated gold particles coated with the protein using the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method for coating gold particles using the solution containing the amphipathic molecule and the protein. It is as follows.
  • the method for producing a macrocarrier spotted with gold particles of the present invention is a step of coating a gold particle with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, and a step of spotting the coated gold particle on a macrocarrier, And can further include other steps.
  • the step of coating the gold particles with the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method of coating the gold particles.
  • the gold particles are applied to the macro carrier film as evenly as possible using a pipette man or the like, and then dried in a sterile environment such as a clean bench.
  • the macro carrier film it is preferable to use a hydrophilic macro carrier film (“SH2CLHF” manufactured by 3M Co., Ltd.) or a macro carrier film coated with a hydrophilic coating agent.
  • Hydrophilic polymers used for hydrophilic coating of hydrophilic films and macrocarriers include polyethylene glycol, hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl methacrylate, dihydroxyethyl methacrylate, diethylene glycol methacrylate, triethylene glycol methacrylate, polyethylene glycol methacrylate, vinylpyrrolidone, Polymers of hydrophilic monomers such as acrylic acid, acrylamide, dimethylacrylamide, glucooxyoxyethyl methacrylate, 3-sulfopropylmethacryloxyethyldimethylammonium betaine, 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine, 1-carboxydimethylmethacryloyloxyethylmethanammonium Can be mentioned.
  • the method for introducing a protein into cells of the present invention comprises a step of coating a gold particle with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, a step of spotting the coated gold particle on a macrocarrier, and the macrocarrier.
  • the step of coating the gold particles with the solution containing the amphipathic molecule and the protein is the same as the method of coating the gold particles.
  • the step of spotting the coated gold particles on the macro carrier is the same as the method for manufacturing the macro carrier on which the gold particles are spotted.
  • the method of bombarding the protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, for example, a macrocarrier film, a plate on which the shoot apex of the target ripe embryo is placed.
  • a high-pressure helium gas is emitted from a gas accelerating tube toward a macro carrier film by installing it in a particle gun device.
  • gold particles that are easily shot from the macro carrier can be obtained. That is, according to the method of the present invention, when the protein is coated with gold particles and spotted and shot on the macrocarrier, the effect that the gold particles remaining on the macrocarrier are reduced as compared with ordinary gold particles is obtained.
  • Genome editing method By the method of coating the gold particles, the method of producing the coated gold particles, the method of producing a macrocarrier spotted with the gold particles, or the method of introducing a protein into the cells, genome editing can be performed, and as a result, Genome-edited cells, tissues, organs, organisms and/or progeny and/or seeds can be obtained.
  • the organism for which the genome is edited in the present invention is not particularly limited as long as it is an organism into which gold particles are introduced by a gene gun, and may be an animal, a plant, or a microorganism.
  • the plant may be a seed plant including angiosperms and gymnosperms, and the angiosperms include monocotyledons and dicotyledons.
  • the present invention can also be applied to the following plants.
  • the monocotyledon may be of any type, and examples thereof include Gramineae plants, Liliaceae plants, Musaceae plants, Pineapple plants and Orchidaceae plants.
  • the above Gramineae plants include rice, wheat, barley, corn, oats, turf, sorghum, rye, millet, sugar cane and the like.
  • Examples of the Liliaceae plant include leeks and asparagus.
  • Examples of the Musaceae plant include banana.
  • Examples of the pineapple plant include pineapple and the like.
  • Examples of the orchidaceous plant include orchids.
  • Examples of the dicotyledon for example, Brassicaceae, legumes, Solanaceae, Cucurbitaceae, Convolvulaceae, Rosaceae, Moraceae, Mallow, Asteraceae, Amaranthaceae, and Examples include Polygonaceae plants.
  • Examples of the cruciferous plant include Arabidopsis, Chinese cabbage, rapeseed, cabbage, cauliflower, and Japanese radish.
  • Examples of the legumes include soybean, adzuki bean, kidney bean, pea, cowpea, alfalfa and the like.
  • Examples of the Solanaceae plant include tomato, eggplant, potato, tobacco, and red pepper.
  • Examples of the Cucurbitaceae plant include makuwari, cucumber, melon and watermelon.
  • Examples of the bindweed plant include morning glory, sweet potato (sweet potato), bindweed, and the like.
  • Examples of the Rosaceae plant include roses, strawberries, apples and the like.
  • Examples of the mulberry plant include mulberry, fig, and rubber tree.
  • Examples of the mallow family plants include cotton and kenaf.
  • Examples of the Asteraceae plant include lettuce and the like.
  • Examples of the Amaranthaceae plant include sugar beet (sugar radish).
  • Examples of the Polygonaceae plant include buckwheat.
  • gymnosperms examples include pine, cedar, ginkgo and cycad.
