JP5866283B2 - トリヌクレオチド反復疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年７月２８日に出願された米国仮出願第６１／２７１，９１３号、および２００９年７月２９日に出願された同第６１／２７３，００９号の利益を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦支援による研究下でなされた発明に対する権利の記載
該当せず。

技術分野
本開示は、遺伝子発現の分野にある。

背景技術
トリヌクレオチド反復伸長疾患は、１９９０年初期に初めて特徴付けられた（Ｄｉ Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ ６：７５６−７６５を参照のこと）。これらの疾患は、３個のヌクレオチドのセットの不安定な反復の局所的伸長を有し、この反復が存在する遺伝子の機能喪失、毒性機能の増加、または両方を引き起こし得る。トリヌクレオチド反復は、非コードおよびコード遺伝子領域を含む、遺伝子のあらゆる部分に位置し得る。コード領域内に位置する反復には、一般的に、トリプレットをコードする反復したグルタミン（ＣＡＧ）またはトリプレットをコードするアラニン（ＣＧＡ）のいずれかが含まれる。非コード配列内の長く伸びる反復領域は、遺伝子の異常な発現を引き起こし得る一方で、コード領域内の長く伸びる反復（コドン反復疾患としても知られている）は、ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を引き起こし得る。異常なタンパク質に関連する病態生理学的な正確な原因は、多くの場合、知られていない。一般的に、トリヌクレオチド伸長を起こしやすい野生型遺伝子において、これらの領域は、正常な集団において可変数の反復配列を含むが、罹患集団において、反復の数は、場合によっては、反復の数の単純な２倍から、反復の数の対数で１桁まで増加し得る。例えば、脆弱Ｘ症候群患者におけるＣＧＧ伸長を受けるＦＭＲ１遺伝子において、野生型集団は、２〜５０の反復を示す一方で、脆弱Ｘ症候群に罹患しているこれらの患者は、２００〜２０００のＣＧＧ反復を有し得る（Ｎａｄｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０（４８）：２８９７０−２８９７７）。

今日まで、２０種類の異なる疾患が、長く伸びるトリヌクレオチド反復に関連付けられている（Ｄｉ ＰｒｏｓｐｅｒｏおよびＦｉｓｃｈｂｅｃｋの同書を参照のこと）。この現象は最初に、アンドロゲン受容体のコード領域においてＣＡＧ反復が長く伸びている球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）に関して記載された。野生型遺伝子の反復は、通常は１３〜３０のＣＡＧを含むが、ＳＢＭＡ患者は、４０以上ものＣＡＧを含み得る。長く伸びるトリヌクレオチド反復によって特徴付けられる他の疾患には、フリードライヒ運動失調症（反復はＦｒａｔａｚｉｎ遺伝子の非コード領域内にある）、脆弱Ｘ症候群ＡおよびＥ（反復はそれぞれ、ＦＭＲ１およびＦＭＲ２遺伝子の非コード領域内にある）、および反復が巨大サイトゾルタンパク質のハンチンチン（Ｈｔｔ）のＮ末端コード領域内に挿入されるハンチントン病が含まれる。それぞれのポリグルタミン伸長疾患は、脳の特定領域に神経細胞脱落が明らかである特徴的病変を示す。Ｐ／Ｑ Ｃａ２＋チャンネル、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、およびアトロフィン−１におけるポリグルタミン伸長はそれぞれ、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）−６、ＳＣＡ−１７、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）を引き起こす。それらのポリグルタミン反復は別として、これらの疾患に関与するタンパク質は全て、中枢神経系および末梢組織の両方において広範に発現するが、関連性はない。

ハンチントン舞踏病としても知られているハンチントン病（ＨＤ）は、運動、認識、および精神疾患の進行性疾患である。この疾患の発症の平均年齢は、３５〜４４歳であるが、症例の約１０％においては、発症が２１歳前に生じ、疾患診断後の平均寿命は、１５〜１８年である。有病率は、西ヨーロッパ系の１００，０００人の間で約３〜７人である。通常のＨｔｔ対立遺伝子は、１５〜２０のＣＡＧ反復を含むが、３５以上の反復を含む対立遺伝子は、潜在的にＨＤを生じる対立遺伝子であると見なすことができ、疾患を発症する危険性を与える。３６〜３９の反復を含む対立遺伝子は、不完全に浸透されると見なされ、これらの対立遺伝子を含むこれらの個人は、疾患を発症し得るか発症し得ない（または後年症状を発症し得る）一方で、４０以上の反復を含む対立遺伝子は、完全に浸透されると見なされ、これだけ多くの反復を有するＨＤ対立遺伝子を含む無症候性の人は報告されていない。若年発症ＨＤを有するこれらの個人（２１歳を下回る）は、しばしば、６０以上のＣＡＧ反復を有することが見出される。ＣＡＧ反復の増加に加えて、ＨＤが、この領域が、ポリグルタミンよりもむしろポリセリンポリペプチド（＋１フレームシフトの場合に、ＡＧＣ反復によってコードされる）経路をコードするように、反復配列内で＋１および＋２フレームシフトを含むことができることも示されている（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：８９３−８９６）。

ハンチントン病は、ＨＤ対立遺伝子が、通常、優勢な特性として１人の親から遺伝子を受け継ぐ遺伝的疾患である。ＨＤ患者から生まれるどの子も、もう一方の親がこの疾患に罹患していない場合、疾患を発症する可能性が５０％である。場合によっては、親は、中間ＨＤ対立遺伝子を有し、無症候性であり得る一方で、伸長を反復するため、その子に疾患が現れる。加えて、ＨＤ対立遺伝子はまた、見込みとして知られる現象を示すこともでき、重症度の増加または発症年齢の低下が、精子形成中の反復領域の不安定な性質のため、数世代にわたって観察される。

ＨＤにおいて、トリヌクレオチド伸長は、線条体中で中型有棘ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射神経細胞の神経細胞の欠損を引き起こし、神経細胞の欠損は新皮質においても生じる。エンケファリンを含み、外部淡蒼球へ突き出る中型有棘神経細胞は、基質Ｐを含み、内部淡蒼球へ突き出る神経細胞よりも病変する。ハンチントン病に罹患している人々に大いに影響を及ぼす他の脳の部位には、黒質、皮質３、５、および６、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉の各回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核、および視床の正中中心核−束傍核複合体が含まれる（Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２１８−２２８）。正常なＨｔｔタンパク質の役割は、不明のところが多いが、神経新生、アポトーシス細胞死、および小胞輸送に関与し得る。加えて、野生型Ｈｔｔは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および線条体ニューロンの生存促進性因子を刺激することを証明する。ＨＤの進行は、ＨＤのマウスモデルにおけるＢＤＮＦ発現の減少と相関する（Ｚｕｃｃａｔｏ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（２）：１３３−１３９）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介遺伝子によってＢＤＮＦあるいはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のいずれかの送達が、ＨＤのマウスモデルにおいて、線条体ニューロンを保護し得る（Ｋｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９（５）：６８２−６８８）ことが示されている。

ＨＤに対する治療法の選択肢は、現在、非常に限られている。シャペロニンの過剰発現または化合物ゲルダナマイシンによる熱ショック応答の産生等の長く伸びるポリグルタミン経路を通して生じるタンパク質凝集に関連する毒性を防止するように設計されるいくつかの潜在的な手法は、インビトロモデルにおけるこれらの毒性の減少を示している。他の治療は、疾患の臨床的指標においてアポトーシスの役割を標的としている。例えば、一方の親は、ＨＤ対立遺伝子を含み、もう一方の親が、カスパーゼ１に対して優性阻害対立遺伝子を有するマウスの対合の子孫において、動物モデルのカスパーゼ活性の妨害によって、病徴の遅延が示される。さらに、カスパーゼによるＨＤ Ｈｔｔの切断は、疾患の病原性における役割を果たし得る。カスパーゼ６の耐性変異Ｈｔｔを担持するトランスジェニックマウスは、正常な神経機能を維持することが見出され、非カスパーゼの耐性変異Ｈｔｔ対立遺伝子を担持するマウスと比較して、線条体神経変性を引き起こさなかった（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ １２５：１１７９−１１９１を参照されたい）。また、アポトーシス経路のメンバーを標的とする分子は、症候学において遅延する影響があることも示している。例えば、化合物ｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびミノサイクリン（これらの両者が、カスパーゼ活性を阻害する）は、マウスにおいて、疾患の兆候を遅延させることが示されている。また、薬物レマセミド（ｒｅｍａｃｅｍｉｄｅ）は、この化合物が、神経細胞における毒作用の発揮を妨げるＮＤＭＡ受容体への変異Ｈｔｔの結合を妨げることが考えられるため、小規模なＨＤヒト試験にも使用されている。しかしながら、統計的に有意な改善は、これらの試験におけるニューロン機能において、観察されなかった。加えて、ハンチントン研究グループは、コエンザイムＱを用いて、ランダム化二重盲検試験を行った。コエンザイムＱ１０により処置された患者においてより遅延した疾患進行に関する傾向があったが、全体の機能的能力の下落率に有意な変化がなかった。（Ｄｉ ＰｒｏｓｐｅｒｏおよびＦｉｓｃｈｂｅｃｋの同書を参照のこと）。

