BRPI1015952B1 - método de introdução de uma nuclease sequência-específica (ssn) em uma célula vegetal - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO DE INTRODUÇÃO DE UMA NUCLEASE SEQUÊNCIA-ESPECÍFICA (SSN) EM UMA CÉLULA VEGETAL (73) Titular: DOW AGROSCIENCES LLC, Sociedade Norte Americana. Endereço: 9330 Zionsville Road, Indianapolis, Indiana 46268, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: JAYAKUMAR SAMUEL; JOSEPH PETOLINO; NARASIMHA SAMBOJU; STEVEN WEBB; KERRM YAU.

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 07/04/2010, observadas as condições legais

Expedida em: 04/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE INTRODUÇÃO DE UMA NUCLEASE SEQUÊNCIA-ESPECÍFICA (SSN) EM UMA CÉLULA VEGETAL.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. 61/167.389 depositado em 7 de abril de 2009.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [002] As propriedades únicas de nanopartículas podem ser exploradas para transportar DNA para células. Entre as nanopartículas investigadas (por exemplo, tungstênio, alumínio, níquel, etc.), Nanopartículas de Ouro (NPO) tendem a ser excelentes candidatas para transporte de DNA. A baixa citotoxicidade e facilidade de funcionalização com vários ligantes de significência biológica tornam nanopartículas de ouro uma escolha preferential para transformação. Nanopartículas de ouro podem variar de tamanho de 1,2 nm-600 nm. A síntese de NPO comumente usada produz uma superfície negativamente carregada (por exemplo, revestimento de citrato) para partículas de 20-400 nm, considerando que faixas menores de 1-10 nm de NPOs são positivamente carregadas. DNA de plasmídeo, que é suficientemente flexível para desenrolar parcialmente suas bases, pode ser exposto a nanopartículas de ouro. No caso da NPO funcionalizada com citrato o DNA de plasmídeo pode desenrolar-se parcialmente. As cargas negativas na cadeia principal de DNA são suficientemente distantes de modo que forças de van der Waals atrativas entre as bases e a nanopartícula de ouro levam DNA de plasmídeo a ligar-se e revestir a superfície da partícula de ouro. Assim, no caso da NPO positivamente carregada, forças eletrostáticas e de van der Waals podem contribuir para revestimento e ligação do DNA.

[003] Além de nanopartículas de metais, nanopartículas semicondutoras (por exemplo, pontos quânticos) (PQs) na faixa de

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2/53 tamanhos de 3-5 nm têm também sido usadas para transportar moléculas para células. DNA e proteínas podem ser revestidos ou ligados à superfície de PQs que é multifuncionalizada com um ligante (ver, por exemplo, Patolsky, F. e colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)). PQs multifuncionalizados com ácido carboxílicos ou aminas podem ser reticulados com moléculas que contêm um grupo tiol (ver, por exemplo, Dubertret B. e colaboradores, Science 298, 1759 (2002); Akerman, M.E., W.C.W. Chan, P. Laakkonen, S.N. Bhatia, E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99,12617 (2002); Mitchell, G.P., C.A. Mirkin, R.L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999)) ou um grupo éster N-hidroxissuccinimila (NHS) usando protocolos padrões de bioconjugação (ver, por exemplo, Pinaud, F. , D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Bruchez, Μ., M. Moronne,

P. Gin, S. Weiss, A.P. Alivisatos, Science 281, 2013 (1998)). Uma maneira alternativa é to multifuncionalizar PQs via conjugação com estreptavidina. A estreptavidina conjuga-se com proteínas biotiniladas, oligos ou anticorpos (ver, por exemplo, Dahan M. e colaboradores, Science 302, 442 (2003); Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Dahan M. e colaboradores, Science 302, 442 (2003); Wu . X. Y. e colaboradores, Nature Biotechnol. 21, 41 (2003); Jaiswal, J.K., H. Mattoussi, J.M. Mauro, S.M. Simon, Nature Biotechnol. 21, 47 (2003); e Mansson, A. e colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 314, 529 (2004).

[004] Nanopartículas têm sido usadas para transportas DNA de plasmídeo para uma variedade de células animais. Verificou-se que quando nanopartículas revestidas com DNA são incubadas com células que não apresentam parede celular, as células capturam as nanopartículas e começam a expressar quaisquer genes codificados no DNA. Onde se deseja transporte de nanopartículas para células que normalmente apresentam parede celular, essa parede celular é

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3/53 removida antes da adição das partículas a protoplastos (ver, Torney, F. e colaboradores, Nature Nanotechnol. 2, (2007). Em células vegetais, a parede celular atua como uma barreira ao transporte de moléculas exogenamente aplicadas. Muitos métodos invasivos, como a pistola gênica (biolística), microinjeção, eletroporação e Agrobacterium, têm sido empregados para obter transporte de genes e de pequenas moléculas para essas células vegetais com parede. Transportar moléculas pequenas e proteínas através da parede celular e para a célula vegetal seria vantajodo para o desenvolvimento de tecnologias mais simples para a manipulação in vitro e in vivo de células, tecidos e órgãos de plantas intactas.

[005] Embora bem estabelecida em bactérias, levedura, células animais e musgo, adição de genes - a introdução de DNA estranho em um local genômico predeterminado - permance um significativo desafio em plantas superiores. Integração transgênica sítio-específica ocorre sob uma frequência muito baixa em células vegetais em comparação com integração Laleatória, mesmo quando o DNA introduzido contém grandes extensões de sequência homóloga à do DNA hospedeiro (Halfter e colaboradores, 1992; Lee e colaboradores, 1990; Mia e Lam (1995)). Por exemplo, um sistema de transfecção baseado em Agrobacterium altamente eficiente e seleção de herbicida resultaram em frequências de direcionamento de genes de até 5x10⁴ em arroz. Tentativas de elevar as eficiências de direcionamento de genes em plantas têm incluído o uso de marcadores de seleção negativos, e o uso de plantas geneticamente engenheiradas para exibir frequências de direcionamento maiores. Esses esforços, no entanto, de integração aleatória de DNA via processos não homólogos continuam a ser o principal impedimento de direcionamento de genes em plantas. Dada a utilidade geral prevista para adição de genes direcionados na modificação de culturas para biotecnologia agrícola e industrial, uma

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4/53 solução para esse problema é simplesmente necessária.

[006] Nesse caso, substancial aumento na frequência de direcionamento de genes em uma ampla faixa de sistemas de modelos vegetais e animais foi observado após a indução de uma ruptura na fita dupla de DNA (RFD) em um local genômico específico em células hospedeiras, o que estimula um reparo por RFD direcionado à homologia por meio de processo celular nativo. Endonucleases que ocorrem naturalmente sítio-específicas cujos sítios de reconhecimento são raros no genoma vegetal têm sido usadas dessa maneira para direcionar integração transgênica em uma sequência-alvo previamente transferida para o genoma vegetal via integração aleatória. Esses estudos ressaltam o potencial de indução de RFD direcionada para estimular direcionamento de genes em células vegetais, embora o desafio de introduzir uma RFD em um local nativo permaneça.

[007] Em células animais, a solução de modulação/manipulação de genoma direcionada é obtida por meio de uma variedade de proteínas de ligação sequência-específica de nucleotídeos tais como zíperes de leucina, proteínas com dedos de zinco, etc.. Essas proteínas são envolvidas com regulação gênica na medida em que fatores de transcrição podem ou não ser usados para induzir RFD em um local genômico nativo. A RFD pode ser proporcionada por diversas classes diferentes de nucleases sequência-específicas tais como meganucleases, zíperes de leucina, proteínas com dedos de zinco, etc. e mais recentemente o desenvolvimento de novas versões quiméricas dessas proteínas. Uma das proteínas de ligação nucleotídeoespecíficas melhor descritas são as Proteínas com Dedos de Zinco (PDZ). O dedo de zinco C2H2 foi descoberto no fator de transcrição anfíbio TFIIIA e verificou-se desde então ser o motivo mais comum de reconhecimento de DNA em todas as espécies de metazoários. A estrutura cristalina por meio de raios X de PDZ C2H2, Zif268, revelou

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5/53 um modo notavelmente silábico de reconhecimento de DNA proteico, com cada dedo de zinco especificando um sub-sítio de 3 ou 4 pb no contexto de uma disposição em tandem e sugerindo a possibilidade de usar esse motivo peptídico como um andaime para domínios de ligação de DNA com novas especificidades. Desde então um grande número de PDZs engenheirados para ligar novas sequências foi usado com êxito em muitos laboratórios diferentes no contexto de fatores de transcrição artificial e outras proteínas quiméricas funcionais. O domínio proteico do dedo de zinco C2H2 foi usado como um andaime para ligação de DNA sequência-específico (Pavelitch e Pabo 1991) e NDZs produzidas mediante fusão de domínios de proteína com dedos de zinco com um domínio de nuclease independente de sequência derivado da endonuclease de restrição Fokl Tipo IIS (Kim e colaboradores, 1996). NDZs engenheiradas foram usadas para direcionamento de alta eficiência em um local genômico endógeno em células humanas transformadas (Moehle e colaboradores, 2007) e células humanas primárias (Lombardo e colaboradores, 2007).

[008] Tentativas iniciais de usar NDZs em plantas têm sido promissoras (Lloyd e colaboradores, 2005; Wright e colaboradores, 2005; Maeder e colaboradores, 2008). Um constructo que transporta um gene para NDZ sob o controle de um promotor indutível juntamente com sua sequência de reconhecimento correspondente mostrou-se estavelmente integrado em Arabidopsis e revelou introduzir mutações direcionadas resultantes de uma extremidade não homóloga que se liga ao sítio de reconhecimento sob uma média de frequências de 7,9% entre mudas de progênie induzidas (Lloyd e colaboradores, 2005). Similarmente, entre 66 plantas de tabaco regeneradas de protoplastos transformados com uma NDZ projetada para clivar no local SuRA, três apresentaram supressões de pares de bases simples no sítio-alvo resultantes de reparo de ligação na extremidade não-homóloga (Maeder

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6/53 e colaboradores, 2008). Células de tabaco, contendo um gene repórter não-funcional pré-integrado em que faltam 600 pb que flanqueiam diretamente uma sequência de reconhecimento de dedo de zinco, quando cotransformada com constructos que contêm um gene correspondente para NDZ e DNA doador homólogo à sequência préintegrada que compreende as 600 pb faltantes, mostrou evidência de reparo direcionado a homologia do gene repórter (Wright e colaboradores, 2005). Mais recentemente, ensaio baseado em levedura foi utilizado para identificar NDZs capazes de clivar um gene para endoquitinase de planta (Cai e colaboradores, 2009). Transporte de um plasmídeo Ti por Agrobacterium abrigando tanto as NDZs quanto um constructo de DNA doador que compreende um cassete de gene de resistência a herbicida pat flanqueado por extensões curtas de homologia do local de endoquitinase produziu até 10% de integração transgênica direcionada voltada para homologia precisamente no sítio de divagem de NDZ. É importante observar que outros projetos de dedo de zinco baseados em um projeto de C3H1 foram demonstrados em plantas (Shukla e colaboradores, 2009, Cai e colaboradores, 2009). [009] A presente invenção refere-se a métodos que usam nanopartículas para transportar não invasivamente nucleases sequência-específicas a células vegetais que apresentam uma parede celular.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0010] As modalidades seguintes são descritas em conjunto com sistemas, ferramentas e métodos que se destinam a serem exemplares e ilustrativos e não limitativos em escopo.

[0011] De acordo com a invenção, são proporcionados métodos de introdução de uma nuclease sequência-específica em uma célula vegetal, métodos estes que compreendem: proporcionar a célula vegetal que apresenta uma parede celular; revestir uma nanopartícula

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7/53 com pelo menos uma nuclease sequência-específica; colocar a célula vegetal que apresenta parede celular e a nanopartícula revestida com nuclease sequência-específica em contato uma com a outra; e permitir absorção da nanopartícula revestida com nuclease sequênciaespecífica na célula vegetal que compreende uma parede celular. [0012] Além dos aspectos exemplares e modalidades descritas acima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão evidentes em vista das descrições seguintes.