  • the method for promoting the binding of the protein of the present invention to the gold particles is a method of promoting the binding of the protein to the gold particles by adding a cationic protein.
  • the cationic protein is as described above.
  • Example 1 Used buffer An experiment was conducted using the following buffer.
  • Example 2 Method for influencing Liposome (Lipopolyamine) (1) Add 3 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 1 ⁇ g sgRNA, 2.0 ⁇ L of Nuclease-free water, and 1 ⁇ L of 10 ⁇ various buffers to a 1.5 mL tube, and mix well by pipetting.
  • FIG. 2 shows the results of examining the amount of protein bound to gold particles when various buffers (AH) were used in the absence of amphipathic molecules.
  • the amount of protein bound to the gold particles was as low as 40%-55% regardless of various buffer compositions (see Table 1).
  • FIG. 3 shows the amount of protein bound to gold particles when 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was used as an amphipathic molecule and various buffers (AI) were used. Is the result of examining. In the presence of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein, the binding amount of the salt concentration protein to the gold particles was high regardless of various buffer compositions (see Table 1) (Fig. 3).
  • FIG. 4 shows that the final concentration of Tris-HCl is 1.0 mM, the final concentration of NaCl is 0-35 mM (see Table 2), and 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone is used as an amphipathic molecule. It is the result of investigating the binding amount of the protein to the gold particles when the H1 protein was used. As shown in FIG. 4, when 10% of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein was added, the binding amount of the protein to the gold particles was almost 100% regardless of the salt concentration. Indicated.
  • the preferable final concentration of NaCl in the case of adding 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein is 15 mM or less.
  • Example 3 Method for Improving Efficiency of RNP Introduction into Shoot Tip by Addition of Amphipathic Molecule (1) 12 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 5 ⁇ g sgRNA, Ribolock (Rnase inhibitor, Thermo Fisher Scientific utb) 1 ⁇ L, ⁇ 10 ⁇ L in a 1.5 mL tube. Add 4 ⁇ L, New England Biolabs, and 5 ⁇ L Nuclease-free water, and mix well by pipetting.
  • Example 4 Method for obtaining a genome-edited individual using an amphipathic molecule (1) Add 12 ⁇ g SpCas9 (TaKaRa), 5 ⁇ g sgRNA, Ribolock (Rnase inhibitor) 1 ⁇ L, ⁇ 10 Cut Smart buffer 4 ⁇ L, and Nuclease-free to a 1.5 mL tube. , Mix well by pipetting. (2) After standing at room temperature for 10 minutes, 5 ⁇ L of 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine/histone H1 protein mixture (3:1, 1330 ⁇ g/mL) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. To do.
  • the wheat TaGASR7 gene was used as a target gene for genome editing.
  • sgRNA target sequence CCG CCGGGCACCCTAGGGCAAC (SEQ ID NO: 1, underlined is PAM sequence) was used.
  • crRNA is GUUGCCGUAGGUGGCCCGGGuuuuagagcuaugcuguuuuug (SEQ ID NO: 2) was used.
  • Cas9 SpCas9 protein purchased from TaKaRa was used.
  • the target sequence was cleaved with CRISPR-Cas9 (DSB), and the base insertion/deletion occurring in the DSB repair process was detected by CAPS analysis (PCR+restriction enzyme treatment) (see Example 13 of JP-A-2017-205104).
  • Examples of aspects of the present invention include the following.
  • ⁇ 1> A method of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
  • ⁇ 2> A method for producing coated gold particles coated with a protein using a solution containing an amphipathic molecule and a protein.
  • ⁇ 3> Production of a gold particle-spotted macrocarrier having a step of coating gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein and a step of spotting the coated gold particles on a macrocarrier Is the way.
  • ⁇ 4> A step of coating the gold particles with a solution containing an amphipathic molecule and a protein, a step of spotting the coated gold particles on a macro carrier, and a protein for a cell using the macro carrier for a gene gun.
  • the method of introducing a protein into a cell which comprises the step of: ⁇ 5>
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 5>, wherein the macrocarrier is a hydrophilic film.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6> above, wherein the amphipathic molecule is liposome, 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine, or Bis Imidazole ODAP. is there.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the solution containing the amphipathic molecule and the protein further contains histone H1 protein.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 8>, which is a genome editing method.
  • ⁇ 10> A cell, tissue, organ, individual, and/or progeny and/or seed introduced with the protein and/or nucleic acid by the method according to any one of ⁇ 4> to ⁇ 8>.
  • ⁇ 11> A cell, a tissue, an individual organism and/or a progeny and/or a seed thereof, whose genome has been edited by the method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 9>.
  • ⁇ 12> A method of promoting the binding of protein to gold particles by adding a cationic protein.
  • ⁇ 13> The method according to ⁇ 12>, wherein the cationic protein is histone H1 protein.