したがって、トリヌクレオチド反復疾患の治療のための組成物および方法が求められている。

概要
トリヌクレオチド反復疾患を治療するための方法および組成物を本明細書に開示する。特に、トリヌクレオチド反復疾患を治療するために、トリヌクレオチド反復を含む遺伝子の発現を調節する、例えば、ハンチントン病を治療するためにＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を調節するための方法および組成物が、本明細書に提供される。また、トリヌクレオチド反復疾患の動物モデルを生成するための方法および組成物も提供される。

したがって、一態様において、ＨＤ対立遺伝子（例えば、Ｈｔｔ）の発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質が提供される。改変された亜鉛フィンガータンパク質とは、認識ヘリックスが事前選択された標的部位に結合するように変化された、天然に存在しない亜鉛フィンガータンパク質である。本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれも、１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の亜鉛フィンガーを含むことができ、それぞれの亜鉛フィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）内の標的亜部位に結合する認識へリックスを有する。いくつかの実施形態において、該認識へリックスは、天然に存在しない。特定の実施形態において、亜鉛フィンガータンパク質は、表１に示される認識へリックスを有する。他の実施形態において、亜鉛フィンガータンパク質は、表２に示される標的配列に結合する。

一態様において、長く伸びるＣＡＧ経路に優先的に結合することが可能であるが、野生型長さのＣＡＧ経路に対する親和性の低い、両端型ＺＦＰリプレッサーが提供される。いくつかの実施形態において、長く伸びるトリヌクレオチド経路に優先的に結合するが、野生型長さのトリヌクレオチド反復経路に対する親和性の低い多量体型ＺＦＰ−ＴＦが使用され、それによって、長く伸びる対立遺伝子の優先的な抑制が達成される。いくつかの実施形態において、これらの多量体型ＺＦＰ−ＴＦは、長く伸びる対立遺伝子が、野生型対立遺伝子よりも多くのＺＦＰによってさらに効率的に結合されるように、反復配列に対して協同的ＤＮＡ結合を達成し、変異対立遺伝子の優先的な抑制を可能にする。いくつかの実施形態において、所与のサイズの多量体の安定した複合体を形成し、ひいては、ある最小サイズのＣＡＧ経路と優先的に相互作用することが可能である、多量体型ＺＦＰ ＴＦが、使用され、その最小サイズは、野生型ＣＡＧ経路の長さよりも長い。

特定の実施形態において、本明細書に記載されるＺＦＰ（例えば、両端型、多量体型等）は、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を優先的に修飾する。いくつかの実施形態において、ＺＦＰは、変異Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合し、長く伸びる経路は、ポリグルタミンをコードする一方、他の実施形態において、ＺＦＰは、変異Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合し、長く伸びる経路は、ポリセリンをコードする。したがって、いくつかの実施形態において、ＺＦＰ−ＴＦは、野生型および変異型のＨｔｔ対立遺伝子の両方を調節する。特定の実施形態において、ＺＦＰは、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみ調節する。他の実施形態において、ＺＦＰは、変異型のＨｔｔのみ調節する。

他の実施形態において、長く伸びるＨＤのＨｔｔ対立遺伝子に関連する既知のＳＮＰに優先的に結合するＺＦＰ−ＴＦの抑制が提供される。このように、ＺＦＰ−ＴＦは、ＳＮＰを含む変異Ｈｔｔ対立遺伝子対して特異的であり、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の特定の抑制を可能にする。別の態様において、野生型対立遺伝子に関連するＳＮＰと相互作用することによって、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を特異的に活性化するＺＦＰ−ＴＦが提供される。このように、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子のみが活性化される。

別の態様において、１つ以上の神経栄養因子の発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質は、トリヌクレオチド疾患を治療するために提供される。いくつかの実施形態において、調節される神経栄養因子は、ＢＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦである。改変された亜鉛フィンガータンパク質とは、認識ヘリックスが事前選択された標的部位に結合するように変化された、天然に存在しない亜鉛フィンガータンパク質である。本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれも、１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の亜鉛フィンガーを含むことができ、それぞれの亜鉛フィンガーは、選択された配列（例えば、遺伝子）内の標的亜部位に結合する認識へリックスを有する。いくつかの実施形態において、該認識へリックスは、天然に存在しない。

特定の実施形態において、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）を、融合タンパク質の一部として、調節ドメイン（または機能ドメイン）と作動的連結状態に配置することができる。ＺＦＰとの融合のために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれか一方を選択することによって、そのような融合タンパク質は、遺伝子発現を活性化するか、または抑制するかのどちらか一方のために使用することができる。いくつかの実施形態において、変異Ｈｔｔ発現を下方制御するために使用され得る転写抑制ドメインに融合された、本明細書に記載される変異Ｈｔｔを標的化するＺＦＰを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を上方制御することができる転写活性化ドメインに融合された、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を標的化するＺＦＰを含む融合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、調節ドメインの活性は、細胞転写機構との相互作用が、外来リガンドの不在下で起こらないように、外来小分子またはリガンドによって調節される。このような外部リガンドは、ＺＦＰ−ＴＦの転写機構との相互作用の程度を制御する。調節ドメインは、１つ以上のＺＦＰの間、１つ以上のＺＦＰの外部、およびこれらの任意の組み合わせを含む、１つ以上のＺＦＰの任意の部分に作動的に連結され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変された亜鉛フィンガータンパク質を、融合タンパク質の一部として、ヌクレアーゼ（開裂）ドメインと作動的連結状態に配置することができる。特定の実施形態において、このようなヌクレアーゼ融合は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）、間充織幹細胞（ＭＳＣ）、または神経幹細胞等の幹細胞中で変異Ｈｔｔ対立遺伝子を標的化するために使用され得、ヌクレアーゼ融合の活性は、多くの野生型のＣＡＧ反復を含有するＨｔｔ対立遺伝子を引き起こす。特定の実施形態において、修飾された幹細胞を含む薬学的組成物が提供される。

さらに別の態様において、本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを、トリヌクレオチド反復疾患を治療することが望ましい対象に投与することができる。

なおさらなる態様において、本発明は、ハンチントン病等のトリヌクレオチド反復疾患の研究のための特定のモデル系の生成のための方法および組成物を提供する。特定の実施形態において、変異Ｈｔｔ対立遺伝子が、細胞の生成のために胚幹細胞中に生成されるモデルと、特定の長さのトリヌクレオチド伸長経路（例えば、５０、８０、１０９、および１８０のＣＡＧ反復）が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）誘導標的化組込みを用いて、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に挿入される動物株と、が提供される。特定の実施形態において、モデル系は、インビトロ細胞株を含む一方で、他の実施形態において、モデル系は、トランスジェニック動物を含む。

さらに別の態様において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクターが提供される。特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込み能力があるもしくは組込み機能を欠損したレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。したがって、少なくとも１つの亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組込みのためのドナー配列を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書に提供される。特定の実施形態において、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込み能力のあるレンチウイルスベクターである。特定の実施形態において、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープまたは他のエンベロープを有する擬似タイプである。

いくつかの実施形態において、モデル系は、標的対立遺伝子（例えば、変異Ｈｔｔ）は、発現マーカーで標識化されるトリヌクレオチド反復疾患（例えば、ハンチントン病）を提供する。特定の実施形態において、変異対立遺伝子（例えば、変異Ｈｔｔ）が標識化される。いくつかの実施形態において、野生型対立遺伝子（例えば、野生型Ｈｔｔ）が標識化され、さらなる実施形態において、野生型および変異対立遺伝子の両方は、別個の発現マーカーで標識化される。特定の実施形態において、モデル系は、インビトロ細胞株を含む一方、他の実施形態において、モデル系は、トランスジェニック動物を含む。

さらに、核酸および／またはＺＦＰ（もしくはＺＦＰを含む融合タンパク質）を含有する薬学的組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、調節配列と作動可能に連結され、薬学的に許容される担体または希釈剤と併用される、本明細書に記載されるＺＦＰの１つをコードする配列を備える核酸を含み、調節配列は、細胞内で核酸の発現を可能にする。特定の実施形態において、コードされるＺＦＰは、ＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子に対して特異的である。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子を調節するＺＦＰおよび神経栄養因子を調節するＺＦＰを含む。タンパク質に基づく組成物には、本明細書に開示される１つ以上のＺＦＰおよび薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれる。

