JP7383062B2 - 配列操作のための最適化されたCRISPR-Cas二重ニッカーゼ系、方法および組成物 - Google Patents
配列操作のための最適化されたCRISPR-Cas二重ニッカーゼ系、方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
2013年6月17日に出願された米国仮特許出願第61/836,123号明細書、2013年7月17日に出願された同第61/847,537号明細書、2013年8月5日に出願された同第61/862,355号明細書、2013年8月28日に出願された同第61/871,301号明細書、2013年12月12日に出願された同第61/915,383号明細書、および2013年12月12日に出願されたPCT/US2013/074667号明細書からの優先権が主張され、PCT/US2013/074667号明細書に関しては、米国の目的上、この出願はまた一部継続出願である。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により助成されたNIHパイオニアアワード(1DP1MH100706)のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
A)-I.CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列
[(a)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、
転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズできるtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、かつCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]、
または
(B)I.ポリヌクレオチドであって、
(a)原核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列
を含むポリヌクレオチド、
II.CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
III.tracr配列を含むポリヌクレオチド配列
[転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズできるtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、およびCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含む目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物または非ヒト生物を改変する方法を提供する。
(A)I.CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が(a)真核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、(b)tracrメイト配列、および(c)tracr配列を含む、第1の調節エレメント、およびII.0または少なくとも1つ以上の核局在化配列(または場合により、一部の実施形態はNLSが関与しないこともあるため、少なくとも1つ以上の核局在化配列)を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント[(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、成分IおよびIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびハイブリダイズ可能な複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、または
(B)I.(a)原核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、および(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、およびIII.tracr配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント[成分I、IIおよびIIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびCRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を含む。一態様において、CRISPR酵素は触媒ドメインの一つに1つ以上の突然変異を含む。一態様において、CRISPR酵素はニッカーゼである。
(A)I.CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が(a)真核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、(b)tracrメイト配列、および(c)tracr配列を含む、第1の調節エレメント、およびII.0または少なくとも1つ以上の核局在化配列(または場合により、一部の実施形態はNLSが関与しないこともあるため、少なくとも1つ以上の核局在化配列)を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント[(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、成分IおよびIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびCRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、または
(B)I.(a)原核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、および(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、およびIII.tracr配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント[成分I、IIおよびIIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびCRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。
(A)I.CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、chiRNAポリヌクレオチド配列が、(a)真核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、(b)tracrメイト配列、および(c)tracr配列を含む、第1の調節エレメント、およびII.0または少なくとも1つ以上の核局在化配列(または場合により、一部の実施形態はNLSが関与しないこともあるため、少なくとも1つ以上の核局在化配列)を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント[(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、成分IおよびIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびCRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物、または
(B)I.(a)原核細胞における標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、および(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、およびIII.tracr配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント[成分I、IIおよびIIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、およびCRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物。真核細胞において使用される実施形態では、ベクター系はウイルスベクター系、例えばAAVベクターまたはAAVベクター系またはレンチウイルス由来ベクター系またはタバコモザイクウイルス由来系を含む。
I.第1のCRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列
を含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のCRISPR-Cas系chiRNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列
を含む第2のポリヌクレオチド配列、および
III.0または少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードし、かつCRISPR酵素に1つ以上の突然変異を含むポリヌクレオチド配列、
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、
I.およびII.の(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、転写されると第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍でDNA二重鎖の逆鎖の開裂を指向して、それによりDNAの切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物または非ヒト生物を改変する。一態様において、DNAにおける第1のニックと第2のニックとは互いに対して二重鎖の少なくとも1塩基対だけオフセットしている。一態様において、第1のニックと第2のニックとは互いに対し、得られるDNA切断が3’オーバーハングを有するようにオフセットしている。一態様において、第1のニックと第2のニックとは互いに対し、得られるDNA切断が5’オーバーハングを有するようにオフセットしている。一態様において、第1のニックと第2のニックとは互いに対し、オーバーハングが少なくとも1nt、少なくとも10nt、少なくとも15nt、少なくとも26nt、少なくとも30nt、少なくとも50ntであるか、または少なくとも50ntを超えるように位置している。得られるオフセットした二重ニックを有するDNA鎖を含む本発明のさらなる態様を当業者は理解し得るとともに、二重ニック系の例示的使用が本明細書に提供される。
I.以下に作動可能に結合している第1の調節エレメント
(a)第1の標的配列にハイブリダイズし得る第1のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列、
II.以下に作動可能に結合している第2の調節エレメント
(a)第2の標的配列にハイブリダイズし得る第2のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列、
III.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント、および
IV.tracr配列に作動可能に結合している第4の調節エレメント、
ここで成分I、II、IIIおよびIVは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列への第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体は、(1)第1の標的配列にハイブリダイズできる第1のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体は、(1)第2の標的配列にハイブリダイズできる第2のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、従ってオフターゲット改変を最小限に抑えることにより生物または非ヒト生物を改変する。
a)遺伝子産物をコードする二本鎖DNA分子のそれぞれ第1の鎖および第2の鎖を標的にする2つのCRISPR-Cas系ガイドRNAの各々に作動可能に結合している第1の調節エレメント、
b)Casタンパク質に作動可能に結合している第2の調節エレメント
ここで成分(a)および(b)は系の同じまたは異なるベクター上にあり、それによりガイドRNAが、遺伝子産物をコードするDNA分子を標的にし、かつCasタンパク質が、遺伝子産物をコードするDNA分子の第1の鎖および第2の鎖の各々にニックを入れ、それにより遺伝子産物の発現が変化し;および、Casタンパク質と2つのガイドRNAとが天然で一緒に存在することはない。