  • ⁇ 14> The method according to ⁇ 12> or ⁇ 13>, further comprising adding an amphipathic molecule.
  • ⁇ 15> The method according to ⁇ 14>, wherein the amphipathic molecule is 1,4-bis(3-oleoylamidopropyl)piperazine.
  • the present invention can be used in the biotechnology industry, agriculture, breed breeding industry, etc.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。

Description

ゲノム編集方法
　本発明は、タンパク質を金粒子に効率よく結合させる技術に関する。より詳しくは、遺伝子銃に使用する金粒子にタンパク質を効率よく結合させる技術に関する。
　近年、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集技術が開発され、種々の生物に応用されるようになりつつある（特許文献１）
　しかしながら、形質転換系の開発されていない生物、または、形質転換効率の低い生物については、ゲノム編集技術の適用が困難であった。
　そこで、形質転換の困難な生物に対するゲノム編集技術の開発が求められていた。
米国特許公開公報第２０１４／００６８７９７号
　タンパク質を金粒子に効率よく被覆する方法を提供する。
　前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
　本発明によれば、タンパク質を効率よく金粒子に結合できる。
図１は、遺伝子銃を用いてゲノム編集個体を取得する工程を示す概略図である。 図２は、両親媒性分子非存在下において、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｈ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を示すグラフである。 図３は、両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用し、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｉ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を示すグラフである。 図４は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌの終濃度を１．０ｍＭ、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン/ヒストンＨ１タンパク質存在下で、塩濃度がタンパク質の金粒子への結合量に及ぼす影響を示すグラフである。
　本発明の最終目的は、図１に記載のように、遺伝子銃を用いてゲノム編集個体を作成することである。そのためには、図１のように４つのステップ、１）金粒子の調製、２）マイクロキャリアへの塗布、３）茎頂への撃ち込み、４）ゲノム編集個体の取得が必要となる。本発明においては、これらの工程のうち、特に、１）金粒子の調製、２）親水性フィルムへの塗布の工程、および３）撃ち込み（マクロキャリアからの放出）の工程を改善するものである。
　本明細書において、「ゲノム編集」とは、ニューブリーディングテクニック（ＮＢＴ）といわれる技術の一部で、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを用いて、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して変異を導入することで遺伝子を破壊すること、もしくは、部位特異的にＤＮＡ断片を挿入または置換すること、または、ＣＲＩＳＰＲシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに、脱アミノ化酵素であるデアミナーゼを付加した人工酵素複合体を構築し、細胞中で発現させることで、狙った点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変することも含まれるがこれらに限られず、ゲノムを編集できる技術であればよい。ゲノム編集技術を用いることで、狙った遺伝子を高い効率で破壊できる。遺伝子破壊の場合、遺伝子組換えの痕跡を残さずに狙った遺伝子のみを破壊できることから組換え植物と取り扱わない国もある。また、ゲノム編集によれば、切断配列の両側の配列に相同な断片を、その部位に導入したいＤＮＡ断片の両側に連結しておくことで、効率よく部位特異的なＤＮＡ断片の挿入または置換が可能である。また、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳなどを通常用いる濃度から下げることで、ＤＮＡ切断後に起きる置換変異の割合を増加させることも可能である。
　上記意味で、ゲノム編集は、外来遺伝子がほぼランダムに組み込まれる従来型の植物の形質転換法、例えば、直接導入法やアグロバクテリウム法などとは異なる技術とも言える。ゲノム編集技術では、切断部位をターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを切断する工程を含むことが特徴で、かかるターゲティングできるヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いない従来型の形質転換法とは区別できる。ここで、「ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを用いて」という意味は、ヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入してもよく、ヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを細胞に導入してヌクレアーゼタンパク質を発現させてもよいという意味である。また、ガイドＲＮＡについてもＲＮＡを細胞に導入してもよく、ガイドＲＮＡを発現し得るＤＮＡを導入してガイドＲＮＡを発現させてもよい趣旨である。
　本明細書において、ＲＮＰとは、ＲＮＡを含む核タンパク質、即ち、リボ核酸とタンパク質の複合体を意味する。ＲＮＰの例としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ、リボソーム、スプライスソーム、テロメラーゼ、ヴォールト、リボヌクレアーゼＰ、ｈｎＲＮＰ、およびｓｎＲＮＰ等が挙げられるがこれらに限られない。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを含む、ゲノム編集能力のあるＲＮＰである。
　上述のように、ゲノム編集においては、ヌクレアーゼなどのタンパク質をターゲットとなる生物の細胞中、特に生殖系列の細胞中に導入することが必要であるが、タンパク質を効率よく遺伝子銃で細胞中に導入することは生物、特に植物の特定の種においては困難な場合があった。そこで、発明者らは、遺伝子銃を用いたゲノム編集技術に用いることができる、タンパク質による金粒子の被覆方法、マクロキャリアにスポットした金粒子の撃ち込み後の残存量を減らす方法を開発し、本発明を完成した。
　（金粒子を被覆する方法）
　本発明の金粒子を被覆する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
　前記両親媒性分子（化合物）は、親水性（水溶性）部分と、疎水性（不溶性）部分とを有している。親水性基は、その化学残基が水を好む性質を有している。親水性基としては、例えば、炭水化物、ポリオキシエチレン、ペプチド、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、又は水酸基を含む基が含まれるが、これらに限られない。両親媒性分子（化合物）としては、脂質分子、リポソーム、リポポリプレックス（ｌｉｐｏ　ｐｏｌｙｐｌｅｘ）などを含むがこれらに限られない。リポポリプレックスは、例えば、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンを含んでいてもよい。