さらに別の態様において、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む単離された細胞も提供される。

別の態様において、本明細書に開示される組成物を用いて、トリヌクレオチド反復疾患を治療するおよび／または予防するための方法が本明細書に提供される。特定の実施形態において、方法には、ハンチントン病の治療が含まれる。いくつかの実施形態において、方法には、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）、および／またはその組み合わせを使用して、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を送達することができる組成物が含まれる。いくつかの実施形態において、方法には、ＺＦＰを含む幹細胞集団を含む、または本発明のＺＦＮを変化させた、組成物が含まれる。

これらおよび他の態様は、全体の開示を考慮して、当業者には容易に明らかである。

パネルＡからＤは、ハンチンチン（Ｈｔｔ）対立遺伝子および対立遺伝子に結合する様々なＺＦＰ−ＴＦを示す概略図である。図１Ａは、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子を示す。図１Ｂは、ＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子に結合する単一のＺＦＰ−ＴＦを示し、ここで「ＫＲＡＢ」とは、ＫＯＸ１遺伝子からのＫＲＡＢ抑制ドメインを指し、「ＺＦＰ」とは、亜鉛フィンガー結合タンパク質を指す。「標準ＺＦＰ ＴＦ」は、亜鉛フィンガー結合ドメインが、ＫＲＡＢ抑制ドメインに連結されるＺＦＰ転写因子融合タンパク質である。図１Ｃは、ＺＦＰ転写因子である「両端型ＺＦＰ ＴＦ」を示し、ここで、亜鉛フィンガードメインの２つのクラスターは、剛体タンパク質配列によって分離される。機能ドメインを、本図中の１つのＺＦＰの外部に示すが、機能ドメインが、ＺＦＰの間またはＺＦＰの外部にあり得ることは明らかである。図１Ｄは、「多量体型ＺＦＰ ＴＦ」を示し、これは、多量体化ドメインを通して多量体化することが可能なＺＦＰ ＴＦである（小さな斑点のあるボックスとして示される）。また、機能ドメイン（例えば、活性化、抑制、開裂ドメイン）を黒菱形のあるボックスとして図１Ｃおよび１Ｄに示す。 ヒト２９３Ｔ細胞（表１中に記載される）における標準ＺＦＰ ＴＦによるＨｔｔの抑制を示す。ＧＦＰは、ＧＦＰに対して特異的なＺＦＰ ＴＦを示し、偽は、偽トランスフェクトされている細胞中の発現を示す。 パネルＡ〜Ｃは、例示的な多量体型ＺＦＰ−ＴＦを示す概略図である。図３Ａは、機能ドメイン（抑制ドメイン）、および多量体化のための二量体化ドメインに融合される単一のＺＦＰを示す。図３Ｂは、上端線に示されるように、２つのＺＦＰの多量体の結合を示す。図３Ｃは、上端線に示されるように、４つのＺＦＰの多量体を示す。任意の数の多量体を使用することができ、機能ドメインは、１つ以上の個々のＺＦＰにおいて、どこでも位置付けられ得ることは明らかである。 パネルＡ〜Ｃは、例示的な両端型ＺＦＰ−ＴＦを示す概略図である。図４Ａは、２つのＺＦＰ間に位置付けられる機能ドメインを含む、両端型ＺＦＰを示す。図１Ｄ中に示されるように、機能ドメインは、ＺＦＰのうちの１つの外部であり得る。図４Ｂは、標的部位への両端型ＺＦＰの結合を示す。ＺＦＰの一方または両方は、それらの標的部位に結合する。図４Ｃは、複数の両端型ＺＦＰの結合を示す。 Ｈｔｔ特異的ＺＦＮ対である２５９２０／２５９２１あるいは２５９２２／２５９２３のいずれかによるＫ５６２細胞の処理を行った後のＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）の結果を示すゲルを示す。ＮＨＥＪ活性の割合をそれぞれのレーンの下に示す。「ＧＦＰ」は、プラスミドをコードするＧＦＰでトランスフェクトされている細胞を示す。示されるデータは、プラスミドを含有するＺＦＮでトランスフェクトしてから１４日後に抽出したＤＮＡからのものである。

詳細な説明
ハンチントン病、ＳＢＭＡ、フリードライヒ運動失調症、ならびに脆弱Ｘ症候群ＡおよびＥ等のトリヌクレオチド反復疾患を治療するための組成物および方法を本明細書に開示する。特に、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ ＴＦ）を含むＨｔｔを調節する転写因子およびこのようなタンパク質を利用する方法が、ハンチントン病を治療で用いるために提供される。例えば、変異Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を抑制する、または野生型Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を活性化するＺＦＰ−ＴＦを提供する。加えて、これらの疾患に関連する遺伝子のゲノム構造を修飾する亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を提供する。例えば、変異型のＨｔｔの部分を特異的に変化させることができるＺＦＮを提供する。これらには、改変された亜鉛フィンガータンパク質、すなわち、所定の核酸標的配列に結合する天然に存在しないタンパク質を用いる組成物および方法が含まれる。

したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、トリヌクレオチド反復疾患の治療のための方法を提供し、これらの方法および組成物は、標的遺伝子および改変された亜鉛フィンガーヌクレアーゼを調節することができる亜鉛フィンガー転写因子を含むことができる。

概論
本明細書に開示される方法の実践、ならびに組成物の調製および使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、および関連分野における従来の技術は、当技術分野の技術範囲内である。これらの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的に更新されたもの；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏシリーズ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状構造で、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸（ホスホロチオエート主鎖）部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対を形成する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用の全ての構成要素は、相互作用が全体として配列特異的である限り、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基との接触する）必要はない。このような相互作用は、一般に、１０^-6Ｍ^-1以下の解離定数（Ｋ_d）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指す。高い結合親和性は、低いＫ_dに関連している。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合する（その結果、ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができる、および／または異なる１つのタンパク質または複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ配列の領域である、１つ以上の亜鉛フィンガーによって配列特異的な様式でＤＮＡに結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰとして略記される。

亜鉛フィンガー結合ドメインは、例えば、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質の認識へリックス領域の改変（１つ以上のアミノ酸を変化させる）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合されるように「改変」することができる。したがって、改変された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。亜鉛フィンガータンパク質を改変するための方法の非制限的な例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計／組成物は、主として合理的基準によって得られる。設計のための合理的基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６号も参照されたい。

「選択された」亜鉛フィンガータンパク質は、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスによって主に得られる。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、および国際公開第０２／０９９０８４号を参照されたい。

「組み換え」とは、２つのポリヌクレオチド間での遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示に関して、「相同組み換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性修復機構を介した細胞中の二本鎖切断の修復中に行われる、このような交換の特殊形態を指す。このプロセスは、ドナーから標的への遺伝子情報の転送につながるため、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）のテンプレート修復のために「ドナー」分子を使用し、「非交差型遺伝子変換」または「短経路遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、このような転送は、破壊標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡの不適合補正、および／または、ドナーが標的の一部となる遺伝子情報を再合成するために使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを含むことができる。このような特殊ＨＲにより、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列が変更される。

本開示の方法において、本明細書に記載される１つ以上の標的ヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）において、二本鎖切断を生成し、切断の領域におけるヌクレオチド配列に相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、または代替的に、ドナーポリヌクレオチドを、相同組み換えを介した切断の修復のためのテンプレートとして使用し、ドナー等の場合、細胞クロマチンへの、ヌクレオチド配列の全てまたは一部を導入させる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更することができ、特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置換（すなわち、情報を持つセンスでの配列の置換）を表すと理解され、１つのポリヌクレオチドを別のものによる物理的または化学的置換は必ずしも必要としない。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、亜鉛フィンガータンパク質の追加の対を使用することができる。

細胞クロマチンにおいて、対象となる領域の配列の標的化組み換えおよび／または置換および／または変更のための方法の特定の実施形態において、染色体の配列は、外来の「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組み換えによって変更される。このような相同組み換えは、二本鎖切断の領域に相同である配列が存在する場合、細胞クロマチン内の二本鎖の切断の存在により刺激される。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、対象となる領域のゲノム配列の相同であるが同一ではない配列を含み、それによって、対象となる領域の非同一配列を挿入するための相同組み換えを刺激することができる。したがって、特定の実施形態において、対象となる領域の配列に相同であるドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列と、約８０〜９９％（またはその間のいずれかの整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、１００個を超える近接塩基対の、ドナーとゲノム配列の間で１個だけヌクレオチドが異なる場合、ドナーとゲノム配列の間の相同性は、９９％よりも高い。場合によっては、ドナー配列の非相同部分は、新規配列が、対象となる領域に導入されるように、対象となる領域には存在しない配列を含むことができる。これらの場合において、非相同配列は、一般に、対象となる領域の配列と相同であるかまたは同一である５０〜１，０００個の塩基対（またはそれらの間のいずれかの整数値）、または１，０００個を超えるいくつかの塩基対の配列によって側方に位置している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列に非相同であり、非相同組み換え機構によってゲノムに挿入される。