I.第1のCRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列
を含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のCRISPR-Cas系chiRNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列
を含む第2のポリヌクレオチド配列、および
III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、かつ1つ以上の突然変異を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、
IV.合成またはエンジニアリングされた一本鎖オリゴヌクレオチドを含む修復テンプレート
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含むことができ、
(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、転写されると第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、および相同組換えによってDNA二重鎖に修復テンプレートが導入され、それにより生物が改変される。
I.第1のCRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列
を含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のCRISPR-Cas系chiRNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列
を含む第2のポリヌクレオチド配列、および
III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、かつ1つ以上の突然変異を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、
IV.オーバーハングの第1のセットを含む修復テンプレート
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、
(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び、転写されると第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向してオーバーハングの第2のセットを含む二本鎖切断を誘導し、オーバーハングの第1のセットがオーバーハングの第2のセットに適合してマッチし、およびライゲーションによってDNA二重鎖に修復テンプレートが導入され、それにより生物が改変される。
I.第1のポリヌクレオチドであって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列
を含む第1のポリヌクレオチド;
II.第2のポリヌクレオチドであって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列
を含む第2のポリヌクレオチド;
および
III.CRISPR酵素および1つ以上の核局在化配列をコードする配列を含む第3のポリヌクレオチド
を細胞に送達するステップを含み、
前記第1および第2のポリヌクレオチドの(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び;
第1の標的配列がDNA二重鎖の第1の鎖上にあり、かつ第2の標的配列がDNA二重鎖の逆鎖上にあり、第1および第2のガイド配列が二重鎖の前記標的配列にハイブリダイズすると、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドの5’末端が互いに対して二重鎖の少なくとも1塩基対だけオフセットし;
転写されると第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、
第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
およびDNA二重鎖の前記第1の鎖が前記第1の標的配列の近傍で開裂され、およびDNA二重鎖の前記逆鎖が前記第2の標的配列の近傍で開裂されることにより、5’オーバーハングまたは3’オーバーハングを有する二本鎖切断が生じる。
I.第1のポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列
に作動可能に結合している調節エレメントを含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列、
に作動可能に結合している第2の調節エレメントを含む第2のポリヌクレオチド配列
III.CRISPR酵素をコードする配列に作動可能に結合している第3の調節エレメントを含む第3のポリヌクレオチド配列、および
IV.tracr配列に作動可能に結合している第4の調節エレメントを含む第4のポリヌクレオチド配列、
を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を細胞に送達するステップを含み、
成分I、II、IIIおよびIVは系の同じまたは異なるベクター上にあり、
第1の標的配列がDNA二重鎖の第1の鎖上にあり、かつ第2の標的配列がDNA二重鎖の逆鎖上にあり、第1および第2のガイド配列が二重鎖の前記標的配列にハイブリダイズすると、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドの5’末端が互いに対して二重鎖の少なくとも1塩基対だけオフセットし;
転写されると第1および第2のtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、
第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
およびDNA二重鎖の前記第1の鎖が前記第1の標的配列の近傍で開裂され、およびDNA二重鎖の前記逆鎖が前記第2の標的配列の近傍で開裂されることにより、5’オーバーハングまたは3’オーバーハングを有する二本鎖切断が生じる。
I.第1のポリヌクレオチドであって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列
を含む第1のポリヌクレオチド;
II.第2のポリヌクレオチドであって、
(a)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列
を含む第2のポリヌクレオチド;
および
III.CRISPR酵素および1つ以上の核局在化配列をコードする配列を含む第3のポリヌクレオチド
を含むキットまたは組成物も提供し、
前記第1および第2のポリヌクレオチドの(a)、(b)および(c)は5’から3’への方向に並び;
第1の標的配列はDNA二重鎖の第1の鎖上にあり、かつ第2の標的配列はDNA二重鎖の逆鎖上にあり、第1および第2のガイド配列が二重鎖における前記標的配列にハイブリダイズされると、第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドの5’末端が互いに対して二重鎖の少なくとも1塩基対だけオフセットし、
および場合によりI、IIおよびIIIの各々が同じまたは異なるベクターに提供される。
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・ Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308.(2013);
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・ Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering,Hsu et al,Cell 157,1262-1278(June 5,2014)(Hsu 2014)、
この各々が参照により本明細書に援用され、簡潔には以下のとおり考察している:
・ Cong et al.は、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9およびまた化膿性連鎖球菌(Streptoccocus pyogenes)Cas9の両方に基づき、真核細胞で使用されるII型CRISPR/Cas系をエンジニアリングし、Cas9ヌクレアーゼが低分子RNAの指図を受けてヒトおよびマウス細胞で正確なDNA開裂を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究はさらに、ニッキング酵素に変換されるCas9を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のCRISPR配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、RNAガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性および広範な適用性を実証した。このようにRNAを使用して細胞における配列特異的DNA開裂をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究はさらに、他のCRISPR遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能であると見込まれ、また哺乳類ゲノム開裂も媒介し得ることを示した。重要なことに、CRISPR/Cas系のいくつかの側面をさらに改良してその効率および多用途性を高め得ることが想定され得る。
毒性の低下;
真核細胞における発現の向上;
特異性の亢進;
タンパク質の分子量の低下、異なるCas9ホモログの最も小さいドメインを組み合わせてより小さいタンパク質を作製;および/または
PAM配列要件の変更。
インビボ送達の点では、AAVはいくつかの理由で他のウイルスベクターと比べて有利である:
毒性が低い(これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心が不要であるという精製方法に起因し得る)
宿主ゲノムにインテグレートされないため挿入突然変異生成を引き起こす可能性が低い。
NHEJ媒介性遺伝子ノックアウトを達成するため:
単一ウイルスベクター:
2つ以上の発現カセットを含むベクター:
プロモーター-Cas9コード核酸分子-ターミネーター
プロモーター-gRNA1-ターミネーター
プロモーター-gRNA2-ターミネーター
プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
二重ウイルスベクター:
Cas9の発現をドライブするための1つの発現カセットを含むベクター1
プロモーター-Cas9コード核酸分子-ターミネーター
1つ以上のガイドRNAの発現をドライブするためのもう1つの発現カセットを含むベクター2
プロモーター-gRNA1-ターミネーター
プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
AAV ITRはプロモーターとして働き得る:これは、追加的なプロモーターエレメント(これはベクター中でスペースを取り得る)の必要性をなくすのに有利である。空いた追加のスペースは、追加的なエレメント(gRNA等)の発現のドライブに使用することができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cas9の過剰発現に起因する毒性を低下させるためにも使用することができる。
肺での発現には、SP-Bを使用することができる。
内皮細胞にはICAMを使用することができる。
造血細胞にはIFNβまたはCD45を使用することができる。
骨芽細胞にはOG-2を使用することができる。
ガイドRNAのドライブに使用されるプロモーターとしては、以下を挙げることができる:
Pol IIIプロモーター、例えばU6またはH1
Pol IIプロモーターおよびイントロンカセットを使用することによるgRNAの発現
組成物を発現させるため組成物を作動可能にコードする1つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達すること
を含む目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作を含み、
ここでこの組成物は、
I.CRISPR-Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)好適な哺乳類細胞におけるCF標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、
[(a)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、