DESCRIÇÃO CONCISA DOS DESENHOS [0013] As figuras 1 e 2 mostram expressão de NDZ-ILI Fokl com abas de histidina (1) e sem abas de histidina (2) em E.coli, respectivamente.

[0014] A figura 3 mostra recombinação homóloga intercromossômica estimulada por proteína de fusão Fokl com dedos de zinco IL-1; com A representando o vetor-alvo e B representando recombinante com gene para PFV reconstituída.

[0015] A figura 4 mostra uma representação esquemática de plasmídeo pD AB 1585.

[0016] A figura 5 mostra linhagens de células únicas BY2-E que exibem internaiização de YFP mediada por NPO 2 horas após incubação das células; Painel A (FITO), B (Rhodamine), C (DIC), D (A+B), E (A+B+C), F (Imagem de refletância invertida): internai ização de YFP como observado por meio de microscopia de fluorescência. [0017] A figura 6 mostra recombinação homóloga intercromossômica estimulada por proteína l-Scel de meganuclease; com A representando o vetor-alvo e B representando recombinante com gene para PFV reconstituída.

[0018] A figura 7 mostra uma representação esquemática de plasmídeo pD AB 100375.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

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8/53 [0019] Na descrição e tabelas que seguem, são usados vários termos. A fim de proporcionar uma compreensão clara e consistente do relatório e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as seguintes definições são proporcionadas:

[0020] Retrocruzamento. Retrocruzamento pode ser um processo em que um criador cruza repetidamente uma progênie híbrida com um dos pais, por exemplo, uma primeira geração Fi híbrida com um dos genótipos paternos do Fi híbrido.

[0021] Embriões. O embrião poderá ser a planta pequena contida em uma semente madura.

[0022] Nanopartícula. Uma partícula microscópica com pelo menos uma dimensão de nanoescala, usualmente menor que 100 nm. Nanopartículas adequadas para uso na presente invenção poderão apresentar um tamanho de 1 nm - 0,4 um. Um ponto quântico poderá apresentar um diâmetro médio de 1 nm -10 nm, preferencialmente 2-4 nm. Nanopartículas como usadas no presente pedido incluem, mas sem limitar-se aos mesmos, nanopartículas de ouro, nanopartículas de tungstênio, nanopartículas revestidas com ouro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de gelatina, nanocascas, nanonúcleos, nanoesferas, nanobastões, nanopartículas magnéticas, nanopartículas semicondutoras, pontos quânticos, nanomatrizes, nanomatrizes dendriméricas e combinações destes.

[0023] Ponto quântico. Um ponto quântico é uma nanopartícula semicondutora que confina o movimento de elétrons na banda de condução, buracos na banda de valências ou excitações (pares ligados de elétrons na banda de condução e buracos na banda de valências) em todas as três direções espaciais. O confinamento pode ser devido a potenciais eletrostáticos (gerados por eletrodos externos, dopagem, tensão, impurezas), à presença de uma interface entre diferentes

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9/53 materiais semicondutores (por exemplo, em sistemas de nanocristais com núcleo-casca), à presença da superfície semicondutora (por exemplo, nanocristal semicondutor) ou uma combinação destes. Um ponto quântico pode apresentar um espectro de energia quantizada discreto. As funções de onda correspondentes são espacialmente localizadas no ponto quântico, mas se estendem por muitos períodos da rede cristalina. Um ponto quântico contém um pequeno número finito (da ordem de 1-100) de elétrons na banda de condução, buracos na banda de valências ou excitações (isto é, um número finito de cargas elétricas elementares).

[0024] Nanomatrizes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, dendrímeros. Dendrímeros são nanopartículas esferoides ou globulares que são engenheiradas para transportar moléculas encapsuladas em seus espaços vazios internos ou ligadas à superfície. As moléculas são moléculas repetidamente ramificadas; a ramificação permite interações polivalentes entre a superfície e materiais a granel. Um exemplo de um dendrímero são os polímeros em cascata de poliamidoamina catiônica esférica (PAMAM). Esses polímeros consistem em aminas primárias na superfície e aminas terciárias no interior. Esse tipo de dendrímero é parcialmente degradado por tratamento térmico em solventes solvolíticos, resultando desse modo em menos restrição estérica e maior flexibilidade. A carga altamente positiva do dendrímero facilita interações eletrostáticas com DNA, e a estrutura flexível permite que o dendrímero compacte quando ligado a DNA e intumesça quando liberado do DNA. A eficiência de transfecção ou transformação aumenta como resultado da carga positiva e da propriedade estrutural flexível do dendrímero. Dendrímeros podem ser obtidos da Qiagen (Qiagen, Germantown, MD); os dendrímeros são comercializados para o público como Superfect™ Transfection Reagent (N° de Cat. 301305).

[0025] Multifuncionalizado. A não ser que especificado de outro

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10/53 modo, o termo multifuncionalizado será usado para descrever nanopartículas mono ou multifuncionalizadas. Partículas monofuncionalizadas devem referir-se a nanopartículas funcionalizadas ou aglomerações de nanopartículas em que grupos funcionais de um único tipo foram quimicamente ligados. Partículas multifuncionalizadas devem referir-se a nanopartículas ou aglomerações de nanopartículas em que pelo menos dois, e talvez três ou mais, tipos diferentes de grupos funcionais foram quimicamente ligados.

[0026] Resistente a Herbicida. Resistência a uma dosagem de herbicida refere-se à capacidade de uma planta sobreviver (isto é, a planta poderá não ser morta) a essa dosagem de um ingrediente ativo que inibiría crescimento e/ou resultaria em sobrevivência da planta não resistente. Em alguns casos, plantas tolerantes poderão temporariamente amarelecer ou então exibir algum dano induzido por herbicida (por exemplo, excessivo afilhamento e/ou inibição de crescimento), mas recuperar-se.

[0027] Estabilizado. Estabilizado refere-se a características de uma planta que são reproduzí vel mente passadas de uma geração à geração seguinte de plantas puras da mesma variedade.

[0028] Absorção. Absorção refere-se à translocação de uma partícula ou matrizes, tal como uma nanopartícula, por exemplo, ouro, dendrímeros ou pontos quânticos, através de uma parede celular ou uma membrana celular, em que a translocação não ocorre somente como resultado de momentum conferido à partícula por algo diferente da célula em que a partícula é está sendo absorvida. Exemplos não limitativos de dispositivos ou métodos que produzem translocação de uma partícula através de uma parede celular ou uma membrana celular apenas como resultado de momentum conferido à partícula são biolística, pistola gênica, microinjeção e/ou tecnologias de impalefecção.

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11/53 [0029] Ácido nucléico. Os termos ácido nucléico, polinucleotídeo e oligonucleotídeo são usados sinonimicamente e referem-se a um polímero de desoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo ou outro nucleotídeo ou nucleoside, em conformação linear ou circular, e em forma ou de fita simples ou de fita dupla. Para os fins da presente descrição, esses termos não devem ser considerados limitativos com relação ao comprimento de um polímero. Os termos poderão abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modificados nas porções base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, cadeias principais de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo particular tem a mesma especificidade de emparelhamento de bases; isto é, um análogo de A emparelhará como base com T.

[0030] Cromossomo. Um cromossomo é um complex de cromatinas que compreende todo ou uma porção do genoma de uma célula. O genoma de uma célula caracteriza-se frequentemente por seu cariótipo, que é a coleção de todos os cromossomos que compreendem o genoma da célula. O genoma de uma célula pode compreender um ou mais cromossomos. Um epissomo é um ácido nucléico replicante, um complexo de nucleoproteína ou outra estrutura que compreende um ácido nucléico que não é parte do cariótipo cromossômico de uma célula. Exemplos de epissomos incluem plasmídeos e certos genomas virais. Uma região acessível é um sítio em cromatina celular em que um sítio-alvo presente no ácido nucléico pode ser ligado por uma molécula exógena que reconhece o sítio-alvo. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita-se que uma região acessível é uma região que não é acondicionada em uma estrutura nucleossômica. A estrutura distinta de uma região acessível poderá com frequência ser detectada por sua sensibilidade a sondas químicas e enzimáticas, por exemplo, nucleases. Um sítio-alvo ou sequênciaPetição 870180127962, de 10/09/2018, pág. 18/68

12/53 alvo é uma sequência de ácidos nucleicos que define uma porção de um ácido nucléico ao qual uma molécula de ligação se ligará, contanto que existam condições suficientes para a ligação. Por exemplo, a sequência 5-GAATTC-3' é um sítio-alvo para a endonuclease de restrição Eco RI.

[0031] Gene. Um gene, para os fins da presente descrição, inclui uma região de DNA que codifica um produto genético, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto genético, quer ou não essas sequências reguladoras sejam adjacentes para codificar e/ou transcrever sequências. Consequentemente, um gene inclui, mas não é necessariamente limitado aos mesmos, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras de tradução tais como sítios de ligação a ribossomos e sítios internos de entrada de ribossomos, intensificadores, silenciadores, isoladores, elementos de contorno, origens de replicação, sítios de ligação a matrizes e regiões de controle de localização.

[0032] Expressão. Os termos expressão ou expressão de genes são usados como sinônimos e referem-se à conversão da informação contida em um gene em um produto genético. Um produto genético pode ser o produto de transcrição direta de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um mRNA. Produtos genéticos também incluem RNAs que são modificados por processos tais como remate, poliadenilação, metilação e edição, e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, ADP-ribosilação, miristilação e glicosilação. Modulação de expressão gênica refere-se a uma mudança na atividade de um gene. Modulação de expressão poderá incluir, mas sem limitação às mesmas, ativação genética e repressão genética.

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13/53 [0033] Proteína. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados sinonimicamente para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácido. O termo também se aplica a polímeros de aminoácidos em que um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de aminoácidos correspondentes que ocorrem naturalmente.

[0034] Sequência. O termo sequência refere-se a uma sequência de nucleotídeos de qualquer comprimento, que poderá ser DNA ou RNA, poderá ser linear, circular ou ramificada e poderá ser de fita simples ou fita dupla. O termo sequência doadora refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é introduzida em um genoma. Uma sequência doadora pode ser de qualquer comprimento, por exemplo, entre 2 e 25.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer valor inteiro entre os mesmos ou acima destes), preferencial mente entre cerca de 100 e 5.000 nucleotídeos de comprimento (ou qualquer número inteiro entre eles), mais preferencialmente entre cerca de 200 e 2.500 nucleotídeos de comprimento.

[0035] Sequência homóloga. Sequência homóloga refere-se a uma primeira sequência que compartilha um grau de identidade de sequências com uma segunda sequência, e cuja sequência poderá ser idêntica àquela da segunda sequência. Uma sequência homóloga não idêntica refere-se a uma primeira sequência que compartilha um grau de identidade de sequências com uma segunda sequência, mas cuja sequência não é idêntica àquela da segunda sequência. Por exemplo, um polinucleotídeo que compreende a sequência do tipo selvagem de um gene mutante é homólogo e não idêntico à sequência do gene mutante. Em certas modalidades, o grau de homologia entre as duas sequências é suficiente para permitir recombinação homóloga entre elas, utilizando mecanismos celulares normais. As duas sequências homólogas não idênticas poderão ter qualquer comprimento e seu grau

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14/53 de não-homologia poderá ser tão pequeno quanto um único nucleotídeo (por exemplo, para correção de uma mutação genômica pontual por recombinação homóloga direcionada) ou tão grande quanto 10 ou mais quilobases (por exemplo, para inserção de um gene em um sítio predeterminado em um cromossomo). Dois polinucleotídeos que compreendem as sequências homólogas não idênticas não precisam ser do mesmo comprimento. Por exemplo, um polinucleotídeo exógeno (isto é, polinucleotídeo doador) entre 20 e 10.000 nucleotídeos ou pares de nucleotídeos poderão ser usados.