本明細書に記載される方法のいずれかは、対象となる遺伝子の発現を妨害するドナー配列の標的化組込みによって、細胞中の１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。

さらに、本明細書に記載される標的化組込み方法はまた、１つ以上の外来配列を組み込むために使用することができる。外来核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子またはｃＤＮＡ分子、またはあらゆる種類のコードもしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。加えて、外来核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抑制ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素または化学化水分かを含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断現象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。

「切断ハーフドメイン」は、（同一または異なる）第２のポリペプチドと連結して、切断活性を有する複合体（好ましくは、二本鎖切断活性）を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および-切断ハーフドメイン」、および「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。

「改変された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の改変された切断ハーフドメイン）と共にヘテロ二量体を形成するために修飾された切断ハーフドメインである。例えば、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、および同第２００８／０１３１９６２号明細書も参照されたく、これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これはＤＮＡもしくはＲＮＡであり得る、線状、環状、もしくは分岐状であり得る、または一本鎖もしくは二本鎖のいずれか一方であり得る。「ドナー配列」という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）長のヌクレオチド、好ましくは、約１００〜１，０００（またはそれらの間の任意の整数）長のヌクレオチド、より好ましくは、約２００〜５００長のヌクレオチドであり得る。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、それぞれ２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて変化する長さ）がヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の１分子は、一般にリンカーＤＮＡと会合する。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、原核性および真核性の両方の全ての種類の細胞核タンパク質を包含するように意図されている。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その核型によって特徴付けられ、これは細胞のゲノムを含む全染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含むことができる。

「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件が提供される場合、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。多様なＮＴ−３標的ＺＦＰに対する例示的な標的部位は、表２および３に示される。

「外来」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在する」とは、細胞の特定の発生段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中のみ存在する分子は、成体の筋細胞に関しては外来分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全型内在性分子の機能型または正常機能型内在性分子の機能不全型を含むことができる。

外来分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等の小分子、または、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子の１つ以上を含む任意の複合体等の高分子であり得る。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、それは一本または二本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号明細書を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

外来分子は、内在性分子と同じ型の分子、例えば、外来タンパク質または核酸であり得る。例えば、外来核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞中に外来分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外来分子はまた、内在性分子と同じ型の分子であってもよいが、細胞が由来する種とは異なる種に由来する。例えば、ヒトの核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株中に導入され得る。

これに対して、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれてもよい。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であるか、または異なる化学型の分子であることができる。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合体）、および融合核酸（例えば、上記に記載される融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合体、および副溝結合剤と核酸との間の融合体が含まれるが、これらに限定されない。

細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達すること、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することによって引き起こされてもよく、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂、およびポリペプチド連結はまた、細胞中のタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法は、本開示の他所で提示されている。

「多量体化ドメイン」は、アミノ、カルボキシで組み込まれるドメイン、またはＺＦＰ ＴＦのアミノまたはカルボキシ末端領域である。これらのドメインは、トリヌクレオチド反復ドメインのより大きな経路が、多量体型ＺＦＰ ＴＦによって結合される一方で、野生型経路は結合されないように、複数のＺＦＰ ＴＦ単位の多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例には、ロイシンジッパーが含まれる。多量体化ドメインはまた、小分子によって調節され得、多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下のみ、別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にする適切な構造であると仮定する。このようにして、外来リガンドは、これらのドメインの活性を調節するために使用することができる。

本開示に関して、「遺伝子」は、このような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接しているかに関わらず、遺伝子産物（以下を参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リポソーム結合部位および内部リポソーム侵入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子産物への遺伝子に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）は、発現を調節するために使用することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載されるようなＺＦＰを含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の減少を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

「対象となる領域」は、例えば、外来分子に結合することが望ましい、遺伝子、遺伝子内、または遺伝子に隣接する非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組み換えの目的のためであり得る。対象となる領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。対象となる領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等の転写された非コード領域内、またはコード領域内の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内であり得る。対象となる領域は、単一ヌクレオチド対と同じくらい小さいか、もしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対の長さであり得る。

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

「作動的連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関連して交換可能に使用され、その中で両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性があるように構成要素が配置される。例として、プロモーター等の転写調節配列は、転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合に、コード配列に作動的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していなくても、コード配列に作動的に連結される転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に、それが果たすであろう他の構成要素に連動して同一の機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合される融合ポリペプチドに関して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＥＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合に、作動的連結状態にある。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインにおける融合ポリペプチドが開裂ドメインに融合される場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインおよびその開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、開裂ドメインが標的部位の近接においてＤＮＡを切断することができる場合に、作動的連結状態にある。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ない、または同一の残基数を有することができる、および／または１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を決定するための方法も、よく知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ開裂を、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的相補性および生化学的相補性の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。

「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移動させることができる。一般的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、対象となる遺伝子の発現を指向することが可能な、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、必ずではないが日常的アッセイにおいて、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、および強化された細胞成長および／もしくは遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、対象となる遺伝子の発現をモニターするために、所望の遺伝子配列に作動的に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。

ＤＮＡ結合ドメイン
Ｈｔｔを含むが、これに限定されない、トリヌクレオチド反復を含む任意の遺伝子において、標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が、本明細書に記載されている。ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦ遺伝子において、標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物も提供される。任意のＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に開示される組成物および方法で使用することができる。

特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、亜鉛フィンガータンパク質を含む。好ましくは、亜鉛フィンガータンパク質は天然に存在せず、それは選択する標的部位に結合するように改変される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号明細書、および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号明細書を参照されたく、全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

改変された亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。改変方法には、合理的設計および多様な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列に結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合する。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ファージディスプレイおよび２ハイブリッド法を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、同第６，２４２，５６８号明細書、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結され得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。

標的部位の選択、融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法が当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号明細書、国際公開第９５／１９４３１号、国際公開第９６／０６１６６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第９８／５４３１１号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、国際公開第０２／０９９０８４号、国際公開第９８／５３０５８号、国際公開第９８／５３０５９号、国際公開第９８／５３０６０号、国際公開第０２／０１６５３６号、および国際公開第０３／０１６４９６号に詳しく記載されている。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結され得る。また、６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

代替的に、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ，ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５-１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３-１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３、およびニューイングランドバイオラボ社カタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然の標的部位に結合するよう改変することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。

特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｈｔｔ遺伝子の標的部位に（配列特異的な様式で）結合し、Ｈｔｔの発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質である。ＺＦＰは、変異Ｈｔｔ対立遺伝子または野生型Ｈｔｔ配列のいずれかに選択的に結合することができる。Ｈｔｔ標的部位は、典型的に少なくとも１個の亜鉛フィンガーを含むが、複数の亜鉛フィンガー（例えば、２個、３個、４個、５個、６個以上のフィンガー）が含まれ得る。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４個、５個、または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に９個または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４個のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する一方で、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。ＺＦＰはまた、そのドメインが転写活性化または抑制ドメインであり得る、１つ以上の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。

「両端型」亜鉛フィンガータンパク質は、２つの亜鉛フィンガードメインが２つの不連続標的部位に結合するように、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが、アミノ酸を介在することによって分離されるタンパク質である。両端型亜鉛フィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、一群の４つの亜鉛フィンガーは、タンパク質のアミノ末端に位置し、一群の３つのフィンガーは、カルボキシ末端に位置する（Ｒｅｍａｃｌｅ ｅｔ ａｌ，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８（１８）：５０７３−５０８４を参照されたい）。これらのタンパク質におけるそれぞれのクラスターの亜鉛フィンガーは、独特の標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は、多くのヌクレオチドを含むことができる。両端型ＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合される機能ドメインが含まれ得る。したがって、機能ドメインは、ＺＦＰの一方または両方の外部に付着され得る（図１Ｃを参照されたい）か、またはＺＦＰ間に位置付けられ得る（両方のＺＦＰに付着される）（図４を参照されたい）。

Ｈｔｔ標的ＺＦＰの特定の例は、表１に開示されている。この表の第１の列は、ＺＦＰに対する内部参照名（番号）であり、表２の第１列の同じ名前に対応する。「Ｆ」はフィンガーを指し、「Ｆ」に続く番号は、どの亜鉛フィンガー（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）かを言及する。

これらのタンパク質の標的部位に対する配列および位置は、表２に開示される。表２は、示される亜鉛フィンガータンパク質に対する標的配列を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。