成分IおよびIIは、系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズできるガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を含む。CFに関して、好ましい標的DNA配列はCFTRΔ508突然変異を含む。好ましいPAMは上記に記載される。好ましいCRISPR酵素は任意のCas(本明細書に記載されるものであるが、特に実施例16に記載されるもの)である。
1.II型CRISPR遺伝子座に隣接するゲノム配列の2Kbウィンドウに存在する;
2.20~50bpにわたる;および
3.20~50bpの間隔が置かれている。
1.ダイレクトリピートとの配列相同性(最大18bpのミスマッチを含むGeneiousにおけるモチーフ検索);
2.転写方向における予測されたRho非依存性転写ターミネーターの存在;および
3.tracrRNAとダイレクトリピートとの間の安定したヘアピン二次構造。
プラスミド上のU6プロモーターおよびガイドRNAをコードするよりむしろ、本出願人らはU6プロモーターをDNAオリゴと共に増幅してガイドRNAを付加した。得られたPCR産物を細胞に形質移入してガイドRNAの発現をドライブすることができる。
フォワードプライマー:
真核細胞でガイドRNAを発現させるためにpol3プロモーター、詳細にはRNAポリメラーゼIII(例えばU6またはH1プロモーター)を使用するよりむしろ、本出願人らは真核細胞でT7ポリメラーゼを発現させることにより、T7プロモーターを使用してガイドRNAの発現をドライブする。
1.Cas9の発現ベクター
2.T7ポリメラーゼの発現ベクター
3.T7プロモーターと融合したガイドRNAを含む発現ベクター
Cas9をmRNAの形態で送達することにより、細胞でのCas9の一過性発現が可能となり、毒性が低下する。例えば、ヒト化SpCas9は、以下のプライマー対を使用して増幅し得る:
フォワードプライマー(インビトロ転写用にT7プロモーターを付加するため):
本出願人らは、ゲノム改変を実行するのに必要となった場合に限りCas9発現を一過性にオンにする。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Tet-OnまたはTet-Off)、小分子2ハイブリッド転写活性化システム(FKBP、ABA等)、または光誘導性システム(フィトクロム、LOVドメイン、またはクリプトクロム)が含まれる。
本出願人らは、低分子量のCas9に対してメタゲノム検索を行った。多くのCas9ホモログはかなり大きい。例えばSpCas9は約1368アミノ酸長であり、これは大き過ぎるため送達用のウイルスベクターへのパッケージングが容易でない。GenBankに寄託されている配列からCas9ホモログの長さ分布を表すグラフが作成される(図5)。配列の中には誤って注釈されているものもあり、従って各長さについての正確な度数は必ずしも正しいとは限らない。それでもなお、これによりCas9タンパク質の分布の概観が得られ、より短いCas9ホモログの存在が示唆される。
機能強化のためまたは新規機能を開発するため、本出願人らは異なるCas9ホモログの断片を組み合わせることにより、キメラCas9タンパク質を作成する。例えば、2つの例示的なキメラCas9タンパク質:
例えば、本出願人らは、St1Cas9(このタンパク質からの断片は太字とする)のN末端を、SpCas9(このタンパク質からの断片には下線を引く)のC末端と融合した。
>St1(N)Sp(C)Cas9
毒性が低下する
真核細胞における発現が向上する
特異性が強化される
タンパク質の分子量が低下し、異なるCas9ホモログからの最も小さいドメインを組み合わせることによりタンパク質が小さくなる。
PAM配列要件の変更
本出願人らは、DNA標的の両鎖の開裂に関与する2つの触媒ドメイン(D10およびH840)を突然変異させることにより、Cas9を汎用DNA結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するため、本出願人らはCas9に転写活性化ドメイン(VP64)を融合した。本出願人らは、転写因子活性化強度が標的で費やされる時間の関数であるため、Cas9-VP64融合タンパク質の強力な核局在を認めることが重要であるという仮説を立てた。従って、本出願人らは一組のCas9-VP64-GFP構築物をクローニングし、それらを293細胞に形質移入し、形質移入後12時間でその局在を蛍光顕微鏡下で評価した。
Cas9ヌクレアーゼを発現するマウスを作成するため、本出願人らは2つの一般的戦略、トランスジェニックとノックインとを提示する。これらの戦略は、目的とする任意の他のモデル生物の作成、例えばラットに適用し得る。これらの一般的戦略の各々について、本出願人らは、構成的に活性なCas9と、条件的に発現する(Creリコンビナーゼ依存性の)Cas9とを作製する。構成的に活性なCas9ヌクレアーゼは以下のコンテクストで発現する:pCAG-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpolyA。pCAGはプロモーターであり、NLSは核局在化シグナルであり、P2Aはペプチド開裂配列であり、EGFPは高感度緑色蛍光タンパク質であり、WPREはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントであり、およびbGHpolyAはウシ成長ホルモンポリAシグナル配列である(図7A~図7B)。条件的バージョンは、プロモーターの後ろおよびNLS-Cas9-NLSの前に1つのさらなる終止カセットエレメント、loxP-SV40 polyA x3-loxPを有する(すなわち pCAG-loxP-SV40polyAx3-loxP-NLS-Cas9-NLS-P2A-EGFP-WPRE-bGHpolyA)。重要な発現エレメントは図8のとおり可視化することができる。構成的構築物は開発全体を通して全ての細胞型で発現しなければならないが、条件的構築物は、同じ細胞がCreリコンビナーゼを発現するときに限りCas9発現を可能にし得る。この後者のバージョンは、Creが組織特異的プロモーターの発現下にあるときCas9の組織特異的発現を可能にし得る。さらに、CreをTET onまたはoffシステムなどの誘導性プロモーターの発現下に置くことにより、Cas9発現を成体マウスで誘導することができる。
CRISPR-Cas系は、細菌および古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外来性DNAに対する適応免疫機構である。II型CRISPR-Cas系は、CRISPR遺伝子座への外来DNAの「獲得」に関与するタンパク質をコードする一組の遺伝子、ならびにDNA開裂機構の「遂行」をコードする一組の遺伝子からなる;これらには、DNAヌクレアーゼ(Cas9)、非コードトランス活性化cr-RNA(tracrRNA)、および外来DNA由来のスペーサーにダイレクトリピートが隣接したアレイ(crRNA)が含まれる。Cas9による成熟時、tracrRNAおよびcrRNA二重鎖が、スペーサーガイド配列により特定されるCas9ヌクレアーゼを標的DNA配列にガイドし、開裂に必要でかつ各CRISPR-Cas系に特異的な、標的DNAの短鎖配列モチーフ近傍でのDNAの二本鎖切断を媒介する。II型CRISPR-Cas系は細菌界全体にわたり見られ、Cas9タンパク質配列およびサイズ、tracrRNAおよびcrRNAダイレクトリピート配列、これらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のモチーフ要件の点で高度に多様である。1つの種が複数の異なるCRISPR-Cas系を有し得る。
本実施例において、本出願人らは、以下の突然変異がSpCas9をニック形成酵素に変換し得ることを示す:D10A、E762A、H840A、N854A、N863A、D986A。
Cas9転写活性化
第2世代の構築物を設計してパイプライン中で試験する(表1)。これらの構築物を使用して転写活性化(VP64融合構築物)および抑制(Cas9のみ)をRT-qPCRにより評価する。本出願人らは、抗His抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Surveyorヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、およびゲルシフトアッセイを使用してDNA結合親和性を評価する。
dCas9を汎用DNA結合ドメインとして使用して遺伝子発現を抑制し得ることがこれまでに示されている。本出願人らは、改良されたdCas9設計ならびにリプレッサードメインKRABおよびSID4xに対するdCas9融合を報告する。表1におけるCas9を使用して転写を調節するため作成されたプラスミドライブラリから、以下のリプレッサープラスミドがqPCRにより機能的に特徴付けられた:pXRP27、pXRP28、pXRP29、pXRP48、pXRP49、pXRP50、pXRP51、pXRP52、pXRP53、pXRP56、pXRP58、pXRP59、pXRP61、およびpXRP62。
本出願人らは、ウイルス送達系あるいはナノ粒子送達系を用いた、代謝疾患、アミロイドーシスおよびタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異および転座により生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、および他の関連症状に罹患した、必要性のある対象または患者における肝組織、脳組織、眼組織、上皮組織、造血組織、または別の組織でのCRISPR-Cas系の遺伝子送達を実証する。
各候補疾患遺伝子について、本出願人らは目的のDNA配列を選択し、それにはタンパク質コードエクソン、既知のドミナントネガティブ突然変異部位を含みかつそれに隣接する配列、病的反復配列を含みかつそれに隣接する配列が含まれる。遺伝子ノックアウト手法に関して、開始コドンに最も近接した初期コードエクソンが、完全なノックアウトを達成し、かつ部分的な機能を保持するトランケート型タンパク質産物となる可能性を最小限に抑えるのに最良の選択肢を提供する。
ガイド配列は二本鎖20~24bpオリゴヌクレオチドとして合成される。オリゴを5’-リン酸化処理し、アニーリングにより二重鎖を形成した後、オリゴを送達方法に応じた好適なベクターにライゲートする:
AAVベースのベクター(PX260、330、334、335)が他の部分に記載されている。
レンチウイルスベースのベクターは、U6プロモーターによってドライブされるキメラRNA足場と、EF1aプロモーターによってドライブされるCas9またはCas9ニッカーゼとを担持する単一のベクターにガイド配列を直接ライゲートする同様のクローニング戦略を用いる。
1.T7プロモーター-ガイド配列キメラRNAをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖としてガイド配列を合成する。T7プロモーターをCas9の5’にPCR方法によって付加する。
ガイド配列を、上記および本出願の他の部分に記載するとおりAAVプラスミドにクローニングする。
形質移入
1.DNAプラスミド形質移入
ガイド配列を担持するプラスミドをヒト胎児腎臓(HEK293T)細胞またはヒト胚性幹(hES)細胞、他の関連性のある細胞型に、脂質ベース、化学ベースまたはエレクトロポレーションベースの方法を使用して形質移入する。HEK293T細胞の24ウェル形質移入(約260,000細胞)に対しては、500ngの総DNAを、リポフェクタミン2000を使用して各ウェルに形質移入する。hES細胞の12ウェル形質移入に対しては、1ugの総DNAを、Fugene HDを使用して単一のウェルに形質移入する。
上記に記載する精製RNAを、HEK293T細胞への形質移入に使用する。1~2ugのRNAを、製造者の指示に従いリポフェクタミン2000を使用して約260,000個に形質移入し得る。Cas9およびキメラRNAのRNA送達を図10に示す。
形質移入後72時間で細胞を回収し、二本鎖切断の指標としてのインデル形成に関してアッセイする。
送達機構
AAVまたはレンチウイルス作製については他の部分に記載される。
市販のキットを使用して、マウスにおけるDNAプラスミドの流体力学的尾静脈注射を実施する。
Cas9およびガイド配列は、ウイルス、ナノ粒子コーティングRNA混合物、またはDNAプラスミドとして送達され、被験動物に注射される。並行する一組の対照動物に、滅菌生理食塩水、Cas9およびGFP、またはガイド配列およびGFP単独を注射する。
市販キットを使用して組織からDNAを抽出する;インデルアッセイは、インビトロ実証について記載されるとおり実施し得る。
研究設計
I.遺伝子標的の同定および設計
・実施例16に記載される
II.送達系に対するガイド配列および修復テンプレートのクローニング
・上記の実施例16に記載される
・本出願人らは、罹患アレルを含む相同性アームを含めるためのDNA修復テンプレートならびに野生型修復テンプレートをクローニングする
III.細胞系に関するインビトロ検証