[0036] Recombinação. Recombinação refere-se a um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos. Para os fins desta descrição, recombinação homóloga (RH) refere-se à forma especializada dessa troca ocorrer, por exemplo, durante reparo de rupturas da fita dupla em células. Esse processo requer homologia de sequências de nucleotídeos, usa uma molécula doadora para padronizar o reparo de uma molécula alvo (isto é, aquela que experimentou a ruptura da fita dupla) e é diversamente conhecida como conversão genética não cruzada ou conversão genética de curto trato, porque leva à transferência de informação genética do doador para o alvo. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, tal transferência poderá envolver correção de incompatibilidade de DNA heteroduplex que se forma entre o alvo rompido e o doador, e/ou recozimento de fita dependente de síntese (RFDS), em que o doador é usado para ressintetizar informação genética que se tornará parte do alvo, e/ou processos correlatos. Essa RH especializada frequentemente resulta em uma alteração da sequência da molécula-alvo tal que parte ou toda a sequência do polinucleotídeo doador é incorporada ao polinucleotídeo-alvo.

[0037] Clivagem. Clivagem, indução de uma ruptura de fita dupla e corte são usados de maneira intercambiável e referem-se à ruptura

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15/53 da cadeia principal covalente de uma molécula de DNA. Clivagem poderá ser iniciada por vários métodos, incluindo, mas sem se limitarás mesmas, hidrólise enzimática ou química de uma ligação fosfodiéster. Tanto a clivagem de fita simples como a clivagem de fita dupla são possíveis, e a clivagem de fita dupla poderá ocorrer como resultado de dois eventos distintos de clivagem de fita simples. Clivagem de DNA poderá resultar na produção de extremidades embotadas ou extremidades em ziguezague. Em certas modalidades, polipeptídeos de fusão são usados para clivagem direcionada de DNA de fita dupla. Um domínio de clivagem compreende uma ou mais sequências de polipeptídeos que possuem atividade catalítica para clivagem de DNA. Um domínio de clivagem poderá estar contido em uma única cadeia polipeptídica, ou atividade de clivagem poderá resultar da associação de dois (ou mais) polipeptídeos. Um meio-domínio de clivagem é uma sequência de polipeptídeos que, em conjunto com um segundo polipeptídeo (quer idêntico ou diferente), forma um complexo que apresenta atividade de clivagem (preferencialmente atividade de clivagem de fita dupla). Ruptura de fita dupla e clivagem de fita dupla são usadas de sinonimicamente.

[0038] Cromatina. Cromatina é a estrutura de nucleoproteína que compreende o genoma celular. Cromatina celular compreende ácido nucléico, principal mente DNA, e proteína, incluindo histonas e proteínas cromossômicas não-histônicas. A maioria das cromatinas celulares eucarióticas existe na forma de nucleossomos, onde o núcleo dos nucleossomos compreende aproximadamente 150 pares de bases de DNA associado a um octâmero que compreende duas de uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4; e DNA ligante (de comprimento variável dependendo do organismo) estende-se entre núcleos nucleossômicos. Uma molécula de histona HZ é geralmente associada ao DNA ligante. Para os fins da presente descrição, entende-se que o termo cromatina

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16/53 abrange todos os tipos de nucleoproteína celular, tanto procarióticas como eucarióticas. Cromatina celular inclui tanto cromatina cromossômica quanto cromatina epissômica.

[0039] Ligação. Ligação refere-se a uma interação não covalente sequência-específica entre macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação precisam ser sequência-específicos (por exemplo, contatos com resíduos de fosfato em uma cadeia principal de DNA), contanto que a interação como um todo seja sequência-específica. Tais interações são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (Kd) de 10 ⁶M¹ ou menos. Afinidade refere-se à força de ligação: aumento de afinidade de ligação sendo correlacionado com IQ menor.

[0040] Ligação operativa. Os termos ligação operativa e operativamente ligado (ou operavelmente ligado) são usados de forma sinonímica com referência a uma justaposição de dois ou mais componentes (tais como elementos de sequências), em que os componentes são dispostos tal que ambos os componentes funcionem normalmente e permitam a possibilidade de que pelo menos um dos componentes possa mediar uma função que é exercida sobre pelo menos um dos outros componentes. À guisa de ilustração, uma sequência reguladora de transcrição, tal como um promotor, é operativamente ligada a uma sequência codificadora se a sequência reguladora de transcrição controla o nível de transcrição da sequência codificadora em resposta à presença ou ausência de um ou mais fatores reguladores de transcrição. A sequência reguladora de transcrição é em geral operativamente ligada a uma sequência codificadora, mas não precisa ser diretamente adjacente a ela. Por exemplo, um intensificador é uma sequência reguladora de transcrição que é operativamente ligada a uma sequência codificadora, ainda que não sejam contíguas. Com

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17/53 relação a polipeptídeos de fusão, o termo operativamente ligado pode referir-se ao fato de que cada um dos componentes realiza a mesma função na ligação com o outro componente como ocorreria se não estivesse ligado desse modo. Por exemplo, com relação a um polipeptídeo de fusão em que um domínio de ligação de DNA de PDZ é fundido com um domínio de clivagem, o domínio de ligação de DNA de PDZ e o domínio de clivagem estão em ligação operativa se, no polipeptídeo de fusão, a porção domínio de ligação de DNA de PDZ é capaz de ligar-se a seu sítio-alvo e/ou seu sítio de ligação, enquanto o domínio de clivagem é capaz de clivar DNA na vizinhança do sítio-alvo. [0041] Nuclease sequência-específica (SSN) - Inclui diversas classes de proteínas bifuncionais que são capazes de reconhecer sequências de nucleotídeos específicas e únicas (sítios de reconhecimento nativos ou personalizados) tais como, mas sem se limitar aos mesmos, meganucleases, zíperes de leucina e proteínas com dedos de zinco. Meganucleases representam uma família de enzimas que podem clivar DNA de fita dupla com alta especificidade na presença de íons de metais divalentes (Ca, Mn, Mg). Entretanto, elas diferem de endonucleases de restrição em suas propriedades e estruturas de reconhede reconhecimento (Belfort, M., Roberts, RJ. Homing endonucleases: keeping the house in order, Nucleic Acid Research 1997, 25: 3379-3388). Em particular, onde enzimas de restrição reconhecem sequências curtas de ácidos nucleicos (3-8 pb), meganucleases reconhecem sequências mais longas (12-40 pb) - o que proporciona melhoramento de especificidade ao direcionamento de RFD. (Mueller, JE, Bryk, M. Loizos, N. Belfort M. Homing endonucleases. In Nucleases 2^a Edição. Linn, SM, Lloyd, RS, Roberts, RJ (Eds) Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1993 111-143.). Zíperes de leucina - são uma classe de proteínas que são envolvidas em interações proteína-proteína em muitas proteínas reguladoras

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18/53 eucarióticas que são importantes fatores de transcrição associados a expressão genética. O zíper de leucina refere-se a um motivo estrutural comum compartilhado nesses fatores de transcrição através de diversos reinos, incluindo animais, plantas, leveduras, etc. O zíper de leucina é formado por dois polipeptídeos (homodímero ou heterodímero) que se ligam a sequências de DNA específicas de uma maneira em que os resíduos de leucina são uniformemente espaçados através de uma ahélice, tal que os resíduos de leucina dos dois polipeptídeos terminem na mesma face da hélice.

[0042] Proteína de ligação de DNA com dedos de zinco. Uma proteína de ligação de DNA com dedos de zinco, PDZ, (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio em uma proteína maior, que se liga a DNA de uma maneira especifica a sequência por meio de um ou mais dedos de zinco, que são regiões de sequência de aminoácidos no domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada por meio de coordenação de um íon zinco. O termo proteína de ligação de DNA com dedos de zinco é frequentemente abreviado como proteína com dedos de zinco ou PDZ. Domínios de ligação de dedos de zinco podem ser engenheirados para ligar-se a uma sequência de nucleotídeos predeterminada. Exemplos não limitativos de métodos para engenheirar proteínas com dedos de zinco são projeto e seleção. Uma proteína com dedos de zinco projetada é uma proteína que não ocorre na natureza cujo projeto/composição resulta principal mente de critérios racionais. Critérios racionais para projeto incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informação em um banco de dados que armazena informação de projetos e dados de ligação de PDZ existentes. Ver, por exemplo, Patentes U.S. 6.140.081, 6.453.242, 6.534.261 e 6.785.613; ver, também. WO 98153058, WO 98153059, WO 98153060, WO 021016536 e WO 031016496, e Patentes U.S. 6.746.838, 6.866.997 e 7.030.215.

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19/53 [0043] Sequência genômica. Sequências genômicas incluem aquelas presentes em cromossomos, epissomos, genomas organelares (por exemplo, mitocôndrias, cloroplastos), cromossomos artificiais e qualquer outro tipo de ácido nucleico presente em uma célula tais como, por exemplo, sequências amplificadas de cromossomos duplos muito pequenos e os genomas de bactérias e vírus endógenos ou infectantes. Sequências genômicas poderão ser normais (isto é, de tipo selvagem) ou mutantes; sequências mutantes poderão compreender, por exemplo, inserções, supressões, translocações, 25 rearranjos e/ou mutações pontuais. Uma sequência genômica poderá também compreender um de vários alelos diferentes.

[0044] Células vegetais. Células vegetais incluem, mas sem se limitar aos mesmos, células de plantas monocotiledôneas (monocots) ou dicotiledôneas (dicots) ou algas ou musgos. Exemplos não limitativos de monocots incluem cereais tais como milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, sugarmaye, abacaxi, cebola, banana e coco. Exemplos não limitativos de dicots incluem tabaco, tomate, girassol, algodão, beterraba sacarina, batata, alface, melão, soja, mayola (colza) e alfalfa. Células vegetais poderão ser de qualquer parte da planta e/ou de qualquer estágio de desenvolvimento da planta.

[0045] Região de interesse. Uma região de interesse é qualquer região de polímero de ácidos nucleicos, tal como, por exemplo, um gene ou uma sequência não codificadora em ou adjacente a um gene, à qual é desejável ligar uma molécula exógena. Ligação poderá ser efetuada para fins de divagem de DNA direcionada e/ou recombinação direcionada. Uma região de interesse pode estar presente em um cromossomo, um epissomo, um genoma organelar (por exemplo, mitocondrial, de cloroplasto), plasmídeo, um genoma viral infectante ou qualquer outra sequência de nucleotídeos, por exemplo. Uma região de interesse poderá estar na região codificadora de um gene, em regiões

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20/53 não codificadoras transcritas tais como, por exemplo, sequências condutoras, sequências-reboque ou íntrons, ou em regiões não-transcritas, seja a montante ou a jusante da região codificadora. Uma região de interesse poderá ser tão pequena quanto um único par de nucleotídeos ou apresentar até 25.000 pares de nucleotídeos de comprimento, ou qualquer valor integral de pares de nucleotídeos. [0046] De acordo com modalidades da invenção, pode ser proporcionado um método de introdução de uma nuclease sequênciaespecífica em uma célula vegetal que compreende uma parede celular, esse método compreendendo colocar uma nanopartícula revestida com nuclease sequência-específica em contato com a célula vegetal e permitir absorção através da parede celular da planta. Em aspectos particulares da invenção, a nanopartícula poderá ser qualquer nanopartícula e poderá reversível ou irreversível mente conter, ser revestida com ou então ser ligada a e/ou transportar uma nuclease com dedos de zinco, e/ou uma meganuclease. Em certas modalidades, uma nuclease com dedos de zinco poderá ser introduzida nas nanopartículas antes de contato com uma célula vegetal que apresenta uma parede celular ou concorrentemente com a introdução da nanopartícula em uma célula vegetal que apresenta uma parede celular. Exemplos de nanopartículas que podem ser usadas em modalidades da present invenção incluem, mas sem se limitar aos mesmos, ouro, pontos quânticos, nanopartículas revestidas com ouro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de tungstênio, nanopartículas de gelatina, nanocascas, nanonúcleos, nanoesferas, nanobastões, nanopartículas magnéticas, nanopartículas semicondutoras, pontos quânticos, nanomatrizes, dendrímeros e/ou combinações destes.