融合タンパク質
本明細書に記載されるＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰ）を含む融合タンパク質および異種調節（機能的）ドメイン（またはその機能的断片）も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子、クロマチン結合性タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子が含まれる。ＤＮＡ結合ドメインならびにヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細ついて、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、および同第２００７／０２１８５２８号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

活性化を達成するための好適なドメインには、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７）を参照）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照）、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７−２９４２（１９９７）を参照）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９−６４４７）が含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４９６１−４９６８ （１９９２）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１−２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７−９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照されたい。

ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとの間の融合タンパク質（または同一物をコードする核酸）の形成において、活性化ドメインと相互作用する活性化ドメインまたは分子のいずれか一方が、機能ドメインとして好適であることが、当業者には明らかである。基本的に、標的遺伝子に活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化等）を補充する能力のある任意の分子が、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子において機能ドメインとしての使用に好適なＩＳＷＩ含有ドメインおよび／またはメチル結合ドメインタンパク質等の絶縁体ドメイン、局在化ドメイン、ならびにクロマチンリモデリングタンパク質が、例えば、譲受人共通の米国特許出願公開第２００２／０１１５２１５号および同第２００３／００８２５５２号明細書、ならびに譲受人共通の国際公開第０２／４４３７６号に記載されている。

例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ−誘発型初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５−３２１およびＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。

融合分子は、当業者によく知られているクローニング法および生化学的接合によって構築される。融合分子には、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）が含まれる。融合分子には、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０媒体Ｔ抗原由来等）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび血球凝集素等）も任意に含まれる。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合の成分間で維持されるように設計される。

一方において機能ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド成分と、他方において非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との間の融合は、当業者に知られている生化学的接合の方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間に融合を起こすための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０−３９３５。

特定の実施形態において、亜鉛フィンガータンパク質によって結合される標的部位は、細胞クロマチンの到達可能領域に存在する。到達可能領域は、例えば、譲受人共通の国際公開第０１／８３７３２号に記載されるように、決定することができる。標的部位が細胞クロマチンの到達可能領域に存在しない場合、譲受人共通の国際公開第０１／８３７９３号に記載されるように、１つ以上の到達可能領域を生成することができる。さらなる実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能領域にあるかに関わらず、細胞クロマチンに結合することができる。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することができる。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型の例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）で見出される。Ｃｏｒｄｉｎｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：２６１−２７０、Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６０：７１９−７３１、およびＣｉｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：２４４−２５４。

融合分子は、当業者に知られているように、薬学的に許容される担体で製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５、および譲受人共通の国際公開第００／４２２１９号を参照されたい。

融合分子の機能的成分／ドメインは、一旦融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことができる多種多様の異なる成分のいずれかから選択され得る。したがって、機能的成分には、活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー、およびサイレンサー等の多様な転写因子ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。

さらなる例示的な機能ドメインは、例えば、譲受人共通の米国特許第６，５３４，２６１号および米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に開示されている。

外来小分子またはリガンドによって調節される機能ドメインも、選択され得る。例えば、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術は、機能ドメインのみが、外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンドの存在下で、その活性立体配座であると仮定する場合、使用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号明細書を参照）。したがって、ＺＦＰは、調節可能な機能ドメインに作動可能に連結され得、ここで、得られたＺＦＰ−ＴＦの活性は、外部リガンドによって制御される。

ヌクレアーゼ
特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、改変されたヌクレアーゼを用いて達成することができる。改変されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の改変に基づいている。例えば、目的に合わせたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの改変が、記載されている。Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（２０）：ｅ１７８、Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−４５８。加えて、ＺＦＰの改変も記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第７，１６３，８２４号、および同第７，０１３，２１９号明細書を参照されたい。

加えて、ＺＦＮ、すなわち、その改変された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通してその意図される核酸標的を認識することができ、かつヌクレアーゼ活性によって、ＤＮＡがＺＦＰ結合部位の近くで切断される、機能的な実体を作り出すために、ＺＦＰが、ヌクレアーゼドメインに融合されている。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。つい最近では、ＺＦＮは、様々な生物におけるゲノム修飾のために使用されている。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。

したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、広範囲に適用可能であり、対象となる任意のヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼの非限定的な例には、メガヌクレアーゼおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼが含まれる。ヌクレアーは、異種ＤＮＡ結合および開裂ドメイン（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；異種開裂ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含み得るか、または代替的に、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同種の結合部位とは異なる部位に結合するように改変されたメガヌクレアーゼ）に結合するように変更され得る。

特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。これらの認識配列は公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号明細書、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５-１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３-１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５３、およびニューイングランドバイオラボ社カタログも参照されたい。

主として、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の天然に存在するメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが、植物、酵母、ショウジョウバエ属、哺乳動物細胞、およびマウスで部位特異的ゲノム修飾を促進するために用いられているが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存している相同遺伝子（Ｍｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８−９３）、またはその中に認識配列が導入されている予め改変されたゲノム（Ｒｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６、Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１３３：９５６−６５、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５０５５−６０、Ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１、Ｇｏｕｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）のいずれかの修飾に限定されている。したがって、医学的または生物工学的に関連のある部位での新規の結合特異性を示すメガヌクレアーゼを改変する試みがなされている（Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号、同第２００６０２０６９４９号、同第２００６０１５３８２６号、同第２００６００７８５５２号、および同第２００４０００２０９２号明細書）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは改変されたＤＮＡ結合ドメインもまた、異種ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の開裂ドメインと作動可能に連結されている。

他の実施形態において、ヌクレアーゼは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、選択遺伝子内の標的部位に結合するように改変されている亜鉛フィンガータンパク質および開裂ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。

上に詳細に記載されるように、亜鉛フィンガー結合ドメインは、選択配列に結合するように改変され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。改変された亜鉛フィンガー結合は、天然に存在する亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。改変方法には、合理的設計および多様な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列と結合する亜鉛フィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ファージディスプレイおよび２ハイブリッド法を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、同第６，２４２，５６８号明細書、ならびに国際公開第９８／３７１８６号、国際公開第９８／５３０５７号、国際公開第００／２７８７８号、国際公開第０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。

標的部位の選択、融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法が当業者に知られており、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号明細書を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

加えて、これらおよび他の参考文献に開示される、亜鉛フィンガードメインおよび／または多フィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号４０）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号４１）、ＴＧＱＫＰ（配列番号４２）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号４３））を含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結され得る。６個以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。また、米国仮特許出願第６１／３４３，７２９号も参照されたい。

ＺＦＮおよび／またはメガヌクレアーゼ等のヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。上記のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得、例えば、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメインであり得る。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。開裂ドメインを生成し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡの２００２−２００３版カタログおよびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；マイクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上は、開裂ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。

同様に、切断ハーフドメインは、切断活性に二量体化が必要である、上記に示すように、任意のヌクレアーゼまたはその部分によって得ることができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）から得ることができるか、またはそれぞれの切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）から得ることができる。加えて、２つの融合タンパク質が、それぞれの標的部位に結合することによって、切断ハーフドメインが互いに、例えば、二量体化することによって、機能的な開裂ドメインを形成するのを可能にする空間的な配向に置かれるように、２つの融合タンパク質の標的部位は、互いに関して、好ましく配置される。したがって、特定の実施形態において、標的部位の近い末端を、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分けられる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）介在することができる。一般に、切断の部位は、標的部位の間にある。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位でまたは結合の部位の近くでＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から隔たった部位の近くでＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上ではその認識部位から９ヌクレオチドで、他方の鎖上ではその認識部位から１３ヌクレオチドで、二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号明細書、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の開裂ドメイン（または切断ハーフドメイン）および改変されても改変されなくてもよい１つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。

開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示に関して、開示される融合タンパク質で用いられるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインと考えられる。したがって、亜鉛フィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合体を用いた細胞配列の標的化した二本鎖切断および／または標的化した置換のために、それぞれ、Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む、２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性のある開裂ドメインを再構成することができる。代替的に、１つの亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。亜鉛フィンガーＦｏｋ Ｉ融合体を用いた標的化した切断および標的とした配列変更のためのパラメータは、本開示の他の箇所に提供されている。

開裂ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的な開裂ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であることができる。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断半ドメインを含み、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

特定の実施形態において、開裂ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号明細書、ならびに米国出願第１１／８０５，８５０号（２００７年５月２３日に出願）（これらの全ての開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、またはホモ二量体化を妨げる１つ以上の改変された切断ハーフドメインを含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基は全て、Ｆｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。

絶対的ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示的な改変された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位のアミノ酸残基における変異を含み、第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基における変異を含む対が含まれる。