a.形質移入については、上記の実施例16に記載される;Ca9、ガイドRNA、および修復テンプレートを関連性のある細胞型に同時形質移入する。
b.インビトロ修復アッセイ
i.本出願人らは形質移入後72時間で細胞を回収し、修復に関してアッセイする
ii.簡潔に言えば、本出願人らは修復テンプレートの周りのゲノム領域を、高フィデリティポリメラーゼを使用してPCR増幅する。本出願人らは突然変異体アレルの発生率の低下に関して産物を配列決定する。
IV.動物におけるインビボ原理証明
a.送達機構については、上記の実施例16および29に記載される。
b.インビボ修復アッセイ
i.本出願人らは、インビトロ実証に記載するとおり修復アッセイを実施する。
V.治療適用
CRISPR-Cas系は、候補疾患遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された標的欠失の達成に適している。例としては、数ある障害の中でも特に、コレステロールおよび脂肪酸代謝、アミロイド病、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染症に関与する遺伝子が挙げられる。
緑内障:本出願人らは、ミオシリン(mycilin)(MYOC)遺伝子の第1のエクソンをターゲティングするガイドRNAを設計する。本出願人らはアデノウイルスベクター(Ad5)を使用してCas9ならびにMYOC遺伝子をターゲティングするガイドRNAの両方をパッケージングする。本出願人らはこのアデノウイルスベクターを、細胞が緑内障の病態生理に関係付けられている小柱網に注入する。本出願人らは、初めにこれを、突然変異MYOC遺伝子を有するマウスモデルで試験して、アデノウイルスベクターが視力を改善し、および眼圧を低下させるかどうかを見る。ヒトにおける治療適用も同様の戦略を用いる。
慢性ウイルス感染症は、有意な罹患率および死亡率の原因である。これらのウイルスの多くに関しては、ウイルス複製の種々の側面を有効にターゲティングする従来の抗ウイルス治療薬が存在するが、現在の治療モダリティは、通常、「ウイルス潜伏」に起因して非治癒的な性質のものである。その性質上、ウイルス潜伏は、活性のあるウイルス産生のないウイルスのライフサイクルにおける休眠期により特徴付けられる。この期間中、ウイルスは大部分が免疫監視機構および従来の治療薬の両方を回避することができるため、ウイルスが宿主内に長期にわたるウイルスリザーバを構築することが可能となり、続いてそこから再活性化し、ウイルスの伝播および伝染を続行することができる。ウイルス潜伏の鍵は、ウイルスゲノムを安定的に維持する能力であり、これは、それぞれウイルスゲノムを細胞質に貯えるかまたはそれを宿主ゲノムにインテグレートするものであるエピソーム潜伏またはプロウイルス潜伏のいずれかによって達成される。初感染を防ぐ有効なワクチン接種がない場合、潜伏リザーバおよび溶菌作用のエピソードにより特徴付けられる慢性ウイルス感染症は重大な影響を及ぼし得る:ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌をもたらすことがあり、C型肝炎ウイルス(HCV)は肝細胞癌の原因となり、およびヒト免疫不全ウイルスは最終的には宿主免疫系を破壊して日和見感染に対する感受性をもたらす。このように、これらの感染症では、現在利用可能な抗ウイルス治療薬の生涯にわたる使用が必要となる。さらに問題を複雑にしているのは、これらのウイルスゲノムの多くの高い変異性であり、これが有効な治療の存在しない耐性株の進化につながっている。
本発明の態様は、CRISPR-Cas遺伝子治療粒子と生体適合性医薬担体とを含み得る医薬組成物を提供する。別の態様によれば、CFTR遺伝子に突然変異を有する対象を治療するための遺伝子治療方法は、対象の細胞に治療有効量のCRISPR-Cas遺伝子治療粒子を投与することを含む。
本出願人らはヒトCFTRゲノム遺伝子座を解析し、Cas9標的部位を同定した(図13A)。(PAMはNGGまたはNNAGAAWモチーフを含み得る)。
本出願人らは、Cas9(またはCas9ニッカーゼ)およびガイドRNAを含むアデノウイルス/AAVベクター系を、F508残基を含有する相同性修復テンプレートを含むアデノウイルス/AAVベクター系と共に対象に、先に考察した送達方法の一つによって導入する。CRISPR-Cas系はCFTRΔ 508キメラガイドRNAによりガイドされ、ニックを入れられるかあるいは開裂されるCFTRゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。開裂後、嚢胞性線維症をもたらしまたは嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を補修する相同組換えによって開裂部位に修復テンプレートが挿入される。適切なガイドRNAでCRISPR系を直接送達し、その全身性の導入を提供するこの戦略を用いて遺伝子突然変異をターゲティングし、表Bにあるような代謝、肝臓、腎臓およびタンパク質の疾患および障害を引き起こす遺伝子を編集または他の方法で操作することができる。
本実施例は、各細胞がノックアウトされた単一遺伝子を有する細胞ライブラリを作成する方法を実証する:
本出願人らは、ES細胞のライブラリであって、各細胞はノックアウトされた単一遺伝子を有し、かつES細胞のライブラリ全体はあらゆる単一遺伝子がノックアウトされているライブラリを作製する。このライブラリは、細胞プロセスならびに疾患における遺伝子機能のスクリーニングに有用である。
Cas9を送達する方法
方法1:本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Hsp70A-Rbc S2またはベータ2-チューブリンの制御下でCas9を発現するベクターを使用してCas9およびガイドRNAを送達する。
Chlamydomonas Resource Centerからのコナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)株CC-124およびCC-125を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、GeneArt Chlamydomonas Engineeringキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。
pChlamy1-Cas9:
タンパク質コード配列の突然変異が関与する疾患:
優性障害は、ドミナントネガティブアレルを不活性化することによりターゲティングされ得る。本出願人らは、Cas9を使用してドミナントネガティブアレルにおけるユニーク配列をターゲティングし、NHEJによって突然変異を導入する。NHEJによって誘導されるインデルは、ドミナントネガティブアレルにフレームシフト突然変異を導入してドミナントネガティブタンパク質を除去することが可能であり得る。これは遺伝子がハプロ不全でない(haplo-sufficient)場合に機能し得る(例えばMYOC突然変異によって生じる緑内障およびハンチントン病)。
本出願人らは、Cas9を使用してプロモーター領域の非コード配列を破壊し、転写因子結合部位を変化させ、およびエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを変化させる。例えば、Cas9を使用して造血幹細胞のKlf1エンハンサーEHS1を切り出すことにより、BCL11aレベルを低下させ、分化した赤血球における胎児グロビン遺伝子発現を再活性化し得る。
本出願に詳説されるCas9の最適化の態様および教示を使用してCas9ニッカーゼもまた作成し得る。本出願人らは、Cas9ニッカーゼをガイドRNAのペアと組み合わせて使用して、規定のオーバーハングを有するDNA二本鎖切断を作成する。ガイドRNAの2つのペアが使用されるとき、介在するDNA断片を切り出すことが可能である。2つのガイドRNAペアで外来性DNA断片を開裂することによってゲノムDNAと適合性のオーバーハングを作成する場合、外来性DNA断片をゲノムDNAにライゲートして切り出された断片を置き換え得る。例えば、これを用いてハンチンチン(huntintin)(HTT)遺伝子のトリヌクレオチドリピート伸長を除去し、ハンチントン病を治療し得る。
Cas9およびそのキメラガイドRNA、またはtracrRNAとcrRNAとの組み合わせは、DNAとしても、あるいはRNAとしても送達することができる。Cas9およびガイドRNAを両方ともにRNA(普通のまたは塩基もしくは骨格改変を含む)分子として送達することを用いて、Cas9タンパク質が細胞内に留まる時間を低減することができる。これにより標的細胞におけるオフターゲット開裂活性のレベルが低下し得る。mRNAとしてのCas9の送達はタンパク質に翻訳されるまでに時間がかかるため、Cas9 mRNAを送達した数時間後にガイドRNAを送達して、Cas9タンパク質との相互作用に利用可能なガイドRNAのレベルを最大化することが有利であり得る。
本出願者らはCas9オルソログ(図3および図4A~図4F)を分析することにより、関連するPAM配列および対応するキメラガイドRNAを同定した。この拡張PAMセットは、ゲノムにわたるより広範囲のターゲティングを提供し、またユニークな標的部位の数を大幅に増加させ、ゲノムにおいて高い特異性レベルの新規Cas9を同定し得る可能性を提供し得る。本出願者らは、黄色ブドウ球菌種アウレウス(Staphylococcus aureus sp.Aureus)Cas9のPAMがNNGRRであることを決定した。黄色ブドウ球菌種アウレウス(Staphylococcus aureus sp.Aureus)Cas9はSaCas9としても知られる。
本出願で既述したとおり、CRISPR複合体の標的ポリヌクレオチドは複数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドを含んでもよく、それらの疾患関連遺伝子の一部はトリヌクレオチドリピート障害と称される(またトリヌクレオチドリピート伸長障害、トリプレットリピート伸長障害またはコドン反復障害とも称される)一連の遺伝的障害に属し得る。
疾患がフラタキシンの発現低下に起因するため、この場合にsiRNAノックダウンは適用できない。ウイルス遺伝子療法が現在調査されている。動物モデルにおいてHSV-1ベースのベクターを使用してフラタキシン遺伝子が送達され、治療効果が示されている。しかしながら、ウイルスベースのフラタキシン送達の長期有効性は、いくつかの問題を抱えている:第一に、フラタキシンの発現を健常者の天然レベルに一致するように調節することが困難であり、第二に、フラタキシンの長期過剰発現は細胞死を引き起こす。
Cas9を使用してゲノムを改変するよりむしろ、本出願人らはまた、Cas9(ヌクレアーゼ活性欠損)ベースのDNA結合ドメインを使用して転写活性化ドメインをFXN遺伝子にターゲティングすることでFXN遺伝子を直接活性化し得る。本出願人らは、Cas9媒介性の人為的な転写活性化のロバスト性について取り組み、それが他の方法と比較して十分にロバストであることを確実にする必要があり得る(Tremblay et al.,「転写活性化因子様エフェクタータンパク質はフラタキシン遺伝子の発現を誘導する(Transcription Activator-Like Effector Proteins Induce the Expression of the Frataxin Gene)」;Human Gene Therapy.August 2012,23(8):883-890)。
本出願において既述したとおり、Cas9を、以下の1つ以上の突然変異を介して一本鎖開裂を媒介し得るように突然変異させ得る:D10A、E762A、およびH840A。
ラフォラ病-ニューロンにおけるグリコーゲンを低下させるための標的GSY1またはPPP1R3C(PTG)。
標的配列をペア(LおよびR)で列挙し、ここではスペーサーにおけるヌクレオチドの数は異なる(0~3bp)。各スペーサーそれ自体を野生型Cas9と共に使用して標的遺伝子座に二本鎖切断を導入し得る。
1.ガイドRNAの5’におけるヌクレオチドは、天然RNAのようなリン酸エステル結合よりむしろ、チオールエステル結合で連結され得る。チオールエステル結合は、内因性RNA分解機構によるガイドRNAの消化を防止し得る。
2.ガイドRNAのガイド配列(5’20bp)におけるヌクレオチドは、結合特異性を改善するためのベースとして架橋核酸(bridged nucleic acid:BNA)を使用することができる。
本発明の態様は、標的設計後3~4日以内に遺伝子改変の効率および特異性を試験することができ、かつ2~3週間以内に改変されたクローン細胞系を得ることができるプロトコルおよび方法に関する。
オフターゲット開裂活性の考慮点:他のヌクレアーゼと同様に、Cas9は低い頻度でゲノムにおけるオフターゲットDNA標的を開裂し得る。所与のガイド配列がオフターゲット活性を呈する程度は、酵素濃度、用いられる特定のガイド配列の熱力学、および標的ゲノムにおける同様の配列の存在量を含めた複合的な要因に依存する。Cas9の常法の適用については、オフターゲット開裂の程度を最小限に抑えるとともに、オフターゲット開裂の存在を検出可能である方法を考慮することが重要である。
