JP2012523234A - 配列特異的ヌクレアーゼのナノ粒子媒介送達 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は米国仮特許出願第61/167,389号(2009年4月7日出願)の利益を主張する。
上記で記されるように、DNA構築物を、様々な従来技術によって、所望される植物宿主(例えば、そのゲノム)に導入することができる。そのような技術の総説については、例えば、Weissbach&Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)、セクションVIII,421頁〜463頁,及び、Grierson&Corey,Plant Molecular Biology(1988,第2版),Blackie,London,第7章〜第9章を参照のこと。
標的化された切断のための開示された方法及び組成物は、ゲノム配列における変異を誘導するために使用することができる。標的化された切断はまた、遺伝子ノックアウト体又は遺伝子ノックダウン体を作出するために(例えば、機能的ゲノミクス又は標的検証)、また、ゲノム内への配列の標的化された挿入(すなわち、配列ノックイン)を容易にするために使用することができる。挿入は、限定されない例として、相同的組換えを介した、又は、新しい配列(すなわち、目的とする領域に存在しない配列)が所定の標的部位に挿入される標的化された組み込みによる、染色体配列の置換によるものであり得る。特定の例において、そのような新しい配列の側面には、染色体における目的とする領域に対して相同的な配列を配置することができる。同じ方法を使用して、野生型配列を変異型配列で置き換えることもでき、また、1つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変えることもできる。
直径150nmのサイズの金コロイド(BBI International、GC150)、5−((2−(及び−3)−S(アセチルメルカプト)スクシノイル)アミノ)フルオレセイン(SAMSAフルオレセイン:Invitrogen、A−685)、サイズが80nm及び90nmであるカルボン酸多官能化金コロイドのナノ粒子(TedPella、32019)、スルホ−NHS(N−ヒドロキシスルホスクシンイミド)、EDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)(Pierce Biotechnology、24510、22980)、MES(2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸)(Fisher Scientific、AC32776−1000)、リン酸塩緩衝化生理的食塩水緩衝剤小包(Sigma、P5368−10PAK)、ヒスチジンタグ化GFP(Evrogen、励起最大−482nm、放射最大−502nm、FP611)、ターボYFP(Evrogen、励起最大−525nm、放射最大−538nm、FP611)、プロピジウムヨウ化物(Sigma、P4864)、フルオレセインジアセタート(Sigma、F7378)は、SSNにより被覆され、標的細胞培養物の中への送達のために使用される様々なタイプの多官能化NPである。
(a)コントロール処理のための、SSNを伴わない金−フルオレセインコンジュゲートの合成:金−フルオレセインコンジュゲートを、SSNを有しないBY2クラスター又はBY2単細胞において粒子を送達し、追跡するために、以前に記載される方法(Cannoneら、2006)によって調製する。1mgのSAMSAフルオレセインを100μlの0.1M NaOHに溶解し、15分間ボルテックス撹拌して、チオールを保護するアセチル基を除く。次いで、この活性化SAMSAを100μlの150nmの金コロイドと混合する(約109個/mLの粒子)。次いで、この溶液を1時間インキュベーションして、反応の完了を確実にする。次いで、50μLの1M HClを加えて、溶液を中和する。溶液を3000RPMで30分間遠心分離し、上清を除く。得られた黄色ペレットを200μLの0.1M PBSに再懸濁し、これにより、オレンジ色の溶液を得る。この精製工程を2回繰り返して、遊離SAMSAフルオレセインの除去を確実にする。SAMSAが金に結合する様式は、主としてチオール結合によるものである。著しい静電反発のために(SAMSAは、7を超えるpHでジアニオン性である)、SAMSAは、金コロイド表面に垂直に位置すると考えられる(Cannoneら、2006)。そのようなNPは、所与の条件における細胞従順性の目安の尺度として、細胞の中に入るそのような蛍光放射粒子の数の進入を追跡するために使用される。
ルミネセンス性半導体ナノ結晶のQDは、多くの実証された生物学的応用を有する強力な原型例を提供する(Thermes Vら、2002;Windbichlerら、2007;Fajardo-Sanchezら、2008;Amould Sら、2006)。それらの有用性が、特有の光物理的特徴と、大きいタンパク質のサイズに匹敵するサイズとの組み合わせに由来する。親水性CdSe−ZnS QDの流体力学的半径が、約5nm(分子リガンドと交換されるナノ結晶キャップについて)から、約20nm(ブロックコポリマー内に包まれるナノ結晶について)にまで及ぶ(Smith Jら、2006)。1個のQDが、高まったアビディティーを被覆されたQDバイオコンジュゲートに与えるためにいくつかの生体分子(例えば、抗体、ペプチド、DNAなど)とコンジュゲート化される。