[0047] De acordo com modalidades da present invenção, uma célula vegetal que apresenta uma parede celular poderá ser qualquer

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21/53 célula vegetal que compreende uma parede celular intacta e inteira. Modalidades da invenção poderão incluir células que compreendem uma parede celular de qualquer tecido ou onde quer que sejam encontradas, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, em embriões, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas das raízes, flores, sementes, vagens, caules, culturas em suspensão e cultura de tecidos.

[0048] Em modalidades particulares da invenção, uma SSN poderá ser qualquer NDZ que pode ser transportada para uma célula vegetal de acordo com a presente invenção. Por exemplo, NDZs poderão compreender proteínas de fusão que compreendem um domínio de divagem (ou um meio-domínio de divagem) e um domínio de ligação de dedos de zinco, polinucleotídeos que codificam essas proteínas e combinações de polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam polipeptídeos. Um domínio de ligação de dedos de zinco poderá compreender um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco), e poderá ser engenheirado para ligar-se a qualquer região de interesse. Assim, ao identificar uma região de interesse alvo em que se deseja divagem ou recombinação, pode-se, de acordo com os métodos descritos aqui, construir uma ou mais proteínas de fusão compreendendo um domínio de divagem (ou meiodomínio de divagem) e um domínio de dedos de zinco engenheirados para reconhecer uma sequência-alvo nessa região de interesse. A presença de tal proteína (ou proteínas) de fusão em uma célula resultará em ligação da(s) proteína(s) de fusão a seu(s) sftio(s) de ligação e divagem em ou próxima dessa região de interesse. Além disso, se um polinucleotídeo homólogo exógeno à região de interesse está também presente nessa célula, recombinação homóloga ocorre a uma alta taxa entre a sequência de nucleotídeos com ruptura na fita dupla e o polinucleotídeo exógeno.

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22/53 [0049] Em modalidades particulares, proporcionar pelo menos uma SSN a uma célula pode compreende fornecer diretamente uma ou cópias de uma proteína SSN à célula por meio de uma nanopartícula. Em outras modalidades, proporcionar pelo menos uma SSN a uma célula pode compreenderfornecerà célula uma nanopartícula que inclui um ácido nucleico que codifica a SSN e permite que a célula produza a SSN a partir do ácido nucleico que a codifica.

[0050] Em outras modalidades, uma ou mais SSNs proporcionadas à célula são capazes de clivar, individualmente ou em conjunto com outras SSNs, em ou próximo de uma ou mais regiões de interesse. Em modalidades particulares, uma ou mais regiões de interesse poderão estar na sequência codificadora de uma proteína proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em algumas modalidades, uma ou mais regiões de interesse poderão estar perto e/ou em um local que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em outras modalidades, uma sequência de nucleotídeos poderá ser ruptura de fita dupla em uma única região de interesse. Em modalidades adicionais, uma sequência de nucleotídeos poderá ser ruptura de fita dupla em duas ou mais regiões de interesse. Em modalidades particulares, uma ou mais das rupturas de fitas duplas poderão localizar-se na sequência codificadora de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em outras modalidades, uma ou mais das rupturas de fitas duplas poderão estar próximas e/ou em um local que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa.

[0051] Em uma modalidade particular em que pelo menos duas rupturas de fitas duplas são produzidas, reparo das rupturas de fitas

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23/53 duplas poderá compreender remover o material entre as rupturas de fitas duplas e reunir as extremidades da sequência de nucleotídeos de modo a excisar as sequências entre as rupturas de fitas duplas. Em modalidades, as sequências excisadas podem, sem limitação, compreender sequências que codificam toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em modalidades adicionais, as sequências excisadas podem, sem limitação, compreender sequências reguladoras que efetuam a expressão de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em tais modalidades, a expressão da proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa é reduzida em relação a níveis de expressão anteriores à divagem.

[0052] Em modalidades alternativas em que pelo menos duas rupturas de fitas duplas são produzidas, reparo das rupturas de fitas duplas poderá compreender remover o material entre as rupturas de fitas duplas, substituindo-o por uma sequência doadora de modo a substituir as sequências entre as rupturas de fitas duplas com a sequência doadora. Em outras modalidades, as sequências removidas poderão, sem limitação, compreender sequências que codificam toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em modalidades adicionais, as sequências removidas poderão, sem limitação, compreender sequências reguladoras que efetuam a expressão de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em tais modalidades, a expressão da proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa é reduzida em relação a níveis de expressão anteriores à divagem.

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24/53 [0053] Em modalidades em que uma ruptura de fita dupla é produzida, reparo da ruptura de fita dupla poderá compreender inserir uma sequência doadora em ou através da ruptura de fita dupla. Em certas modalidades, a sequência doadora poderá ser inserida na sequência codificadora de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em modalidades, a inserção dessa sequência poderá romper a transcrição da sequência codificadora de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa pela presença, à guisa de exemplo não-limitativo, de um códon de parada na estrutura (in-frame). Em modalidades adicionais o doador poderá, sem limitação, romper a função de sequências reguladoras que efetuam a expressão de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa. Em modalidades, a expressão de uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa é reduzida em relação a níveis de expressão anteriores à divagem.

[0054] Em outras modalidades ainda, a sequência doadora pode codificar uma proteína de interesse. Em modalidades adicionais, expressão da proteína de interesse a partir da sequência doadora poderá ser controlada, regulada por ou operativamente ligada a sequências reguladoras presentes na sequência doadora e/ou sequências reguladoras presentes na sequência em que a sequência doadora foi introduzida. Em modalidades adicionais, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de interesse poderá ser fornecida à célula separada ou em conjunto com a sequência doadora. Em algumas modalidades, a sequência doadora poderá estar contida na mesma molécula de ácido nucleico que a sequência que codifica uma proteína de interesse.

[0055] Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos que

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25/53 codifica uma sequência de nucleotídeos de proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa que codifica uma proteína altamente, mais altamente, muito altamente ou ainda mais altamente expressa poderá localizar-se em, à guisa de exemplo não-limitativo, um genoma, um plasmídeo, um cosmídeo, cromossomo artificial, epissomo ou outra estrutura nucleotídica na célula.

[0056] Prática dos métodos, bem como preparação e uso das composições descritas aqui, empregam, a não ser que indicado de outra maneira, técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, estrutura e análise de cromatina, química computacional, cultura de células, DNA recombinante e campos afins como estão dentro da capacidade do estado da técnica. Essas técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook e colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL, Segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e Terceira edição, 2001; Ausubel e colaboradores, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1987, e atualizações periódicas; a série METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego-, Wolffe, CHROMATIN ESTRUTURA AND FUNCTION, Terceira edição, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin (P.M. Wassarman e A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Transporte de Ácido Nucléico a Células de Planta [0057] Como observado acima, constructos de DNA poderão ser introduzidos em (por exemplo, no genoma de) uma planta hospedeira desejada por meio de uma variedade de técnicas convencionais. Para revisões de tais técnicas ver, por exemplo, Weissbach & Weissbach,

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Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, NI), Seção VIII, pp. 42 1-463; e Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2^a Ed.), Blackie, Londres, Cap. 7-9.

[0058] Por exemplo, o constructo de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células vegetais, ou os constructos de DNA poderão ser introduzidos diretamente no tecido vegetal usando métodos biolísticos, tal como bombardeio de partículas em DNA (ver, por exemplo, Klein e colaboradores (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, os constructos de DNA poderão ser combinados com regiões adequadas de flanqueamento de T-DNA e introduzidos em um vetor hospedeiro convencional Agrobacterium tumefaciens. Técnicas de transfecção mediada por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarme e uso de vetores binários, são perfeitamente descritos na literatura científica. Ver, por exemplo, Horsch e colaboradores (1984) Science 233:496-498, e Fraley e colaboradores (1983) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80:4803.

[0059] Além disso, transferência de genes pode ser obtida usando bactérias ou vírus não-Agrobacterium tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico da veia de mandioca e/ou vírus do mosaico do tabaco. Ver, por exemplo, Chung e colaboradores (2006) Trends Plant Sei. 1 1(1): 1-4.

[0060] Ademais, peptídeos de penetração na célula fundidos com uma nanopartícula ou nuclease sequência-específica podem ser usados para transportar sequências de nucleotídeos ou de proteínas para uma célula vegetal. O peptídeo de penetração na célula pode ser expresso, isolado e funcionalizado com uma nanopartícula, sequência de nucleotídeos ou proteína para transporte para células vegetais. Peptídeos de penetração na célula capazes de transportar

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27/53 funcionalmente moléculas para células vegetais são conhecidos no estado da técnica e podem incluir, mas não se limitam aos mesmos: TAT (Chugh e colaboradores, (2008) FEBS 275:2403-2414); R9 (Chang e colaboradores (2005) Plant Cell Physiol 46(3): 482-488 e Chen e colaboradores (2007) FEBS Lett 581(9): 1891-1897); MPG (Ziegler e colaboradores (2008) Adv Drug Deliver Rev 6: 580-597 e Morris e colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2730-2736); PEPI (Henriques e colaboradores (2005) Biochemistry-US 44(3): 10189 10198); e peptídeos de penetração na célula derivados de plantas. [0061] As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens dirigirão a inserção do constructo e marcador adjacente no DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pelas bactérias que usam vetor binário T DNA (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) ou o procedimento de cocultivo (Horsch e colaboradores (1985) Science 227:1229-1231). Geralmente, o sistema de transfecção por Agrobacterium é usado para engenheirar plantas dicotiledôneas: Bevan e colaboradores (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers e colaboradores (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). O sistema de transfecção por Agrobacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir, DNA para plantas monocotiledôneas e células vegetais. Ver Patente U.S. No. 5.591.616; Hemalsteen e colaboradores (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren e colaboradores (1984) Nature 311 : 763-764; Grimsley e colaboradores (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton e colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12:3 1-40; e Gould e colaboradores (1991) Plant Physiol. 95:426-434.

[0062] Métodos alternativos de transferência e transfecção de genes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, transfecção de protoplastos por absorção de DNA nu mediada por cálcio, polietilenoglicol (PEG) ou eletroporação (ver Paszkowski e

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28/53 colaboradores (1984) EMBO / 3:2717-2722, Potrykus e colaboradores (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; From e colaboradores (1985) Proc. Nat. Acad. ScL USA 82: 5824-5828; e Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276), e eletroporação de tecidos vegetais (D'Halluin e colaboradores (1992) Plant Cell 4: 1495- 1505). Métodos adicionais para transfecção de células vegetais incluem microinjeção, absorção de DNA mediada por carbeto de silício (Kaeppler e colaboradores (1990) Plant Cell Repórter 9:415-418) e bombardeio de microprojéteis (ver Klein e colaboradores (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85:4305-4309; e Gordon-Kim e colaboradores (1990) Plant Cell2\ 603-618).

[0063] Os métodos e composições descritos podem ser usados para inserir sequências exógenas em um local predeterminado no genoma de uma célula vegetal. Isso é útil na medida em que expressão de um transgene introduzido em um genoma vegetal depende criticamente de seu sítio de integração. Consequentemente, genes que codificam, por exemplo, nutrientes, antibióticos ou moléculas terapêuticas poderão ser inseridos, por recombinação direcionada, em regiões de um genoma vegetal favorável à sua expressão.

[0064] Células vegetais transfectadas que são produzidas por qualquer das técnicas de transfecção acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transfectado e, assim, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração dependem de manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecidos, normalmente dependendo de um marcador de biocida e/ou de herbicida que foi introduzido juntamente com as sequências de nucleotídeos desejadas. Regeneração de plantas de protoplastos cultivados é descrita in Evans e colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, Nova Iorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC

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Press, Boca Raton, 1985. Regeneração poderá também ser obtida de calo vegetal, explantes, órgãos, pólens, embriões ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas de modo geral in Klee e colaboradores (1987), Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

[0065] Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula vegetal poderão ser usadas para conferir características desejadas a essencialmente qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de células vegetais podem ser engenheiradas no sentido das características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas aqui usando os constructos de ácidos nucleicos da presente invenção e os vários métodos de transfecção mencionados acima. Em modalidades preferidas, plantas-alvo e células vegetais destinadas a engenheiramento incluem, mas sem se limitar às mesmas, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas que incluem culturas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arros, painço, cevada), culturas de frutas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas forrageiras (por exemplo, alfalfa), culturas de plantas tuberosas (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas sacarinas, inhame), culturas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre, repolho); plantas de flores (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinho, abeto); plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, plantas que acumulam metais pesados); culturas de oleaginosas (por exemplo, girassol, colza, soja, palma) e plantas usadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Assim, os métodos e composições descritos têm de usar yma ampla faixa de plantas, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, espécies do gênero Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanurn, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna e

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Zea.