SURVEYORヌクレアーゼアッセイ:本出願人らは、SURVEYORヌクレアーゼアッセイ(またはPCRアンプリコンシーケンシングのいずれかによりインデル突然変異を検出した。本出願人らのオンラインCRISPR標的設計ツールは、両方の手法に推奨されるプライマーを提供する。しかしながら、SURVEYORまたはシーケンシングプライマーはまた、ゲノムDNAから目的の領域を増幅し、かつ非特異的なアンプリコンを回避するようにNCBIプライマーBlastを使用して手動で設計されてもよい。SURVEYORプライマーは、ゲル電気泳動による開裂バンドの明確な可視化を可能にするため、Cas9標的の両側で300~400bp(600~800bpの総アンプリコンに対して)を増幅するように設計されなければならない。過剰なプライマー二量体形成を防ぐため、SURVEYORプライマーは、典型的には融解温度が約60℃の25nt長未満であるように設計されなければならない。本出願人らは、特定のPCRアンプリコンに対する候補プライマーの各ペアを試験し、ならびにSURVEYORヌクレアーゼ消化プロセスの間に非特異的な開裂が存在しないことについても試験することを推奨する。
sgRNA調製:
超高純度DNアーゼRNアーゼ不含蒸留水(Life Technologies、カタログ番号10977-023)
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
重要。標準Taqポリメラーゼ、これは3’-5’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠いており、フィデリティが低く、増幅エラーをもたらし得る。Herculase IIは高フィデリティポリメラーゼ(Pfuと同等のフィデリティ)であり、最小限の最適化で高収率のPCR産物を生じる。他の高フィデリティポリメラーゼに代えてもよい。
Herculase II反応緩衝液(5×;Agilent Technologies、ポリメラーゼと同梱)
dNTP溶液ミックス(各25mM;Enzymatics、カタログ番号N205L)
MgCl2(25mM;ThermoScientific、カタログ番号R0971)
QIAquickゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)
QIAprep spinミニプレップキット(Qiagen、カタログ番号27106)
超高純度TBE緩衝液(10×;Life Technologies、カタログ番号15581-028)
SeaKem LEアガロース(Lonza、カタログ番号50004)
SYBR Safe DNA染色(10,000×;Life Technologies、カタログ番号S33102)
1kb Plus DNAラダー(Life Technologies、カタログ番号10787-018)
TrackIt CyanOrangeローディング緩衝液(Life Technologies、カタログ番号10482-028)
FastDigest BbsI(BpiI)(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号FD1014)
Fermentas Tango緩衝液(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号BY5)
DL-ジチオスレイトール(DTT;Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号R0862)
T7 DNAリガーゼ(Enzymatics、カタログ番号L602L)
重要:より一般的に用いられるT4リガーゼを代用しないこと。T7リガーゼは付着末端で平滑末端と比べて1,000倍高い活性を有し、かつ市販の高濃度T4リガーゼと比べて全体的な活性が高い。
T7 2×迅速ライゲーション緩衝液(T7 DNAリガーゼと同梱、Enzymatics、カタログ番号L602L)
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs、カタログ番号M0201S)
T4DNAリガーゼ反応緩衝液(10×;New England Biolabs、カタログ番号B0202S)
アデノシン5’-三リン酸(10mM;New England Biolabs、カタログ番号P0756S)
PlasmidSafe ATP依存性DNアーゼ(Epicentre、カタログ番号E3101K)
One Shot Stbl3化学的コンピテント大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)(Life Technologies、カタログ番号C7373-03)
SOC培地(New England Biolabs、カタログ番号B9020S)
LB培地(Sigma、カタログ番号L3022)
LB寒天培地(Sigma、カタログ番号L2897)
アンピシリン、滅菌ろ過済み(100mg ml-1;Sigma、カタログ番号A5354)
HEK293FT細胞(Life Technologies、カタログ番号R700-07)
ダルベッコ最小イーグル培地(DMEM、1×、高グルコース;Life Technologies、カタログ番号10313-039)
ダルベッコ最小イーグル培地(DMEM、1×、高グルコース、フェノールレッド不含;Life Technologies、カタログ番号31053-028)
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1×;Life Technologies、カタログ番号14190-250)
ウシ胎仔血清、適格品(qualified)かつ熱失活済み(Life Technologies、カタログ番号10438-034)
Opti-MEM I低血清培地(FBS;Life Technologies、カタログ番号11058-021)
ペニシリン-ストレプトマイシン(100×;Life Technologies、カタログ番号15140-163)
TrypLE(商標)Express(1×、フェノールレッド不含;Life Technologies、カタログ番号12604-013)
リポフェクタミン2000形質移入試薬(Life Technologies、カタログ番号11668027)
Amaxa SF細胞系4D-Nucleofector(登録商標)XキットS(32 RCT;Lonza、カタログ番号V4XC-2032)
HUES 9細胞系(HARVARD STEM CELL SCIENCE)
Geltrex LDEV不含低成長因子基底膜マトリックス(Life Technologies、カタログ番号A1413201)
mTeSR1培地(Stemcell Technologies、カタログ番号05850)
Accutase細胞剥離液(Stemcell Technologies、カタログ番号07920)
ROCK阻害薬(Y-27632;Millipore、カタログ番号SCM075)
Amaxa P3初代細胞4D-Nucleofector(登録商標)XキットS(32 RCT;Lonzaカタログ番号V4XP-3032)
QuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre、カタログ番号QE09050)
SURVEYOR、RFLP分析、またはシーケンシング用のPCRプライマー(プライマー表参照)
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
重要。Surveyorアッセイは一塩基ミスマッチの感度を有するため、高フィデリティポリメラーゼを使用することが特に重要である。他の高フィデリティポリメラーゼに代えてもよい。
Herculase II反応緩衝液(5×;Agilent Technologies、ポリメラーゼと同梱)
dNTP溶液ミックス(各25mM;Enzymatics、カタログ番号N205L)
QIAquickゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)
Taq緩衝液(10×;Genscript、カタログ番号B0005)
標準ゲル電気泳動用のSURVEYOR突然変異検出キット(Transgenomic、カタログ番号706025)
超高純度TBE緩衝液(10×;Life Technologies、カタログ番号15581-028)
SeaKem LEアガロース(Lonza、カタログ番号50004)
4~20%TBEゲル 1.0mm、15ウェル(Life Technologies、カタログ番号EC62255BOX)
Novex(登録商標)高密度TBE試料緩衝液(5×;Life Technologies、カタログ番号LC6678)
SYBR Gold核酸ゲル染色(10,000×;Life Technologies、カタログ番号S-11494)
1kb Plus DNAラダー(Life Technologies、カタログ番号10787-018)
TrackIt CyanOrangeローディング緩衝液(Life Technologies、カタログ番号10482-028)
FastDigest HindIII(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号FD0504)
フィルター付き滅菌ピペットチップ(Corning)
標準1.5ml微量遠心管(Eppendorf、カタログ番号0030 125.150)
Axygen96ウェルPCRプレート(VWR、カタログ番号PCR-96M2-HSC)
Axygen 8ストリップPCRチューブ(Fischer Scientific、カタログ番号14-222-250)
Falconチューブ、ポリプロピレン、15ml(BD Falcon、カタログ番号352097)
Falconチューブ、ポリプロピレン、50ml(BD Falcon、カタログ番号352070)
細胞ストレーナーキャップ付き丸底チューブ、5ml(BD Falcon、カタログ番号352235)
ペトリ皿(60mm×15mm;BD Biosciences、カタログ番号351007)
組織培養プレート(24ウェル;BD Falcon、カタログ番号353047)
組織培養プレート(96ウェル、平底;BD Falcon、カタログ番号353075)
組織培養皿(100mm;BD Falcon、353003)
プログラム可能な温度ステッピング機能付き96ウェルサーモサイクラー(Applied Biosystems Veriti、カタログ番号4375786)。
卓上微量遠心機5424、5804(Eppendorf)
ゲル電気泳動システム(PowerPac basic power supply、Bio-Rad、カタログ番号164-5050、およびSub-Cell GTシステムゲルトレー、Bio-Rad、カタログ番号170-4401)
Novex XCell SureLock Mini-Cell(Life Technologies、カタログ番号EI0001)
デジタルゲルイメージングシステム(GelDoc EZ、Bio-Rad、カタログ番号170-8270、および青色試料トレー、Bio-Rad、カタログ番号170-8273)
青色光トランスイルミネーターおよびオレンジフィルターゴーグル(SafeImager 2.0;Invitrogen、カタログ番号G6600)
ゲル定量化ソフトウェア(Bio-Rad、ImageLab、GelDoc EZと同梱、または国立衛生研究所(National Institutes of Health)のオープンソースImageJ、ウェブサイトrsbweb.nih.gov/ij/で利用可能)
紫外分光光度計(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific)
トリス-ホウ酸EDTA(TBE)電気泳動溶液 TBE緩衝液を蒸留水に希釈し、アガロースゲルをキャスティングするためおよびゲル電気泳動用緩衝液として使用するための1×ワーキング溶液とする。緩衝液は室温(18~22℃)で少なくとも1年間保存しておくことができる。
ターゲティング成分の設計およびオンラインツールの使用・タイミング1日
1|標的ゲノムDNA配列を入力する。本出願人らは、目的の入力配列を受け取り、好適な標的部位を同定してそれに順位を付け、および意図する標的毎にオフターゲット部位を計算的に予測するオンラインCas9ターゲティング設計ツールを提供する。あるいは、任意の5’-NGGの直ちに上流で20bp配列を同定することにより、ガイド配列を手動で選択してもよい。
3|sgRNA発現構築物を作成するため、PCRベースまたはプラスミドベースのいずれのプロトコルも用いることができる。
(i)本出願人らは希釈U6 PCRテンプレートを調製する。本出願人らはPX330をPCRテンプレートとして使用することを推奨するが、任意のU6含有プラスミドを同様にPCRテンプレートとして使用することができる。本出願人らはテンプレートを10ng/ulの濃度となるようにddH2Oで希釈した。U6によってドライブされるsgRNAを既に含んでいるプラスミドまたはカセットがテンプレートとして使用される場合、ゲル抽出を実施して、産物が意図したsgRNAのみを含み、テンプレートからのsgRNAキャリーオーバーの痕跡を含まないことを確実にする必要がある点に留意されたい。