　前記疎水性基は、その化学残基は水を排除する性質を有している。かかる化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない。炭化水素は、疎水性基である。
　本発明の金粒子のタンパク質被覆方法においては、両親媒性化合物を用いることにより、金粒子へのタンパク質の結合量（結合率）を増加させることができ、さらに、マクロキャリアからの放出率も向上させる（マクロキャリアへの金粒子の残存量を減少させる）ことができる。
　前記両親媒性化合物は陽イオン性を有していることが好ましい。この陽イオン性両親媒性化合物は、天然由来ではないポリアミンであってもよく、これら１つ以上のアミンは、少なくとも１つの疎水性残基に結合されており、この疎水性残基は、Ｃ６－Ｃ２４アルカン、Ｃ６－Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモンを有していてもよい。ここでＣＸのＸの数字は炭素数を表す。両親媒性化合物は、リポソームを形成していても形成していなくてもよい。また、両親媒性化合物は、以下の構造を有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ｒ１及びＲ２は、Ｃ６－Ｃ２４アルカン、Ｃ６－Ｃ２４アルケン、ステロール、ステロイド、脂質、脂肪酸又は疎水性ホルモン及びその他の類似する疎水基からなる群から選択された置換基である。Ｒ１及びＲ２は、同一であっても異なっていてもよい。
　前記両親媒性化合物は、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンまたはＢｉｓ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ＯＤＡＰ　（Ｂｉｓ　ｉｍＯＤＡＰ，　ＯＤＡＰはＯｘａｌｙｌｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）であってもよい。
　前記両親媒性分子（化合物）の、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が１０μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１００μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
　本発明においては、前記両親媒性化合物に加えて、ポリカチオンを添加することができる。好ましいポリカリオンとしては、ポリ－Ｌ－リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリシラザン、ポリジヒドロイミダゾレニウム、ポリアリルアミン及びこれらに類する化合物などのポリマーなどが挙げられるがこれらに限られない。好適なポリカチオンは、エトキシル化ポリエチレンイミン（ｅＰＥＩ）である。
　また、前記ポリカチオンは陽イオン性タンパク質であってもよい。陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進することができる。好適な陽イオン性タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質であり、例えばＨ１、Ｈ２Ａ又はＨ２Ｂなどのヒストンである。前記ヒストンは、牛胸腺などの天然ソースに由来していてもよいし、バクテリア内で合成された組換えタンパク質であってもよい。ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質は、ポリリジンなどのポリカチオン化合物に比べて種々の点で利点を有している。ＤＮＡ結合タンパク質は、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルやヒトヒストンＨ１のＣ末端ドメイン（ＮＬＳ－Ｈ１）の両方を有する組換えヒストンであってもよく、これは核局在化シグナルにリンクされている。陽イオン性タンパク質としては両親媒性分子と混合することでタンパク質の金粒子への結合効率が上がるものであれば特に限定されないが、ヒストンＨ１タンパク質が好ましい。
　また、前記両親媒性化合物と、前記ポリカチオンを組み合わせて用いてもよい。例えば、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンとヒストンＨ１タンパク質の比率は、３：１程度が好ましい。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、核酸を含むことができる。
　前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの誘導体などが挙げられる。
　前記タンパクとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどの核酸代謝酵素が挙げられる。
　前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのＣＡＳヌクレアーゼなどが挙げられる。
　前記ＣＡＳヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ３、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９などが挙げられる。
　前記タンパクの、前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、終濃度が５０μｇ／ｍＬ以上が好ましく、３００μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
　前記金粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、少なくとも表面が金であればよく、中実構造のものでもよいし、コアシェル構造のものであっても、中空粒子であってもよく、金ナノロッドなどのナノ粒子であってもよい。
　前記金粒子の金の純度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９９％以上が好ましい。
　前記金粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、０．６μｍ以上が特に好ましい。
　前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．５μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下がさらに好ましく、１．２μｍ以下が特に好ましく、１．１μｍ以下がさらに特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
　前記被覆の時間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３分間以上が好ましく、５分間以上がより好ましく、１０分間以上がさらに好ましい。
　前記被覆の時間の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０分間以下が好ましく、２０分間以下がより好ましく、１０分間以下がさらに好ましい。
　前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液と金粒子をピペッティングまたはタッピングにより混合し、静置する方法などが挙げられる。
　前記金粒子へのタンパク質の結合量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、金粒子とタンパクの混合液を遠心し、上清に、×２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃３分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質を分離後、ＣＢＢ染色し、コントロール(金粒子なし)のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるタンパク質量を算出することができる。