[0066] Aquele habilitado no estado da técnica reconhecerá que após o cassete de expressão ser estável mente incorporado em plantas transgênicas e confirmado ser operável, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer de várias técnicas de reprodução padrões poderá ser utilizada, dependendo da espécie a ser cruzada.

[0067] Uma célula vegetal transfectada, calo, tecido ou planta pode ser identificada e isolada selecionando ou classificando o material vegetal engenheirado em relação a características codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA transfectante. Por exemplo, seleção poderá ser realizada desenvolvendo o material vegetal engenheirado em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida a que o constructo de genes transfectantes confere resistência. Adicionalmente, plantas e células vegetais transfectadas podem também ser identificadas classificando as atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes para β-glicuronidase, luciferase, B ou Cl) que podem estar presentes nos constructos de ácido nucleico recombinantes. Essas metodologias de seleção e classificação são bem conhecidas daqueles habilitados no estado da técnica.

[0068] Métodos físicos e bioquímicos também poderão ser usados para identificar transfectantes de plantas ou células vegetais contendo constructos de genes inseridos. Esses métodos incluem, mas sem se limitar aos mesmos: 1) análise Southern ou amplificação por RCP para detectar e determinar a estrutura da inserção de DNA recombinante; 2) Northern blot, extensão por iniciadores ou amplificação por RCP via transcriptase reversa para detectar e examinar transcritos de RNA dos constructos de genes; 3) ensaios enzimáticos para detectar atividade de enzimas ou de ribozimas, em que os produtos genéticos são codificados

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31/53 pelo constructo de genes; 4) eletroforese em gel de proteína, técnicas de Western blot, imunoprecipitação ou imunoensaios ligados à enzima, em que os produtos de constructos de genes são proteínas; 5) tecnologias de detecção de Polimorfismo de Único Nucleotídeo, ensaio invasivo, pirosequenciamento, sequenciamento solexa. Técnicas adicionais, tais como hibridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração, também poderão ser usadas para detectar a presença ou expressão do constructo recombinante em órgãos e tecidos específicos a plantas. Os métodos para realizar todos esses ensaios são bem conhecidos daqueles habilitados no estado da técnica.

[0069] Efeitos da manipulação de genes usando os métodos descritos aqui podem ser observados por meio de, por exemplo, northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isolado dos tecidos de interesse. Normalmente, se a quantidade de mRNA aumentou, pode-se admitir que o gene endógeno correspondente está sendo expresso a uma taxa maior do que antes. Outros métodos de medição de atividade gênica podem ser usados. Tipos diferentes de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato utilizado e do método de detecção do aumento ou diminuição de um produto ou subproduto de reação. Além disso, os níveis de proteína expressa poderão ser medidos imunoquimicamente, isto é, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios baseados em anticorpos bem conhecidos daqueles habilitados no estado da técnica, tal como por meio de ensaios de detecção eletroforéticos (ou com coloração ou western blotting). O transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios de desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em substancialmente todos os tecidos vegetais, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. Entretanto, qualquer modo combinatório de expressão é também aplicável.

[0070] A presente descrição também abrange sementes das

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32/53 plantas transgênicas descritas acima, em que as sementes apresentam o transgene ou constructo de genes. A presente descrição abrange ainda a progênie, clones, linhagens de células ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que essa progênie, clones, linhagens de células ou células apresentam o transgene ou constructo de genes. Aplicações [0071] Os métodos e composições descritos para clivagem direcionada podem ser usados para induzir mutações em uma sequência genômica. Clivagem direcionada pode também ser usada para criar inativações gênicas (gene knock-outs) ou reduções de expressão gênica (knock-downs) (por exemplo, validação funcional genômica ou direcionada) e para facilitar inserção direcionada de uma sequência em um genoma (isto é, knock-in de sequência). Inserção poder ser realizada por meio de substituição de sequências cromossômicas por meio de, à guisa de exemplo não-limitativo, recombinação homóloga ou por integração direcionada, em que uma nova sequência (isto é, uma sequência não presente na região de interesse) é inserida em um sítio-alvo predeterminado. Em certos exemplos, essas novas sequências poderão ser flanqueadas por sequências homólogas às da região de interesse no cromossomo. Os mesmos métodos podem também ser usados para substituir uma sequência do tipo selvagem por uma sequência mutante ou para converter um alelo em um alelo diferente.

[0072] Clivagem direcionada de patógenos vegetais infectantes ou integrados pode ser usada para tratar infecções patogênicas em um hospedeiro vegetal, por exemplo, clivando o genoma do patógeno tal que sua patogenicidade seja reduzida ou eliminada. Adicionalmente, clivagem direcionada de genes que codificam receptores para vírus vegetais poderá ser usada para bloquear expressão desses receptores, prevenindo desse modo infecção viral e/ou disseminação viral na planta.

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Ipomoviruses,

Marafiviruses,

Nepoviruses,

Tobraviruses,

Tymoviruses, [0073] Patógenos de plantas exemplares incluem, mas sem se limitar aos mesmos, vírus de plantas tais como Alfarnoviruses, Alphacryptoviruses, Badnaviruses, Betaciyptoviruses, Bigeminiviruses, Bromoviruses, Bymoviruses, Capilloviruses, Carlaviruses,

Carrnoviruses, Caulimoviruses, Closteroviruses, Comoviruses, Cucurnoviruses, Cytorhabdoviruses, Dianthoviruses, Enamoviruses, Fabaviruses, Fijiviruses, Furoviruses, Hordeiviruses, Hybrigeminiviruses, Idaeoviruses, llawiruses,

Luteoviruses, Machlomoviruses, Macluraviruses, Monogeminiviruses, Nanaviruses, Necroviruses,

Nucleorhabdoviruses, Oryzaviruses, Ourmiaviruses, Phytoreoviruses, Potexviruses, Potyviruses, Rymoviruses, satellite 1/1/AS, satelliviruses, Sequiviruses, Sobemoviruses, Tenuiviruses, Tobamoviruses, Tornbusviruses, Tospoviruses, Trichoviruses, Umbraviruses, Varicosaviruses e Waikaviruses', patógenos fúngicos tais como mangras (por exemplo, Ustilaginales), ferrugem (Uredinales), ferrugem dos cereais (Clavicepts pupurea) e míldio; mofos (Oomycetes) tal como Phytophthora infestam (praga da batata); patógenos bacterianos tais como Erwinia (por exemplo, E. herbicola), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa, P. syringae, P. fluorescens e P. putida), Ralstonia (por exemplo, R. solanacearum), Agrobacterium e Xanthomonas', lombrigas (Nematoda)', e Phytomyxea (Polymyxa e Plasmodiophora).

[0074] Os métodos descritos para produção de uma proteína de interesse por recombinação direcionada podem ser usados para substituir qualquer sequência genômica por uma sequência não idêntica. Por exemplo, uma sequência genômica mutante poderá ser substituída por sua contrapartida do tipo selvagem, proporcionando desse modo métodos para tratar doenças das plantas; proporcionar resistência contra patógenos das plantas; aumentar o rendimento das

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34/53 culturas, etc.. Desse modo, um alelo de um gene pode ser substituído por um alelo diferente usando os métodos de recombinação direcionada descritos aqui.

[0075] Em muitos desses casos, uma região de interesse compreende uma mutação, e o polinucleotídeo doador compreende a sequência correspondente do tipo selvagem. Similarmente, uma sequência genômica do tipo selvagem pode ser substituída por uma sequência mutante, se tal é desejável. Por exemplo, superexpressão de um oncogene pode ser revertida mediante mutação do gene ou substituindo suas sequências de controle por sequências que sustentam um nível de expressão não patológica menor. Na verdade, qualquer patologia dependente de uma sequência genômica particular, de qualquer modo, poderá ser corrigida ou aliviada usando os métodos e composições descritos aqui.

[0076] Clivagem direcionada, inserção, excisão e/ou recombinação poderão também ser usadas para alterar sequências não codificadoras (por exemplo, sequências reguladoras tais como promotores, intensificadores, iniciadores, terminadores, sítios de emenda) para alterar os níveis de expressão de um produto genético. Tais métodos podem ser usados, por exemplo, para fins terapêuticos, estudos funcionais de validação genômica e/ou direcionada.

[0077] Modificação direcionada da estrutura de cromatina pode ser usada para facilitar a ligação de proteínas de fusão com cromatina celular. Em modalidades adicionais, uma ou mais fusões entre um domínio de ligação de dedos de zinco e uma recombinase (ou fragmento funcional desta) poderão ser usadas, em adição a ou em vez das fusões de domínios de clivagem com dedos de zinco descritas aqui, para facilitar recombinação direcionada. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6.534.261 sob propriedade conjunta e Akopian e colaboradores (2003) Proc. Natl. Acad. ScL USA 100:8688-8691. Em modalidades adicionais,

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35/53 os métodos e composições descritos são usados para proporcionar fusões de domínios de ligação de PDZ com domínios de ativação ou repressão de transcrição que exigem dimerização (seja homodimerização ou heterodimerização) para sua atividade. Nesses casos, um polipeptídeo de fusão compreende um monômero de domínio de ligação de dedos de zinco e um monômero de domínio funcional (por exemplo, um monômero de um domínio de ativação ou repressão de transcrição dimérico). Ligação de dois desses polipeptídeos de fusão a sítios-alvo apropriadamente situados permite dimerização de modo a reconstituir um domínio de ativação ou repressão de transcrição funcional.

[0078] Além disso, conforme descrito acima, os métodos e composições apresentados aqui podem ser usados para integração direcionada de sequências exógenas em uma região de interesse no genoma de uma célula, por exemplo, em que divagem aumenta inserção via mecanismos dependentes de homologia (por exemplo, inserção de uma sequência doadora que compreende uma sequência exógena juntamente com uma ou mais sequências que são ou idênticas ou homólogas mas não idênticas, com uma sequência genômica predeterminada (isto é, um sítio-alvo)).

[0079] A sequência doadora poderá conter homologia suficiente nas regiões que flanqueiam a sequência exógena para sustentar reparo de uma ruptura de fita dupla voltado para homologia em uma sequência genômica, introduzindo dessa maneira a sequência exógena no sítio genômico-alvo. Portanto, o ácido nucleico doador poderá ser de qualquer tamanho suficiente para sustentar integração da sequência exógena por meio de mecanismos de reparo dependentes de homologia (por exemplo, recombinação homóloga). Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, pensa-se que as regiões de homologia que flanqueiam a sequência exógena proporcionem às extremidades

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36/53 cromossômicas rompidas um padrão para ressíntese da informação genética no sítio da ruptura de fita dupla. Em certas modalidades, duas das sequências idênticas ou duas das sequências homólogas mas nãoidênticas (ou uma de cada) estão presentes, flanqueando a sequência exógena. Uma sequência exógena (ou ácido nucleico exógeno ou polinucleotídeo exógeno) é uma sequência que contém uma sequência de nucleotídeos que não está normalmente presente na região de interesse.

[0080] Sequências exógenas exemplares incluem, mas sem se limitar aos mesmos, cDNAs, sequências promotoras, sequências intensificadoras, abas de epítopos, genes marcadores, sítios de reconhecimento de enzimas de divagem e vários tipos de constructos de expressão. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6.833.252. Endonucleases nativas exemplares adicionais incluem l-Ceul, Pl-Pspl, Pl-Sce, 1-ScelV, l-Csml, l-Panl, l-Scell, l-Ppol, l-Scelll, ICrel, I-Tevl, ITevll e l-Tailll. Suas sequências de reconhecimento são conhecidas. Ver, também, Patente U.S. No. 5.420.032; Belfort e colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon e colaboradores (1989) Gene 82:115-118; Perler e colaboradores (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1 125-1 127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble e colaboradores (1996) Mol. Biol. 263:163-180; Argast e colaboradores (1998) Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo New England Biolabs.