(i)sgRNAオリゴインサートを調製する。本出願人らは、各sgRNA設計について、100uMの最終濃度となるようにオリゴの上部鎖および下部鎖を再懸濁した。オリゴを以下のとおりリン酸化およびアニーリングする:
37℃で30分
95℃で5分
毎分5℃で25℃まで下降させる。
3|ssODNを設計および注文する。センスまたはアンチセンスのいずれかのssODNを供給業者から直接購入することができる。本出願人らは、両側に少なくとも40bpおよび最適なHDR効率のためには90bpの相同性アームを設計することを推奨する。本出願人らの経験上、改変効率はアンチセンスオリゴの方がやや高い。
CRISPR-Cas系は多くの哺乳類細胞系で使用されている。細胞系毎に条件が異なり得る。以下のプロトコルは、HEK239FT細胞の形質移入条件を詳説する。ssODN媒介性HDR形質移入に関する注記として、ssODNの最適な送達のためAmaxa SF細胞系Nucleofectorキットが使用される。これは次節に記載する。
15|ターゲティングプラスミドを線状化する。ターゲティングベクターは、可能な場合には、相同性アームの一方の近傍またはいずれかの相同性アームの遠位端におけるベクター骨格中の制限部位で1回切断することにより線状化する。
hESC(HUES9)株の維持。本出願人らはHUES9細胞系をmTeSR1培地による無フィーダー条件に常法で維持する。本出願人らは、基本培地と同梱の5×サプリメントおよび100ug/ml Normocinを添加することによりmTeSR1培地を調製した。本出願人らは、10uM Rock阻害薬をさらに補給したmTeSR1培地の10mlアリコートを調製した。組織培養プレートをコーティングする。冷GelTrexを冷DMEMに1:100希釈し、100mm組織培養プレートの表面全体をコーティングする。
形質移入後24時間でFACSによるかまたは段階希釈によりクローン単離を実施し得る。
66|本出願人らは上記に記載したとおり24ウェルプレートから細胞を解離した。確実に単一細胞に解離する。細胞ストレーナーを使用して細胞の凝集を防ぐことができる。
形質移入細胞の開裂効率をアッセイする前に、本出願人らは、以下に記載するプロトコルを使用するSURVEYORヌクレアーゼ消化のステップにより陰性(形質移入されていない)対照試料でそれぞれの新規SURVEYORプライマーを試験することを推奨する。時折、シングルバンドのクリーンなSURVEYOR PCR産物であっても非特異的SURVEYORヌクレアーゼ開裂バンドを生じ、正確なインデル分析を妨げる可能性がある。
91|
最初のステップは、SURVEYORアッセイのステップ71~79と同じである。注:フォワードおよびリバースプライマーに適切な制限部位が付加される場合、サンガーシーケンシングにSURVEYORプライマーを用い得る。推奨されるpUC19骨格へのクローニングに関しては、フォワードプライマーにEcoRIおよびリバースプライマーにHindIIIを用い得る。
100|上記に記載したとおり、欠失させる領域を標的にするsgRNAのペアを細胞に形質移入した。
109|本出願人らは上記に記載したとおりQuickExtract溶液を使用してDNAを回収し、ゲノムDNAを100~200ng/ulの最終濃度となるようにTEで標準化した。
ii.本出願人らは、ローディング色素を含む10ulの消化産物を、4~20%勾配ポリアクリルアミドTBEゲル上でキシレンシアノールバンドが移動してゲルの底に達するまで泳動させた。
オンラインCRISPR標的設計ツールは、同定された標的部位のそれぞれについて候補ゲノムオフターゲット部位を作成する。これらの部位でのオフターゲット分析は、SURVEYORヌクレアーゼアッセイ、サンガーシーケンシング、または次世代ディープシーケンシングにより実施することができる。これらの部位の多くで改変率が低いまたは検出不能である可能性を考えると、本出願人らは、高感度および高精度のためのIllumina Miseqプラットフォームによるディープシーケンシングを推奨する。プロトコルはシーケンシングプラットフォームによって異なり得る;ここで本出願人らは、シーケンシングアダプターをつなぎ合わせるための融合PCR方法について簡単に記載する。
ステップ1~2 sgRNAオリゴおよびssODNの設計および合成:1~5日、供給業者によって変動
ステップ3~5 CRISPRプラスミドまたはPCR発現カセットの構築:2時間~3日
ステップ6~53 細胞系への形質移入:3日(1時間のハンズオン時間)
ステップ54~70 任意選択のクローン株誘導:1~3週間、細胞型によって変動
ステップ71~91 SURVEYORによるNHEJの機能検証:5~6時間
ステップ92~124 サンガー法または次世代ディープシーケンシングによる遺伝子タイピング:2~3日(3~4時間のハンズオン時間)
CRISPR-Casは容易に多重化し得るため、いくつかの遺伝子の同時改変が促進され、かつ高効率で染色体微小欠失が媒介される。本出願人らは2つのsgRNAを使用することにより、HEK293FT細胞において最大68%の効率でのヒトGRIN2BおよびDYRK1A遺伝子座の同時標的化を実証した。同様に、sgRNAのペアを使用することによりエクソンの切り出しなどの微小欠失を媒介することができ、これはクローンレベルでPCRにより遺伝子型決定され得る。エクソン接合部の正確な位置は異なり得ることに留意されたい。本出願人らはまた、ssODNおよびターゲティングベクターを使用したHEK 293FT細胞およびHUES9細胞におけるCas9の野生型およびニッカーゼ突然変異体の両方によるHDRの媒介も実証した(図12)。本出願人らはCas9ニッカーゼを使用したHUES9細胞でのHDRを検出できていないことに留意されたく、これはHUES9細胞における修復活性の低い効率または潜在的な違いに起因し得る。これらの値は典型的であるが、所与のsgRNAの開裂効率にはいくらかのばらつきがあり、まれにある種のsgRNAは、未だ解明されていない理由により機能しないこともある。本出願人らは、各遺伝子座につき2つのsgRNAを設計し、かつ意図される細胞型におけるそれらの効率を試験することを推奨する。
Cas9転写モジュレーター:本出願人らは、Cas9/gRNA CRISPR系を、DNA開裂の域を越える機能が遂行され得る汎用DNA結合システムに転換しようと試みた。例えば、1つまたは複数の機能ドメインを触媒的に不活性なCas9と融合することにより、本出願人らは新規機能、例えば転写活性化/抑制、メチル化/脱メチル化、またはクロマチン改変を付与している。この目標を達成するため、本出願人らは、ヌクレアーゼ活性に必須の2つの残基D10およびH840をアラニンに変えることにより、触媒的に不活性なCas9突然変異体を作製した。これらの2つの残基を突然変異させることにより、Cas9のヌクレアーゼ活性を消失させ、一方で標的DNAとの結合能は維持する。本出願人らが自らの仮説を検証するため着目することに決めた機能ドメインは、転写活性化因子VP64ならびに転写リプレッサーSIDおよびKRABである。
材料および試薬
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
10× NE緩衝液 4(NEB、カタログ番号B7004S)
BsaI HF(NEB、カタログ番号R3535S)
T7 DNAリガーゼ(Enzymatics、カタログ番号L602L)
Fast Digest緩衝液、10×(ThermoScientific、カタログ番号B64)
FastDigest NotI(ThermoScientific、カタログ番号FD0594)
FastAPアルカリホスファターゼ(ThermoScientific、カタログ番号EF0651)
リポフェクタミン2000(Life Technologies、カタログ番号11668-019)
トリプシン(Life Technologies、カタログ番号15400054)
鉗子#4(Sigma、カタログ番号Z168777-1EA)
鉗子#5(Sigma、カタログ番号F6521-1EA)
10× ハンクス平衡塩類溶液(Sigma、カタログ番号H4641-500ML)
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Life Technologies、カタログ番号P4333)
Neurobasal(Life Technologies、カタログ番号21103049)
B27サプリメント(Life Technologies、カタログ番号17504044)
L-グルタミン(Life Technologies、カタログ番号25030081)
グルタミン酸塩(Sigma、カタログ番号RES5063G-A7)
β-メルカプトエタノール(Sigma、カタログ番号M6250-100ML)
HAウサギ抗体(Cell Signaling、カタログ番号3724S)
LIVE/DEAD(登録商標)細胞イメージングキット(Life Technologies、カタログ番号R37601)
30G World Precision Instrumentシリンジ(World Precision Instruments、カタログ番号NANOFIL)
定位固定装置(Kopf Instruments)
UltraMicroPump3(World Precision Instruments、カタログ番号UMP3-4)
スクロース(Sigma、カタログ番号S7903)
塩化カルシウム(Sigma、カタログ番号C1016)
酢酸マグネシウム(Sigma、カタログ番号M0631)
トリス-HCl(Sigma、カタログ番号T5941)
EDTA(Sigma、カタログ番号E6758)
NP-40(Sigma、カタログ番号NP40)
フェニルメタンスルホニルフルオリド(Sigma、カタログ番号78830)
塩化マグネシウム(Sigma、カタログ番号M8266)
塩化カリウム(Sigma、カタログ番号P9333)
β-グリセロリン酸(Sigma、カタログ番号G9422)
グリセロール(Sigma、カタログ番号G9012)
Vybrant(登録商標)DyeCycle(商標)Ruby染色(Life technologies、カタログ番号S4942)
FACS Aria Flu-act-細胞選別機(Koch Institute of MIT、Cambridge、米国)
DNAeasy血液および組織キット(Qiagen、カタログ番号69504)
インビボで脳において使用されるgRNA多重体の構築
本出願人らは、マウスTETおよびDNMTファミリーメンバーを標的にする単一のgRNAを設計し、PCR増幅した(本明細書に記載されるとおり)。標的化効率をN2a細胞系で評価した(図15)。インビボでいくつかの遺伝子の同時改変を達成するため、効率的なgRNAをAAVパッケージングベクターに多重化した(図16)。系の効率のさらなる分析を促進するため、本出願人らは、ヒトシナプシンIプロモーターの制御下にあるGFP-KASHドメイン融合タンパク質からなる発現カセットを系に加えた(図16)。この改変により、ニューロン集団における系の効率のさらなる分析が可能になる(さらに詳細な手順は「核の選別およびインビボ結果」の節にある)。
PCR産物消化:
AAV送達系は、そのユニークな特徴にも関わらず、パッキングに限界がある-インビボでの発現カセットの送達を成功させるには、4.7kb未満のサイズでなければならない。SpCas9発現カセットのサイズを小さくして送達を促進するため、本出願人らはいくつかの変更を試験した:異なるプロモーター、より短いポリAシグナルおよび最後により小さいバージョンの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来Cas9(SaCas9)(図19および図20)。試験した全てのプロモーターが、マウスMecp2(Gray et al.,2011)、ラットMap1bおよびトランケート型ラットMap1b(Liu and Fischer,1996)を含め、以前試験され、ニューロンにおいて活性であることが発表されたものである。代替的な合成ポリA配列は、同様に機能性であることが以前示されたものである(Levitt et al.,1989;Gray et al.,2011)。クローニングした全ての構築物を、リポフェクタミン2000による形質移入後にN2a細胞で発現させ、ウエスタンブロッティング法で試験した(図21)。
開発した系のニューロンにおける機能性を確認するため、本出願人らはインビトロで初代ニューロン培養物を使用する。Banker and Goslin(Banker and Goslin,1988)により既発表のプロトコルに従いマウス皮質ニューロンを調製した。
435ml H2O
50ml 10×ハンクス平衡塩類溶液
16.5ml 0.3M HEPES pH7.3
5ml ペニシリン-ストレプトマイシン溶液