　本発明で両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を作成する際に使用する緩衝液の好ましい塩濃度の終濃度としては、２０ｍＭ以下が好ましく、より好ましくは１８ｍＭ以下、１６ｍＭ以下であっても良い。ここで「塩」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩をいう。「塩」とは、例えば、食塩（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）、トリス（Ｔｒｉｓ・Ｃｌ）、Ｔｒｉｓ－ＯＡｃ、ＨＥＰＥＳ等が含まれるが、これらに限られず、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する物質であれば制限なく含まれる。なお、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）は塩に含まれない。塩としては、好ましくはアルカリ金属を含む。また「塩濃度」とは、タンパク質が金粒子に結合するのを阻害する塩の濃度をいう。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液は、さらに、その他の成分を含むことができる。
　前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＥＤＴＡ、ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロールなどが挙げられる。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液における、ＭｇＣｌ２、及びＤＴＴを除く塩濃度は、イオンクロマトグラフ法により測定することができる。前記イオンクロマトグラフ法では、あらかじめＭｇＣｌ２、及びＤＴＴを除く塩の濃度と応答との関係式を求めておき、サンプルについて得られた応答をその関係式に当てはめることで、該当する塩濃度を測定することができる。
　（被覆金粒子を製造する方法）
　本発明の被覆金粒子を製造する方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法は、前述の両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法のとおりである。
　（金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法）
　本発明の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
　前記スポット工程において、金粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリヤーフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させる。前記マクロキャリヤーフィルムとしては、親水性のマクロキャリヤーフィルム（３Ｍ社「ＳＨ２ＣＬＨＦ」など）、又は、親水性のコーティング剤によりコーティングしたマクロキャリヤーフィルムを用いるのが好ましい。
　親水性フィルムやマクロキャリアの親水性のコーティングに用いられる親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体が挙げられる。
（細胞へのタンパク質導入方法）
　本発明の細胞へのタンパク質導入方法は、両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有し、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程は、前述の金粒子を被覆する方法のとおりである。
　前記該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程は、前述の金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法のとおりである。
　前記細胞にタンパク質を撃ち込む工程において、タンパク質を撃ち込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マクロキャリヤーフィルム、ターゲットの完熟胚の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ヘリウムガスをマクロキャリヤーフィルムに向かって発射する方法などが挙げられる。
　また、本発明の金粒子の被覆方法によれば、マクロキャリアから撃ち出されやすい金粒子が得られる。すなわち、本発明の方法により、タンパク質を金粒子に被覆し、マクロキャリアにスポットして撃ち込んだ場合、通常の金粒子よりもマクロキャリアに残存する金粒子が減少するという効果が得られる。
　前記細胞へのタンパク質導入方法により、タンパク質および／または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子を得ることができる。
（ゲノム編集方法）
　前記金粒子を被覆する方法、前記被覆金粒子を製造する方法、前記金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法、又は前記細胞へのタンパク質導入方法により、ゲノム編集を行うことができ、その結果、ゲノム編集された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子を得ることができる。
　本発明におけるゲノム編集の対象となる生物は、遺伝子銃により金粒子が導入される生物であれば、特に制限されず、動物、植物、微生物であってもよい。前記植物としては、被子植物及び裸子植物を含む種子植物であってもよく、前記被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。また、以下の植物についても本発明を適用し得る。
　前記単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えば、イネ科植物、ユリ科植物、バショウ科植物、パイナップル科植物、ラン科植物などが挙げられる。
　前記イネ科植物としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ、ソルガム、ライムギ、アワ、サトウキビなどが挙げられる。前記ユリ科植物としては、ネギ、アスパラガスなどが挙げられる。前記バショウ科植物としては、バナナなどが挙げられる。前記パイナップル科植物としては、パイナップルなどが挙げられる。前記ラン科植物としては、ランなどが挙げられる。
　前記双子葉植物としては、例えば、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物、バラ科植物、クワ科植物、アオイ科植物、キク科植物、ヒユ科植物、およびタデ科植物などが挙げられる。
　前記アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワー、ダイコンなどが挙げられる。前記マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ササゲ、アルファルファなどが挙げられる。前記ナス科植物としては、トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、トウガラシなどが挙げられる。前記ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカなどが挙げられる。前記ヒルガオ科植物としては、アサガオ、サツマイモ（カンショ）、ヒルガオなどが挙げられる。前記バラ科植物としては、バラ、イチゴ、リンゴなどが挙げられる。前記クワ科植物としては、クワ、イチジク、ゴムノキなどが挙げられる。前記アオイ科植物としては、ワタ、ケナフなどが挙げられる。前記キク科植物としては、レタスなどが挙げられる。前記ヒユ科植物としては、テンサイ（サトウダイコン）などが挙げられる。前記タデ科植物としては、ソバなどが挙げられる。