上記で記載されるように、粒子に結合するZFN−IL1Fok1又はI−SceIで処理される、組み込まれたZFN結合部位又はI−SceI結合部位を有する標的細胞株を、ペトリディッシュにおける培地に置床する。細胞を、処理後、非選択培地に置床する。緑色蛍光の中心が7日後に認められる。観測された蛍光が機能的gfp遺伝子の再構成から生じることを確認するために、蛍光を発する組織セグメントの一団を単離し、数回の選択的継代培養によって手作業により濃縮する。ゲノムDNAをこれらの蛍光発生組織から単離し、いずれかのgfp遺伝子フラグメントに結合するプローブを用いたPCRによって分析する。SSN処理された蛍光発生組織から濃縮されたサンプルは、増幅されたとき、予測された0.6kbのPCR生成物をもたらし、このPCR生成物は、予期された組換えにより、機能的なgfp遺伝子がこれらの組織において再構成されていることを示している。さらなる4.1kbのPCR生成物もまた、濃縮されたサンプルにおいて認められ、このことは、細胞集団における非組み換えレポーター遺伝子の存在を示している。このことは、gfp陽性細胞の濃縮を達成するために使用される蛍光発生組織の肉眼選択の方法を考えた場合、予想されないことではない。
Claims (16)
- 配列特異的ヌクレアーゼ(SSN)を植物細胞に導入する方法であって、
細胞壁を有する前記植物細胞を提供する工程;
ナノ粒子をSSNにより被覆する工程;
細胞壁を有する前記細胞と、前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触状態に置く工程;及び
細胞壁を含む前記植物細胞の中への前記ナノ粒子及び前記SSNの取り込みを可能にする工程、を含む方法。 - ナノ粒子をSSNにより被覆する工程が、前記SSNを前記ナノ粒子の表面に非共有結合性吸収により固定化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SSNを前記ナノ粒子の中に吸収する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞壁を含む前記植物細胞の区画の中へ前記ナノ粒子を取り込ませる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子を細胞浸透ペプチド及び/又は細胞内区画標的化タンパク質により被覆する工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記区画が、細胞質ゾル、核、トノプラスト、プラスチド、エチオプラスト、クロモプラスト、白色体、エライオプラスト、プロテイノプラスト、アミロプラスト、葉緑体、及び、二重膜の内腔からなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 細胞壁を含む前記植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、カノーラ、ナタネ、綿、ヤシ、ピーナッツ、ダイズ、イネ属種(Oryza sp.)、アラビドプシス属種(Arabidopsis sp.)、トウゴマ属種(Ricinus sp.)及びサトウキビの細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや及び茎からなる群より選択される組織に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、多孔性ナノ粒子、メソポーラス(mesoporous)ナノ粒子、シリカナノ粒子、ポリマーナノ粒子、タングステンナノ粒子、ゼラチンナノ粒子、ナノシェル、ナノコア(nanocore)、ナノスフェア(nanosphere)、ナノロッド(nanorod)、磁性ナノ粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、ナノマトリックス、デンドリマーナノマトリックス及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子の表面を誘導体化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SSNが、配列非依存的ヌクレアーゼドメインを有するジンクフィンガータンパク質から構成されるジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記配列非依存的ヌクレアーゼドメインがIIS型制限エンドヌクレアーゼFokIに由来する、請求項11に記載の方法。
- 前記ZFNを安定的に組み込んでいる細胞を選択する工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記選択された細胞が再生可能な細胞である、請求項13に記載の方法。
- 植物を前記再生可能な細胞から再生する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が多官能化ナノ粒子である、請求項1に記載の方法。
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