ろ過(0.2μm)および保存4℃
97ml Neurobasal
2ml B27サプリメント
1ml ペニシリン-ストレプトマイシン溶液
250μl グルタミン
125μl グルタミン酸
本出願人らは、AAV送達後のニューロン培養物におけるSpCas9およびSaCas9の発現を、ウエスタンブロット法を用いて確認した(図24)。形質導入後1週間でニューロンをβ-メルカプトエタノール含有NuPage SDSローディング緩衝液に回収し、タンパク質を95℃で5分間変性させた。試料をSDS PAGEゲル上で分離し、WBタンパク質検出用のPVDF膜に移した。HA抗体でCas9タンパク質を検出した。
CRISPR系を含むAAVの毒性を評価するため、本出願人らはウイルス形質導入後1週間のニューロンの全体的な形態を調べた(図27)。加えて、本出願人らは、設計した系の潜在的毒性を、培養下の生細胞と死細胞との区別を可能にするLIVE/DEAD(登録商標)細胞イメージングキットで調べた。これは、細胞内エステラーゼ活性の存在(非蛍光カルセインAMから強度に緑色の蛍光カルセインへの酵素変換により決定されるとおりの)に基づく。他方で、キットの赤色の細胞不透過性成分は、破損した膜を有する細胞に限り侵入し、DNAに結合して死細胞で蛍光を生じる。両方のフルオロフォアとも、生細胞では蛍光顕微鏡法で容易に可視化され得る。初代皮質ニューロンにおけるCas9タンパク質および多重gRNA構築物のAAVドライブ発現は十分な忍容性を有し、非毒性であった(図25および図26)ことから、設計されたAAV系がインビボ試験に好適であることを示している。
McClure et al.,2011に記載される方法により濃縮ウイルスを作製した。HEK293FT細胞において上清ウイルス産生が生じた。
ウイルスベクター注入のため、10~15週齢雄性C57BL/6Nマウスをケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgのケタミン用量および10mg/kgのキシラジン用量)で腹腔内注射により麻酔した。先制鎮痛薬(1mg/kg)としてブプレネックス(Buprenex)の腹腔内(intraperitonial)投与を使用した。動物を、耳内位置決めスタッドおよびトゥースバーを使用してKopf定位固定装置に固定化し、固定された頭蓋を維持した。手持形ドリルを使用して、ブレグマの-3.0mm後方および3.5mm側方に、海馬のCA1野における注入用の穴(1~2mm)を開けた。30G World Precision Instrumentシリンジを2.5mmの深さで使用して、総容積1ulのAAVウイルス粒子の溶液を注入した。注入は「World Precision Instruments UltraMicroPump3」注入ポンプにより0.5ul/分の流量でモニタして組織損傷を防いだ。注入が完了した時点で注射針をゆっくりと、0.5mm/分の速度で取り出す。注入後、6-0 Ethilon縫合糸で皮膚を閉じた。動物を術後に1mLの乳酸加リンゲル液(皮下)で水分補給させ、歩行可能な回復に達するまで温度制御された(37℃)環境に収容した。術後3週間で深麻酔により動物を安楽死させ、続いて核選別のため組織を摘出するか、または免疫化学のため4%パラホルムアルデヒドを灌流させた。
本出願人らは、標識した細胞核の蛍光活性化細胞選別(FACS)ならびにDNA、RNAおよび核タンパク質の下流処理のためgRNA標的神経細胞核をGFPで特異的に遺伝的にタグ標識する方法を設計した。そのために、本出願人らの多重ターゲティングベクターが、GFPとマウス核膜タンパク質ドメインKASH(Starr DA,2011,Current biology)との間の融合タンパク質および目的の特異的遺伝子座を標的にする3つのgRNAの両方を発現するように設計された(図16)。GFP-KASHはヒトシナプシンプロモーターの制御下で発現してニューロンを特異的に標識した。融合タンパク質GFP-KASHのアミノ酸は以下であった:
いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子CHD8、KATNAL2、およびSCN2A;および症候性自閉症(アンジェルマン症候群)遺伝子UBE3Aが含まれる。これらの遺伝子および得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、本発明を任意の遺伝子に適用することができ、従って任意のモデルが可能であることを示している。
本明細書には、ハイスループットスクリーニング用途のために開発された、かつそれで特に上手く機能するAAV産生系またはプロトコルが提供され、しかしながらこれは、本発明においても同様により広い適用性を有する。内因性遺伝子発現の操作は、発現速度が、調節エレメント、mRNAプロセシング、および転写物の安定性を含めた多くの要因に依存するため、種々の難題を突きつける。この難題を解消するため、本出願人らは、送達用のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースのベクターを開発した。AAVはssDNAベースのゲノムを有し、従って組換えを起こしにくい。
500mlボトルDMEM高グルコース+Glutamax(GIBCO)
50ml Hyclone FBS(熱失活)(Thermo Fischer)
5.5ml HEPES溶液(1M、GIBCO)
細胞:低継代HEK293FT(ウイルス産生時の継代数<10、ウイルス産生には継代数2~4の新しい細胞を解凍し、3~5代成長させる)
50ml滅菌超高純度H2Oに50mg PEI「Max」を溶解する
pHを7.1に調整する
0.22umフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを-20℃で凍結する(保存のため、また直ちに使用してもよい)
D10+HEPES中で低継代HEK293FTを培養する
毎日1:2~1:2.5で継代する
有利には細胞を85%より高いコンフルエンシーに至らせない
-フラスコ当たり10ml HBSS(-Mg2+、-Ca2+、GIBCO)+1ml TrypLE Express(GIBCO)を37℃に温める(ウォーターバス)
培地を完全に吸引する
-10mlの温HBSSを穏やかに添加する(培地を完全に洗い流すため)
-フラスコ当たり1mlのTrypLEを添加する
-フラスコをインキュベーター(37℃)に1分間置く
-フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
-9mlのD10+HEPES培地(37℃)を添加する
-上下に5回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
-1:2~1:2.5(T75には12mlの培地)の比で分割する(細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない)
-十分な(大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの)細胞が存在するようになったら直ちにT225に移す
1000万細胞を15cmディッシュ中21.5ml培地にプレーティングする
37℃で18~22時間インキュベートする
80%コンフルエンスでの形質移入が理想的である
22ml培地(D10+HEPES)を予熱する
5.2ug 目的のベクターのプラスミド
4.35ug AAV血清型1プラスミド
4.35ug AAV血清型2プラスミド
10.4ug pDF6プラスミド(アデノウイルスヘルパー遺伝子)・ボルテックスして混合する
434uL DMEMを添加する(無血清!)
130ul PEI溶液を添加する
5~10秒間ボルテックスする
DNA/DMEM/PEI混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
15cmディッシュ中の培地をDNA/DMEM/PEI混合物に交換する
37℃インキュベーターに戻す
48時間インキュベートした後回収する(培地が過度に酸性にならないようにすること)
1.15cmディッシュから培地を慎重に吸引する(有利には細胞を押し退けない)
2.各プレートに25ml RT DPBS(Invitrogen)を添加し、細胞スクレーパーで細胞を穏やかに剥がし取る。50mlチューブに懸濁液を収集する。
3.800×gで10分間細胞をペレット化する。
4.上清を廃棄する。
5.ペレットを150mM NaCl、20mM トリス pH8.0中に再懸濁し、組織培養プレート当たり10mlを使用する。
6.dH2O中に10%デオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製する。これを0.5%の最終濃度で組織培養プレート当たり1.25ml添加する。ベンゾナーゼ(benzonase)ヌクレアーゼを50単位/mlの最終濃度となるように添加する。チューブを徹底的に混合する。
7.37℃で1時間(ウォーターバス)インキュベートする。
8.3000×gで15分間遠心することにより細胞残屑を除去する。新鮮な50mlチューブに移し、ヘパリンカラムの詰まりを防ぐため、全ての細胞残屑が除去されたことを確実にする。
1.蠕動ポンプを使用して、溶液が毎分1mlでカラムを通って流れるようにHiTrapヘパリンカラムをセットアップする。ヘパリンカラム内に気泡が取り込まれないよう確実にすることが重要である。
2.蠕動ポンプを使用して、10ml 150mM NaCl、20mM トリス、pH8.0でカラムを平衡化する。
3.ウイルスの結合:50mlウイルス溶液をカラムに加え、中を通って流れさせる。
4.洗浄ステップ1:カラムを20ml 100mM NaCl、20mM トリス、pH8.0で(蠕動ポンプを使用)。
5.洗浄ステップ2:3mlまたは5mlシリンジを使用して、1ml 200mM NaCl、20mM トリス、pH8.0、続いて1ml 300mM NaCl、20mM トリス、pH8.0でカラムの洗浄を続ける。
フロースルーは廃棄する。
(上記のウイルス溶液を50分間流す間、種々の緩衝液でシリンジを調製する)
6.溶出 5mlシリンジおよび軽い圧力(<1ml/分の流量)を使用して、以下を加えることによりカラムからウイルスを溶出させる:
1.5ml 400mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
3.0ml 450mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
1.5ml 500mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
これらを15ml遠心管に収集する。
1.濃縮ステップ1:100,000分子量カットオフのAmicon ultra 15ml遠心フィルターユニットを使用して、溶出したウイルスを濃縮する。カラム溶出物を濃縮機にロードし、2000×gで2分間遠心する(室温で。濃縮された容積を確認する-約500μlとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで1分間隔で遠心する。
2.緩衝液交換:1mlの滅菌DPBSをフィルターユニットに添加し、正しい容積(500ul)に達するまで1分間隔で遠心する。
3.濃縮ステップ2:500ulの濃縮物をAmicon Ultra 0.5ml 100Kフィルターユニットに添加する。6000gで2分間遠心する。濃縮された容積を確認する-約100μlとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで1分間隔で遠心する。
4.回収:フィルターインサートを反転させ、新鮮な収集チューブに挿入する。1000gで2分間遠心する。
アリコートに分け、-80℃で凍結する
典型的には注入部位当たり1ulが必要であり、従って少量のアリコート(例えば5ul)が推奨される(ウイルスの凍結融解を回避する)。
qPCRを使用してDNアーゼI耐性GC粒子力価を決定する(別個のプロトコルを参照)
Amicon Ultra、0.5ml、100K;MILLIPORE;UFC510024
Amicon Ultra、15ml、100K;MILLIPORE;UFC910024
Benzonaseヌクレアーゼ;Sigma-Aldrich、E1014
HiTrapヘパリンカートリッジ;Sigma-Aldrich;54836
デオキシコール酸ナトリウム;Sigma-Aldrich;D5670
培地:D10+HEPES
500mlボトルDMEM高グルコース+Glutamax(Invitrogen)
50ml Hyclone FBS(熱失活)(Thermo Fischer)
5.5ml HEPES溶液(1M、GIBCO)
細胞:低継代HEK293FT(ウイルス産生時の継代数<10)
ウイルス産生には継代数2~4の新しい細胞を解凍し、2~5代成長させる
形質移入試薬:ポリエチレンイミン(PEI)「Max」
50ml滅菌超高純度H2Oに50mg PEI「Max」を溶解する
pHを7.1に調整する