したがって、一実施形態において、４９０位の変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、５３８位の変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し、４８６位の変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し、４９９位の変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。具体的に、本明細書に記載される改変された切断ハーフドメインは、一方の切断ハーフドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させることによって、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる改変された切断ハーフドメインを産生し、もう一方の切断ハーフドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによって、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる改変された切断ハーフドメインを産生するように調製した。本明細書に記載される改変された切断ハーフドメインは、絶対的ヘテロ二量体変異体であり、この変異体では、異常な切断が最小限に抑えられているかまたは消失させられている。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたく、この開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、改変された切断ハーフドメインは、４８６位、４９９位、および４９６位（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされた）での変異、例えば、４８６位で野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位で野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、４９６位で野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）もしくはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む。他の実施形態において、改変された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位、および５３７位（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされた）での変異、例えば、４９０位で野生型Ｇｌｎ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位で野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位で野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）もしくはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む。他の実施形態において、改変された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型Ｆｏｋ Ｉに対して番号付けされた）での変異、例えば、４９０位で野生型Ｇｌｎ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３７位で野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）もしくはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）で置換する変異を含む。（２０１０年２月８に出願された米国仮出願第６１／３３７，７６９号を参照されたい）。

本明細書に記載される改変された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００８０１３１９６２号明細書に記載される、野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的突然変異生成によって調製することができる。

代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いた核酸標的部位でのインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照）。このようなスプリット酵素の成分は、別個の発現構築物上で発現され得るか、または１つのオープンリーディングフレーム内に連結することができ、ここで、個々の成分は、例えば、自己切断型２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。成分は、個々の亜鉛フィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌であるキサントモナス（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１を参照）およびラストニア（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照）由来のものと同様に、ＴＡＬエフェクター由来の改変されたドメインである。また、国際公開第２０１０／０７９４３０号も参照されたい。

ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）は、例えば、国際公開第２００９／０４２１６３号および第２００９００６８１６４号に記載される、酵母ベースの染色体系で使用する前に活性に対してスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で知られている方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構造性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で、活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にある。

送達
タンパク質（例えば、ＺＦＰ）、同一物をコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段で、例えば、ＺＦＰ ＴＦまたはＺＦＮ ｍＲＮＡを注入することによって、標的細胞に送達され得る。好適な細胞には、真核および原核細胞ならびに／または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。このような細胞またはこのような細胞から生成された細胞株の非制限的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。また、好適な細胞には、例として、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、および間充織幹細胞等の幹細胞も含まれる。

本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書に記載され、これらの全ての開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される亜鉛フィンガータンパク質はまた、亜鉛フィンガータンパク質の１つ以上をコードする配列を含有するベクターを使用して送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクター系が使用され得る。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号明細書を参照されたく、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが、配列をコードする１つ以上の亜鉛フィンガータンパク質を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のＺＦＰが細胞中に導入される時、ＺＦＰは、同一のベクターまたは異なるベクター上で担持され得る。複数のベクターが使用される時、それぞれのベクターは、１つまたは複数のＺＦＰをコードする配列を含み得る。

従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して、改変されたＺＦＰをコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。このような方法を使用して、ＺＦＰをコードする核酸を、細胞にインビトロ投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子療法用途のために投与される。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達媒体と複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれか一方を有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子療法手順の総説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂoｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。

核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により強化されたＤＮＡの取込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。

さらなる例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６００８３３６号を参照）により提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適な陽イオン性および中性脂肪には、Ｆｅｌｇｎｅｒのもの、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号が含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に送達することができる。

免疫脂質複合体等の標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号明細書を参照されたい）。

送達のさらなる方法には、送達されるべき核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージングする方法も含まれる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、ここで、抗体の一方のアームには、標的組織に対する特異性を有し、もう一方には、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、標的細胞表面にＥＤＶを取り込まれ、次いで、ＥＤＶが、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。一旦細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照）。

改変されたＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（インビボ）することができるか、またはインビトロで細胞を治療するために使用することができ、修飾された細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子送達のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みにより、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子送達方法を使用して可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子が長期発現される。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的群を伸長する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることが可能であり、典型的には高ウイルス価を産生する。レトロウイルス遺伝子送達システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用の長い末端反復から成る。最小限のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、それらは、次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するように治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用される。広範囲にわたって使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ第９４／０５７００号を参照されたい）。

一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い導入効率があり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを使用して、高力価および高レベルの発現が得られている。比較的単純なシステムにおいて、このベクターを多量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、およびインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号明細書、国際公開第９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）のために、細胞に標的核酸を形質導入する。ＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号明細書、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載される。

現在、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子導入に使用可能であり、それらは形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージされたベクターに対して、５０％またはそれより大きい導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノム内への組込みによる効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ８を含む他のＡＡＶ血清型も本発明に従って使用することができる。

複製欠損性アデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターの大半は、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、その後、複製欠損性ベクターが、トランス内の消失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞で増殖するように改変される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるもの等の非分裂の分化した細胞を含む、複数の種類の組織をインビボで形質転換することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例には、筋肉内注入を用いる抗腫瘍免疫のポリヌクレオチド治療が含まれた（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が含まれる。

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。このような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産出細胞株によって生成される。これらのベクターには、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現されるようにタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている他のウイルス配列が含まれる。欠損しているウイルス機能は、パッケージングする細胞株によってトランスで提供される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを所有する。ウイルスＤＮＡは、細胞株内にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠失するヘルパープラスミドを含有する。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。このヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドから、ＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠失の結果、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、ＡＡＶよりも敏感であるアデノウイルスに対する熱処理によって減少することができる。

多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターが高度の特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所定の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、関心の細胞型上に存在することで知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように、モロニーマウス白血病ウイルスを修飾することができ、そのウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、細胞表面受容体に対して、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスがリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで及ぶことができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を表示するように、線状ファージを改変することができる。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同一の原理を非ウイルスベクターに適用することができる。特異的標的細胞による取り込みを好む特異的な取り込み配列を含有するように、そのようなベクターを改変することができる。

遺伝子治療ベクターは、下で説明するように、個々の患者への投与、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所投与によって、インビボで送達することができる。代替的に、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの幹細胞等の細胞に、ベクターをエクスビボで送達することができ、その後、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者への細胞の再移植が続く。

診断、研究のため、または遺伝子治療のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物にトランスフェクトされた細胞の再注入を介して）が当業者によく知られている。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、対象生物（例えば、患者）内に戻って再注入される。エクスビボのトランスフェクションに好適な多様な細胞型は、当業者によく知られている（患者からの細胞の単離および培養方法についての説明は、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４）、およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。

一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボ処置で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、または、それらが骨髄に生着する哺乳動物（幹細胞のドナー等）に導入し得ることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型にインビトロで分化するための方法が知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。

幹細胞は、周知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化された抗原提示細胞）等の不要な細胞に結合する抗体を有する骨髄細胞をパンニングすることによって骨髄から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。

いくつかの実施形態において、修飾されている幹細胞も、使用され得る。例えば、アポトーシスに耐性をなしている神経幹細胞は、治療組成物として使用され得、ここで、幹細胞はまた、本発明のＺＦＰ ＴＦも含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞において、ＢＡＸまたはＢＡＫに特異的なＺＦＮを用いて（米国特許出願第１２／４５６，０４３号を参照）ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ、または例えば、カスパーゼ６に特異的なＺＦＮを用いて再度、カスパーゼにおいて妨害されるものを不活性化することによって生じ得る。これらの細胞は、変異または野生型Ｈｔｔを調節することが知られているＺＦＰ ＴＦでトランスフェクトすることができる。

治療的ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、細胞の形質導入のために、生物にインビボで直接投与することもできる。代替的に、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液細胞または組織細胞との最終的な接触内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する好適な方法は、使用可能であり、かつ当業者にも知られており、１つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも即時かつ有効な反応を提供することができる。

造血幹細胞にＤＮＡを導入するための方法が、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号明細書に開示されている。トランス遺伝子の、例えば、ＣＤ３４⁺細胞等の造血幹細胞への導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。

トランス遺伝子の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入に好適なベクターには、非組込みレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照されたい。

薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、下で説明するように、使用可能な薬学的組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照）。

上述のように、開示される方法および組成物には、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない、任意の種類の細胞で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株が当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞（ツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）等）、および真菌細胞（サッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等）が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変種、および誘導体を使用することもできる。

用途
トリヌクレオチド反復疾患に関連する遺伝子を調節する、および／またはこれらの疾患に関連する遺伝子におけるトリヌクレオチド反復の経路を取り除くことが望ましい任意の用途のために、開示される組成物および方法を使用することができる。特に、治療および研究用途を含むが、これらに限定されない、Ｈｔｔ対立遺伝子の調節が望ましい任意の用途のために、これらの方法および組成物を使用することができる。