　前記裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどが挙げられる。
（タンパク質の金粒子への結合を促進する方法）
　本発明のタンパク質の金粒子への結合を促進する方法は、陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
　前記陽イオン性タンパク質は、前述のとおりである。
（実施例１）
用いたｂｕｆｆｅｒ
　以下のｂｕｆｆｅｒを用いて実験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例２）
　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）の影響
方法
（１）１．５ｍＬチューブに３μｇ　ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、１μｇ　ｓｇＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　２．０μＬ、×１０　各種ｂｕｆｆｅｒ　１μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）両親媒性分子である、Ｂｉｓ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ＯＤＡＰ（両親媒性分子１）または１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混粒子（３：１）（両親媒性分子２）（１３３０μｇ／ｍＬを１．２５μＬ）、３６０μｇ　金粒子（直径０．６μｍ）を添加し、ピペッティングにより混ぜ、１０分間静置（最終ｖｏｌｕｍｅ　１０μＬ）する。
（３）遠心後、上清を新しいエッペンチューブへ移し、×２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　１０μＬを加え、９５℃３分間加熱する。
（４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質（Ｃａｓ９）を分離後、ＣＢＢ染色する。
（５）各処理区において、Ｃａｓ９タンパク質由来のバンドを定量化する。コントロール（金粒子なし）のバンドと比較し、金粒子に吸着したと考えられるＣａｓ９タンパク質量を算出する。
　結果を図２～４に示す。図２は両親媒性分子非存在下において、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｈ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。タンパク質の金粒子への結合量は、各種ｂｕｆｆｅｒ組成（表１参照）に関わらず、４０％－５５％と低かった。
　図３は両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用し、各種ｂｕｆｆｅｒ（Ａ－Ｉ）を用いた際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。
　１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質存在下における、塩濃度のタンパク質の金粒子への結合量は、各種ｂｕｆｆｅｒ組成（表１参照）に関わらず高かった（図３）。
　図４はＴｒｉｓ－ＨＣｌの終濃度を１．０ｍＭ、ＮａＣｌの終濃度を０－３５ｍＭとし（表２参照）、両親媒性分子として１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を使用した際のタンパク質の金粒子への結合量を調べた結果である。図４に示すように、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を１０％添加した場合、塩濃度にかかわらずほぼ１００％のタンパク質の金粒子への結合量を示した。ただし、ＮａＣｌが０ｍＭの場合は、タンパク質の金粒子への結合量は８５％程度に低下し、また、ＮａＣｌの終濃度が１５ｍＭを超えると、タンパク質の金粒子への結合量は減少した。すなわち、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を添加した場合の好ましいＮａＣｌの終濃度は１５ｍＭ以下と考えられる。
（実施例３）
　両親媒性分子添加による茎頂へのＲＮＰ導入効率の向上
方法
（１）１．５　ｍＬチューブに１２μｇ　ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、５μｇ　ｓｇＲＮＡ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ（Ｒｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　１μＬ、×１０　Ｃｕｔ　Ｓｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　５μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）室温１０分間静置した後、Ｂｉｓ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ＯＤＡＰまたは１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混合物（３：１、１３３０μｇ／ｍＬ）を０．５－５μＬ加え、さらに室温で５分間静置する。
（３）１８００μｇ金粒子を加え、氷上で１０分間静置する。
（４）遠心後上清を捨て、２１μＬ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ＋５μＬ　ＧＦＰ　ｐｌａｓｍｉｄ（１μｇ／μＬ）を加え、超音波処理により攪拌する。
（５）疎水性フィルム（マクロキャリア）または親水性フィルムに６μＬずつ塗布し、４回／３０茎頂／プレートの撃ち込みを行う。
（６）翌日、ＧＦＰ蛍光を有する茎頂を数え、ＧＦＰ　ｐｌａｓｍｉｄ（Ｃａｓ９タンパク質）が撃ち込まれた茎頂の割合を算出する。
　結果を表３に示す。疎水性フィルムを用いた場合では、本実験条件下においては、両親媒性分子の有無に関わらず、茎頂でのＧＦＰ発現は見られなかった。一方、親水性フィルムを用いた場合、両親媒性分子の非存在下では、茎頂でのＧＦＰ発現効率は２３．３％程度であった。一方、両親媒性分子を添加することで、その効率は８０％以上となることがわかった。よって、本発明の被覆方法によれば、金粒子へのタンパク質の結合が促進されるだけでなく、マクロキャリアからの撃ち出しの効率も高くなることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例４）
　両親媒性分子によるゲノム編集個体の取得
方法
（１）１．５　ｍＬチューブに１２μｇ　ＳｐＣａｓ９（ＴａＫａＲａ）、５μｇ　ｓｇＲＮＡ、Ｒｉｂｏｌｏｃｋ（Ｒｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）　１μＬ、×１０　Ｃｕｔ　Ｓｍａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　５μＬを加え、ピペッティングにより、よく混ぜる。
（２）室温１０分間静置した後、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質混合物（３：１、１３３０μｇ／ｍＬ）を５μＬ加え、さらに室温で５分間静置する。
（３）１８００μｇ　金粒子を加え、氷上で１０分間静置する。
（４）遠心後上清を捨て、２６μＬ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒを加え、超音波処理により攪拌する。
（５）親水性フィルムに６μＬずつ塗布し、４回／３０茎頂／プレートの撃ち込みを行う。