0.22umフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを-20℃で凍結する(保存のため、また直ちに使用してもよい)
細胞培養
D10+HEPES中で低継代HEK293FTを培養し、毎日1:2~1:2.5で継代する
有利には細胞を85%より高いコンフルエンシーに至らせる
T75について
-フラスコ当たり10ml HBSS(-Mg2+、-Ca2+、GIBCO)+1ml TrypLE Express(GIBCO)を37℃に温める(ウォーターバス)
-培地を完全に吸引する
-10mlの温HBSSを穏やかに添加する(培地を完全に洗い流すため)
-フラスコ当たり1mlのTrypLEを添加する
-フラスコをインキュベーター(37℃)に1分間置く
-フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
-9mlのD10+HEPES培地(37℃)を添加する
-上下に5回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
-1:2~1:2.5(T75には12mlの培地)の比で分割する(細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない)
-十分な(大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの)細胞が存在するようになったら直ちにT225に移す
AAV産生(単一15cmディッシュスケール)
1000万細胞を15cmディッシュ中21.5ml培地にプレーティングする
37℃で18~22時間インキュベートする
プレート毎に80%コンフルエンスでの形質移入が理想的である
22ml培地(D10+HEPES)を予熱する
DNA混合物を含むチューブを調製する(内毒素不含maxiprep DNAを使用する):
5.2ug 目的ベクターのプラスミド
8.7ug AAV血清型1プラスミド
10.4ug DF6プラスミド(アデノウイルスヘルパー遺伝子)
ボルテックスして混合する
434uL DMEMを添加する(無血清!)130ul PEI溶液を添加する
5~10秒間ボルテックスする
DNA/DMEM/PEI混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
15cmディッシュ中の培地をDNA/DMEM/PEI混合物に交換する
37℃インキュベーターに戻す
48時間インキュベートした後回収する(有利には、培地が過度に酸性にならないよう監視する)
15cmディッシュから上清を取り出す
0.45umフィルター(低タンパク質結合)でろ過し、アリコートに分け、-80℃で凍結する
形質導入(24ウェルフォーマット、5DIVでの初代ニューロン培養)
形質導入されるニューロンの各ウェル内の完全neurobasal培地を新鮮なneurobasalに交換する(通常、ウェルにつき500ul中400ulが交換される)
37℃のウォーターバスでAAV上清を解凍する
インキュベーターで30分間平衡化させる
各ウェルに250ul AAV上清を添加する
37℃で24時間インキュベートする
培地/上清を取り出し、新鮮な完全neurobasalに交換する
48時間後に発現が目に見え始め、感染後約6~7日で飽和する
GOI(目的の遺伝子)を含むpAAVプラスミド用の構築物は、両方のITRSを含めて4.8kbを超えてはならない。
Cas9は、RNAにガイドされるDNAヌクレアーゼであり、20bp RNAガイドの助けによりゲノムにおける特定の位置にターゲティングされ得る。しかしながら、ガイド配列はガイド配列とDNA標的配列との間のいくらかのミスマッチを許容し得る。ガイドRNAによってCas9が、ガイド配列と数塩基の違いを有するオフターゲット配列をターゲティングするき、オフターゲット開裂が起こる可能性があるため、この柔軟性は望ましくない。全ての実験的応用(遺伝子ターゲティング、作物エンジニアリング、治療適用等)について、Cas9媒介性遺伝子ターゲティングの特異性を向上させ、かつCas9によるオフターゲット改変の可能性を低下させることが重要である。
標的ゲノム編集技術は、幅広い研究および医学的応用を可能にしている。微生物CRISPR-Cas系のCas9ヌクレアーゼは20ntガイド配列によって特定のゲノム遺伝子座にターゲティングされ、ガイド配列はDNA標的とのある程度のミスマッチを許容し得るため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得る。実施例30に簡単に記載したとおり、この例では、本出願者らは、Cas9ニッカーゼ突然変異体を対のガイドRNAと組み合わせて標的二本鎖切断を導入する手法についてさらに記載する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドRNAによる同時のニッキングが必要であり、従って標的開裂のために特異的に認識される塩基の数が事実上拡張される。本出願者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を50~1,000分の1に減らし、オンターゲット開裂効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。従ってこの多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
細胞培養および形質移入:ヒト胎児腎臓(HEK)細胞系293FT(Life Technologies)またはマウスNeuro 2a(Sigma-Aldrich)細胞系を、10%ウシ胎仔血清(HyClone)、2mM GlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に37℃で5%CO2インキュベーションによって維持した。
293FTおよびHUES62細胞に、上記に記載したとおりのDNAを形質移入した。細胞を形質移入後72時間にわたり37℃でインキュベートした後、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAはQuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre)を使用して、製造者のプロトコルに従い抽出した。簡潔に言えば、ペレット化した細胞をQuickExtract溶液に再懸濁し、65℃で15分間、68℃で15分間、および98℃で10分間インキュベートした。
二重ニッキング特異性:Cas9多重ニッキングのターゲティングスペースは、標的DNAが複数のガイドRNA(sgRNA)によってターゲティングされるときのCas9 PAM認識のストリンジェンシーの緩和を利用して増加させることができる。本出願者ら(applciants)は、実施例31において(Ran et al.,「ゲノム編集特異性を増強するためのRNAガイドCRISPR Cas9による二重ニッキング(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity)」,Cell.2013 Sep 12;154(6):1380-9)、2つの適切にオフセットしたsgRNAが特異的な「sgRNAオフセット」パラメータ内でターゲティングされ、インデルを生成し得ることを実証している。本出願者ら(aplicants)は、オフセットしたsgRNAが非NGG PAM(詳細にはNGNおよびNNG)でターゲティングされるとき、効率的なインデルが形成され得ることを実証している。Cas9は、シフトしたPAM、または2番目または3番目のPAM塩基位置にGヌクレオチドを1つのみ有するPAMを潜在的に許容し得るように思われる。
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Claims (16)
- 真核細胞の目的の内因性ゲノム遺伝子座の改変に使用するための組成物であって、前記組成物は、
(a)Cas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記Cas9が、S.aureus Cas9であり、前記Cas9は1つ以上の突然変異をRuvCドメインまたはHNHドメインに含み、かつニッカーゼであり、前記Cas9は少なくとも2つの核局在化シグナルに融合している、Cas9タンパク質またはCas9タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)第1のCRISPR-Cas系キメラRNAであって、目的のゲノム遺伝子座において第1の標的配列とハイブリダイズすることができる第1のガイド配列、第1のtracrメイト配列、および第1のtracrメイト配列とハイブリダイズすることができる第1のtracr配列を含む、第1のCRISPR-Cas系RNA、または前記第1のキメラRNAをコードするポリヌクレオチド、ここで前記第1のキメラRNAは、Cas9タンパク質と第1のCRISPR複合体を形成し、真核細胞の核内の第1の標的配列への第1のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向することができ、それによって、Cas9タンパク質が目的のゲノム遺伝子座の第1のDNA鎖を切断して第1のニックを生成できる;および
(c)第2のCRISPR-Cas系キメラRNAであって、目的のゲノム遺伝子座において第2の標的配列とハイブリダイズすることができる第2のガイド配列、第2のtracrメイト配列、および第2のtracrメイト配列とハイブリダイズすることができる第2のtracr配列を含む、第2のCRISPR-Cas系RNA、または前記第2のキメラRNAをコードするポリヌクレオチド、ここで前記第2のキメラRNAは、Cas9タンパク質と第2のCRISPR複合体を形成し、真核細胞の核内の第2の標的配列への第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向することができ、それによって、Cas9タンパク質が目的のゲノム遺伝子座の第2のDNA鎖を切断して第2のニックを生成できる、
を含み、
ここで、第1のニックは、第2のニックの1~200ヌクレオチド5’に位置する、
組成物。 - 前記Cas9が、SpCas9のD10A、E762A又はD986Aに対応するRuvCドメイン中の少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記Cas9が、SpCas9のD10Aに対応するRuvCドメイン中の突然変異を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記Cas9が、SpCas9のH840A、N854A、又はN863Aに対応するHNHドメイン中の少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記Cas9が、SpCas9のH840Aに対応するHNHドメイン中の突然変異を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記第1及び第2のCRISPR-Cas系キメラRNAおよび前記Cas9をコードするベクターを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項6に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項7に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記第1及び第2のCRISPR-Cas系キメラRNAおよび前記Cas9タンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記第1及び第2のCRISPR-Cas系キメラRNA、および前記Cas9タンパク質をコードするmRNAを含む、請求項1に記載の組成物。
- 第1または第2の標的配列の少なくとも5ヌクレオチドと重複する鋳型ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記Cas9が、異種機能性タンパク質ドメインに融合している、請求項1に記載の組成物。
- 第1のニックが、第2のニックの少なくとも30ヌクレオチド5’であるか、
第1のニックが、第2のニックの最大で100ヌクレオチド5’であるか、
第1のニックが、第2のニックの30~100ヌクレオチド5’であるか、または
第1のニックが、第2のニックの34~50ヌクレオチド5’である、
請求項1に記載の組成物。 - 目的のゲノム遺伝子座が遺伝子産物をコードしており、遺伝子産物の発現が減少または増加するか、あるいは遺伝子産物の活性または機能が変化する、請求項1に記載の組成物。
- 遺伝子産物がタンパク質である、請求項14に記載の組成物。
- 真核細胞が、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または植物細胞である、請求項1に記載の組成物。
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