ＺＦＰ ＴＦを抑制するＨＤ Ｈｔｔを治療剤として使用することができる疾患および状態には、ハンチントン病が含まれるが、これに限定されない。さらに、Ｈｔｔの変異対立遺伝子に対して特異的なＺＦＮを含む方法および組成物をハンチントン病の治療のための治療剤として使用することができる。

ＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子を抑制するＺＦＰ−ＴＦはまた、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦが含まれるが、これらに限定されない神経栄養因子を活性化するＺＦＰ−ＴＦと連結して使用され得る。これらのＺＦＰ（またはこれらのＺＦＰをコードするポリヌクレオチド）は、同時に投与され得る（例えば、同じ薬学的組成物において）か、または任意の順序で連続して投与され得る。

また、ハンチントン病の治療のための方法および組成物には、幹細胞内でＨｔｔ対立遺伝子の変異コピーがＨｔｔに特異的なＺＦＮを用いて、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子に修飾されている幹細胞組成物も含まれる。

本発明の方法および組成物はまた、インビトロおよびインビボモデル、例えば、トリヌクレオチド反復疾患の動物モデルの設計および実施に有用であり、これは、これらの疾患の研究を可能にする。

実施例１：Ｈｔｔ標的亜鉛フィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）の設計および構築
Ｈｔｔを標的化した亜鉛フィンガータンパク質は、米国特許第６，５３４，２６１号明細書に記載されるように、基本的に改変された。表１は、例示的なＨｔｔ標的ＺＦＰの認識へリックスＤＮＡ結合ドメインを示す。

また、両端型ＺＦＰ−ＴＦは、最終ベクターが、ＳＩＰ１等の両端型ＺＦＰ−ＴＦの遺伝子配列に隣接する２つのアレイのＺＦＰを含むことを除いては、基本的に上記のような亜鉛フィンガー結合ドメインの２つの別個のクラスターを用いて構築される。図１Ｃおよび図４を参照されたい。

多量体型ＺＦＰ ＴＦはまた、このベクターが、ＺＦＰ ＴＦをコードする配列に作動可能に連結されるトリヌクレオチド反復の経路に沿って発現タンパク質の多量体化を可能にする１つ以上の多量体化ドメインをコードする配列を含有することを除いては、上記のように構築される。図１Ｄおよび図３を参照されたい。

ＺＦＰ ＴＦは、核局在化配列、Ｈｔｔ対立遺伝子を標的とした改変された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン（表１を参照）、およびヒトＫＯＸ１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインを含む、融合タンパク質として構築された。図１Ａを参照されたい。設計されたＤＮＡ結合ドメインは、１８−ｂｐ配列を認識する６個のフィンガー分子を含有する（表２を参照）。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、非接触ヌクレオチドは小文字で示される。

ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、標的配列に結合するＺＦＰを確認する。簡潔に言えば、Ｔ７プロモーターの制御下で、血球凝集素エピトープ（ＨＡ）標的化全長ＺＦＰをコードする発現カセットは、ＨＡタグのＴ７プロモーターおよびコード配列を導入するプライマーを用いて、組み立てられたＺＦＰのそれぞれからのＰＣＲ増幅によって作製される。このＰＣＲ断片を使用して、ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎおよびＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いることによって、インビトロでＨＡ標識化ＺＦＰタンパク質を生成し、ＨＡ標識化タンパク質は、次いで、Ｈｔｔ遺伝子内の意図される標的部位を含有するビオチン化ＤＮＡオリゴ、ならびに競合体（ヒトゲノム）ＤＮＡと混合し、特異的ＺＦＰ−ＤＮＡ認識のみ報告することが可能である。

次いで、ＺＦＰ−ＤＮＡ複合体は、ペルオキシダーゼ共役抗ＨＡ抗体で標識化され、続いて、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート上に捕捉する。次いで、特異的ＺＦＰ−ＤＮＡ複合体は、基質として、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、捕捉したペルオキシダーゼの活性をアッセイすることによって定量化する。マウスまたはヒトＨｔｔプロモーターおよびエクソン１に対して特異的なＺＦＰ ＴＦは、標的配列に結合するために設計および試験される。

実施例２：ヒトおよびマウス細胞におけるＨＤ Ｈｔｔの抑制。
ＺＦＰ ＴＦを抑制するＨｔｔの活性を試験するために、ＺＦＰ ＴＦをヒト細胞にトランスフェクトし、ＰＣＲを用いてＨｔｔの発現を観察した。

初めに、表１中に示される標準ＺＦＰ ＴＦを試験した。ヒト２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ（１９７７）．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６：５９−７４）を、１０％ ＦＢＳで捕捉したＤＭＥＭ中に培養した。９６ウェルプレートに、１ウェルにつき１ｅ４細胞の密度で播種し、翌日、製造業者の指示に従って、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬を用いて、１８８３２、１８８５６、１８８５９、および１８８６８のＺＦＰ−ＴＦをコードする０．１ｕｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３日間インキュベートし、次いで、遺伝子発現分析のためにＣｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプロセスした。内部対照のベータアクチン（ＡＣＴＢ）と比較した内因性ヒトハンチンチン（Ｈｔｔ）のレベルを、Ｈｓ００９１８１７６＿ｍ１および４３５２９３５Ｅのプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）７３００上のリアルタイムＰＣＲによって分析した。

図２に示されるように、ＺＦＰ−ＴＦは、ＧＦＰおよび偽対照と比較して、Ｈｔｔ発現を抑制した。結果は、ＡＣＴＢの内因性レベルに対する、基底Ｈｔｔの割合で示される。

両端型および多量体型ＺＦＰ ＴＦの活性を試験するために、同じプロトコルを、両端型および多量体型ＺＦＰを用いて行う。

ヒトＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子に対する特異性を有するＺＦＰ ＴＦを試験するために、Ｈｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦを、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（Ｂｉｅｄｌｅｒ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８：３７５１−３７５７）に過渡的にトランスフェクトする。簡潔に言えば、組み立てられたＺＦＰ−ＴＦ構築物を、ｐｃＤＮＡベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、製造業者のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅ６キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてトランスフェクトする。Ｈｔｔ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＨｓ００９１８１７６＿ｍ１プライマー／プローブのセットを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定する。Ｈｔｔタンパク質の減少を確認するために、ウエスタンブロット解析を行う。

マウス対立遺伝子と相互作用するように設計されたＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦを試験するために、マウスＺＦＰ ＴＦをコードする構築体をｐｃＤＮＡベクターにクローン化し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ニューロ２Ａ細胞（Ｋｌｅｂｅ ＆ Ｒｕｄｄｌｅ（１９６９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４３：６９Ａ）またはマウスＨｔｔを発現する同等のマウス神経細胞株に過渡的にトランスフェクトする。Ｈｔｔ発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定する。Ｈｔｔタンパク質の減少を確認するために、ウエスタンブロット解析を行う。

加えて、ヒトＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦを、ＣＡＧ伸長を有する切断型ヒトＨｔｔ対立遺伝子を担持するＲ６．２トランスジェニックマウス由来の一次神経細胞において試験する（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：４９３-５０６）。マウスＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦ、ならびにＣＡＧ反復（両端型ＺＦＰおよび多量体化ドメインを有するＺＦＰ）を標的化するＺＦＰを、Ｈｔｔノックインマウス由来の不死化線条体細胞において試験する（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｊａｎ；８（１）：１１５−２２）。

実施例３：インビボでのＨｔｔ発現の抑制
インビボでのＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦを試験するために、ＺＦＰをコードするＡＡＶ２ベクターを産生する。次いで、これらのＡＡＶ２ベースの構築体を、マウスの脳に送達する。ヒトＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦにおいては、ＡＡＶベクターをＲ６．２マウスまたはＢＡＣ ＨＤマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６またはＦＶＢ／Ｎ株）に送達し、ヒト導入遺伝子の抑制を評価する。マウスＨｔｔ特異的ＺＦＰにおいては、ＡＡＶベクターを野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６またはＦＶＢ／Ｎ）に送達し、内因性マウスＨｔｔ発現の抑制を評価する。ＣＡＧを伸長した対立遺伝子を優先的に標的化するＺＦＰにおいては、ＡＡＶベクターをＲ６．２マウスまたはヒトＨｔｔノックインマウスに送達し、野生型対伸長したＨｔｔ対立遺伝子の選択的抑制を検証する。殺処分後、脳組織を、ＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、Ｈｔｔ発現に対して分析する。

実施例４：神経栄養因子およびＨＤ Ｈｔｔ対立遺伝子特異的なＺＦＰ ＴＦの共トランスフェクション。
上で同定されるＨｔｔ特異的ＺＦＰ ＴＦは、脳神経栄養因子に対して特異的なＺＦＰ ＴＦで共トランスフェクトされる。使用した脳神経栄養因子に対して特異的なＺＦＰ ＴＦは、ＧＤＮＦあるいはＢＤＮＦのいずれかに対して特異的である。