（６）翌日、茎頂においてＧＦＰ蛍光の見られる個体を選抜し、そのまま生育させる。ＧＦＰプラスミドを導入していない場合は、全個体をそのまま生育させる。
（７）Ｔ０世代第５葉、止葉およびＴ１世代幼葉をサンプリングし、ＣＡＰＳ解析により、変異の有無を確認する。
　ゲノム編集の標的遺伝子としてはコムギＴａＧＡＳＲ７遺伝子を用いた。ｓｇＲＮＡ標的配列として、ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＣ（配列番号１、下線部はＰＡＭ配列）
を用いた。ｓｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）のうち、ｃｒＲＮＡには、
ＧＵＵＧＣＣＧＵＡＧＧＵＧＣＣＣＧＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕｇｕｕｕｕｇ（配列番号２）
を用いた。Ｃａｓ９はＴａＫａＲａ社から購入したＳｐＣａｓ９タンパク質を用いた。上記標的配列をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で切断（ＤＳＢ）し、ＤＳＢ修復過程で起こる塩基挿入／欠失をＣＡＰＳ解析（ＰＣＲ＋制限酵素処理）により検出した（特開２０１７－２０５１０４の実施例１３参照）。
　結果を表４に示す。両親媒性分子の未添加時には、ゲノム編集された個体は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン／ヒストンＨ１タンパク質を用いて被覆金粒子を調製したところ、ＧＦＰプラスミドの有無に関わらず、制限酵素ＢｃｎＩで切断されないバンドが見られた。すなわち、表４に示すように、ゲノム編集が起きていることが１％以上の効率で確認された。
　以上より、本発明の金粒子へのタンパク質結合法は植物のゲノム編集に有効であることが示された。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法である。
　＜２＞　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法である。
　＜３＞　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法である。
　＜４＞　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、を有する、細胞へのタンパク質導入方法である。
　＜５＞　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、前記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法である。
　＜６＞　前記マクロキャリアが親水性フィルムである、前記＜３＞～＜５＞のいずれかに記載の方法である。
　＜７＞　前記両親媒性分子が、リポソーム、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン、またはＢｉｓ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ＯＤＡＰである、前記＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法である。
　＜８＞　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンＨ１タンパク質を含む、前記＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の方法である。
　＜９＞　ゲノム編集方法である、前記＜５＞～＜８＞のいずれかに記載の方法である。
　＜１０＞　前記＜４＞～＜８＞のいずれかに記載の方法によりタンパク質および／または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子である。
　＜１１＞　前記＜５＞～＜９＞のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子である。
　＜１２＞　陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法である。
　＜１３＞　前記陽イオン性タンパク質がヒストンＨ１タンパク質である、前記＜１２＞に記載の方法である。
　＜１４＞　さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、前記＜１２＞または＜１３＞に記載の方法である。
　＜１５＞　前記両親媒性分子が、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンである、前記＜１４＞に記載の方法である。
　本発明は、バイオテクノロジー産業、農業、新品種育種産業等において利用できる。

Claims (15)

  1. 　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する方法。
  2. 　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、該タンパク質を被覆した被覆金粒子を製造する方法。
  3. 　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
    　該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
    を有する、金粒子をスポットしたマクロキャリアの製造方法。
  4. 　両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液を用いて、金粒子を被覆する工程と、
    　該被覆した金粒子をマクロキャリアにスポットする工程と、
    　該マクロキャリアを遺伝子銃に用いて細胞にタンパク質を撃ち込む工程と、
    を有する、細胞へのタンパク質導入方法。
  5. 　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに核酸を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記マクロキャリアが親水性フィルムである、請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記両親媒性分子が、リポソーム、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジン、またはＢｉｓ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ　ＯＤＡＰである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記両親媒性分子及びタンパク質を含む溶液が、さらに、ヒストンＨ１タンパク質を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　ゲノム編集方法である、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項４～８のいずれかに記載の方法によりタンパク質および／または核酸を導入された細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子。
  11. 　請求項５～９のいずれかに記載の方法によりゲノム編集された、細胞、組織、器官、生物個体ならびに／またはその後代および／もしくは種子。
  12. 　陽イオン性タンパク質を添加することにより、タンパク質の金粒子への結合を促進する方法。
  13. 　前記陽イオン性タンパク質がヒストンＨ１タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　さらに、両親媒性分子を添加することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　前記両親媒性分子が、１，４－ビス（３－オレオイルアミドプロピル）ピペラジンである、請求項１４に記載の方法。