[0081] Genes marcadores incluem, mas sem se limitar às mesmas, sequências que codificam proteínas que mediam resistência a antibióticos (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à neomicina, resistência a G418, resistência à puromicina), sequências que codificam proteínas coloridas ou fluorescentes ou luminescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde intensificada, proteína fluorescente vermelha, lucif erase), e proteínas que mediam crescimento celular intensificado e/ou amplificação de

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37/53 genes (por exemplo, diidrofolato reductase). Genes marcadores exemplares incluem, assim, mas sem se limitar aos mesmos, βglicuronidase (GUS), fosfinotricina N-acetil transferase (PAT, BAR), neomicina fosfotransferase, p-lactamase, catecol dioxigenase, aamilase, tirosinase, P-galactosidase, luciferase, equorina, EPSP sintase, nitrilase, acetolactato sintase (ALS), diidrofolato reductase (DHFR), dalapon desalogenase e antranilato sintase. Em certas modalidades, integração direcionada é usada para inserir um constructo de expressão de RNA, por exemplo, sequências responsáveis por expressão regulatada de micro RNA ou siRNA. Promotores, intensificadores e sequências adicionais reguladoras de transcrição, como descritos acima, podem também ser incorporados em um constructo de expressão de RNA.

[0082] A Transformação convencional usa integração aleatória de DNA estranho para produzir planta de cultura transgênica modificada com a característica de escolha que é submetida a rigorosas restrições em alguns mercados estrangeiros. Além disso, resultados indesejáveis também se originam do método de introdução de DNA ou da inserção aleatória do transgene em áreas sensíveis do genoma, frequentemente por genoma. Em particular, os efeitos de inserção imprecisa poderão não se manifestar nas primeiras gerações, uma vez que diferentes mecanismos de verificação de erros em DNA são ativados durante crescimento, reprodução, embriogênese e desenvolvimento. Essas consequências causam impacto no tempo e custos em dólares de qualquer programa transgênico em biotecnologia agrícola. No entanto, em uma recente invenção da Dow AgroSciences (W0/2008/021207), é descrito um método para inserção de transgenes com precisão via recombinação homóloga mediada por Nuclease com Dedos de Zinco (NDZ). Contrariamente, onde a proteína NDZ pode ser expressa e purificada fora do organismo-alvo e em seguida transportada para

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38/53 células vegetais-alvo, mutação cirurgicamente específica/inativação gênica poderá ser induzida via união não homóloga de extremidades (UNHE). Desse modo, a presente invenção pode produzir uma planta não transgênica geneticamente modificada que contornaria as restrições a culturas transgênicas e processo de edição de genes direcionados será possível sem exigir uma abordagem transgênica. [0083] Métodos para a expressão heterológa de proteínas nucleases sequência-específicas, tais como proteínas NDZ, são conhecidos no estado da técnica. Sistemas de expressão aplicáveis incluem, mas sem se limitar aos mesmos: o uso de um sistema in vitro tal como um sistema sem células de germe de trigo (ver PAT. U.S. NO. 7.235382, aqui incorporada como referência); o sistema de expressão de Pseudomonas fluorescens (Madduri e colaboradores «4(2007) Protein Expres Purif, 55(2): 352-360); e o sistema de expressão de proteínas Pichia (ver PAT. U.S. NOs. 4.683.293, 4.808.537, 4.812.405, 4.818.700, 4.837.148, 4.855.231, 4.857.467, 4.879.231, 4.882.279, 4.885.242, 4.895.800, 4.929.555, 5.002.876, 5.004.688, 5.032.516, 5.122.465, 5.135.868, 5.166.329, aqui incorporadas como referência).

[0084] Modalidades particulares da presente invenção incluem uma NDZ funcional exogenamente expressa conjugada com nanopartículas (NP) e transportada via método de transporte inteligente e dissimulado mediado por NP para as células vegetais intactas para induzir a ruptura de fita dupla e a restauração por UNHE da funcionalidade do gene rompido. Em outras modalidades a NDZ funcional conjugada com NP é transportada com um fragmento de DNA doador via método de transporte inteligente e dissimulado mediado por NP. Nesse ponto, a NDZ cliva uma sequência específica no genoma e o DNA doador integra-se em seu local via recombinação homóloga. Estratégias para ligar uma proteína à NP têm assumido quatro abordagens principais: (1) adsorção eletrostática, (2) conjugação com o ligante na superfície da

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NP, (3) conjugação com uma pequena molécula de cofator que a proteína pode reconhecer e ligar, e (4) conjugação direta com a superfície da NP (Aubin-Tam e Hamad-Schifferli, 2008). Outras estratégias são descritas na revisão de Medintz e colaboradores. Questões envolvidas nessas estratégias relativas a marcação incluem questão de ordem estérica ou se a proteína pode 'passar' o ligante para a superfície da NP ou para o grupo de ligação correspondente. Uma escolha de químicas que resultem em uma ligação específica (isto é, que não cause reticulação extensiva) e sejam estáveis para o fim desejado constitui também consideração necessária. Peptídeo de NDZ precisa ser funcionalizado sob a alta concentração de DDT e na presença de íons zinco. A fim de manter a estabilidade dos conjugados, a funcionalização será efetuada de acordo com o procedimento de conjugação descrito in Oh e colaboradores, 2010.

[0085] A invenção é ainda descrita com a ajuda dos seguintes exemplos ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de Nucleases sequência-específicas (SSNs) por meio de Tradução ou Expressão Bacteriana in vitro.

[0086] SSNs (ILI-LO/Fokl, ILI-43/Fokl, ILI-8/Fokl e l-Scel) são engenheiradas e amplificadas por RCP de plasmídeos que contêm as SSNs unindo sítios de enzimas de restrição e 6x abas de histidina. O produto de RCP é inserido no vetor pCR2.1 TOPO para clonagem e sequenciamento. Fragmentos de genes que contêm a sequência que codifica SSN são removidos do plasmídeo via digestão de restrição e ligados em sítios de restrição compatíveis do vetor de expressão pET15b. Essas amostras são transformadas em células de E. coli competentes de expressão de BL21 juntamente com pDAB4883. Para expressão eficaz, dano à proteína SSN é reduzido em DNA de E. coli para BL21 mediante transformação de BL21 com o plasmídeo

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40/53 pDAB4883 que consiste em plasmídeo de expressão pCOT4 contendo um gene para ligase a jusante de um promotor que é também induzido por IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo). Isso ajuda a reparar qualquer dano pelo SSNs ao genoma das células BL21 durante superexpressão.

[0087] O constructo gene para ligase gene-pCOT4 e os constructos SSN-pET15b são cotransformados nas mesmas células de expressão BL21. As culturas das células transgênicas BL21 são desenvolvidas em 50 mL de meio LB com cloranfenicol, carbenicilina e ZnCk e incubadas a 37Ό até DO 6oo nm atingir 0,5. Expressão é induzida com várias concentrações de IPTG (0,1- 0,7 mM), incubação é realizada sob várias temperaturas (16-28Ό) e análise é feita via SDS-PAGE e Western Blot para detecção da presença da proteína SSN. Assim, ILI-LO/Fokl, ILI43/Fokl, ILI-8/Fokl e l-Scel são expressos em células de E. coli e purificados com Ni-NT A. Após purificação, função de SSN é demonstrada com base na capacidade de liberar um fragmento específico de um plasmídeo de expressão.

[0088] Alternativamente, as nucleases sequência-específicas são expressas via tradução in vitro. Um kit comercial, TNT®, da Promega proporciona um processo eficiente e conveniente para expressão de proteína. Plasmídeos circulares contendo genes para nucleases sequência-específicas clonadas a jusante dos promotores de RNA polimerase T7 ou SP6 são expressos in vitro por proteína que expressa enzimas fornecida com o kit. Proteínas sintetizadas são produzidas em 50 pL de uma reação dentro de 60 - 90 minutos segundo protocolo do fabricante. Kits comerciais adicionais são disponíveis para tradução in vitro de proteína, kits adicionais que podem ser usados incluem: ActivePro™ da Ambion, PROTEINscript™ II da Ambion, PURExpress™ da New England Biolabs, além de outros kits comercial mente disponíveis.

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41/53 [0089] As Figuras 1 e 2 mostram expressão de SSN, NDZ-ILIFokl, com abas de histidina (1) e sem abas de histidina (2) em E. coli. Em NDZ-ILIFokl expresso por vzYro há liberação de um fragmento bem definido do plasmídeo flanqueado por sítios de ligação com NDZ. Assim, tanto SSNs expressa por E. coli como SSNs expressa in vitro são úteis para a digestão eficiente e específica de moléculas de DNA alvo, e são usadas alternadamente ao longo desta investigação.

[0090] Proteínas expressas a partir de genes para SSN clonados mostram ser funcionais (isto é, ao clivar o DNA doador). Por exemplo, plasmídeo pD AB 1585 (mostrado na figura 4) é tratado com NDZILIFokl. O DNA digerido de plasmídeo é linearizado. O fragmento linearizado a partir do plasmídeo diferido por NDZ-ILIFokl é então purificado do gel e se autoligam usando um procedimento de ligação in vitro de um dia para o outro. O produto de ligação é transferido para células de E. coli DH5a quimicamente competentes. Diversas colônias recombinantes são recuperadas e analisadas tanto por análise padrão de restrição como por sequenciamento de DNA, demonstrando que pDAB1585 digere como esperado.

Exemplo 2- Produção de Culturas de Células Alvo com Sítio de Ligação de SSN Flanqueados por Fragentos de Gene Repórter PFV. [0091] Sequências-alvo consistem em dois fragmentos de gene para Proteína Fluorescente Verde (pfv) (Evrogen Joint Stock Company, Moscou, Rússia) que flanqueiam um cassete de expressão de βglicuronidase (uidA). Em um constructo-alvo, um sítio de ligação de NDZ com sequências de reconhecimento consistindo de repetições invertidas às quais proteínas de fusão Fokl com dedos de zinco podem se ligar como homodímeros (figura 3) é integrado no constructo-alvo. O sítoo de ligação contém quatro repetições em tandem da sequência de reconhecimento de proteínas de fusão ILI-Fokl de modo que cada sítio de ligação tenha -200 pb de tamanho para assegurar que as sequências

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42/53 de reconhecimento sejam acessíveis às proteínas de fusão Fokl com dedos de zinco no ambiente complexo de cromatina. Em um segundo constructo, um sítio de ligação l-Scel é integrado no constructo-alvo (figura 6). Em cada constructo-alvo, os sítio de ligação são fundidos com a sequência codificadora uidA no término N. Os fragmentos de gene para pfv 5' e 3' se sobrepõem por 540 pb. Essas sequências sobrepostas proporcionam homologia nas sequências-alvo e um códon de parada é inserido na extemidade 3' do fragmento de pfv 5' para assegurar que não ocorra nenhuma transcrição funcional de pfv a partir da sequência-alvo.