実施例５：Ｈｔｔ標的亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計および構築
ヒトＨｔｔおよびマウスＨｔｔを標的化するＺＦＮは、ＣＡＧ反復に隣接する配列、ならびに最初および最後のコーディングエクソンの配列を標的化するように設計される。ＺＦＮは、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）：８０８−８１６、および米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号明細書に記載されるように基本的に設計され、プラスミドまたはアデノウイルスベクターに組み込まれた。

上記のように、組み立てられたＺＦＮを、ＥＬＩＳＡによって、それらのそれぞれの配列に結合させるために試験する。

実施例６：Ｈｔｔ特異的ＺＦＮの切断活性
上記のヒトＨｔｔ特異的ＺＦＮの対をコードするプラスミドを、Ｋ５６２細胞にトランスフェクトする。Ｋ５６２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手して、１０％規格ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｃｙｃｌｏｎｅ）を補足したＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で推奨されるように、成長させた。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）プロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラスチック容器から引き離した。トランスフェクションのために、１００万個のＫ５６２細胞を、２μｇの亜鉛フィンガーヌクレアーゼプラスミドおよび１００μＬ Ａｍａｘａ溶液Ｔと混合した。細胞を、プログラムＵ−２３を用いてＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（商標）中でトランスフェクトし、１．４ｍＬの温Ｆ−１２培地＋１０％ＦＣＳ中に回収した。

ゲノムＤＮＡを収穫し、意図された切断部位を含むＨｔｔ遺伝子座の一部をＰＣＲ増幅する。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ ＨｉＦｉポリメラーゼを用いたＰＣＲを、以下の通りに実行する。９４℃で最初の３分間変性させた後、ＰＣＲの３０サイクルを、９４℃で３０秒間の変性ステップを行い、続いて、５８℃で３０秒間のアニーリングステップ、６８℃で３０秒間の伸長ステップを行う。３０サイクルが完了した後、反応物を６８℃で７分間インキュベートし、次いで、１０℃で無制限に行う。

Ｋ５６２ Ｈｔｔ特異的ＺＦＮで処理された細胞からのゲノムＤＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２００８００１５１６４号、第２００８０１３１９６２号、および第２００８０１５９９９６号明細書に記載される、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によって検証される。

マウスＨｔｔ特異的ＺＦＮの対をコードするプラスミドを、同様の様式で、ニューロ２ａ細胞中で試験する。

実施例７：可変長のトリヌクレオチド反復の標的化組込み
上記の、ＣＡＧ反復に隣接する配列に対して最大の切断活性を有するＨｔｔ特異的ＺＦＮを、標的化組込み戦略に使用して、Ｈｔｔの野生型コピーへの可変長のＣＡＧ反復を導入する。５０、８０、１０９、および１８０のＣＡＧ反復単位を含むドナーが、構築される。次いで、これらのドナーは、上記のように、Ｈｔｔ特異的ＺＦＮをコードするプラスミドを用いて、Ｋ５６２細胞にトランスフェクトされる。ドナー組込みの検証は、ゲノムＤＮＡ単離、ＰＣＴ増幅（上記のような）、続いて、対象となる領域のシークエンシングによって達成される。

Ｈｔｔ対立遺伝子へのドナー対立遺伝子の標的化組込みさせるＫ５６２細胞中で同定されたＺＦＮを使用して、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）に可変長のドナー核酸を挿入する。成功したドナー組込みは、上記のように、ゲノムＤＮＡ単離、ＰＣＲ、およびシークエンシングによって確認される。

実施例８：野生型およびＨＤマウスＨｔｔ対立遺伝子の発現タグ
最初または最後のコーディングエクソンに対して最大の切断活性を有するＺＦＮを使用して、異なるレポータータンパク質を用いて、野生型および変異Ｈｔｔ対立遺伝子を標識化する。それぞれのレポーター（ＡおよびＢ）に対してドナーＤＮＡは、レポーター遺伝子の標的化組込みが、Ｈｔｔへのインフレーム融合を産生することができるように、リードＺＦＮ対の切断部位に基づいて設計される。ドナーＤＮＡは、組込みの最も高い頻度を与えるドナーＤＮＡ構築体を選択するために、リードＺＦＮ対を用いて、ニューロ２Ａ細胞に共トランスフェクトされる。

ＺＦＮ対２５９２０／２５９２１および２５９２２／２５９２３は、上記のように調製され、実施例６に記載されるように、Ｃｅｌ Ｉミスマッチを用いて、切断活性について試験した。これらのＺＦＮ対は、Ｈｔｔ遺伝子配列の３’末端を標的化し、ひいては、野生型Ｈｔｔ対立遺伝子あるいは変異Ｈｔｔ対立遺伝子のいずれかを標的化するために使用され得る。結果を図５に示す。図から見られるように、これらの２つの対は、Ｈｔｔ遺伝子を切断することが可能であり、したがって、レポーターの導入のために利用することができる。

対応するＺＦＮと共にレポーターＡに対して選択されたドナーＤＮＡ構築体は、長く伸びるＨｔｔ対立遺伝子（例えば、ヒトＨｔｔノックインマウス）を含むモデルマウス由来のマウス胚幹細胞に送達される。レポーターＡの標的化組込みのために、クローンが、得られ、スクリーニングされる。ヘテロ接合体の現象が望ましく、標的化対立遺伝子は、ＰＣＲによって同定される。単一のレポーター標識化Ｈｔｔ対立遺伝子および他の対立遺伝子において非修飾のＺＦＮ標的配列を含むクローンが、選択され、レポーターＢおよび対応するＺＦＮのドナー構築体は、レポーターＢを用いて第２の対立遺伝子を標識化するようにトランスフェクトされる。

得られたマウス胚幹細胞クローンは、それぞれの対立遺伝子から発現の追跡を可能する２つの異なるマーカーを用いて標識化した野生型Ｈｔｔ対立遺伝子および変異対立遺伝子を含み、標準プロトコルを用いて、これらの細胞を使用して、トリヌクレオチド反復疾患のマウスモデルを生成する。

本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

理解の明瞭化を目的とした図示および例のために、本開示を多少詳しく提供したが、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、多様な変更および修正を実施することができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および例を限定的であると見なすべきではない。

Claims (13)

1. ハンチントン（Ｈｔｔ）遺伝子の発現を調節する改変された亜鉛フィンガータンパク質であって、以下の表１
   

   

   でＮ末端からＣ末端方向にＦ１〜Ｆ５又はＦ１〜Ｆ６と並べられた、５個又は６個の亜鉛フィンガードメインを含み、
   ここで、前記亜鉛フィンガードメインは、表１の単列で示される認識へリックス領域を含み、
   ここで前記亜鉛フィンガードメインは前記遺伝子中の標的部位と結合し、ここで前記標的部位は、配列番号２０〜２３及び３６〜３９からなる群から選択される配列である、亜鉛フィンガータンパク質。
2. 前記遺伝子は、野生型または少なくとも１つの長く伸びるトリヌクレオチド反復を含む遺伝子である、請求項１に記載の亜鉛フィンガータンパク質。
3. 請求項１または請求項２に記載の少なくとも２つの亜鉛フィンガータンパク質を含む、多量体であって、前記多量体の前記亜鉛フィンガータンパク質は、野生型トリヌクレオチド反復と比較して、長く伸びるトリヌクレオチド反復に優先的に結合する、多量体。
4. 前記長く伸びるトリヌクレオチド反復は、ポリグルタミンまたはポリセリンをコードする、請求項１乃至３のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質または多量体。
5. 前記亜鉛フィンガータンパク質は、前記遺伝子の発現を活性化するか、または抑制する、請求項１乃至４のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質または多量体。
6. 請求項１乃至５のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質または多量体、ならびに、機能ドメインを含む、融合タンパク質。
7. 前記機能ドメインが、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。
8. 請求項１乃至７のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、多量体、または融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
9. 請求項１乃至８のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、多量体、融合タンパク質、またはポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
10. 請求項１乃至８のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、多量体、融合タンパク質、またはポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
11. インビトロで、長く伸びるトリヌクレオチド反復を標的修飾する方法であって、前記融合タンパク質の活性により、前記長く伸びるトリヌクレオチド反復が修飾されるように、請求項６に記載の１つ以上の融合タンパク質または前記１つ以上の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、長く伸びるトリヌクレオチド反復を含む遺伝子を有するゲノムを含む細胞にインビトロで投与することを含む、方法。
12. 前記細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）、間充織幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記修飾は、トリヌクレオチド反復の数を減少させることを含む、請求項１１に記載の方法。

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