PCT/JP2019/046070 2018-11-26 2019-11-26 ゲノム編集方法 WO2020111029A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020557719A JP7416384B2 (ja) 2018-11-26 2019-11-26 ゲノム編集方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018220784 2018-11-26
JP2018-220784 2018-11-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020111029A1 true WO2020111029A1 (ja) 2020-06-04

Family

ID=70853987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/046070 WO2020111029A1 (ja) 2018-11-26 2019-11-26 ゲノム編集方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7416384B2 (ja)
WO (1) WO2020111029A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004532850A (ja) * 2001-04-30 2004-10-28 サイティミュン サイエンス， インコーポレイテッド コロイド状金属組成物および方法
WO2017195906A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 株式会社カネカ 植物のゲノム編集方法
US20180186842A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Synthetic Genomics, Inc. High productivity algal mutants having reduced photosynthetic antenna
CN108498460A (zh) * 2017-02-24 2018-09-07 国家纳米科学中心 金纳米簇-脂质体复合颗粒及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004532850A (ja) * 2001-04-30 2004-10-28 サイティミュン サイエンス， インコーポレイテッド コロイド状金属組成物および方法
WO2017195906A1 (ja) * 2016-05-13 2017-11-16 株式会社カネカ 植物のゲノム編集方法
US20180186842A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Synthetic Genomics, Inc. High productivity algal mutants having reduced photosynthetic antenna
CN108498460A (zh) * 2017-02-24 2018-09-07 国家纳米科学中心 金纳米簇-脂质体复合颗粒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIZUTA, YOKO ET AL.: "Genome editing of pollen", RESEARCH PRESENTATION RECORD OF THE 82ND ANNUAL MEETING OF THE BOTANICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 82, September 2018 (2018-09-01), pages 256 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020111029A1 (ja) 2021-10-14
JP7416384B2 (ja) 2024-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634722B2 (en) Plant gene editing systems, methods, and compositions
AU2017355507B2 (en) Novel plant cells, plants, and seeds
JP2022130538A (ja) 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
EP3456825A1 (en) Plant genome editing method
JP2022109971A (ja) 細胞および組織への遺伝子編集タンパク質および組成物の、ベクターなしでの送達
WO2016201155A1 (en) Crispr-cas compositions and methods
EP3392339A1 (en) Improved genome editing in plant cells
BRPI1015952B1 (pt) método de introdução de uma nuclease sequência-específica (ssn) em uma célula vegetal
US20230235349A1 (en) Novel maize cells and maize plants
JP2023510744A (ja) 鋳型を用いた編集のためのｄｎａポリメラーゼのリクルート
WO2019238772A1 (en) Polynucleotide constructs and methods of gene editing using cpf1
WO2020111029A1 (ja) ゲノム編集方法
US11976291B2 (en) Genetically enhanced maize plants
WO2020111028A1 (ja) ゲノム編集方法
EP4086353A1 (en) Plant modification method
US11499158B2 (en) Method for modifying plant
CN111979262A (zh) 植物改造
CN112166189A (zh) 植物基因组编辑
WO2023090459A1 (ja) 植物のゲノムを編集する方法、それを用いてゲノム編集された植物体及び植物種子、並びにそれらの製造方法
US20220403401A1 (en) Methods and compositions for altering protein accumulation
US11926835B1 (en) Methods for efficient tomato genome editing
EP4389897A1 (en) Polynucleotide including site-specific nuclease expression cassette
JP2023127794A (ja) 植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法
WO2023141487A1 (en) Improved soybean explant preparation and transformation
JP2024523759A (ja) インテインと融合した転写活性化因子様エフェクター

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19891529

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020557719

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19891529

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1