[0092] Sequências-alvo são estavelmente integradas em culturas em suspensão de células de tabaco BY2 usando transformação por Agrobacterium. Culturas de BY2 (obtidas da Jun UekiofJapan Tobacco, Iwata, Shizuoka, Japão) são mantidas em meio contendo sais basais LS (PhytoTechnology Labs, Shawnee Mission, KS, No. L689), 170 mg/L de KH2PO4, 30 g/L de sacarose, 0,2 mg/L de 2,4-D e 0,6 mg/L de tiaminaHCL sob um pH de 6,0. As células BY2 são subcultivadas a cada sete dias adicionando 0,25 mL de PCV a 50 mL de meio à base de LS mantido em frascos de 250 mL em um agitador rotativo a 25Ό e 125 RPM. A fim de gerar culturas de células BY2 transgênicas com sequências-alvo integradas, um frasco de uma suspensão de póssubcultura de quatro dias é dividido em 10-12 alíquotas de 4 mL que são cocultivadas em placas de Petri de 100x25 mm com 100 pL de cepas de Agrobacterium LBA4404 abrigando ou pNDZ-TARGET pDAB1585 (figura 4) ou pl-Scel-TARGET pDAB100375 (figura 7) crescem de um dia para o outro sob uma ODooo de -1,5. As placas são envoltas com Nescofilm® (Azwell Inc., Osaka, Japão) e incubadas a 25°C sem agitação por três 3 dias, após o que excesso de líquido é removido e substituído por 11 mL de meio LS contendo 500 mg/L de carbenicilina. Após ressuspensão das células de tabaco, 1 mL de

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43/53 suspensão é colocado em placas de 100x25 mm de meio LS contendo 500mg/L de carbenicilina e 200 mg/L de higromicina solidificada com 8 g/L TC ágar (PhytoTechnology, Shawnee Mission, KS). As placas incubam descobertas sob 28Ό no escuro. Isso resulta em 120-144 placas de seleção para um único tratamento. Isolados individuais resistentes a higromicina aparecem em 10-14 dias após plaqueamento e são transferidos para placas individuais de 60x20 mm (um isolado por placa) nas quais são mantidos sob seleção como calo em um programa de subcultura de 14 dias até ser requisitado para análise e subsequentes experimentos de retransformação.

[0093] Culturas de células transgênicas resistentes a higromicina contendo uma única cópia integrada de comprimento total da sequência-alvo são selecionadas e usadas para reiniciar culturas em suspensão colocando -250-500 mg de tecido de calo em 40-50 ml_ de meio basal LS contendo 100 mg/L de higromicina e subcultivando a cada sete dias, conforme descrito acima.

[0094] Tanto grupos de células como células únicas (produzidas como descrito no pedido de patente de células únicas DAS, WO/2008/083233) são usados nos experimentos. Três a quatro dias antes dos experimentos, um cultura em suspensão de uma semana é subcultivada em meio fresco mediante transferência de 2 mL de agregados em suspensão de BY2 para 40 mL de meio LSBY2 contendo concentração de estoque de ácido 4-cloro-1,5-difenil-1 H-pirazol-3-ilóxi)acético éster etílico (como descrito na Patente WO/2008/083233), 1-3% de Glicerol e 0,05-0,1% (v/v) DMSO em um frasco de 250 mL. Células únicas são coletadas 3,5 dias ou 7 dias após o tratamento induzir células únicas. As células únicas BY2 são processadas por meio de um citômetro de fluxo para determinar a viabilidade das células e também avaliar, via microscopia confocal, a estabilidade das células. A estabilidade é detectada observando o nível de fluorescência de fundo,

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44/53 se houver. Uma pequena porcentagem de células mostra fluorescência de fundo que corresponde à de células mortas, indicando que a fluorescência de fundo é das células que sofreram necrose. Tanto as células únicas quanto os agregados em suspensão regulares são usados nos experimentos após ensaio em relação à fluorescência de fundo.

Exemplo 3 - Revestimento de Nanopartículas (NP) com SSNs Para Transporte Para Células Vegetais.

[0095] Coloides de ouro de 150 nm de diâmetro (BBI International, GC150), 5-((2-(e -3)-S(acetilmercapto)succinoil)amino)fluoresceína (SAMSA fluoresceim Invitrogen, A-685), Nanopartículas de 80 e 90 nm de tamanho de coloides de ouro multifuncionalizados com ácido carboxílico (TedPeila, 32019), Sulfo-NHS (N-hidroxissulfossuccinimida), EDC(l-etil3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida cloridreto), (Pierce Bitoechnology, 24510, 22980), MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico) (Fisher Scientific, AC32776-1000), Pacotes de tampão salino tamponado com fosfato (Sigma, P5368-10PAK), PFV com abas de histidina (Evrogen, Excitação máx. em 482 nm, Emissão máx. em 502 nm, FP611), turbo YFP (Evrogen, Excitação máx. em 525 nm, Emissão máx. em 538 nm, FP611), lodeto de propídio (Sigma, P4864), Diacetato de fluoresceína (Sigma, F7378) são tipos de NPs multifuncionalizadas que são revestidas com SSNs e usadas para transporte para as culturas de células alvo.

(i) Preparação de conjugados de nanopartículas (a) Síntese de conjugado ouro-fluoresceína sem SSNs para tratamentos de controle: conjugado ouro-fluoresceína é preparado por um método anteriormente (Cannone e colaboradores, 2006) para transporte e monitoramento das partículas em grupos de células BY2 ou células únicas sem SSNs. (1) 1 mg de SAMSA fluorescein é dissolvido em 100 pl de NaOH 0,1 M e centrifugado por 15 minutos para

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45/53 remover o grupo acetila que protege o tiol. A SAMSA ativada é então misturada com 100 pl de coloides de ouro de 150 nm (109 partículas/mL). Essa solução é por conseguinte incubada por 1 hora para assegurar a conclusão da reação. Em seguida, 50 μΙ_ de HCI 1 M é adicionado para neutralizar a solução. A solução é centrifugada a 3000 RPM por 30 minutos e o sobrenadante removido. O pellet amarelo obtido é ressuspenso em 200 μΙ_ de PBS 0,1 M, resultando em uma solução de cor laranja. Essa etapa de purificação é repetida duas vezes para assegurar remoção de SAMSA fluorescein livre. O modo de ligação de SAMSA a ouro se dá principal mente via ligação tiol. Devido à significativa repulsão eletrostática (SAMSA é dianiônica a pH>7), pensase que SAMSA seja perpendicular à superfície coloidal de ouro (Cannone e colaboradores, 2006). Tais NPs são usadas para monitorar a entrada do número de partículas fluorescentes que entram nas células como medida de indicação de tratabilidade celular nas condições dadas.

(b) Síntese de nanopartículas de ouro (NPO) revestidas com SSN: conjugados NPO-SSN são sintetizados usando um protocolo ligeiramente modificado descrito por Grabarek e Gergely, 1990. 0,25 mL de solução coloidal de ouro multifuncionalizada com ácido carboxílico de 20-150 nm (109 partículas/mL) é centrifugado a 3000 RPM por 10 minutos. Após descarte do sobrenadante, o pélete vermelho é suspenso em 1 mL de tampão de ativação (MES 0,1 M, NaCI 0,5 M, pH 6,0). Portanto, 0,4 mg de EDC e 1,1 mg de sulfo-NHS são adicionados a essa solução e centrifugados por 15 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, 9 pL de NDZ-ILIFokl são adicionados e a solução resultante é incubada por até 2 horas no escuro a temperatura ambiente a fim de a proteína e ouro reagirem completamente. A razão de coloides de ouro e proteína usada nesta reação é determinada encontrando o número de ácidos carboxílicos presentes em coloides de ouro. Primeiro, o número de grupos carboxílicos presentes em um coloide de ouro é calculado

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46/53 dividindo a área superficial de uma partícula de ouro (na hipótese de uma esfera) pela superfície ocupada por um grupo carboxílico (0,20 nm² (Kimura e colaboradores 2002)). Em seguida, esse resultado é multiplicado pelo número total de coloides de ouro presentes para obter o número total de grupos carboxílicos presentes em toda a solução coloidal de ouro. Esse número é comparado com o número de grupos amino presentes em dada quantidade de proteína. Os coloides de ouro ligam-se a proteína via formação de uma ligação amida entre ácido carboxílico presente no coloide de ouro e o grupo amino presente na proteína (Grabarek e Gergely, 1990). Grosseiramente há 127.285 moléculas de proteína ligadas a uma nanopartícula de ouro.

(ii) Tratamento celular:

a) Curso de tempo de absorção de ouro e viabilidade celular: As amostras seguintes são preparadas em placas estéreis de 24 poços: (I) 500 pl_ de grupo de células ou células únicas (controle) em suspensão-alvo; (ii) 500 μΙ_ de grupo de células ou células únicas BY2 em suspensão + 20 μΙ_ de NPO + 25 μΙ de diacetato de Fluoresceína (DAF) + 25 μΙ_ de iodeto de propídio; e (iii) outros tratamentos incluem 40, 60, 80 μΙ_ de NPO isoladamente e em combinação de NDZ-IL IFokl com as cepas de células e cepas de viabilidade celular. Amostras tratadas são examinadas sob microscópio de fluorescência em 5, 20, 120 min e finalmente após 24-48 h para confirmar a viabilidade das células.

b) Tratamento com Ouro-SAMSA fluoresceirr. As amostras seguintes são preparadas em placas estéreis de 24 poços antes dos experimentos: (i) 500 μΙ_ de grupo de células ou células únicas (controle) em suspensão-alvo; (ii) 500 μΙ_ de grupo de células ou células únicas em suspensão-alvo + 20 μΙ_ de SAMSA-fluorescein (controle); e (iii) grupo de células ou células únicas em suspensão-alvo + 20 μΙ_ de NPOSAMSA-fluorescein são tratados e as suspensões são incubadas por 20

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47/53 minutos no escuro a temperatura ambiente para confirmar a entrada de partículas.

c) Tratamentos de NDZ-ILI Fokl revestida (por exemplo, em forma de abas) em NPO - As amostras seguintes são preparadas em placas estéreis de 24 poços antes dos tratamentos das células ou grupos de células em suspensão: (i) 500 μΙ_ de grupo de células ou células únicas (controle) em suspensão-alvo; (H) 500 μΙ_ de grupo de células ou células únicas em suspensão-alvo + 9-20 μΙ_ de NDZ (controle); e Hi) 500 μΙ_ de células únicas + 10-40 μΙ_ de NPO revestida (por exemplo, em forma de abas) com NDZ-ILIFokl. As células e grupos de células tratados são incubados por até 2 horas no escuro a temperatura ambiente antes dos experimentos.

[0096] Tratamentos de controle usando NPOs ligadas a PFV/YFP são incluídas em todos os experimentos para assegurar penetração não invasiva e a cronometragem de entrada ótima que é usada como orientação nos experimentos (ver Figura 5). Além disso, peptídeos de penetração em células de fusão (PPCs) são fundidos (por exemplo, multifuncionalizados) com NP para monitorar a entrada em tempo real de partículas nos grupos de células e células únicas em suspensãoalvo.

Exemplo 4: Síntese de Conjugados Ponto Quântico (PQ)SSN em Abas [0097] PQs de nanocristais semicondutores luminescentes proporcionam um poderoso exemplo prototípico com muitas aplicações biológicas demonstradas (Thermes V. e colaboradores, 2002; Windbichler e colaboradores, 2007; Fajardo-Sanchez e colaboradores, 2008; Arnould S e colaboradores, 2006). Sua utilidade é derivada da combinação de características e dimensões fotofísicas únicas comparáveis àquelas de uma proteína grande. O raio hidrodinâmico de PQs hidrófilos CdSe-ZnS varia de ~5 nm (para remates de nanocristais

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48/53 trocados por ligantes moleculares) a -20 nm (para nanocristais encapsulados com copolímeros em bloco) (Smith J. e colaboradores, 2006). Um único PQ é conjugado com diversas biomoléculas (tais como anticorpos, peptídeos, DNA) para proporcionar PQ bioconjugados revestidos com elevada avidez.

[0098] Uso de NDZ-ILIFokl conjugado (por exemplo, revestido) com PQs hidrófilos como uma estratégia alternativa para facilitar sua absorção intracelular e transporte ao sítio de DNA alvo apropriado é descrito neste exemplo. O método geralmente segue o procedimento para a internaiização de cargas PQ-proteína em células vivas como descrito no pedido de patente DAS 65502.

(i) Síntese de PQ: PQs núcleo-casca de CdSe-ZnS com emissão máxima centralizada em 510 e 540 nm são sintetizados usando reações por etapas de precursores organometálicos em misturas de solventes de coordenação quentes seguindo os procedimentos descritos (Lu e colaboradores, 2007; Doyon e colaboradores, 2006; Collins e colaboradores, 2003; Lanio e colaboradores, 2000). Os nanocristais são multifuncionalizados e tornados hidrófilos mediante troca da casca de remate nativo, composta principal mente de trioctil fosfina e óxido de trioctil fosfina (TOP/TOPO), com ligantes bifuncionais como anteriormente descrito (Lie e colaboradores, 2002; Mani e colaboradores, 2005; Desjarlais e Berg, 1993). São usados dois conjuntos de PQs hidrófilos: (1) nanocristais rematados com apenas ácido diidrolipoico; e (2) nanocristais rematados com uma mistura de ácido diidrolipoico anexado a poli(etilenoglicol) (PEG Pm - 600, DHLAPEG) e DHLA-poli (etilenoglicol) terminado com biotina (PEG Pm - 400, DHLA-PEG-biotina) com uma razão molar de 9:1 dos ligandes. Estes são referidos como DHLA-PQs e DHLA-PEG-biotina-PQs, respectivamente.

(ii) Automontagem de Bioconjugados de Pontos Quânticos:

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Para automontar conjugados de PQ-NDZ-ILIFokl na valência desejada, His-NDZs nas razões molares apropriadas são adicionadas a 0,3 μΜ de 510-nm emitindo PQs rematados com DHLAem tampão Tris-C110 mM, pH 8, e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. Similarmente, b-PE-Estreptavidina é adicionada a 0,3 μΜ de PQs de emissão a 540-nm (rematados com DHLA-PEG:DHLA-PEG-biotina, razão de 9:1) em solução salina tampaonada com fosfato (NaCI 137 mM, fosfato 10 mM, KCI 2,7 mM, pH 7,4, PBS) e incubada a 4°C de um dia para o outro; formação de conjugados nesse caso é orientada por interações de Estreptavidina-biotina. Conjugados são caracterizados usando eletroforese em gel, onde mudanças na mobilidade eletroforética de PQs montados com NDZ anexada a His ou b-PE marcado com Estreptavidina são monitorados. Amostras são diluídas em tampão 1 x TBE (Tris 0,09 M, Na2-EDTA 0,002 M, Ácido bórico 0,09 M, pH 8,3) e passadas sobre 1% ou 2% de géis de agarose em relação a conjugados PQ-b-PE e YFP, respectivamente. Em particular, os efeitos de variar o número de moléculas de NDZ-ILI Fokl por bioconjugado de PQs são monitorados quanto a se as moléculas se fundem a proteínas fluorescentes para monitoramento. Imagens em gel são coletadas excitando o PQ e/ou proteína e capturando imagens de fluorescência das bandas separadas nos géis. Formação de conjugado é confirmada monitorando mudanças na transferência de energia entre os PQs e proteínas fluorescentes após automontagem. Espectros fluorescentes são coletados em uma Leitura de Placas de Microtitulação Multifunção Tecan Safire Dual Monochromator (Tecan, Research Triangle Park, NC) usando excitação a 325 nm. Para transporte intracelular e experimentos de formação de imagem, PQs são automontados com uma mistura da NDZ-ILIFokl sob uma razão molar nominal de NDZ:PQ.

(iii) Absorção intracelular de Ponto Quântico - Conjugados de

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Proteínas Fluorescentes: Experimentos de internaiização celular são realizados em condições estéreis, como anteriormente descrito. Bioconjugados de PQs são diluídos em meio de cultura completo, adicionados à cultura de células e incubados a 37°C por 1 h sob 40-150 pg/mL. Conjugados mistos revestidos com PQs consistindo de PQ/NDZ e PQ/b-PE 1:5 ou 1:10 com valência de montagem de 1:1 to 1:2.5, juntamente com PPC a 50 PPCs por PQ, são incubados com as culturas de células sob diferentes concentrações de conjugados de PQs. Excesso de Conjugados de PQs não-ligados são removidos lavando a cultura pelo menos três vezes com PBS ou meio de cultura de células. Células são então fixadas em 3,7% de paraformaldeído por 10 minutos a temperatura ambiente, lavadas duas vezes com PBS e montadas em meio de montagem ProLong Antifade contendo corante DAPI (Invitrogen) para coloração nuclear. Coleta de imagens por epifluorescência é realizada utilizando um microscópio Leica. Imagens de fluorescência divididas lado a lado são coletadas e quantificadas usando um sistema DualView equipado com um filtro dicroico de 565 nm. Para formação de imagem cellular por PQ-YFP/NDZ a 510 nm, amostras são excitadas a 488 nm e emissões são coletadas/separadas com o filtro dicroico de 565 nm e desconvoluídas. Fluorescência de PQ é coletada a λ < 565 nm e a cauda fluorescente de YFP coletada a λ > 565 nm. Ligação de YFP na janela de PQ é subtraída como parte da desconvoluição. Os PQs e b-PE de 540 nm são excitados a 488 nm e suas respectivas emissões separadas com o filtro dircroico de 565 nm e deconvoluídas. Fluorescência de DAPI é excitada usando uma lâmpada de Xe e emissão coletada usando um cubo de DAPI (D350/50x para excitação, 400DCLP dicroico, D460/50m para detecção). AF647TF é excitada usando a lâmpada de Xe e fluorescência é detectada usando um cubo de Cy5 (HQ620/60x para excitação, Q660LP dicroico, HQ700/75m para emissão). Ambos os cubos de excitação/detecção são

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51/53 fornecidos por Chroma Technology. Imagens de contraste por interferência diferencial (CID) são coletadas usando uma fonte de luz brilhante.

(iv) Confirmação de PQs revestidos com NDZ-ILIFokl: Interações de His ocorem diretamente com superfície inorgânica dos nanocristais rica em Zn. Engenheiramento de NDZ-ILIFokl com um término N que transporta suas sequências de (His)6 separadas por um pequeno espaçador e PPC que apresenta uma sequência terminal N de (His)8 permite a formação de complexos compactos PQproteína/peptídeo. Ligação biotina-avidina é uma estratégia de bioconjugação ubíqua conhecida no estado da técnica por sua forte interação (KD ~ 10 ¹⁵ M). Usar PQs com superfície rematada com uma mistura de PEG(DHLA-PEG-biotina-PQs) terminada com hidroxila e biotina permite conjugação fácil (por exemplo, revestimento) com b-PEEstreptavidina comercial mente disponível.

(v) Transporte intracelular de Conjugados PQ-NDZ-ILIFokl: Para verificar que absorção de PQs multifuncionalizados (por exemplo, funcionalizados na superfície) revestidos com cargas de YFP/NDZILIFokl é mediada pela presença de PPC na superfície dos nanocristais, linhagens de células-alvo BY2 são separadamente incubadas com três tipos de conjugados: conjugados PQ-PPC (10-100 PPCs por PQ), PQNDZ-ILIFokl/PPC e PQs montados com uma mistura de NDZ-ILIFokl e PPC (PQ-NDZ-ILIFokl-PPC com -10 NDZ-ILIFokl e -50 PPC per conjugado). Células são incubadas com soluções de conjugados de PQs com emissão a 510 nm (sob concentração de 75 nM), ligeiramente lavadas para remover qualquer material não ligado e subsequentemente convertidas em imagem utilizando microscópio de epifluorescência. Células são também contracoradas com DAPI para permitir visualização dos núcleos e endossomos, respectivamente. Quando PPC adicional está presente na superfície de PQs (conjugados

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52/53 mistos com superfície PQ-NDZ-ILIFokl-PPC), ocorre uma substancial absorção intracelular de conjugados conforme indicado pela pronunciada intensidade de fluorescência medida para ambos os conjuntos de células. Ademais, imagens coletadas em relação a ambas as culturas mostram que há uma sobeposição quase completa entre os padrões de fluorescência dos PQs e NDZ-ILIFokl AfFP. Avaliação dos padrões de coloração e padrão de colocalização indica uma distribuição perinuclear e são predominantemente confinados em compartimentos endossômicos. A internaiização eficiente de conjugados de PQs pelas linhagens de células na presença de PPC demonstra que PPC facilita absorção intracelular de PQs multifuncionalizados (por exemplo, funcionalizados na superfície) com cargas de proteínas de fusão fluorescentes NDZ-ILIFokl.

[0099] Células únicas e grupos de células agregadas são tratados similarmente aos tratamentos de NPs descritos na seção nanopartículas e são plaqueadas sem seleção e monitoradas em relação às colônias de expressão de PFV 2-4 semanas após os experimentos.

Exemplo 5 - Reparo Orientado a Homologia Após Transporte de SSN Para Células de Tabaco via NPOs e PQs [00100] Linhagens de células-alvo com sítios de ligação integrados de NDZ ou l-Scel tratados com NDZ-ILIFokl ou l-Scel ligadas às partículas, conforme descrito acima, são plaqueadas em meio em placas de Petri. Células são plaqueadas em meio sem seleção após os tratamentos. Focos verdes fluorescentes são visíveis após 7 dias. Para confirmar que a fluorescência observada resulta de reconstituição de um gene funcional para pfv, uma combinação de segmentos de tecido fluorescente é isolada e manualmente enriquecida por meio de várias passagens de subcultura seletiva. DNA genômico é isolado desses tecidos fluorescents e ensaiado por RCP com sondas ancoradas em cada fragmento do gene para pfv. Amostras enriquecidas de tecidos

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53/53 fluorescentes tratados com SSN, quando amplificadas, produzem o produto de RCP previsto de 0,6 kb indicando que a recombinação anticipada reconstituiu um gene funcional para pfv nesses tecidos. Um produto de RCP adicional de 4,1 kb é também observado nas amostras enriquecidas, indicando a presença da sequência repórter nãorecombinada na população de células. Isso não é inesperado dado o método de seleção visual de tecido fluorescente usado para enriquecimento celular positivo g/p.

[00101] Embora vários aspectos e modalidades exemplares tenham sido discutidos acima, aqueles habilitados no estado da técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e subcombinações desses aspectos e modalidades. Pretende-se, portanto, que as reivindicações anexas seguintes e reivindicações ulteriores introduzidas sejam interpretadas de modo a incluir todas essas modificações, permutações, adições e subcombinações na medida em que estejam dentro de seu verdadeiro espírito e escopo.

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Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de introdução de uma nuclease sequênciaespecífica (SSN) em uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende:

   proporcionar a célula vegetal que apresenta uma parede celular;

   revestir uma nanopartícula com uma SSN;

   colocar a célula que apresenta uma parede celular e a nanopartícula revestida em contato uma com a outra; e permitir absorção da nanopartícula e da SSN na célula vegetal que compreende uma parede celular.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o revestimento de uma nanopartícula com uma SSN compreende imobilizar a SSN via absorção não covalente na superfície da nanopartícula.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda absorver a SSN na nanopartícula.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda permitir absorção da nanopartícula em um compartimento da célula vegetal que compreende uma parede celular.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda revestir a nanopartícula com um peptídeo de penetração celular e/ou proteína orientada a compartimento subcelular.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o compartimento é selecionado do grupo que consiste em citosol, núcleo, tonoplastos, plastídeo, etioplasto, cromoplasto, leucoplasto, elaioplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto e o lúmen da membrana dupla.

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7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal que compreende uma parede celular é selecionada do grupo que consiste em células de tabaco, cenoura, milho, canola, colza, algodão, palma, amendoim, soja, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. e cana-de-açúcar.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é de um tecido selecionado do grupo que consiste em embrião, meristema, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raízes, flores, sementes, vagens e caules.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é selecionada do grupo que consiste em nanopartículas de ouro, nanopartículas revestidas com ouro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílica, nanopartículas poliméricas, nanopartículas de tungstênio, nanopartículas de gelatina, nanocascas, nanonúcleos, nanoesferas, nanobastões, nanopartículas magnéticas, nanopartículas semicondutoras, pontos quânticos, nanomatrizes, nanomatrizes dendriméricas e combinações destes.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda derivatizar a superfície da nanopartícula.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a SSN é uma nuclease com dedos de zinco compreendida de uma proteína com dedos de zinco com um domínio de nuclease sequência-independente.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de nuclease sequência-independente é derivado da endonuclease de restrição Fokl Tipo IIS.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda selecionar células que apresentam

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    3/3 estavelmente integrada a NDZ.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células selecionadas são células regeneráveis.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda regenerar uma planta das células regeneráveis.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é uma nanopartícula multifuncionalizada.

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